CZ298131B6 - Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu Escherichia coli, prostredek a vakcína s jeho obsahem a pouzití této mutantní formy - Google Patents

Abstract

Podstatu resení tvorí mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu holotoxinu Escherichia coli, ve kterém je aminokyselina Arg192 v podjednotce A mutovaného holotoxinu nahrazena Gly192, mutovaný holotoxin má podstatne snízenou toxicitu ve srovnání s nativním termolabilním enterotoxinem holotoxinem E. coli, uchovává si imunologicky adjuvantní úcinnost pri merení na bunkách Y-1 nadledvinek, ale nemá ADP-ribosylacní úcinnost pri pouzitíNAD-Agmatinu a ADP-ribosyltransferázy. Soucást resení tvorí také prostredek nebo vakcína s obsahem uvedené mutantní formy a pouzití této mutantní formy pro výrobu vakcín.

Description

Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu Escherichia coli, prostředek a vakcína s jeho obsahem a použití této mutantní formy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká geneticky odlišného termolabilního enterotoxinu E. coli (LT) a jeho použití jako orálního adjuvans pro indukci slizničních a sérových protilátek. Přesněji, mutantní LT je modifikován substitucí jedné aminokyseliny, která odstraňuje jeho základní toxicitu, ale 10 nenarušuje adjuvantní vlastnosti jeho molekuly.

Dosavadní stav techniky

Mikrobiální patogeny mohou infikovat hostitele jedním z několika mechanismů. Mohou vstupovat povrchovým indukovaným traumatem, mohou vstupovat přenosem vektorem, nebo mohou interagovat se slizničním povrchem. Většina lidských patogenů iniciuje chorobu posledním mechanismem, například po interakci s povrchem sliznic. Bakteriální a virové patogenny působící tímto mechanismem nejprve vstupují do kontaktu s povrchem sliznic, kde se mohou připojit a 20 potom jej kolonizovat, nebo mohou být vychytávány specializovanými absorpčními buňkami (M buňkami) v epitelu, který pokrývá Peyerovy pláty a jiné lymfatické folikuly (Bockman and Cooper, 1973, Am. J. Anat. 136: 455 -477; Owenetal., 1986, J. Infect. Dis. 153: 1108- 1118). Organismy, které vstupují do lymfatické tkáně, mohou být snadno usmrceny uvnitř lymfatických folikulů, což vyvolává silnou obranou imunitní odpověď vůči antigenům, které jsou dopraveny k imunitním buňkám uvnitř folikulů (např. Vibrio cholerae). Alternativně se může patogen, který je schopen odolat lokálním obraným mechanismům, šířit z folikulů a následně způsobit lokální nebo systémové onemocnění (např. Salmonella spp., Poliovirus, rotavirus u imunokompromkovaných hostitelů),

Sekreční IgA (slgA) protilátky namířené proti specifickým determinantám virulence infikujících organismů hrají významnou roli v celkové slizniční imunitě (Cebra et al., 1986, v: Vaccines 86, Brown et al., (vyd.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, str. 129 - 133). V mnoha případech je možné zabránit počáteční infekci slizničních povrchů stimulací produkce slizničních sigA namířených proti patřičným determinantám virulence infikujícího organismu. Sekreční IgA může zabránit počáteční interakci patogenů se slizničním povrchem blokováním připojení a/nebo kolonizace, neutralizací na povrch účinkujících toxinů, nebo zabráněním invaze hostitelských buněk. Zatímco jsou prováděny rozsáhlé výzkumy pro určení role buňkami zprostředkované imunity a sérový protilátek pro ochranu proti infekčním agens, méně je známo o regulaci, indukci a sekreci slgA. Parenterálně podané přípravky inaktivovaných celých buněk a celých virů jsou účinné ve zvýšení ochranných sérových IgG a v reakcích oddálené přecitlivělosti proti organismům, které mají signifikantní sérovou fázi ve své patogenesi (např. Salmonella tyfy, Hepatitis B). Nicméně, parenterální vakcíny nejsou účinné ve zvýšení slizniční IgA odpovědi a jsou neúčinné proti bakteriím, které interagují se slizničním povrchem a neinvadují (např. Vibrio cholerae). Existují, nicméně, nedávné zprávy o tom, že parenterálně podané vakcíny mohou být účinné proti alespoň jednomu viru, rotaviru, který interaguje primárně se slizničním povrchem (Conner et al., 1993, J. Virol. 67: 6633 - 6641). Ochrana je předpokládané způsobena transsudací antigen specifických IgG na slizniční povrchy a tak neutralizací viru. Proto jsou pro účinné vakcíny důležité mechanismy, které stimulují jak sérové, tak slizniční protilátky.

Orální imunizace může být účinná pro indukci specifické IgA odpovědi, je-li antigen presentován T a B lymfocytům a přídatným buňkám obsaženým uvnitř Peyerových plátů, kde je iniciován preferenční vývoj IgA B-buněk. Peyerovy pláty obsahují pomocné T (TH)-buňky, které zprostředkují přesmyk izotypu B buněk z IgM buněk na IgA buňky. Pláty také obsahují T buňky, které iniciují konečnou diferenciaci B buněk. „Primed“ B buňky potom migrují do mesenteriál55 nich lymfatických uzlin a podléhají diferenciaci, vstupují do ductus thoracicus, potom do syste

-1CZ 298131 B6 mového oběhu a následně osídlují všechny sekreční žlázy v těle, včetně lamina propria střeva a respiračního traktu. IgA je potom produkován zralými plasmatickými buňkami, spojován s membránovou vazebnou sekreční komponentou a transportován na slizniční povrch a je přístupný interakci s invadujícím patogenem (Strober and Jacobs, 1985, v: Advances in host Defens mechanism, vol. 4, Mucosal Immunity, Gallin and Fauci (vyd.) Raven Press, New York, str. 1 30; Tomáši a Plaut, 1985, v: Advances in host defens mechanism, vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin and Fauci (vyd). Raven Press, New York, str. 31- 61). Existence tohoto všeobecného systému slizniční imunity částečně vysvětluje potenciál živých orálních vakcín a orální imunizace na ochranu proti patogenním organismům, které iniciují infekci prvotní interakcí se slizničními povrchy.

Bylo vyvinuto množství strategií pro orální imunizaci, včetně použití atenuovaných mutantů bakterií (např. Salmonella spp.) jako nosičů heterologních antigenů (Cárdenas and Clements, 1929, Clin. Microb. Rev. 5: 328 - 342; Clements et al., 1992, v: Recombinant DNA Vaccines: Rationale and Stratégy, Issacson (vyd.), Marcel Decker, New York, str. 293 - 321; Clements a Cárdenas, 1990, Res, Microbiol, 141: 981 -993; Clements a El-Morshidy, 1984, Infect, Immunol. 46: 564 - 569); enkapsulace antigenů do mikrosfér složených z poly-DL-lactideglycolidu (PGL), proteinům podobných polymerů - protenoidů (Santiego et al., 1993, Pharmaceutical Research 10: 1243 - 1247), želatinových kapslí, různých přípravků liposomů (Alving et al., 1986, Vaccine 4? 166 - 172; Garcon and Six, 1993, J. Immunol, 146: 3697 - 3702; GouldFogerite and Mannino, 1939, v: Liposome Technology 2. vyd, vol. III, Gregoriadis (vyd.)), adsorpce na nanočástice, užití lipofílních imunitních stimulačních komplexů (ISCOMS), (Mowat a Donachie, 1991, Imunology Today, 12: 383 -385), a přidání bakteriálních produktů se známými adjuvantními vlastnostmi (Clemens et al., 1988, Vaccine 6: 269 -277; Elson, 1989, Immunology Today, 146: 29 - 33; Lycke a Holmgren, 1986, Immunology, 59: 301 - 308; Licke et al., 1992, Eur, J. Immunol. 22: 2277 - 2281). Dva bakteriální produkty s největším potenciálem pro funkci jako orální adjuvans jsou cholera toxin (CT), produkovaný různými kmeny V. Cholerae, a termolabilní enterotoxin (LT) produkovaný některý nu eritero toxickým i kmeny Escherichia coli. Ačkoliv CT a LT mají mnoho vlastností společných, jsou to zjevně odlišné molekuly s biochemickými a imunologickými odlišnostmi, které je činí jedinečnými.

Masivní průjem při choleře je výsledkem působení silného exo-enterotoxínu, který způsobuje aktivaci adenylát cyklasy a následné zvýšení intracelulámí hladiny cyklického 3'-, 5'- adenosin monofosfátu (cAMP). Cholera enterotoxin (CT) je polymerický protein o 84000 daltonech a je složený ze dvou hlavních, nekovalentně asociovaných, imunologicky odlišných regionů nebo domén („cholera A“ a „cholera B“) (Finkelstein a LoSpalluto, 1969, J.Exp. Med. 130: 185 -202). Z těchto je 56000 daltonový region, neboli choleragenoid, odpovědný za vazbu toxinu na membránový receptor hostitelské buňky, Gmi (galaktosyl-N-ácetylgalaktošarhinyl-(s!alyl)galaktosyl-glukosyl ceramid), který je nacházen na povrchu v podstatě všech eukaryotických buněk. Choleragenoid je složen z pěti nekovalentně asociovaných podjednotek, zatímco A region (27000 daltonů) je odpovědný za různé biologické efekty toxinu.

