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MX2012008453A - Formulaciones liquiddas para un conjugado de eritropoientina de accion prolongada. - Google Patents

Formulaciones liquiddas para un conjugado de eritropoientina de accion prolongada.

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MX2012008453A
MX2012008453A MX2012008453A MX2012008453A MX2012008453A MX 2012008453 A MX2012008453 A MX 2012008453A MX 2012008453 A MX2012008453 A MX 2012008453A MX 2012008453 A MX2012008453 A MX 2012008453A MX 2012008453 A MX2012008453 A MX 2012008453A
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MX
Mexico
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liquid formulation
epo
formulation according
long
concentration
Prior art date
Application number
MX2012008453A
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English (en)
Inventor
Sung Min Bae
Dae Seong Im
Min Young Kim
Chang Ki Lim
Sung Youb Jung
Se Chang Kwon
Original Assignee
Hanmi Science Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanmi Science Co Ltd filed Critical Hanmi Science Co Ltd
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Abstract

Se describe una formulación líquida que permite conjugados EPO de acción prolongada, que tienen una duración y estabilidad mejorada in vivo, para ser estables cuando se almacenan por un periodo prolongado de tiempo. Comprende una composición estabilizadora caracterizada por una solución amortiguadora y manitol. Al estar libre de albúmina de suero humana y de otros factores potencialmente perjudiciales para el cuerpo, la formulación líquida está libre de preocupaciones acerca de infecciones virales y garantiza una excelente estabilidad al almacenamiento para los conjugados EPO de acción prolongada.

Description

FORMULACIONES LÍQUIDAS PARA UN CONJUGADO DE ERITROPOIETINA DE ACCIÓN PROLONGADA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención: actual se refiere a una formulación liquida para garantizar estabilidad al almacenamiento de larga duración de un conjugado de eritropoyetina de larga duración en el cual eritropoyetina, un polímero no péptido y un fragmento Fe de inmunoglobulina se ligan covalentemente y los cuales exhiben una duración de acción prolongada comparado con el tipo natural.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína, que consiste de 165 residuos de aminoácidos, que actúa como una eitoquina para precursores de eritrocitos en la médula ósea, siendo de esta manera responsables en controlar la eritropoyesis (producción de células de glóbulos rojos) . La EPO se sintetiza principalmente por células renales, con una cantidad pequeña siendo producida por el hígado. Como se aprecia en la insuficiencia renal crónica, la pérdida de funciones renales se acompaña típicamente por una reducción, por ejemplo, en el nivel de EPO, con una reducción concomitante en la producción de eritrocito. Ahora, la EPO se usa para tratar la anemia, que resulta de enfermedad renal crónica y de otras enfermedades críticas así como administrarse a pacientes programados para experimentar cirugía (Mijake et al., J. Biol. Chem. 25: 5558-5564 ,. 1977 ; , Eschbach et al., New Engl. J. Med. 316: 73-78, 1987; SanfordB.K, Blood, 177: 419-434, 1991; PCT WO 85-02610) .
La EPO urinaria humana se purificó primero a partir de pacientes con anemia aplástica por Miyake et al. (Miyake et al., J. Biol. Chem., 252: 5558, 1977), pero la cantidad.de EPO de esta fuentes es insuficiente para usar en el tratamiento de anemia. Ya que la publicación de-la Patente E.U.A. No. 4,703,008 describe la identificación y clonación de un gen EPO humano y la expresión de proteínas EPO de recombinación, la producción en masa de EPO se ha alcanzado por. varias manipulaciones genéticas diferentes.
Ya que los polipéptidos tienden a desnaturalizarse fácilmente debido a su baja estabilidad,, se degradan por enzimas proteolíticas en la sangre ' y pasan a través del hígado o riñon, los medicamentos de proteína, incluyendo polipéptidos como componentes farmacéuticamente efectivos, necesitan administrarse frecuentemente a pacientes para mantener las concentraciones y titulaciones en nivel sanguíneo deseadas. Sin embargo, la administración frecuente de medicamentos de proteína, especialmente por inyección, causa dolor en los pacientes.
Para solucionar estos problemas, se ha colocado una cantidad de esfuerzo en mejorar la estabilidad en suero de fármacos de proteína y mantener los fármacos en la sangre a nivel altos por un periodo prolongado de tiempo, y de esta manera maximizar la eficacia farmacéutica de los fármacos. Para usar en formulaciones de larga duración, los fármacos de proteina deben formularse para tener una alta estabilidad y tienen sus titulaciones mantenidas a niveles suficientemente altos sin incurrir en respuestas inmunitarias en los pacientes.
Para estabilizar proteínas y prevenir la degradación y liberación enzimática por los ríñones, se usó convencionalmente un polímero que tiene alta solubilidad, tal como polietilenglicol (PEG), para modificar químicamente la superficie de un fármaco dé proteína. Al enlazarse a regiones específicas o varias de una proteína objetivo, PEG estabiliza la proteína y previene la hidrólisis, sin causar efectos colaterales serios (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139, 1991). Sin embargo, a pesar de su capacidad para aumentar la estabilidad de proteína, la PEGilación tiene problemas tales como que reducé mayormente las titulaciones de proteínas fisiológicamente activas. Además, el rendimiento reduce con el incremento de peso molecular del PEG debido a la reactividad reducida de las proteínas.
Un método alternativo para mejorar la estabilidad in vivo de proteínas fisiológicamente activas es ligando un gen de una proteína fisiológicamente activa a un gen que codifica una proteína que tiene una alta estabilidad en suero por tecnología de recombinación genética y cultivo de las células transfectadas con el gen recombinante para producir una proteína de fusión. Por ejemplo, una proteína de fusión puede prepararse al conjugar albúmina, una proteína conocida para ser la más efectiva en aumentar la estabilidad de la proteína, o su fragmento a una proteína fisiológicamente activa de interés por recombinación genética (Publicación PCT Nos. O 93/15199 y WO 93/15200, Publicación Europea de Pat . No. 413,622).
Otro método es usar una inmunoglobulina . Como se describe en la Patente E.U.A. No. 5,045,312, la hormona de crecimiento humano se conjuga a la albúmina de suero de bovino o inmunoglobulina de ratón por el uso de un agente reticulante. Los conjugados tienen actividad aumentada, cuando se compara con hormona de crecimiento no modificada. Se emplea carbodiimida o glutaraldehído como el agente reticulante. Sin embargo, al enlazarse no específicamente a los péptidos, tales agentes reticulantes de bajo peso molecular no permiten la formación de conj ugados homogéneos y son aún tóxicos in vivo . Además , la patente muestra actividad aumentada sólo gracias al acoplamiento químico con la hormona de crecimiento. El método de la patente no garantiza actividad aumentada para varios tipos de fármacos de polipéptido, de manera que la patente no reconoce factores relacionados con la estabilidad de la proteína uniformes, tal como duración, periodo medio en la sangre, etc.
Recientemente se ha sugerido una formulación de fármaco que es una formulación de fármaco de proteina de larga duración con mejora tanto en duración como estabilidad in vivo. Para uso en la formulación de fármaco de larga duración, se prepara un conjugado de proteina al ligar covalentemente un polipéptido fisiológicamente activo, un polímero no polipéptido y un fragmento Fe de inmunoglobulina (Patente Coreana No. 10-0567902 y 10-0725315) .
En este método, la EPO puede usarse como un polipéptido fisiológicamente activo para proporcionar un conjugado EPO de larga duración. Para aplicar conjugados EPO de larga duración a productos de fármaco, es necesario mantener la eficacia farmacéutica del mismo in vivo mientras se restringen los cambios fisicoguímicos tales como degeneración, agregación, adsorción o hidrólisis inducida por luz, calor o aditivos durante el almacenado y transporte. Los conjugaos EPO de larga duración son más difíciles de estabilizar que un polipéptido EPO por sí mismo debido a que se incrementan en volumen y peso molecular.
