DE102005036542A1

DE102005036542A1 - CTL-Prodrug

Info

Publication number: DE102005036542A1
Application number: DE102005036542A
Authority: DE
Inventors: Klaus Prof. Dr. Pfizenmaier; Harald Prof. Dr. Wajant; Iris Watermann; Jeannette Dr. Gerspach; Dafne Dr. Müller
Original assignee: Universitaet Stuttgart; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: Universitaet Stuttgart; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2005-08-03
Filing date: 2005-08-03
Publication date: 2007-02-08
Also published as: WO2007014744A3; WO2007014744A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit vorzugsweise antitumoralen und/oder immunmodulierenden Zytokineigenschaften, welches durch Prozessierung in vivo aktivierbar ist, umfassend eine C-terminale Region mit spezifischer biologischer Aktivität, an dessen N-terminalen Ende eine inhibitorische Region, eine Region mit einer Prozessierungsstelle und eine Region, die ein Makromolekül auf einer Zelloberfläche oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, angeordnet ist.

Description

Der Einsatz von rekombinanten Liganden der TNF-Familie, z.B. TNF oder FasL (CD95L), zur Behandlung von beispielsweise Tumorerkrankungen ist bisher aufgrund von starken systemischen Nebenwirkungen, die als therapiebegrenzend anzusehen sind, stark eingeschränkt. So ist z.B. eine Behandlung mit TNF nur unter speziellen, aufwendigen Behandlungsprotokollen (z.B. mittels sog. "Isolated Limb Perfusion") bei sehr begrenzten Indikationen (Melanom/Sarkom-Metastasen der Extremitäten) mit Erfolg durchführbar. Aus diesen klinischen Daten kann man abschätzen, daß etwa eine 10- bis 100-fach höhere TNF-Dosis als die MTD (engl. "Maximum Tolerated Dose") zur anti-tumoralen Wirksamkeit erforderlich wäre, als es die massiven systemischen Nebenwirkungen zulassen würden. Behandlungskonzepte, die auf der Aktivierung von Fas, dem Rezeptor des FasL, beruhen, sind bisher keine versucht worden, da eine systemische Aktivierung dieses Rezeptors sehr schnell Apoptose in Hepatozyten induziert und so zu akutem, im Experimentaltier tödlich verlaufendem Leberversagen führt.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die unerwünschten Folgen einer Behandlung mit therapeutisch wirksamen Polypeptidwirkstoffen, wie z.B. FasL- oder TNF-haltigen Substanzen, zu vermeiden oder zu vermindern, während gleichzeitig die therapeutisch wirksamen, beispielsweise antitumoralen Eigenschaften der aktiven Substanz, wie FasL oder TNF, beibehalten oder sogar verstärkt werden.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bereitgestellt, umfassend von N- nach C-terminal

(1) eine Region („Inhibitor"), welche die biologische Aktivität der Region (4) durch intramolekulare oder intermolekulare Bindung und/oder Wechselwirkung hemmt,
(2) eine Region, die mindestens eine Prozessierungsstelle aufweist,
(3) eine Region(„Targeting-Modul"), die ein spezifisches Makromolekül auf einer Zelloberfläche und/oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, und
(4) eine Region („therapeutisch wirksame Region oder Substanz") mit einer biologischen Aktivität für ein spezifisches Zielmolekül,

wobei die biologische Aktivität der Region (4) durch Prozessierung in vivo der mindestens einen Prozessierungsstelle in Region (2) freisetzbar ist. Ohne Prozessierung der Region (2) bleibt die Aktivität der Region (4) inhibiert und das Polypeptid daher biologisch, z.B. im Sinne der Zytokinwirkung (beispielsweise der FasL oder TNF-Wirkung), inaktiv.