Vztahy mezi dvěma podjednotkami CT s ohledem na imunologické vlastnosti molekuly byly zdrojem značné debaty. Na jednu stranuje CT vynikající imunogen, který vyvolává jak sériovou, tak slizniční protilátkovou odpověď proti toxinu, pokud je podán orálně. Toto zjištění není nové, jelikož o pacientech s cholerou je známé, že se u nich vyvíjí nárůst litrů protilátek proti toxinu během rekonvalescence klinické cholery (Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 69: 137 - 196). Jedním klíčovým objevem jeho výzkumu vlastností této odpovědi bylo, že CT, oproti většině jiných proteinových antigenů, neindukuje orální toleranci proti sobě samému (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 289 2 - 2897; Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 132L 2736 2741). Toto bylo také potvrzeno při krmení myší B-podjednotkou, pozorováním provedeným v oblasti cholerové vakcíny v Bangladéši, kdy orální imunizace B podjednotkou kombinovanou s usmrcenými celými buňkami vedla ke slizniční, stejně jako systémově antitoxinové protilátkové odpovědi (Sevennerholdm et al., 1984, J. Infect. Dis. 149: 884 - 893).

-2CZ 298131 B6

Kromě toho, že je potentní orální imunogen, má CT množství jiných popsaných imunologických vlastností. Jak bylo ukázáno výše, Elson a Ealding (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892 - 2897) pozorovali, že orálně podaný CT neindukuje toleranci proti sobě samému. Navíc, simultánní orální podání CT se solubilním proteinovým antigenem, „keyhole limpet“ hemocyaninem (KLH), vede k rozvoji sekreční IgA odpovědi jak proti CT, tak proti KLH a také ruší indukci orální tolerance proti KLH. Tato zjištění byla následovně potvrzena a rozšířena Lyckem a Holmgrenem (Lycke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308). Zmatek narůstá při pokusu definovat roli A a B podjednotek CT s ohledem na adjuvantní vlastnosti molekuly. Následující pozorování, jak je shrnul Elson (Elson, 1989, Immunology Today, 146: 29 - 33) jsou základem pro tento zmatek:

* CT neindukuje orální toleranci proti sobě samému (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892-2897).

* CT-B neindukuje orální toleranci proti sobě samému (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897).

* CT může zabránit indukci tolerance proti jiným antigenům, se kterými je simultánně podán a také slouží jako adjuvans pro tyto antigeny (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892 2897; Lycke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308).

* CT může účinkovat jako adjuvans pro CT-B (Elson a Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892-2897).

* Teplem agregovaný CT má malou toxicitu, ale je silný orální imunogen (Pierce et a., 1983, Infect. Immunol. 40: 1112-1118).

* CT-B může sloužit jako imunologický „nosič“ v tradiční konfiguraci hapten-nosič (Cebra et al., 1986, v: Vaccines 86, Brown, et al., (vyd.), Cold Spring Harbor laboratory, New York, str. 129- 133; McKenzie a Halsey, 1984, J. Immunol. 133: 1818 — 1824).

Velký počet výzkumníků vyvodil z těchto zjištění to, že B-podjednotka musí vlastnit základní adjuvantní aktivitu. Objevy Cebra et al., (Cebra et al., 1986, v: Vaccines 86, Brown et al, (vyd.), Cold Spring Harbor laboratory, New York, str. 129 - 133), Lycke a Holmgren (Lycke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308), a Liang et al., (Liang et al., 1988, J. Immunol. 141: 1495 - 1501) budou stát proti této úvaze. Cebra et a., (Cebra et al., 1986; V. Vaccines 86, Brown et al., (vyd.), Cold Spring Harbor laboratory, New York, str. 129 - 133 ukázal, že purifikovaný CT-B byl účinný v nárůstu frekvence specifických anti-cholera toxin B buněk v Peyerových plátech, když byl podán intraduodenálně, ale oproti CT nevedl k signifikantnímu počtu IgA B buněk. Lycke a Holmgren (Lýcke a Holmgren, 1986, Immunology 59: 301 - 308) srovnávali schopnost CT a CT-B zvyšoval imunitní odpověď střevní mukosy na KLH měřením imunoglobulin secemujících buněk v lamina propria orálně imunizovaných myší. Nezjistili žádné zvýšení anti-KLH produkujících buněk v odpovědi na jakoukoliv dávku B-podjednotky testované vjejich systému. Konečně, Liang et al., (Liang et al., 1988, J. Immunol. 141: 1495 - 1501) nezjistil žádný adjuvantní efekt, pokud byl CT-B podán orálně v konjunkci s inaktivovaným Sendai virem.

Tam, kde byla adjuvantní aktivita izolované B-podjednotky pozorována tomu bylo z jednoho ze dvou důvodů. První je, že tradiční metoda přípravy B-podjednotky byla podrobení holotoxinu disociační chromatografii gelovou filtrací za přítomnosti disociačního činidla (např. guanidin HC1 nebo kyselina mravenčí). Izolované podjednotky jsou potom povolovány a disociační činidlo je odstraněno. B-podjednotky připravené touto technikou jsou pravidelně kontaminovány stopovým množstvím A-podjednotky, takže při renaturaci je obnoveno malé množství holotoxinu. Druhý důvod musí být dán s definicí imunologického nosiče. Jako mnoho jiných solubilních proteinů může B-podjednotka sloužit jako imunologický prostředek pro presentaci antigenu imunitnímu systému. Jestliže jsou tyto antigeny dostatečně malé, aby byly slabě imunogenní, mohou se stát imunogenními v tradiční konfiguraci hepten - nosič. Podobně, je zde „teoretické“ imunitní zvýšení asociované s B-podjednotkou, zejména pro orální presentaci, v tom, že . 2 _

B-podjednotka se váže na povrch epiteliálních buněk á může imobilizovat připojený antigen pro zpracování se střevem asociovanou lymfatickou tkání. Nicméně, jakákoliv potenciální výhoda tohoto mechanismu může být vyvážena distribucí antigenu na non-imunologicky relevantní tkáni, například na povrch střevních epiteliálních buněk. V kontextu odpovídavosti mukosy jsou imunologicky relevantní místa Peyerovi pláty, zejména proti antigen - specifický T lymfocyt dependentní aktivaci B buněk (Strober a Jacobs, 1985, v: Advancs in host defense mechanisms. vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin a Fauci (vyd.), Raven Press, New York, str. 1 - 30; Tomáši a Plaut, 1985, v: Advances in host defense mechanisms. vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin a Fauci (vyd.), Raven Press., New York, str. 31-61; Bretzaeg, 1989, Curr. Top. Micoribol. Immunol. 146: 13 - 25). Tak, události, které předcházejí přesmyku izotypů z IgM buněk na lgA B-buňky probíhají vPeyerových plátech. Antigeny lokalizované na povrchu epiteliálních buněk mohou přispívat k antigenem indukované proliferaci B buněk v tom, že třída II pozitivních virosních epiteliálních buněk může účinkovat jako antigen presentující buňky pro aktivaci T buněk v sekretorickém místě, a tak ke zvýšené produkci cytokinů, terminální diferenciaci B buněk, zvýšené expresi sekreční komponenty a zvýšenému zevnímu transportu antigen specifického IgA (Tomáši, T.B., a A. G. Plaut, 1985, v: Advances in host defense mechanisms. vol. 4, Mucosal Imunity, Gallin a Fapci (vyd.), Raven Press, New York, str. 31-61). Vztahy těchto dějů nejsou jasně definovány pro B podjednotku jako nosič jiných antigenů a použití termínu „adjuvans“ se jeví nevhodné pro takový efekt.

Je jasné, že adjuvantní vlastnosti molekuly jsou umístěny v hologoxinu, ve kterém je B podjednotka vyžadována pro rozpoznání receptoru a pro facilitaci penetrace A-podjednotky do buňky. A-podjednotka je také požadována pro adjuvantní aktivitu, předpokládané jako funkce její ADPríbosylující enzymatické aktivity a schopnosti zvyšovat intracelulámí hladiny CAMP (viz níže). B-podjednotka sama může účinkovat jako nosič při jiné antigeny v tom, že pokud je konjugována na tyto antigeny, může být i mobilizována pro zpracování se střevem asociovanou lymfatickou tkání.

Ačkoliv LT a CT mají mnoho rysů společných, jsou to jasně odlišné molekuly s biochemickými a imunologickými rozdíly, které činí jedinečnými, včetně 20% rozdílu v homologii nukleotidové a aminokyselinové sekvence (Dallas a Falkow, 1980, Nátuře 288: 499 - 501). Dva toxiny mají stejný počet podjednotek a uspořádání, stejné biologické mechanismy účinku a stejnou specifickou aktivitu v mnoha in vitro zkouškách (Clements a Finkelstein, 1979, Infect.Immunol. 24: 760 - 760; Clements et al., 1980, Infect. Immunol. 24: 91 - 97).

Existují, nicméně, signifikantní rozdíly mezi těmito molekulami, které ovlivňují nejenom jejich enterotoxické vlastnosti, ale také jejich schopnost účinkovat jako adjuvans. Počínaje tím, že oproti CT produkovanému V. Cholerae LT zůstává asociován s buňkou a je uvolněn pouze při buněčné lýze (Clements a Finkelstein, 1979, Infect. Immunol. 24: 760 - 760). CT je secemován z vibria, jakmile je syntetizován a může být snadno identifikován v, a purifikován z, supernatantu kultury. Dále, oproti CT, LT není plně biologicky aktivní, když je prvně izolován z buněk. Stejně jako A-B model pro bakteriální toxiny vyžaduje LT proteolýzu a disulfidovou redukci, aby byl plně aktivní. Za absence proteolytického zpracování je enzymaticky aktivní A| skupina neschopna di soci ovát od A₂ komponenty a nemůže dosáhnout svůj cílový substrát (adenylát cyklasu) na basolaterálním povrchu střevních epiteliálních buněk. Toto také platí pro CT, ale proteasy v kultuře supernatantu, kterému je toxin vystaven v průběhu purifikace, provádějící proteolýzu. Protože LT není plně biologicky aktivní, je obtížné ho identifikovat v průběhu purifikace za použití in vitro biologických zkoušek jako je zkouška Y-l adrenálních buněk nebo zkouška faktoru permeability.

