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CN1761684A - 具有延长的体内半衰期的生理学活性多肽缀合物 - Google Patents

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CN1761684A
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裴城敏
林昌基
权世昌
李宽淳
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Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

一种具有生理活性的、体内半衰期被延长的蛋白质缀合物，其包括：i)一种生理学活性多肽，ii)一种非肽聚合物(non－peptidic polymer)，和iii)一种免疫球蛋白，由于其被增强的体内稳定性和被延长的血液半衰期，该蛋白质缀合物对于多肽药物的开发是有益的，同时它还减少了诱发免疫应答的可能性。

Description

具有延长的体内半衰期的生理学活性多肽缀合物
技术领域
本发明涉及一种具有延长的体内半衰期的长效蛋白及其制备方法。
背景技术
多肽在血液、肝脏或肾脏内容易发生变性或酶解。因为多肽的低稳定性，为了保持活性物质的有效血浆浓度，所以要求以持续的频率施用对患者施用多肽药物。此外，因为多肽药物通常是通过注射被施用.施用，所以多肽药物的频繁注射给患者造成了相当的不便。因此，已有许多研究在开发具有被提高的血液循环半衰期并同时保持其高药理功效的多肽药物。这些想得到的多肽药物也应当满足了对提高的血清稳定性、高活性、对各种多肽的可应用性以及当注射到患者体内时诱发非所需的免疫应答的低可能性的要求。
用于提高蛋白质稳定性的最常用的方法之一是用高度可溶的大分子，例如聚乙二醇(“PEG”)，对多肽进行化学修饰，该大分子阻止了多肽与蛋白酶的接触。也熟知的是当PEG被特异地或非特异地连接到多肽药物时，PEG增加了多肽药物的可溶性并防止其被水解，从而增加了多肽药物的血清稳定性，并且因为它的低抗原性而不引起任何免疫应答(Sada et al.，J.Fermentation Bioengineering，1991，71：137-139)。但是，这些PEG化(pegylated)多肽所具有的缺点是当PEG的分子量增加时降低了活性物质的活性和产量。在US5,738,846和WO 92/16221中分别公开了与两个被激活的PEG缀合的干扰素和被连接到两个具有不同活性的多肽上的PEG间隔物；但是在延长生理学活性多肽的体内活性方面，它们没有显示出任何突出的效果。
也报道了通过经异质双功能(hetero-bifunctional)PEG将重组人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)共价连接到白蛋白上可延长G-CSF的循环半衰期(Kinstler et al.，Pharmaceutical Research，1995，12(12)：1883-1888)。但是，经修饰的G-CSF-PEG-白蛋白的稳定性只比真G-CSF(authentic G-CSF)高4倍，因此它还不能被投入到实践应用中。
作为另一种增强生理学活性多肽的体内稳定性的方法，通过利用重组技术在转化体中生成了与稳定的蛋白质融合的活性多肽。例如，已知白蛋白是用于增强与其融合的多肽的稳定性的最有效的蛋白质中的一种，已经报道的这样的融合蛋白有很多(WO 93/15199和WO93/15200，和EP 413,622)。但是，与白蛋白结合的融合蛋白仍有活性被降低的问题。
US 5,045,312公开了一种为了增强生长激素的活性，使用交联剂，例如碳化二亚胺、戊二醛、酰基氯等将生长激素缀合到牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白上的方法。但是，这一方法是单独地针对于增强靶生长激素的活性。另外，使用化学化合物例如碳化二亚胺、戊二醛、酰基氯等作为交联剂是不利的，这是由于它们强烈的毒性和反应的非特异性。
已经报道了免疫球蛋白能用作抗体以呈现出依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)的抗体，糖链在ADCC及CDC中发挥了重要作用(Burton D.，Molec.Immun.22，161-206，1985)。尽管缺失糖链，无糖基化免疫球蛋白具有与糖基化免疫球蛋白相似的血液半衰期，但是由于去糖基化，它对补体或受体的亲和力下降了10到1000倍(Waldmann H.，Eur.J.Immnunol.23，403-411，1993；Morrison S.，J.Immunol.143，2595-2601，1989)。
尽管在将生理学活性多肽与各种大分子进行组合方面已经进行了很多的尝试，但是所有的尝试都不能达到同时增加稳定性和活性。
作为一种用于增强活性多肽的稳定性并同时保持其体内活性的改进方法，本发明提供了一种蛋白质缀合物，其包括彼此共价连接的一种生理学活性多肽、一种非肽聚合物和一种免疫球蛋白缀合物。
发明概述
因此，本发明的第一个目的是提供一种具有体内半衰期被延长的生理学活性多肽的、且不诱导患者体内的免疫应答、同时将多肽活性的减低最小化的蛋白质缀合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备包括共价连接的一种生理学活性多肽、一种生物相容性的非肽聚合物和一种免疫球蛋白的蛋白质缀合物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种包括具有延长的体内半衰期的所述的生理学活性多肽的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种增强生理学活性多肽的体内稳定性并延长其循环半衰期且不牺牲其活性的方法。
附图说明
结合附图，根据本发明以下的描述，本发明的上述以及其他的目的和特征将是显而易见的，所述各附图如下：
图1：hGH-PEG-IgG缀合物的层析；
图2：hGH-PEG-IgG缀合物的SDS-PAGE结果；
图3：干扰素-PEG-IgG缀合物的SDS-PAGE结果；
图4：在DDT处理之前和之后的hGH-PEG-IgG缀合物的SDS-PAGE结果；
图5：IFNα-PEG-IgG缀合物的反相HPLC层析；
图6：hGH-PEG-IgG缀合物的质谱；
图7：显示hGH-PEG-IgG缀合物具有优于PEG-hGH复合物的血清稳定性的药物代谢动力学图。
图8：显示促红细胞生成素-PEG-IgG缀合物相对于游离的促红细胞生成素或通过高糖基化稳定的促红细胞生成素，具有增强了的循环半衰期的药物代谢动力学图；
图9：无糖基化IgG(AG IgG)的质谱；
图10：显示IFNα-PEG-AG IgG缀合物相对于野生型IFNα具有增强了的血液稳定性，并且尽管缺失了糖链但保持了它的活性的药物代谢动力学图；
图11：显示EPO-PEG-AG IgG缀合物相对于比野生型IFNα具有增强了的血液稳定性，并且尽管缺失了糖链但保持了它的活性的药物代谢动力学图；
图12：显示Fab′-S-PEG-N-IgG和Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物相对于野生型Fab′和Fab′-S-40K PEG复合物具有增强了的循环半衰期的药物代谢动力学图；
图13：显示Fab′、Fab′-S-40K PEG复合物、Fab′-S-PEG-N-IgG缀合物和Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物的体内活性。
图14：基于仅注射载体(30μg/天，组1)、野生型hGH(30μg/天，组2)、hGH-PEG(30μg/天，组3)、hGH-PEG-IgG缀合物(30μg/天，组4)和hGH-PEG-IgG缀合物(10μg/天，组4)之后鼠的时间依赖性的体重变化的hGH-PEG-IgG缀合物的体内活性。
图15：基于在未处理组(组1)、仅注射载体(组2)、野生型G-CSF(组3)、20kDa PEG-G-CSF(组4)、和17S-G-CSF-PEG-IgG缀合物治疗(组5)中的时间依赖性的中性粒细胞数目变化的G-CSF-PEG-IgG缀合物的体内活性；和
图16：基于在仅注射溶剂(组1)、野生型EPO(组2)、高糖基化的EPO(组3)、和EPO-PEG-IgG缀合物治疗(组4)中的时间依赖性的红细胞比容的数目变化的EPO-PEG-IgG缀合物的体内活性。
具体实施方案
本文所用术语“生理学活性多肽”是指当对包括人在内的哺乳动物施用时，任何具有有益的生物学活性的多肽或蛋白，它与术语“生理活性蛋白”、“活性蛋白”、“活性多肽”或“肽药物”可互换使用。
术语“蛋白质缀合物”或“缀合物”是指一种包括根据本发明彼此共价连接的一种生理学活性多肽、一种非肽聚合物和一种免疫球蛋白的化合物。
区别于术语“缀合物”，本文所用术语“复合物”的意思是那些仅包括选自一种生理学活性多肽、一种免疫球蛋白和一种非肽聚合物中的两种成分的化合物。
术语“非肽聚合物”是指一种包括至少两种单体的生物相容性聚合物，其中所述单体通过任何不同于肽键的共价键连接在一起。
根据本发明的一个方面，提供了一种蛋白质缀合物，其包括：i)一种生理学活性多肽，ii)一种非肽聚合物，以及iii)一种免疫球蛋白，它们是彼此共价地连接的，并且生理学活性多肽的体内半衰期被延长。
例如，发明的蛋白质缀合物可以包括至少一个单位结构的[活性多肽/非肽聚合物/免疫球蛋白]，其中所有的成分以线性形式被共价连接。非肽聚合物可以在其两个末端具有两个反应基团，通过这两个反应基团聚合物分别被共价地连接到生理学活性多肽和免疫球蛋白上。在一个优选的实施方案中，两种生物活性多肽和非肽聚合物的复合物可被共价地连接到免疫球蛋白上。
生理学活性多肽对免疫球蛋白的摩尔比的范围可以从1∶1到10∶1，优选地为1∶1到4∶1。
一种类型的聚合物以及不同类型的聚合物的组合可被用作为非肽聚合物。
在本发明的蛋白质缀合物中，免疫球蛋白的合适的结合位点可以包括免疫球蛋白的可变区或恒定区的氨基酸残基的游离功能基团。用于与非肽聚合物或活性多肽共价结合的免疫球蛋白的合适位点可以包括可变区内的氨基末端基团、赖氨酸残基或组氨酸残基的氨基、半胱氨酸的游离SH基团，非肽聚合物的合适的位点是末端的反应基团。
免疫球蛋白可以选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和IgG的所有亚型如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。为了不诱导患者体内的免疫应答，免疫球蛋白优选是人免疫球蛋白。
作为构成本发明的蛋白质缀合物的一种成分，免疫球蛋白可以是分离自血液的天然免疫球蛋白或是通过遗传工程所制备的重组免疫球蛋白。用氨基酸残基的取代、缺失或添加在免疫球蛋白中的不同位点修饰的任何免疫球蛋白及其任何高糖基化、低糖基化或无糖基化的衍生物也可以被用于本发明，只要这些免疫球蛋白或衍生物在其功能、结构和稳定性方面完全等价于野生型免疫球蛋白。用任何一种传统方法例如化学的方法、酶的方法和生物技术的方法可以实现糖基化或去糖基化程度的增加或减少。已知免疫球蛋白G的第214到238位、297到299位、318到322位和327到331位氨基酸残基是结合的重要位点，可被用作用于修饰的合适位点。
