CN1690079A

CN1690079A - 聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物

Info

Publication number: CN1690079A
Application number: CNA200410037523XA
Authority: CN
Inventors: 钟慧娟
Original assignee: Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Best Pharmaceutical Co ltd; Lianyungang Hongchuang Pharmaceutical Co ltd; Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2024-04-28
Also published as: CN100355786C; WO2005105151A1

Abstract

本发明涉及长效胸腺肽1衍生物及其适用于药用的盐的制备方法和其应用。长效胸腺肽衍生物由胸腺肽衍生物和聚乙二醇共价连结组成，其结构如说明书中所定义。用于聚乙二醇修饰的前体胸腺肽1衍生物可以用化学合成方法制备，也可用重组DNA方法制备。

Description

聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物

技术领域

本发明涉及长效胸腺肽1衍生物的制备和应用。具体涉及聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物。

技术背景

胸腺是体内的重要免疫器官，在淋巴系统发育和维持免疫系统的正常功能中起重要作用。尤其在抗感染，抗肿瘤，自身免疫性疾病和器官移植等作用中具有特殊的意义。随着机体年龄老化，胸腺渐萎缩退化，肿瘤，感染，免疫性疾病等发病率逐渐增高。近年国外学者将胸腺肽提纯为几种单独成分，发现其中胸腺肽1的生物学活性比胸腺肽混合物活性高10-1000倍。胸腺肽1属于胸腺肽第五组分，具有免疫调节作用，在体外可以进致敏细胞生成淋巴因子，具有免疫调节作用，在体外可以促进致敏细胞生成淋巴因子，如α-IFN，γ-INF，IL-2；增强细胞因子高亲和力IL-2的表达；调控骨髓前体细胞和脾细胞的末端脱氧核酸转移酶(TdT)活性；增强骨髓前体细胞的Thy1和Lyt1，2，3，的表达；加速NK细胞的生成，促进NK细胞的活性；通过增强辅助T细胞的活性可以促进混合淋巴细胞的反应；拮抗胸腺细胞成熟过程中的凋亡。体内应用结果也表明其在T细胞发育和功能重中具有重要意义；可促进淋巴细胞分泌IL-2和IL-2的表达；增强宿主的抗感染能力；促进病毒清除；增强免疫功能；有抗氧化，抑制癌细胞生长等重要作用；临床上常应用于治疗肿瘤，抗病毒及免疫缺陷病人的辅助治疗，并可以作为疫苗增强剂使用。Chien等(Chien，R-N et al，Hepatology，1998；27：1383-138)用胸腺肽1治疗慢性乙型肝炎患者，其HBV DNA血清清除率和HBeAg阴转率高于未用胸腺肽1治疗的对照组，且病理学检查也发现治疗组炎症及纤维生成情况均显著底于对照组。在治疗肝纤维化方面胸腺肽a1也有独到之处。目前发现对肝纤维化只有IFN有一定疗效，但其存在低反应性和剂量限制等缺点，Sherman等(Sherman，K.E.等，Hepatology，1998；27：1128-35)将IFN和胸腺肽1合用，治疗慢性丙型肝炎，随机分组，双盲对照，观察到合用组各项检测指标均优于单用IFN组和未处理对照组，其中HCV RNA清除率为此37.1％，明显高于单用组IFN组的确16.2％。胸腺肽1对肝癌也有治疗作用，Stefanini等(Stefanini G.F.等，Hepatol-Gastroenterology，1998；45：209-15)用它治疗了不下12例肝癌患者，发现其存活期显著延长。

近年国内外已有胸腺肽1的产品，商品名“日达仙”，人工化学合成，不含其他血清产物如白蛋白等。临床应用治疗乙型肝炎，丙型肝炎，免疫缺陷病毒感染以及一些肿瘤，如黑色素瘤，肺癌，白血病，磷状上皮细胞癌，结肠癌等，效果较为显著。但是胸腺肽1本身的药物动力学性质较差，在体内逗留时间较短而被排除，其半衰期为2小时。动物实验证明不能完全发挥其应有的药效。这就需要频繁注射胸腺肽1，因此导致治疗的不方便和治疗成本升高，同时因为价格昂贵普通病人难以承受，治疗质量下降。研究表明，体内胸腺肽1是由体内前胸腺肽1衍生而来，前胸腺肽1和胸腺肽1具有相同的生活活性，其差别就在于它们分子量的大小不同。前胸腺肽1其体内活性可能持久些。因为其分子量较大排除时间要更长些。因此，解决上述问题的方法之一，就是研究开发长效的胸腺肽1衍生物，用化学修饰的方法来延长胸腺肽1在体内的停留时间和稳定性，将会达到减少治疗成本，提高治疗质量的目的。