Tyto rozdíly v aktivaci izolovaného materiálu vedou k rozdílům v odpovědi na LT a CT v biologických systémech. Například, CT indukuje detekovatelnou sekreci tekutin ve střevě myší při dávce 5 až 10pg. LT indukuje detekovatelnou sekreci v myším střevě při dávce vyšší než 100 μg. U králičí ligované ideální smyčky je rozdíl dramatický a jasně odlišitelný. Navíc, u primátů bylo ukázáno, že LT neindikuje sekreci tekutin v jakékoli testované dávce vyšší než

-dCZ 298131 B6 miligram. Toto je 200 krát vyšší množství než to, o kterém bylo popsáno pro CT, že indukuje pozitivní přesuny tekutin u lidí. Je-li LT vystaven proteolytickým enzymům s trypsinu podobnou specifickou, stane se jeho molekula nerozlišitelnou od CT v jakémkoliv systému biologických zkoušek. Toto bylo jasně demonstrována Clementsem a Finkelsteinem (Clements a Finkelstein, 5 1979, Infect. Immunol. 24: 760 - 769).

Kromě výše popsaných rozdílů má LT neobvyklou afinitu k uhlovodany obsahujícím matricím.

Přesněji, LT, s molekulovou hmotností 90000, eluuje se Sephadex kolon (glukosa) se zřetelnou molekulovou hmotností 45000 a z Agarosa kolon (galaktosa) se zřetelnou molekulovou hmot10 ností 0. To znamená, že se váže na galaktosu obsahující matrice a může být eluován z těchto matric v čisté formě aplikací galaktósy. LT se váže nejenom na agarosu v kolonách použitých pro purifíkaci, ale navíc, a to je důležité, na jiné biologické molekuly obsahující galaktosu, včetně glykoproteinů a lipopolysacharidů. Tato lektinu podobná vazebná vlastnost vede k širší distribuci na receptorech savčích buněk pro LT než pro CT, který se váže pouze na G_Mi- Toto může být 15 částečně přičítáno popsaným odlišnostem ve schopnostech těchto dvou molekul indukovat odlišnou odpověď T helper lymfocytů (McGhee et al., 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, str. 2L).

V těchto studiích, které popsal McGhee et aL, (McGhee et aL, 1949, Mucosal Munilogy Update, 20 Spring 1994, Raven Press, New York, str. 21.) je ukázáno, orální imunizace myší vakcínami jako je tetanický toxoid (TT) spolu s CT jako sliznicním adjuvans selektivně indukuje T_H2 typ buněk v Peyerových plátech a slezině, jak je manifestováno TH buňkami, které produkují IL-4 a IL-5, ale nikoliv IL-2 nebo INF-gamma. (Pro důkladnější popisu cytokinové sítě viz. Arai et al., 1990,. Ann. Rev. Biochem. 59: 783 - 836). Důležité je, že pokud je CT použit jako slizniční adjuvans,, 25 zvyšuje také kromě IgE odpovědi antigen specifické IgE odpovědi. Takové zvýšení IgE odpovědí vážně ohrožuje bezpečnost CT jako slizničního adjuvans vzhledem ke možnosti indukce hypersensitivních reakcí okamžitého typu. Oproti tomu, LT indukuje jak TrI, tak Th2 buňky a predominantně antigen specifické IgA odpovědi vůči IgE odpovědím, pokud je použit jako orálně podané slizniční adjuvans.

Dvě molekuly mají také mnoho imunologických odlišností, jak je demonstrováno imunodifusními studiemi (Clements a Finkelstein, 1978, Infect. Immunol. 21: 1036 - 1039; Clements a Finkelstein, 1978, Infect. Immunol. 22: 709 - 713), in vitro neutralizačními studiemi a částečnou ochranou proti s LT asociovanému E. co li průjmu u dobrovolníků, kteří dostali B-podjednotko35 vou cholerovou vakcínu celých buněk (Clements et al., 1988, J. Infect. Dis. 158: 372 - 377).

Dohromady tato zjištění demonstrují, že LT a CT jsou unikátní molekuly, navzdory jejich zjevným podobnostem, a že LT je praktické orální adjuvans, zatímco CT nikoliv.

Demonstrace adjuvantních vlastností LT vyplynula z výzkumu vlivu ,LT na vliv tolerance k orálně podaným antigenům, který prováděl jeden z předkladatelů tohoto vynálezu, nebylo jasné, zda LT může také ovlivňovat indukci orální tolerance nebo vykazoval adjuvantní účinky demonstrované pro CT, vzhledem k pozorovaným odlišnostem pro tyto dvě molekuly. Následně, autoři předkládaného vynálezu zkoumali velký počet parametrů, včetně účinku LT na orální 45 toleranci OVA a role dvou podjednotek LT v pozorované odpovědi, účinku různých způsobů podání a časování podání LT, účinku předchozího vystavení OVA na schopnost LT ovlivňovat toleranci k OVA, použití LT jako adjuvans se dvěma nepříbuznými antigeny, a účinku způsobu imunizace na anti-OVA odpovědi. Výsledky získané z těchto studií (Clements et al., 1988, Vaccine 6: 269 - 277; Cements et al., 1988, Abstract No. B91, 88th Ann. Meet. Am. Soc.

Microbiol) jsou shrnuty níže:

1. Při simultánním podání LT s OVA bylo ukázáno, že zabraňuje indukci tolerance na OVA a že zvyšuje sérovou anti-OVA IgG odpověď ze 30 až 90-krát vzhledem k OVA indukovaným a

PBS indukovaným zvířatům, v příslušném pořadí. Tento účinek byl určen jako funkce enzyma_ 5 _ ticky aktivní A-podjednotky toxinu, protože B-podjednotka samotná nebyla schopná ovlivňovat indukci tolerance.

2. Zvířata, kterým byl podán LT s OVA po iniciálním vystavení OVA vyvíjeli signifikantně nižší sérové IgG a slizniční IgA anti-OVA odpovědi, než ty, kterým byl podán LT sOVA v počáteční imunizaci, což ukazuje, že předchozí expozice antigenú redukuje účinnost LT na ovlivnění tolerance ajeho schopnost účinkovat jako adjuvans. LT nebyl schopen zrušit toleranci, která byla jednou navozena. Toto také platí pro CT, kdy zvířata byla preimunizována OVA před orálním ovalbuminem plus CT a toto nabízí určité vysvětlení výhodného pozorování, že proti10 látková odpověď na necílové dietní antigeny není zvýšena, pokud jsou použita tato adjuvans.

3. Sérové IgG a slizniční IgA odpovědi u zvířat, která obdržela LT pouze jedenkrát a bylo to při prvním vystavení antigenú, byly ekvivalentní k odpovědím po třech OVA/LT expozicích, což indikuje, že odpověď se vyskytuje časně a po první expozici antigenú. Bylo také demonstrováno, že namíření odpovědi na predominantní buď sérový IgG, nebo slizniční IgM může být kontrolováno tím, jestli je nebo není podána parenterálně další dávka antigenú.

4. Simultánní podání LT se dvěma rozpustnými proteinovými antigeny vede k vývoji sérových a slizničních protilátek proti oběma antigenům, pokud nemělo zvíře předchozí imunologickou zkušenost ani s jedním. Toto bylo důležité zjištění, protože jedna možná aplikace LT jako adjuvans může být pro vývoj slizničních protilátek proti komplexu antigenú, jako jsou usmrcené bakterie nebo viry, kde může být významná schopnost odpovídat na mnohé antigeny.

Studie Tamury et al., (Tamura et all., Patent US 5 182 109) demonstrovala, že LT a/nebo. CT 25 podán intranasálně zvyšuje titr protilátek proti společně podanému antigenú. Nicméně, nikde u Tamury et al., není zmíněno, že tyto toxiny mohou indukovat ochranou imunitní odpověď, pokud jsou podány orálně.