Generalmente, las proteínas tienen una vida media muy corta y, cuando se exponen a temperaturas inapropiadas, interfaces agua-aire, altas presiones, tensión física/mecánica, solventes orgánicos, contaminación microbiana, etc., experimentan degradación tal como la agregación de monómeros, precipitación por agregación, y adsorción en la superficie de los recipientes. Cuando se degeneran, las proteínas pierden sus propiedades ß . fisicoquímicas y actividad fisiológica. Una vez que se degeneran, las proteínas casi no recuperan sus propiedades originales debido a que la degeneración es irreversible . Particularmente, en el caso de las proteínas que se administran en cantidades residuales de cientos de microgramos por inyección, tal como EPO, cuando pierden estabilidad y de esta manera se absorben en la superficie del recipiente, resulta una cantidad relativamente grande de daño. Además, las proteínas absorbidas se agregan fácilmente durante el proceso de degeneración, y los agregados de las proteínas degeneradas, cuando se administran al cuerpo, actúan como antígenos, al contrario de. las proteínas sintetizadas in vivo. De esta manera,, las proteínas deberán administrarse en una forma estable. Se han dado muchos estudios para prevenir la degeneración de proteínas en soluciones ( John Geigert, J. Parenteral Sci . Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., 34-48, 1997; ei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willern Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelle et . Al., Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995).
Se aplica la .liofilización a algunos fármacos de proteína para alcanzar el objetivo de estabilidad. Sin embargo, los productos liofilizados son inconvenientes en que deben volverse a disolver en agua de inyección para su uso. Además, necesitan inversión masiva en secadores por congelado de gran- capacidad debido a que el proceso de liofilización se incluye en los procesos de producción de los mismos. Se sugirió la confricación de proteínas por el uso de un secador por rocío. Sin embargo, este método es económicamente desfavorable debido a su rendimiento de producción bajo. Además, el proceso de secado por rocío expone las proteínas a altas temperaturas, teniendo de esta manera influencias negativas en la estabilidad de las proteínas.
Como una alternativa para vencer las limitaciones, han aparecido estabilizadores que, cuando se agregan a proteínas en solución, pueden resistir los cambios fisicoquímicos de los fármacos de proteína y mantener eficiencia farmacéutica in vivo aún después de ser almacenados por un periodo de tiempo largo. Entre estos están los carbohidratos, aminoácidos, proteínas, tensoactivos , polímeros y sales. Entre otras cosas, la albúmina de suero humano se ha usado ampliamente como un estabilizador para varios fármacos de proteíná, con certificación para su desempeño (Edward Tarelli et al., Biologicals, 26: 331-346, 1998).
Un proceso de purificación típico para albúmina de suero humano incluye contaminantes biológicos inactivados tales como microplasma, prion, bacteria y virus o seleccionar o examinar uno o más contaminantes o patógenos biológicos. Sin embargo, siempre hay el riesgo de que los pacientes estén expuestos a los contaminantes biológicos debido a que no se remueven o inactivan completamente. Por ejemplo, La sangre humana de donadores se selecciona para examinar si contiene ciertos virus. Sin embargo, este proceso no siempre es confiable. Particularmente, existen ciertos virus en un número muy pequeño que no se detectan.
Se han sugerido recientemente, alternativas a la albúmina de suero humano, incluyendo albúmina recombinante (Publicación de Patente Coreana Abierta No . 10-2004-0111351) y eritropoyetina libre de albúmina (Patentes Coreanas Nos. 10-0560697 y 10-0596610) .
Aunque se emplean .estabilizadores libres de albúmina, las diferentes proteínas pueden inactivarse gradualmente debido a las diferencias- químicas de estas ya que se someten a diferentes relaciones y condiciones durante el almacenado. El efecto de un estabilizador en el término de almacenado de proteínas difiere de una proteína a otra. Esto es, pueden usarse varios estabilizadores a relaciones diferentes dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas de interés.
Además, cuando se usan concurrentemente diferentes estabilizadores, pueden traer efectos inversos debido a la competencia y la operación errónea de los mismos. Una combinación de diferentes estabilizadores también presenta efectos diferentes debido a que causan que las proteínas cambien en características o concentración durante el almacenado. Debido a que cada estabilizador realiza apropiadamente su actividad estabilizante en un cierto intervalo de concentraciones, . deben hacerse muchos esfuerzos para combinar los tipos y concentraciones de estabilizadores diferentes, con cuidado.
Particularmente para conjugados EPO de larga duración que han mejorado la duración y .estabilidad in vivo, sus pesos moleculares y volúmenes son completamente diferentes de aquellos de compuestos de eritropoyetina generales debido a que están compuestos de la EPO de péptido fisiológicamente activo, polímeros no de péptido, y el fragmento Fe de inmunoglobulina . En consecuencia, los estabilizadores con composiciones especiales diferentes de aquellos de estabilizadores de EPO se requieren para conjugados de EPO de larga duración.
Conduciendo a la invención actual, la investigación intensiva y a fondo en el desarrollo de una formulación líquida estable para conjugados EPO de larga duración, capaces de mantener la eficacia farmacéutica por un periodo largo de tiempo sin ' infección viral, resulta en el hallazgo de que el estabilizador . comprende una solución amortiguadora y una alta concentración de conjugados EPO de larga duración dotados de manitol con estabilidad aumentada y permite la formación de formulaciones líquidas económicas y estables para conjugados EPO de larga duración.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto es un objetivo de la invención actual proporcionar una formulación líquida que comprende un conjugado de eritropoyetina de larga duración en el cual EPO, un polímero no péptido y un fragmento Fe de inmunoglobulina se ligan covalentemente, y un estabilizador libre de albúmina compuesto de solución amortiguadora y manitol.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 es una gráfica que muestra la estabilidad de EPO en formulaciones líquidas diferentes para conjugado EPO de larga duración y en la formulación EPO comercialmente disponible Recormon cuando se analizan usando cromatografía de fase inversa cada semana por la duración del almacenado a 40 °C por cuatro semanas.
La FIG. 2 es una gráfica que muestra la estabilidad del conjugado EPO de. larga duración en una formulación líquida que comprende solución amortiguadora de fosfato pH 6.5, cloruro de sodio, manitol y polisorbato 80 cuando se analiza usando cromatografía de fase inversa y cromatografía de exclusión de tamaño cada dos meses por la duración del almacenado a 4°C por 12 meses.
La FIG. 3 es una gráfica que muestra la estabilidad del conjugado EPO de larga .duración en una formulación líquida que comprende solución amortiguadora de fosfato. pH 6.5, cloruro de sodio, manitol y polisorbato 80 cuando se analiza usando un ensayo in vitro cada dos meses por la. duración del almacenado a 4°C por 12 meses.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con-una modalidad de la misma, la invención actual proporciona una formulación líquida que comprende un conjugado de eritropoyetina de larga duración en el cual EPO, un polímero no péptido y un fragmento Fe de inmunoglobulina se ligan covalentemente, y un estabilizador libre de albúmina compuesto de solución amortiguadora y manitol.
El término "conjugado de eritropoyetina de larga duración" o "conjugado EPO de larga duración", como se usa en la presente, se pretende que se refiera a un constructo de proteína en el cual la EPO fisiológicamente activa, uno o más polímeros no de péptido y uno o más fragmentos Fe . de inmunoglobulina se ligan covalentemente, y que tienen una duración prolongada de acción comparado con EPO en su forma natural.
El término "larga duración", como se usa en la presente, se refiere a una duración prolongada de acción comparada con la de una forma natural. El término "conjugado" se refiere a un constructo en el cual EPO, un polímero no péptido y un fragmento Fe de inmunoglobulina se ligan covalentemente.
Para uso en la invención actual, la EPO tiene una' secuencia de aminoácido de eritropoyetina humana o análogos cercanamente relacionados. La EPO útil en la invención actual puede ser una proteína que se presenta naturalmente o una proteína recombinante . También, la EPO puede ser un mutante que ha experimentado la inserción, eliminación o' inserción de aminoácidos con la condición de que la mutación no tiene una influencia importante en la actividad biológica original del mismo.
