CN1214115C

CN1214115C - 由作为靶特异前体药物的抗体－细胞因子－细胞因子抑制剂(选择因子)组成的融合蛋白质

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Publication number: CN1214115C
Application number: CNB018157645A
Authority: CN
Inventors: 克劳斯·菲曾梅尔; T·维斯特; D·穆斯迈尔; M·格雷尔; P·舍伊里希
Original assignee: Universitaet Stuttgart
Current assignee: Universitaet Stuttgart
Priority date: 2000-09-15
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2021-09-17
Also published as: DE10045592A1; EP1317556A1; ZA200302008B; YU18903A; JP2004508828A; SK2812003A3; AU2001293819A1; PL360540A1; RU2003106429A; NO20031185L; KR20030048041A; HRP20030192A2; HUP0301693A2; CA2422759A1; BR0113928A; BG107613A; WO2002022833A1; CN1458977A; EE200300100A; MXPA03002229A

Abstract

本发明涉及一种具有优选抗肿瘤的和/或免疫调制的细胞因子特性的多肽，它通过体内处理而活化，该多肽包含有特异生物活性的中心区，在其C-端所述区包含具有处理单元和抑制剂结构域的区，而在N-端包含选择性识别细胞表面大分子或胞外基质成分的区。

Description

由作为靶特异前体药物的抗体-细胞因子-细胞因子抑制剂 (选择因子)组成的融合蛋白质

本发明涉及一种具有优选抗肿瘤的和/或免疫调制的细胞因子特性的多肽，它可在体内经处理而活化，该多肽包含有特异生物活性的中心区，在中心区的C-端存在具有处理单元和抑制剂结构域的区，而在中心区的N-端存在选择性识别细胞表面大分子或胞外基质成分的区。

采用重组肿瘤坏死因子(TNF)和其它的活性物质用于治疗如肿瘤病，由于视为治疗限制因素的强的全身副作用，至今仅可基于特定的昂贵的治疗方案(例如采用所谓的“隔离的肢灌注”)对非常有限的症状(肢的黑素瘤/肉瘤-转移)有效地实施。从临床数据得知，为达抗肿瘤活性，与允许的大量全身副作用相比，其需要比MTD(最大允许剂量)约10倍-100倍高的TNF-剂量。

因此本发明的目的在于，在保持或甚至增强活性物质如TNF的例如对抗肿瘤呈治疗有效的特性的同时，还可避免或减低用治疗有效的多肽活性物质如含TNF的物质治疗时的有害后果。

该目的是通过在权利要求中表征的本发明的实施方案达到的。

特别是按本发明制备一种具有氨基酸序列的多肽，它从N端向C-端含有：

(1)选择性识别细胞表面上的特定大分子和/或胞外基质的成分的区，

(2)包含肽连接体(Petidlinker)的区，

(3)对特定靶分子具有生物活性的区，

(4)具有至少一个处理部位的区，和

(5)通过分子内结合和/或相互作可延缓区(3)的生物活性的区，其中，区(3)的生物活性可通过区(4)中至少一个处理部位的体内处理而释放。

本发明的多肽(后面也称为“选择因子(Selektokin)”)是一种构成模块的活性物质，按照特别优选的实施方案，一种具有细胞因子，优选TNF或其生物有效衍生物或生物有效突变体的优选同三聚体融合蛋白质作为抗肿瘤有效的物质或区(3)，通过与达到有病组织(如肿瘤区)的四个其它功能模块的偶联释放出生物效应。它通过治疗有效物质如TNF-分子与用于目标组织的特异靶模块(1)，如对肿瘤特异的抗体或其衍生物如scFy-抗体的N-端偶联和与抗治疗有效物质的抑制剂(5)，特别是肽-抑制剂的C-端偶联达到，其在目标组织如肿瘤区中通过结构域(4)的作用选择性失活，优选通过融合蛋白的有目的的蛋白水解分裂而去除，并由此形成在选择的靶-模块上结合的活性物质如TNF。在靶-模块(如scFy-抗体断片)和具有治疗作用的模块(如TNF)之间存在肽连接体结构域(2)，优选三聚结构域，它保证共价的二硫桥键的形成及由此形成融合蛋白质的有规的和稳定的均三聚作用。

用本发明的构型，可达到治疗有效的物质如TNF的局部高的有效浓度，并不会引起全身高的治疗含量(如血清中的TNF)及由此引来的限制治疗的副作用。同时，例如在TNF作为治疗有效区的情况下，通过靶-模块-(如抗体-)促成的位置前活化的TNF的呈现达到相应于天然膜-TNF的作用，即导致两个TNF-受体-型的共活化。并由此导致TNF的抗肿瘤特性的增加。通过选择靶-模块的特异性，可在各个肿瘤本体上产生特异性谐调的/最佳的治疗法。

本发明的多肽的(氨基酸序列-)区或模块将在下面按优选实施方案给以详细描述。

本发明的多肽(选择因子)提供了一种新型前体药物工艺，并且是一种构型，即按本发明的优选实施方案是一种重组的均三聚的融合蛋白质，它原则上包括下列结构成分(在单体中)的确定的顺序(N端向C-端)：(1)鼠的、人源化的或人的由VH-连接体-VL组成的确定抗原特异性的单链抗体片段(scFv)；(2)具有固有三聚特性的肽连接体；(3)TNF-分子，它例如相应于野生型-TNF或TNF的胞外区(成熟17kDa形式、AA1-157、Swissprot # PO 1375)或由其衍生的生物活性变体；(4)具有特异蛋白酶-分裂位置的可变肽连接体；(5)特异的结合TNF的蛋白质或肽。

