MX2007014889A

MX2007014889A - Fusion de interferon-inmunoglobulina g.

Info

Publication number: MX2007014889A
Application number: MX2007014889A
Authority: MX
Inventors: Leonard G Presta; Narendra Kishnani
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2008-02-19
Also published as: WO2006127757A2; IL187347A0; AU2006250068A1; KR20080021614A; JP2008545409A; CA2609613A1; EP1899368A2; ZA200709871B; WO2006127757A3; CN101184771A; US20060269516A1

Abstract

La presente invencion provee, entre otras cosas, polipeptidos para el tratamiento de varias enfermedades tales como HCV asi como metodos de tratamiento y metodos para hacer los polipeptidos.

Description

FUSIÓN DE INTERFERON-INMUNOGLOBULINA G SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/685,018; presentada el 26 de mayo de 2005, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos de fusión entre interferón (IFN) e lgG4 así como métodos de uso y métodos de producción de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Varios tipos de interferón han sido aprobados para tratamiento de infecciones virales, cánceres y otras enfermedades incluyendo esclerosis múltiple. Por ejemplo, el interferón alfa-2b ha sido aprobado para leucemia de células pilosas, melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, infección por hepatitis C crónica e infección por hepatitis B crónica. Una ventaja de fusionar interferón a polietilenglicol (PEG) es incrementar su vida media in vivo y, por lo tanto, reducir el número de dosis requerido con el tiempo. Por ejemplo, dos de esos productos pegilados con IFN han sido aprobados con una frecuencia de dosis de una vez a la semana: PEG-Intron® y Pegasys® que respectivamente tienen un PEG de 12 kDa o un PEG de 40 kDa covalentemente ligado a la proteína de IFN. Además de mejorar el acatamiento del paciente, la extensión farmacológica en la vida media favorablemente altera las características farmacodinámicas y las eficacias relacionadas de terapia como niveles circulantes sistémicos sostenidos prolongados de IFN dan por resultado una mejor eficacia que los perfiles pulsátiles. Jones et al. (J. Interferon and Cytokine Res. 24:560-572 (2004)), describen una fusión entre interferón-alfa-2b y mutantes de los mismos e lgG1. Jones et al. Reclaman que la fusión puede ser adecuada para el tratamiento de infección por HCV y que posee propiedades farmacocinéticas benéficas. Puesto que, por ejemplo, se ha demostrado que lgG1 presenta un nivel relativamente alto de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) (véase Steplewski et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 85(13):4852-4856 (1988)), existe en la técnica la necesidad de una composición que comprende interferón fusionado a una molécula que presente una vida media extendida, baja toxicidad y alta actividad y que sea simple y barata de fabricar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención enfrenta, entre otras cosas, esta necesidad en la técnica. La presente invención provee un polipéptido aislado que comprende uno o más polipéptidos de interferón fusionados a uno o más polipéptidos de lgG4 {v.gr., un polipéptido de región Fc, v.gr., que comprende CH2+CH3+región de gozne). En una modalidad, el interferón es un miembro seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c, interferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, interferón alfa-6, interferón alfa-7a, interferón alfa-7b, interferón alfa-8a, interferón alfa-8b, interferón alfa-8c, interferón alfa-1 Oa, interferón alfa-1 Ob, interferón alfa-13, interferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, interferón alfa-17b, interferón alfa-17c, interferón alfa-17d, interferón alfa-21a, interferón alfa-21 b, interferón alfa-24, interferón beta, interferón omega, interferón tau, interferón alfa-N3, interferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-1 b, interferón gamma, interferón alfa F e interferón alfa conl {v.gr., SEQ ID NO: 2, 3 ó 15). En una modalidad, el interferón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13 y 14. En una modalidad, la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. En una modalidad, el interferón es fusionado a la lgG4 por un enlazador de péptido {v.gr., en donde el enlazador comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 18 aminoácidos {v.gr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18); v.gr., que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 , 17, 18, 19 ó 20). La presente invención también comprende cualquiera de las fusiones de IFN- lgG4 aquí en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención también provee un multímero que comprende dos o más (v.gr., 2, 3, 4, 5,6,7, 8, 9 ó 10) IFN-lg polipéptidos de la invención unidos juntos en un complejo no covalente. En una modalidad de la invención, los polipéptidos del multímero son coordinados con un catión divalente tal como Zn +. La presente invención también provee cualquiera de los polipéptidos de IFN-lg aquí en forma cristalina. Incluida dentro del alcance de la presente invención está una composición que comprende cualquier fusión de IFN-lgG4 aquí en asociación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales; por ejemplo, adecuados para tratar una condición médica seleccionada del grupo que consiste de infección por virus de Flaviviridae, esclerosis múltiple, infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis maligna, condiloma acuminado externa refractaria o recurrente, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Ph), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, infección por hepatitis B e infección por hepatitis C. En una modalidad, el agente adicional es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ribavirin, isatoribine, VX-497, viramidine, BILN 2061 , VX-950, IDN-6556 y cualquier otro agente expuesto aquí, por ejemplo, bajo la sección "Composiciones farmacéuticas" más adelante o una composición farmacéutica del mismo. La presente invención también incluye un polinucleótido aislado que codifica cualquier fusión de IFN-lgG4 expuesta aquí. En una modalidad de la invención, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 5 y 16. Una modalidad de la invención incluye un vector recombinante que comprende un polinucleótido de la invención. También incluida dentro del alcance de la presente invención es una célula hospedero aislada que comprende el vector. El presente método provee un método para incrementar la vida media in vivo de interferón que comprende fusionar el interferón a lgG4 (v.gr., para crear una fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 2, 3 y 15). Por ejemplo, en una modalidad, el método comprende expresar recombinantemente el polipéptido de fusión, por ejemplo, en una célula hospedero {v.gr., una célula bacteriana tal como E.coli); por ejemplo, en donde la fusión se expresa al introducir un polinucleótido que codifica la fusión, por ejemplo, en un vector recombinante operablemente asociado con un elemento regulador tal como un promotor, bajo condiciones en donde la fusión se expresa, opcionalmente aislando la fusión, e introduciendo la fusión o una composición farmacéutica de la misma en el cuerpo de un sujeto, tal como un humano. En una modalidad, el interferón es un miembro seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c, interferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, interferón alfa-6, interferón alfa-7a, interferón alfa-7b, interferón alfa-8a, interferón alfa-8b, interferón alfa-8c, interferón alfa-1 Oa, interferón alfa-1 Ob, interferón alfa-13, interferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, interferón alfa-17b, interferón alfa-17c, interferón alfa-17d, interferón alfa-21a, interferón alfa-21b, interferón alfa-24, interferón beta, interferón omega, interferón tau, interferón alfa-N3, interferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-Ib, interferón gamma, interferón alfa F e interferón alfa con 1. En una modalidad, el interferón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13 y 14. En una modalidad, la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 1. La presente invención también provee un método para tratar o prevenir, en un sujeto, cualquier condición médica que es tratable por terapia de interferón, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste de virus de infección de Flaviviridae, esclerosis múltiple, infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis maligna, condiloma acuminado externo refractario o recurrente, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Ph), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, infección por hepatitis B e infección por hepatitis C, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido aislado que comprende interferón fusionado a lgG4 o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo (v.gr , que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 2, 3 y 15). En una modalidad, el sujeto es una madre embarazada o una madre en lactancia. En una modalidad, el interferón es un miembro seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c, interferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, interferón alfa-6, interferón alfa-7a, interferón alfa-7b, interferón alfa-8a, interferón alfa-8b, interferón alfa-8c, interferón alfa-1 Oa, interferón alfa-1 Ob, interferón alfa-13, interferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, interferón alfa-17b, interferón alfa-17c, interferón alfa-17d, interferón alfa-21a, interferón alfa-21b, interferón alfa-24, interferón beta, interferón omega, interferón tau, interferón alfa-N3, interferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-1b, interferón gamma, interferón alfa F e interferón alfa conl . En una modalidad, el polipéptido se administra en asociación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales; por ejemplo, adecuados para tratar una condición médica seleccionada del grupo que consiste de infección por virus de Flaviviridae, esclerosis múltiple, infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis maligna, condiloma acuminado externo refractario o recurrente, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Oh), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, infección de hepatitis B e infección de hepatitis C o una composición farmacéutica del mismo. En una modalidad, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste de ribavirin, isatoribine, VX-497, viramidine, BILN 2061 , VX-950, IDN-6556 y cualquier otro agente expuesto aquí, por ejemplo, bajo la sección "Composiciones farmacéuticas" más adelante. En una modalidad, el interferón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12, 13 y 14. En una modalidad, la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. En una modalidad, el hospedero es un humano {v.gr., una madre embarazada o una madre en lactancia). En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido aislado que comprende interferón fusionado a lgG4, opcionalmente en asociación con un compuesto terapéutico anti-viral, o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo se administra durante un período de tratamiento suficiente para erradicar ARN de virus de hepatitis C detectable y para mantener ARN de virus de hepatitis C no detectable por lo menos durante doce semanas {v.gr., 24 semanas) después del fin del período de tratamiento. La presente invención también provee un método para hacer un polipéptido que comprende interferón fusionado a lgG4 que comprende introducir un polinucleótido que codifica el polipéptido en una célula hospedero bajo condiciones en donde el polinucleótido es expresado. En una modalidad, el método además comprende aislar el polipéptido. También dentro del alcance de la presente invención está cualquier polipéptido producido por el método anterior para hacer un polipéptido. Una modalidad adicional de la invención incluye cualquier fusión aislada que comprende lgG4 fusionada, opcionalmente por un péptido enlazador, a una citocina de vida meda corta {v.gr., IL-10 de cualquier especie); junto con cualquier polinucleótido que codifica una fusión, cualquier vector aislado que comprende dicho polinucleótido y cualquier célula hospedero que comprende dicho vector. La presente invención también comprende cualquier método para tratar o prevenir cualquier trastorno inflamatorio (v.gr., esclerosis múltiple, síndrome intestinal inflamatorio, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, o colitis ulcerativa) en un sujeto al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de fusión de lgG4-IL-10.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee, entre otras cosas, un producto de IFN-lgG4 que presenta un perfil de PK/PD in vivo benéfico y que se puede hacer convenientemente con un procedimiento de fabricación de un solo paso. De hecho, el procedimiento de fabricación de un solo paso es de una complejidad similar al de la expresión recombinante convencional de IFN. Más aún, el perfil de PK/PD de IFN-lgG4 requiere únicamente una frecuencia de dosificación baja. lgG4 es benéfica, en comparación con otras IgGs, tales como lgG1 , porque presenta baja toxicidad tal como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) y/o CDC (citotoxicidad dependiente de complemento). Sin estar limitado por una sola teoría o mecanismo de acción, las fusiones de lgG4 de la invención presentan ADCC y/o CDC más bajas que otros subtipos de inmunoglobulina porque lgG4 se une al complemento Fc y/o receptores de Fc gamma relativamente en forma deficiente (véase v.gr., Steplewski et ai, Proc Nati Acad Sci U.S.A. 85(13):4852-4856 (1988)). Sin estar limitado por una sola teoría o mecanismo de acción, las fusiones de la presente invención serían adecuadas para el tratamiento de mujeres embarazadas porque la fusión no cruza la barrera placentaria eficientemente. Se ha mostrado que el interferón a2b tiene efectos abortivos en Macaca mulatta (monos rhesus) a 15 y 30 millones de lU/kg. Un interferón a2b que no puede cruzar la barrera placentaria y no está contraindicada para mujeres embarazadas con, v.gr., una infección viral {v.gr., virus de hepatitis C) sería benéfico.

Biología molecular De conformidad con la presente invención, se pueden utilizar técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, v.gr., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (aqui "Sambrook, ef al., 1989"); DNA Cloninq: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Svnthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hvbridización (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcripción And Translación (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M.

Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Bioloqy, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Un "polinucleótido", "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" incluye la forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxiribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualesquiera análogos de fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, en forma de una sola cadena, en forma de doble cadena o de otra manera. Una "secuencia de polinucleótidos", "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia de nucleótidos" es una serie de bases de nucleótidos (también llamadas "nucleótidos") en un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, y significa cualquier cadena de dos o más nucleótidos. Una "secuencia codificadora" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína, o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da por resultado la producción del producto. El término "gen" significa una secuencia de ADN que codifica para, o corresponde a, una secuencia particular de ribonucleótidos o aminoácidos que comprenden todas o parte de una o más moléculas de ARN, proteínas o enzimas, y puede o no incluir secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias de promotor, que determinan, por ejemplo, las condiciones bajo las cuales se expresa el gen. Los genes pueden ser transcritos de ADN a ARN que pueden o no ser traducidos a una secuencia de aminoácidos. Una "secuencia de proteína", "secuencia de péptido" o "secuencia de polipéptido" o "secuencia de aminoácidos" incluye una serie de dos o más aminoácidos en una proteína, péptido o polipéptido. Los términos "polinucleótido aislado" o "polipéptido aislado" incluyen un polinucleótido (v.gr., molécula de ARN o ADN, o un polímero mixto) o un polipéptido, respectivamente, que son parcialmente o completamente separados de otros componentes que normalmente se encuentran en células o en sistemas de expresión de ADN recombinante. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a, membranas celulares, paredes celulares, ribosomas, polimerasas, componentes del suero y secuencias genómicas extrañas. Un polinucleótido o polipéptido aislado, preferiblemente, será una composición esencialmente homogénea de moléculas pero puede contener cierta heterogeneidad. "La amplificación" de ADN como se usa aquí incluye el uso de reacción de cadena de polimerasa (PCR) para incrementar la concentración de una secuencia de ADN particular dentro de una mezcla de secuencias de ADN. Para una descripción de PCR, véase Saiki, ef al., Science (1988) 239:487. El término "célula hospedero" incluye cualquier célula de cualquier organismo que sea seleccionado, modificado, transfectado, transformado, crecido o usado o manipulado de cualquier manera, para la producción de una sustancia por la célula, por ejemplo la expresión o replicación, por la célula, de un gen, una secuencia de ADN o ARN o una proteína. Las células hospedero incluyen células bacterianas {v.gr., E.coli), ovario de hámster chino (CHO), células J774 de macrófago murino o cualquier otra línea de células de macrófago y células Caco2 epiteliales intestinales humanas. La secuencia de nucleótidos de un polinucleótido se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica (v.gr., secuenciación química o secuenciación enzimática). "Secuenciación química" de ADN incluye métodos tales como aquellos de Maxam y Gilbert (1977) (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:560), en los cuales el ADN es aleatoriamente digerido usando reacciones específicas de base individuales. "Secuenciación enzimática" de ADN incluye métodos tales como el de Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463). Los polinucleótidos en la presente pueden ser flanqueados por secuencias reguladoras naturales (control de expresión), o pueden estar asociadas con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios de entrada a ribosoma internos (IRES) y otras secuencias de sitio de entrada a ribosoma, incrementadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias de señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones 5'- y 3'- no codificadoras, y similares. En general, un "promotor" o "secuencia de promotor" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa en una célula {v.gr., directamente o a través de otras proteínas o sustancias unidas a promotor) y que inician la transcripción de una secuencia codificadora. Una secuencia de promotor, en general, es unida en su término 3' por el sitio de inicio de transcripción y se extiende hacia el extremo 5' (en dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a cualquier nivel. Dentro de la secuencia de promotor se puede encontrar un sitio de inicio de transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, mapeando con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa. El promotor puede estar operablemente asociado con otras secuencias de control de expresión, incluyendo secuencias incrementadotas y represoras o con un polinucleótido de la invención. Los promotores que se pueden usar para controlar para expresión de genes incluyen, pero no se limitan a, promotor de citomegalovirus (CMV) (patentes de E.U.A. Nos. 5,385,839 y 5,168,062), la región de promotor temprano de SV40 (Benoist, ef al., (1981) Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, ef al., (1980) Cell 22:787-797), el promotor de timidita cinasa de herpes (Wagner, et al., (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalocioneína (Brinster, ef al., (1982) Nature 296:39-42); virus de expresión procarióticos tales como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Komaroff, ef al., (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), o el promotor de tac (DeBoer, et al., (1983) Proc Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American (1980) 242:74-94; y elementos de promotor de levaduras u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol cinasa) o el promotor de fosfatasa alcalina. Una secuencia codificadora está "bajo el control de", "funcionalmente asociada con" u "operablemente asociada con" secuencias de control transcripcional y traduccional en una célula cuando las secuencias dirigen transcripción mediada por ARN polimerasa de la secuencia codificadora a ARN, preferiblemente ARNm, que después puede ser empalmada a ARN (si contiene intrones) y, opcionalmente, traducida a una proteína codificada por ia secuencia codificadora. Los términos "expresar" y "expresión" significan permitir o causar que la información en un gen, secuencia ARN o ADN se manifieste; por ejemplo, produciendo una proteína al activar las funciones celulares implicadas en la transcripción y traducción de un gen correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una célula para formar un "producto de expresión" tal como un ARN {v.gr., ARNm) o una proteína. También se I i puede decir que el producto de expresión mismo es "expresado" por la célula. El término "transformación" significa la introducción de i I polinucleótido en una célula. El gen o secuencia introducido se puede llamar un "clon". Una célula hospedero que recibe en ADN o ARN introducido ha sido "transformada" y es un "transformante" o un "clon." El ADN o ARN introducido en una célula hospedero puede provenir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedero, o de células de un género o especie diferente. El término "vector" incluye un vehículo {v.gr., un plásmido) por el cual una secuencia de ADN o ARN puede ser introducida en una célula hospedera, para transformar el hospedero y, opcionalmente, promover la expresión y/o replicación de la secuencia introducida. Vectores que se pueden usar en esta invención incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que puedan facilitar la introducción del polinucleótido al hospedero. Los plásmidos son la forma más comúnmente usada de vector pero todas las demás formas de vectores que tienen una función similar y que son, o se vuelven, conocidos en la técnica son adecuados para usarse aquí. Véase, v.gr., Pouwels, ef al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 y Supplements, Elsevier, N.Y., y Rodríguez ef al. (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, MA. El término "sistema de expresión" significa una célula hospedero y vector compatible que, bajo condiciones adecuadas, puede expresar una proteína o ácido nucleico que es portado por el vector e introducido a la célula hospedero. Los sistemas de expresión comunes incluyen células hospedero de E. coli y vectores de plásmido, células hospedero de insecto y vectores de Baculovirus, y células hospedero y vectores de mamífero. La expresión de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión de IFN-lgG4 de esta invención se puede llevar a cabo por métodos convencionales ya sea en células procarióticas o eucarióticas. Aunque las células hospedero de E. coli se utilizan muy frecuentemente en sistemas procarióticos, muchas otras bacterias, tales como varias cepas de Pseudomonas y Bacillus, se conocen en la técnica y también se pueden usar.

Las células hospedero adecuadas para expresar ácido nucleicos que codifican los polipéptidos de fusión de IFN-lgG4 incluyen procariotes y eucariotes superiores. Los procariotes incluyen tanto organismos gram-negativos como gram-positivos, v.gr., E. coli fí. subtilis. Los eucariotes superiores incluyen líneas de células de cultivo de tejido establecidas de células animales, tanto de origen de organismos que nos son mamíferos, v.gr., células de insecto, como de origen de aves, y de origen de mamífero, v.gr., humanos, primates y roedores. Los sistemas de hospedero-vector procariótico incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o cualquiera de muchos de sus derivados (v.gr., pUC18 ó 19). Los vectores que se pueden usar para expresar los polipéptidos de IFN-lgG4 incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen el promotor de lac (serie pUC); promotor de trp (pBR322-trp), promotor de Ipp (la serie pIN); promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius ef al., "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survev of Molecular Cloninq Vectors and Their Uses, 1988, Buttersworth, Boston, pp. 205-236. Muchos polipéptidos se pueden expresar, a niveles altos, en un sistema de expresión de E.colifT7 como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,952,496, 5,693,489 y 5,869,320 y en Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 81 : 2035-2039; Studier, F. W., ef al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130; Rosenberg, A. H., ef al., (1987) Gene 56: 125-135; y Dunn, J. J., ef al., (1988) Gene 68: 259. Células de cultivo de tejido eucariótico superiores también se pueden usar para la producción recombinante de los polipéptidos de fusión de IFN-lgG4 de la invención. Una línea de células de cultivo de tejido eucariótico superiores se puede usar, incluyendo sistemas de expresión de baculovirus de insecto y células de mamífero. La transformación o transfección y propagación de dichas células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células útiles incluyen células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), células J774, células Caco2, líneas de células de riñon de rata recién nacida (BRK), líneas de células de insecto, líneas de células de aves, y líneas de células de mono (COS). Típicamente, los vectores de expresión para esas líneas de células incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de inicio de traducción, sitios de empalme de ARN (si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de transcripción. Estos vectores también, usualmente, contienen un gen de selección o gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que portan promotores derivados, v.gr., de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vaccinia, o citomegalovirus. Ejemplos de vectores de expresión incluyen pCR®3.1 , pCADNI , pCD (Okayama, ef al., (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136), pMCIneo Poly-A (Thomas, et al., (1987) Cell 57:503), pREP8, pSVSPORT y derivados de los mismos, y vectores de baculovirus tales como pAC373 o pAC610. Modificaciones (v.gr., modificaciones post-traduccionales) que ocurren en un polipéptido a menudo serán una función de cómo está hecho. Para polipéptidos hechos al expresar un gen clonado en un hospedero, por ejemplo, la naturaleza y grado de las modificaciones, en gran parte, estarán determinadas por la capacidad de modificación post-traduccional de la célula hospedero y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, como se sabe bien, la glicosilación a menudo no ocurre en hospederos bacterianos tales como E. coli. Por consiguiente, cuando se desea la glicosilación de IFN-lgG4, el polipéptido se puede expresar en un hospedero de glicosilación, generalmente una célula eucariótica. Las células de insecto a menudo llevan a cabo glicosilaciones post-traduccionales que son similares a las de células de mamífero. Por esta razón, los sistemas de expresión en células de insecto se han desarrollado para expresar, eficientemente, proteínas de mamífero que tienen patrones de glicosilación nativos. Una célula de insecto que se puede usar en esta invención es cualquier célula derivada de un organismo de la clase Insecta; por ejemplo, en donde el insecto es Spodoptera fruigiperda (Sf9 o Sf21) o Trichoplusia ni (High 5). Ejemplos de sistemas de expresión en insecto que se pueden usar con la presente invención, por ejemplo para producir un polipéptido de fusión de IFN-lgG4, incluyen Bac-To-Bac (Invitrogen Corporación, Carlsbad, CA) o Gateway (Invitrogen Corporación, Carlsbad, CA). Si se desea, se pueden usar enzimas de desglicosilación para remover carbohidratos unidos durante la producción en sistemas de expresión eucarióticos. La presente invención contempla cualquier modificación superficial o ligera a las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que corresponden a los polipéptidos de IFN lgG4 de la invención. En particular, la presente invención contempla variantes conservativas de secuencia de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. Las " variantes conservativas de secuencia" de una secuencia de polinucleótidos son aquellas en las cuales un cambio de uno o más nucleótidos en un codón dado no produce alteración en el aminoácido codificado en esa posición. Las variantes conservativas de función de los polipéptidos de la invención también son contempladas por la presente invención. Las "variantes conservativas de función" son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos en una proteína o enzima han sido cambiados sin alterar la conformación y función globales del polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse de ninguna manera, el reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares. Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, aminoácidos polares/hidrofílicos que pueden ser intercambiables ¡ncluyen asparagina, glutamina, serina, cisteína, treonina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos no polares/hidrofóbicos que pueden ser intercambiables incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosins, fenilalanina, triptofano y metionina; aminoácidos ácidos que pueden ser intercambiables incluyen ácido aspártico y ácido glutámico y aminoácidos básicos que pueden ser intercambiables incluyen histidina, lisina y arginina. La presente invención incluye polinucleótidos que codifican un polipéptido de fusión de IFN-lgG4 (v.gr., SEQ ID NO: 4, 5 ó 16) así como ácido nucleicos que hibridan a los polinucleótidos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos hibridan bajo condiciones de baja astringencia, muy preferiblemente bajo condiciones de astringencia moderada y muy preferiblemente bajo condiciones de astringencia alta. Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o ARN, cuando una forma de una sola cadena de la molécula de ácido nucleico se puede templar a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y concentración iónica de la solución (véase Sambrook, ef al., supra). Las condiciones de temperatura y concentración iónica determinan la "astringencia" de la hibridación. Las condiciones de hibridación de astringencia baja típicas son 55°C, 5X SSC, 0.1% de SDS, 0.25% de leche, y sin formamida a 42°C; o 30% de formamida, 5X SSC, 0.5% de SDS a 42°C. Las condiciones de hibridación de astringencia moderada típicas son similar a las condiciones de astringencia baja excepto que la hibridación se lleva a cabo en 40% de formamida, con 5X o 6X SSC a 42°C. Las condiciones de hibridación de astringencia alta son similares a las condiciones de astringencia baja excepto que las condiciones de hibridación se llevan a cabo en 50% de formamida, 5X o 6X SSC y, opcionalmente, a una temperatura más alta {v.gr., mayor que 42°C: 57°C, 59°C, 60°C, 62°C, 63°C, 65°C o 68°C). En general, SSC es NaCI al 0.15M y citrato de Na al 0.015M. La hibridación requiere que los dos ácido nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque, dependiendo de la astringencia de la hibridización, son posibles coincidencias erróneas entre bases. La astringencia apropiada para hibridar ácido nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Mientras mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será la astringencia bajo la cual los ácidos nucleicos pueden hibridar. Para híbridos mayores que 100 nucleótidos de longitud, se han derivado las ecuaciones para calcular la temperatura de fusión (véase i i Sambrook, ef al., supra, 9.50-9.51). Para hibridación con ácido nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de coincidencias erróneas se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook, et al., supra). En la presente invención también se incluyen polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos y polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son por lo menos aproximadamente 70% idénticas, preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% idénticas, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% idénticas y muy preferiblemente aún por lo menos aproximadamente 95% idénticas {v.gr., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) al polinucleótido de fusión de IFN-lgG4 de referencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 5 ó 16 y secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 3 ó 15 cuando la comparación ser realiza por un algoritmo de BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la coincidencia más grande entre las secuencias respectivas sobre toda la longitud de las secuencias de referencia respectivas. Los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son por lo menos aproximadamente 70% similares, preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% similares, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% similar y muy preferiblemente aún por lo menos aproximadamente 95% similar (v.gr., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) a la secuencia de aminoácidos de fusión de IFN-lgG4 de cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 3 ó 15, cuando la comparación se realiza con un algoritmo de BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la coincidencia más grande entre las secuencias respectivas sobre toda la longitud de las secuencias de referencia respectivas, también se incluyen en la presente invención. Identidad de secuencia se refiere a coincidencias exactas entre los nucleótidos o aminoácidos de dos secuencias que están siendo comparadas. La similitud de secuencia se refiere a coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos polipéptidos que están siendo comparados además de coincidencias entre aminoácidos no idénticos, bioquímicamente relacionados. Los aminoácidos bioquímicamente relacionados que comparten propiedades similares y pueden ser intercambiables se describieron antes. Las siguientes referencias con respecto al algoritmo de BLAST se incorporan aquí por referencia: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., ef al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141 ; Altschul, S.F., ef al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., ef al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., ef al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M., ef al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolucionary change in proteins." en Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., ef al., "Matrices for detecting distant relationships." en Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, supl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., ef al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., ef al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., ef al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., ef al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873- 5877; Dembo, A., ef al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; y Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of múltiple distinct local alignments." en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.