Die Begriffe „Region" und „Modul" werden im folgenden synonym verwendet. Der Begriff „Fragment" bezeichnet eine verkürzte Form eines Moleküls. Die Begriffe „Derivat" und „Mutante" bezeichnen jedes Derivat bzw, jede Mutante eines Moleküls, die im wesentlichen die gleiche funktionalen und/oder biologischen Eigenschaften des Moleküls aufweisen. In Bezug auf Nukleinsäuren können Derivate bzw. Mutanten Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Basen enthalten, deren Abwesenheit, Anwesenheit oder Substitution keinen wesentlichen Einfluß auf die Akti vität des Genprodukts hat, beispielsweise Basen, die in einem transkriptionell inaktiven Teil einer Nukleotidsequenz liegen. Dies schließt auch Derivate und Mutanten ein, welche bei unterschiedlicher Nukleotidsequenz die gleiche Aminosäuresequenz kodieren. Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen, die zu einer geringfügigen Steigerung oder Verringerung der Transkriptionsrate führen, sind ebenfalls mit eingeschlossen. In Bezug auf Aminosäuresequenzen können Derivate bzw. Mutanten Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren enthalten, deren Abwesenheit, Anwesenheit oder Substitution keinen wesentlichen Einfluß auf die Aktivität des Polypeptids hat, beispielsweise konservative Substitutionen von Aminosäuren, d.h. Ersetzen von Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften. Der Begriff „Derivat" schließt auch post-translationale Modifikationen, wie beispielsweise zum Wildtyp unterschiedliche Glykosylierungsmuster, ein.

Erfindungsgemäße Polypeptide werden nachstehend auch allgemein als "C-terminal TNF family Ligand (CTL)-Prodrug" bezeichnet. Sind im nachfolgenden erfindungsgemäße Polypeptide gemeint, in denen die Region (4) aus einem bestimmtem Liganden der TNF-Familie, z.B. dem FasL oder TNF abgeleitet ist, so werden diese entsprechend dieser Region benannt. Besteht die Region (4) z.B. aus einem FasL-Derivat so wird das erfindungsgemäße Polypeptid als FasL-Prodrug bezeichnet. Die erfindungsgemäßen CTL-Prodrugs sind modular aufgebaute Wirkstoffe und gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein vorzugsweise homotrimeres oder homohexameres Fusionsprotein mit beispielsweise einem Zytokin als antitumoral wirksamer Substanz in Region (4), welches seine biologische Wirkung durch Verknüpfung mit drei weiteren Funktionsmodulen gezielt im erkrankten Gewebe, z.B. einem Tumorareal, freisetzt. Dies wird erreicht durch gentechnisches Anknüpfen der therapeutisch wirksamen Substanz, z.B. des FasL-Moleküls, an den C-Terminus eines für das Zielgewebe spezifischen Targeting-Moduls (3), z.B. tumorspezifische Antikörper oder Derivate davon, wie scFv-Antikörper, dem N-terminal durch eine prozessierbare Region (2) ein Inhibitor (1) gegen die therapeutisch wirksame Substanz (4) vorangeht, welcher selektiv im Zielgewebe, wie z.B. dem Tumorareal, durch Prozessierung der Region (2) inaktiviert wird, vorzugsweise durch gezielte proteolyti sche Abspaltung aus dem Fusionsprotein entfernt wird, und so ein am selektiven Targeting-Modul gebundener, bioaktiver Wirkstoff, z.B. FasL, entsteht.

Das beispielsweise als therapeutisch wirksame Substanz einsetzbare Zytokin ist vorzugsweise ein Ligand der TNF-Familie, besonders bevorzugt FasL, TNF, TRAIL, CD40L, LIGHT oder APRIL oder ein biologisch wirksames Derivat oder eine biologisch wirksame Mutante dieser Moleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Inhibitor (1) ein Peptid-Inhibitor, vorzugsweise eine extrazelluläre Domäne des zur Region (4) korrespondierenden Rezeptors. Der C-Terminus von Liganden der TNF-Familie kann für die optimale Aktivität des Moleküls sehr wichtig sein. Nach der Fusion von Peptiden an den C-Terminus ist die Aktivität dieser Zytokine daher oft sehr stark eingeschränkt. Dies gilt insbesondere für den FasL. Das CTL-Prodrug-Prinzip hat daher u.a. den Vorteil, daß bei der Konstruktion der Prodrug der C-Terminus der eigentlichen biologischen Wirkkomponente des Fusionsproteins frei bleibt und so nach der Prozessierung ein Zytokin-Derivat mit maximaler Aktivität entstehen kann.

Viele Antikörperdomänen aggregieren spontan. Die Herstellung von Antikörper-Zytokin Fusionsproteinen nach dem Stand der Technik führt deshalb typischerweise häufig auch zur Aggregation des Fusionsproteins. Bei Verwendung von FasL im Zytokinmodul bewirkt diese Aggregation eine konstitutive Aktivierung des FasL, was eine ungerichtete, d.h. potentiell systemische Aktivität des betreffenden Fusionsproteins und damit gravierende Nebenwirkungen nach sich zieht. Das CTL-Prodrug-Prinzip hat daher u.a. den Vorteil, daß zur Konstruktion von Prodrugs mit freiem Liganden C-Terminus auch aggregierende Antikörperdomänen verwendet werden können.