合适的非肽聚合物具有选自由乙醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组的反应基团。琥珀酰亚胺衍生物可以选自由琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基和琥珀酰亚胺基碳酸酯所构成的组。在其两末端具有乙醛基的非肽聚合物可有效地使非特异结合最小化，从而在该聚合物的每个末端分别将非肽聚合物与生理学活性多肽和免疫球蛋白相连接。乙醛基的还原烷基化所生成的蛋白质缀合物比用酰胺基所结合的蛋白质缀合物更为稳定。
非肽聚合物的两个末端的反应基团可以是彼此相同的或不同的。例如，非肽聚合物可以在一个末端具有马来酰亚胺基团，在另一个末端具有马来酰亚胺基团、乙醛基或丙醛基。当聚乙二醇被用作非肽聚合物时，商品化可获得的产品可被用于制备本发明的蛋白质缀合物；或在结合反应之前，商品化的PEG的末端羟基可被进一步转化成其他的反应基团。
非肽聚合物可以用作间隔基，它分别共价连接免疫球蛋白的氨基末端、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基以及生理学活性多肽的其中一个反应基团。
非肽聚合物是优选地选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚(乳酸-乙醇酸)、可生物降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合所构成的组。本领域已知的上述非肽聚合物的衍生物可被用于相同的目的。更优选的非肽聚合物是聚乙二醇。非肽聚合物的分子量可以从500到100,000，优选地从500到20,000。
先前所报道的用于通过基因克隆将两种多肽结合起来的交联剂，例如寡肽，增加了非所需的免疫应答的可能性并将结合位点限定于所述多肽的N末端或C末端。因此，使用非肽聚合物相对于使用寡肽的其中一个优点在于毒性和免疫原性的减低。另一个优点是结合位点的多样性所造成的它的广泛的可适用性。
当小的化学化合物，例如碳化二亚胺和戊二醛被用作交联剂时，可以造成将被连接其上的多肽的变性或可以阻碍产物的可控的结合及纯化。与这些化学品相反，在控制所形成的缀合物的结合、纯化缀合物以及使非特异结合反应最小化的容易性方面，包括一种非肽聚合物的本发明的蛋白质缀合物是有优势的。
本发明的蛋白质缀合物显示出延长的体内半衰期以及明显优于多肽-PEG复合物或多肽-PEG-白蛋白质缀合物的活性。根据药物代谢动力学分析，本发明的hGH-PEG-IgG缀合物的半衰期比野生型hGH长约13倍，而hGH-PEG复合物和hGH-PEG-白蛋白缀合物的半衰期分别比野生型蛋白长7倍和5倍(见测试实施例2，表3)。从用G-CSF、17S-G-CSF、干扰素或EPO取代hGH的测试中得到了相似的结果。与仅被PEG修饰或PEG-白蛋白复合物所修饰的活性多肽复合物相比较，本发明的蛋白质缀合物在平均滞留时间(“MRT”)和血清半衰期上都表现出相当大的增加，它们比传统复合物的MRT和血清半衰期要高出2-70个因子(见测试实施例2，表4-7)。另外，本发明的Fab′-PEG-IgG缀合物，即其中IgG-PEG复合物被分别连接到邻近于Fab’的C末端或Fab的N末端的SH基团的Fab′-S-PEG-N-IgG和Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物，呈现其血清半衰期比Fab′-S-40K PEG复合物的血清半衰期高2-3倍(见测试实施例3和图12)。
另外，通过采用无糖基化免疫球蛋白所制备的蛋白质缀合物表现出与那些相应的包括糖基化免疫球蛋白的蛋白质缀合物相似的血液半衰期和体内活性(见表4、7和9，以及图10和11)。
药物代谢动力学分析的结果表明应用于不同的多肽的本发明的蛋白质缀合物在血液半衰期和MRT方面表现出极好的性能特征，因此可以被有利地用于制备具有延长的体内半衰期的多肽药物剂型，所述不同的多肽包括hGH、干扰素、EPO、G-CSF或它们的衍生物和抗原片段。
另外，根据使用动物模型的体内试验，本发明的hGH-PEG-IgG缀合物表现出极好的体内活性。具体地，通过以对应于1/3野生型剂量的量每6天给药hGH-PEG-IgG缀合物一次所产生的效果等同于或优于每天给药野生型所产生的效果，这意味着hGH-PEG-IgG缀合物的体内活性比野生型的体内活性高超过3倍(见图14)。
本发明的17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG缀合物呈现出比20kDaPEG-G-CSF复合物高3倍的体内活性；对于相同的给药总量，当每5天给药1次时，它所产生的恢复中性粒细胞的疗效比每日给药的野生型G-CSF高2倍(图15)。此外，本发明的EPO-PEG-IgG缀合物诱导了比野生型EPO和高糖基化EPO更高和更快的红细胞比容水平的增加速度并且长时间地保持这样高的体内活性(图16)。
这些结果表明本发明的蛋白质缀合物显著地增加了生理学活性多肽的血液半衰期和体内活性，同时克服了野生型多肽需频繁给药的问题。
生理学活性多肽的实例类型包括以下的多肽、突变蛋白和它们的其他类似物：激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体。
适合于制备本发明的蛋白质缀合物的生理学活性多肽的特定的实例包括人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素(例如干扰素α、β和γ)、集落刺激因子、白介素(例如白介素-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7，-8，-9，-10，-11，-12，-13，-14，-15，-16，-17，-18，-19，-20，-21，-22，-23，-24，-25，-26，-27，-28，-29和-30)、葡糖脑苷脂酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、载脂蛋白E、促红细胞生成素、高糖基化的促红细胞生成素、VII因子、VIII因子、IX因子、纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素(leptin)、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成骨生长因子、成骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心房肽(atriopeptin)、软骨诱导因子、结缔组织激活蛋白、促卵泡激素、促黄体素、FSH释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、胰泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、受体(例如，TNFR(P75)和TNFR(P55))、受体拮抗剂(例如IL1-Ra)、细胞表面抗原(例如，CD2，3，4，5，7，11a，11b，18，19，20，23，25，33，38，40，45和69)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和病毒来源的疫苗抗原。
抗体片段指的是能结合特异性抗原的抗体的片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和scFv，其中优选Fab’。Fab片段由抗体的轻链和重链的可变区及第一恒定区(CH1区)组成；Fab’片段为Fab片段加上连接到CH1区的C末端的几个含有一个或多个来自绞链区的半胱氨酸残基的氨基酸残基；F(ab’)2片段是通过二硫键或通过化学反应彼此连接起来的两个Fab’片段；Fd片段是重链的可变区和第一恒定区(CH1)。scFv片段是由通过连接肽彼此连接的重链和轻链的可变区所构成的单多肽链。
特别优选的多肽是一种选自由人生长激素、干扰素(例如干扰素α、β和γ)、粒细胞集落刺激因子和促红细胞生成素所构成的组的多肽，这是因为为了治疗或预防相关疾病的目的，这些多肽比其他的多肽更需要频繁给药这一事实。
可应用本发明的生理学活性多肽的列表并不限定于上述所引用的多肽，还包括它们的任何突变蛋白或衍生物，因为这些突变蛋白或衍生物的功能、结构、活性和稳定性被认为是等价于或优于野生型多肽的。
本发明的另一方面是提供一种制备所述蛋白质缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将非肽聚合物至少一种生理学活性多肽、至少一种免疫球蛋白与至少一种其两个末端具有反应基团的非肽聚合物共价地连接；(b)分离主要包括共价连接的生理学活性多肽、免疫球蛋白和非肽聚合物的蛋白质缀合物。
在上述方法的步骤(a)中，可以用两步反应或同步反应共价地连接多肽、免疫球蛋白和非肽聚合物。两步反应(例如，将非肽聚合物共价地连接到活性多肽或免疫球蛋白上，然后将所形成的复合物共价地连接到活性多肽或免疫球蛋白上以产生它们的缀合物，其中活性多肽和免疫球蛋白是经非肽聚合物彼此连接)在减少非所需的副产物的产量上是有优势的。
因此，上述方法的步骤(a)可以包括：
(a1)将非肽聚合物的一个末端与免疫球蛋白或生物活性多肽共价地结合非肽聚合物；
(a2)从反应混和物中分离出包括与免疫球蛋白或生理学活性多肽相结合的非肽聚合物的复合物；和
(a3)将上述复合物的非肽聚合物的游离末端与免疫球蛋白或生理学活性多肽共价地结合非肽聚合物，以生成蛋白质缀合物，该缀合物中非肽聚合物共价地连接到生理学活性多肽和免疫球蛋白上。
在步骤(a1)中的生理学活性多肽与非肽聚合物的摩尔比可以优选从1∶2.5到1∶5，步骤(a1)中的免疫球蛋白与非肽聚合物的摩尔比优选从1∶5到1∶10。在步骤(a2)中所得到的复合物与步骤(a3)中的生理学活性多肽或免疫球蛋白的摩尔比可以是1∶0.5到1∶20，优选1∶1到1∶5。
步骤(a1)和(a3)可以优选在有还原剂存在时进行，还原剂可以选自由氰基硼氢化钠、硼氢化钠、二甲胺硼酸盐和吡啶硼酸盐所构成的组。
根据对所形成的缀合物的所需纯度的程度和缀合物包括分子量在内的特性和带电情况，用于进行步骤(a2)和(b)的操作可以依据用于纯化蛋白的传统方法例如尺寸排阻层析、离子交换层析等及其组合。
本发明再一方面是提供了一种与未修饰的多肽相比，具有延长的体内半衰期的生理学活性多肽的药物组合物，它包括本发明的蛋白质缀合物和药学上可接受的载体(赋形剂)。
本发明的药物组合物可以经各种途径给药，包括口服、经皮、皮下、静脉和肌肉内导入(introduction)施用药物组合物，更优选注射。可以通过采用任何一种本领域熟知的方法配制本发明的组合物，以提供一种在其对患者给药后活性成分被施用快速地、持续地或延迟地释放，。制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、囊剂、酏剂(elixir)、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软的和硬的胶囊、无菌可注射溶液、无菌包装粉剂等等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂的例子有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂还可以包括填充剂、抗凝集剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等等。
应当根据各种相关因素决定所实际施用的活性成分的量，所述相关因素包括所治疗的疾病、所选择的给药途径、年龄、性别和个体患者的体重、以及患者症状的严重程度、特别是活性成分的种类。由于本发明的蛋白质缀合物的被增强的稳定性，可以显著地减少所施用的包含蛋白质缀合物的多肽药物制剂的总量和频率。