借助于用聚乙二醇修饰蛋白成功的先例，用同样的技术来修饰胸腺肽1衍生物将会改进其药代性质，从而提高药效。WO 03/037272公开了有关用高聚物来修饰胸腺肽1本身的方法及应用。具体地说，用分子量为20,000左右的聚乙二醇来修饰胸腺肽1本身所含五个氨基之一或同时修饰其中多个氨基。正是因为胸腺肽1有五个氨基(一个N端氨基，四个赖氨酸側链氨基)，再加上其化学修饰是建立这五个氨基基础上的，所以这种修饰方法的选择专一性只有通过复杂的化学合成及保护机制才能实现，因而，对其进行大规模生产的成本高，达到商业化的可能性很小。这需要寻找在工业上更易于制备的修饰性胸腺肽1衍生物和制备方法。

鉴于上述观察和经过研究比较发现，借助于反应专一的的化学修饰方法，用聚乙二醇修饰胸腺肽1的C端来模拟体内前胸腺肽1和胸腺肽1的作用，这样会最小程度地减少或影响胸腺肽1本身的生物活性的可能性。为此，只有用胸腺肽1的衍生物而不是胸腺肽1本身作为修饰的前体。就是说，在胸腺肽1的C端加上修饰反应的连接点或把其序列内的赖氨酸，用精氨酸替换从而促成修饰反应的专一性。这些修饰所用前体的制备可以用本领域公知的任何技术进行完成，优选用化学方法或用重组DNA方法。

本发明目的在于提供一类用聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物C端而产生的一类新化合物，它们的制备方法具有反应专一生产工艺简洁的特点。它们可以作为注射制剂或其它制剂，用于免疫功能低下的疾病的治疗及辅助治疗。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明涉及一种用聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其可药用盐，该聚乙二醇在胸腺肽1衍生物的C端进行修饰。

所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于胸腺肽1衍生物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。另外胸腺肽1衍生物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端。聚乙二醇的分子量范围为5,000-80,000，优选为8,000-60,000，更优选为10,000-50,000，最优选的为20,000-40,000。

本发明的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于具有下式结构：

A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-B-Asp-Leu-C-Glu-D-E-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

其中A是H或Ac；

B，C，D，E是Lys或Arg，

X选自(Gly)n，(Gly-Ser)n，(Gly-Gly-Ser)n，(Ser-Gly-Gly)n，

n＝0-10

Y是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，并且Y是聚乙二醇修饰的残基；

Z是OH或NH2。

所示结构为SEQ ID NO：1-12所述的序列。

所示的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其中

A为Ac；

B，C，D，E是Lys；

n＝0；

Y是PEG40K修饰的Cys。或者，

A为Ac；

B，C，D，E是Arg；

n＝0；

Y是PEG40K修饰的Lys。

本发明还涉及聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐的制备方法，其中包括以下步骤：

用化学合成方法或基因工程法制备供修饰的前体胸腺肽1衍生物；前体胸腺肽1衍生物C端与聚乙二醇进行衍生。

该方法包括以下步骤：

(1)制备或获得(a)含麦克尔加成反应受体的聚乙二醇与含麦克尔加成反应给体半胱氨酸的胸腺肽1衍生物；或(b)含麦克尔加成反应给体的聚乙二醇与麦克尔加成反应受体的胸腺肽1衍生物；

(2)进行麦克尔加成反应，用其受体或给体衍生的聚乙二醇和胸腺肽1衍生物进行反应，形成聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物。

反应类型解释

在该方法中，前体胸腺肽1衍生物C端与聚乙二醇进行衍生是通过前体胸腺肽1衍生物C端的半胱氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸作为聚乙二醇化学修饰点，与聚乙二醇进行衍生。