Fusiones l La presente ¡nvención comprende cualquier polipéptido de fusión que comprende uno o más de cualesquiera polipéptidos de interferón, fusionados, opcionalmente por un péptido enlazador, a uno o más polipéptidos de lgG4 Fc ("fusión de IFN-lgG4"). En una modalidad, el interferón es interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, ¡nterferón alfa-2c, interferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, interferón alfa-6, interferón alfa-7a, interferón alfa-7b, interferón alfa-8a, interferón alfa-8b, interferón alfa-8c, interferón alfa-1 Oa, interferón alfa-1 Ob, interferón alfa-13, interferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, interferón alfa-17b, interferón alfa-17c, interferón alfa-17d, interferón alfa-21a, interferón alfa-21b, interferón alfa-24, interferón beta, interferón omega, interferón tau, interferón alfa-N3, interferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-1 b, interferón alfa-F o interferón alfa conl o cualesquiera especies de interferón descritas en Blatt ef al., J. Interferon and Cytokine Res. 16: 489-499 (1996) o en Pestka, Interferon from 1981 to 1986, Methods Enzymol. 119:3-14 (1986); que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. El polipéptido y secuencia de polinucleótido codificadora para cada una de estas especies de interferón se conoce en la técnica (véase v.gr., Alien ef ai, J. Interferon and Cytokine Res. 16:181-184 (1996); o solicitud de patente de E.U.A. publicada No. U.S. 2004/0219131 A1 ; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia). En una modalidad de la invención, la secuencia de aminoácidos de humano interferón alfa-2b es: MCDLPQTHSLGSRRTLML AQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFS TKDSSAAWDETLLDKFYTE YQQLNDLEACVIQGVGVTETP MKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSP CAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQES RSKE (SEQ ID NO: 12; véase también acceso a Genbank No. CAA25770); en donde la primera M es opcional. En una modalidad de la invención, la secuencia de aminoácidos de humano interferón alfa-2a es: MCDLPQTHS GSRRTL L AQMRKIS FSC KDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFS TKDSSAA DETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSP CAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (SEQ ID NO: 13; véase también acceso a Genbank No. 1 ITF); en donde la primera M es opcional. En una modalidad de la invención, la secuencia de aminoácidos de interferón alfa de consenso humano (alfa con-1) es: MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLF STKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQ NDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRITLYLTEKK YSPCA E VRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE (SEQ ID NO: 14; véase Blatt et ai, J. Interferon Cytokine Res. 16: 489-499 (1996); Klein ef ai, J. Chromatography 454: 205-215 (1988)); en donde la primera M es opcional. Las fusiones de la invención comprenden uno o más interferones y/o una o más lgG4s. Si la fusión comprende interferones múltiples, los interferones pueden ser los mismos o diferentes. Por ejemplo, una fusión de la invención comprende, en una modalidad, interferón alfa-2a-interferón alfa-2a-lgG4 humano. En otra modalidad, la fusión comprende interferón alfa-2a humano-interferón alfa-2b-lgG4 humano o interferón alfa-2a-lgG4-interferón alfa-2a. Los polipéptidos múltiples de lgG4 también se pueden incluir en una fusión de la invención. Por ejemplo, en una modalidad, la fusión comprende ¡nterferón alfa-2a humano-interferón alfa-2a-lgG4-lgG4 humano o interferón alfa-2a humano-interferón alfa-2b-lgG4-lgG4 humano. Cualquiera de estas modalidades se incluyen bajo el término "IFN-lgG4". Las fusiones que comprenden interferón en el amino-terminal están dentro del alcance de la presente invención junto con fusiones con interferón en el carboxi-terminal; el término IFN-lgG4 se refiere a estos dos tipos de fusiones. Por ejemplo, la presente invención comprende cualquiera de las siguientes fusiones de IFN-lgG4: lgG4 Fc-interferón alfa-1 a, lgG4 Fc-interferón alfa-1 b, lgG4 Fc-interferón alfa-2a, lgG4 Fc-interferón alfa-2b, lgG4 Fc-interferón alfa-2c, lgG4 Fc-interferón alfa-4a, lgG4 Fc-interferón alfa-4b, lgG4 Fc-interferón alfa-5, lgG4 Fc-interferón alfa-6, lgG4 Fc-interferón alfa-7a, lgG4 Fc-interferón alfa-7b, lgG4 Fc-interferón alfa-8a, lgG4 Fc-interferón alfa-8b, lgG4 Fc-interferón alfa-8c, lgG4 Fc-interferón alfa-1 Oa, lgG4 Fc-interferón alfa-1 Ob, lgG4 Fc-interferón alfa-13, lgG4 Fc-interferón alfa-14a, lgG4 Fc- ' i interferón alfa-14b, lgG4 Fc-interferón alfa-14c, lgG4 Fc-interferón alfa-16, lgG4 Fc-interferón alfa-17a, lgG4 Fc-interferón alfa-17b, lgG4 Fc-interferón alfa-17c, lgG4 Fc-interferón alfa-17d, lgG4 Fc-interferón alfa-21a, lgG4 Fc- interferón alfa-21b, lgG4 Fc-interferón alfa-24, lgG4 Fc-interferón beta, lgG4 Fc-interferón omega, lgG4 Fc-interferón tau, lgG4 Fc-interferón alfa-N3, lgG4 Fc-interferón alfa-N, lgG4 Fc-interferón beta-1 a, lgG4 Fc-interferón beta-1 b, lgG4 Fc-interferón gamma-Ib, lgG4 Fc-interferón gamma, lgG4 Fc-interferón alfa F, lgG4 Fc-interferón alfa conl , interferón alfa-1 a-lgG4 Fc, interferón alfa- 1b-lgG4 Fc, interferón alfa-2a-lgG4 Fc, interferón alfa-2b-lgG4 Fc, interferón alfa-2c-lgG4 Fc, interferón alfa-4a-lgG4 Fc, interferón alfa-4b-lgG4 Fc, interferón alfa-5-lgG4 Fc, interferón alfa-6-lgG4 Fc, interferón alfa-7a-lgG4 Fc, ¡nterferón alfa-7b-lgG4 Fc, interferón alfa-8a-lgG4 Fc, interferón alfa-8b-lgG4 Fc, interferón alfa-8c-lgG4 Fc, interferón alfa-10a-lgG4 Fc, interferón alfa-1 Ob- lgG4 Fc, interferón alfa-13-lgG4 Fc, interferón alfa-14a-lgG4 Fc, interferón alfa-14b-lgG4 Fc, interferón alfa-14c-lgG4 Fc, interferón alfa-16-lgG4 Fc, i interferón alfa-17a-lgG4 Fc, interferón alfa-17b-lgG4 Fc, interferón alfa-17c- lgG4 Fc, interferón alfa-17d-lgG4 Fc, interferón alfa-21a-lgG4 Fc, interferón alfa-21b-lgG4 Fc, interferón alfa-24-lgG4 Fc, interferón beta-lgG4 Fc, interferón omega-lgG4 Fc, interferón tau-lgG4 Fc, interferón alfa-N3-lgG4 Fc, interferón alfa-N-lgG4 Fc, interferón beta-1 a-lgG4 Fc, interferón beta-1 b-lgG4 Fc, interferón gamma-1b-lgG4 Fc, interferón gamma-lgG4 Fc, interferón alfa F-lgG4 Fc o interferón alfa con1-lgG4 Fc; en donde la porción ¡nterferón y la porción lgG4 Fc es opcionalmente fusionada por un enlazador de péptido; junto con polinucleótidos que codifican cualquiera de las fusiones de la invención. En una modalidad, la lgG4 Fc comprende la siguiente secuencia de aminoácidos DKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT PPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV ! I MHEALHNHYTQKS SLSLGK (SEQ ID NO: 1); opcionalmente que comprende una primera metionina (M). En una modalidad, la proteína de fusión de humano interferón-alfa-2b-humano lgG4 Fc comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: MALTFALLVALLV SCKSSCSVGCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ FQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAA DETLLDKFYTELYQQ NDLEACVIQGVGVTETP MKEDS ' ' I I ¡ ILAVRKYFQRITLYLKEKKYS PCAWEVVRAEIMRS FS STNLQESLRSKEASDKTHTCPPCPAPEFLGG ! i PSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL , ' ¡ i I TVLHQD LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS i I DIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLS SLGK (SEQ ID NO: 2); en donde la secuencia de señal (MALTFALLVALLVLSCKSSCSVG) (SEQ ID NO: 6) es opcional y por lo tanto puede estar ausente; sin embargo, en una modalidad de la invención, el N- l , I terminal de la fusión opcionalmente comprende una metionina (M); en donde ! i el enlazador es subrayado y es también opcional; en donde la secuencia que ¡ | ! I es N-terminal al enlazador es IFN-alfa-2b humano y la secuencia que es C- terminal al enlazador es lgG4 Fc humana. En una modalidad, el enlazador es seleccionada de SEQ ID NOs: 7-11 y 17-20. Por ejemplo, en una modalidad, el interferón alfa-2b secuencia de aminoácidos es idéntico al de Intron A® (Schering Corp.; Kenilworth, NJ). En una modalidad, la proteína de fusión de interferón-alfa-2a humano-lgG4 Fc humana comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: MCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKIS FSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFS TKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSP CAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQES RSKEASDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 3); en donde, en una modalidad de la invención, el N-terminal de la fusión opcionalmente comprende una metionina (M); en donde el enlazador es subrayado y es también opcional; opcionalmente que comprende una secuencia de señal; en donde la secuencia que es N-terminal al enlazador es IFN-alfa-2a humano y la secuencia que es C-terminal al enlazador es lgG4 Fc humana. En una modalidad, el enlazador es seleccionado de SEQ ID NOs: 7-11 y 17-20. Por ejemplo, en una modalidad, la secuencia de interferón de aminoácidos de alfa-2a es idéntica a la de Roferon A® (Roche Laboratories; Nutley, NJ). En una modalidad, la proteína de fusión de interferón-alfa con-1 humano-lgG4 Fc comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQTFN F STKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSILAVKKYFQRIT Y TEKK YSPCA EVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKEASDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSR TVDKSR QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 15); en donde, en una modalidad de la invención, el N-terminal de la fusión opcionalmente comprende una metionina (M); en donde el enlazador es subrayado y es también opcional; opcionalmente que comprende una secuencia de señal; en donde la secuencia que es N-terminal al enlazador es IFN-alfa con-1 humano y la secuencia que es C-terminal al enlazador es lgG4 Fc humana. En una modalidad, el enlazador es seleccionado de SEQ ID NOs: 7-11 y 17-20. La presente invención incluye cualquier polinucleótido que codifica cualquiera de las fusiones de IFN-lgG4 en la presente. En una modalidad, el polinucleótido codifica interferón-alfa-2b humano-lgG4 Fc humana que comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: ATGGCNYTNA CNTTYGCNYT NYTNGTNGCN YTNYTNGTNY TN SNTGYAA RWSNWSNTGY WSNGTNGGNT GYGAYYTNCC NCARACNCAY WSNYTNGGNW SNMGNMGNAC NYTNATGYTN YTNGCNCARA TGMGNMGNAT HWSNYTNTTY SNTGYYTNA ARGAYMGNCA YGAYTTYGGN TTYCCNCARG ARGARTTYGG NAAYCARTTY CARAARGCNG ARACNATHCC NGTNYTNCAY GARATGATHC ARCARATHTT YAAYYTNTTY WSNACNAARG AYWSN SNGC NGCNTGGGAY GARACNYTNY TNGAYAARTT YTAYACNGAR YTNTAYCARC ARYTNAAYGA YYTNGARGCN TGYGTNATHC ARGGNGTNGG NGTNACNGAR ACNCCNYTNA TGAARGARGA Y SNATHYTN GCNGTNMGNA ARTAYTTYCA RMGNATHACN YTNTAYYTNA ARGARAARAA RTAYWSNCCN TGYGCNTGGG ARGTNGTNMG NGCNGARATH ATGMGN SNT TY SNYTN S NACNAAYYTN CARGAR SNY TN GNWSNAA RGARGCNWSN GAYAARACNC AYACNTGYCC NCCNTGYCCN GCNCCNGART TYYTNGGNGG NCCNWSNGTN TTYYTNTTYC CNCCNAARCC NAARGAYACN YTNATGATH SNMGNACNCC NGARGTNACN TGYGTNGTNG TNGAYGTNWS NCARGARGAY CCNGARGTNC ARTTYAAYTG GTAYGTNGAY GGNGTNGARG TNCAYAAYGC NAARACNAAR CCNMGNGARG ARCARTTYAA YWSNACNTAY MGNGTNGTNW SNGTNYTNAC NGTNYTNCAY CARGAYTGGY TNAAYGGNAA RGARTAYAAR TGYAARGTNW SNAAYAARGG NYTNCCNWSN WSNATHGARA ARACNATHWS NAARGCNAAR GGNCARCCNM GNGARCCNCA RGTNTAYACN YTNCCNCCNW SNCARGARGA RATGACNAAR AAYCARGTNW SNYTNACNTG YYTNGTNAAR GGNTTYTAYC CNWSNGAYAT HGCNGTNGAR TGGGARWSNA AYGGNCARCC NGARAAYAAY TAYAARACNA CNCCNCCNGT NYTNGAYWSN GAYGGNWSNT TYTTYYTNTA YWSNMGNYTN ACNGTNGAYA ARWSNMGNTG GCARGARGGN AAYGTNTTYW SNTGYWSNGT NATGCAYGAR GCNYTNCAYA AYCAYTAYAC NCARAARWSN YTNWSNYTNW SNYTNGGNAA R (SEQ ID NO: 4) En una modalidad, el polinucleótido codifica interferón-alfa-2a humano-lgG4 Fc humana que comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: TGYGAYYTNC CNCARACNCA YWSNYTNGGN WSNMGNMGNA CNYTNATGYT NYTNGCNCAR ATGMGNAARA THWSNYTNTT YWSNTGYYTN AARGAYMGNC AYGAYTTYGG NTTYCCNCAR GARGARTTYG GNAAYCARTT YCARAARGCN GARACNATHC CNGTNYTNCA YGARATGATH CARCARATHT TYAAYYTNTT YWSNACNAAR GAYWSNWSNG CNGCNTGGGA YGARACNYTN YTNGAYAART TYTAYACNGA RYTNTAYCAR CARYTNAAYG AYYTNGARGC NTGYGTNATH CARGGNGTNG GNGTNACNGA RACNCCNYTN ATGAARGARG AYWSNATHYT NGCNGTNMGN AARTAYTTYC ARMGNATHAC NYTNTAYYTN AARGARAARA ARTAYWSNCC NTGYGCNTGG GARGTNGTNM GNGCNGARAT HATGMGNWSN TTYWSNYTNW SNACNAAYYT NCARGARWSN YTNMGNWSNA ARGARGCNWS NGAYAARACN CAYACNTGYC CNCCNTGYCC NGCNCCNGAR TTYYTNGGNG GNCCNWSNGT NTTYYTNTTY CCNCCNAARC CNAARGAYAC NYTNATGATH WSNMGNACNC CNGARGTNAC NTGYGTNGTN GTNGAYGTNW SNCARGARGA YCCNGARGTN CARTTYAAYT GGTAYGTNGA YGGNGTNGAR GTNCAYAAYG CNAARACNAA RCCNMGNGAR GARCARTTYA AYWSNACNTA YMGNGTNGTN WSNGTNYTNA CNGTNYTNCA YCARGAYTGG YTNAAYGGNA ARGARTAYAA RTGYAARGTN WSNAAYAARG GNYTNCCNWS NWSNATHGAR AARACNATHW SNAARGCNAA RGGNCARCCN MGNGARCCNC ARGTNTAYAC NYTNCCNCCN WSNCARGARG ARATGACNAA RAAYCARGTN WSNYTNACNT GYYTNGTNAA RGGNTTYTAY CCNWSNGAYA THGCNGTNGA RTGGGARWSN AAYGGNCARC CNGARAAYAA YTAYAARACN ACNCCNCCNG TNYTNGAYWS NGAYGGNWSN TTYTTYYTNT AYWSNMGNYT NACNGTNGAY AARWSNMGNT GGCARGARGG NAAYGTNTTY WSNTGYWSNG TNATGCAYGA RGCNYTNCAY AAYCAYTAYA CNCARAARWS NYTNWSNYTN WSNYTNGGNA AR (SEQ ID NO: 5) En una modalidad, el polinucleótido codifica interferón-alfa con humano-1-lgG4 Fc humana que comprende la siguiente secuencia de nucleótidos: ATGTGYGAYY TNCCNCARAC NCAYWSNYTN GGNAAYMGNM GNGCNYTNAT HYTNYTNGCN CARATGMGNM GNATHWSNCC NTTYWSNTGY YTNAARGAYM GNCAYGAYTT YGGNTTYCCN CARGARGART TYGAYGGNAA YCARTTYCAR AARGCNCARG CNATHWSNGT NYTNCAYGAR ATGATHCARC ARACNTTYAA YYTNTTYWSN ACNAARGAYW SNWSNGCNGC NTGGGAYGAR WSNYTNYTNG ARAARTTYTA YACNGARYTN TAYCARCARY TNAAYGAYYT NGARGCNTGY GTNATHCARG ARGTNGGNGT NGARGARACN CCNYTNATGA AYGTNGAYWS NATHYTNGCN GTNAARAART AYTTYCARMG NATHACNYTN TAYYTNACNG ARAARAARTA YWSNCCNTGY GCNTGGGARG TNGTNMGNGC NGARATHATG MGNWSNTTYW SNYTNWSNAC NAAYYTNCAR GARMGNYTNM GNMGNAARGA RGCNWSNGAY AARACNCAYA CNTGYCCNCC NTGYCCNGCN CCNGARTTYY TNGGNGGNCC NWSNGTNTTY YTNTTYCCNC CNAARCCNAA RGAYACNYTN ATGATHWSNM GNACNCCNGA RGTNACNTGY GTNGTNGTNG AYGTNWSNCA RGARGAYCCN GARGTNCART TYAAYTGGTA YGTNGAYGGN GTNGARGTNC AYAAYGCNAA RACNAARCCN MGNGARGARC ARTTYAAYWS NACNTAYMGN GTNGTNWSNG TNYTNACNGT NYTNCAYCAR GAYTGGYTNA AYGGNAARGA RTAYAARTGY AARGTNWSNA AYAARGGNYT NCCNWSNWSN ATHGARAARA CNATHWSNAA RGCNAARGGN CARCCNMGNG ARCCNCARGT NTAYACNYTN CCNCCNWSNC ARGARGARAT GACNAARAAY CARGTNWSNY TNACNTGYYT NGTNAARGGN TTYTAYCCNW SNGAYATHGC NGTNGARTGG GARWSNAAYG GNCARCCNGA RAAYAAYTAY AARACNACNC CNCCNGTNYT NGAYWSNGAY GGNWSNTTYT TYYTNTAYWS NMGNYTNACN GTNGAYAARW SNMGNTGGCA RGARGGNAAY GTNTTYWSNT GYWSNGTNAT GCAYGARGCN YTNCAYAAYC AYTAYACNCA RAARWSNYTN WSNYTNWSNY TNGGNAAR (SEQ ID NO: 16) La presente invención además incluye cualquier polipéptido de fusión que comprende lgG4 fusionado a una citocina de vida meda corta tal como IL-10 (fusión de IL-10-lgG4). En una modalidad de la invención, IL-10 humana comprende la secuencia de aminoácidos: MHSSALLCCL V LTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ DNLLLKESL LEDFKGY GC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE FDIFINYIEA YMTMKIRN (SEQ ID NO: 24; véase también accesos a Genbank Nos.: CAH71813; AAV38450; AAX36831 ; CAG46825 or XP_525040). En una modalidad de la invención, la fusión de IL-10-lgG4 humana comprende la secuencia de aminoácidos: MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNM RDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKES LLEDFKGYLGCQALSEMIQFY EEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKA VEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNASDKTHTCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 25) en donde, en una modalidad de la invención, el N-terminal de la fusión opcionalmente comprende una metionina (M); en donde el enlazador es subrayado y es también opcional; opcionalmente que comprende una secuencia de señal; en donde la secuencia que es N-terminal al enlazador es IL-10 humana y la secuencia que es C-terminal al enlazador es lgG4 Fc humana. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del enlazador es seleccionada de SEQ ID NOs: 7-11 y 17-20.