La EPO humana o sus análogos útiles en la invención actual pueden aislarse de vertebrados o puede sintetizarse químicamente. Alternativamente, la EPO o sus análogos puede obtenerse de procariotas o eucariotas que se transforman con una EPO que codifica un gen o su análogo usando una técnica de recombinación genética. A este respecto, la bacteria de colon (por ejemplo, E.coli), células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) , o células de mamífero (por ejemplo, células de ovario de hámster chino, células de monos) pueden usarse como células hospederas. Dependiendo de las células hospederas, la EPO recombinante o sus análogos puede- glicosilarse con carbohidratos de mamífero o eucarióticos o aglicosilarse . Cuando se expresa, la EPO recombinante o sus análogos pueden contener el residuo de metioniha inicial (posición 1). Preferiblemente, la EPO humana recombinante (HuEPO) se prepara usando células CHO como un hospedero.
Para uso en la invención actual, el fragmento Fe de inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos de fragmentos Fe de inmunoglobulina humana o sus análogos cercanamente relacionados. Los fragmentos Fe pueden obtenerse a partir de formas nativas aisladas de animales incluyendo vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas. y conej illos'de indias. Además, el fragmento Fe de inmunoglobulina puede ser un fragmento Fe que se deriva de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, o que se hace por combinaciones del mismo o híbridos del mismo. Preferiblemente, se deriva de IgG o IgM, que está entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y aún más preferiblemente de IgG, que se conoce que aumenta las vidas medias de las proteínas enlazadas al ligando. En la presente, el Fe de inmunoglobulina pueden obtenerse a partir de una inmunoglobulina nativa al aislar inmunoglobulinas enteras de organismos humanos o animales y tratarlos con una enzima proteolítica o pueden ser recombinantes o derivados del mismo, obtenidos de células animales transformadas o microorganismos. Es preferible el Fe de inmunoglobulina humana recombinante producido por transformantes de E. coli.
Por otro lado, IgG se divide en subclases IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, y la invención actual incluye combinaciones e híbridos de los mismos. Se prefieren las subclases IgG2 e IgG4, y aún más preferido es el fragmento Fe de IgG4 que raramente tiene funciones efectoras tal como CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . Esto es, como el portador fármaco de la invención actual, el fragmento Fe de inmunoglobulina más preferible es ün fragmento aglicosilado derivado de IgG4 humana. El fragmento Fe derivado de humano es más preferible que un fragmento Fe no derivado de humano, que puede actuar como un antígeno en el cuerpo humano y causa respuestas inmunitarias indeseables tales como la producción de un anticuerpo nuevo' contra el antígeno.
El. conjugado EPO de larga duración útil en la invención actual se prepara al ligar la EPO y el fragmento Fe de inmunoglobulina juntos. A este respecto, la EPO y el fragmento Fe de inmunoglobulina pueden reticularse por medio de un polímero no péptido o pueden formarse en una proteína de fusión usando una técnica recombinante .
El polímero no péptido para uso en reticulación puede seleccionarse del grupo que consiste de polímeros biodegradables, polímeros lípidos, quitinas, ácido hialurónico, y combinaciones del mismo. El polímero biodegradable puede seleccionarse de polietilenglicol , polipropilenglicol , copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos , dextrano, éter de polivinil etilo, PLA . (poli (ácido láctico), PLGA (ácido poliláctico-glicólico) , y combinaciones de los. mismos. El aún más preferido es poli (etilenglicol) . (PEG) , con una preferencia por polietilenglicol. También, se incluyen los derivados de los mismos bien conocidos en la técnica y capaces de prepararse fácilmente dentro de la experiencia de la técnica en el alcance de la invención actual.
Los conjugados EPO de larga duración útiles en la invención actual pueden prepararse usando una técnica de producción por ingeniería genética, como se describe en la Patente Coreana No. 10-0725315.
La formación líquida de acuerdo con la invención actual comprende un conjugado EPO de larga duración en una cantidad terapéuticamente efectiva. Típicamente, la cantidad terapéuticamente efectiva de EPO está en el intervalo desde 2,000 hasta 10,000 unidades internacionales (IU, por sus siglas en inglés) por vial de uso . sencillo. La, concentración de los conjugados EPO de larga duración usados en la invención actual está en el orden de 1 hasta 5000 g/ml, y preferiblemente en el orden de 50 hasta 3000 ug/ml.
Como se usa en la presente, el término "estabilizador" se pretende que se refiera a una sustancia que permite que el conjugado EPO de larga duración se almacene de forma segura. El término "estabilización" se pretende que signifique la pérdida de un ingrediente activo por hasta una relación predeterminada, generalmente, hasta 10%, por un cierto periodo de tiempo bajo una condición de almacenado. uando la EPO mantiene 90% o más de su actividad original y preferiblemente 95% o mayor de la actividad original después de almacenarse a 10°C por 2 años, a 25°C por 6 meses o a 40 °C por una a dos semanas, se entiende como que es estable Como para proteínas tales como EPO, su estabilidad al almacenado es importante para suprimir la generación potencial de materiales antigénicos tipo EPO así como para garantizar las cantidades de administración exactas. Durante el almacenado, alrededor del 10% de pérdida de actividad EPO puede entenderse como que es permisible para administración a menos que la EPO dentro de la formulación forme agregados o se fragmente para formar materiales antigénicos .
El estabilizador apropiado para uso en la invención actual comprende una solución amortiguada formulada para dotar al conjugado EPO de larga duración con estabilidad, y manitol.
Además, el estabilizador de acuerdo con la invención actual está preferiblemente libre de albúmina. Debido a que se prepara de sangre humana, la albúmina de suero humana, disponible como un estabilizador para proteínas, tiene la posibilidad de contaminarse por virus patogénicos derivados de humanos. La albúmina de suero de bovino o gelatina puede causar enfermedades o inducir una reacción, alérgica en algunos pacientes. Libre de proteínas de albúmina de suero derivado de humano. o animal o proteínas heterólogas tales como gelatina purificada, el estabilizador de acuerdo con la invención actual está libre de asuntos acerca de infección viral.
El manitol, un tipo de alcohol de azúcar, se usa en el estabilizador de la invención actual debido a que actúa para aumentar la estabilidad del conjugado EPO de larga duración. El manitol se usa preferiblemente a una concentración desde 1 hasta 20 % (p/v) con base en. el volumen total de la formulación líquida, más preferiblemente a una concentración desde 3 hasta 12 % (p/v) y aún más preferiblemente a una concentración desde 5 hasta io.%(p/v) : De acuerdo con una modalidad de la invención actual, cuando el manitol en presencia de una solución amortiguada en fosfato se usó como un estabilizador, la estabilidad en almacenado del conjugado EPO de larga duración se mostró que se incrementa más ampliamente que cuando se usaron estabilizadores convencionales incluyendo sorbitol ,. maltosa, PEG400 y aminoácidos (ver Tabla 1) . Cuando se aplica a la invención actual, la maltosa, usada como un estabilizador en la Publicación de. Patente Japonesa abierta No. 2009-249292, se encontró que reduce la estabilidad del conjugado EPO de larga duración conforme el término de almacenado se extendió (ver Tabla 8).
Estos datos revelan la especificidad del manitol como un estabilizador para el conjugado EPO de larga duración, comparado con otros estabilizadores, lo que indica que son necesarios estabilizadores diferentes de acuerdo con los objetivos necesarios de estabilización.