靶模块(1)优选对细胞表面分子是特异的，该分子在与血管生成过程有关的肿瘤病变和/或增殖的内皮细胞中进行表达(exprimiert)。按另一优选实施方案，靶-模块(1)对细胞外的基质的一个成分是特异的，该成分存在于肿瘤病变和/或病理病变的血管生成区域中。按照更优选的实施方案，靶模块(1)对恶性肿瘤细胞本身的成分是特异的。该区域模块(1)包含抗体(如鼠、人源化或人的)或其片段，如Fab-片段或典型的按现有技术制备的对例如在肿瘤组织中优选或主要表达(exprimiert)抗原有特异性的来源于鼠的、经CDR-移植的人源化的或完全是人的单链抗体片段(scFv)，其中基本上可在恶性细胞本身上表达(exprimiert)，但优选在肿瘤未恶化的部分、基质细胞或肿瘤内皮中表达(exprimiert)。这种实体肿瘤(癌)的未恶化的组织部分的抗体一方面在遗传上是不变的，另一方面在不同的肿瘤本体中是存在的，并由此是普适的肿瘤标志。例如这里可列举VEGFR-配合物或VEGFR/VEGF-配合物(如受体-配位体-配合物)以及整联蛋白αvβ3、皮内唾酸蛋白、作为肿瘤内皮选择性细胞结构的纤连蛋白一同种型bFn和在肿瘤基质中存在的作为胞外基质成分的选择性标志的所谓成纤维细胞活化蛋白质(FAP)，例如它们可有效地包含在特异的高亲合性的scFv中。适用的靶-模块的另一些实例是肽、人工抗体和Spiegelmere。

肽连接体区(2)优选是三聚模块，并且以治疗有效的区(3)连接靶-模块区(1)。按照优选的实施方案，三聚模块包括具有固有三聚合特性的天然存在的或合成的肽。这类肽的特别合适的实例为腱生蛋白-分子(AA 110-139，Swissprot #P 10039，(鸡)或Swissprot#P 24821(人))的结构域，它产生靶-模块(1)(例如scFv)和治疗剂(3)(例如TNF)之间的联系，并同时确保融合蛋白质在生物发生时的共价均三聚偶联。

如前所述，治疗有效的模块(3)优选包含细胞因子的氨基酸序列或其治疗有效的片段。优选区(3)包含TNF的氨基酸序列，更优选为TNF-前体蛋白，最优选是与经处理的成熟的野生型-TNF-分子(AA 1-157，Swissprot #PO 1375)相同的蛋白质，或由其衍生的衍生物或具有选择性受体键合特性的突变体或由此使其特异的生物活性或其它特性(稳定性，耐蛋白酶)最佳化的突变体或衍生物。

处理模块(4)例如是对蛋白酶敏感的(即处理部位相应蛋白酶的识别序列)和优选的是在氨基酸组成和总长中能通过三聚模块和TNF本身引起的融合蛋白质均三聚的那种，但同时也能在TNF-部分上有在分子C-端存在的TNF-抑制剂的高亲合的稳定的结合，以致抑制TNF-模块在细胞表达(zellexprimierte)的TNF受体上的键合。此外，这种连接体优选是含至少一个或多个对这种胞外的或与细胞有关的蛋白酶有选择性的分裂位置，它表明在肿瘤组织中有优选的选择性。适合的分裂位置的实例是尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、活性凝血因子VIIa、基质-金属蛋白酶如MMP-2和MMP-9、和在肿瘤的基质中高选择性膜固定表达(exprimierte)FAP-蛋白酶。特别优选的对蛋白酶敏感的分裂位置是在链中与转移和血管生成有关的基质-金属蛋白酶(如MMP-9-识别序列Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys；SEQ ID NO 18)、优选在坏死斑中出现的酶以及与前列腺癌有关的酶(如PSMA，PSA，可分裂的处理模块戊二酰基-(4-羟丙基)-Ala-Ser-环己甘氨酰-Gln-Ser-Leu-COOH)。这种连接体的结构如此选择，使蛋白酶-识别序列可供自由使用，即通过特异蛋白酶的有效作用是可能的，并且融合蛋白质，有时在TNF-分子上保留的连接的氨基酸分裂后，治疗有效的区的生物活性不受不利影响。

按本发明的多肽的优选实施方案，抑制剂模块(5)是细胞因子的受体或其片段。此外，抑制剂模块优选地具有至少一个适于治疗有效区(3)的结合位置。在区(3)中应用TNF的情况下，抑制剂模块优选包括人的TNF-受体的全部的或部分的胞外结构域，例如huTNFR1(异名p 55/60 TNFR；Swissprot #P 19438，AA 1-190；或这种分子的片段，如AA 1-157或AA 60-120)。另外的特异TNF结合的蛋白质，如huTNFR2(EMBL-数据库#M32315)的胞外域或病毒源的蛋白质如T2蛋白质以及由此衍生的具有TNF结合特性和干扰在固定有细胞膜的TNF-受体上的TNF结合的合成肽同样是适合的。基于抑制剂与治疗有效的模块的结合或相互作用，本发明的融合蛋白质处于生物失活状态，即以前体形式(前体药物)存在。

本发明的聚肽还可包括其它的域。例如为简化重组制备的蛋白质的净化和体外分析，可附加适用的标记序列。例如可将由媒介物POPE导出的myc-His₆-Tag附加在区(5)的C-端，优选附加在TNFR-片段上。其它的标记序列是专业人员所已知的。

本发明优选的TNF-选择因子是共价偶联的均三聚分子，它由三个官能域、对肿瘤特异的抗体模块、TNF和嵌段的TNF-结合蛋白质(胞外受体域或由其衍生的肽)以及位于其间的具有三聚特性或特异性的蛋白酶-分裂位置的官能连接体的上述详细描述的融合组成，它在这种复杂状态下，涉及TNF-作用是非活性的。该选择因子在体内给药后通过抗体一部分首先特别在肿瘤区域浓集，并在那里通过由肿瘤本身或反应性的肿瘤基质/肿瘤血管体系形成的蛋白酶(如FAP、uPA、tPA、MMP2、因子VIIa)处理，即分裂抑制的肽(5)。选择性蛋白酶剪切(proteolytischer Spaltung)后，三聚合的TNF-分子的TNFR-片段/抑制剂肽离解，其后变成生物活性的(即区的生物活性通过区(4)中处理部位的处理而释放)。如此处理的TNF优选在细胞的TNF-受体上形成，因为作为均多聚分子，它比单体的可溶的受体-片段具有明显高的亲合性。用本发明的选择因子，TNF-作用的选择性也通过两个措施达到：一方面通过scFv-促成的非活性前体药物在肿瘤中的选择性浓集和其在蛋白酶解活化后的保留，另一方面通过前体药物经蛋白酶的特定地点的转变，这可由唯一的或优选的在肿瘤区域中的明显活性来证实。通过TNF在有膜的抗原上由scFv促成的键合会达到选择因子的更优选的作用，即与通常采用的(溶解的)TNF-分子相比，有更好的类似于天然膜-TNF分子的生物作用。通过经scFv固定TNF使在TNFR2上的离解平衡移向更稳定的结合，并由此达到它的活化。已知两个TNFR的同时活化共价信号机制和由此产生的增强的细胞反应，特别是在肿瘤细胞中内皮细胞的活化和细胞死亡的诱发，在这方面对于通常应用(溶解)的TNF是抗性的。