Mit dem erfindungsgemäßen Prodrug-Aufbau wird es ermöglicht, lokal hohe Wirkkonzentrationen der therapeutisch wirksamen Substanz, z.B. des FasL, zu erreichen, ohne daß es zu systemisch erhöhten Therapeutikum-Spiegeln (z.B. FasL im Serum) und damit therapielimitierenden Nebenwirkungen kommt. Insbesondere wird beispielsweise im Fall von FasL als therapeutisch wirksamer Region nach der Prozes sierung durch die Targeting-Modul- (z.B. Antikörper-) vermittelte zellständige Präsentation des FasL eine Wirkung erzielt, die der des natürlichen Membran-FasL entspricht, d.h. es kommt zur optimalen Aktivierung von Fas. Die differentielle biologische Wirkung löslicher und membranständiger Liganden einiger Mitglieder der TNF Familie, v.a. FasL, TNF, TRAIL, CD40, ist bekannt und hängt mit der Affinität der verschiedenen Formen der Liganden zu ihren Rezeptoren, der unterschiedlichen Bindung an Rezeptorsubtypen und/oder der unterschiedlichen Fähigkeit zur Rezeptor-Clusterbildung in der Membran und damit Aktivierung der Signalprozesse zusammen.

Durch Auswahl der Spezifität des Targeting-Moduls (3) und der Prozessierungsregion (2) kann ein auf die jeweilige Tumorentität spezifisch abgestimmtes/optimiertes Therapeutikum hergestellt werden. Durch die Herstellung einer CTL-Prodrug mit freiem C-Terminus, die sich im gewünschten Zielort durch einen Antikörperanteil anreichern lässt und dort durch Proteolyse aktiviert wird, wird eine lokale Aktivierung des entsprechenden Liganden und damit des zu diesem korrespondierenden Rezeptors in vivo ermöglicht. Die Aktivierung erfolgt dabei durch zellassoziierte Proteasen, die insbesondere am gewünschten Zielort vorkommen. Die lokale Aktivität wird dann zum einen durch die Spezifität des verwendeten Antiköpers bedingt, zum anderen aber auch durch die bevorzugte Expression entsprechender Proteasen am Zielort.

Die (Aminosäuresequenz-)Regionen bzw. Module des erfindungsgemäßen Polypeptids werden nachstehend in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen im Einzelnen beschrieben.

Das erfindungsgemäße Polypeptid basiert auf einer neuartigen Prodrug-Technologie und ist ein Konstrukt, das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein rekombinantes Fusionsprotein ist, welches prinzipiell eine definierte Abfolge der folgenden Strukturelemente (im Monomer) umfaßt (N-terminal nach C-terminal): (1) ein spezifisch an die Region (4) bindendes und diese inaktivierendes Protein bzw. Peptid, (2) ein variables Linkerpeptid mit spezifischen Protease-Spaltstellen, (3) ein murines, humanisiertes oder humanes Einzelkettenantikörperfragment (scFv) definierter Anti genspezifität, bestehend aus V_H-Linker-V_L oder ein Peptid mit vergleichbarer Eigenschaft, und (4) einen Ligand der TNF-Familie, welcher beispielsweise dem Wildtyp-Ligand oder dessen extrazellulärer Domäne oder davon abgeleiteten biologisch aktiven Varianten entspricht.

Das Inhibitor-Modul (1) ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polypeptids ein Rezeptor bzw. dessen Ligandenbindungsdomäne für den Zytokinteil im Modul (4). Das Inhibitor-Modul weist bevorzugt mindestens eine Bindungsstelle für die therapeutisch wirksame Region (4) auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Inhibitor-Modul im Falle der Verwendung von FasL in Region (1) die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines humanen Fas-Rezeptors. Andere, spezifisch FasL bindende Proteine, beispielsweise Fas-Fragmente oder Fas anderer Spezies-Herkunft oder Proteine viralen Ursprungs sowie jeweils davon abgeleitete synthetische Peptide, die FasL-Bindungseigenschaft besitzen und mit der FasL-Bindung an Fas-Rezeptoren interferieren, sind ebenfalls geeignet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Zytokin-Rezeptor die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines Rezeptors der TNF-Rezeptorfamilie und/oder ein TNF-Ligand-bindendes Virus-Protein oder eine biologisch aktive Mutante dieser Domäne oder eine synthetische TNF-Ligand-bindende Verbindung. Aufgrund der Bindung bzw. Wechselwirkung des Inhibitors mit dem therapeutisch wirksamen Modul ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein in diesem Zustand biologisch inaktiv, d.h. es befindet sich in der Proform (Prodrug).