La solución amortiguadora en el estabilizador juega un papel en mantener el pH de la formulación liquida constante para prevenir fluctuaciones en el pH, estabilizando de esta manera el conjugado EPO de larga duración. La solución amortiguadora útil en la invención actual puede comprender agentes amortiguadores del pH farmacéuticamente aceptables incluyendo sales alcalinas (fosfato de sodio o potasio, sales ácidas o diácidas del mismo) , citrato de sodio/ácido cítrico, acetato de sodio/ácido acético, y una combinación de los. mismos. Apropiado para uso en la invención actual es la solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de fosfato, solución amortiguadora de tartarato, solución amortiguadora de carbonato, solución amortiguadora de succinato, solución amortiguadora de lactato y solución amortiguadora de acetato, con una . preferencia para solución amortiguadora de fosfato y solución amortiguadora de citrato, la solución amortiguadora de fosfato siendo mayormente preferida. En la solución amortiguadora de fosfato, los intervalos de fosfato en la concentración preferiblemente van desde 5 hasta 100 mM y más preferiblemente d.esde 10 hasta 50 mM. La solución amortiguadora preferiblemente tiene un pH de 4.0 hasta 8.0 y más preferiblemente un pH de 5.0 hasta 7.0.
En otra modalidad de la invención actual, el estabilizador útil en la invención actual puede comprender además al menos un componente seleccionado del grupo, gue consiste de agentes isotónicos, alcoholes polihídricos , azúcares, tensoactivos no iónicos y aminoácidos neutros, además de la solución' amortiguadora y manitol.
El agente isotónico actúa no sólo para mantener una presión osmótica apropiada cuando el conjugado EPO de larga duración en la formulación líquida se permite que entre al cuerpo, pero para estabilizar además el conjugado EPO de larga duración en la formación liquida. Los ejemplos del agente isotónico incluyen sales inorgánicas solubles en agua. Entre estas están cloruro de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio, cloruro de calcio, y una combinación de los mismos. Aún más preferible es cloruro de sodio .
Preferiblemente, la concentración del agente isotónico está en el orden de 5 hasta 200 mM. Dentro de este intervalo, la concentración del isotónico puede ajustarse de acuerdo con los tipos y cantidades de los componentes contenidos tal como si la formulación liguida es isotónica.
De acuerdo con una modalidad de la invención actual, la influencia en la estabilidad del conjugado EPO de larga duración en presencia de una solución amortiguadora se evaluó por varios tipos de sales. Como un resultado, las formulaciones liquidas que comprenden sulfato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio o una combinación de sulfato de sodio y cloruro de sodio, junto con una solución amortiguada, en fosfato, se encontraron que incrementan la estabilidad del conjugado EPO de larga duración, comparado con las formulaciones liquidas libres de sales (ver Tabla 2) . A partir de los datos, se entiende que el conjugado EPO de larga duración de la invención actual se estabiliza hasta diferentes extensiones dependiendo de los tipos de sal usados y muestra una estabilidad pico con algunas sales. .
Los ejemplos preferidos del azúcar que pueden además estar contenidos para incrementar la estabilidad en almacenado del conjugado EPO de larga duración incluyen monosacáridos tales como mañosa, glucosa, fucosa y xilosa, y polisacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa y dextrano . En la formulación liquida, el azúcar se usa preferiblemente en una cantidad desde 1 hasta 20 % (p/v) y más preferiblemente se usa en una cantidad desde 5 hasta 20 % (p/v) . Los ejemplos del alcohol polihidrico útil en la invención actual incluyen propilenglicol , polietilenglicol de bajo peso molecular, gliceról, y polipropilenglicol de bajo peso molecular. Pueden usarse solos o en combinación. Y su concentración en la . formulación liquida está preferiblemente en el orden de 1¦ hasta 15 % (p/v) y más preferiblemente en el orden de 5 hasta 15 % (p/v) .
En cuanto al tensoactivo no iónico, se disminuye la tensión superficial de¦ la solución de proteina para prevenir que las proteínas se adsorban sobre o se agreguen en superficies hidrofóbicas . Los tensoactivos no iónicos basados en polisorbato y tensoactivos no iónicos basados en poloxámero son apropiados para uso en la invención actual. Pueden usarse solos o en combinación. Se prefieren tensoactivos no iónicos basados en polisorbato. Entre estos están polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 y polisorbato 80, con mayor preferencia para polisorbato 80.
No se recomienda usar el" tensoactivo no iónico en una alta concentración debido a que el tensoactivo. no iónico, si está presente a una alta concentración, induce interferencia con espectrometría UV o enfoque iso para hacer difícil evaluar la concentración o estabilidad de la proteína, exactamente. De esta manera, la formulación líquida de la invención actual puede comprender el tensoactivo no iónico preferiblemente a una concentración de 0.1 % (p/v) o menos y más preferiblemente a una concentración desde 0.001 hasta 0.05 % (p/v) .
En una modalidad de la invención actual, los tensoactivos no iónicos se analizaron para efecto en la estabilidad de proteína en presencia de solución amortiguadora de fosfato. Durante una duración de almacenado de tan corta como una semana, los tensoactivos no iónicos se encontraron que tienen poca influencia en la estabilidad del conjugado EPO de larga duración (ver Tabla 3) . También, cuando el tensoactivo no iónico polisorbato 80 se usó, el conjugado EPO de larga duración se encontró que es más estabilizado durante el almacenado por un estabilizador que contiene polisorbato 80 al 0.01% en vez de polisorbato 80 al 0.1% (ver Tabla 4) .
Un aminoácido, también disponible como un estabilizador para la formulación líquida, actúa para atraer más moléculas de agua alrededor de EPO en una. solución, de manera que las moléculas de aminoácido hidrofílico más exteriores de la EPO se estabilizan-adicionalmente (Wang, Int. J. Pharm. 185: 129-188, 1999). A este respecto, los aminoácidos cargados pueden inducir atracción electrostática con EPO para promover la agregación de EPO. Por lo tanto, los aminoácidos neutros, tales como glicina, alanina, leucina e isoleucina, se agregaron como un componente estabilizante. En la formulación liquida, el aminoácido neutro se usa preferiblemente a. una concentración desde 0.1 hasta 10 % (p/v) .
En una modalidad de'la invención actual , la maltosa garantiza una estabilidad al almacenado superior para conjugados EPO de larga duración que cuando se usa en combinación con glicina que solo. Sin embargo, el tratamiento con manitol a una concentración tan alta como 3 hasta 12 % (p/v) se observó para proporcionar estabilidad superior aún en ausencia de aminoácidos neutros que el tratamiento con una combinación de maltosa y glicina (ver Tabla 10) .
En consecuencia, una formulación liquida para proporcionar alta estabilidad para conjugados EPO de larga duración puede prepararse usando una alta concentración de manitol aun cuando no se agregan aminoácidos neutros. Sin embargo, una concentración de manitol que excede 20 % (p/v) está fuera del limite isotónico superior'. De esta manera, el manitol se usa a una concentración desde 1 hasta 20 % en la formulación liquida, preferiblemente a una concentración desde 3 hasta 12 % (p/v) , y más preferiblemente a una concentración desde 5 hasta 10 % (p/v) .
¦Además de los componentes antes mencionados incluyendo una solución amortiguadora, un agente isotónico, un alcohol de azúcar , un aminoácido neutro y un tensoactivo no iónico, la formulación liquida de la invención actual puede comprender selectivamente además otros componentes conocidos en la técnica en la medida en que no deterioren el efecto de la invención actual.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención actual, la formulación liquida no contiene albúmina y puede comprender una solución amortiguadora, manitol> un agente isotónico y un tensoactivo no iónico.