通过反应专一的修饰反应而形成共价连接应选自以下的方法：

<1>具有形成不对称双硫键能力的聚乙二醇或胸腺肽1衍生物反应；

<2>具有羧基活化的聚乙二醇衍生物与含C端赖氨酸或组氨酸的胸腺肽1衍生物共价结合反应；

<3>具有醛基的聚乙二醇衍生物与含C端赖氨酸的胸腺肽1衍生物通过还原胺化反应；

<4>具有异氰或异硫氰基团的聚乙二醇衍生物含C端赖氨酸的胸腺肽1衍生物通过与氨基加成反应，形成脲或硫脲连接；

<5>具有羰基活化的聚乙二醇与含C端赖氨酸或组氨酸反应形成氨酯连接。

<6>具有2-酮基-苯乙醛的聚乙二醇衍生物与含C端精氨酸的胸腺肽1衍生物反应；

<7>具有含巯基的胸腺肽1衍生物与含易离去基因的聚乙二醇发生亲核取代反应。

行麦克尔加成反应为含活化的双硫键的聚乙二醇与含半胱氨酸的胸腺肽1衍生物反应。

所述的供聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐可用于治疗与免疫系统调节物应答相关的疾病，对免疫系统调节物应答相关的疾病包括流行性感冒，慢性肝炎，免疫功能低下，肿瘤病毒感染。

反应类型解释

换言之，本发明的内容提供了一种用聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其可药用盐，该聚乙二醇在胸腺肽1衍生物的C端进行修饰，优选具有下式结构：

5 10

A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser

15 20

-Glu-Ile-Thr-Thr-B-Asp-Leu-C-Glu-D-E-Glu

25 30

-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

其中A是H或Ac；

B，C，D，E是Lys或Arg，

X选自(Gly)n，(Gly-Ser)n，(Gly-Gly-Ser)n，(Ser-Gly-Gly)n，

n＝0-10

Y是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，并且Y是聚乙二醇修饰的残基；

Z是OH或NH2，

如果Y是Cys或高Cys则聚乙二醇是用硫醚键或双硫键而共价结合；如果Y是Lys，则聚乙二醇是用酰胺键或二级胺而共价结合；如果Y是His，则聚乙二醇是与组氨酸的咪唑环山的氮形成酰咪唑而共价结合；如果Y是Arg，则聚乙二醇是通过型成杂环而联接的。

聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其可药用盐优选为SEQ ID NO：1-12所述的序列，最佳的选择性的氨基酸或基团具有以下定义：

A为Ac，B，C，D，E是Lys，n＝0，Y是PEG40K修饰的Cys；或

A为Ac，B，C，D，E是Arg，n＝0，Y是PEG40K修饰的Lys。

本发明中所用的聚乙二醇的分子量范围为5,000-80,000。其中以分子量范围为8,000-60,000为佳，以10,000-50,000更好，以20,000-40,000最好。

本发明中胸腺肽1衍生物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端，以连接在一个末端的修饰方法为佳。

本发明提供的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物是两性化合物，所属领域技术人员利用公知技术可使用本领域常用的酸性或碱性化合物与之反应成盐。

通常采用的形成酸加成盐的酸为：盐酸，氢溴酸，氢碘酸，碳酸，磷酸，对甲苯磺酸，甲磺酸，苯酸，对溴苯基碳酸，碳酸，琥珀酸，柠酸，苯甲酸，乙酸盐，氟乙酸等。这类盐的例子包括硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，亚硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，盐酸盐，溴化物，碘化物，乙酸盐，三氟乙酸盐，丙酸盐，癸酸盐，辛酸盐，丙烯酸盐，甲酸盐，异丁酸盐，己酸盐，庚酸盐，丙炔酸盐，苯酸盐，丙二酸盐，丁二酸盐，辛二酸盐，癸二酸盐，富马酸盐，马来酸盐，丁炔-1，4-二酸盐，乙炔-1，6-二酸盐，苯甲酸盐，氯苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基苯甲酸盐，羟基苯甲酸盐，甲氧基苯甲酸盐，苯己酸盐，苯丙酸盐，苯丁酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，r-羟基丁酸盐，甘醇酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐，丙磺酸盐，萘-1-磺酸盐，萘-2-磺酸盐，扁桃酸盐等，优选的酸加成盐是聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物与盐酸盐，氢溴酸，乙酸，三氟乙酸，尤其是乙酸形成的盐。

碱性物质也可以与聚乙二醇修饰的胸腺肽1反应形成盐，这些碱性物质包括铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐，碳酸氢盐等。典型的有氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，碳酸钠，碳酸钾等。

本发明所述的胸腺肽1衍生物的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备，此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸，用多肽合成法或手工合成法来进行氨基酸序列的合成，再经切除，经高效液相(HPLC)分离纯化，冻干。所得多肽为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。本发明的胸腺肽1衍生物优选具有SEQ ID NO：1-24的氨基酸序列。