Métodos terapéuticos La presente invención provee composiciones y métodos para tratar o prevenir cualquier condición que es aliviada por la administración de un interferón. Por ejemplo, la presente invención comprende un método para tratar o prevenir una infección, en un hospedero, sujeto o paciente, por un virus que es un miembro de la familia Flaviviridae en un hospedero al administrar una dosis terapéuticamente efectiva de una fusión de IFN-lgG4 de la presente invención, o una composición farmacéutica de la misma; opcionalmente en asociación con cualquier agente terapéutico adicional expuesto más adelante bajo la sección "Composiciones farmacéuticas" {v.gr, ribavirin), al hospedero, sujeto o paciente. Por ejemplo, la presente invención incluye, pero no se limita a métodos para tratar o prevenir infecciones causadas por miembros del género Hepacivirus que incluye el virus de hepatitis C (HCV). HCV incluye varios tipos, subtipos y aislados: Virus de hepatitis C (aislado 1 ) Virus de hepatitis C (aislado BK) Virus de hepatitis C (aislado EC1) Virus de hepatitis C (aislado EC10) Virus de hepatitis C (aislado HC-J2) Virus de hepatitis C (aislado HC-J5) Virus de hepatitis C (aislado HC-J6) Virus de hepatitis C (aislado HC-J7) Virus de hepatitis C (aislado HC-J8) Virus de hepatitis C (aislado HC-JT) Virus de hepatitis C (aislado HCT18) Virus de hepatitis C (aislado HCT27) Virus de hepatitis C (aislado HCV-476) Virus de hepatitis C (aislado HCV-KF) Virus de hepatitis C (aislado Hunan) Virus de hepatitis C (aislado Japonés) Virus de hepatitis C (aislado Taiwán) Virus de hepatitis C (aislado TH) Virus de hepatitis C aislado H Virus de hepatitis C tipo 1 Virus de hepatitis C tipo 1 a Virus de hepatitis C cepa H77 Virus de hepatitis C tipo 1 b Virus de hepatitis C tipo 1 c Virus de hepatitis C tipo 1 d Virus de hepatitis C tipo 1 e Virus de hepatitis C tipo 1f Virus de hepatitis C tipo 10 Virus de hepatitis C tipo 2 Virus de hepatitis C tipo 2a Virus de hepatitis C tipo 2b Virus de hepatitis C tipo 2c Virus de hepatitis C tipo 2d Virus de hepatitis C tipo 2f Virus de hepatitis C tipo 3 Virus de hepatitis C tipo 3a Virus de hepatitis C tipo 3b Virus de hepatitis C tipo 3g Virus de hepatitis C tipo 4 Virus de hepatitis C tipo 4a Virus de hepatitis C tipo 4c Virus de hepatitis C tipo 4d Virus de hepatitis C tipo 4f Virus de hepatitis C tipo 4h Virus de hepatitis C tipo 4k Virus de hepatitis C tipo 5 Virus de hepatitis C tipo 5a Virus de hepatitis C tipo 6 Virus de hepatitis C tipo 6a Virus de hepatitis C tipo 7 Virus de hepatitis C tipo 7a Virus de hepatitis C tipo 7b Virus de hepatitis C tipo 8 Virus de hepatitis C tipo 8a La presente invención también incluye métodos y composiciones para tratar o prevenir infección causada por miembros del género Flavivirus.

El género Flavivirus incluye virus de fiebre amarilla; virus portado por garrapatas tales como el virus de Gadgets Gully, virus de Kadam, virus de enfermedad de Kyasanur Forest, virus de Langat, virus de fiebre hemorrágica de Omsk, virus de Powassan, virus de Roya! Farm, virus de Karshi, virus de encefalitis portado por garrapatas, virus de Neudoeríl, virus de Sofjin, virus de enfermedad de Louping y el virus de Negishi; virus de aves marinas portados por garrapatas tales como el virus de Meaban, virus de Saumarez Reef, y el virus de Tyuleniy; virus portados por mosquitos tales como el virus de Aroa, virus de Bussuquara, virus de Iguape y el virus de Naranjal; virus de Dengue tales como el virus de Dengue y el virus de Kedougou; virus de encefalitis Japonés tal como el virus de Cacipacore, virus de Koutango, virus de encefalitis Japonés, virus de encefalitis de Murray Valley, virus de Alfuy, virus de encefalitis de St. Louis, virus de Usutu, virus de West Nile, virus de Kunjin y el virus de Yaounde; virus de Kokobera tales como el virus de Kokobera y el virus de Stratford; virus de Ntaya tales como el virus de Bagaza, virus de llheus, virus de Roció, virus de de meningoencefalomielitis de pavo de Israel, virus de Ntaya y el virus de Tembusu; virus de Spondweni tales como el virus de Zika y el virus de Spondweni; virus de fiebre amarilla tales como el virus de Banz, virus de Bouboui, virus de Edge Hill, virus de Jugra, virus de Saboya, virus de Potiskum, virus de Sepik, virus de Uganda S, virus de Wesselsbron y el virus de fiebre amarilla; virus de Entebbe tales como el virus de murciélago de Entebbe, virus de Sokoluk, y el virus de Yokose; virus de Modoc tales como el virus de Apoi, virus de Cowbone Ridge, virus de Jutiapa, virus de Modoc, virus de Sal Vieja y el virus de San Perlita; virus del Río Bravo tales como el virus de murciélago de Bukalasa, virus de Carey Island, virus de murciélago de Dakar, virus de de leucoencefalitis de Montana myotis, virus de murciélago de Phnom Penh, virus de Batu Cave, virus del Río Bravo, virus de murciélago de Tamaña, y el virus de agente de fusión de células. La presente invención incluye métodos y composiciones para tratar o prevenir infección causada por miembros del género Pestivirus genus.