En mayor detalle, la invención actual proporciona una formulación liquida que comprende un conjugado EPO de larga duración, y un estabilizador, el estabilizador comprende solución amortiguadora de fosfato o citrato, manitol, un agente isotónico y polisorbato 80, el agente isotónico es seleccionado del grupo que consiste de cloruro de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio y una combinación de los mismos. Preferiblemente, la formulación liquida comprende una solución amortiguadora de fosfato o citrato a una concentración desde 5 hasta 100 mM, manitol a una concentración desde 1 hasta 20 % (p/v) , un agente isotónico a una concentración desde 5' hasta 200 mM, el agente isotónico está seleccionado del grupo que. consiste de cloruro de sodio, sulfato de sodio y citrato de sodio, y polisorbato 80 a una concentración desde 0.001 hasta 0.05 % (p/v) . Más preferiblemente, la fórmula líquida comprende una solución amortiguadora de fosfato a una concentración desde 5 hasta 100 mM, manitol a una concentración desde 3 hasta 12 % (p/v) , cloruro de sodio a una concentración desde 100 hasta 200 mM, y polisorbato 80 a una concentración desde 0.001 hasta 0.05 % (p/v) . Aún más preferiblemente, la formulación líquida comprende una solución amortiguadora de fosfato de sodio (pH 6.5) a una concentración de 10 mM, manitol a una concentración desde 5 hasta 10 % (p/v) , sodio a una concentración desde 100 hasta 200 mM, y polisorbato 80 a una concentración desde 0.001 hasta 0.05 % (p/v) , y no comprende aminoácidos neutros.
En una modalidad de la invención actual, una formulación líquida para conjugados EPO de larga duración que comprende una solución amortiguadora de fosfato de sodio a una concentración de 10 mM (pH 6.5), manitol a una concentración desde 5 hasta 10 % (p/v) , cloruro de sodio a una concentración desde 100 hasta 200 mM y polisorbato 80 a una concentración desde 0.001 hasta 0.05 % (p/v) se comparó con la formulación EPO conocida Recormon, Roche, para la estabilidad en almacenado de EPO. La EPO se encontró que es más estable en la . formulación líquida de la invención actual que en la comercialmente disponible (ver Tablas 6 y 14) .
También, la formulación líquida para EPO de acuerdo con la invención actual se comparó con otras formulaciones, tales como Aranesp, un terapéutico para anemia fabricado por Amgen, Enbrel (TNFR-Fc) , un terapéutico para artritis reumatoide fabricado por Amgen, y PBS solo, para la estabilidad en almacenado de EPO. Como un resultado, la formulación liquida para conjugados EPO de larga duración de acuerdo con la invención actual exhibe estabilidad superior que cualquier otra formulación liquida (ver Tabla 17) .
En otra modalidad, la formulación liquida para conjugados EPO de larga duración de acuerdo con la. invención actual se evaluó para estabilidad de larga duración y se encuentra que mantiene los conjugados EPO de larga duración establemente por 12 meses y garantiza al menos 92.5% de la actividad aún después de 6 meses de almacenado bajo una condición acelerada (ver Tablas 19 hasta 21) .
A partir de los datos, se entiende que la formulación liquida que comprende solución amortiguadora y manitol a una concentración desde 1 hasta 20 % (p/v) puede almacenar conjugado EPO de larga duración en esta establemente por 12 meses o mayor aún en ausencia de aminoácidos neutros.
Efectos Ventajosos Estando libre de albúmina de suero humana y otros factores potenciales perjudiciales al cuerpo, la formulación liquida para conjugados de eritropoyetina de larga duración de acuerdo con la invención actual está libre de asuntos acerca de infecciones virales y garantiza estabilidad al almacenado excelente para los conjugados EPO de larga duración en los cuales la EPO y fragmento Fe de inmunoglobulina se ligan y qué son mayores en peso molecular y más largos en duración de acción que las formas naturales de EPO. Aún cuando que no contiene aminoácidos neutros, la formulación liquida de la invención actual puede proporcionar estabilidad al almacenado excelente para EPO, siendo de esta manera más económicamente benéficos que otros agentes estabilizadores y lio'filizantes .
Modo para la Invención Puede obtenerse un mejor enténdimiento de la invención actual a través de los siguientes ejemplos que se establecen para ilustrar, pero no se construyen como limitantes de la invención actual.
EJEMPLO 1 : Construcción de Conjugado EPO de larga duración <1-1> Preparación de fragmento Fe de inmunoglobulina usando Inmunoglobulina El fragmento Fe de inmunoglobulina útil en la invención actual fue fragmento Fe IgG4 aglicosilado humano que puede expresarse a partir de el transformante de E. coli como se describe en la Patente Coreana No. 725314. <l-2> Preparación de Eritropoyetina humana recombinante La EPO humana usada en este ejemplo se obtuvo como se describe en la Patente Coreana No. 880509. Para esto, una linea de célula animal transformada con un vector capaz de aumentar mayormente la amplificación del gen eficientemente al debilitar . artificialmente un promotor de gen dihidrofoloato reductasa, que es una secuencia de control transcripcional del gen, se cultivó para expresar las proteínas EPO humanas. Sólo se purificaron proteínas altamente glicosiladas para uso. <l-3> Preparación de Conjugado EPO de larga duración usando fragmento Fe de inmunoglobulina El conjugado EPO de larga duración en este ejemplo fue un constructo en el cual la eritropoyetina humana y un fragmento Fe de inmunoglobulina se ligan covalentemente por un polímero no péptido. Y se obtuvo como se describe en la Patente Coreana No. 725315 y 775343.
EJEMPLO 2: Ensayo de Conjugados EPO de larga duración para estabilidad de acuerdo con Varios Estabilizadores En presencia de solución amortiguadora de fosfato, varios agentes estabilizantes incluyendo azúcares, alcoholes de azúcar, alcoholes polihídricos y aminoácidos se evaluaron por su capacidad para estabilizar el conjugado EPO de larga duración.
Para el ensayo, se -usó solución amortiguadora de fosfato-Na como una solución amortiguadora de fosfato, manitol o sorbitol como un alcohol de azúcar, histidina o metionina como un alcohol de azúcar, maltosa como un azúcar, y PEG 400 como un alcohol polihidrico.
Después de almacenar a 40 °C por una semana en las composiciones enlistadas ' en la Tabla 1, se realizó la cromatografía de fase inversa para conducir el análisis. Los resultados se resumen en la Tabla 1, enseguida. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparado con el valor inicial del mismo -se expresó como RPC (%) ( % de área/ % de área inicial) .
Tabla 1 Como es aparente a partir de los datos de Tabla 1, el uso de manitol como un agente estabilizante mantiene el conjugado EPO de larga duración como el más estable.
EJEMPLO 3 : Ensayo de Conjugados EPO de larga duración para estabilidad de acuerdo con Sales ¦ En presencia de solución amortiguadora de fosfato, varias sales se evaluaron para capacidad para estabilizar el conjugado EPO de larga duración, como sigue. Las sales tales como sales alcalinas y sales inorgánicas no sólo sirven como agentes que amortiguan el pH para dotar al conjugado de larga duración con estabilidad del pH adicional, sino como agentes isotónicos para mantener presiones osmóticas apropiadas.
Después de almacenar a 40°C por una semana las composiciones enlistadas en la Tabla 2, se realizó la cromatografía de fase inversa para análisis. Para el ensayo, se usó solución amortiguadora de fosfato de sodio (pH 6.5) como una solución amortiguadora mientras que se usaron cloruro de cobre (II), sulfato de sodio, citrato de sodio y carbonato de sodio como sales. Los resultados se resumen en la Tabla 2, enseguida. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparado con el valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) .
Tabla 2 Como es aparente a partir de los datos de Tabla 2, la estabilidad del conjugado EPO de larga duración se incrementó cuando sulfato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio o una combinación de sulfato de sodio y cloruro de sodio se usó en presencia de solución amortiguadora de fosfato, comparado con el control al cual ninguno de estos se agregaron. En contraste, la estabilidad del conjugado EPO de larga duración se redujo en presencia de cloruro de cobre (II), comparado con el control.
A partir, de los datos, se entiende que el conjugado EPO de larga duración de la invención actual se estabiliza hasta diferentes extensiones dependiendo de los tipos de sal usados y muestra estabilidad superior con algunas sales. ¦ EJEMPLO 4: Ensayo de Conjugados EPO de larga duración para estabilidad de acuerdo con tensoactivo no iónico En presencia de solución amortiguadora de fosfato, varios tensoactivos no iónicos se evaluaron para capacidad para estabilizar el conjugado EPO de larga duración, como sigue.