本发明所述的胸腺肽1衍生物也可用基因工程法制备，其步骤包括；

a.按胸腺肽1衍生物的氨基酸序列合成基因片段；

b.基因片段经连接，质粒构建，受固体的培养，转化，克隆得到菌株；

c.菌株经发酵，破壁，抽提得到色涵体；

d.色涵体裂解，分离得粗品，给高效液相仪(HPLC)分离纯化，最后经冻干所得为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。

本发明所述的用聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物制备方法，其中包括：

1、制备或获得(a)含麦克尔加成反应受体的聚乙二醇与含麦克尔加成反应给体半胱氨酸的胸腺肽1衍生物；或(b)含麦克尔加成反应给体的聚乙二醇与麦克尔加成反应受体的胸腺肽1衍生物；

2、进行麦克尔加成反应，用其受体或给体衍生的聚乙二醇和胸腺肽1衍生物进行反应，形成聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物，如含马来酰亚胺衍生的聚乙二醇与含半脱氨酸的胸腺肽1衍生物加成反应而形成产品。

其中该方法优选通过以下步骤进行制备：

(1)具有形成不对称双硫键能力的聚乙二醇或胸腺肽1衍生物，如含活化的双硫键的聚乙二醇与含半胱氨酸的胸腺肽1衍生物反应而形成产品；

(2)具有羧基活化的聚乙二醇衍生物与含C端赖氨酸或组氨酸的胸腺肽1衍生物反应形成酰胺键而共价结合形成产品，此时胸腺肽1内部所含的四个赖氨酸应用精氨酸替换；

(3)具有醛基的聚乙二醇衍生物与含C端赖氨酸的胸腺肽a1衍生物通过还原胺化反应形成产品，此时胸腺肽1内部所含的四个赖氨酸因为精氨酸替换。

(4)具有异氰或异硫氰基团的聚乙二醇衍生物含C端赖氨酸的胸腺肽1衍生物通过与氨基加成而形成产物，此时胸腺肽1内部的四个赖氨酸应为精氨所替换；

(5)具有2-酮基-苯乙醛的聚乙二醇衍生物与含C端精氨酸的胸腺肽1衍生物反应形成的产品；

(6)具有含巯基的胸腺肽1衍生物与易离去基因(如I，Br，Cl)的聚乙二醇发生亲核取代反应形成的产品。

本发明的化合物是用聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物，亦包括为进行聚乙二醇修饰而产生的新中间体，是适用于治疗对免疫系统调节物应答的各种疾病和指怔的免疫系统调节物。本发明的增强免疫化合物可用于丧失免疫和免疫抑制的患者重组免疫功能，并能用于治疗免疫缺陷疾病，如流行性感冒，慢性肝炎，免疫功能低下，肿瘤病毒感染等疾病，特别是对于治疗肿瘤，病毒感染的病人可作辅助治疗。

本发明提供了一类新的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物，利用聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物的C端来模拟前胸腺肽1。经药效药代实验证明，聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物完全具有胸腺肽1的药效作用。胸腺肽1如果用皮下注射其体内半衰期只有近2小时，但是用本发明中制备的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物在体内半衰期延长至此2-3天。其作免疫增强辅助治疗的用量可用常规的剂量滴定法测定，其用量可确定为1-100mg/公斤体重/周的范围内，其中以5-50mg/公斤体重/周为佳，以20mg/公斤体重/周为最优。用聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物可用合适药用液体如水制针剂而使用。其药代性质得到了很大的改善，从而真正产生了长效胸腺肽1衍生物。

与N端聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物比较发现，本发明所提供的C端聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物以及制备方法易于制备，克服了N端聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物在工业生产中不易大规模产业生产、难于获得的问题，且治疗活性更强。

附图说明

图1为受试品标准ELISA校正曲线。

图2为猕猴sc PEG-TA1(64μg.kg-1)后血清抗原浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面实施是对本发明的进一步阐述，而不是对发明的限制。

实施例一：

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Glu-Cys-PEG40K的制备

步骤1：固相化学合成法制备供聚乙二醇修饰的前体——C端半胱氨酸胸腺肽1衍生物：

(1)所采用的氨基酸单体

Fmoc-Ala-OH Fmoc-Lys(Boc)-OH

Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH

Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Thr(tBu)-OH

Fmoc-Cys(Trt)-OH Fmoc-Val-OH

Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Ile-OH

Fmoc-Leu-OH

上式中缩写表示：

Fmoc：9-芴基甲氧羰基本(9-fluorenylmethoxycarbonyl)