Je jasné, že LT má signifikantní imunoregulační potenciál, tak jako prostředek pro zabránění 30 indukce tolerance na specifické antigeny, tak jako adjuvans pro orálně podané antigeny a že zvyšuje produkci jak sérových IgG, tak slizničních IgA proti antigenům, se kterými je podán. Toto podněcuje možnost účinných programů imunizace proti široké škále patogennů, který podání usmrcených nebo atenuovaných agens nebo relevantních determinant virulence specifických agens. Nicméně, fakt, že tento „toxin“ může stimulovat sekvenční odpověď lumínální 35 sítě, pokud je proteolyticky štěpen, například střevními proteasami, nebo pokud je podán v dostatečně vysokých koncentracích orálně, může překážet výzkumu jeho potenciálu nebo bránit jeho použití za vhodných podmínek. Tento problém může být vyřešen, pokud by mohl LT být „detóxi kován“ bez narušení adjuvantních vlastností jěhó molekuly. Pro Zhodnocení toho, je-li toto možné, je nezbytné dále analyzovat mechanismus účinku LT a CT a strukturální a funkční 40 vztahu těchto molekul. Jak bylo ukázáno dříve, jak LT, tak CT jsou syntetizovány jako multipodjednotkové toxiny s A a B komponentami. Po počáteční interakci toxinu s membránovým receptorem hostitelské buňky usnadňuje B region penetraci A podjednotky přes buněčnou membránu. Při thiolové redukce disociuje tato A složka do dvou menších polypeptidových řetězců. Jeden z nich, A] řetězec, katalyzuje ADP-ribosylaci stimulačního GTP-vážícího protei45 nu (Gs) v enzymovém komplexu adenylát cyklasy na basolaterálním povrchu epiteliálních buněk a toto vede ke zvýšení intracelulámích hladin cAMP. Výsledné zvýšení cAMP vede k sekreci vody a lektrolytů do tenkého střeva přes interakci se dvěma cAMP-senzitivními iontovými transportními mechanismy, které vyžadují: (1) NaCI kotransport přes kartáčový lem vilosních epiteliálních buněk, a (2) elektrogenní Na⁺ dependentní Cl sekreci buňkami krypt (Fields, 1980, 50 v Secretory diarhea, Field et al., (vyd.), Waverly Press, Baltimore, str. 21-30). A podjednotka je také základní skupinou asociovanou se zvýšením imunity pomocí těchto toxinů. Tato podjednotka se tak stává pravděpodobným cílem pro manipulaci pro disociaci toxických a imunologických funkcí molekul. Nová studie Lyckeho et al., (Lycke et al., 1992, Eur, J. Immunol. 22: 2277 - 2281) objasnila, že tyto alterace, které ovlivňují ADP- ribosylační enzymatickou aktivitu

-6CZ 298131 B6 toxinu a alterují schopnost zvyšovat intracelulámí hladiny cAMP také zabraňují molekule, aby fungovala jako adjuvans, V důsledku toho musí být využit jiný přístup pro detoxifikaci.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu holotoxinu Escherichia coli, ve kterém je aminokyselina Argl92 v podjednotce A mutovaného hologoxinu nahrazena Gly 192, mutovaný má podstatně sníženou toxicitu ve srovnání s nativním termolabilním enterotoxinem holotoxinem E, coli, uchovává si imunologicky adjuvantní účinnost při měření na buňkách Y-l nadledvinek, ale nemá ADP-ríbosy lační účinnost pří použití NAD-Agmatinu a ADP-ribosyltransferázy.

Mutantní formy LT nemají dále potenciál pro to, aby se staly toxickými prostřednictvím proteolytické aktivace. Tento mutantní LT (dále mLT) si uchovává schopnost zvyšovat imunitní odpověď u zvířete (např, IgG, IgA) na antigen, který je nepříbuzný s LT nebo mLT bez toxických vedlejších účinků. Experimentální důkazy ukazují, že mLT je využitelný jako adjuvans pro orálně podané antigeny; takové podání vede k produkci sérových IgG a/nebo slizničních slgA proti antigenům se kterým je mLT podán. Předkládaný vynálezu poskytuje metodu pro indukci sérové a slizniční imunitní odpovědi u hostitele na jakýkoliv orálně podaný antigen, která zahrnuje podání hostiteli efektivní množství mLT v konjunkci s orálním podáním efektivního množství antigenu. Preferovaně jsou antigen a mLT podány iniciálně v simultánní dávce.

Předkládaný vynález a kompozice poskytují zlepšený způsob orální imunizace pro vývoj sérových a slizničních protilátek proti patogenním mikroorganismům. Produkce IgA protilátkové odpovědi proti patogenním mikroorganismům, které penetrují nebo invadují přes slizniční povrchy může být směřována na povrch, zatímco signifikantní sérová protilátková odpověď se může rozvíjet pro zabránění infekce patogenními organismy, proti kterým jsou sérové protilátky protektivní. Předkládaný vynález je využitelný pro jakýkoliv specifický antigen, u kterého by mohla být užitečná odpověď specifickými neutralizačními protilátkami pro odstranění fyziologických nebo chorobných stavů asociovaných s antigenem.

Předkládaný vynález také poskytuje kompozice užitečné jako složka vakcíny proti enterotoxickým bakteriálním organismům exprivujícím cholera-podobně enterotoxiny a způsoby jejich použití.

Vynález také poskytuje kompozice použitelné v těchto metodách. Kompozice obsahují účinné množství mLT v kombinaci s účinným množstvím antigenu.

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález může být pochopen lépe s odkazem na následující podrobný popis vynálezu, příklady specifických provedení vynálezu a připojené obrázky, kde:

Obrázek 1: Schematický diagram plasmidu pBD94, který kóduje obě podjednotky A i B pod kontrolou promotoru lac.Plasmid pBD95 obsahuje substituci jedné báze v aminokyselinovém residuu 192 podjednotky A, kódující pro Gly místo Arg, což zachovává čtecí rámeček, ale eliminuje proteoiytické místo. Je ukázána aminokyselinová sekvence korespondující s regionem sensitivity na trypsin a místo aminokyselinové substituci Arg^-Gly 192·

Obrázek 2: Grafické znázornění na dávce závislého zvýšení hladin DAP-ríbosylagmatinu jako funkce zvýšeného množství CT.

- 7 cz, zyai.51 B6

Obrázek 3: Akumulace tekutin po podání 125 pg nativního LT, ale nikoliv po podání 125 pg mLT myším. Poměr střevo-trup je definován jako hmotnost střeva ku zbylé hmotnosti trupu.

Obrázek 4: Schopnost mLT působit jako imunologické adjuvans. Obrázek 4A: Schopnost mLT indukovat sérovou IgG odpověď na OVA. Obrázek 4B: Schopnost mLT indukovat slizniční IgA odpověď na OVA.

Obrázek 5: Experimentální demonstrace toho, že mLT si uchovává schopnost bránit indukci orální tolerance na LT. Obrázek 5A: Schopnost mLT indukovat sérovou IgG odpověď na LT. Obrázek 5B: Schopnost mLT indukovat slizniční IgA odpověď na LT.

Předkládaný vynález zahrnuje kompozice a metody pro navození produkce slizničních a sérových protilátek proti antigenům, které jsou simultánně orálně podány spolu s geneticky modifikovaným bakteriálním toxinem. Modifikovaný toxin je tvořen termolabilním enterotoxinem (LT) E. coli, který díky genetickému zpracování ztratil své trypsin senzitivní místo, což Činí molekulu netoxickou, ale navíc si, neočekávaně, uchovává svou schopnost účinkovat jako imunologické adjuvans. Mutantní LT je zde označen jako „mLT“. Vynález je založen na objevu, že mutantní LT je stejně účinný jako LT jako imunologické adjuvans, což je neočekávaný a překvapivý výsledek. mLT dále nemá enzymatickou aktivitu pro ADP-ribosylaci, protože A podjednotka nemůže být dále proteolyticky zpracována. Oproti publikovaným studiím Lyckeho a kol., kteří objasnili, že alterace tohoto DTP-ribosylační aktivity LT také zabraňuje funkci molekuly jako imunologické adjuvans (Lycke et al„ 1992, Eur. J. lmmunol, 22: 2277-2281), nyní popisovaný mLT si uchovává aktivitu jako imunologické adjuvans, ačkoliv, jak je demonstrováno na příkladech, nemá ADP-ribosylační aktivitu.

Nová mutantní forma termolabilního enterotoxinu E, coli mLT, zde popsaná, se chová jako adjuvans a zvyšuje produkci jak sérových IgG, tak slizničních IgA proti antigenům, se kterými je podán. Využitelnost tohoto překvapivého objevuje vtom, žc adjuvantně účinné množství mLT může být využito v programu imunizace proti množství patogennů, kde tento program zahrnuje podání účinného množství mLT adjuvans ve směsi s usmrcenými nebo atenuovanými patogenny nebo relevantními determinantami virulence specifických patogennů bez obav z reálných nebo potenciálních toxických vedlejších účinků asociovaných s orálním podáním CT nebo LT,

Předkládaný vynález obohacuje předchozí vědomosti v tom, že předkládaný vynález může být použit v množství imunologických aplikací, ve kterých byly používány CT, LT, nebo podjednotky CT nebo LT, ale nyní s mLT, kde nejsou reálné nebo potenciální toxické vedlejší účinky, jako je průjem, asociované s jejich použitím. Oproti LT, který ačkoliv není toxický při izolaci z bakterie, má potenciál stát se plně toxickým při vystavení próteásám jako jsou ty, které jsou nacházeny ve střevě savců, mLT nemá potenciál stát se aktivním prostřednictvím proteolytické aktivace.

Jiným provedením předkládaného vynálezu je složka vakcíny proti enterotoxickým organismům, které exprivují choleře podobný toxin. Předkladatelé tohoto vynálezu ukázali, že mLT není subjektem orálně indukované imunitní tolerance při podání (viz níže), a proto může mLT účinkovat a je vysoce žádoucí jako složka vakcíny namířené proti enterotoxickým organismům. Nynější technologie poskytují vakcíny proti cholera-podobný toxin exprivujícím organismům obsahující usmrcené celé buňky a B podjednotku toxinu. Nahrazení B podjednotky mLT ve vakcíně je vakcína vylepšena dvěma způsoby, první je, že mLT, který má jak A, tak B podjednotku bude nyní indukovat imunitní odpověď nejenom na B podjednotku, ale také na A podjednotku. Toto poskytuje více epitopů pro účinnou neutralizaci. Druhý je, že adjuvantní aktivita základní v mLT bude zvyšovat imunitní odpověď proti komponentě usmrcených celých buněk vakcíny.