本发明在以下实施例中被进一步阐释。应当了解这些实施例虽然说明了本发明的优选的实施方案，但它只是用于举例说明，而非对本发明的范围的限制。
实施例1：hGH-PEG-IgG缀合物I的制备
(步骤1)hGH-PEG复合物的制备
将人生长激素(hGH，M.W.22kDa)溶解于100mM磷酸缓冲液中，至浓度为5mg/ml，并将在其两末端都含有乙醛基的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD，Shearwater Inc，USA)(分子量为3.4kDa)以相应于1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10或1∶20的hGH∶PEG摩尔比的量加入到所形成的缓冲溶液中。将氰基硼氢化钠(NaCNBH3，Sigma)作为还原剂加入到其中至终浓度为20mM，在4℃下搅拌反应混和物3个小时。为了分离hGH-PEG复合物，其中PEG被选择性地以1∶1的摩尔比连接到hGH的末端氨基上，将反应混和物在Superdex(Pharmacia，USA)上进行尺寸排阻层析。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)从柱上洗脱并纯化出hGH-PEG复合物以去除污染物例如未修饰的hGH、未反应的PEG和在PEG的两末端上都连接有两分子hGH的二聚体副产物。将纯化的hGH-PEG复合物浓缩至5mg/ml。已经发现为获得最佳结果，最优化的hGH∶PEG摩尔比是1∶2.5-1∶5的范围内。
(步骤2)hGH-PEG复合物和IgG之间的缀合物的形成
将分子量为150kDa的免疫球蛋白G(IgG，Green Cross，Korea)溶解于100mM磷酸缓冲液中。为了将IgG缀合到在实施例1中所纯化的PEG-hGH复合物的乙醛基上，PEG-hGH复合物被以对应于hGH-PEG复合物∶IgG的摩尔比为1∶1、1∶2、1∶4或1∶8的量加入到含IgG的缓冲液中。将NaCNBH3作为还原剂加入其中至终浓度为20mM，并在4℃下轻轻地搅拌反应混和物20个小时。为了在缀合反应之后从污染物中纯化出hGH-PEG-IgG缀合物，将反应混和物用经20mM Tris缓冲液(pH 7.5)平衡的DEAE柱(Pharmacia，USA)进行阴离子交换层析。将流动相从缓冲液A(20mM Tris缓冲液，pH 7.5)转换到具有线性浓度梯度(NaCl浓度：0M→0.5M)的缓冲液B(含有1.0M NaCl的20mM Tris缓冲液，pH 7.5)中。为了从所洗脱的hGH-PEG-IgG缀合物中去除少量的未反应的IgG和未修饰的hGH，将洗脱溶液用经10mM乙酸钠(Ph4.5)平衡的polyCAT柱(PolyLC，美国)的阳离子交换层析。将流动相从缓冲液A(10mM乙酸钠，pH4.5)转换到具有线性浓度梯度(NaCl浓度：0M→0.5M)的缓冲液B(含有1.0M NaCl的10mM乙酸钠，pH 7.5)中，这造成纯化hGH-PEG-IgG缀合物(图1)。
已经发现为获得最佳结果的最优化的hGH-PEG复合物∶IgG摩尔比是1∶4。
实施例2：hGH-PEG-IgG缀合物II的制备
(步骤1)IgG-PEG复合物的制备
将IgG(Green Cross，Korea)溶解于100mM磷酸缓冲液中至浓度为15mg/ml，并将3.4kDa的ALD-PEG-ALD(Shearwater Inc，USA)以相应于1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10或1∶20的IgG∶PEG摩尔比的量加入到所形成的缓冲溶液中。将NaCNBH3作为还原剂加入到其中至终浓度20mM，在4℃下搅拌反应混和物3个小时。为了分离其中PEG被选择性地以1∶1的摩尔比连接到IgG的末端氨基上的IgG-PEG复合物，将反应混和物在Superdex(Pharmacia，USA)上进行尺寸排阻层析。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)从柱中洗脱并纯化出IgG-PEG复合物以去除污染物例如未修饰的IgG、未反应的PEG和在PEG的两末端上都连接有两分子IgG的二聚体产物。将纯化的IgG-PEG复合物浓缩至1 5mg/ml。已经发现为了得到最佳结果，最优化的IgG∶PEG摩尔比是在1∶5到1∶10的范围内。
(步骤2)IgG-PEG复合物和hGH之间的缀合物的形成
为了将hGH(分子量22kDa)缀合到在实施例1中所纯化的IgG-PEG复合物上，将溶解于100mM磷酸缓冲液中的hGH与IgG-PEG复合物以1∶1、1∶1.5、1∶3或1∶6的摩尔比反应。将NaCNBH3作为还原剂加入其中至终浓度为20mM，并在4℃下搅拌反应混和物20个小时。根据与实施例1的步骤2所描述的相同的方法将反应混和物进行纯化以去除未反应物质和副产物，并从中纯化出hGH-PEG-IgG缀合物。
实施例3：IFNα-PEG-IgG缀合物的制备
根据在实施例1中所描述的相同的方法制备并纯化IFNα-PEG-IgG缀合物，除了用干扰素α2b(IFNα2b，分子量20kDa)取代hGH，IFNα2b∶ALD-PEG-ALD(分子量3.4kDa)的摩尔比为1∶5。
实施例4：人G-CSF-PEG-IgG缀合物的制备
根据在实施例1中所描述的相同的方法制备并纯化G-CSF-PEG-IgG缀合物，除了用人粒细胞集落刺激因子(G-CSF，分子量18.7kDa)取代hGH，G-CSF∶ALD-PEG-ALD(分子量3.4 kDa)的摩尔比为1∶5。
此外，根据上面描述的相同的方法用G-CSF衍生物(17S-G-CSF)制备并纯化G-CSF衍生物-PEG-IgG缀合物，其中用丝氨酸取代野生型G-CSF的第17位氨基酸得到所述衍生物。
实施例5：EPO-PEG-IgG缀合物的制备
根据在实施例1中所描述的相同的方法制备并纯化EPO-PEG-IgG缀合物，除了用人促红细胞生成素(EPO，分子量35kDa)取代hGH，EPO∶ALD-PEG-ALD(分子量3.4kDa)的摩尔比为1∶5。
实施例6：用具有不同的功能基的PEG制备蛋白质缀合物
用在其两末端都具有不同的功能基而非乙醛基的PEG按照如下制备hGH-PEG-IgG缀合物。将溶解于100mM磷酸缓冲液的10mghGH与在其两末端都含有琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)的PEG(SPA-PEG-SPA，Sharter Inc，USA，分子量3.4kD)以对应于hGH∶PEG的摩尔比为1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10或1∶20的量反应。将反应混和物在室温下搅拌2个小时。为了得到其中PEG被选择性地按1∶1的摩尔比连接到hGH的赖氨酸残基上的hGH-PEG复合物，将反应混和物在Superdex(Pharmacia，USA)上进行尺寸排阻层析。用10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)从柱中洗脱并纯化出hGH-PEG复合物以去除污染物例如未修饰的hGH、未反应的PEG和在PEG的两末端上连接有两分子hGH的二聚体副产物。将纯化的IgG-PEG复合物浓缩至5mg/ml。根据实施例1中所描述的相同方法用浓缩的hGH-PEG复合物制备hGH-PEG-IgG缀合物。已经发现为了获得最佳结果，最优化的hGH∶PEG摩尔比是在1∶2.5到1∶5的范围内。
根据上述的相同的方法制备和纯化另一种hGH-PEG-IgG缀合物，除了用在其两末端含有N羟基琥珀酰亚胺基(NHS)的PEG取代SPA-PEG-SPA。
实施例7：利用具有不同的分子量的PEG制备蛋白质缀合物
根据在实施例1的步骤1中的相同的方法制备并纯化hGH-PEG复合物，除了用在其两末端都含有乙醛基且分子量为10,000道尔顿的PEG(ALD-PEG-ALD，Shearwater Inc，USA)以外。同时，已经发现对为了获得最佳结果，最优化的hGH∶PEG摩尔比是在1∶2.5到1∶5的范围内。将所纯化的hGH-PEG复合物浓缩至5mg/ml。根据实施例1的步骤2中所描述的相同方法用浓缩的hGH-PEG复合物制备hGH-PEG-IgG缀合物。
实施例8：Fab′-S-PEG-N-IgG缀合物(-SH基)的制备
(步骤1)Fab’的表达和纯化
将表达抗TNFαFab’的大肠杆菌BL21/poDLHF(保藏号KCCM10511)接种于100ml LB培养基中并震荡培养过夜。将所培养的LB肉汤转移到51发酵罐(Marubishi)中，并在30℃、通风率为20vvm、搅拌速度为500rpm的条件下进行培养。随着发酵的进展，往培养物中加入适当量的葡萄糖和酵母提取物以补充微生物生长所造成的能量源的短缺。当所培养的肉汤在600nm的吸光率达到80时，往培养基中加入IPTG以诱导蛋白表达。将培养物再继续培养40到45个小时，直到所培养的肉汤在600nm的吸光率达到120到140。在20,000xg下离心所形成的培养肉汤30分钟以获得上清液。
为了纯化抗TNFαFab’，将上清液进行下面的三步层析纯化处理。将上清液装入到经20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡的HiTrapProteinG(5ml，Pharmacia，Germany)柱中，并用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)洗脱。被洗脱的Fab’部分被装入到经10mM磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia，Germany)中，并用相同的缓冲液洗脱。被洗脱的Fab’部分被装入到polyCAT21x250(PolyLC Inc.，USA)，并用在线性浓度梯度的NaCl(0.15M→0.4M)下的10mM乙酸缓冲液(pH 4.5)洗脱以获得纯的抗TNFα Fab’部分。
(步骤2)IgG-PEG复合物的制备
将150mg免疫球蛋白G(IgG，分子量为150kDa，Green Cross Inc.，Korea)溶解于100mM PBS(pH 6.0)中至浓度为5mg/ml，并将NHS-PEG-MAL(分子量为3400Da，Shearwater Inc.，USA)以对应于IgG∶PEG摩尔比为1∶10的量加入到所形成的溶液中。在4℃下轻轻地搅拌反应混和物12个小时。
完成反应后，马上将反应缓冲液换为20mM PBS(pH 6.0)以去除未反应的NHS-PEG-MAL。之后，将反应混和物装入到polyCAT21x250柱(PolyLC Inc.，USA)中，并用20mM PBS(pH 6.0)用线性浓度梯度法(NaCl浓度0.15M→0.5M)洗脱以获得IgG-PEG复合物。未反应的IgG比IgG-PEG复合物更晚被洗脱，并将其废弃。
(步骤3)Fab′-S-PEG-N-IgG缀合物(-SH基团)的制备
将在步骤1中所纯化获得的Fab’溶解于100mM PBS(pH 7.3)中至浓度为2mg/ml，并将在步骤2中所制备的IgG-PEG复合物以对应于Fab’∶复合物的摩尔比为1∶5的量加入到所形成的溶液中。将反应混和物浓缩为50mg/ml的蛋白浓缩物，并在4℃下轻轻地搅拌浓缩物24个小时。