Boc：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)

Trt：三苯甲基(trityl)

OtBu：叔丁基

tBu：叔丁基(tert-butyl)

(2)合成所采用的设备及试剂

仪器：多肽序列的合成采用手工方法进行，反应器具均为专制。

试剂：N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，六氢吡啶，异丙醇，甲醇，二异丙基，碳二亚胺(N，N-Diisopropylcarbodimide)，1-羟基苯并三唑(HOBt)

(3)操作

于底部装有烧结玻璃过滤器和颈部装有机械搅拌器的肽合成烧瓶中加入10g接有Fmoc-Cys(Trt)-OH的王树脂(Fmoc-Cys(Trt)-OH-Wang resin)0.6mMol/g树脂，6mmol)。用150ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤此树脂。用20％的六氢吡啶的DMF溶液(300ml)分二次每次各10分钟来处理树脂，以去除氨基保护基团Fmoc。再用DMF 450ml分三次洗涤树脂，抽干。以溶于150ml DMF中的15mmol Fmoc-Asn(Trt)-OH(8.95g)，15mmol 1-羟基苯并三唑水和物(2.3g)和15mmol N，N-二异丙基碳化二亚胺(2.34ml)与去除了氨基保护基因的树脂反应二小时形成Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)王树脂。茚三酮试验应显阴性。然后，按照下面的步骤继续进行固相合成。其中，依此将一种氨基酸连结于树脂上增长的肽链上(另有说明)。除外，每次洗涤用20体积溶剂或试剂。除另有说明外，所有氨基酸的衍生物均为L构型。

1)用溶于DMF的20％六氢吡啶溶液对所说的树脂进行洗涤。

2)用溶于DMF的20％六氢吡啶溶液中搅拌30分钟；

3)用DMF洗涤三次；

4)与溶于DMF中各为15mmol的Fmoc-Glu(OtBu)-OH，1-羟基苯并三唑水和物和N，N-二异丙基碳化二亚胺搅拌120分钟；

5)用异丙醇洗涤二次；

6)用DMF洗涤三次；

7)试验茚三酮的显色反应，如是阳性，重复步骤4-6；如阴性，则进行下一个合成循环。

依此用下述Fmoc-氨基酸且在每一循环步骤7中用相应的氨基酸重复合成循环；

Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-Ort，

Fmoc-Val-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Glu(OtBu)，

Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH，

Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，

Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，

Fmoc-Ile-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH， Fmoc-Ser(tBu)-OH，

Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，

Fmoc-Val-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Ala-OH，

Fmoc-Asp(O+Bu)-OH，Fmoc-Ser(+Bu)-OH，

最后用乙酸乙酰化后从而完成全部合成循环。这样获得受保护的C端半胱氨酸修改了的胸腺肽1王树脂。

Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Wang resin重40g。

把获得的次肽树脂(5.0g)与含2％苯甲硫醚，2％甲醇，4％三异丙基硅烷，2％二巯基乙烷50ml三氟乙酸混合搅拌2小时。去除三氟乙酸后，用乙醚沉淀出产品粗品。将粗品溶于100ml浓度为0.2M的醋酸胺缓冲液中。过滤后，上清液待用制备HPLC分离提纯。

以10ml/分流速，在234nm处检测，用Vydac，C18拄(2.2×25cm，10u)。用线性梯度0.5％乙腈/1分钟洗脱(缓冲液A：0.01％三氟乙酸水溶液；缓冲液B：0.01％三氟乙酸乙腈溶液)。将含产品的组成合并，冻干得纯度为99％的产品0.4g。用液质(LC-MS)联用对分子量进行测定表明具有正确的分子量(M+2H)²⁺＝1606，(M+H)⁺＝3210。(计算的分子量为＝3210，参见图2)。对此肽酸水解后，水解条件为：用6NHCl在110℃水解24小时。进行氨基酸分析表明此肽具有预计的氨基酸比例。

步骤2：多肽前体与聚乙二醇反应，合成修饰的胸腺肽1衍生物：

将50mgC端半胱氨酸胸腺肽1和500mg用马来酰亚胺修改了的甲氧基聚乙二醇(分子量为40,000Dalton)溶于己于5ml 0.1M磷酸盐缓冲液中。反应二小时后，用Superdex去盐，然后再用反相制备高效液相法分离出产品。条件为；Vydac C18柱(2.2×25cm，10μ)；线性梯度0.5％乙腈/分钟，乙腈和水都含0.01％三氟乙酸；检测：234mm；流速：10毫升/分钟。产品冻干后得490mg。