Dále, jiní výzkumníci (Hase et al„ 1949, Infect. lmmunol. 62: 3051-6057), ukázali, že A podjednotka, modifikovaná tak, že není dále toxická alterací aktivního místa ADP eribosylační enzymatické aktivity (oproti proteolytickému místu, které je předmětem předkládaného vynálezu)

-8CZ 298131 B6 může indukovat imunitní odpověď proti divokému typu A podjednotky. Nicméně, A podjednotka takto modifikovaná nyní postrádá adjuvantní imunologickou aktivitu a je proto méně žádoucí jako složka vakcíny než mLT.

Navíc, jelikož protilátky proti mLT zkříženě reagují s LT a CT, může být mLT použit ve vakcínách namířených proti mnohým typům enterotoxických bakteriálních organismů, které exprivují cholera-podobné toxiny, jakoje Escherichia spp. a Vibrio spp.

Produkce mLT

Divoký typ LT toxinu je kodován přirozeně se vyskytujícím plasmidem nacházeným ve kmenech enterotoxigeních E. coli schopných produkce tohoto toxinu. Předkladatelé tohoto vynálezu již dříve klonovali LT gen z lidských izolátů E. coli označených H10407. Tento subklon se skládá z 5,2 kb DNA fragmentu z enterotoxinového plasmidu H10407 insertovaného do Pstl místa plasmidu pBR322 (Clements et af, 1983, Infect. Immunol. 40:653). Tento rekombinantní plasmid, označený pDF82, byl rozsáhle charakterizován a exprivoval LT za kontroly nativního LT promotoru. Dalším krokem v tomto procesu bylo umístění LT genu pod kontrolu silného promotoru, v tomto případe lac promotoru na plasmidu pUC 18. Toto bylo provedené izolací genů pro LT-A a LT-B separátně a jejich rekombinováním v kazetě ve vektorovém plasmidu. Toto byl důležitý krok, jelikož dovolil purifikaci významných množství LT a derivoval mutanty pro následnou analýzu. Tento plasmid, označený pBD94, je diagramaticky znázorněn na Obrázku 1.

Jak CT, tak K.T jsou syntetizovány s trypsin senzitivní peptidovou vazbou, která připojuje A! a A₂ části. Tato peptidová vazba musí být zlomena pro to, aby molekula byla „toxická“. Toto také platí pro difteria toxin^ prototyp A-B toxinu, a pro mnoho jiných bakteriálních toxinu, Pokud není A_t-A₂ vazba odstraněna, buď bakteriálními proteasami, nebo střevními proteasami v lumen střeva, nemůže A] část dosáhnout svého cíle na bazolaterálním povrchu střevních epiteliálních buněk. Oproti CT, není LT plně biologicky aktivní, je-li poprvé izolován z buňky. LT také vyžaduje proteolýzu pro to, aby byl plně biologicky aktivní a proteolytická aktivace se nevyskytuje aktivní a proteolytická aktivace se nevyskytuje uvnitř bakterie. Proto, jedním prostředkem alterace toxicity molekuly bez ovlivnění ADP-ribosylační enzymatické aktivity by mělo být odstranění - pomocí genetické manipulace - trypsin sensitivní aminokyseliny, která spojuje Ai a A₂ složky A podjednotky. Pokud nebude molekula enzymaticky štěpena, nebude toxická. Odborník by mohl předpokládat, že molekula by si měla, nicméně, uchovat ADP ribosylační enzymatickou aktivitu a následně, spoji adjuvantní funkci.

Obrázek 1 ukazuje sekvenci regionu, ležícího pod disulfidem který odděluje A) a A₂ část. Uvnitř tohoto regionu je jedno argininové residuum, o kterém se soudí, zeje místem štěpení nezbytným pro aktivaci toxických vlastností molekuly. Tento region byl pozměněn místně řízenou mutagenesí takovým způsobem, aby se molekula stala necitlivou na proteolytické trávení a tím pádem netoxickou.

Místně řízená mutagenese je provedena hybridizací na jednořetězcový DNA syntetický oligonukleotid, který je komplementární kjednořetězcovému templátu kromě regionu chybného spárování blízko centra. To je ten region, který obsahuje požadovanou změnu nebo změny nukleotidů. Po hybridizací s jednořetězcovou cílovou DNA je oligonukleotid rozšířen DNA polymerasou za vytvoření dvouřetězcové struktury. Zářez je potom uzavřen DNA ligasou a duplexní struktura je transformována do E. coli hostitele. Teoretický výnos mutantů za použití této metody je 50%, díky semi-konzervativnímu způsobu DNA replikace. V praxi je výnos mnohem nižší. Existuje, nicméně, množství dostupných metod pro zlepšení výnosu a pro selekci pro oligonukleotidy řízených mutantů. Použitý systém využívá druhý mutagenní oligonukleotid pro vytvoření alterovaných restrikčních míst ve strategii dvojitých mutací.

Dalším krokem byla substituce jiné aminokyseliny za Arg (např. GGA = Gly nahrazuje AGA = Arg), za zachování čtecího rámečku a zároveň eliminace proteolytického místa, mLT byl

-9CZ 298131 B6 potom purifikován agarosovou afinitní chromatografií z jednoho mutantu (pDB95), který byl potvrzen sekvencováním. Alternativní metody purifikace budou odborníkům známé. Tento mutantní LT, označený je LT(_R|_92C) byl pak zkoumán SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou a modifikace trypsin senzitivní vazby. Vzorky byly zkoumány s a bez vystavení trypsinu a srovnány s nativním (nemodifikovaný). LT. mLT nedisocioval do A] a A₂, když byl inkubován s trypsinem, což ukazuje, že sensitivita k protease byla odstraněna.

Způsob podání mLT a nepříbuzných antigenů

V souladu s předkládaným vynálezem může být mLT podán v konjunkci s biologicky relevantním antigenem a/nebo vakcínou tak, aby zvyšoval imunitní odpověď na uvedený antigen a/nebo vakcínu, V preferovaném provedení je mLT a antigen podán simultánně ve farmaceutické kompozici obsahující účinné množství mLT a účinné množství antigenů. Způsob podání je orální. Příslušné množství antigenů a mLT se bude velmi lišit v závislosti na identitě využitého antigenů a druhu zvířete, které má být imunizováno. V. jednom provedení je počáteční podání mLT a antigenu následováno boostem příslušného antigenů. V jiném provedení není boost podán. Načasování boostu se může velmi lišit, v závislosti na antigenů a ošetřovaném zvířeti. Modifikace v rozsahu dávky a načasování boostu pro jakýkoliv daný druh a antigen je možné snadno určit rutinními experimenty. Při zvyšování imunitní reakce lze podat antigen, popřípadě v kombinaci s mLT perorálně, do nosu nebo parenterálně, v případě použití s mLT je výhodné orální podání.

Metody a kompozice podle předkládaného vynálezu jsou zamýšleny pro. použití jak u nezralých, tak u zralých obratlovců, zejména ptáků, savců a lidí. Použitelné antigeny, pouze jako příklady a nikoliv jako omezeni, mohou zahrnovat antigeny z patogenních kmenů bakterií (Streptococcus pyogenes, Streptococcus peneumoniae, Niesseria gonorhoeae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diptheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumonia, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis, Staphyloccocus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas auruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophyla, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallaidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgedorferi, Leptospira icterohemrrhagiea, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis čarinii, Francisella tularensis, Bručella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); patogenní houby (Coccidioides immitis, Aspergillus gumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Croptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); protozoa (Entamoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma thodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania brasiliensis, Pneumocyctis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); nebo helmihti (Enterobius vermicularis, Trichuris trichura, Ascaris lumbricoides, trichinela spiralis, Strongyloides stercoralis, Schisostoma japonicum,'Schisostoma mansoni, Schisostoma heimatobium, a měchovci) buď presentované imunitní systému ve formě celých buněk, nebo částečně izolované z média kultur projektovaných pro růst uvedených organismů, které jsou v oboru dobře známy, nebo ve formě protektivních antigenů od uvedených organismů získaných metodami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Jinými relevantními antigeny mohou být patogenní viry (například, ale nejenom: Poxviridae, Herpesviridae, Herpes simplex virus 1, Herpes simplex virus 2, Adenoviridae, papovaviridae, Enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, chřipkové viry, parainfluenza viry, viry spalniček, příušnic, respiračně syncyciální virus, virus zarděnek, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus hepatitidy A, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C, virus hepatitidy E, virus hepatitidy non A/non B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, a virus lidské imunodeficience), které jsou imunitnímu systému prezentovány buď celé, nebo jako části izolované z média kultur projektovaných pro růst takových virů, které jsou v oboru dobře známy,

- 10CZ 295131 B6 nebo ve formě protektivních antigenů od uvedených organismů získaných metodami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Další příklady relevantních antigenů zahrnují, ale nejsou jimi omezeny, vakcíny. Příklady takových vakcín zahrnují, ale nejsou omezeny na, chřipkovou vakcínu, vakcínu proti pertussi, difterický a tetanový toxoid kombinovaný s vakcínou proti pertussi, hepatitis A vakcínu, hepatitis B vakcínu, hepatitis C vakcínu, hepatitis E vakcínu, vakcínu proti Japonské encefalitidě, herpetickou vakcínu, spalničkovou vakcínu, zarděnkovou vakcínu, vakcínu proti příušnicím, smíšenou spalničkovou, příušnicovou a zarděnkovou vakcínu, papilomavirovou vakcínu, parvovirovou vakcínu, vakcínu proti respiračně syncyciálnímu viru, vakcínu proti Lymské boreliose, polio vakcínu, vakcínu proti malarii, vakcínu proti planým neštovicím, gonorhoea vakcínu, HIV vakcínu, schisostomiasa vakcínu, rota vakcínu, mykoplasma vakcínu, pneumokokovou vakcínu, meningokokovou vakcínu, a jiné. Tyto mohou být produkovány známými běžnými procesy. Obecně, taková vakcína obsahuje celý organismus nebo virus kultivovaný a izolovaný technikami dobře známými v oboru nebo obsahuje relevantní antigeny těchto organismů nebo virů, které jsou produkovány technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou. Jejich produkce je ilustrována, ale nikoliv omezena, následujícím.