本发明的多肽的特别优选的实施方案具有图1(SEQ ID NO 1)和图5(SEQ ID NO 3)所示的氨基酸序列。

本发明的另一主题是一种核酸，它包括核苷酸序列，该序列用于本发明的多肽的编码。术语“核酸”意指来自脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸和/或改性的核苷酸的一种天然的、半合成的、合成的或改性的核酸分子。本发明优选的核酸的实施方案包括图1(SEQ ID NO 2)和图5(SEQ ID NO 4)所示的核酸序列。

此外，按本发明提供一种含前述定义的核酸的媒介物。该媒介物在原核细胞和/或真核细胞中可优选地用于表达和/或扩增。由此，该媒介物优选含有适用的调控成分，如启动子、增强子、终止序列等。该媒介物也可用于将本发明的核酸的稳定整合到宿主细胞的基团材料中。

本发明的另一主题是提供一种含上述核酸和/或上述媒介物的宿主细胞。适用的宿主细胞例如是所有的哺乳动物细胞，如COS细胞或CHO细胞。

本发明还提供了一种用于制备本发明多肽的方法，它包括下列步骤：

(a)在合适的条件下于培养基中培育存在的宿主细胞，和

(b)从宿主细胞和/或培养基中分离本发明的多肽。

本发明的多肽优选地通过适合的表达系统的表达来制备，优选作为细胞系CHO DG44的可选择的稳定的转染子的分泌产物或在COS 7细胞中瞬时表达后制备。另外的相应于现有技术的真核细胞的表达系统，如Pichia pastoris、昆虫细胞或哺乳动物细胞也是适用的，如在Brock等人(免疫技术3：173-184，1997)对哺乳动物和昆虫细胞所描述的适合分泌作用的各个细胞系统的表达媒介物，在酵母Pichiapastoris中用于表达和分泌作用的pPICZ(α-媒介物(INVITROGEN)。

本发明的多肽、核酸和/或媒介物可优选地用于制备治疗由疾病引起的失调的药物组合物。

因此，本发明的另一主题涉及一种药物组合物，它以药物有效量包含本发明的多肽和/或本发明的核酸和/或本发明的媒介物，需要时可含有一种或多种药物上适用的助剂、稀释剂和/或载体。该药物组合物优选地用于治疗癌和/或感染性疾病和/或代谢性疾病。该药物组合物的特别优选的应用范围是治疗实体瘤以及病理病变中的血管。本发明的药物组合物可采用当前专业领域中的每一种适用的已知形式。优选的是固态、液态或气溶胶型。

由此，本发明还包括一种治疗方法，包括对需治疗的病人给以足够治疗量的本发明的药物组合物。本发明药物组合物的适用的给药途径是本领域专业人员所已知的，例如包括口服、静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、鼻给药、直肠给药和局部给药。静脉内给药可按连续的注射间隔以丸剂注射和/或以注入给药。用本发明的药物组合物可治疗人类的病，也可治疗动物的病。该治疗方法优选用于有前述疾病的病人。

附图说明：

图1示出本发明选择因子前体药物W24的氨基酸序列(SEQ ID NO1，上)和相应的cDNA-核苷酸序列(SEQ ID NO2，下)。

图2示出用抗-c-myc-mAK培养后的考马斯染色的SDS-PAGE-凝胶和相应的蛋白质印迹的照相描述。前体药物W24在CHO-DG44-细胞中表达，并用IMAC纯化。纯化后的蛋白质在还原条件(还原)以及非还原条件下涂布。

图3示出按抗-c-myc-mAK 9E10检出的12％SDS-凝胶的蛋白质印迹分析的照相描述，印迹1：用PBS培育后的纯化的前体药物W24；印迹2：用PBS+tPA培育后的纯化的前体药物W24。

图4示出使用典型活化的前体药物W24(■)或非活化的前体药物W24()时在Kym-1细胞上的诱发细胞死亡的图。

图5示出本发明的选择因子前体药物W33的氨基酸序列(SEQ IDNO3，上)和相应的cDNA-核苷酸序列(SEQ ID NO 4，下)。

图6中(A)示出用抗-c-myc-mAK 9E 10培育后的考马斯染色的SDS-PAGE-凝胶和相应的蛋白质印迹的照相描述。前体药物W32在CHO-DG44-细胞中表达并用IMAC纯化。纯化后的蛋白质在还原条件以及非还原条件下涂布。(B)示出用FACS-分析的关于FAP-结合的前体药物W32的K_D，app.的测定结果。用一系列稀释的前体药物W32培育FAP-正性HT 1080 # 33-细胞(o)和FAP-负性HT1080-对照细胞(●)，并用间接的免疫荧光强度来探测形成细胞的份额。示出所用前体药物浓度与平均荧光强度(m.f.i)之间的关系。