实施例二：

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Lys-PEG40K

步骤1：固相化学合成制备供聚乙二醇修饰的前体C端赖氨酸14，17，19，20，精氨酸取代的胸腺肽1衍生物：

固相化学合成法见实施例1固相化学制备C端半胱氨酸胸腺肽1衍生物。合成用10g接有Fmoc-Lys(Boc)-OH的王树脂(0.6mmol/g树脂，6mmol)。合成按照下述Fmoc氨基酸且在每一循环步骤中用相应的氨基酸重复合成循环：

Fmoc-Asn(Tre)-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH，

Fmoc-Glu(OtBu)-Ort，

Fmoc-Val-OH， Fmoc-Val-OH， Fmoc-Glu(OtBu)，

Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH，

Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Leu-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，

Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，

Fmoc-Ile-OH， Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，

Fmoc-Ser(tBu)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-OH，

Fmoc-Val-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Ala-OH，

Fmoc-Asp(O+Bu)-OH， Fmoc-Ser(+Bu)-OH，

最后用乙酸乙酰化后，从而完成全部合成循环，这样获得受保护的多肽树脂，重40g。将粗品多肽从树脂中切割的方法与实施例一中的方法相似。所得的粗品多肽的分离提纯制备方法亦和实施例一中所给的方法相似。对此多肽进行水解，水解条件为：用6NHCL在110℃水解24小时。进行氨基酸分析表明，此肽具有预计的氨基酸比例。

多肽前体与聚乙二醇形成聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物，将50mgC端赖氨酸，14，17，19，20精氨酸联代的胸腺肽1衍生物溶于5ml0。1M碳酸氢钠溶液中。向此溶液加入550mg用含羧基经N-羟基丁二酰亚胺活化的聚乙二醇(分子量40,000Dalton)。

步骤2：多肽前体与聚乙二醇反应，合成修饰的胸腺肽1衍生物：反应PH应控制在8-9之间。反应4小时后用Superdex去盐，然后再用反相制备高效液相法分离出产品。条件为：Vydac C18柱(2.2×25cm，10μ)；线性梯度0.5％乙睛/分钟，乙睛和水均含0.01％三氟乙酸；检测；234nm；流速10毫升/分钟。产品冻干后得出490mg。

实施例三药效实验

用日达仙为阳性对照，检测样品对T淋巴细胞产生细胞因子的影响作用，以确定样品对T淋巴细胞的免疫活性是否有调节作用和作用的强弱。

[实验原理]

体外培养的淋巴细胞中T淋巴细胞在受到有丝分裂原刀豆素A(ConA，Concanavalin A)刺激后，可导致T淋巴细胞活化，产生细胞因子合成、细胞因子受体表达、细胞分化及细胞增殖的细胞行为的变化。细胞因子的产生和细胞的增殖反应是免疫细胞的功能状态和细胞活化的反映。检测手段具有可靠性、良好的重复性及简便性等特点，故通过细胞因子产生和细胞增殖反应的测定来判断样品对T淋巴细胞的功能影响作用一直得到广泛的应用。

[实验材料]

1.样品：日达仙、PEG样品用1640培养液稀释，分别稀释成实验所需浓度。

2.动物：实验采用ICR小鼠，雄性，6-8周龄，购于中科院上海实验动物中心，动物合格证书号：SCXK(沪)2002-0010。动物购来后，饲养于本所清洁级动物房，一般饲养3-4天后，用于实验。

2.试剂：ConA(Concanavalin A)购自Sigma公司。

RPMI 1640培养液为GIBCO产品配制，含10％灭活的胎牛血清，HEPES缓冲液10mM，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，谷氨酰胺2mM，α-巯基乙醇50μM，PH7.2。

细胞因子IFN-、IL-2等ELISA试剂盒(Becton Dickinson co.生产)。

[实验方法]

脾细胞悬液的制备：无菌取出脾脏，用毛玻璃片将小鼠脾脏磨碎，制成脾细胞悬液。裂解红细胞后，洗涤三次，计数(活细胞在95％以上)。用含10％FBS(胎牛血清)RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为5×106细胞/ml。

一、IL-2和IFN-γ含量的测定(ELISA法)