Chřipková vakcína: vakcína obsahující celý nebo část hemaglutininu, neuraminidasy, nukleoproteinu a proteinu matrix, které je možné získat purifikací viru, který je kultivován na kuřecích embryích, s etherem a detergentem, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Vakcína proti pertussi: vakcína obsahující celý nebo část toxinu pertussi, hemaglutinin a K-aglutinin, které jsou získány zavirulentního toxinu s formalinem, který je extrahován vysolením nebo ultracentrifugací z bujónové kultury nebo bakteriálních buněk Bordetella pertussis, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntesou.

Difterický a tetanový toxoid kombinovaný s vakcínou proti pertussi: vakcína složená z vakcíny proti pertussii, tetanického a difterického toxoidu.

Vakcína proti japonské encefalitidě: vakcína obsahující celý nebo část antigenního proteinu, který je získán kultivací viru intracerebrálně u myší a purifikací virových partikulí centrifugací nebo ethylalkoholem a inaktivací tímtéž, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Vakcína proti hepatitidě B: vakcína obsahující celý nebo část antigenního proteinu, který je získán izolací a purifikací Hbs antigenů vysolením nebo ultracentrifugací, získaného z hepátitidý obsahující krve, nebo technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntesou.

Spalničková vakcína: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře buněk kuřecích embryí nebo na kuřecích embryích, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Zarděnková vakcína: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře buněk kuřecích embryí nebo na kuřecích embryích, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Vakcína proti příušnicím: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře králičích buněk nebo na kuřecích embryích, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Smíšená vakcína proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím: vakcína produkovaná smíšením vakcíny proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím.

-11LZ Z9SL5I B6

Rota vakcína: vakcína obsahující celý nebo část viru kultivovaného v kultuře Ma 104 buněk nebo izolovaného ze stolice pacienta, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Mykoplasmová vakcína: vakcína obsahující celé nebo část mykoplasmových buněk kultivovaných v tekutém kultivačním médiu pro mykoplasmata, nebo protektivní antigen získaný technikami genetického inženýrství nebo chemickou syntézou.

Tyto stavy, pro které může být pomocí předkládané metody dosaženo účinné prevence budou odborníkům známé.

Příprava kompozic vakcín podle předkládaného vynálezu může být připravena smísením výše zmíněných antigenů a/nebo vakcín s mLT v požadovaném poměru. Příprava musí být provedena přísně asepticky, a každá složka musí také být aseptická. Pyrogeny a alergeny musí přirozeně být odstraněny tak důkladně, jak je to možné. Antigenů přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být použity za přípravy antigenů per se a mLT separátně.

Dále vynález zahrnuje kit obsahující účinné množství antigenů a adjuvantně účinné množství mLT. Při použití mohou být složky kitu buď nejprve smíseny dohromady a potom podány orálně, nebo mohou být složky podány orálně odděleně během krátké doby.

Přípravky kompozic vakcín podle předkládaného vynálezu mohou být kombinovány buď s kapalnými, nebo pevnými farmaceutickými nosiči, a kompozice mohou být ve formě tablet, kapslí, prášku, granulí, suspenzí nebo roztoků. Kompozice mohou také obsahovat vhodné ochranné látky, barvicí a ochucovací činidla, nebo činidla, která zpomalují uvolňování. Potenciální nosiče, které mohou být použity v přípravě farmaceutických kompozic podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezena na želatinové kapsle, cukry, deriváty celulosy jako je karboxymethyl celulosu sodnou, želatinu, tulek stearát horečnatý, rostlinné oleje jako je burákovy oleu, atd., glycerin, sorbitol, agar a vodu. Nosiče mohou také sloužit jako vazebné sloučeniny pro usnadnění tabletování kompozic pro vyhovuj ící orální podání.

Přípravky kompozic vakcín podle předkládaného vynálezu mohou být udržovány ve stabilní skladovací formě pro snadné použití pomocí lyofilizace nebo jinými prostředky odborníkům známými. Pro orální podání může být vakcína rekonstituována jako suspense v pufrovaném fyziologickém roztoku, mléku, nebo jakémkoliv jiném fyziologicky kompatibilním tekutém médiu. Médium může být upraveno pro lepší poživatelnost přidáním barviv a ochucovacích činidel podle potřeby.

Podání přípravku kompozice vakcín může předcházet orální dávka účinného množství neutralizačního činidla žaludeční kyseliny. Ačkoliv pro tento účel může být použito mnoho sloučenin, preferován je bikarbonát sodný. Alternativně může být kombinace vakcíny podána v enterálních potažených kapslích, (tj. kapslích, které se rozpouští pouze po průchodu žaludkem).

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uvedeny pouze za účelem ilustrace .a žádným způsobem neomezují rozsah vynálezu.

Konstrukce mLT

Divoký typ ML toxinu je dokován přirozeně se vyskytujícím plasmidem nacházeným ve kmenech anterotoxigenních E. coli schopných produkce tohoto toxinu. Předkladatelé tohoto vynálezu již dříve klonovali LT gen z lidských izolátů E. coli označených H10407. Tento subklon se skládá z 5,2 kb DNA fragmentu z enterotoxinového plasmidu H10407 insertovaného do Pstl

-12CZ Z9813I B6 místa plasmidu pBR322 (Clements et al, 1983, Infect. Immunol. 40:653). Tento rekombinantní plasmid, označený pDF82, byl rozsáhle charakterizován a exprivoval LT za kontroly nativního LT promotoru. Dalším krokem v tomto procesu bylo umístění LT genu pod kontrolu silného promotoru, v tomto případě lac promotoru na plasmidu pUC18. Toto bylo provedeno izolací genů pro LT-A a LT-B separátně a jejich rekombinováním v kazetě ve vektorovém plasmidu. Toto byl důležitý krok, jelikož dovolil purifikaci významných množství LT a derivoval mutanty pro následnou analýzu. Tento plasmid, označený pBD94, je diagramaticky znázorněn na Obrázku 1.

Jak CT, tak LT jsou syntetizovány s trypsin senzitivní peptidovou vazbou, která připojuje Aj a A₂ části. Tato peptidová vazba musí být zlomena proto, aby molekula byla „toxická“. Toto také platí pro difterický toxin, prototyp A-B toxinu, a pro mnoho jiných bakteriálních toxinů. Pokud není Aj-A₂ vazba odstraněna, buď bakteriálními proteasami, nebo střevními proteasami v lumen střeva, např. proteolytickým zpracováním nebo aktivací, nemůže A| část dosáhnout svého cíle na bazolaterálním povrchu střevních epiteliálních buněk. Oproti CT, není LT plně biologicky aktivní, je-li poprvé izolován z buňky. LT také vyžaduje proteolýzu pro to, aby byl plně biologicky aktivní a proteolytická aktivita se nevyskytuje uvnitř bakterie. Proto, jedním prostředkem alterace toxicity molekuly bez ovlivnění ADP-ribosylační enzymatické aktivity by mělo být odstranění - pomocí genetické manipulace - trypsin sensitivní aminokyseliny, která spojuje A! a A₂ složky A podjednotky. Pokud nebude molekula enzymaticky štěpena, nebude toxická. Odborník by mohl předpokládat, že molekula by si měla nicméně uchovat DP ribosylační enzymatickou aktivitu a následně svoji adjuvantní funkci.

Obrázek 1 ukazuje sekvenci regionu pod disulfídem, který odděluje A_t a A₂ části. Uvnitř tohoto regionu je jedno argininové residuum, o kterém se soudí, že je místem štěpení nezbytným'pro aktivaci toxických vlastností molekuly. Tento region byl pozměněn místně řízenou mutagenesí takovým způsobem, aby se molekula stala necitlivou na proteolytické trávení a tím pádem netoxickou.

Místně řízená mutageneze je provedena hybridizací na jednořetězcový DNA syntetický oligonukleotid, který je komplementární kjednořetězcovému templátu kromě regionu chybného spárování blízko centra. To je ten region, který obsahuje požadovanou změnu nebo změny nukleotidů. Po hybridizací sjednořetězcovou cílovou DNA je oligonukleotid rozšířen DNA polymerasou za vytvoření dvouřetězcové struktury. Zářez je potom uzavřen DNA ligasou a duplexní struktura je transformována do E. coli hostitele. Teoretický výnos mutantů za použití této metody je 50%, díky semi-konzervativnímu způsobu DNA replikace. V praxi je výnos mnohem nižší. Existuje nicméně množství dostupných metod pro zlepšení výnosu a pro selekci oligonukleotidy řízených mutantů. Použitý systém využívá druhý mutagenní oligonukleotid pro vytvoření alterovaných restrikčních míst ve strategii dvojitých mutací.

Dalším krokem byla substituce jiné aminokyseliny za Arg (např. GGA = Gly nahrazuje AGA = Arg), za zachování čtecího rámečku a zároveň při eliminaci proteolytického místa. mLT byl potom purifikován agarosovou afinitní chromatografií z jednoho mutantu (pBD95), který byl potvrzen sekvencováním. Alternativní metody purifikace budou odborníkům známé. Tento mutantní LT, označený jako LT, označený jako LT (r^g) byl pak zkoumán SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou na modifikace trypsin sensitivní vazby. Vzorky byly zkoumány s a bez vystavení trypsinu a srovnány s nativním (nemodifikovaný) LT. mLT nedisocioval do A! a A₂, když byl inkubován s trypsinem, což ukazuje, že senzitivita k protease byla odstraněna.