图7中(A)示出在具有非活化前体药物W32(■)、胰蛋白酶活化的前体药物W32(□)或野生型-TNF(●)的Kym-1-细胞情况下，细胞死亡诱发实验的结果。图中示出三个实验的典型情况。插入IMAC-纯化的前体药物W32的在还原条件下用考马斯染色的SDS-PAGE-凝胶(左印迹)和胰蛋白酶活化后IMAC-纯化的前体药物W32(右印迹)的照相描述。(B)示出在用呈现前体药物的FAP-正性细胞(HT 1080#33)以及用FAP-负性-对照细胞(HT1080)协同培养时的Kym-1-细胞的细胞死亡诱发实验的结果。(B)中示出的相应实验的图示为：HT1080+非活化前体药物W32(△)，HT1080+胰蛋白酶活化的前体药物W32(□)，HT 1080#33+非活化的前体药物W32(▲)，HT 1080#33+胰蛋白酶活化的前体药物W32(■)。(C)是相应(B)中实验的图示，但就在结合到HT-细胞上后进行胰蛋白酶活化，并接着固定。其图示为：HT1080+非活化前体药物W32(○)，HT1080+胰蛋白酶活化的前体药物W32(□)，HT1080#33+非活化前体药物W32(●)，HT1080#33+胰蛋白酶活化的前体药物W32(■)。在(B)和(C)的图中总是由三个实验的典型情况。

下面将用非限定性实施例来详细说明本发明。

实施例

实施例1：TNF-选择因子的序列

在连接体(Linker)和各种受体片段中具有多个分裂位(Schnittstellen)的TNF-选择因子的序列：

1.scFv-TD_腱生蛋白-huTNF(AS1-157)-连接体-huTNFR1(AS1-190)。

2.scFv-TD_腱生蛋白-huTNF(AS1-157)-连接体-huTNFR1(AS60-120)。

在另一方案中，在huTNF-分子中的可能的内生分裂位在保留scFy、连接体序列和受体序列的情况下，通过氨基酸的交换去除(TNFmut I83F，R131Q)，如上述实例所述。

在不同物种情况下腱生蛋白-C的高保存的卷曲螺旋域(AS110-139)用作三聚域：AS-序列的实例为：

鸡：ACGCAAAPIVKDLLSRLEELEGLVSSLREQ(Swissprot#P10039，SEQ ID NO

5)^*

人：ACGCAAAPDVKRLLSRLEELENLVSSLREQ(Swissprot#P24821，SEQ ID NO

6)^#

*Nies，D.E；Hemesath，T.J.，Kim，J.H.，Gulcher，J.R.和Stefansson，K.人的hexabrachion(腱生蛋白)的完整cDNA序列。含单一表皮生长因子复制的多域蛋白质。J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266(5)，2818-2823(1991)。

#Spring，J.，Beck，K.和Chiquet-Ehrismann，R.腱生蛋白的两个相反功能：由重组腱生蛋白片段的活性位点的剖分。Cell(细胞)59(2)，325-334(1989)。

实施例2：连接体-序列

本发明的处理序列例如是具有适于凝血酶、tPA、因子VIIa和uPA的蛋白酶分解位置的连接体(氨基酸序列如下，SEQ ID NO 7；cDNA核苷酸序列如上，SEQ ID NO 8)：

TCCGGAATGTACCCCAGAGGATCGATCGGCGCCCCCTTCGGCCGCGGCGCCCCCTTCGTACGCATC

S G M Y P R G S I G A P F G R G A P F V R I

| 凝血酶 | | tPA | | 因子 VIIa|

GAGGGTCGGGTC

E G R V

| uPA |

实施例3：TNF-选择因子前体药物W24的表达、纯化和功能表征

前体药物W24

TNF-选择因子前体药物W24由下列成分组成(从N端向C-端，氨基酸基团(AA)基于SEQ ID NO 1)：

1.AA 1-19：前导肽序列

2.AA 20-285：scFv OS4(特异性：人的FAP；参看Mersmann(2000)斯图加特大学博士论文，Grauer出版社，斯图加特，ISBN 3-86186-335-9；Rippmann 1999，斯图加特大学博士论文，ISBN 3-86186-281-6)

3.AA 286-315：腱生蛋白的三聚结构域(鸡，见上面)

AA 316-321：连接体(Linker)

4.AA 322-486：天然的人的TNF-前体蛋白质的变异形式(26kDa膜形式，Swissprot#P01375,233 AA)，缺失N-端56AA和AA 78-89(TNF_{△1-56，78-89})，即缺失胞质结构域、跨膜结构域和TNF-前体多肽的TACE-分裂位置。

5.AA 487-512：具有蛋白酶分裂位置的连接体(参看实施例2)

6.AA 513-639：含有胞外结构域1-3的人的TNFR1片段(Swissprot#P19438，AA 12-138；参看Himmler等(1990)DNA和Cell Biology(细胞生物学)9，705-715)，

7.AA 640-652：myc-tag

8.AA 653-658：His-tag

图1中示出氨基酸序列(SEQ ID NO 1)和相应的编码的DNA-序列(SEQ ID NO 2)。该蛋白质部分的计算MW为70.3kDa。

表达和纯化

前体药物W24按制造商(Pharmacia)的说明从CHO-上层清液以IMAC纯化。在用考马斯染色的SDS-PAGE-凝胶中，在还原和非还原条件下使用400ng(20μl)该物质，在有抗-c-myc-mAK 9E10的蛋白质印迹中，采用2μl，参看图2。检测单体、二聚物和三聚物的表达。

前体药物W24由tPA的分裂

经纯化的前体药物W24(600ng)在PBS(50μl)或在PBS+tPA(5μg tPA在50μl PBS中)于37℃下培养16小时。在12％SDS-PAGE(还原)和蛋白质印迹之后，用抗-c-myc-mAK 9E10进行检测，接着用碱性磷酸酶-共轭的山羊抗-小鼠1gG-血清检测。接有tPA的在其C-端带有myc-tag的分裂的TNFR-片段(约17kDa)的预计大小的高度中，在33kDa下方的条带的现象表明前体药物W24的部分吸收；见图3。活化的TNF-选择因子不能用这种检测方法来说明。