El género Pestivirus incluye, virus de Border disease (ovejas), virus de diarrea viral de bovinos 1, virus de diarrea viral de bovinos 2, virus de fiebre de porcinos clásica, y virus de cólera de cerdos. Más aún, la presente invención incluye métodos y composiciones para tratar o prevenir infecciones causadas por virus de Hepatitis G o virus de Hepatitis GB-A, B o C. En una modalidad, al sujeto se administra la fusión de IFN-lgG4 de la invención, opcionalmente, en asociación con un agente terapéutico adicional; por ejemplo una cantidad terapéuticamente efectiva otra terapia anti-viral, durante un período de tratamiento suficiente para erradicar ARN de virus de hepatitis C detectable y mantener ARN de virus de hepatitis C no detectable por lo menos durante doce semanas {v.gr., 24 semanas) después del término del período de tratamiento. Como también se describe más adelante, el término "en asociación" indica que una fusión de IFN-lgG4 y el agente terapéutico adicional {v.gr., terapia anti-viral) se pueden formular en una sola composición para el suministro simultáneo o formularse por separado en dos o más composiciones {v.gr., un equipo). Además, cada componente se puede administrar a un sujeto en un tiempo diferente que cuando se administra el otro componente; por ejemplo, cada administración se puede dar en forma no simultánea {v.gr., por separado o secuencialmente) en varios intervalos durante un periodo dado. Más aún, los componentes separados se pueden administrar a un sujeto por la misma vía o por una vía diferente {v.gr., oral, intravenosa, subcutánea). Un "hospedero", "sujeto" o "paciente" puede ser cualquier organismo, tal como un mamífero {v.gr., primate, chimpancé, perro (v.gr., beagle), gato, vaca, caballo, cerdo, cabra, conejo, rata {v.gr., rata Sprague Dawley), ratón, ave), por ejemplo un humano. Por consiguiente, los métodos de la invención incluyen modalidades en donde las fusiones de la invención se usan para tratar a un humano, por ejemplo, en un establecimiento clínico o para tratar a un animal, por ejemplo, por un veterinariario o por un investigador {v.gr., al realizar estudios de toxicologia, farmacocinética o evaluación de seguridad). En una modalidad, el "hospedero", "sujeto" o "paciente" es una madre embarazada o en lactancia. Una persona que padece de infección de hepatitis C crónica puede presentar uno o más de los siguientes signos o síntomas: (a) ALT elevado, (b) prueba positiva para anticuerpos anti-HCV, (c) presencia de HCV como se demuestra por una prueba positiva para HCV-ARN, (d) estigmas clínicos de enfermedad del hígado crónica, (e) daño hepatocelular. Dichos criterios pueden usarse no sólo para diagnosticar infección viral de hepatitis C, sino también se pueden usar para seguir y evaluar la respuesta del paciente a tratamiento con fármacos. Dichos parámetros pueden ser usados, por un médico de clínica, para modular la dosis y duración de tratamiento. La evaluación de dichos criterios y el ajuste del régimen de tratamiento de un hospedero, paciente o sujeto puede ser realizado fácilmente por un experto en la técnica. Los métodos y composiciones de la presente invención se pueden usar en un procedimiento de trasplante de hígado para tratar o prevenir infección por Flaviviridae en el receptor. El hígado del donador puede provenir de un donador vivo (es decir, trasplante de hígado de donador vivo (LDLT)) en donde una porción del hígado del donador es removida e introducida al receptor. Alternativamente, el transplante se puede formar de un donador muerto de donde el higado completo es removido y trasplantado. Por ejemplo, una modalidad de la invención comprende un método para prevenir infección de un hospedero, con un virus que es un miembro de la familia de virus Flaviviridae, después del trasplante de un hígado en el hospedero o transfusión de sangre al hospedero que comprende administrar al hospedero una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-lgG4 o una composición ÉáiJi farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención también comprende un método para tratar o prevenir esclerosis múltiple o una recaída de esclerosis múltiple en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-lgG4 o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, al sujeto se administra IFN beta-1 a-lgG4 o IFN beta-1 b-lgG4. Opcionalmente, IFN-lgG4 se administra en asociación con uno o más de tolterodina; oxibutinina; oxibutinina; oxibutinina; bromuro de propantelina; cloruro de trospio; imipramina; succinatro de solifenacina; aceite mineral; docusato; bisacodilo; laxante de docusato suavizante de heces; fosfato de sodio; muciloide hidrofílico de Psyllium; hidróxido de magnesio; glicerina; acetato de glatiramero; mitoxantrona; clorhidrato de duloxetina; venlafaxina; paroxetina; fluoxetina; bupropiona; sertralina; meclizina; papaverina; tadalafil; vardenafil; alprostadil; alprostadil; sildenafil; dexametasona; prednisona; metilprednisolona; amantadina; modafinil; fluoxetina; pemolina; hidroxizina; meclizina; clorhidrato de duloxetina; fenitoína; amitriptilina; gabapentina; nortriptilina; clonazepam; carbamazepina; imipramina; baclofen; dantrolene; baclofen (intratecal); clonazepam; diazepam; tizanidina; isoniazid; clonazepam; desmopressin; desmopresina; sulfametoxazol; ciprofloxacin; metenamina; nitrofurantoína; o fenazopiridina o una composición farmacéutica de los mismos. La presente invención también comprende un método para tratar (v.gr., reduciendo la severidad o erradicando) o previniendo infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-lgG4 o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, al sujeto se administra IFN gamma-1b-lgG4. Opcionalmente, IFN-lgG4 se administra en asociación con uno o más de una combinación de trimetoprim y sulfametazol o trimetoprim o itraconizol o una composición farmacéutica de los mismos. La presente invención también comprende un método para tratar o prevenir o retrasar el tiempo de progreso de la enfermedad, en pacientes con osteopetrosis maligna severa que comprende administrar al paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-lgG4 o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, al sujeto se administra IFN gamma-1b-lgG4. Opcionalmente, IFN-lgG4 se administra en asociación con uno o más de calcitriol o prednisona o una composición farmacéutica del mismo. La presente invención también comprende un método para tratar o prevenir condiloma acuminado externo refractario o recurrente, que comprende administrar {v.gr., por inyección intralesional), al paciente, una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-lgG4 o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, al sujeto se administra interferón alfa-n3-lgG4. Opcionalmente, IFN-lgG4 se administra en asociación con uno o más de ácido tricloroacético, podophyllum, tratamiento tópico con nitrógeno líquido, pintura de podophyllo-toxina, crema de imiquimod, solución de podophyllo, crema de 5-fluorouracilo o ácido tricloroacético (TCA) o una composición farmacéutica del mismo. La presente invención también comprende un método para tratar o prevenir, en un sujeto, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Oh), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, hepatitis B crónica que comprende administrar, al sujeto, una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-lgG4 o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, al sujeto se administra interferón alfa-2a-lgG4 o interferón alfa-2b-lgG4. Opcionalmente, IFN-lgG4 se administra en asociación con uno o más de cladribine (2-clorodeoxiadenosina, 2-CdA), pentostatin, imatinib, podophyllum, tratamiento tópico con nitrógeno líquido, pintura de podophyllo-toxina, crema de imiquimod, podophyllo solución, crema de 5-fluorouracilo, ácido tricloroacético (TCA), rituximab, tositumomab y yodo I131, Ibritumomab tiuxetan, dacarbazina, aldesleukin o clorhidrato de doxorubicina o una composición farmacéutica de los mismos. La presente invención incluye métodos para tratar o prevenir cualquier trastorno inflamatorio {v.gr., esclerosis múltiple, síndrome intestinal inflamatorio, psoriasis, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide o colitis ulcerativa) en un sujeto, al administrar, al sujeto, una cantidad terapéuticamente efectiva de una fusión de IL-10-lgG4. En una modalidad de la invención, una fusión de IFN-lgG4 de la invención se administra a un paciente, sujeto u hospedero, en cualquiera de los métodos anteriores, que es una madre embarazada o en lactancia, debido a toxicidad fetal y toxicidad a bebés lactantes reducidas, a cuya madre se administra IFN-lgG4, en comparación con otras fusiones de IFN. Sin estar limitado por una sola teoría o mecanismo de acción, la fusiones de IFN-lgG4 de la invención pueden presentar toxicidad fetal y toxicidad a bebés lactantes más bajas debido a la presencia de la porción lgG4 que presenta transferencia placentaria limitada.

Composiciones farmacéuticas La presente invención incluye métodos para usar una composición farmacéutica que comprende una fusión de IFN-lgG4, opcionalmente en asociación con un agente terapéutico, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para tratar una infección por Flaviviridae junto con las composiciones farmacéuticas mismas. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia; véase, v.gr., Gilman, ef ai, (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a. Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Edición, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania.; Avis, ef ai, (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman, ef ai, (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman, et ai, (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York. Una composición farmacéutica que contiene una fusión de IFN-lgG4 se puede preparar usando excipientes y aditivos farmacéuticamente aceptables convencionales y técnicas convencionales. Dichos excipientes y aditivos farmacéuticamente aceptables incluyen llenadores, aglutinantes, desintegrantes, reguladores de pH, conservadores, anti-oxidantes, lubricantes, saborizantes, espesantes, agentes colorantes, emulsionantes y similares, compatibles no tóxicos. Se contemplan todas las vías de administración incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral {v.gr., subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular) y no parenteral {v.gr., oral, transdérmica, intranasal, intraocular, sublingual, inhalación, rectal y tópica). Las composiciones inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Las soluciones y emulsiones inyectables también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se han de administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH, estabilizadores, incrementadotes de solubilidad, y otros de esos agentes, tales como por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.

Vehículos farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, reguladores de pH, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes y quelatadores y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de solución de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, inyección de Ringer con dextrosa y lactosada. Vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de ajonjolí y aceite de cacahuate. Agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas generalmente se añaden a preparaciones parenterales empacadas en contenedores de dosis múltiples que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, esteres de ácido metil y propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Reguladores de pH incluyen fosfato y citrato. Antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilceluosa sódica, hidroxipropil metilcelulosa y polivinilpirrolidona. Agentes emulsionantes incluyen Polisorbato 80 (TWEEN- 80). Un agente secuestrante o quelatador de iones de metal incluye EDTA. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles con agua; e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para ajuste de pH. Preparaciones para administración parenteral pueden incluir soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para ser combinados con un solvente inmediatamente antes de usarse, incluyendo tabletas hipodérmicas, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo inmediatamente antes de usarse y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser ya sea acuosas o no acuosas. La implantación de un sistema de liberación lenta o liberación sostenida, de tal manera que se mantenga un nivel de dosis constante también se contempla aqui. En breve, en esta modalidad, una fusión de IFN-lgG4 se dispersa en una matriz interna sólida, v.gr., metacrilato de polimetilo, metacrilato de polibutilo, cloruro de polivinilo plastificado o no plastificado, nylon plastificado, polietilentereftalato, plastificado, hule natural, poliisopreno, poliisobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etíleno-acetato de vinilo, hules de silicón, polidimetilsiloxanos, copolímeros de silicón-carbonato, polímeros hidrofílicos tales como hidrogeles de esteres de ácido acrílico y metacrílico, colágeno, alcohol polivinílico entrelazado y acetato de polivinilo parcialmente hidrolizado entrelazado, que es rodeado por una membrana polimérica externa, v.gr., polietileno, polipropileno, copolímeros de iiÉtáiál etileno/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etilo, copolímeros de etileno/acetato de vinilo, hules de silicón, polidimetilsiloxanes, hule de neopreno, polietileno clorado, cloruro de polivinilo, copolímeros de cloruro de polivinilo con acetato de vinilo, cloruro de vinilideno, etileno y propileno, tereftalato de polietileno ionomérico, hule de butilo, hules de epiclorohidrina, copolímero de etileno/alcohol vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinilo/alcohol vinílico, y copolímero de etileno/viniloxietanol, que es insoluble en fluidos corporales. El ingrediente activo se difunde a través de la membrana polimérica externa en un paso de control de velocidad de liberación. El porcentaje de compuesto activo contenido en dichas composiciones parenterales depende altamente de la naturaleza específica de las mismas, así como la actividad de la fusión de IFN-lgG4 y las necesidades del sujeto. La concentración de la fusión de IFN-lgG4 se puede ajustar de tal manera que una inyección provee una cantidad efectiva para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende, entre otras cosas, de la edad, peso y condición del paciente o animal como se conoce en la técnica. Las preparaciones parenterales de dosis unitaria son empacadas en una ampolleta, un frasco o una jeringa con una aguja. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, como se conoce y se pone en práctica en la técnica. La fusión de IFN-lgG4 se puede formular en un polvo liofilizado, que puede ser reconstituido para administrarse como soluciones, emulsiones y otras mezclas. El polvo también puede ser reconstituido y formulado como un sólido o gel. El polvo liofilizado estéril se prepara disolviendo la fusión de IFN-lgG4, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en un solvente adecuado. El solvente puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o solución reconstituida, preparada a partir del polvo. Excipientes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, sorbital, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, • ! glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El solvente también puede contener un regulador de pH, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otro regulador de pH conocido por los expertos en la técnica, en una modalidad, pH aproximadamente neutro. La filtración estéril subsecuente de la solución seguida por liofilización bajo condiciones estándares conocidas por los expertos en la técnica provee la formulación deseada. En una modalidad, la solución resultante se colocará en porciones en frascos para liofilización. Cada frasco puede contener una sola dosis o dosis múltiples de la IFN-lgG4. El polvo liofilizado puede ser almacenado bajo condiciones apropiadas, tales como a aproximadamente 4°C a temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección provee una formulación para usarse en administración parenteral. Para reconstitución, el polvo liofilizado se puede añadir a agua estéril u otro vehículo adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Dicha cantidad se puede determinar empíricamente.

La administración por inhalación se puede proveer usando, v.gr., un aerosol que contiene trioleato de sorbitán u ácido oleico, por ejemplo, junto con triclorofluorometano, diclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o cualquier otro gas propelente biológicamente compatible; también es posible usar un sistema que contenga una fusión de IFN-lgG4, como tal o asociada con un excipiente, en forma de polvo. En una modalidad, la fusión de IFN-lgG4 se formula en una forma de dosis para administración oral, en una modalidad, en una cápsula o tableta. Tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener uno o más de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante; un lubricante; un diluyente; un resbalante; un desintegrante; un agente colorante; un agente edulcorante; un agente saborizante; un agente humectante; un revestimiento emético; y un revestimiento de película. Ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma tragacanto, solución de glucosa, mucílago de acacia, solución de gelatina, melasa, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarosa y pasta de almidón. Los lubricantes incluyen talco, almidón, estearato de magnesio o calcio, lycopodium y ácido esteárico. Los diluyentes ¡ncluyen, por ejemplo, lactosa, sacarosa, almidón, caolina, sal, manitol y fosfato de dicalcio. Los resbalantes incluyen, pero no se limitan a, dióxido de silicio coloidal. Los agentes desintegrantes incluyen croscarmelosa sódica, glicolato de almidón sódico, ácido algínico, almidón de maíz, almidón de papa, bentonita, metilcelulosa, agar y carboximetilcelulosa. Los agentes colorantes incluyen, por ejemplo, cualquiera de los colorantes FD &C solubles en agua certificados y aprobados, mezclas de los mismos; y colorantes FD &C insolubles en agua suspendidos sobre hidrato de alúmina. Los agentes edulcorantes incluyen sacarosa, lactosa, manitol y agentes edulcorantes artificiales tales como sacarina, y cualquier número de sabores secados por aspersión. Los agentes saborizantes incluyen sabores naturales extraídos de plantas tales como frutos y mezclas sintéticas de compuestos que producen una sensación placentera, tales como, pero sin limitarse a menta y salicilato de metilo. Los agentes humectantes incluyen monoestearato de propilenglicol, monooleato de sorbitán, monolaurato de dietilenglicol y éter laurílico de polioxietileno. Los revestimientos eméticos incluyen ácidos grasos, grasas, ceras, laca, laca amoniacada y ftalatos de acetato de celulosa. Los revestimientos de película incluyen hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, polietilenglicol 4000 y ftalato de acetato de celulosa. Los métodos de la presente invención incluyen administración de una fusión de IFN-lgG4 en asociación con, por ejemplo, uno o más e otros agentes terapéuticos. En una modalidad, el otro agente terapéutico es un agente anti-viral que, cuando se administra a un sujeto, trata o previene una infección viral en el sujeto. La administración y dosis de esos agentes es típicamente de conformidad con el programa listado en la hoja de información del producto de los agentes aprobados, en Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57a. Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57a. edición (Noviembre 2002), asi como protocolos terapéuticos bien conocidos en la técnica. Un "agente terapéutico" es un agente que, cuando se administra a un sujeto lleva aproximadamente un efecto terapéutico deseado o benéfico, tal como prevención, eliminación o reducción de la progresión o severidad de síntomas asociados con una condición médica dada. Un agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un agente anti-viral o un agente anticanceroso. Los compuestos que se pueden administrar o combinar en asociación con una fusión de IFN-lgG4 incluyen uno o más análogos de ribonucleósido, inhibidores de IMPDH, inhibidores de N-glicosilación, inhibidores de proteasa N3, inhibidores de NS5B, compuestos inmunomoduladores e inhibidores de CTP sintasa, derivados de tiazolidina, benzanilidas, fenantrenequinonas, inhibidores de helicasa, inhibidores de polimerasa, oligodeoxinucleótidos de fosfotioato de antisentido, inhibidores de traducción dependiente de IRES, ribozimas resistentes a nucleasa, 1-amino-alquilcilohexanos, lípidos alquílicos, antioxidantes, escualeno, amantadina, ácidos biliares, ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico, bencenodicarboxamidas, derivados de ácido poliadenílico, 2',3'-dideoxiinosina y bencimidazoles. i I Como se mencionó antes, en una modalidad de la presente invención, ribavirin 1-ß-D-ribofuranosil-1 H-1 ,2,4-tpazolo-3-carboxamida) se administra o se combina en asociación con una fusión de IFN-lgG4. Ribavirin es vendido como REBETOL® por Schering Corporación; Kenilworth, NJ. Su fabricación y formulación se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 4,211 ,771.