Účinek mLT na Y-l adrenální buňky

Odborník bude předpokládat, že mLT nebude aktivní ve zkoušce Y-l adrenálních buněk. Tento předpoklad bude založen na předchozích zjištěních (Clements a Finkelstein, 1979, Infect. Immunol., 24: 760 - 769), že LT bez zlomů byl více než 1000 méně aktivní v tomto testovacím systému než CT a že ošetření trypsinem aktivovalo LT na stejnou úroveň biologické aktivity jako měl CT v tomto testu. Bylo předpokládáno, že residuální aktivita LT pozorovaná v tomto testu za

-13absence aktivace trypsinem byla funkcí nějaké residuální proteasové aktivity, která nebyla zhodnocena. Například, trypsin je použit v procesu subkultivace Y-l adrenálních buněk. Bylo proto předpokládáno, že LT, který nemohl být se zlomy, bude kompletně inaktivní v testu Y-l-*· ’ adrenálních buněk. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1.

Tabulka 1
Toxin Aktivace trypsinem	Specifická aktivita *
Cholera: toxin	15
LT	60
LT +	15
LT(R19 2 G) -	4,8,800
LT(R192G> +	48,800 .

* Minimální dávka (pikográmy na jamku) požadovaná pro produkci 050%) buněčného zaoblení.

Tabulka I demonstruje neočekávané zjištění, že mLT si uchovává bazální aktivitu v testu Y-l 4 adrenálních buněk, ačkoliv nemohl být enzymaticky zpracován. Jak je ukázáno v Tabulce I, CT a LT ošetřený trypsinem mají stejnou úroveň aktivity (15 pg) na Y-l buňky. Oproti tomu, mLT (48,000 pg) byl >1000 krát méně aktivní než CT nebo nativní LT a nemohl být aktivován trypsinem. Rezíduální bazální aktivita nepochybně odráží jinou a dosud neznámou aktivaci adrenálních buněk než je ta, která vyžaduje separaci Aj-A₂ vazby.

ADP-ribosylační enzymatická aktivita mLT

Protože mutace nahrazující Arg_]92 s Glyi₉₂ nealteruje enzymatické místo A] skupiny, bude odborník předpokládat, že mLT si zachová svou ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu. Pro zkoumání této vlastnosti byl využit NAD-Agmatine ADP—ribosyltransferasový test (Moss et al., 1993,

J. Biol. Chem. 268: 6383 - 6387). Jak je ukázáno na Obrázku 2, produkuje CT na dávce závislé zvýšení hladin ADP-ribosylagmatinu, funkce ADP-ťibosyltransferasové aktivity této molekuly.

-14CZ 298131 B6

Tabulka II

ADP-ribošyl.transferasová aktivita ,CT, nativního LT á

LT < r19 2 G )

Experiment	1.	2
žádný t.pxin	ND	9,12
IpgCT	ŇD	17,81
lOpgCT	ND	107,32
lOOpgCT	351,55	3‘61,73
lÓOpgLT	.17,32	14,48
1OOpgLT + trypsin	164,.10	189,89
lOOpg LT ( R 1 9 2 G )	14,58	12,34
lOOpg LT(R192G) +trypsin	14,73	8,9

3	4	prúměr+SEM
5,63	1.4,17	9,64 ±2,48
17,60	2'5,75	20,39 ± 2,68
107,32	104,04	107,55 ± 2,09
308,09	ND	340.,46 + 16,45
13,86	:ND	15,22 ±1,07
152,96	NĎ	168,98 ± 10,94
.9,30	ND	12,0’7 ± 1,53
10; 47	ND	11,37 ± 1.,74

ND žádná data data vyjádřená v ÍMolech min^-1

Tabulka II demonstruje v tabulkové formě neočekávané zjištění, že mLT postrádá jakoukoliv detekovatelnou ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu, s nebo bez aktivace trypsinem, ačkoliv enzymatická místa nebyla alterována a byla zde demonstrovatelná bazální hladina aktivity v testu Y-l adrenálních buněk.

Enterotoxická aktivita mLT

Vzhledem k neočekávanému zjištění, že mLT postrádá jakoukoliv detegovatelnou ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu, s nebo bez aktivace trypsinem, ačkoliv enzymatická místa nebyla alterována a dalšímu zjištění, že zde je bazální hladina aktivity v testu Y-l abrenálních buněk nebo jasné, zda si mLT uchovává jakékoliv své enterotoxické vlastnosti. Ideální adjuvantní formulace mLT by si měla uchovávat svou schopnost účinkovat jako imunologické adjuvans, ale měla by postrádat reálné nebo potenciální vedlejší účinky, jako je průjem, asociovaný s použitím LT nebo CT, Obrázek 3 demonstruje, že mLT neindukuje sekreci tekutin v patent-myším modelu, ani při dávce 125 pg. Tato dávka je více než pětinásobná vzhledem k adjuvantně účinné dávce pro LT v tomto modelu. Důležité je, že potenciální toxicita nativního LT může být pozorována při této hladině.

-15CZ Ζ9βΙ5Ι B6

Adjuvantní aktivita mLT

Odborník bude předpokládat, že jelikož mLT nevlastní žádnou demonstrovatelnou ADP-ribosyltransferasovou aktivitu a není enterotoxický, bude také postrádat adjuvantní aktivitu. Tento předpoklad bude založen na zprávě Lycke et aL, (Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277 2281), kde objasnil, že alterace, která ovlivňuje ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu toxinu a alteruje jeho schopnost zvyšovat intracelulární hladiny cAMP; také brání molekule účinkovat jako adjuvans. Jak je demonstrováno výše, mLT nemá ADP-ribosylační enzymatickou aktivitu a má pouze určitou nedefinovanou bazální aktivitu vY-1 adrenálních buňkách a neindukuje sekreci tekutin v patentním myším modelu.

Pro určení adjuvantní aktivity byl proveden následující experiment. Tri skupiny BABL-c myší byly imunizovány. Zvířata byla inokulována intragastricky tupě zakončenou krmící jehlou (Popper & Sons, lne. New Hyde Park, New York). V den 0 byla každá skupina imunizována následovně: Skupina A obdržela 0,5 ml PBS obsahující 5 mg OVA, skupina B obdržela 0,5 ml PBS obsahující 5 mg OVA a 25 pg nativního LT a skupina C obdržela 0,5 ml PBS obsahujícího 5 mg OVA a 25 pg mLT. Každý protokol byl opakovaně podán v den 7 a 14. V den 21 byla všem zvířatům podána i.p. další dávka 1 pg OVA v 20% Maalox. Jeden týden po i.p. inokulaci byla zvířata usmrcena a testována ELISA na sérové IgG a slizniční ígA protilátky proti OVA a LT,

Reagens a antiséra proti ELISA byla získána od Sigma Chemicals Co. Vzorky pro ELISA byly postupně ředěny ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (pH 7,2) -0,05% Tween 20 (PBS-Tween). Pro určení anti LT byly mikrotitrační, pláty předem potaženy 1,5 pg na jamku směsí gangliosidů (Typ III), potom 1 pg na jamku purifikovaného LT. Anti OVA byly určeny na mikrotitrační pláty a předem potaženy 10 pg na jamku OVA. Sérové anti-LT a anti-OVA byly určeny za použití králičího antiséra proti myším IgG konjugovaného s alkalickou fosfatasou. Slizniční anti-LT a anti-OVA IgA byly testovány za použití kozího antiséra proti myším IgA (alfa-řetězec specifické) po kterém následovalo králičí antíséram proti kozím IgG konjugované s alkalickou fosfatasou. Reakce byla ukončena 3N NaOH. Hodnoty pro IgG a IgA byly určeny ze standardní křivky s purifikovanými myšími myelomovými proteiny (MOCP 315, gA (IgA 12); MOPC 21, gGl: Litton Bionatics, lne., Charleston, CS).

Sérové IgG Anti-OVA

Jak je ukázáno na Obrázku 4A, zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérové IgG anti-OVA odpovědi po následné parenterální imunizaci OVA (4,058 pg/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detekovatelná anti OVA odpověď) (Student t-tešt ρ=ϋ,031). Signifikantně, zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérovou IgG ánti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (1,338 pg/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti OVA odpověď) (Student t-test p=0,0007).

Slizniční slgA Anti-OVA

Jak je ukázáno na Obrázku 4B, podobné výsledky byly získány, když byly anti-OVA IgA odpovědi srovnány uvnitř této stejné skupiny zvířat. Zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší slizniční IgA anti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA, (869 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti OVA odpověď) (Student t-test p= 0,0131). Stejně jako výše, zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu slizniční IgA anti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (230 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti OVA odpověď) (Student t-test p= 0,0189).

-16CZ 298131 B6

Sérové IgG Anti-LT

Schopnost LT a mLT zvyšovat anti LT proti látkovou odpověď u těchto stejných zvířat byla také zkoumána. Toto bylo důležité v tom, že to mohlo ukázat, zda je mutantní LT schopen zabránit 5 indukcí tolerance proti sobě samému kromě svého účinku jako adjuvans pro jiné proteiny. Jak je ukázáno na Obrázku 5A, zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérové IgG anti-LT odpovědi po následné parenterální imunizaci OVA (342 pg/ml) než ta, která byl primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detekovatelná anti LT odpověď) (Student t-test p=0,0005). 10 Zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu sérovou IgG anti-LT odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (552 pg/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti LT odpověď) (Student t-test p = 0,0026).