前体药物W24由胰蛋白酶的蛋白水解活化

将在50μl标准-培养基(10％FCS)中的20000 Kym-1-细胞在前一天散布在有96个凹穴的平板中(4-倍值)，并在次日加入50μl前体药物W24-稀释液。以IMAC-纯化的前体药物W24(2μg)的胰蛋白酶活化是在含最终浓度为100μg/ml的胰蛋白酶的总体积为50μl的PBS中完成的。室温下用200μl RPMI/10％FCS培育5分钟后停止反应。未活化的样品同样处理，但不含胰蛋白酶。16小时后通过MTT-染色确定活性。结果表明(图4)，未处理过的TNF-选择因子直到浓度约2-3μg/ml都无生物活性(细胞死亡诱发)，而胰蛋白酶活化的选择因子具有与野生型TNF可相比的高特异生物活性(LD₅₀＝0.5ng/ml)。LD₅₀的测定表明通过处理可使活性提高约4000倍。

实施例4：前体药物W33

前体药物W33的结构具有与实施例3的前体药物W24相同的功能特性，但区别是具有较长的对蛋白酶敏感的连接体(AA487-520)和较短的TNFR片段(AA 521-582；Swissprot#P19438，人的TNFR1的AA 54-115；参见Himmler等人(1990)DNA和细胞生物学9，705-715)。前体药物W33的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)和编码的cDNA序列(SEQID NO 4)示于图5。

实施例5：TNF选择因子前体药物W32的表达、纯化和功能表征

前体药物W32

制备了另一种其功能相应于实施例3的前体药物W24的结构(前体药物W32)，但含有另外的抗体片段作为靶-模块(1)(scFv M036)，它是从鼠的Ig基因库中独立分离出的，并选择用于交叉反应性人/鼠FAP。与此相反，实施例3的前体药物W24的靶-特异性基于scFv，它唯一地识别人的FAP。

TNF-选择因子前体药物W32的生物化学表征和抗原-结合活性

对前体药物W32进行如结构W24(实施例3)的表达(exprimiert)用IMAC纯化并通过SDS-PAGE/蛋白质印迹分析；参看图6A。

此外，通过FACS-分析进行用于FAP-结合的前体药物W32的K_D，app.测定；参看图6B。K_D，app.由得到半最大信号的浓度计算。得到的值为2.4×10^-10M。

前体药物W32的TNF-活性

在Kym-1细胞死亡实验中(参看实施例3步骤)，活化的前体药物W32具有与天然存在的TNF可比的活性，而未经处理的结构仅在高得多的浓度下才显示细胞死亡活性，参看图7A。

此外，在用对前体药物起作用的细胞的共培育进行了活化的前体药物W32的juxtatrope细胞死亡诱发试验。对此，用一系列稀释的前体药物或胰蛋白酶-活化的前体药物对FAP-负性HT 1080-对比细胞或FAP-正性HT 1080#33细胞进行培育、洗涤、固定，用Kym-1共培养，并在16小时后测定细胞的活力，参看图7B。在另一实验中，在其它相同的批次(Anstzen)下，进行只在结合到细胞上并接着细胞固定之后的胰蛋白酶活化；参看图7C。在两种情况下，通过活化的前体药物产生明显的juxtatrope细胞死亡诱发作用。

实施例6：本发明的多肽选择因子W24和W33的形成

按如下制备融合蛋白质：

1.单链抗体片段(scFv)OS4(其后表示为OS4)是通过“CDR接枝”的人源化的FAP特异mAb F19类型(Retting等人，1988)并在Rippmann J.F.(斯图加特大学博士论文，Grauer出版社，斯图加特，1999)和Rippmann等人(Appl EnvMicrobiol 64：4862-4869，1998)中描述。

2.在具有用于mAb 19的重免疫球蛋白链表达盒的真核的表达载体pG1D105(描述于EP 0 953639中)中，通过BstE2和Nae1以由scFv OS4；hulgG1的铰链-CH3区；质粒pW7的myc/his-Tag组成的小体OS4盒交换(描述于Wüest，T.，斯图加特博士论文，2001)。通过Not1/BamH1吸收选择性地除去Fc片段(hulgG1的铰链区和CH3-区)。

3.三聚结构域的cDNA序列(例如鸡的腱生蛋白的AA 110-139)借助于引物1(SEQ ID NO 10)和2(SEQ ID NO 11)通过校对PCR来扩增，由此引入分裂位置Not1和Kpn1。人的TNF片段从不可分裂的膜的TNF突变体(膜-TNF，TNF delta 1-12，Grell等人，细胞83：793-802，1995)借助引物3(SEQ ID NO 12)和4(SEQ ID NO 13)来扩增，由此在5’端引入分裂位置Kpn1和在3’-端引入分裂位置Acc3和BamH1以及在用于腱生蛋白结构域和TNF结构域编码的序列段之间引入为肽-连接体TyrGlyGlyGlySer编码的序列(SEQ ID NO 9)。这两片段通过采用Not1-、Kpn1-和BamH1-分裂位置在2.中描述的Not1/BamH1吸收的克隆中间体中嵌入。

4.对蛋白酶敏感的连接体的克隆和人的TNF-受体1片段的克隆是通过多个中间体实现的。对此，TNF-受体1片段(富半胱氨酸结构域1-3；AS 12-138；Swissprot # 10039)从质粒pADBTNF-R(Himmler等人，DNA-细胞生学物9：705-715，1990)用引物5(SEQ ID NO 14)和6(SEQ ID NO 15)PCR扩增，由引物7(SEQ ID NO 16)和6(SEQID NO 15)再扩增，由此引入分裂位置Acc3，BamH1和TNFR片段的连接体5’，它对蛋白酶分裂位置编码。这种片段通过分裂位置Acc3/BamH1在3.中所描述的中间体中克隆。

5.通过用引物8(SEQ ID NO 17)和6(SEQ ID NO 15)PCR扩增，将蛋白酶敏感的连接体的变化引入连接体-TNFR1-片段中。如此所得的片段通过分裂位置Cla1和BamH1嵌入4.中描述的中间体中，代替了先前得到连接体-TNFR片段。如此制备的真核的表达质粒pW24可表达TNF-选择因子-前体药物W24。