Para el ensayo, se usó polisorbato 80 como una solución amortiguadora de fosfato no iónico, y otros agentes que muestran que proporcionan estabilidad para el conjugado EPO de larga duración, incluyendo sales, alcoholes de azúcar y azúcares, se emplearon en combinación apropiada.
Para simplicidad, se seleccionó el cloruro de sodio de entre las sales verificadas incluyendo cloruro de sodio, sulfato de sodio y citrato de sodio. También, se usó el manitol probado en el Ejemplo 1 como garantía de mejor estabilidad. ' Bajo las mismas condiciones que la EPO estableció para tener 200 µg/ml en solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 6.5), el conjugado EPO de larga duración de la invención actual se almacenó a 40°C por una semana en las composiciones enlistadas en la Tabla 3, seguido por análisis para cromatografía de fase inversa. Los resultados se resumen en la Tabla 3, enseguida. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparado con el valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) .
Tabla 3 Bajo la condición de la solución amortiguadora de fosfato, como se observa en la Tabla 3, la EPO fluctúa un poco en estabilidad sin tener en cuenta la presencia del tensoactivo no iónico, lo que indica que el .tensoactivo no iónico no tiene efectos importantes en la estabilidad de EPO durante tan corto como una semana.
También, se hizo un examen del efecto de la concentración de tensoactivo no iónico en la estabilidad de conjugado EPO de larga duración. Bajo las mismas condiciones que la EPO estableció para tener 200 pg/ml en solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 6.5), el conjugado EPO de larga duración de la invención actual se almacenó a 40°C por dos semanas en las composiciones enlistadas en la Tabla 4, seguido por análisis por cromatografía de fase inversa. Los resultados se resumen en la Tabla 4, enseguida. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparado con el valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) .
Tabla 4 Por la duración de dos semanas de almacenado, como se muestra en la Tabla 4, el conjugado EPO de larga duración se encontró que es más estable en una formulación liquida que comprende manitol al 5 % y cloruro de sodio 150 mM en solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 6.5) cuando se complementó con polisorbato 80 al 0.01% que con polisorbato 80 al 0.1%.- EJEMPLO 5 : Comparación de las formulaciones liquidas para Conjugados EPO de Larga Duración (I) Con respecto a la¦ estabilidad de almacenamiento, la formulación liquida EPO Recormon (Roche) comercialmente disponible se comparó con la formulación liquida para conjugado EPO de larga duración de la invención actual. La composición de Recormon, a pesar de que queda por demostrar, incluye fosfato de sodio como solución amortiguadora, polisorbato 20 como un tensoactivo, cloruro de sodio como una sal, y urea, CaCl, glicina, leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico y fenilalanina como agentes estabilizadores.
Para las formulaciones liquidas de conjugados EPO de larga duración de la invención actual, se usó polisorbato 80 como un tensoactivo en varias concentraciones de desde 0.1 a 0.005 %, cloruro de sodio como sal en concentraciones de 150 y 200 mM, y manitol o urea como un agente . estabilizador en varias concentraciones de desde 1 a 10 % (p/v) . El conjugado EPO de larga duración de la invención actual se almacenó en 40°C por dos semanas en las composiciones enlistadas en la Tabla 5, seguido por el análisis de cromatografía de fase inversa y cromatografía de exclusión de tamaño (SE-HPLC) . Los resultados se resumen en la Tabla 6, a continuación. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) y SE-HPLC (%).
Tabla 5 Tabla 6 Para la duración de dos semanas de almacenamiento, como se ve en la Tabla 6, todas las formulaciones liquidas de la invención actual garantizaron estabilidad más alta de EPO que como lo hizo Recormon, excepto la formulación No. 5 que tiene 0.1% polisorbato 80 como un tensoactivo y la formulación No. 7 que tiene urea como un agente estabilizador.
EJEMPLO 6 : Búsqueda para los Agentes estabilizadores capaces de dotar al Conjugado EPO de larga duración con estabilidad de almacenamiento Para buscar los agentes estabilizadores que pueden estabilizar los conjugados EPO de larga duración a largo plazo, las formulaciones liquidas para el conjugado EPO de larga duración se prepararon con las composiciones de la Tabla 7, a continuación Respecto a esto, glicina y metionina se agregaron individualmente a una composición de tensoactivo-cloruro de sodio-maltosa para examinar el efecto de los aminoácidos sobre la estabilidad al almacenamiento de larga duración. En las formulaciones liquidas, la concentración de EPO se estableció en 200 ug/ml en solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 6.5) .
Mientras se almacena a 40°C por cuatro semanas, las formulaciones liquidas para el conjugado EPO de larga duración se analizaron cada semana usando cromatografía de fase inversa. Los resultados se resumen en la Tabla 8, a continuación. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) .
Tabla 7 Tabla 8 Para la duración de almacenamiento de cuatro semanas, como se muestra en la Tabla 8, el conjugado EPO de larga duración se encontró es el más estable en una formulación liquida que comprende cloruro de sodio en combinación con maltosa y glicina como agentes estabilizadores. Después de dos semanas de almacenamiento, la estabilidad de almacenamiento similar fue detectada entre las formulaciones líquidas en las que maltosa al 10% sola se usó y en combinación con glicina al 1%, respectivamente. Sin embargo, el uso de maltosa al 10% sola redujo de manera importante la estabilidad después del almacenamiento por cuatro semanas. En contraste, el uso de maltosa al 10% en combinación con glicina al 1% se encontró para, mantener estabilidad alta después del almacenamiento por cuatro semanas.
Con referencia a la comparación de formulaciones líquidas de los números 2 y 3, la metionina bajó de manera importante la estabilidad del conjugado EPO de larga duración, indicando que los aminoácidos neutrales, especialmente la glicina, puede dar una gran contribución a la estabilidad del conjugado EPO de larga duración en almacenamiento a largo plazo.
EJEMPLO 7 : Ensayo de manitol y maltosa para la estabilidad al almacenamiento de larga duración del Conjugado EPO de larga duración Se prepararon tres formulaciones líquidas como se dan en la Tabla 9, a continuación: una formulación liquida que comprende maltosa-glicina que mostró la estabilidad más alta del conjugado EPO de larga duración en el EJEMPLO 6; la misma formulación liquida, con excepción de que se uso manitol en lugar de maltosa; y una formulación liquida que comprende manitol solo. Se ensayaron para su estabilidad al almacenamiento de larga duración. En las formulaciones líquidas, la concentración de EPO se estableció en 200 ug/ml en solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 6.5) .
Mientras se almacenaban en 40°C por cuatro semanas, las formulaciones líquidas para el conjugado EPO de larga duración se analizaron cada semana usando cromatografía de a continuación. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) . También, los datos de la Tabla 10 están graficados en la FIG. 1 donde los valores de la formulación EPO Recormon comercialmente disponible son. extrapolados .
Tabla 9 Tabla 10 Para la duración del almacenamiento.de cinco semanas, como se muestra en la Tabla 10, el conjugado EPO de larga duración se encontró es más estable en la formulación liquida que comprende manitol-glicina que maltosa-glicina como agentes estabilizadores. La estabilidad de almacenamiento comparable se detectó en la formulación líquida que comprende manitol solo.
Los resultados están en un contrate rígido con el hecho de que la formulación líquida que comprende maltosa sola disminuyó de manera significativa en la estabilidad de almacenamiento comparada a la formulación líquida que comprende maltosa y glicina, indicando que el manitol puede garantizar la estabilidad al almacenamiento de larga duración para el conjugado EPO de larga duración incluso sin la ayuda de los aminoácidos neutrales. También, el uso de manitol en una concentración tan alta como de 5 a 15 % (p/v) se encontró que le permite al conjugado EPO almacenarse y retener estabilidad alta incluso en la ausencia de aminoácidos neutrales.
EJEMPLO 8 : Ensayo de Solución amortiguadora para la Estabilidad al almacenamiento de larga duración del Conjugado EPO de larga duración .