Das Prozessierungsmodul (2) ist beispielsweise Protease-sensitiv (d.h. die Prozessierungsstelle entspricht der Erkennungssequenz einer Protease) und vorzugsweise in Aminosäurezusammensetzung und Gesamtlänge derart beschaffen, daß es eine hochaffine, stabile Bindung des im Molekül N-terminal befindlichen Moduls (1), z.B. eines FasL-Inhibitors (z.B. die extrazelluläre Fas-Rezeptordomäne) an die Region (4), z.B. FasL erlaubt, so daß hierdurch die Bindung des Liganden-Anteils des Moduls (4) an die zu diesem Liganden korrespondierenden, zellexprimierten Rezeptoren in vivo verhindert wird. Das Prozessierungsmodul („Linker") ist weiterhin vor zugsweise derart beschaffen, daß er mindestens eine, vorzugsweise mehrere selektive Spaltstellen für solche extrazellulären oder zellassozierten Proteasen enthält, die vorzugsweise selektiv im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Beispiele für geeignete Spaltstellen sind diejenige für Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA), Gewebsplasminogenaktivator (tPA), den aktivierten Gerinnungsfaktor VIIa, Matrix-Metalloproteasen, wie MMP-2 und MMP-9, und für die hochselektiv im Stroma von Tumoren membranständig exprimierte FAP-Protease. Besonders bevorzugte Protease-sensitive Spaltstellen sind diejenige von mit dem Vorgang der Metastasierung und der Angiogenese in Verbindung stehenden Matrix-Metalloproteasen (z.B. MMP-9-Erkennungssequenz Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys), von Heparanase, von Enzymen, die bevorzugt in nekrotischen Läsionen auftreten, sowie von Enzymen, die mit Prostatakrebs assoziiert sind (z.B. PSMA, PSA, spaltbares Prozessierungsmodul Glutaryl-(4-hydroxypropyl)-Ala-Ser-cyclohexaglycyl-Gln-Ser-Leu-COOH). Die Struktur des Linkers wird derart gewählt, daß die Protease-Erkennungssequenz frei zugänglich ist, d.h. eine effektive Prozessierung durch spezifische Proteasen möglich ist, und nach Spaltung des Fusionsproteins ggf. an dem abgespaltenen Teil, der das therapeutisch wirksamen Modul enthält, verbleibende Aminosäuren des Linkers die Bioaktivität der therapeutisch wirksamen Region nicht negativ beeinflussen.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Polypeptid zusätzlich ein Trimerisierungsmodul zwischen dem Inhibitor-Modul (1) und dem Prozessierungsmodul (2) oder zwischen dem Prozessierungsmodul (2) und dem Targeting-Modul (3) auf. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Trimerisierungsmodul ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Peptid mit intrinsischen Trimerisierungseigenschaften. Ein besonders geeignetes Beispiel eines derartigen Peptids ist eine Domäne des Tenascin-Moleküls (AA 110-139, Swissprot #P10039, (Huhn) oder Swissprot #P24821 (Mensch)). Es gewährleistet die kovalente, homotrimere Verknüpfung des Fusionsproteins während der Biogenese und kann die Bindung des Inhibitor Moduls (1) an das therapeutisch wirksame Modul (4) verbessern. Die Liganden der TNF-Familie, insbesondere auch der FasL, haben intrinsische Trimerisierungseigenschaften. Eine optionale Trimerisierungsregion dient da her hauptsächlich dazu, Ligandentrimere zu stabilisieren. Wie wichtig eine Stabilisierung für den Erhalt der trimeren, potentiell aktiven Form ist, hängt vom Einzelfall ab.