6.在TNF-选择因子-前体药物的另一个实施方案中，TNF-受体由引物9和10PCR扩增，得到具有5’位连接体的、为人的TNFR1的AA54-115编码的序列。这种片段通过Sal1-和BamH1-分裂位置嵌入pW24中，并代替在那里含有的连接体-TNFR1片段。由此所得的表达质粒pW33可表达TNF-选择因子-前体药物W33。

7.为获得TNF-选择因子-前体药物(W24和W33)，按照制造商的描述以脂转染胺试剂(Gibco-BRL)转染具有在5.和6.中描述结构的CHO-DG44细胞，并接着通过不含次黄嘌呤和胸苷的(HT^-)CHO-S-SFM介质(生命技术)以稳定的结构整合选入基因组中。通过选择性试剂氨甲蝶呤的逐渐增加(0.1；1；10μM)来得到表达的提高。借助如Rippmann等人(Appl EnvMicrobiol 64：4862-4869，1998)的固定的金属亲合色谱(IMAC)在无菌条件下由培养物上层清液纯化W24和W33，并在4℃下保存直到进一步应用。

所有的克隆步骤和PCR-扩增步骤均用下面的引物按通常的标准程序进行。所有结构经排序以验证它们的cDNA-序列。相关的分裂位置以黑体字印刷。

引物1(SEQ ID NO 10)

Not1

5′TAA ATA GGG GCC CAC AGC CAG GCG GCC GCC TGT GGC TGT GCG GCT

GC3′

引物2(SEQ ID 11)

Kpn1

5′ATA AAT GGT ACC CTG CTC CCG GAG GGA GGA 3′

引物3(SEQ ID NO 12)

Kpn1

5′GAG AGG GTA CCG GAG GTG GGT CTG GCC CCC AGA GGG AAG AG3′

引物4(SEQ ID NO 13)

BamH1 Acc3

5′TTG TTC GGA TCC ACG ACC CTC GAT TCC GGA CAG GGC AAT GAT CCC

AAAG3′

引物5(SEQ ID NO 14)

BamH1

5′CTC GGG ATC CGG CGG TGG CAG ATC TGG CGG GGG TGG GGT CGA

CAG TGT GTG TCC CCA AGG 3′

引物6(SEQ ID NO 15)

BamH1

5′CCT GCG GAT CCG GTG CAC ACG GTG TTC TG 3′

引物7(SEQ ID NO 16)

Acc3 Cla1

5′GCC TTC CGG AAT GTA CCC CAG AGG ATC GAT TGG TGG CAG ATC TGG

CGG 3′

引物8(SEQ ID NO 17)

Cla1

5′AGT GGA TCG ATC GGC GCC CCC TTC GGC CGC GGC GCC CCC TTC GTA

CGC ATC GAG GGT CGG GTC GAC AGT GTG TGT C 3′

序列表

<110>斯图加特大学，

Pfizenmaier，Klaus

<120>作为靶特异前体药物的抗体-细胞因子-细胞因子-抑制剂

融合蛋白质(选择因子)

<130>U 1125

<140>

<141>

<150>DE 100 45 592.1

<151>2000-09-15

<160>18

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>658

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：选择因子W24氨基酸序列

<400>1

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His

115 120 125

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg

145 150 155 160

Val Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu

165 170 175

Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr

180 185 190

Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

195 200 205

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly

210 215 220

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu

225 230 235 240

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

245 250 255

Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

260 265 270

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ala Ala Ala Cys Gly

275 280 285

Cys Ala Ala Ala Pro Asp Ile Lys Asp Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Glu Gly Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Gly Thr Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser

325 330 335

Pro Leu Ala Gln Ala Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu

340 345 350

Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn

355 360 365

Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu

370 375 380

Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser

385 390 395 400

Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr

405 410 415

Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg

420 425 430

Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr

435 440 445

Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu

450 455 460

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr

465 470 475 480

Phe Gly Ile Ile Ala Leu Ser Gly Met Tyr Pro Arg Gly Ser Ile Gly

485 490 495

Ala Pro Phe Gly Arg Gly Ala Pro Phe Val Arg Ile Glu Gly Arg Val

500 505 510

Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser

515 520 525

Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys

530 535 540

Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser

545 550 555 560

Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys

565 570 575

Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp

580 585 590

Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp

595 600 605

Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly

610 615 620

Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Gly

625 630 635 640

Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser His His His His

645 650 655

His His

<210>2

<211>1977

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：选择因子W24 cDNA-序列

<400>2

atggactgga cctggcgcgt gttttgcctg ctcgccgtgg ctcctggggc ccacagccag 60

gtgcaactag tgcagtccgg cgccgaagtg aagaaacccg gtgcttccgt gaaagtcagc 120

tgtaaaacta gtagatacac cttcactgaa tacaccatac actgggttag acaggcccct 180

ggccaaaggc tggagtggat aggaggtatt aatcctaaca atggtattcc taactacaac 240

cagaagttca agggccgggt caccatcacc gtagacacct ctgccagcac cgcctacatg 300

gaactgtcca gcctgcgctc cgaggacact gcagactact actgcgccag aagaagaatc 360

gcctatggtt acgacgaggg ccatgctatg gactactggg gtcaaggaac ccttgtcacc 420

gtctcctcag cctccaccaa gggcccaaag cttgaagaag gtgaattttc agaagcacgc 480

gtagacattg tgatgaccca atctccagac tctttggctg tgtctctagg ggagagggcc 540

accatcaact gcaagtccag tcagagcctt ttatattcta gaaatcaaaa gaactacttg 600

gcctggtatc agcagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatcttttg ggctagcact 660

agggaatctg gggtacctga taggttcagt ggcagtgggt ttgggacaga cttcaccctc 720

accattagca gcctgcaggc tgaagatgtg gcattttatt actgtcagca atattttagc 780

tatccgctca cgttcggaca agggaccaag gtggaaataa aacgtactgt ggctgcacca 840

tctgtcttcg cggccgcctg tggctgtgcg gctgccccag acatcaagga cctgctgagc 900

agactggagg agctggaggg gctggtatcc tccctccggg agcagggtac cggaggtggg 960

tctggccccc agagggaaga gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag 1020

gcagtagccc atgttgtagc aaaccctcaa gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc 1080

cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca 1140

tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc 1200

acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc 1260

aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc 1320

aagccctggt atgagcccat ctatctggga ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga 1380

ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat ctcgactttg ccgagtctgg gcaggtctac 1440

tttgggatca ttgccctgtc cggaatgtac cccagaggat cgatcggcgc ccccttcggc 1500

cgcggcgccc ccttcgtacg catcgagggt cgggtcgaca gtgtgtgtcc ccaaggaaaa 1560

tatatccacc ctcaaaataa ttcgatttgc tgtaccaagt gccacaaagg aacctacttg 1620

tacaatgact gtccaggccc ggggcaggat acggactgca gggagtgtga gagcggctcc 1680

ttcaccgctt cagaaaacca cctcagacac tgcctcagct gctccaaatg ccgaaaggaa 1740

atgggtcagg tggagatctc ttcttgcaca gtggaccggg acaccgtgtg tggctgcagg 1800

aagaaccagt accggcatta ttggagtgaa aaccttttcc agtgcttcaa ttgcagcctc 1860

tgcctcaatg ggaccgtgca cctctcctgc caggagaaac agaacaccgt gtgcaccgga 1920

tccgaacaaa agctgatctc agaagaagat ctatcccatc atcaccatca tcattaa 1977

<210>3

<211>601

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：选择因子W33氨基酸序列

<400>3

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His

115 120 125

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg

145 150 155 160

Val Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu

165 170 175

Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr

180 185 190

Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

195 200 205

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly

210 215 220

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu

225 230 235 240

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

245 250 255

Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

260 265 270

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ala Ala Ala Cys Gly

275 280 285

Cys Ala Ala Ala Pro Asp Ile Lys Asp Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu

290 295 300

Leu Glu Gly Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Gly Thr Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser

325 330 335

Pro Leu Ala Gln Ala Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu

340 345 350

Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn

355 360 365

Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu

370 375 380

Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser

385 390 395 400

Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr

405 410 415

Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg

420 425 430

Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr

435 440 445

Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu

450 455 460

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr

465 470 475 480

Phe Gly Ile Ile Ala Leu Ser Gly Met Tyr Pro Arg Gly Ser Ile Gly

485 490 495

Ala Pro Phe Gly Arg Gly Ala Pro Phe Val Arg Ile Glu Gly Arg Val

500 505 510

Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr

515 520 525

Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg

530 535 540

Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp

545 550 555 560

Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu

565 570 575

Asn Leu Phe Gln Cys Phe Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

580 585 590

Asp Leu Ser His His His His His His

595 600

<210>4

<211>1806

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：选择因子W33 cDNA-序列

<400>4

atggactgga cctggcgcgt gttttgcctg ctcgccgtgg ctcctggggc ccacagccag 60

gtgcaactag tgcagtccgg cgccgaagtg aagaaacccg gtgcttccgt gaaagtcagc 120

tgtaaaacta gtagatacac cttcactgaa tacaccatac actgggttag acaggcccct 180

ggccaaaggc tggagtggat aggaggtatt aatcctaaca atggtattcc taactacaac 240

cagaagttca agggccgggt caccatcacc gtagacacct ctgccagcac cgcctacatg 300

gaactgtcca gcctgcgctc cgaggacact gcagtctact actgcgccag aagaagaatc 360

gcctatggtt acgacgaggg ccatgctatg gactactggg gtcaaggaac ccttgtcacc 420

gtctcctcag cctccaccaa gggcccaaag cttgaagaag gtgaattttc agaagcacgc 480

gtagacattg tgatgaccca atctccagac tctttggctg tgtctctagg ggagagggcc 540

accatcaact gcaagtccag tcagagcctt ttatattcta gaaatcaaaa gaactacttg 600

gcctggtatc agcagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatcttttg ggctagcact 660

agggaatctg gggtacctga taggttcagt ggcagtgggt ttgggacaga cttcaccctc 720

accattagca gcctgcaggc tgaagatgtg gcagtttatt actgtcagca atattttagc 780

tatccgctca cgttcggaca agggaccaag gtggaaataa aacgtactgt ggctgcacca 840

tctgtcttcg cggccgcctg tggctgtgcg gctgccccag acatcaagga cctgctgagc 900

agactggagg agctggaggg gctggtatcc tccctccggg agcagggtac cggaggtggg 960

tctggccccc agagggaaga gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag 1020

gcagtagccc atgttgtagc aaaccctcaa gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc 1080

cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca 1140

tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc 1200

acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc 1260

aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc 1320

aagccctggt atgagcccat ctatctggga ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga 1380

ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat ctcgactttg ccgagtctgg gcaggtctac 1440

tttgggatca ttgccctgtc cggaatgtac cccagaggat cgatcggcgc ccccttcggc 1500

cgcggcgccc ccttcgtacg catcgagggt cgggtcgacg gcggctctgg cggcagtctc 1560

gagtgtgaga gcggctcctt caccgcttca gaaaaccacc tcagacactg cctcagctgc 1620

tccaaatgcc gaaaggaaat gggtcaggtg gagatctctt cttgcacagt ggaccgggac 1680

accgtgtgtg gctgcaggaa gaaccagtac cggcattatt ggagtgaaaa ccttttccag 1740

tgcttcggat ccgaacaaaa gctgatctca gaagaagatc tatcccatca tcaccatcat 1800

cattaa 1806

<210>5

<211>30

<212>PRT

<213>Gallus gallus

<400>5

Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Ile Val Lys Asp Leu Leu Ser Arg