完成结合反应后，马上将反应混和物装入到经10mM磷酸缓冲液(pH 7.3)平衡过的Superdex 200(Pharmacia，USA)柱中，并用相同的缓冲液以1ml/min的流速洗脱以获得Fab′-S-PEG-N-IgG部分。具有高分子量的Fab′-S-PEG-N-IgG缀合物较早地被洗脱，未反应的IgG-PEG复合物和Fab’比缀合物被更晚洗脱并将其废弃。为了去除剩余的未反应的IgG-PEG复合物，将Fab′-S-PEG-N-IgG缀合物部分装入到polyCAT21x250(PolyLC Inc.，USA)中并用线性浓度梯度方法(NaCl浓度0.15M→0.5M)用20mM乙酸缓冲液(pH 6.0)进行洗脱。最后，得到含有纯Fab′-S-PEG-N-IgG缀合物的部分，其中IgG-PEG复合物被连接到邻近于Fab’的C末端的-SH基团上。
实施例9：Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物(N末端)的制备
(步骤1)Fab′-PEG复合物(N末端)的制备
将40mg在实施例8的步骤1中所得到的被纯化的Fab’溶解于100mM PBS(pH6.0)中至浓度为5mg/ml，并将丁基ALD-PEG-丁基ALD(分子量为3400Da，Shearwater Inc.，USA)以对应于Fab’∶PEG的摩尔比为1∶5的量加入到所形成的溶液中。往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM，然后在4℃下轻轻地搅拌混合物2个小时。
完成反应后，马上将缓冲液换为20mM PBS(pH6.0)。在变换缓冲液之后，将混和物装入到polyCAT21x250柱(PolyLC Inc.，USA)中，并用线性浓度梯度法(NaCl浓度0.15M→0.4M)用20mM PBS(pH4.5)进行洗脱以获得含有Fab’-PEG复合物的部分。未反应的IgG比复合物更晚被洗脱，并将其废弃。
(步骤2)Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物(N末端)的制备
将在步骤1中所获得的纯化Fab’-PEG溶解于100mM PBS(pH6.0)中至浓度为10mg/ml，并将IgG(分子量为150 kDa，Green CrossInc.Korea)以对应于复合物∶IgG的摩尔比为1∶5的量加入到所形成的溶液中。将反应混和物浓缩为50mg/ml的蛋白浓缩物。往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM的，并在4℃下轻轻地搅拌反应混和物24个小时。
完成结合反应后，马上将反应混和物装入到经10Mm PBS(pH7.3)平衡过的Superdex 200(Pharmacia，USA)柱中，并用相同的缓冲液以1ml/min的流速进行洗脱以获得含有Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物的部分。具有高分子量的Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物被较早地洗脱，未反应的免疫球蛋白和Fab’-PEG比缀合物被洗脱得更晚并将其废弃。为了去除剩余的未反应的免疫球蛋白，将Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物部分装入到polyCAT21x250柱(PolyLC Inc.，USA)中，并用线性浓度梯度法(NaCl浓度0.15M→0.5M)，用20mM乙酸缓冲液(pH6.0)进行洗脱。最后，得到含有纯Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物的部分，其中IgG-PEG复合物被连接到Fab’的N末端上。
实施例10：无糖基化IgG(AGIgG)的制备
将200mg免疫球蛋白G(Green Cross Inc.，Korea)溶解于100mM磷酸缓冲液(pH 7.5)中至浓度为2mg/ml，并往其中加入300U/mg无糖基化酶，PNGase F(NEB Inc.，UK)。在轻轻搅拌下，该混和物于37℃反应24个小时。完成反应后，马上将反应混和物装入到SP琼脂糖FF(Pharmacia，Germany)柱中，用线性浓度梯度法利用1MNaCl(NaCl浓度：0.1M→0.6M)用10mM乙酸缓冲液(pH 4.5)洗脱以得到无糖基化IgG部分，它比野生型IgG被洗脱得更晚。
实施例11：IFNα-PEG-AGIgG缀合物的制备
通过将在实施例10中所制备的无糖基化(AGIgG)缀合到在实施例3中所制备的IFNα-PEG复合物上，按照如下制备IFNα-PEG-AGIgG缀合物。
将AG IgG(分子量：约147kDa)溶解于10mM磷酸缓冲液中。将IFNα-PEG复合物以对应于IFNα-PEG复合物∶AG IgG的摩尔比为1∶1、1∶2、1∶4或1∶8的量加入到含AG IgG的缓冲液中。将所形成的混和物调整到100mM磷酸缓冲液，并往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM。在4℃下轻轻地搅拌反应混和物20个小时。已经发现为了获得最佳结果，最优化的IFNα-PEG复合物∶AGIgG的摩尔比为1∶2。
为了在结合反应之后从污染物中纯化出IFNα-PEG-AGIgG缀合物，将反应混和物进行尺寸排阻层析。将反应混和物装入到Superdex(Pharmacia，USA)柱中并用10mM PBS(pH 7.3)以2.5ml/min的流速进行洗脱，以得到IFNα-PEG-AGIgG缀合物部分，同时也去除了污染物例如未反应的AG IgG和IFNα-PEG复合物。然后将如此所获得的IFNα-PEG-AGIgG缀合物部分进一步进行阳离子交换层析以去除少量未反应的AG IgG和IFNα-PEG复合物。将该部分装入到经10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)平衡过的polyCAT LP柱(PolyLC，USA)中，利用线性浓度梯度法(NaCl浓度0M→0.6M)用含有1.0M NaCl的10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)进行洗脱以获得IFNα-PEG-AGIgG缀合物部分。然后将所得到的部分进一步进行阴离子交换层析。将该部分被装入到经10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡过的polyWAXLP柱(PolyLC Inc.，USA)中，通过线性浓度梯度法(NaCl浓度0M→0.3M)用含有1.0M NaCl的10Mm Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行洗脱以获得纯的IFNα-PEG-AGIgG缀合物部分。
实施例12：EPO-PEG-AG IgG缀合物的制备
通过采用在实施例5中所制备的EPO-PEG复合物和在实施例10中所制备的无糖基化IgG重复实施例11中的操作，得到EPO-PEG-AGIgG缀合物。
比较实施例1：PEG-hGH复合物的制备
将5mg hGH溶解于100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)中以得到5ml溶液，并将活化的具有40kDa PEG的甲氧基-PEG-ALD以对应于hGH∶PEG的摩尔比为1∶4的量加入到溶液中。往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM，然后在4℃下逐渐搅拌反应混和物18个小时。然后往其中加入氨基乙醇至终浓度50mM，以灭活未反应的PEG。
为了进一步去除未反应的PEG，将反应混和物进行SephadexG-25柱(Pharmacia，USA)层析。在装入反应混和物之前，将柱用2倍柱体积(CV)的10mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液平衡。用UV分光光度计在260nm分析洗脱部分的吸收率吸光率。具有大分子量的PEG修饰的hGH在未反应的PEG之前首先被洗脱。
然后如下从洗脱部分中进一步纯化PEG修饰的hGH。用10mMTris-HCl(pH 7.5)缓冲液平衡装有3ml PolyWAX LP(Polywax Inc，USA)的柱。将含有PEG修饰的hGH的洗脱部分以1ml/min的速度装入到柱中，并用15ml平衡缓冲液洗涤柱。通过利用1M NaCl缓冲液的盐浓度梯度法(NaCl浓度：0％→100％)30分钟依次分离出三、双和单PEG连接的hGH。
为了从混和物中进一步纯化出单PEG连接的hGH复合物，将柱流出物进行尺寸排阻层析。将浓缩的流出物装入到经10mM磷酸钠缓冲液平衡过的Superdex 200(Pharmacia，USA)柱中，并用相同的缓冲液以1ml/min的流速进行洗脱。比单PEG连接的hGH更早被洗脱的三和双PEG连接的hGH复合物被出去以获得单PEG连接的hGH复合物。
根据上述的相同的方法制备并纯化PEG-IFNα、PEG-17S-G-CSF衍生物和PEG-G-CSF，其中40kDa PEG分别被连接到IFNα和G-CSF的末端氨基上的。
比较实施例2：白蛋白-hGH复合物的制备
为了将白蛋白和在实施例1中所得到的hGH-PEG复合物相缀合，将溶解于10mM磷酸缓冲液中的人血清白蛋白(HAS，分子量为约67 kDa)(Green Cross，Korea)以对应于hGH-PEG复合物∶HSA的摩尔比为1∶1、1∶2、1∶4或1∶8的量与hGH-PEG复合物反应。反应混和物被浓缩到100mM磷酸缓冲液中，并往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM。然后在4℃下搅拌反应混和物20个小时。已经发现为了获得最佳结果，最优化的hGH-PEG复合物∶白蛋白的摩尔比为1∶2。
在结合反应之后，将反应混和物在Superdex中进行尺寸排阻层析以去除未反应的原料和副产物。浓缩反应混和物并将其以2.5ml/min的流速装入到使用10mM乙酸钠(Ph 4.5)的柱中，以得到纯化的hGH-PEG-白蛋白质缀合物。因为所纯化的hGH-PEG-白蛋白质缀合物仍被少量的未反应的白蛋白和hGH二聚体所污染，因此进一步进行阳离子交换层析以去除这些污染物。将hGH-PEG-白蛋白质缀合物流出物装入到经10mM乙酸钠(pH 4.5)平衡过的SP5PW(Waters，USA)柱中，用具有线性浓度梯度(NaCl浓度：0M→0.5M)的含有1.0M NaCl的10mM乙酸钠(pH 4.5)将其分级以回收纯hGH-PEG-白蛋白。
根据上述的相同的方法制备并纯化到IFNα-PEG-白蛋白、G-CSF-PEG-白蛋白和17S-G-CSF衍生物-PEG-白蛋白，其中白蛋白被分别连接到IFNα、17S-G-CSF和G-CSF上。
比较实施例3：Fab’-S-40K PEG复合物的制备
将在实施例8的步骤1中所得到的纯化的Fab’放置在活化缓冲液(20mM PBS(pH 4.0)和0.2 mM DTT)中1个小时，以激活其游离-SH基。将缓冲液换为PEG化缓冲液(50mM磷酸钾(pH 6.5))。将马来酰亚胺-PEG(分子量为40kDa，Shearwater Inc.，USA)以对应于Fab’∶PEG的摩尔比为1∶10的量加入到所形成的溶液中。在4℃下轻轻地搅拌反应混和物24个小时。