Como se mencionó antes, en una modalidad de la presente invención, lamuvidina o zidovudine 3 ) se administra o se combina en asociación con una fusión de IFN-lgG4. En otra modalidad de la invención, gemcitabina se administra o se combina en asociación con una fusión de IFN-lgG4.

Gemcitabina es vendida como GEMZAR® por Eli Lilly and Co. (Indianapolis, IN). Una modalidad adicional de la presente invención comprende la administración de fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con VX497 Vértex Pharmaceuticals; Cambridge, MA). Una modalidad de la invención comprende la administración de micofenolato (MMF; 2-morfolinoetil (E)-6-(1 ,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuran?l)-4-metil-4-hexenoato) de mofetilo o una combinación de éste en asociación con una fusión de IFN-lgG4. MMF es vendida como CelICept® por Roche Laboratories (Nutley, NJ). Otra modalidad comprende la administración de EICAR 5-etinil-1-beta-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida o una combinación de ésta; Balzarini et al., J. Biol. Chem. 268(33): 24591-24598 (1993)) o en asociación con una fusión de IFN-lgG4. Una modalidad de la presente invención comprende administración de tiazofurin o una combinación de éste; Balzarini ef ai, J. Biol. Chem. 268(33): 24591-24598 (1993)) en asociación con una fusión de IFN-lgG4. Otra modalidad de la invención comprende la administración de desoxinojirímicina o una combinación de ésta y/o derivados de la misma, tales como N-nonil-desoxinojirimycin (De Clercq et ai, Mini Rev Med Chem. 2(2):163-75 (2002)) o n-butildesoxinojirimicina (nB-DNJ; Ouzounov et ai, Antiviral Res. 55(3):425-35 (2002)), en asociación con una fusión de IFN-lgG4. En otra modalidad, BILN-2061 ( Lamarre ef ai, Nature 426(6963):129-31 (2003)), se administra o se combina en asociación con una fusión de IFN-lgG4. En otra modalidad, timalfasin (v.gr., ZADAXIN™) se administra o se combina en asociación con una fusión de IFN-lgG4. ZADAXIN™ está disponible de SciClone Pharmaceuticals Internacional, Ltd. (San Mateo, CA). En otra modalidad más, isatoribine ANA245; monohidrato de 5-Amino-3-beta-D-ribofuranosilthiazolo(4,5-d)pirimidino-2,7(3H,6H)-diona; tiazolo(4,5-d)pirimidino-2,7(3H,4H)-diona, 5-amino-3-beta-D-ribofuranosil-, monohidrato) se administra o se combina en asociación con una fusión de IFN-lgG4. En otra modalidad, una fusión de IFN-lgG4 se administra o se combina en asociación con cualquier inhibidor de NS5B tal como telbivudine ( ) MN283 ( ) o NM107 (Idenix Pharmaceuticals; Cambridge, MA). En otra modalidad, una fusión de IFN-lgG4 se administra o se combina en asociación con Chu et ai, Tetrahedron Letters 37(40): 7229-7232 (1996)) o Biorg. Med. Chem. Lett. 9(14): 1949-1952 (1999)). En una modalidad adicional, una fusión de IFN-lgG4 se administra o se combina en asociación con cualquiera de las variantes Pi de Elgin c descrita en Qasim ef ai, Biochemistry 36: 1598-1607 (1997). En otra modalidad más, una fusión de IFN-lgG4 se administra o se combina en asociación con gliotoxin ( ; Ferrari ef ai, J. Virology 73(2): 1649-1654 ' (1999)). Otras modalidades de la invención incluyen la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con RD3-4082 ( ; Sudo ef ai, Anti-viral Chem. & Chemother. 9: 186 (1998)) o con RD3-4078 ( ; Sudo ef ai, Anti-viral Chem. & Chemother. 9: 186 (1998)) o cualquier otro inhibidor de proteasa descrito en Sudo ef al. Una modalidad adicional de la invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con Kakiuchi ef ai, FEBS Letters 421 : 217-220 (1998)) o cualquier otro inhibidor de proteínasa descrito en Kakiuchi et ai. Otra modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con RD4-6205 Sudo ef ai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 238: 643-647 (1997)) o cualquier otro inhibidor de proteasa descrito en Sudo ef ai Una modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con cerulenin Registro de CAS No. 17397-89-6; Lohmann et ai, Virology 249: 108-118 (1998)) o cualquier otro inhibidor de ARN polimerasa dependiente de ARN de HCV (RdRp) descrito en Lohmann ef al. Una modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con ceplene dicloehidrato de 2-(1 H-lmidazol-4-il)etanamina. Otra modalidad más de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con amantadine Una modalidad adicional de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con IDN-6556 Otra modalidad más de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de ésta en asociación con naftoquinona, 2-metilnanaftoquinona, 2-hidroxinanaftoquinona, 5-hidroxinanaftoquinona, 5,8-dihidroxinanaftoquinona, alcanin o shikonin (Takeshita et ai, Analytical Biochem. 247: 242-246 (1997)). Una modalidad adicional de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con 1-amino-1 ,3,5-trimetilciclohexano, 1-amino-1 (trans),3(trans),5-trimetilciclohexano, 1 -amino-1 (cis),3(cis),5-trimetilciclohexano, 1 -amino- 1 ,3,3,5-tetrametilciclohexano, 1-amino-1 ,3,3,5,5-pentametilciclohexano, 1-amino-1 ,3,5,5-tetrametil-3-etilciclohexano, 1-amino-1 ,5,5-trimetil-3,3-dietilciclohexano, 1-amino-1 ,5,5-trimetil-cis-3-etilciclohexano, 1-amino-(1S,5S)cis-3-etil-1 ,5,5-trimetilciclohexano, 1-amino-1 ,5,5-trimetil-trans-3-etilciclohexano, 1-amino-(1 R,5S)trans-3-etil-1 ,5,5-trimetilciclohexano, 1-amino-1-etil-3,3,5,5-tetrametilciclohexano, 1-amino-1-propil-3, 3,5,5-tetrametilciclohexano, N-metil-1-amino-1 ,3,3,5,5-pentametilciclohexano, N-etil-1-amino-1 ,3,3,5,5-pentametilciclohexano o N-(1 ,3,3,5,5-pentametilciclohexil)pirrolidina o cualesquiera otros inhibidores de N-metil-D-aspartato de 1-aminoalquilciclohexano (NMDA) descritos n la patente de E.U.A. No. 6,034,134. Una modalidad adicional de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con d-a-tocoferol o cualquier otro compuesto anti-HCV descrito en la patente de E.U.A. No. 5,922,757. Otra modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con ácido tauroursodesoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico o ácido biliar libre o cualquier otro inhibidor de HCV de ácido biliar en la patente de E.U.A. No. 5,846,964. Otra modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con 1 ,1,-[1 >4-fenilenebis(metilen)]bis(4,4'-trans-(4,5,6,7,8,9-hexahidro)benzimidazoil)piperidina, l .l'-f ^-fenilenbisímetilenjjbis^^'-benzimidazoil)piperidina o cualquier otro compuesto anti-HCV descrito en la patente de E.U.A. No. 5,830,905. Otra modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 en asociación con N,N'-4-[(2-benzimidazol)fenil]-1 ,4-butanodicarboxamida, N,N'-4-[(2-bencimidazol)fenil]-1 ,6-hexanodicarboxamida, N,N'-4-[(2-bencimidazol)fenil]-1 ,8-octanodicarboxamida, N,N'-4-[(2-bencimidazol)fenil]-1 ,9-nonanodicarboxamida, N,N'-4-[(2-bencimidazol)fenil]-1 ,10-decanodicarboxamida o N,N'-4-[(2-bencimidazol)feníl]-1 ,4-butenedicarboxamida o cualquier otro inhibidor de HCV de carboxamida descrito en la patente de E.U.A. No. 5,633,388. Otra modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con cualquiera de los derivados de ácido poliadenílico (5') descritos en la patente de E.U.A. No. 5,496,546. Una modalidad adicional de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con 2',3'-dideoxiinosina (patente de E.U.A No. 5,026,687). Una modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con o cualquier otro bencimidazol descrito en la patente de E.U.A. No. 5,891 ,874. Una modalidad adicional de la invención comprende la administración de VX-950 ( ; Lin et ai, J. Biol. Chem. 279(17): 17508-17514 (2004)) en asociación con una fusión de IFN-lgG4. Otra modalidad de la presente invención comprende la administración de una fusión de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con viramidina HHMCI l HO- y v0-/ c*' o levovirin ( « " *OH ).

En una modalidad, la presente invención comprende la administración de IFN-lgG4 o una combinación de la misma en asociación con una o más seleccionada de: tolterodina; oxibutinina; oxibutinina; oxibutinina; bromuro de propantelina; cloruro de trospio; imipramina; succinatro de solifenacina; aceite mineral; docusato; bisacodilo; laxante de docusato suavizante de heces; fosfato de sodio; muciloide hidrofílico de Psyllium; hidróxido de magnesio; glicerina; acetato de glatiramero; mitoxantrona; i clorhidrato de duloxetina; venlafaxina; paroxetina; fluoxetina; bupropiona; sertralina; meclizina; papaverina; tadalafil; vardenafil; alprostadil; alprostadil; sildenafil; dexametasona; prednisona; metílprednisolona; amantadina; modafinil; fluoxetina; pemolina; hidroxizina; meclizina; clorhidrato de duloxetina; fenitoína; amitriptilina; gabapentina; nortríptilina; clonazepam; carbamazepina; imipramina; baclofen; dantrolene; baclofen clonazepam; diazepam; tizanidina; isoniazid; clonazepam; desmopressin; desmopresina; sulfametoxazol; ciprofloxacin; metenamina; nitrofurantoína; fenazopiridina, una combinación de trimetoprim y sulfametazol o trimetoprim, itraconizol, calcitriol, prednisona, ácido tricloroacético, podofilum, tratamiento tópico con nitrógeno líquido, pintura de podofilo-toxina, crema de imiquimod, solución de podophyllo, crema de 5-fluorouracilo, ácido tricloroacético (TCA), cladribina (2-clorodesoxi adenosina, 2-CdA), pentostatin, imatinib, de ácido tricloroacético, podofilum, tratamiento tópico con nitrógeno líquido, pintura de podofilo-toxina, crema de imiquimod, solución de podofilo, crema de 5-fluorouracilo, ácido tricloroacético (TCA), rituximab, tositumomab y yodo I131, Ibritumomab tiuxetan, dacarbazina, aldesleukin o clorhidrato de doxorubicina. Como también se describió antes, las composiciones y métodos de la invención incluyen una fusión de IFN-lgG4 opcionalmente "en asociación" con uno o más agentes antivirales adicionales {v.gr., ribavirin, interferón alfa-2a or 2b, o pegilato de interferón alfa-2a o 2b). El término "en asociación" indica que los componentes de las combinaciones de la invención se pueden formular en una sola composición para administración simultánea o se pueden formular por separado en dos o más composiciones {v.gr., un equipo). Además, cada componente de una combinación de la invención se puede administrar a un sujeto en un tiempo diferente que cuando el otro componente se administra; por ejemplo, cada administración se puede dar en forma no por separado o secuencialmente) a varios intervalos durante un período dado. Más aún, los componentes separados se pueden administrar a un sujeto por la misma vía o por una vía diferente {v.gr., oral, intravenosa, subcutánea). La presente invención además comprende composiciones que comprenden fusión de IFN-lgG4 en asociación con uno o más agentes antivirales descritos anteriormente (v.gr., ribavirin) junto con las composiciones farmacéuticas de la misma que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Dosis y administración Los protocolos típicos para la administración terapéutica de dichas sustancias son bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la invención se puede administrar, por ejemplo, por cualquier vía parenteral {v.gr., inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa) o no parenteral {v.gr., oral, nasal). Las pildoras y cápsulas de la invención se pueden administrar por vía oral. Las composiciones inyectables se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica; por ejemplo, mediante inyección con una aguja hipodérmica incluyendo el REDIPEN® o el NOVOLET® Novo Pen descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas inyectables de la invención también se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja; tal como los dispositivos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941 ,880; 4,790,824 o 4,596,556. Las composiciones de la invención se pueden administrar, por ejemplo, tres veces al día, dos veces al día, una vez al dia, tres veces a la semana, dos veces a la semana o una vez a la semana, una vez cada dos semanas o 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas.