Das Targeting-Modul (3) bindet vorzugsweise an ein Zelloberflächenmolekül, das in Tumorläsionen und/oder proliferierenden Endothelzellen, die mit dem Prozeß der Angiogenese assoziiert sind, exprimiert wird. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting-Modul (3) für eine Komponente der extrazellulären Matrix spezifisch, die in Tumorläsionen und/oder Angiogenesebereichen pathologischer Läsionen vorhanden ist. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting-Modul (3) für eine Komponente der malignen Tumorzelle selbst spezifisch. Vorzugsweise umfaßt die Region bzw. das Modul (3) einen Antikörper (z.B. murin, humanisiert oder human) oder ein Fragment davon, z.B. ein Fab-Fragment oder ein typisches, nach dem Stand der Technik hergestelltes Einzelkettenantikörperfragment (scFv) murinen, durch CDR-Grafting humanisierten oder vollständig humanen Ursprungs mit einer Spezifität für ein z.B. im Tumorgewebe vorzugsweise selektiv bzw. dominant exprimiertes Antigen, wobei dies prinzipiell auf den malignen Zellen selbst exprimiert sein kann, vorzugsweise aber im nicht-malignen Anteil des Tumors, den Stromazellen oder dem Tumorendothel, exprimiert wird. Derartige Antigene nicht-maligner Gewebeanteile eines soliden Tumors (Karzinoms) sind einerseits genetisch invariant, andererseits bei unterschiedlichsten Tumorentitäten vorkommend und damit universelle Tumormarker. Beispielsweise seien hier der VEGFR- bzw. der VEGFR/VEGF-Komplex (als Beispiel für Rezeptor-Liganden-Komplexe) sowie das Integrin αvβ3, das Endosialin und die Fibronektin-Isoform bFn als selektive Zielstrukturen des Tumorendothels und das sog. Fibroblast Activation Protein (FAP) als selektiver Marker für eine als Target dienende Komponente der extrazellulären Matrix, welche im Tumorstroma vorhanden ist, genannt, die beispielsweise mit spezifischen, hochaffinen scFv wirksam erfaßt werden können. Weitere Beispiele für geeignete Targeting-Module sind Peptide bzw. Proteindomänen, die z.B. natürlicherweise an eine Tumor- bzw. Tumorstroma- bzw. Tumorendothel-typische Struktur binden, aber auch artifizielle Antikörper und Spiegelmere.

Wie vorstehend ausgeführt, enthält das therapeutisch wirksame Modul (4) vorzugsweise eine Aminosäuresequenz eines Zytokins oder eines therapeutisch wirksamen Fragments davon. Vorzugsweise enthält die Region (4) die Aminosäuresequenz eines Liganden der TNF-Familie, vorzugsweise von FasL, mehr bevorzugt eines TNF-Liganden-Vorläuferproteins, vorzugsweise eines FasL-Vorläuferproteins, besonders bevorzugt von einem dem prozessierten, reifen Wildtyp-TNF-Liganden-Molekül identischen Protein oder davon abgeleiteten Derivaten oder Mutanten mit selektiven Rezeptorbindungseigenschaften oder Mutanten bzw. Derivaten, die hinsichtlich ihrer spezifischen Bioaktivität oder anderer Eigenschaften (Stabilität, Proteaseresistenz) optimiert wurden, und am meisten bevorzugt von einem dem prozessierten, reifen Wildtyp-FasL-Molekül identischen Protein, oder davon abgeleiteten Derivaten oder Mutanten mit selektiven Rezeptorbindungseigenschaften oder Mutanten bzw. Derivaten, die hinsichtlich ihrer spezifischen Bioaktivität oder anderer Eigenschaften (Stabilität, Proteaseresistenz) optimiert wurden.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann weitere Regionen umfassen. Beispielsweise können zur vereinfachten Reinigung des rekombinant hergestellten Proteins und der in vitro Analytik geeignete Markierungssequenzen angefügt werden. So kann das erfindungsgemäße Polypeptid z.B. am N-Terminus und/oder zwischen zwei benachbarten Regionen mindestens eine detektierbare Markierung aufweisen. Eine solche detektierbare Markierung kann ein „tag", z.B. zur Reinigung, sein, z.B. ein Flag tag.

Die erfindungsgemäß bevorzugte FasL-Prodrug ist ein nicht kovalent verknüpftes, homotrimeres Molekül oder, wenn eine entsprechende Trimersierungsregion eingefügt wurde, ein kovalent verknüpftes, homotrimeres Molekül, oder bei intermolekularer Wechselwirkung ein homohexameres Molekül bestehend aus der oben im Detail erläuterten Fusion von vier Funktionsregionen, dem tumorspezifischem Antikörpermodul (3), dem FasL-Modul (4) und dem blockierendem FasL-Bindeprotein (extrazelluläre Rezeptordomäne oder davon abgeleitetes Peptid)-Modul (1) sowie dem zwischen Modul (1) und Modul (3) liegenden spezifischen Protease-Spaltstellen Modul (2), welches in diesem kompletten Zustand in Bezug auf die FasL-Wirkung inaktiv ist.