获取培养上清液：

取小鼠脾细胞，调至5×106/ml，加入24孔板中，1ml/孔；各样品每个浓度分别加于24孔板，0.5ml/孔；加刺激物ConA(20ug/ml)0.5ml/孔。370C，CO2培养箱中培养24小时，离心，收培养上清液。

二、ELISA检测方法：

抗体包被：用包被稀释液将抗体稀释，96孔酶标板加入稀释后的抗体(Capture Antibody)，50μl/孔。封板，于40C过夜。

封闭：去抗体溶液，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入封闭液(PBS/10％FBS)，100ul/孔。室温1小时。

标准品和样品：去封闭液，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入标准品和样品，50μl/孔。室温2小时。

检测抗体和酶：去标准品和样品，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入稀释后的检测抗体(Detection Antibody)和酶(HRP)，50μl/孔，室温1小时。

底物显色：去检测抗体和酶，用洗液(PBS/Tween溶液)洗3次，加入溶于柠檬酸，双氧水的底物(TMB)，50μl/孔。室温，避光，30分钟。显色后，加终止液(2N H2SO4)，25ul/孔。

OD值：置酶标仪中，于450nm、校正570nm处，测定OD值。

[实验结果]

样品对ConA诱导T淋巴细胞细胞因子产生的影响作用检测：

		IFN-r(pg/ml)		IL-2(pg/ml)
		IFN-r(pg/ml)		IL-2(pg/ml)		样品	浓度(ug/ml)	Mean	SD	Mean	SD
对照		4122	77	2920	24	样品	浓度(ug/ml)	Mean	SD	Mean	SD
对照		4122	77	2920	24	日达仙	0.0010.010.1110100	417741184106483648324095	17713419120836427	323135823434369236143840	302518419304476
PEG样品	0.0010.010.1110100	480946034141494938745467	151234200367373	350534383339321433483582	2961171345529325	日达仙	0.0010.010.1110100	417741184106483648324095	17713419120836427	323135823434369236143840	302518419304476

[实验结论]

在ConA激活诱导T细胞产生细胞因子实验中，日达仙样品对T细胞的IFN-产生在1ug/ml和10ug/m时有一定的促进作用，而C-thymosin2样品在多个浓度单位、并与日达仙样品相比有较好的促进T细胞的IFN-产生。

在ConA激活诱导T细胞产生细胞因子实验中，日达仙和C-thymosin 2两样品对T细胞的IL-2产生的促进作用无明显的差异。

实施例四药代实验

1.实验目的

观察PEG样品(代号：PEG-TA1)在猕猴体内的药代动力学特点。

2.试验材料和方法

2.1受试品

受试品PEG-TA1为无色澄清注射液，4℃保存。

2.2动物

猕猴，军事医学科学院实验动物中心产(军医动字第BDW95002号)，共3只，雌1只，雄2只，体重3.7±0.5kg。分笼用猴标准饲料喂养，自由饮水，每日给新鲜水果两次。

2.3给药途径和剂量

皮下注射。剂量根据临床人用剂量换算，猕猴剂量为64μg.kg-1。

2.4取血时间及样品制备

于药前、药后0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48h自后肢静脉取血。取血后30分钟以内室温下离心760g×15min，。避免溶血。分离血清，-20℃保存待测。

2.5检测方法

ELISA法测定血清PEG-TA1浓度。德国Immundiagnostik公司产Thymosin α1试剂盒。

2.6药代动力学参数的估算及生物等效性的统计推断非房室-统计矩法估算药代动力学参数。

3.结果

3.1标准曲线

药盒对于受试品在1.6-16000ng.mL-1范围内有良好的反应性，呈倒“S”型曲线(图1)。实验中各板分别设标准曲线。用同一板上的标准曲线计算未知血清样品中EPO归一浓度。

3.2血药浓度

表1列出了3只猕猴sc 64μg.kg-1受试品用ELISA法测得的去本底血清抗原浓度。图2是平均血清抗原浓度-时间曲线的比较。从图和表可以看到，动物间个体差异值很大，达峰时间从4-12小时不等，平均值则于给药后8h达峰。

表1、猕猴sc PEG-TA1(64μg.kg-1)后去本底血清抗原浓度-时间变化(ng.mL-1)

Time/h	1#	2#	3#	Mean±SD	RSD％
Time/h	1#	2#	3#	Mean±SD	RSD％	0.51246812243648	169-722636-936216319761091926	1352375658802099267724681716663463	-119510341244995-745965985-	152±24716±678773±239920±3061547±7801807±12311792±9191553±525913±223695±328	15953133506851342447