En una modalidad, la dosis diaria de un compuesto de la presente invención o de cualquier otro agente antiviral administrado en asociación con un compuesto de la invención es, en donde es posible, administrado de conformidad con Phvsicians' Desk Reference 2003 (Phvsicians' Desk Reference, 57a. Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57a. edición (Noviembre 2002). La dosis apropiada, sin embargo, puede ser alterada por un médico de clínica para compensar las características particulares del sujeto que recibe la terapia dependiendo, por ejemplo, de la potencia del compuesto administrado, efectos colaterales, edad, peso, condición médica, salud global y respuesta. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa aquella cantidad de un agente o sustancia terapéutica {v.gr., fusión de IFN-lgG4) que inducirá una respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, sujeto u hospedero que está siendo buscada por el administrador (tal como un investigador, médico o veterinario) que incluye, por ejemplo, alivio de los síntomas del virus de Flaviviridae {v.gr., HCV) infección y la prevención, reducción de la velocidad o detención del progreso de la infección por virus de Flaviviridae {v.gr., HCV) y sus síntoma(s) a cualquier grado incluyendo prevención de la infección de un hospedero con un virus de Flaviviridae {v.gr., HCV) después de trasplante de un hígado en el hospedero; o bien, en una modalidad, que incluye alivio de los síntomas de esclerosis múltiple, infección por virus de hepatitis B, condiloma acuminado, cáncer {v.gr., leucemia, linfoma, melanoma, sarcoma de Kaposi) o cualquier trastorno médico descrito aquí y la prevención, reducción de la velocidad o detención del progreso de dicho trastorno médico y sus síntoma(s) a cualquier grado. Por ejemplo, en una modalidad, una "dosis terapéuticamente efectiva" de fusión de IFN-lgG4 o una combinación que incluye otro agente antiviral {v.gr., ribavirin y/o interferón alfa-2a ó 2b pegilado o no pegilado) da por resultado la erradicación de ARM viral de Flaviviridae detectable {v.gr., ARN de HCV) durante un período, por ejemplo, 12 semanas o más (v.gr., 24 semanas). La detección de ARN viral en un hospedero se puede hacer fácilmente usando métodos bien conocidos en la técnica convencionales En una modalidad, una dosis o cantidad terapéuticamente efectiva de cualquier fusión de IFN-lgG4 o fusión de IL-10-lgG4 de la invención es de aproximadamente 2 mg/60 kg de peso corporal a aproximadamente 3 mg/60 kg de peso corporal (v.gr., aproximadamente 2.1 , 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8 ó 2.9 mg /60 kg de peso corporal) con una frecuencia de dosis de aproximadamente una vez al mes a una vez cada dos meses. En una modalidad, una dosis terapéuticamente efectiva de ribavirin {v.gr., REBETROL®) depende del peso corporal del paciente. En una modalidad, la dosis recomendada de REBETOL® se provee, más adelante, en el cuadro 1 CUADRO 1 Dosis recomendada En una modalidad, la duración de tratamiento con ribavirin {v.gr., REBETOL®) para pacientes previamente tratados con interferón es 24 a 48 semanas. La duración de tratamiento debe ser individualizada al paciente dependiendo de características de enfermedad de línea basal, respuesta a la terapia, y tolerabilidad del régimen. Después de 24 semanas de tratamiento, la respuesta virológica se debe evaluar. La descontinuación del tratamiento se puede considerar en cualquier paciente que no haya logrado un ARN de HCV por debajo del límite de detección de la prueba por 24 semanas. En una modalidad, en pacientes con recaída después de terapia con interferón, la duración del tratamiento con ribavirin {v.gr., REBETOL®) es de 24 semanas. REBETOL® se puede administrar sin considerar el alimento, pero se debe administrar de una manera consistente con respecto a la ingesta de alimento. Un médico de clínica o médico puede ajustar la dosis de una fusión de IFN-lg de la invención de acuerdo con el progreso observado en el paciente que recibe la terapia. Por ejemplo, la carga viral de un paciente que padece de infección por virus de hepatitis {v.gr., HCV) se puede monitorear usando cualquiera de los muchos métodos conocidos en la técnica. En una modalidad de la invención, la carga viral es monitoreada por rtPCR o ELISA como se describe con más detalle más adelante (véase v.gr., Fabrizi et ai, J. Clin. Microbiol. 43(1):414-20 (2005) o Cook ef ai, J. Clin. Microbiol. 42(9):4130-6 (2004)). De manera ideal, aunque no necesariamente, un hospedero infectado a quien se administra una composición de la invención, finalmente, presentará ARN de HCV no detectable en su cuerpo durante un período (v.gr., 12 o más semanas). El término "ARN de HCV no detectable" en el contexto de la presente invención significa que hay menos que aproximadamente 100 copias de ARN de HCV por ml de suero del paciente como se mide por metodología de PCR de transcriptasa inversa (rtPCT) de ciclos múltiples cuantitativa. Dichas pruebas basadas en PCR son convencionales y bien conocidas en la técnica. En general, la rtPCR se realiza aislando el ARN de un espécimen, transcribiéndolo en forma inversa para generar ADNc, amplificando secuencias de ácido nucleico específicas por PCR, y después usando una variedad de métodos para detectar las secuencias amplificadas (Urdea ef ai, Clin. Chem. 43:1507-1511 (1997)). En una modalidad, una composición de la presente invención, cuando se administra a un hospedero infectado con un virus de Flaviviridae, presentará una respuesta virológica sostenida. El término "respuesta virológica sostenida" como se usa en el contexto de la presente invención significa que hay ARN de HCV no detectable en el suero de pacientes tratados de conformidad con la presente invención por lo menos durante 24 semanas después del término del tratamiento de terapia combinada. Preferiblemente, el período de respuesta virológica sostenida es por lo menos un año -o más -- después del término del tratamiento. De manera similar, la dosis en el tratamiento de indicaciones cancerosas descritas aqui puede ser monitoreado usando métodos que son bien conocidos en la técnica y el médico clínico o médico que da el tratamiento puede ajustar la dosis del IFN-lg que está siendo administrado de acuerdo con el nivel de progreso observado y de acuerdo con otras exigencias clínicas que se observan {v.gr., reacciones adversas al régimen de tratamiento escogido). En una modalidad de la invención, el progreso del tratamiento de indicaciones de leucemia como se describe aquí {v.gr., leucemia de células pilosas o leucemia mielógena crónica), usando una IFN-lg de la presente invención, se monitorean usando pruebas de química sanguínea tales como para la enzima fosfatasa alcalina de leucocitos (calificación de LAP) (Rambaldi ef ai, Blood 73(5):1113-5 (1989)). Una calificación de LAP más baja se ha asociado con CML. En una modalidad de la invención, el progreso del tratamiento de leucemia de células pilosas, con un IFN-lg de la presente invención, es monitoreado, por ejemplo, con un conteo de sangre completa para detectar un conteo de glóbulos blancos bajo, un conteo de glóbulos rojos bajo, plaquetas bajas; un examen médico para detectar un bazo o hígado agrandado; una biopsia de médula ósea para detectar células pilosas; un frotis de sangre periférica para detectar células pilosas; una prueba hecha cobre sangre o células de médula ósea para fosfatasa acida resistente a tartrato que puede confirmar la presencia de células pilosas; o un escudriñamiento de tomografía computada abdominal (CT) para detectar un bazo o hígado agrandado. En una modalidad de la invención, el progreso del tratamiento de un melanoma, usando una IFN-lg de la presente invención, es monitoreado por visual inspección de la piel incluyendo fotografía de cuerpo entero y mapeo molar. En una modalidad de la invención, el progreso de tratamiento de osteopertosis maligno se puede monitorear usando rayos X de esqueleto (los rayos X de pacientes conosteopetrosis a menudo tendrán una densidad inusual con una apariencia blanca gredosa), pruebas de densidad ósea, biopsias de hueso, escudriñamientos de CAT o MRl. En una modalidad de la invención, el progreso de tratamiento de condiloma acuminado refractario o recurrente (verrugas de genitales) se puede monitorear por visual inspección de la superficie de la piel infectada. En una modalidad de la invención, el progreso de tratamiento de linfoma folicular se puede monitorear por conteo de sangre completa (CBC), examen de frotis de sangre periférica, rayos X de tórax y escudriñamientos de CT y pruebas de química sanguínea (v.gr., incluyendo LDH, ácido úrico, pruebas de función celular y creatinina). LDH es a menudo un indicador de carga de tumor en donde el LDH elevado es un factor de pronóstico negativo. En una modalidad de la invención, el progreso de tratamiento de sarcoma de Kaposi (v.gr., sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA) es monitoreado por inspección visual de lesiones de la piel, rayos X de tórax (para visualizar lesiones en los pulmones), Broncoscopía (para visualizar lesiones en las vías aéreas superiores) y endoscopía (para visualizar lesiones en el estómago e intestino delgado). En una modalidad de la invención, el progreso de tratamiento de infecciones asociada con enfermedad granulomatosa crónica (CGD) es monitoreado por una entrevista del paciente y el monitoreo de la temperatura corporal, rayos X de tórax, un conteo de sangre para detectar cualquier nivel excesivamente alto de inmunoglobulina, o una prueba para detectar una tasa de sedimentación de eritrocitos elevada o ESR (un signo de infección o inflamación crónica). En una modalidad de la invención, el progreso de tratamiento de esclerosis múltiple (MS) es monitoreado por formación de imagen por resonancia magnética para detectar la presencia de placas o cicatrización en el cerebro así como entrevistas del paciente para monitorear la frecuencia de ataques, exacerbaciones, brotes o recaídas de síntomas de MS.

Equipos y articulos de fabricación Los equipos de la presente invención incluyen fusión de IFN-lgG4 o una composición farmacéutica de la misma, por ejemplo, en una forma de dosis farmacéutica tal como una pildora, un polvo, un líquido inyectable, una tableta, granulos dispersables, una cápsula, un cachet o un supositorio. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a. Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York. Los equipos de la presente invención también incluyen información, por ejemplo en forma de un inserto de empaque, que incluye información referente a las composiciones farmacéuticas y formas de dosis en el equipo. Generalmente, dicha información ayuda a los pacientes y médicos a usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosis adjuntas de manera efectiva y segura. Por ejemplo, la siguiente información referente a IFN-lgG4 puede ser suministrada en el inserto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración apropiadas, cómo se suministra, condiciones de almacenamiento apropiadas, referencias e información de patente. Los equipos de la invención también pueden incluir otra composición terapéutica tal como ribavirin, por ejemplo, combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una formulación farmacéutica, muy preferiblemente en una forma de dosis farmacéutica tal como una pildora, un polvo, un líquido inyectable, una tableta, granulos dispersables, una cápsula, un cachet o un supositorio {v.gr., Rebetol®).

IFN-lgG4 y la otra composición terapéutica (v.gr., ribavirin) se pueden suministrar, en el equipo, como composiciones separadas o combinar en una sola composición.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proveen para describir más claramente la presente invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Clonación, expresión y purificación de lnterferón-alfa-2b humano/Ala- Ser/proteína de fusión de lgG4 Fc humana El interferón-alfa-2b humano clonado (IFNa2b), incluyendo la secuencia de péptido de señal de IFNa2b, derivado del vector pE3-327-IFNa2b se fusionó a lgG4 Fc humano por reacción de PCR. La proteína madura comprendía IFNa2b-(enlazador de Ala-Ser) humano-lgG4 Fc humana: lnterferón-alfa-2b humano/Ala-Ser/proteina de fusión de lqG4 Fc humano (SEQ ID NO: 2): Secuencia de señal de IFN-alfa-2b humano M A L T F A L L V A L L V L S ATG GCC TTG ACC TTT GCT TTA CTA GTG GCC CTC CTG GTG CTC AGC C K S S C S V G TGC AAG AGC TCC TGC AGC GTG GGC IFN-alfa-2b humano C D L P Q T H S L G S R R T L TGT GAT CTG CCT CAÁ ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC TTG M L L A Q M R R I S L F S C L ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC TTG K D R H D F G F P Q E E F G N AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC AAC Q F Q K A E T I P V L H E M I CAG TTC CAÁ AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC Q Q I F N L F S T K D S S A A CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCT D E T L L D K F Y T E L Y Q TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC TAC CAG Q L N D L E A C V I Q G V G V CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG GGG GTG T E T P L M K E D S I L A V R ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG AGG K Y F Q R I T L Y L K E K K Y AAA TAC TTC CAÁ AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG AAA TAC S P C A W E V V R A E I M R S AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCT F S L S T N L Q E S L R S K E TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAÁ GAA AGT TTA AGA AGT AAG GAA enlazador A S GCT AGC lgG4 Fc humano D K T H T C P P C P A P E F L GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC CTG G G P S V F L F P P K P K D T GGG GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT L M I S R T P E V T C V V V D CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC V S Q E D P E V Q F N W Y V D GTG AGC CAG GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAC GTG GAT G V E V H N A K T K P R E E Q GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG F N S T Y R V V S V L T V L H TTC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC Q D W L N G K E Y K C K V S N CAG GAC TGG CTG AAC GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC K G L P S S I E K T I S K A K AAA GGG CTC CCG TCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA G Q P R E P Q V Y T L P P S Q GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CAG E E M T K N Q V S L T C L V K GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA G F Y P S D I A V E W E S N G GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG Q P E N N Y K T T P P V L D S CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC D G S F F L Y S R L T V D K S GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG GAC AAG AGC R W Q E G N V F S C S V H E AGG TGG CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG A L H N H Y T Q K S L S L S L GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CTG G K GGT AAA TGA Enlazadores para otras formas A S G S G (SEQ ID NO: 7) GCT AGC GGA TCC GGC (SEQ ID NO: 21) A S G S G S G (SEQ ID NO: 8) GCT AGC GGC AGC GGA TCC GGC (SEQ ID NO: 22) A S G G G G S G G G G S G G G G S G (SEQ ID NO: 17) GCT AGC GGAGGCGGTGGATCCGGTGGAGGCGGCAGTGGTGGTGGAGGAAGCGGC (SEQ ID NO: 23) El residuo en negritas, en la región lgG4 es un residuo mutado que es serina en lgG4 de tipo silvestre. La mutación facilita la formación de enlaces de disulfuro intermolecular entre las moléculas de lgG4 (favoreciendo así la creación de formas diméricas de las fusiones) y dificulta la formación de enlace intramolecular.

El vector incluyó un marcador resistente a la ampicilina y región promotora de citomegalovirus.