完成反应之后，马上将反应混和物装入到经10mM PBS(pH 7.3)平衡过的Superdex 200柱(Pharmacia，USA)中，并用相同的缓冲液以1ml/min的流速进行洗脱以获得含有Fab’-S-40K PEG复合物的部分。未反应的Fab’比复合物被洗脱得更晚并将其废弃。为了去除未反应的Fab’，将Fab′-S-40K PEG复合物部分装入到polyCAT 21x250柱(PolyLC Inc.，USA)中，并利用线性浓度梯度法(NaCl浓度：0.15M→0.5M)用20mM PBS(pH 4.5)进行洗脱。最后，得到含有纯Fab′-S-40K PEG复合物的部分，其中40kDa PEG被连接到邻近于Fab’的-SH基团上。
测试实施例1：蛋白质缀合物的确认和定量
(1)蛋白质缀合物的确认
利用具有浓度梯度为4到20％的凝胶通过SDS-PAGE和ELISA(R&D System，USA)分析在上述实施例中所制备的蛋白质缀合物的修饰情况。
hGH、hGH-PEG、IFN和IFN-PEG每种都在SDS-PAGE以及一种与50mM DTT(二硫苏糖醇)的混和物中显影，而IgG、hGH-PEG-IgG和IFN-PEG-IgG中没有DTT。
图2和3分别显示了hGH-PEG-IgG和IFN-PEG-IgG缀合物所得到的SDS-PAGE结果。左边所列的数字是分子量标记(kDa)。
如图2中所示，hGH-PEG-IgG缀合物的表观分子量为约170kDa。但是，因为在SDS-PAGE中区别出IgG蛋白质缀合物与野生型IgG之间的分子量差异是困难的，用DTT处理还原hGH-PEG-IgG缀合物和IgG，将其分离成重链和轻链，并分别通过SDS-PAGE确认它们的缀合状态(图4)。
当用DTT处理IgG时，根据它们的分子量，IgG的轻链被首先分离，随后是IgG的重链。经DTT处理的hGH-PEG-IgG缀合物的带出现在对应于通过分别累计hGH-PEG的分子量(3.4kDa)和轻链及重链片段的分子量所计算出的分子量的位置上显现出缀合物。hGH-PEG-IgG缀合物的轻链在比hGH-PEG-IgG缀合物的重链更低的位置(更小的分子量)上形成了一个条带，发现所述重链条带在对应于约80kDa的位置。从上述的结果中，已经发现hGH与轻链及重链结合的可能性相同，且IgG与hGH以1∶1的摩尔比反应。
(2)蛋白质缀合物的定量分析
通过计算在尺寸排阻层析(柱：Superdex；洗脱液：10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0))中所观察到的峰面积并将其与对照比较，确定出在上述的实施例中所制备的每种蛋白质缀合物的量。在分别用预先定量的hGH、IFN、G-CSF、17S-G-CSF、EPO和IgG进行尺寸排阻层析之后，确定出峰面积的相对感应因子。用恒定量的每种蛋白质缀合物在相同条件下进行尺寸排阻层析，并通过从上面所得到的每种蛋白质缀合物的峰面积中减去对应于IgG的峰面积而确定出存在于每种蛋白质缀合物中的生理活性蛋白的数量值。
除了层析外，也进行ELISA(R&D System，USA)分析。如果IgG的一部分被缀合到多肽的生理学活性位点上，利用特异于生理学活性位点的抗体所得到的ELISA分析的数值要比层析所计算出的数值小。对于hGH-PEG-IgG缀合物，已经发现通过ELISA所测定的数值只有通过层析所确定的数值的30％。
(3)蛋白质缀合物的纯度和质量的确认。
为了检查在实施例3中所得到的INFα-PEG-IgG复合物的纯度，利用反相柱(259VHP54柱，Vydac Inc.，USA)进行反相HPLC。在有0.5％TFA存在的情况下，通过线性浓度梯度法(乙腈浓度：40％→100％)用乙腈洗脱复合物，并在280nm下对该复合物进行检测。如图5中所能看到的，复合物的纯度超过95％。
在尺寸排阻层析期间，分析在每个实施例中所得到的蛋白质缀合物在280nm的吸光值，发现hGH-PEG-IgG、IFN-PEG-IgG、G-CSF和17S-G-CSF-PEG-IgG每种都显示出对应于分子量从170,000到180,000道尔顿的单峰。观察到EPO-PEG-IgG峰在对应于分子量为200,000道尔顿的位置。
为了确定出每种蛋白质缀合物的确切的分子量，用MALDI-TOF(Voyager DE-STR，Applied Biosystems，USA)超高速质谱法分析所纯化的样本。芥子酸被用作基质。将0.5μl的每种样本涂抹在载玻片上并在空气中晾干。在将等体积的基质滴到载玻片上之后，将载玻片在空气中晾干，并放置到离子源中。用利用阳性法的线性模式TOF装置进行检测，在利用750nsec/1500nsec延迟提取时间的延迟离子提取器的分离的提取供应源中，用约2.5kV的总电位差对离子进行加速。hGH-PEG-IgG缀合物的质谱分析的结果示于表1和图6。
表1对IgG-蛋白质缀合物的质谱分析
理论值(kDa)  测定值(kDa)
hGH-PEG-IgG(实施例1) 175.4  176.8
INFα-PEG-IgG(实施例3) 172.6  172.6
G-CSF-PEG-IgG(实施例4) 172.1  173.0
17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG(实施例4) 171.9  172.2
EPO-PEG-IgG(实施例5) 185.4  183.0
结果表明hGH-PEG-IgG缀合物的纯度为90％或更高，所测定的分子量几乎等于理论值。另外，hGH-PEG-IgG缀合物是IgG与hGH-IgG复合物以1∶1的摩尔相结合的形式。
另外，如通过上面的MALDI-TOF方法所测定的在实施例10中所制备的AG IgG的分子量为147kDa，它比野生型IgG小3,000Da(图9)。这一被减少的分子量，即3,000Da，对应于糖链的理论大小，因此推断IgG的糖链被完全地去除了。
表2显示了在实施例11和12中所制备的INFα-PEG-AG IgG和EPO-PEG-AGIgG缀合物的分子量。
表2对AGIgG-蛋白质缀合物的质谱分析
理论值(kDa) 测定值(kDa)
 INFα-PEG-AG IgG(实施例11) 169.6  170.0
 EPO-PEG-AG IgG(实施例12) 182.4  180.0
测试实施例2：药物代谢动力学分析I
比较了在实施例和比较实施例中所制备的IgG-蛋白质缀合物、PEG-蛋白和白蛋白-蛋白复合物(测试组)和生物学活性野生型蛋白(对照组)的体内稳定性和药物代谢动力学系数。在下面的试验中，每组使用5只Sprague-Dawley(SD)鼠。以100μg/kg分别对鼠皮下注射对照、PEG-复合物、白蛋白-蛋白质缀合物和IgG-蛋白质缀合物。在注射后的0.5、1、2、4、6、12、24、30、48、72和96小时，从对照组中采取血样，在注射后的1、6、12、24、30、48、72、96、120、240和320小时，从测试组中采取样本。将血样收集到经肝素涂层的试管中以预防血液凝固，并将其在4℃、3,000xg下高速微离心30分钟以去除细胞。通过使用特异于每种生物学活性蛋白的各个抗体的ELISA法测定血清中的蛋白浓度。
在表2到6中显示了野生型hGH、IFN、G-CSF和EPO及它们的蛋白质缀合物、复合物的药物代谢动力学数值，其中Tmax意思是到达最大药物浓度的时间，T1/2为药物在血液中的半衰期，MRT(平均滞留时间)为在体内的平均滞留时间。
表3hGH的药物代谢动力学数值
野生型hGH  hGH-40K PEG(比较实施例1) hGH-PEG-白蛋白(比较实施例2)  hGH-PEG-IgG(实施例1)
 Tmax(hr) 1.0  12  12  12
 T1/2(hr) 1.1  7.7  5.9  13.9
 MRT(hr) 2.1  18.2  13.0  19.0
表4IFNα的药物代谢动力学数值
野生型IFNα IFNα-40KPEG(比较实施例1) IFNα-PEG-白蛋白(比较实施例2) IFNα-PEG-IgG(实施例3)  IFNα-PEG-AGIgG(实施例11)
  Tmax(hr)   1.0   30   12   30   24.0
  T1/2(hr)   1.7   35.8   17.1   76.7   59.7
  MRT(hr)   2.1   71.5   32.5   121.0   98.2
表5 G-CSF的药物代谢动力学数值
野生型G-CSF  G-CSF-40K  PEG(比较实施例1) G-CSF-PEG-白蛋白(比较实施例2)  G-CSF-PEG-IgG(实施例4)
 Tmax(hr) 2.0  12  12  12
 T1/2(hr) 2.8  4.8  5.2  8.4
 MRT(hr) 5.2  24.5  25.0  35.7
表6 17S-G-CSF的药物代谢动力学数值
野生型17S-G-CSF衍生物 17S-G-CSF衍生物-40K PEG(比较实施例1) 17S-G-CSF衍生物-PEG-白蛋白(比较实施例2) 17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG(实施例4)
Tmax(hr) 2.0  24  24  48
T1/2(hr) 2.9  4.3  6.4  7.2
MRT(hr) 5.8  24.4  25.1  42.6
表7EPO的药物代谢动力学数值
野生型EPO 高糖基化EPO(Darbepoetin-α) EPO-PEG-IgG(实施例5)  EPO-PEG-AGIgG(实施例12)
 Tmax(hr) 6.0  12  48.0  48.0
 T1/2(hr) 9.4  14.9  67.5  47.8
 MRT(hr) 21.7  30.7  121.7  89.5
如在表3和图7中所能看到的那样，hGH-PEG-IgG缀合物的半衰期为13.9hr，这约是野生型hGH的13倍和约是在比较实施例1中所制备的hGH-40K PEG复合物(7.7hr)的2倍。其中白蛋白被连接到PEG的一个末端而不是直接连接到hGH的hGH-PEG-白蛋白质缀合物的半衰期是5.9hr。这个结果确认本发明的蛋白质缀合物表现出非常优越的体内的持久性。
另外，在表4和图10中的IFNα的结果类似于hGH的结果，但是在本发明的蛋白质缀合物中所观察到的增加血液半衰期的效应是更高的。当野生型IFNα的半衰期是1.7hr时，40kDa PEG-IFNα复合物的半衰期增加到了35.8hr，IFNα-PEG-白蛋白质缀合物的半衰期增加至17.1hr。与这些相比较，IFNα-PEG-IgG缀合物的半衰期显著地增加到了76.7hr。另外，IFNα-PEG-AG IgG缀合物的半衰期为59.7hr，这几乎等于IFNα-PEG-IgG缀合物的半衰期。从这个结果中，可以看糖链的缺失并不影响缀合物的体内稳定性。
如表5和6所示，G-CSF和它的衍生物的体内持久性表现出与hGH和IFN相似的倾向。40kDa PEG修饰的蛋白复合物和白蛋白质缀合物的半衰期要比野生型G-CSF和它的衍生物的半衰期更长。但是，本发明的IgG蛋白质缀合物表现出更长的半衰期。在氨基酸修饰的衍生物中也观察到了这样的缀合IgG增加药物在血液中的稳定性的能力。从这些结果中，可以预计应用于其他蛋白的本明的蛋白质缀合物也将发挥出上述所需的的作用。
表7和图8及11表明本发明的蛋白质缀合物增加血液半衰期的作用对于具有糖基化部分的EPO是明显的。就是说，野生型EPO的血液半衰期为9.4hr，而高糖基化EPO，即Darbepoetin-α(Aranesp，Amgen，USA)，具有高血液稳定性为14.9hr。对于EPO-PEG-IgG缀合物，血液半衰期显著地增加到了67.5hr，EPO-PEG-AG IgG缀合物的半衰期也增加到了47.8hr。
从上述的结果可看出，其中生理学多肽与非肽聚合物及免疫球蛋白共价结合的本发明的蛋白质缀合物具有比野生型蛋白的血液半衰期高12倍的血液半衰期。此外，甚至采用了无糖基化的免疫球蛋白，增加蛋白质缀合物的血液半衰期的作用仍被保持在相似的水平上。