Las soluciones amortiguadoras se ensayaron para su capacidad para estabilizar al conjugado EPO de larga duración. También, se hizo un examen' de la relación entre la estabilidad de los conjugados EPO de larga duración y las dosis de sales y alcoholes de azúcar, como sigue.
Primero, los efectos de las soluciones amortiguadoras en la estabilidad de los- conjugados EPO de larga duración se investigaron usando formulaciones liquidas las cuales se formularon con polisorbato al 0.01%, cloruro de sodio 150 mM, y solución amortiguadora de fosfato o citrato como se muestra en la Tabla 11 (No. 1 y 2) . Las formulaciones liquidas contuvieron una concentración alta (5%) de manitol como un agente estabilizador, pero ningún aminoácido, y el conjugado EPO de larga duración se agregó' en una concentración de 200 g/ml. Las formulaciones se almacenaron en 40 °C por cuatro semanas, durante ese tiempo las formulaciones liquidas para el conjugado EPO de larga duración se analizaron en la Semana 1 y Semana 4 usando cromatografía de fase inversa. Los resultados se resumen en la Tabla 12 (No. 1 y 2), a continuación. La relación de retención del conjugado EPO de- larga duración comparada al valor inicial de la. misma se expresó como RP-HPLC (%)-. ' La misma formulación liquida que comprende manitol como en el EJEMPLO 7, la misma formulación liquida pero comprendiendo solución amortiguadora de citrato en lugar de solución amortiguadora de fosfato, y la misma formulación liquida pero comprendiendo la mitad de las cantidades de la sal y el alcohol de azúcar se examinaron para su efecto sobre la estabilidad en el conjugado EPO de larga duración.
En las formulaciones liquidas, la concentración del conjugado EPO de larga duración se estableció en 200 yg/ml y los agentes estabilizadores se usaron como se muestra en la Tabla 11, a continuación. Las formulaciones liquidas para el conjugado EPO de larga duración se almacenaron en 40°C y se analizaron en la Semana 1 y la Semana 4 usando cromatografía de fase inversa. Los resultados se resumen en la Tabla 12, a continuación. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se' expresó ' como. RP-HPLC (%).
Tabla 11 Tabla 12 Como es aparente de los datos de la Tabla 12, las formulaciones liquidas, si contienen manitol en ellas, garantizaron la estabilidad de almacenamiento del conjugado de larga duración en los respectivos niveles deseados de los tipos de soluciones amortiguadoras usadas en ellas. Estos resultados indican que las soluciones amortiguadoras típicas, diferentes a la solución amortiguadora de fosfato, pueden usarse para preparar formulaciones líquidas en las cuales el conjugado EPO de larga duración pueda almacenarse establemente por un periodo de tiempo largo.
EJEMPLO 9 : Comparación de estabilidad de almacenamiento de Conjugados EPO de larga duración entre formulación liquidas (II) Con respecto, a la estabilidad de almacenamiento, la formulación líquida que se preparó con solución amortiguadora de fosfato (pH 6.5), cloruro, de sodio, manitol y polisorbato 80, todos probados para la capacidad estabilizadora EJEMPLOS 2 a 8, se comparó con la formulación liquida EPO Recormon, Roche comercialmente disponible. Las composiciones de la formulación liquida de la invención actual y Recormon se muestran en la Tabla 13, a- continuación. Mientras se almacenaban en 40°C por cuatro semanas, las formulaciones líquidas para el conjugado EPO de larga duración se analizaron en la Semana 2 y la Semana 4 usando cromatografía de fase inversa y cromatografía de exclusión de tamaño. Los resultados se resumen en la Tabla 14, a continuación. La relación de retención del. conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) y SE-HPLC (%) .
Tabla. 13 Tabla 14 Como es aparente de los datos de la. Tabla 14, la formulación liquida que contiene una concentración alta de manitol como un agente estabilizador garantizó estabilidad de almacenamiento más grande de EPO que Recormon que contenia varios tipos de aminoácidos neutrales. De estos resultados, se entiende que las formulaciones liquidas de la - invención actual son capaces de garantizar estabilidad de almacenamiento excelente específicamente para el conjugado. EPO de larga duración.
EJEMPLO 10 : Comparación de estabilidad de almacenamiento entre varias formulaciones liquidas Con respecto a la estabilidad de almacenamiento, una formulación líquida que se preparó con solución amortiguadora de fosfato (pH 6.5), cloruro de sodio, manitol y polisorbato 80, todos se probaron para su capacidad estabilizadora mostrada en los EJEMPLOS 2 a 8, se comparó con las formulaciones líquidas que se prepararon aplicando las composiciones de varias formulaciones comercialmente disponibles para el conjugado EPO de larga duración.
Las formulaciones liquidas usadas en este ejemplo se resumen en la Tabla 15, a continuación.. En la Tabla 15, No. 1 es Aranesp, fabricado por Amgen, que se usa actualmente como un terapéutico para la anemia; No. 2 es una formulación liquida que se preparó con una composición de estabilización que comprende solución amortiguadora de fosfato (pH 6.5), cloruro.de sodio, manitol y polisorbato 80; No. 3 es la misma formulación liquida como en Aranesp, con excepción de que el conjugado EPO de larga duración se usó en lugar del fármaco; No. 4 es la misma formulación liquida como en Enbrel (TNFR-Fc) , un terapéutico para artritis reumatoide fabricado por Amgen, con excepción de que el conjugado EPO de larga duración se usó en lugar del fármaco; y No . 5 es una formulación líquida que contiene PBS solo.
Mientras se almacenaba en 40°C por tres semanas, las formulaciones liquidas para el conjugado EPO de larga duración se analizaron cada semana usando cromatografía de fase inversa y cromatografía de exclusión de tamaño. Los resultados se resumen en la Tabla 17, a continuación.. La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) y SE-HPLC (%).
Tabla 15 Tabla 16 Tabla 17 Como es aparente de los datos de la Tabla 17, todas las formulaciones liquidas, menos la formulación liquida que comprende solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM (pH 6.5), polisorbato 80 al 0.005%, manitol al 10% y cloruro de sodio 200 nM de acuerdo con la invención actual, se observaron para agregar durante el almacenamiento durante el curso de tres semanas Consecuentemente, la formulación liquida que comprende solución amortiguadora de fosfato de sodio 10, mM (pH 6.5), polisorbato 80 al 0.005%, manitol al 10% y cloruro de sodio 200 nM de acuerdo a la invención actual es el agente más prometedor para el almacenamiento del conjugado EPO de larga duración establemente para un largo periodo de tiempo.
EJEMPLO 11: Ensayo de formulaciones liquidas para el Conjugado EPO de larga duración para la Estabilidad al almacenamiento de larga duración y estabilidad acelerada Para examinar la estabilidad al almacenamiento de larga • duración y la estabilidad acelerada del mismo, la formulación liquida para el conjugado EPO de larga duración, preparado de un estabilizador que comprende solución amortiguadora de fosfato (pH 6.5), cloruro de sodio, manitol y polisorbato 80, .que se probó garantiza la estabilidad con mayor almacenamiento, se almacenó en 4°C por 12 meses sobre los cuales la estabilidad del conjugado EPO de larga duración se analizó. Las condiciones detalladas para el almacenamiento se resumen en la Tabla 18, a continuación. Los resultados del análisis se dan en- la Tabla 19 y FIG . 2. En la Tabla 19, La relación de retención del conjugado EPO de larga duración comparada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%) y SE-HPLC (%) .
Además, la formulación liquida para el conjugado EPO de larga duración se ensayó in vitro para la estabilidad de almacenamiento para la duración de almacenamiento de 4°C por 12 meses (FIG. 3) .