Se preparó ADN transformando plásmidos en Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene), crecimiento durante 10 horas en 500 ml de Luria Broth-50 ug/ml de ampicilina, y preparación de dsADN usando Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qíagen, Catalog # 12163). dsADN purificado fue transfectado en células de riñon embrionarias humanas 293 (HEK293) usando el método de fosfato de calcio (Gorman et ai, ADN Prot. Engineer. Tech. 2:3 (1990)). Las células se hicieron crecer inicialmente en 50% de Hamm's F12/50% de DMEM F-12 con 10% de suero de bovino fetal (Cellgro). Veinticuatro horas después de la transfección el medio se cambió a suero libre de CHO-PF (Sigma) con 1 ug/ml de apo-transferrina (Sigma) y 5 ug/ml de insulina (Sigma) añadida. La proteína secretada se cosechó 96 horas después de la transfección. El sobrenadante se aplicó a una columna de proteína A- Sepharose CL-4B (Pharmacia), regulador de pH intercambiado con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) y se concentró a 0.5 ml usando un Centriprep-10 (Amicon). La proteína purificada se cuantificó por A28o- Proteínas de fusión adicionales se generaron insertando enlazadores de varios tamaños entre la secuencia de dipéptido de Ala-Ser y lgG4 Fc humana. Estos enlazadores fueron: Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 9), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 10), y (Gly-Gly-Gly-Ser)3-Gly (SEQ ID NO: 11).

EJEMPLO 2 Farmacocinética de IFN alfa-2b-lgG4 Construcciones de fusión de IFN alfa-2b-lgG4 humanas se prepararon usando técnicas de clonación molecular convencionales. En breve, se prepararon tres construcciones: una que comprende una fusión directa entre el C-terminal de IFN alfa-2b, un enlazador de Ala-Ser, y la región Fc de lgG4 humana (CH2+CH3+región de gozne) con los restantes dos conteniendo enlazadores que comprenden ASGSG (SEQ ID NO: 7) o ASGSGSG (SEQ ID NO: 8). Después de la transfección de células HEK293, las proteínas recombinantes expresadas fueron purificadas sobre Proteína-A y se solubilizaron en un regulador de pH de PBS (solución salina reguladora de pH de fosfato) a concentraciones que varían entre 0.79 y 2.31 mg/ml. La bioactividad (relacionada con IFN a2b) de estas proteínas de fusión se evaluó usando un bioensayo validado. Proteína estándar de IFN alfa-2b nativa de referencia se usó para comparar la bioactividad de las proteínas de fusión. La farmacocinética de estas proteínas de fusión se evaluó en ratas Sprague Dawley después de administración intravenosa a una dosis de 1 mg/kg. Pre dosis obtenida en muestras de plasma, 1 , 4, 8, 24 horas, y el día 2, 3, 4, 7, 10, 14, 22 y 28 post-dosis se analizaron usando un bioensayo validado. Los resultados de las pruebas se exponen más adelante en el cuadro 2.

CUADRO 2 Bioactividad de cada fusión sobre el tiempo La bioactividad de las 3 construcciones de fusión variaron entre 2.1 y 3.3X106 lU/mg de proteína (la bioactividad estándar de referencia de IFN es 2.6 X108 lU/mg de proteína; como se determina en una prueba in vitro). La prueba de efecto citopático (CPE) con la cual la bioactividad del interferón se midió se basa en la capacidad de interferón (IFN) (o moléculas con actividad de IFN) para proteger a las células contra muerte inducida por virus o efecto citopático. La prueba usó células de fibroblastos humanos (FS-71 , células de la piel anterior diploides humanas normales) y virus de EMC (virus de encefalomiocarditis) en un formato de 96 pozos: un número de células fijo se cultivó en presencia de muestras (y un estándar de referencia de IFN) que contenía IFN durante aproximadamente 4 horas seguido por infección con un número fijo de partículas virales. Después de que las células infectadas con virus alcanzan una etapa pre-determinada de CPE, el medio se cosechó y las células se probaron colorimétricamente usando cristal violeta. Las muestras se compararon después con la curva de actividad estándar de referencia de IFN para cálculo de bioactividad. La farmacocinética de estas proteínas de fusión en ratas demostró una mejora sustancial en la vida media terminal (VA) de bioactividad derivada de IFN en relación con la proteína de IFN. La VA varió entre 5.6 a 9.7 días en comparación con una VA de 1 hora con la proteína de IFN en ratas (VA es ~2 horas en humanos).

EJEMPLO 3 Expresión, purificación y caracterización de IFNa2b-lgG4 La línea de células de producción, 293 c18, se obtuvo del American Type Culture Collección (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo) (CRL-10852) y se mantuvo DMEM complementado con 10% de FBS. Los ADNc que codifican las proteinas de fusión de IFN, SCH Y y SCH Z, se clonaron en vector de expresión pCEP4 (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). Los vectores de expresión, pCEP4-LPD475 y pCEP4-LPD476, fueron transfectados a células 293 c18 usando TranslT-293 (Mirus Bio, Madison, Wl). El cultivo de células transfectadas se trató después con Geneticín (400 µg/ml) e higromicina B (400 µg/ml). Para la producción de las proteínas de fusión, las células transfectadas se sembraron en matraces en T en DMEM con 10% de FBS. Aproximadamente tres días después de la siembra, el cultivo fue reemplazado por 293 SFMII (Invitrogen Corp.) complementado con 200 mM de glutamina (40 ml/l), Traza A (1 ml/l), Traza B (1 ml/l), Tris Ph 7.4 (15ml/L), IS (complemento de hierro) Fe (1 ml/l, Irvine Scientific; Santa Ana, CA). Dentro de 72 horas, la temperatura de la incubadora se redujo de 37°C a 34°C y se mantuvo a 34°C durante la producción. El sobrenadante de cultivo se recuperó a aproximadamente 10-12 dias después del cambio de temperatura.

El medio de cultivo acondicionado se centrifugó con una centrífuga de mesa.

El sobrenadante se filtró a través de un filtro de a 0.2 µm. Las fusiones fueron purificadas por cromatografía en columna de proteína A como sigue: dos clones de IFN alfa-2b-lgG4 se purificaron usando una columna de 5 ml de HiTrap-rProtein A. Las dimensiones de la columna fueron 1.6 cm x 2.5 cm. Las purificaciones se llevaron a cabo en un cuarto frío usando un sistema AKTA 100 (GE Healthcare; Piscataway, NJ). El objetivo de carga fue aproximadamente 10 mg/ml de resina. La columna se equilibró con tres volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM con cloruro de sodio 125 mM, pH 7.2. Después el alimento se cargó sobre la columna a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La columna se lavó con diez volúmenes de columna del regulador de pH anterior a la misma velocidad de flujo. Después del lavado, la proteína ligada se eluyó usando 100 mM de acetato de sodio, pH 2.9 a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La mezcla fue ajustó a un pH de 5.5 usando 1 M de base de Tris, se filtró a través de 0.22 µm de filtro y se usó para análisis preliminar. Posteriormente la mezcla se dializó contra un litro de fosfato de sodio al 10 mM con cloruro de sodio 125 mM, pH 7.2, 0.22 µm, se filtró y se almacenó a 4°C.

CUADRO 3 Resultados analíticos de las mezclas La fusión de IFN alfa-2b-lgG4 se analizó sobre una columna de CLAR de exclusión de tamaño y los resultados se exponen más adelante en el cuadro 4.

CUADRO 4 Análisis de CLAR de exclusión de tamaño de IFN alfa-2b-lgG4 Lisozima, albúmina de suero de bovino (BSA) e IgG se hicieron correr sobre la columna como estándares de tamaño contra los cuales se calculó el tamaño de IFN alfa-2b-lgG4 SCH-Y o SCH-Z. Puesto que el peso molecular es aproximadamente la mitad del tamaño del polipéptido eluído de la columna, se dedujo que el IFN alfa-2b-lgG4 eluído de la columna era un dímero. La bioactividad de las fusiones expresadas en este ejemplo se midió como se expuso anteriormente en una prueba de efecto citopático in vitro (CPE): IFNa2b-lgG4 (SCH Y): 7.48 x 106 lU/mg IFNa2b-lgG4 (SCH Z): 1.02 x 107 lU/mg i La presente invención no debe estar limitada en alcance por las modalidades específicas descritas aquí. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas aquí serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Se pretende que dichas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, ' descripciones de producto y protocolos se citas a lo largo de esta solicitud, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un polipéptido aislado que comprende uno o más polipéptidos de interferón fusionados a uno o más polipéptidos de lgG4 Fc. 2.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el interferón es un miembro seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c, interferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, interferón alfa-6, interferón alfa-7a, interferón alfa-7b, interferón alfa-8a, interferón alfa-8b, interferón alfa-8c, interferón alfa-1 Oa, interferón alfa-1 Ob, interferón alfa-13, interferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, interferón alfa-17b, ¡nterferón alfa-17c, interferón alfa-17d, interferón alfa-21a, interferón alfa-21 b, interferón alfa-24, interferón beta, interferón omega, interferón tau, interferón alfa-N3, interferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-1b, interferón gamma, interferón alfa F e interferón alfa con-1. 3.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3 y 15. 4.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el interferón comprende una secuencia de

Claims

aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12-14. 5.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. 6.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el interferón es fusionado a la lgG4 por un enlazador de péptido. 7.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el enlazador comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 18 aminoácidos. 8.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: Ala Ser Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 7); Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 8); Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 9); Gly Ser Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 10); Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 11); Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 19); Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 17); Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly (SEQ ID NO: 18); y Ala Ser (SEQ ID NO: 20). 9.- Un multimero que comprende dos o más polipéptidos de la reivindicación 1 opcionalmente coordinados con un catión divalente. 10.- El multimero de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el catión es Zn +. 11.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es cristalino. 12.- Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 13.- Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 en asociación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales o una composición farmacéutica de los mismos. 14.- Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 en asociación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales adecuados para tratar una condición médica seleccionada del grupo que consiste de infección por virus de flaviviridae, esclerosis múltiple, infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis maligna, condiloma acuminado externo refractario o recurrente, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Oh), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, infección de hepatitis B e infección de hepatitis C o una composición farmacéutica de los mismos. 15.- La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el agente farmacéutico adicional es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ribavirin, isatoribine, VX-497, viramidine, BILN 2061 , VX-950 y IDN-6556. 16.- Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la reivindicación 1. 17.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 5 y 16. 18.- Un vector aislado que comprende el polinucleótido de la reivindicación 16. 19.- Una célula hospedero aislada que comprende el vector de la reivindicación 18. 20.- Un método para incrementar la vida media in vivo de interferón que comprende fusionar el interferón a lgG4. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el interferón fusionado a la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3 y 15. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el interferón es un miembro seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, ¡nterferón alfa-2b, interferón alfa-2c, ¡nterferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, ¡nterferón alfa-6, ¡nterferón alfa-7a, interferón alfa-7b, ¡nterferón alfa-8a, ¡nterferón alfa-8b, ¡nterferón alfa-8c, ¡nterferón alfa-1 Oa, ¡nterferón alfa-10b, ¡nterferón alfa-13, ¡nterferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, ¡nterferón alfa-17b, interferón alfa-17c, interferón alfa-17d, ¡nterferón alfa-21a, interferón alfa-21 b, ¡nterferón alfa-24, interferón beta, ¡nterferón omega, interferón tau, ¡nterferón alfa-N3, ¡nterferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-1b, ¡nterferón gamma, interferón alfa F e interferón alfa con 1. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el interferón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12-14. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. 25.- El uso un polipéptido aislado que comprende ¡nterferón fusionado a lgG4 o una composición farmacéutica del mismo, para la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir, en un sujeto, una condición médica seleccionada del grupo que consiste de infección por virus de flaviviridae, esclerosis múltiple, infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis maligna, condiloma acuminado externo refractario o recurrente, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Ph), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, hepatitis B infección, hepatitis C infección, y cualquier condición médica tratable por terapia con interferón. 26 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el interferón fusionado a lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 3 y 15. 27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el sujeto es una madre embarazada o en lactancia. 28.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el interferón es un miembro seleccionado del grupo que consiste de interferón alfa-1 a, interferón alfa-1 b, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c, interferón alfa-4a, interferón alfa-4b, interferón alfa-5, interferón alfa-6, interferón alfa-7a, interferón alfa-7b, interferón alfa-8a, interferón alfa-8b, interferón alfa-8c, interferón alfa-1 Oa, interferón alfa-1 Ob, interferón alfa-13, interferón alfa-14a, interferón alfa-14b, interferón alfa-14c, interferón alfa-16, interferón alfa-17a, interferón alfa-17b, interferón alfa-17c, interferón alfa-17d, interferón alfa-21a, interferón alfa-21b, interferón alfa-24, interferón beta, interferón omega, interferón tau, interferón alfa-N3, interferón beta-1 a, interferón beta-1 b, interferón gamma-1b, interferón gamma, interferón alfa F e ¡nterferón alfa conl . 29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el medicamento está formulado para ser administrable en asociación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales o una composición farmacéutica de los mismos. 30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento está formulado para ser administrable en asociación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales adecuados para tratar una condición médica seleccionada del grupo que consiste de infección por virus de flaviviridae, esclerosis múltiple, infecciones severas asociadas con enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis maligna, condiloma acuminado externo refractario o recurrente, leucemia de células pilosas, fase crónica, leucemia mielógena crónica (CML) positiva de cromosoma de Filadelfia (Oh), melanoma maligno, linfoma folicular, condiloma acuminado, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA, infección de hepatitis B e infección de hepatitis C o una composición farmacéutica de los mismos. 31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en donde el agente farmacéutico adicional es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ribavirin, isatoribine, VX-497, viramidine, BILN 2061 , VX-950 y IDN-6556. 32.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el interferón comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 12-14. 33.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde la lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. 34.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el hospedero es un humano. 35.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde la condición médica es infección por hepatitis C y en donde una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido aislado que comprende interferón fusionado a lgG4, opcionalmente en asociación con un compuesto terapéutico antiviral, o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo es administrable durante un período de tratamiento suficiente para erradicar ARN de virus de hepatitis C detectable y para mantener ARN de virus de hepatitis C no detectable por lo menos durante doce semanas después del término del período de tratamiento. 36.- Un método para hacer un polipéptido que comprende interferón fusionado a lgG4 que comprende introducir un polinucleótido de la reivindicación 16 en una célula hospedero bajo condiciones en donde el polinucleótido es expresado. 37 - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque comprende adicionalmente aislar el polipéptido. 38.- Un polipéptido producido por el método de la reivindicación 36. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el interferón fusionado a lgG4 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs. 2, 3 y 15.