1 5 10 15

Leu Glu Glu Leu Glu Gly Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln

20 25 30

<210>6

<211>30

<212>PRT

<213>人

<400>6

Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg

1 5 10 15

Leu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln

20 25 30

<210>7

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：对于凝血酶、tPA、因子VIIa和uPA的有

蛋白酶分裂位置的处理序列

<400>7

Ser Gly Met Tyr Pro Arg Gly Ser Ile Gly Ala Pro Phe Gly Arg Gly

1 5 10 15

Ala Pro Phe Val Arg Ile Glu Gly Arg Val

20 25

<210>8

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：对于凝血酶、tPA、因子VIIa和uPA编码的

cDNA的有蛋白酶分裂位置的处理序列

<400>8

tccggaatgt accccagagg atcgatcggc gcccccttcg gccgcggcgc ccccttcgta 60

cgcatcgagg gtcgggtc 78

<210>9

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：肽-连接体

<400>9

Tyr Gly Gly Gly Ser

1 5

<210>10

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于鸡的腱生蛋白的三聚结构

域扩增的引物1

<400>10

taaatagggg cccacagcca ggcggccgcc tgtggctgtg cggctgc 47

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于鸡的腱生蛋白的三聚结构域

扩增的引物2

<400>11

ataaatggta ccctgctccc ggagggagga 30

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于人的TNF-片段扩增的引物3

<400>12

gagagggtac cggaggtggg tctggccccc agagggaaga g 41

<210>13

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于人的TNF-片段扩增的引物4

<400>13

ttgttcggat ccacgaccct cgattccgga cagggcaatg atcccaaag 49

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于TNFR1-片段扩增的引物5

<400>14

ctcgggatcc ggcggtggca gatctggcgg gggtggggtc gacagtgtgt gtccccaagg 60

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于TNFR1-片段扩增的引物6

<400>15

cctgcggatc cggtgcacac ggtgttctg 29

<210>16

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于TNFR1-片段再扩增的引物7

<400>16

gccttccgga atgtacccca gaggatcgat tggtggcaga tctggcgg 48

<210>17

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：通过PCR-扩增在连接体-TNFR-片段中引入

对蛋白酶敏感的连接体的引物8

<400>17

agtggatcga tcggcgcccc cttcggccgc ggcgccccct tcgtacgcat cgagggtcgg 60

gtcgacagtg tgtgt 75

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：MMP-9-识别序列

<400>18

Gly Pro Leu Pro Val Arg Gly Lys

1 5

Claims

1.一种具有氨基酸序列的多肽，它从N端向C端含有：

(1)选择性识别细胞表面上的特定大分子和/或胞外基质的成分的区，该区对细胞表面分子是特异的，该分子在与血管生成过程有关的肿瘤病变和/或增殖的内皮细胞中进行表达，

(2)包含肽连接体的区，该肽连接体是三聚模块，并且区(1)与区(3)连接，

(3)对特定靶分子具有生物活性的区，该区由细胞因子的氨基酸序列或其片段组成，

(4)具有至少一个处理部位的区，该至少一个处理部位是蛋白酶的分裂位置，和

(5)通过分子内结合和/或相互作用延缓区(3)的生物活性的区，其中区(5)是用于细胞因子或其片段的受体，其中，区(3)的生物活性可通过区(4)中至少一个处理部位的体内处理而释放。

2.权利要求1的多肽，其中细胞因子是肿瘤-坏死-因子(TNF)、其生物活性的衍生物或其生物活性的突变型。

3.权利要求1或2的多肽，其中区(3)的特定靶分子是结合有细胞膜的细胞因子受体。

4.权利要求3的多肽，其中区(3)由SEQ ID NO 1的氨基酸基团322-486组成。

5.权利要求4的多肽，其中蛋白酶是尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)、组织纤溶酶原活化剂(tPA)、活化的凝结因子VIIa、基质-金属蛋白酶或FAP-蛋白酶。

6.权利要求5的多肽，其中区(4)由SEQ ID NO 1的氨基酸基团487-512或SEQ ID NO 3的氨基酸基团487-520组成。

7.权利要求1或2的多肽，其中区(5)有至少一个用于区(3)的结合位置。

8.权利要求1的多肽，其中受体包含人的TNF-受体的全部或部分胞外结构域和/或结合TNF的病毒-蛋白质或其突变体或合成的结合TNF的化合物。

9.权利要求8的多肽，其中区(5)由SEQ ID NO 1的氨基酸基团513-639或SEQ ID NO 3的氨基酸基团521-582组成。

10.权利要求1的多肽，其中三聚模块包含具有固有的三聚特性的天然存在的或合成的肽。

11.权利要求10的多肽，其中区(2)由SEQ ID NO 5或SEQ ID NO6的氨基酸序列组成。

12.权利要求1或2的多肽，其中区(1)对胞外基质的成分是特异的，该成分存在于肿瘤病变和/或病理病变的血管生成区域中。

13.权利要求1或2的多肽，其中区(1)对恶性肿瘤细胞本身的成分是特异的。

14.权利要求1或2的多肽，其中区(1)是具有确定的抗原特异性的鼠、人源化或人的抗体或其片段。

15.权利要求14的多肽，其中抗体片段是scFv-片段或Fab-片段。

16.权利要求15的多肽，其中区(1)由SEQ ID NO 1的氨基酸基团20-285组成。

17.含有核苷酸序列的核酸，该序列对权利要求1-16之一的多肽编码。

18.媒介物，它含有权利要求17的核酸。

19.权利要求18的媒介物，它能在原核细胞和/或真核细胞中进行表达和/或扩增。

20.宿主细胞，它含有权利要求17的核酸和/或权利要求18或19的媒介物。

21.一种制备权利要求1-16之一的多肽的方法，它包括下列步骤：

(a)在合适的条件下于培养基中培育权利要求20的宿主细胞，和

(b)从宿主细胞和/或培养基中分离权利要求1-16之一的多肽。

22.药物组合物，它含有药物有效量的权利要求1-16之一的多肽和/或权利要求17的核酸和/或权利要求18或19的媒介物，需要时与一种或多种在药物上可接受的助剂、稀释剂和/或载体相结合。

23.权利要求22的药物组合物在制备用于治疗病理病变中的实体瘤和/或血管生成的药物中的用途。

24.权利要求22的药物组合物，它呈固态、液态或气溶胶形式。