具体地，与在先前报道的PEG制剂中具有最高血液持久性的40kDa PEG修饰的蛋白复合物相比较，本发明的IgG蛋白质缀合物表现出远为更好的持久性。另外，相对于用白蛋白取代IgG所结合的蛋白质缀合物，本发明的蛋白质缀合物表现出显著更高的持久性。这些结果表明本发明的蛋白质缀合物可以被有效地用于制备持久的蛋白质药物制剂。本发明的发现，即对于包括具有一个点突变的G-CSF衍生物在内的较广范围内的蛋白，本发明的蛋白质缀合物比先前报道的PEG结合蛋白或白蛋白结合蛋白呈现出显著更高的血液稳定性和更长的MRT，强烈地表明本发明的蛋白质缀合物所观察到的这些增加血液稳定性和持久性的作用也将在其他生物学活性肽中被实现。
用上述的相同的方法测定用10kDa PEG作为非肽聚合物所制备的hGH-PEG-IgG缀合物的半衰期(实施例7)为9.5hr，这比用3.4kDaPEG的hGH-PEG-IgG缀合物的半衰期(13.9hr)稍短。在用具有不同的功能基例如琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基和丁醛基的PEG所制备的蛋白质缀合物中所观察到的表观分子量和血液半衰期与用具有乙醛基的PEG所制备的蛋白质缀合物是相似的。
测试实施例3：药物代谢动力学分析II
为了测定分别在实施例8和9中所制备的Fab′-S-PEG-N-IgG和Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物以及在比较实施例3中所制备的Fab′-S-40KPEG复合物的血液半衰期，根据测试实施例2中的方法通过使用缀合物、复合物和作为对照的Fab’进行了药物代谢动力学分析。结果示于图12。
如在图12中所能看到的那样，Fab′-S-PEG-N-IgG和Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物显示出延长的血液半衰期，它们是Fab′和Fab′-S-40K PEG复合物的2到3倍。
测试实施例4：体外活性的测定
(1)hGH蛋白质缀合物的体外活性的比较
如下通过利用进行hGH依赖性有丝分裂的鼠结节淋巴瘤细胞系Nb2(European Collection of Cell Cultures，ECCC#97041101)测定hGH-PEG-IgG缀合物(实施例1)、40kD PEG-hGH复合物(比较实施例1)和hGH-PEG-白蛋白质缀合物(比较实施例2)的体外活性。
将Nb2细胞培养在加有10％胎牛血清(FBS)、0.075％NaCO3、0.05mM 2-巯基乙醇和2mM谷氨酰胺的Fisher培养基中。将细胞在不含10％FBS的相同培养基中再培养24个小时。将每孔约2×104个细胞加入到96孔板之后，往每个孔中加入hGH-PEG-IgG、40kDaPEG-hGH、hGH-PEG-白蛋白和对照(National Institute for BiologicalStandards and Control，NIBSC)的各种稀释液，并将培养板在37℃，CO2孵箱中培养48个小时。为了测定细胞生长的程度(每个孔中所存在的细胞的数目)，往每个孔中加入25μl的Cell Titer 96 AqueousOne Solution(Promega，USA)并在37℃下培养4个小时。测定在490nm处的吸光率以计算出每个样本的滴度，所计算出的滴度如表8中所示。
表8hGH的体外活性分析
浓度(ng/ml) 比活性*(U/mg) 与野生型hGH的相对活性(％)
野生型hGH  100  2.71E+06  100
对照(NIBSC)  100  2.58E+06  95.2
hGH-40K PEG  100  0.206E+06  7.6
hGH-PEG-白蛋白  100  0.141E+06  5.2
hGH-PEG-IgG  100  0.86E+06  31.7
*比活性＝1/ED50×106(ED50：代表50％的最大细胞生长的蛋白的量)
从表8中可看到，在试验中所用的所有样本都具有体外活性。另外，PEG修饰的hGH的体外活性要比未修饰的hGH更小。对于干扰素，据报道与IFNs缀合的12kDa PEG和40kDa PEG分别显示出仅为野生型的约25％和7％的活性(P.Bailon et al.，Bioconjugate Chem.12：196-202，2001)。PEG的分子量增加得越大，PEG复合物的体外活性降低得越少。40kDa PEG修饰的hGH复合物的体外活性仅为野生型hGH的约7.6％；hGH-PEG-白蛋白质缀合物也显示出非常低的体外活性，约为野生型的5.2％。但是，在IgG与hGH-PEG复合物缀合的情况下，它的相对活性被显著地增强到野生型的30％或更高。这些结果表明本发明的蛋白质缀合物具有更高的体内活性以及延长的血液半衰期。对于本发明的IgG蛋白质缀合物，增强的蛋白活性被认为是因为与IgG缀合所造成的血液稳定性的增加以及非肽聚合物提供的间隔空间，IgG发挥了保留与受体的结合亲和力的作用非肽聚合物。预计任何其他生物学活性蛋白的IgG蛋白质缀合物也能出现这样的效果。
(2)IFNα蛋白质缀合物的体外活性的比较
为了比较IFNα蛋白质缀合物的体外活性，通过利用经水疱性口膜炎病毒(VSV)浸透的Madin-Darby牛肾细胞(MDBK细胞，ATCCCCL-22)的细胞培养活检法测定了IFNα-PEG-IgG复合物(实施例3)、40kDa PEG-IFNα缀合物(比较实施例1)和IFNα-PEG-白蛋白缀合物(比较实施例2)的抗病毒活性。将无PEG修饰的IFNα2b(NIBSCIFN)用作对照。
在37℃、于含5％CO2孵箱中，将MDBK细胞培养在加有10％FBS和1％青霉素-链霉素的MEM(最低基础培养基，JBI)。用相同的培养基将样本和对照(NIBSC IFN)稀释到恒定浓度，并将100μl的每种稀释液加入到96孔板中。往每个孔中加入100μl所培养的细胞溶液，并将细胞在37℃、于含5％CO2孵箱中培养约1个小时。一个小时后，将50μl病毒浓度为5-7×103PFU的VSV加入到每个孔中，并在37℃、于5％CO2条件下再培养16到20个小时。只含有细胞和病毒而不含样本或对照的孔被用作阴性对照，只含有细胞而不含添加病毒的孔被用作阳性对照。
为了去除培养基和染色活细胞，将100μl中性红溶液加入到每个孔中，并在37℃、于5％CO2孵箱中再培养2个小时。通过抽吸去除上清后，将萃取溶液(100％乙醇和1％乙酸(1∶1)的100μl的混和物)加入到每个孔中。随着摇动，染色细胞被重悬于萃取溶液中，并在540nm测定吸光率。通过将阳性对照的细胞生长当作相对于阴性对照的细胞生长为100％计算出代表50％的最大细胞生长的ED50。
表9IFNα的体外活性分析
浓度(ng/ml) ED50(IU/mg) 对野生型IFNα的相对活性(％)
 野生型IFNα  100  4.24E+08  100
 IFNα-40K PEG  100  2.04E+07  4.8
 IFNα-PEG-白蛋白  100  2.21E+07  5.2
 IFNα-PEG-IgG  100  4.75E+07  11.2
 IFNα-PEG-AGIgG  100  4.32E+07  10.2
如表9所示，PEG修饰的IFNα的活性低于未修饰的IFNα。具体地，当PEG部分的分子量增加时，血液稳定性也增加，但相对活性逐步减低。40kDa PEG修饰的IFNα复合物显示出非常低的体外活性，相当于野生型活性的约4.8％。如上面所提及的那样，先前报道了缀合了IFNs的12kDa PEG和40kDa PEG分别显示出野生型的体外活性的约25％和7％(P.Bailon et al.Bioconjugate Chem.12：196-202，2001)。也就是说，既然如果PEG的分子量增加，血液半衰期也增加但是它的药效却突然降低了，因此需要开发出一种具有改进的药理活性和延长的半衰期的物质。IFNα-PEG-白蛋白缀合物也显示出了非常低的体外活性，仅仅相当于野生型的约5.2％。但是，对于用IgG修饰的IFNα(IFNα-PEG-IgG缀合物)，相对活性增加到了野生型的11.2％。另外，IFNα-PEG-AG IgG缀合物显示出相当于野生型的10.2％的体外活性，并据此推断糖链的缺失对蛋白质缀合物的活性没有显著的影响。
这些结果表明本发明的IgG蛋白质缀合物呈现出高的体内活性以及延长的半衰期。
(3)G-CSF蛋白质缀合物的体外活性的比较
测定了野生型G-CSF(Filgrastim)、17Ser-G-CSF衍生物、20kDaPEG-G-CSF复合物(Neulasta，USA)、40kDa PEG-17S-G-CSF衍生物复合物、17Ser-G-CSF衍生物-PEG-白蛋白质缀合物和17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG缀合物的体外活性。
首先，将人骨髓来源的细胞HL-60(ATCC CCL-240，早幼粒细胞白细胞患者/36岁白种女性)的细胞培养在添加有10％FBS的RPMI1640培养基中，并将细胞数调节至约2.2×105细胞/ml。往细胞内加入DMSO(二甲基亚砜，培养级/SIGMA)直到浓度为1.25％(v/v)。将90μl经DMSO处理过的具有约每孔2×104个悬浮细胞的培养溶液加入到96孔板(Corning/低蒸发96孔板)，并在37℃、于5％CO2孵箱中培养72个小时。
用G-CSF ELISA试剂盒(R&D Systems，USA)确定每个样本的浓度，用RPMI 1640培养基以适当的比例将每个样本稀释到10μg/ml的浓度。将所形成的溶液进行19个循环的RPMI 1640培养基的连续半稀释。
将10μl上述制备的每个样本加入到每一具有正在培养的HL-60细胞的孔中，并将浓度从1,000μg/ml减半。将用蛋白样本处理过的微量板在37℃下再培养72个小时。
为了检查培养后的细胞生长的程度，通过用CellTiterTM(Promega，USA)测定670nm处的吸光率确定出细胞数。
表10 G-CSF衍生物的体外活性分析
ED50(IU/ml) 对野生型G-CSF的相对活性(％)
 野生型G-CSF(Filgrastim) 0.30  100
 17Ser-G-CSF衍生物 0.26  115
 20K PEG-G-CSF(Neulasta) 1.20  25
 17Ser-G-CSF衍生物-40K PEG 10.0  ＜10.0
 17Ser-G-CSF衍生物-PEG-白蛋白 1.30  23.0
 17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG 0.43  69.0
如从表10中所看到的那样，具有氨基酸修饰的17Ser-G-CSF衍生物的IgG蛋白质缀合物显示出与在野生型的蛋白质缀合物中所观察到的作用相似的作用。已经确认用PEG修饰的17Ser-G-CSF衍生物显示出比未被修饰的衍生物更长的半衰期但更低的活性(韩国专利申请号：2003-17867)。具体地，虽然当PEG部分的分子量增加时，PEG修饰的17Ser-G-CSF衍生物的血液稳定性也增加，但是它的相对活性却逐步降低。40kDa PEG修饰的17Ser-G-CSF衍生物复合物显示出非常低的体外活性，相当于野生型的约10％。换句话说，当PEG的分子量增加时，血液半衰期增加但是药效却突然减低，已经需要开发出一种具有改进的药理活性和延长的半衰期的物质。同时，用白蛋白修饰的17Ser-G-CSF衍生物显示出相当低的体外活性，相当于野生型的约23％。但是，对于用IgG修饰的17Ser-G-CSF衍生物(17Ser-G-CSF-PEG-IgG缀合物)，它的相对活性增加到野生型的69％或更高的水平。这些结果表明本发明的IgG蛋白质缀合物同时呈现出高的体内活性和延长的半衰期。