3.3PK参数

根据平均血药浓度-时间资料计算的药代动力学参数如表2所示。

表2、猕猴sc PEG-TA1(64μg.kg-1)后的平均PK参数

参数	单位	mean±SD	RSD％
参数	单位	mean±SD	RSD％	AUC(0-48h)AUC(0-∝)AUC(48h-∝)AUC(48h-∝)％MRTCL/FVSSt1/2Kel	ng.h.mL-1ng.h.mL-1ng.U.h.mL-1％hmL.h-1.kg-1mL.kg-1h-	60221±1689680742±3232420521±1827725.4±17.859.2±0.76.6±2.861±2720±60.03385±0.011	28408970843443134

4.结论

PEG化修饰后的TA1总体上达峰时间延迟，末端消除相半衰期计算值也显著比文献报道的未修饰TA1原形药物为长。

序列表

SEQ ID NO： 1 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 2 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 3 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 4 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Arg-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 5 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 6 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 7 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Lys-Glu-Arg-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 8 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 9 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 10 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 11 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 12 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z

SEQ ID NO： 13 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 14 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 15 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 16 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 17 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 18 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Lys-Glu-Arg-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 19 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 20 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 21 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Lys-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 22 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 23 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Lys-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Z

SEQ ID NO： 24 A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Arg-Asp-Leu-Arg-Glu-Arg-Arg-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-His-Z

A：H，Ac，RCO-

X：(Gly)n，(Gly-Ser)n，(Gly-Gly-Ser)n，(Ser-Gly-Gly)n

Y：Lys，Cys，homoCys，衍生的Lys

Z：OH或NH2

Claims

1、一种用聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其可药用盐，该聚乙二醇在胸腺肽1衍生物的C端进行修饰。

2、如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于胸腺肽1衍生物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端或其两个末端。

3、如权利要求2所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于胸腺肽1衍生物的C端可以连接在聚乙二醇的一个末端。

4、如权利要求1-3任意一项所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于聚乙二醇的分子量范围为5,000-80,000。

5、如权利要求4所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于聚乙二醇的分子量范围为8,000-60,000。

6、如权利要求5所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于聚乙二醇的分子量范围为10,000-50,000。

7、如权利要求6所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于聚乙二醇的分子量范围为20,000-40,000。

8、如权利要求1-3任意一项所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于具有下式结构：

其中A是H或Ac；

B，C，D，E是Lys或Arg，

X选自(Gly)n，(Gly-Ser)n，(Gly-Gly-Ser)n，(Ser-Gly-Gly)n，

n＝0-10

Y是Cys或高Cys或Lys或Arg或His，并且Y是聚乙二醇修饰的残基；

Z是OH或NH2。

9、如权利要求8所述的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于所示结构为SEQ ID NO：1-12所述的序列。

10、如权利要求8所示的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于：

A为Ac；

B，C，D，E是Lys；

n＝0；

Y是PEG40K修饰的Cys。

11、如权利要求8所示的聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐，其特征在于：

A为Ac；

B，C，D，E是Arg；

n＝0；

Y是PEG40K修饰的Lys。

12、权利要求1-11所述的供聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐的制备方法，其中包括以下步骤：

用化学合成方法或基因工程法制备供修饰的前体胸腺肽1衍生物；

前体胸腺肽1衍生物C端与聚乙二醇进行衍生。

13、根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于该方法是以下具体步骤：

14、根据权利要求12或13所述的制备方法，其特征在于前体胸腺肽1衍生物C端与聚乙二醇进行衍生是通过前体胸腺肽1衍生物C端的半胱氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸作为聚乙二醇化学修饰点，与聚乙二醇进行衍生。

15、根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于通过反应专一的修饰反应而形成共价连接应选自以下的方法：

16、根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于行麦克尔加成反应为含活化的双硫键的聚乙二醇与含半胱氨酸的胸腺肽1衍生物反应。

17、根据权利要求1-11所述的供聚乙二醇修饰的胸腺肽1衍生物及其药用盐在制备药物中的应用，其中该药物可用于治疗与免疫系统调节物应答相关的疾病。

18、根据权利要求17所述的应用，其特征在于对免疫系统调节物应答的疾病是流行性感冒，慢性肝炎，免疫功能低下，肿瘤病毒感染。