Slizniční slgA Anti-LT

Jak je ukázáno na Obrázku 5B, podobné výsledky byly získány, když byly anti-LT IgA odpovědi srovnány uvnitř této stejné skupiny zvířat. Zvířata, která byla primárně imunizována orálně OVA a LT vykazovala signifikantně vyšší slizniční IgA anti-LT odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (4,328 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a 20 následně imunizována parenterálně OVA (žádná detegovatelná anti LT odpověď) (Student t-test p=0,0047). Stejně jako výše, zvířata primárně imunizovaná orálně OVA a mLT také vykazovala signifikantně vyšší hladinu slizniční IgA anti-OVA odpověď po následné parenterální imunizaci OVA (1,463 ng/ml) než ta, která byla primárně imunizována OVA samotným a následně imunizována parenterálně OVA (žádná detekovatelná anti LT odpověď (Student t-test p=0,0323).

'

Uložení mikroorganismů

Následující plasmid byl uložen v Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 18.8.1994, a byl označen popsaným přírůstkovým číslem:

Plasmid Přírůstkové číslo pBD95 v E. coli LTR192G ATCC 69683

Popsaný a nárokovaný vynález není omezen v rozsahu specifickými provedeními zde popsanými, jelikož tato provedení jsou míněna jako ilustrace některých aspektů vynálezu. Ekvivalentní provedení spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Kromě toho, různé modifikace vynálezu, 35 kromě těch, které jsou zde popsány, jsou odborníkům zřejmá z předešlého popisu. Takové modifikace také spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Mělo by také být zřejmé, že všechna čísla párů bází a aminokyselinových zbytků a velikosti dané pro nukleotidy jsou přibližná a jsou použita za účelem popisu.

Je zde citováno množství odkazů a jejich objevy jsou zde uvedeny jako odkazy.

- 17CL ZVS131 B6

MICROORGANISMS

OatienarSbsai ineonneetton wtth tne 'riicrQgrgarMm rcfeneC to on pegas ^2^3. hneš 35-37 aru? t-3 qi tne aascnotion

A. IDENTÍFICAŤION OF DEPOSIT ‘ tůnner deposits are iHtnnfiee on an aggitrórut trteet *

Nunc of dcpauufý insatuoón * Aaencáb Type Cuiturt CůUtoion

AQdressof depositary msmutiori (including dostal cope ang countrý) '

12301 ParklewnDrÍve

RocáviUe. MD 20852

US

Dáte of deoosn ' August 18.. .1994 Accesston Number ‘ 69683

δ. ADOÍTlONAL INOICATIONS ' Dów Hu* d nt* iworti: Th» ndmraticn u conmad: on i «anu iww iten

C. DESIGNATED STATES FOR WHICH INOICATIONS ARE MADE ’ <,

D. SEPAŘATĚ AJRNI5HING OF ÍNDICAŤIQNS ' ňme ou* ,t y τη^ Η*φΕ«ρ<χα tutea iw* oe Miommaa to tne tmernanew Bieuu uter? (Šoaettv tn· qmwm nátur· 91 tM tTOcawu e.g.. -atxnúon Nirnoar ot Ohmů')

E. C This-shect vasreccivcd with efte Intenuopiúl appiícinon wtten fiied (to tediccted bythe reccrruig Officci EinoraRIvera. fiecetóns Office íá®»?⁵The dáte of reccijpt {from die Jpplicuit) by the Imenuteeiial Rtiretd .· wu rgrm PCÍ/W0/}34UdanuarY. láflt I fÁuchónzed Officer)

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mutantní forma termolabilního bakteriálního enterotoxinu holotoxinu Escherichia coli, ve kterém je aminokyselina Argl92 vpodjednotce A mutovaného holotoxinu nahrazena Glyl92, mutovaný holotoxin má podstatně sníženou toxicitu ve srovnání s nativním termolabilním enterotoxinem holotoxinem E. coli, uchovává s imunologicky adjuvantní účinnost při měření na buňkách Y-l nadledvinek, ale nemá ADP-ribosylační účinnost při použití NAD-Agmatinu a ADP-ribosyltransferázy.
2. 2. Mutantní forma bakteriálního aneteroxinu holotoxinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že kódovaná plasmidem pBD95, uloženým v E. coli LTR192G s přírůstkovým číslem ATTC 69683, u nějž dochází k expresi obou jednotek A i B termolabilního enterotoxinu E. coli.
3. 3. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje antigen v kombinaci s mutantní formou holotoxinu podle nároku 1 nebo 2.
4. 4. vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje vhodný nosič, ředidlo nebo pomocnou látku.
5. 5. Prostředek podle vyvolání imunitní odpovědi hostitele na patogen, vyznačující se tím, že obsahuje směs a) účinné množství antigenu a b) adjuvantně účinné množství mutantní. formy holotoxinu podle nároku 1 nebo 2.
6. 6. Kit pro vyvolání imunitní odpovědi hostitele na patogen, vyznačující se tím, že obsahuje dvě složky: a) účinné množství antigenu a b) adjuvantně účinné množství mutantní formy hvlvtoxmu podle nároku 1 nebo 2.
7. 7. Kit podle nároku 6, vyznačující se tím, že obsahuje obě složky v perorálne přijatelném nosiči, přičemž tyto složky je možno podávat po vzájemném smísení nebo odděleně v krátkém časovém odstupu.
8. 8. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje bakteriální antigen patogenní bakterie, vybrané ze skupiny Streptococcus pyogenes, Streptococus pneumoniae, neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium butolinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ožaénae, Klebsiella rhinoscleromatis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Cympylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsilla tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia, pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertunue, Treponema carateneum, Borelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugamushi aChlamydia spp.
9. 9. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen houby ze skupiny Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Ciyptococcus neoformans a Histoplasma capsulatum.
10. 10. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen prvoka ze skupiny Entamoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas, hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma

    -19CZ 298131 B6 gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania, donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumoniae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum a Plasmodium malariae.
11. 11. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen helmintů ze skupiny Enterobius vermicularis, Trichuris Trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides Stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haemotobium a Ancylostoma spp.
12. 12. Vakcína podle nároků 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje virový antigen ze skupiny Poxviridae, Herpesviridae, Herspes Simplex virus 1, Herpes Simplex virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Roeviridae, Retroviridae, virus influenzae, virus parainfluenzae, virus příušnic nebo spalniček, syncytíální respirační virus, virus zarděnek, Arbeviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus hepatitidy A, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C, virus hepatitidy E, Rhinoviridae, Coronaviridae a Rotaviridae.
13. 13. Vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje antigen ze skupiny vakcín proti chřipce, černému kašli, záškrtu, záškrtu a tetanovému toxoidu v kombinaci s vakcínou proti černému kašli, vakcínu proti hepatitidě A, hepatitidě B, hepatitidě C, hepatitidě E, vakcínu proti japonské encefalitidě, proti herpetickému viru, proti spalničkám, zarděnkám, příušnicím, směsnou vakcínu proti spalničkám, zarděnkám a příušnicím, proti papillomaviru, parvoviru, respiračnímu syncytiálnímu viru, proti Lymské nemoci, proti dětské obrně, malárií, planým neštovicím, kapavce, proti Schistosomiase, vakcínu proti rotaviru, Campylobacter spp., vakcínu proti choleře, enteropathogenní E. coli, enterotoxické E. coli, proti mycoplasmatům, pneumokokům a meningokokům a b) prostředek podle nároku 1.
14. 14. Vakcína podle nároku 3 nebo 4, prostředek podle nároku 5 nebo kit podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že antigen je odvozen od enterotoxického bakteriálního organismu.
15. 15. Vakcína, prostředek nebo kit podle nároku 14, vyznačující se tím, že enterotoxický bakteriální organismus se volí ze skupiny organismů, u nichž dochází k expresi toxinů, podobných toxinům cholery.
16. 16. Vakcína, prostředek nebo kit podle nároku 15, vyznačující se tím, že se enterotoxický bakteriální organismus volí ze skupiny Escherichia spp. a Vibrio spp.
17. 17. Mutantní forma enterotoxinu holotoxínu podle nároku 1 nebo 2 pro použití v lékařství.
18. 18. Použití směsi a) účinného množství antigenu a b) adjuvantně účinného množství a mutantní formy holotoxínu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiva pro vyvolání nebo udržení ochranné nebo adaptivní imunitní odpovědi hostitele na antigen.
19. 19. Použití podle nároku 18, při něž je vyvolávána nebo udržována sérová odpověď.
20. 20. Použití podle nároku 18, při němž je produkována nebo udržována slizniční odpověď.
21. 21. Použití podle nároku 18, při němž je podávaný antigen odvozen z bakterií, virů, prvoků, hub, helmintů a jiných mikrobiálních patogennů.
22. 22. Použití podle nároku 18, při němž léčivo obsahuje jednotlivou dávku směsi.

    -20CZ Z95IJ1 B6
23. 23. Použití mutantní formy holotoxinu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu vakcíny pro vyvolání ochranné imunitní odpovědi proti enterotoxickému bakteriálnímu organismu.
24. 24. Použití podle nároku 23, při němž se enterotoxický bakteriální organismus volí ze skupiny 5 organismů, u nichž dochází k expresi toxinů, podobných toxinům cholery.
25. 25. Použití podle nároku 23, při němž se enterotoxický bakteriální organismus volí ze skupiny Escherichia spp. a Vibrio spp.