(4)EPO蛋白质缀合物的体外活性的比较
测定了野生型EPO(BRP，UK)、高糖基化EPO(Aranesp，USA)和EPO-PEG-IgG缀合物的体外活性。
首先，将人骨髓来源的细胞，TF-1细胞(ATCC CRL-2003，红白血病)，培养在添加有10％FBS和12ng/ml GM-CSF的RPMI 1640培养基中，然后在缺少GM-CSF的相同RPMI 1640培养基中培养1天。往96孔板(Corning/低蒸发96孔板)的每个孔中加入50μl具有约2×104个细胞的培养液，并在37℃、于5％CO2孵箱中培养72个小时。
用EPO ELISA试剂盒(R&D Systems，USA)确定每个样本的浓度，用RPMI 1640培养基以适当的比例将每个样本稀释到10μg/ml的浓度。将所形成的溶液进行19个周期的RPMI 1640培养基的连续的对倍稀释。
将50μl上述制备的每个样本加入到具有正在培养的TF-1细胞的每个孔中，并将浓度从5μg/ml减半。将用蛋白样本处理过的微量板在37℃、5％的CO2的条件下再培养72个小时。
为了检测培养后的细胞生长的程度，通过用CellTiterTM AQueousOne(Cat.No.G3581，Promega，USA)测定490nm处的吸光率确定出细胞数。
表11EPO的体外活性分析
比活性(U/mg) 对野生型EPO的相对活性(％)
野生型EPO(BRP) 8.9×105  100
高糖基化EPO(Aranesp) 6.8×104  7.6
EPO-PEG-IgG 3.7×104  4.2
如从表11中所能看到的那样，在试验中所用的所有样本都如它们对人骨髓来源细胞的生长的促进所证实的那样具有体外活性，。另外，高糖基化EPO和PEG-IgG复合物修饰的EPO的体外活性都要低于未修饰的EPO的活性。但是，预计本发明的EPO缀合物具有比未修饰EPO更优的体内活性，因为其显著延长的血液半衰期。对于本发明的EPO蛋白质缀合物，所增加的蛋白活性被认为是由于与IgG缀合所造成的血液稳定性的增加以及提供间隔空间的非肽聚合物，IgG发挥了保留与受体的结合亲和力的作用非肽聚合物了。
(5)Fab’蛋白质缀合物对细胞毒性的中和作用
如下通过在鼠成纤维细胞系L929(ATCC CRL-2148)中测定它们的中和TNFα的细胞毒性的能力检测出分别在实施例8和9中所制备的Fab′-S-PEG-N-IgG和Fab′-N-PEG-N-IgG缀合物以及在比较实施例3中所制备的Fab′-S-40K PEG复合物的体外活性。
将每种Fab’缀合物和复合物进行连续的对倍稀释，并将100μl每种稀释液加入到96孔板的每个孔中。将RhTNFα(R&D systems)和放线菌素D(sigma)(一种RNA合成的抑制剂)加入到孔中直到浓度分别为10ng/ml和1μg/ml。然后，将混和物在37℃、5％CO2的条件下反应30分钟，并将其转移到分析微量板中。往每孔中加入50μl每种L929细胞系培养物至浓度为5×104个细胞/孔。将细胞在37℃、5％CO2的条件下孵育24个小时。去除孔内的培养液并往每孔中各加入于PBS中的50μl的5mg/ml MTT(sigma)溶液。将细胞在37℃、5％CO2的条件下孵育4个小时。往每孔中加入150μl DMSO并使其溶解。测定540nm处的吸光率以确定出测试Fab’缀合物和复合物中和rh TNFα的程度。采用在实施例8的步骤1中得到的纯化的Fab’作为对照。
如在图13中的结果所能看到的那样，所有的蛋白质缀合物和复合物都显示出与Fab’相似的吸光率。这个结果表明其中通过PEG间隔基将免疫球蛋白连接到Fab’的N末端或邻近于Fab’的C末端的游离-SH基的Fab′-PEG-IgG缀合物保持了Fab’的生物学活性。
测试实施例5：动物模型中的体内活性的测定
(1)hGH蛋白质缀合物的体内活性的比较
每组采用10只切除垂体的雄性Sprague Dawley鼠(5周大，SLC，USA)，用体重增加测试测定hGH-PEG-IgG缀合物、hGH-40K PEG复合物和野生型hGH的体内活性。根据在表12中所描述的给药方案和剂量，用26G注射器(1ml，Korea Vaccine Co.，Ltd.)将对照组溶剂、野生型hGH、hGH-PEG-IgG缀合物和hGH-40K PEG复合物皮下注射到鼠的肩部的背侧。在注射前和注射后16小时测量鼠的体重。在最后一次注射后24小时杀死鼠，并用肉眼检查脑下垂体以从结果中排除具有可观察到的脑下垂体的鼠。
表12hGH在动物模型中的体内活性测试的条件
组别  药物 平均每日剂量(天) 给药总量 给药方案
1  对照组溶剂  - PBS(0.5ml) 每天一次，每天给药共12天
2  野生型hGH  30μg 360mIU(30μg/次) 每天一次每天给药共12天
3  hGH-40KPEG  30μg 360mIU(180μg/次) 每6天给药一次，给药两次
4  hGH-PEG-IgG  30μg 360mIU(180μg/次) 每6天给药一次，给药两次
5  hGH-PEG-IgG  10μg 120mIU(60μg/次) 每6天给药一次，给药两次
在图14中显示了施用每种样本后的体重变化。因为被用作标准(对照)的野生型hGH必须每天给药以保持它的体内活性，每天给药一次共12天，因此，组2的鼠在给药期间体重增加。每6天施用用hGH-40kDa PEG复合物1次的组3的鼠持续增加体重直至给药后3天，之后增加的速度减慢。这些结果与基于测试实施例1和2的结果的预期一致，即hGH-PEG复合物显示出比野生型hGH远为更长的半衰期和更高的体内活性。具体地，通过每6天施用相当于野生型剂量的1/3的量的hGH-PEG-IgG缀合物1次所产生的效果等于或优于每天施用野生型。这意味着hGH-PEG-IgG缀合物的体内活性比野生型高出3倍多。
(2)G-CSF衍生物蛋白质缀合物的体内活性的比较
为了检测具有第17位氨基酸的丝氨酸取代的17Ser-G-CSF的本发明的蛋白质缀合物的作用，比较了野生型G-CSF、商品化可获得的20kDa PEG-G-CSF复合物和17Ser-G-CSF-PEG-IgG缀合物的体内活性。将本发明的17Ser-G-CSF-PEG-IgG缀合物溶解于包含20mM磷酸钠、1％甘氨酸和0.25％甘露醇(pH7.0)的溶剂中。将溶解于相同溶剂中的野生型蛋氨酰G-CSF复合物(Filgrastim，Amgen，USA)和20kDa PEG修饰的G-CSF(Neulasta，Amgen，USA)用作对照组。从Samtaco Bio(Korea)购得雄性的7周龄ICR鼠，并将其在试验前给予1周的适应期。在试验开始时，ICR鼠的体重是在30-35g的范围内。在适应期和试验期间，它们被允许自由地摄取处方饲料(Samyang Corporation，Korea)和水，并在22±3℃、55±5％的相对湿度、10～12次/小时的通气、150-200勒克斯的照度和每天12hr亮/12hr暗的照明循环的条件下将其饲养在笼子中。每个试验组包括5只鼠，根据表13中多述的给药方案和剂量给鼠施用用一种复合的抗癌制剂和每种样本。通过将130mg/kg环磷酰胺(CPA；Sigma，USA)、4.5mg/kg阿霉素(DXR；Sigma，USA)和1mg/kg长春新碱(VCR，Sigma，USA)的混和物一次注射到ICR鼠的腹腔中制备到中性粒细胞减少的动物模型。未处理组没有施用抗癌制剂，也显示没有中性粒细胞的减少。对照组溶剂是被施用了施用用以减少中性粒细胞的抗癌制剂和只施用用了取代药物样本的佐剂的组。施用抗癌制剂后的第1天起直到第5天，在每天上午10点左右以100μg/kg/天的剂量皮下注射野生型G-CSF。在施用用抗癌制剂后的第1天一次注射1000μg/kg剂量的17S-G-CSF-IgG和20kDa PEG-G-CSF复合物(Neulasta，Amgen，USA)，当野生型剂量的两倍量被当作每天剂量(200μg/kg/天)时，该剂量相当于5天的剂量。在施用用抗癌制剂后的第1、2、3、4、5、6和8天，从鼠的眶静脉采取0.3-0.5ml血。在下午4点左右进行采血，即注射药物样本6小时后。用自动化血细胞计数仪测定白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血小板的数目。另外，制备血涂片并进行Giemsa染色。分类计算每种血小板以得到中性粒细胞的比例，然后根据中性粒细胞比例用公式1计算出中性粒细胞的数目。
公式1
中性粒细胞的数目(个细胞/mm3)＝WBC的总数(个细胞/mm3)×中性粒细胞的比例(％)×1/100
为了检测在未处理组、对照溶剂组和17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG组中所观察到的数值的统计学显著性，用Student t-检验进行了关于每组的血细胞数目和体重的统计学分析。
表13测试蛋白增加动物模型中的中性粒细胞的数目的条件
    组别   药物 平均每日剂量(kg/天) 给药总量 给药方案
    1   未处理   - PBS(0.5ml) 每天一次，每天给药共5天
    2   对照溶剂   - PBS(0.5ml) 每天一次，每天给药共5天
    3   野生型G-CSF(Filgrastim)   100μg 500μg/kg/5次 每天一次，每天给药共5天
    4   20K PEG-G-CSF(Neulasta)   200μg 1000μg/kg/次 一次给药
    5  17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG   200μg 1000μg/kg/次 一次给药
在图15中显示了施用用每种样本后的中性粒细胞的恢复。当每天注射被用作标准的野生型G-CSF 5天时，中性粒细胞的数目在给药期间逐步增加并最终在第5天达到最大值。但以每天剂量的两倍量一次施用20kDa PEG-G-CSF仅显示出在每日施用野生型G-CSF中观察到的体内活性的2/3，17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG缀合物表现出比20kDa PEG-G-CSF复合物的体内活性高3倍的活性。此外，本发明的蛋白质缀合物产生了比每天施用G-CSF高2倍的恢复中性粒细胞的效果，这与基于17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG具有比野生型显著更长的血液半衰期和更高的体内活性的结果所作预期是一致的。这些结果表明可以预计具有氨基酸修饰的蛋白衍生物和野生型一样具有IgG共价地结合到PEG所产生的本发明的蛋白质缀合物相同的作用。因此，本发明的蛋白质缀合物可以被有效地用作满足显著增加G-CSF的血液半衰期和体内活性的目的且同时克服了野生型G-CSF需要过度频繁给药的问题的长效制剂。
(3)EPO蛋白质缀合物的体内活性的比较
为了比较野生型EPO、高糖基化EPO(Aranesp，USA)和EPO-PEG-IgG缀合物的体内活性，检测了用上面的测试样本给药的鼠的血液成分的变化。如下对J.C.Egrie和Browne所描述的方法(British Journal of Cancer(2001)B4(Supplement l)，3-10)的方法进行略微修改进行试验。