El conjugado EPO de larga duración usado en este Ejemplo se- midió in vitro para titulación en una linea celular TF-1 (células de eritroleucemia, ATCC CRL 2003). Después de descongelarse de un tanque de nitrógeno de almacenado, las células TF-1 se cultivaron a una extensión determinada y se contaron. Una mezcla de BRP-EPO y el conjugado EPO de larga duración en una relación predeterminada se emplacó en una cantidad de 50 L/pozo en placas de 96 pozos. Las células se diluyeron en una concentración de 40000 células/mL en un medio de ensayo que después se sembró en una cantidad de 50 µ/???? en las placas de 96 pozos. Seguidas de la incubación en 37 °C por 72 hrs en una incubadora CO2, 15 pL de Reactivo de Solución CellTiter 96 Aqueous One (PROMEGA, G358B) se agregó a cada pozo de placas de 96 pozos. Se incubaron de nuevo en 37 °C por 4 hrs en una incubadora C02. El reactivo de tinción se removió pipeteando suavemente, seguido por la medición de absorbancia en 490 nm para calcular EC50. La actividad especifica se obtuvo de los valores EC50 calculados.
Tabla 18 Tabla 19 Como se muestra én la Tabla 19, el conjugado EPO de larga duración se encontró que es muy estable para 12 meses en la formulación liquida que comprende la .composición estabilizadora de la invención actual.
Además, como se mencionó, anteriormente, la formulación liquida para el conjugado EPO de larga duración, que comprende la misma composición es'tabilizadora, se almacenó en 4°C por 12 meses y subsecuentemente en 25 °C por 6 meses durante los cuales se analizaron las muestras para la estabilidad de almacenamiento. Los resultados se resumen en las Tablas 20 y 21, a continuación. En las Tablas 20 y 21, La relación de retención del conjugado EPO de larga duración compar'ada al valor inicial del mismo se expresó como RP-HPLC (%), SE-HPLC (%), contenido de proteina (%) y actividad inerte biológica (%) .
Tabla 20 Tabla 21 Como es aparente de los datos de las Tablas 20 y 21, el conjugado EPO de larga duración se mantuvo altamente estable por 12 meses en la formulación liquida que comprende la composición estabilizadora de acuerdo a la invención actual y se encontró que tiene 92.5% de la actividad inicial incluso después de ser almacenada 6 meses en la formulación liquida bajo la condición acelerada. Por lo tanto, la formulación líquida para el conjugado EPO de larga actividad de acuerdo' a. la invención actual exhibe estabilidad de almacenamiento efectiva.
Aunque las modalidades preferidas de la invención actual se han descrito para propósitos ilustrativos, aquellos expertos en la técnica apreciarán que varias modificaciones, adiciones y sustituciones son posibles, sin apartarse del enfoque y espíritu de la invención como se describe en las reivindicaciones que la acompañan.
Aplicabilidad industrial Estando libre de albúmina de' suero humano, la formulación líquida garantiza estabilidad de almacenamiento específicamente para' conjugados de eritropoyetina de larga duración de acuerdo con la invención actual, se libera de las preocupaciones acerca de las infecciones virales. Comprende una composición simple, de este modo teniendo una ventaja económica sobre otros estabilizadores o formulaciones liofilizadoras . Además, ya que contiene un conjugado EPO de larga actividad el cuál tiene una duración más larga de acción que hace una forma natural y también mantiene la actividad de proteina alta por un periodo más largo de tiempo, la formulación liquida puede usarse como un sistema de fármaco efectivo.

Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una formulación liquida de un conjugado de eritropoyetina (EPO) de larga duración, · caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de eritropoyetina de. larga duración en el cual la EPO se liga covalentemente a un fragmento Fe de inmunoglobulina por medio de un polímero no péptido o ligadura de péptido, y un estabilizador libre de albúmina que comprende solución amortiguadora ymánitol.
2. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intervalos de manitol en una concentración son desde 1 hasta 20% (p/v) con base en el volumen total de la formulación líquida.
3. La formulación' líquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la solución amortiguadora es seleccionada del. grupo que consiste de soluciones amortiguadoras de citrato, fosfato, tartrato, carbonato, succinato, lactato y acetato.
4. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intervalos de solución amortiguadora en una concentración son desde 5 hasta 100 mM.
5. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intervalos de solución amortiguadora en pH son desde 4 hasta 8.
6. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el estabilizador libre de albúmina además comprende un ingrediente seleccionado del grupo que consiste de un agente isotónico, un alcohol polihidrico, un azúcar, un tensoactivo no iónico, un aminoácido neutro, y una combinación de los mismos.
7. La . formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el agente isotónico es una sal seleccionada del grupo que consiste de cloruro de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio y una combinación de los mismos.
8. La formulación liquida · de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porgue los intervalos de agente isotónico en una concentración son desde 5 hasta 200 mM.
9. .La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el tensoactivo no iónico es un tensoactivo no iónico basado en poloxámero o basado en polisorbato.
10. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el tensoactivo no iónico basado en polisorbato es seleccionado del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 y polisorbato 80.
11. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los intervalos del tensoactivo no iónico en una concentración son desde 0.001 hasta 0.05% (p/v) con base en el volumen total de la formulación liquida .
12. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el azúcar se selecciona de un grupo que consiste de mañosa, glucosa, fucosa, xilosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, dextrano y una combinación de los mismos.
13. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los intervalos de azúcar en una concentración son desde 1 hasta 20% (p/v) con base en el volumen total de la formulación liquida.
14. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el alcohol polihidrico es seleccionado del grupo que consiste de propilenglicol , polietilenglicol de bajo peso molecular, glicerol, polipropilenglicol de bajo peso molecular, y una combinación de los mismos.
15. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los intervalos de alcohol polihidrico en una concentración son desde 1 hasta 15% (p/v) en la formulación liquida.
16. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el aminoácido neutro es seleccionado del grupo que consiste de glicina, alanina, leucina, isoleucina, y una combinación de los mismos.
17. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque los intervalos de aminoácido neutro en. una concentración son desde 0.1 hasta 10% (p/v) en la formulación liquida.
18. La formulación liquida, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el estabilizador libre de albúmina comprende manitol en una cantidad desde 3 hasta 12% (p/v) y aminoácidos no neutros.
19. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el estabilizador libre de albúmina comprende una solución amortiguadora de fosfato a una concentración desde 5 hasta 100 mM, manitol a una concentración desde 1 hasta 20% (p/v) , cloruro de sodio a una concentración desde 5 hasta 200 mM, y polisorbato 80 a una concentración desde 0.001 hasta 0.05 % (p/v) .
20. La formulación' liquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la EPO es una proteina EPO mutante modificada de la EPO de tipo natural por sustitución, eliminación o inserción de un aminoácido o aminoácidos, o un análogo de péptido que tiene actividad similar a la de la EPO de tipo natural.
21. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intervalos de EPO en una concentración son desde 1 hasta 500 pg/ml.
22. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento Fe de inmunoglobulina es seleccionado del grupo que consiste de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM y una combinación de los mismos.
23. La formulación liquida de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el fragmento Fe de inmunoglobulina es un fragmento híbrido compuesto de dominios de diferentes orígenes del grupo que consiste de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
24. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el fragmento Fe de inmunoglobulina está en una forma de un dímero o un multimero de inmunoglobulinas de cadena sencilla compuestos de dominios del mismo origen.
25. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el fragmento Fe de inmunoglobulina es un fragmento Fe de IgG4.
26. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el fragmento Fe de inmunoglobulina es un fragmento Fe de IgG4 aglicosilado humano.
27. La formulación líquida' de conformidad con la reivindicación 1 ,. caracterizada porque el polímero no péptido es seleccionado del grupo que consiste de un polímero biodegradable, un polímero lípido, quitina, ácido hialurónico, y una combinación de los mismos.
28. La formulación líquida de conformidad con la reivindicación 27,. -caracterizada porque el polímero biodegradable es seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicol , polipropilenglicol , un copolímero de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivinílico, polisacáridos , dextrano, etiléter de polivinilo, PLA (ácido poliláctico) y PLGA (ácido poliláctico-glicólico) .
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