将本发明的EPO-PEG-IgG缀合物溶解于包含20mM磷酸钠、1％甘氨酸和0.25％甘露醇(pH 7.0)的溶剂中。将溶解于相同溶剂中的野生型EPO和高糖基化EPO用作对照组。从Daehan Biolink Inc.(Korea)购得雄性的7周龄的鼠，并在试验前给予其1周的适应期。在试验开始时，ICR鼠的体重是在200-250g的范围内。在适应期和试验期间，它们被允许自由地摄取处方饲料(Cheiljedang Co.Korea)和水，并在22±3℃、55±5％的相对湿度、10～12次/小时的通气、150-200勒克斯的照度和每天的12hr亮/12hr暗的照明循环的条件下将其饲养在笼子中。每个试验组包括5只鼠，根据在表14中所描述的给药方案和剂量，用26G注射器(1ml，Korea Vaccine Co.，Ltd.)将如上所制备的每种测试样本皮下注射到鼠的肩部的背侧。
给药后，从鼠的尾静脉中采集全血样本到含有抗凝剂(EDTA)的试管中，每3天1次共一个月。用自动化血小板计数仪(Vet ABC)测定血样本的红细胞压积。
表14测试增加动物模型中的红细胞压积的蛋白质活性的条件
组别     药物     给药总量  给药方案
    1     对照溶剂     PBS(0.5ml)  一次给药
    2     野生型EPO     8μg/kg/5次  每日一次每天给药共5天
    3     高糖基化EPO(Anaesp)     8μg/kg/次  一次给药
    4     EPO-PEG-IgG     8μg/kg/次  一次给药
在图16中显示了施用每种样本后的红细胞压积的恢复。当每天注射被用作标准的野生型EPO共5天时，红细胞压积在给药期间逐步增加并最终在第9天达到最大值。在组3的施用高糖基化EPO的鼠中，红细胞压积在注射后快速地增加6天，之后快速地减低。相反地，本发明的EPO-PEG-IgG缀合物呈现出比高糖基化EPO更高的和更快的最初增加红细胞压积的速度，并比其他的测试蛋白保持更高的体内活性超过2周。这些结果与基于测试实施例2的结果的预期是一致的，即EPO-PEG-IgG缀合物呈现出比野生型EPO和高糖基化EPO远为更长的血液半衰期。因此，本发明的蛋白质缀合物能被有效地用作满足显著增加EPO的血液半衰期和体内活性的目的，且同时克服了野生型EPO需过度频繁给药的问题的长效制剂。

Claims (37)

1.一种蛋白质缀合物，其包括彼此共价连接的i)一种生理学活性多肽，ii)一种非肽聚合物，以及iii)一种免疫球蛋白，并具有生理学活性多肽的延长的体内半衰期。
2.权利要求1的蛋白质缀合物，其中所述非肽聚合物在其两末端具有两个反应基团，通过这两个反应基团，该聚合物被共价地连接到生理学活性多肽和免疫球蛋白上。
3.权利要求2的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白被共价地连接到至少两个由生理学活性多肽和非肽聚合物形成的复合物上。
4.权利要求1的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白选自由IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合所构成的组。
5.权利要求4的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合所构成的组。
6.权利要求4的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
7.权利要求1的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白选自由具有野生型糖基化的免疫球蛋白、具有增加或减少的糖基化程度的免疫球蛋白、无糖基化的免疫球蛋白及其组合所构成的组。
8.权利要求7的蛋白质缀合物，其中通过选自由化学方法、酶学方法、生物技术方法及其组合所构成组的方法进行免疫球蛋白的糖基化程度的增加或减少或无糖基化。
9.权利要求2的蛋白质缀合物，其中所述非肽聚合物的反应基团选自由乙醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组。
10.权利要求9的蛋白质缀合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
11.权利要求9的蛋白质缀合物，其中所述非肽聚合物在其两末端具有乙醛基。
12.权利要求1的蛋白质缀合物，其中所述非肽聚合物在其末端分别被共价地连接到免疫球蛋白的氨基末端、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基以及生理学活性多肽的氨基末端、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基。
13.权利要求1的蛋白质缀合物，其中所述非肽聚合物选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚(乳酸-乙醇酸)、可生物降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合所构成的组。
14.权利要求13的蛋白质缀合物，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。
15.权利要求1的蛋白质缀合物，其中所述生理学活性多肽选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体所构成的组。
16.权利要求15的蛋白质缀合物，其中所述生理学活性多肽选自由人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、集落刺激因子、白介素、葡糖脑苷脂酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、载脂蛋白E、促红细胞生成素、高糖基化促红细胞生成素、VII因子、VIII因子、IX因子、纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成骨生长因子、成骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心房肽、软骨诱导因子、结缔组织激活蛋白、促卵泡激素、促黄体素、FSH释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、胰泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、受体、受体拮抗剂、细胞表面抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和scFv的抗体片段、和病毒来源的疫苗抗原所构成的组。
17.权利要求16的蛋白质缀合物，其中所述生理学活性多肽是人生长激素、α干扰素、β干扰素、粒细胞集落刺激因子或促红细胞生成素。
18.一种制备权利要求1的蛋白质缀合物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种生理学活性多肽、至少一种免疫球蛋白与至少一种在其两末端具有反应基团的非肽聚合物共价连接；和
(b)分离主要含有共价相连的活性多肽、免疫球蛋白和非肽聚合物的蛋白质缀合物。
19.权利要求18的方法，其中步骤(a)进一步包括：
(a1)将非肽聚合物的一个末端与免疫球蛋白或生理学活性多肽共价地结合；
(a2)从得到的反应混和物中分离出包括与免疫球蛋白或生理学活性多肽相结合的非肽聚合物的复合物；和
(a3)将上述复合物的非肽聚合物的游离末端与免疫球蛋白或生理学活性多肽共价地结合，以生成蛋白质缀合物，该缀合物中包含彼此共价相连的生理学活性多肽、非肽聚合物和免疫球蛋白。
20.权利要求19的方法，其中在步骤(a1)中的生理学活性多肽与非肽聚合物的摩尔比是在从1∶2.5到1∶5的范围内。
21.权利要求19的方法，其中在步骤(a1)中的免疫球蛋白与非肽聚合物的摩尔比是在从1∶5到1∶10的范围内。
22.权利要求19的方法，其中在步骤(a2)中所获得的复合物与步骤(a3)中的生理学活性多肽或免疫球蛋白的摩尔比是在从1∶1到1∶3的范围内。
23.权利要求19的方法，其中在存在还原剂的条件下实施步骤(a1)和(a3)。
24.权利要求23的方法，其中所述还原剂是氰基硼氢化钠、硼氢化钠、二甲胺硼酸盐或吡啶硼酸盐。
25.一种半衰期被延长的生理学活性多肽的药物组合物，其包括权利要求1-17中任一项的蛋白质缀合物和药学上可接受的载体。
26.一种用于延长生理学活性多肽的体内半衰期的方法，该方法包括将在其两末端具有反应基团的非肽聚合物与生理学活性多肽和免疫球蛋白共价连接的步骤。
27.权利要求26的方法，其中所述免疫球蛋白被共价连接到至少两个由生理学活性多肽和非肽聚合物形成的复合物上。
28.权利要求26的方法，其中所述免疫球蛋白选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合所构成的组。
29.权利要求28的方法，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
30.权利要求26的方法，其中所述免疫球蛋白选自由具有野生型糖基化的免疫球蛋白、具有增加或减少的糖基化程度的免疫球蛋白、无糖基化的免疫球蛋白及其组合所构成的组。
31.权利要求30的方法，其中通过选自由化学方法、酶学方法、生物技术方法及其组合所构成的组的方法进行免疫球蛋白的糖基化程度的增加或减少或无糖基化。
32.权利要求26的方法，其中所述非肽聚合物的反应基团选自由乙醛、丙醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组。
33.权利要求26的方法，其中所述非肽聚合物选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合所构成的组。
34.权利要求33的方法，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。
35.权利要求26的缀合物方法，其中所述生理学活性多肽选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体所构成的组。
36.权利要求35的方法，其中所述生理学活性多肽选自由人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、集落刺激因子、白介素、葡糖脑苷脂酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、载脂蛋白E、促红细胞生成素、高糖基化促红细胞生成素、VII因子、VIII因子、IX因子、纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成骨生长因子、成骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心房肽、软骨诱导因子、结缔组织激活蛋白、促卵泡激素、促黄体素、FSH释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、胰泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、受体、受体拮抗剂、细胞表面抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和scFv的抗体片段、和病毒来源的疫苗抗原所构成的组。
37.权利要求36的方法，其中所述生理学活性多肽是人生长激素、α干扰素、β干扰素、粒细胞集落刺激因子或促红细胞生成素。
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