Die FasL-Prodrug wird nach in vivo Verabreichung durch den Antikörper-Anteil zunächst spezifisch im Tumorareal angereichert und dort durch die vom Tumor selbst oder vom reaktiven Tumorstroma/Tumorgefäßsystem gebildete Proteasen (z.B. FAP, uPA, tPA, MMP2, Faktor VIIa) prozessiert, d.h. das inhibierende Modul/Peptid (1) wird abgespalten. Nach selektiver proteolytischer Spaltung dissoziiert das FasL-Rezeptor-Fragment/Inhibitorpeptid vom FasL-Modul (4), letzteres wird somit bioaktiv (d.h. die biologische Aktivität der Region wird durch Prozessierung der Prozessierungsstelle in Region (2) freigesetzt). Der derart prozessierte FasL bindet nun bevorzugt an zellständige Fas-Rezeptoren, da diese sich nicht durch Diffusion vom Bindungsort entfernen. Die Selektivität der FasL-Wirkung wird mit der erfindungsgemäßen FasL-Prodrug also durch zwei Maßnahmen erreicht: Einerseits über die Region (3)-vermittelte selektive Anreicherung der inaktiven Prodrug im Tumor und der Retention des biologisch aktiven Fragments, bestehend aus Region (3) und Region (4), auch nach proteolytischer Aktivierung und andererseits über die ortsspezifische Umwandlung des Prodrugs durch Proteasen, welche ausschließlich oder bevorzugt im Tumorareal in signifikanter Aktivität nachweisbar sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das CTL-Prodrug die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 auf.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert. Der Begriff „Nukleinsäure" bedeutet ein natives, halbsynthetisches, synthetisches oder modifiziertes Nukleinsäuremolekül aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 2 auf.

Desweiteren wird erfindungsgemäß ein Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind.

Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminationssequenzen usw. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand betrifft erfindungsgemäß eine Wirtszelle, enthaltend die vorstehend genannte Nukleinsäure und/oder den vorstehend genannten Vektor. Geeignete Wirtszellen sind beispielsweise alle Säugerzellen, insbesondere kultivierte Zellinien wie z.B. COS- oder CHO-Zellen.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, umfassend die Schritte

(a) des Züchtens der vorstehenden Wirtszelle in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen und
(b) des Isolierens des erfindungsgemäßen Polypeptids aus den Wirtszellen und/oder dem Kulturmedium.

Das erfindungsgemäße Polypeptid wird vorzugsweise durch Expression mit Hilfe von geeigneten Expressionssystemen, vorzugsweise als sezerniertes Produkt selektionierbarer, stabiler Transfektanden der Zellinie CHO DG44 oder nach transienter Expression in COS7-Zellen, hergestellt. Andere, dem Stand der Technik entsprechende eukaryontische Expressionssysteme, z.B. Pichia pastoris, Insekten- oder Säugerzellen, mit den für das jeweilige Zellsystem für Sekretion geeigneten Expressionsvektoren, werden z.B. in Brocks et al. (Immunotechnology 3:173-184,1997) für Säuger- und Insektenzellen beschrieben. pPICZalpha-Vektoren (INVITROGEN) zur Expression und Sekretion in der Hefe Pichia pastoris, sind ebenfalls geeignet.

Das erfindungsgemäße Polypeptid, die Nukleinsäure und/oder der Vektor kann (können) vorteilhafter Weise zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammenset zungen zur Behandlung krankhafter Störungen beispielsweise von Tumorerkrankungen in einem Individuum/Patient verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in pharmazeutisch wirksamer Menge das erfindungsgemäße Polypeptid und/oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder den erfindungsgemäßen Vektor, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln und/oder Trägern. Die pharmazeutische Zusammensetzung dient vorzugsweise zur therapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Infektionskrankheiten und/oder metabolischen Erkrankungen. Besonders bevorzugte Einsatzgebiete der pharmazeutischen Zusammensetzung sind die Behandlung solider Tumoren sowie die Angiogenese in pathologischen Läsionen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann jegliche im vorliegenden Fachgebiet als geeignet bekannte Form annehmen. Vorzugsweise ist sie fest, flüssig oder aerosolartig.

Die vorliegende Erfindung umfaßt somit ebenfalls ein Behandlungsverfahren, welches die Verabreichung einer therapeutisch ausreichenden Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen die Behandlung benötigenden Patienten einschließt. Geeignete Verabreichungswege der pharmazeutischen Zusammensetzung sind einem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die orale, intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, nasale, rektale und topische Applikation. Eine intravenöse Verabreichung kann z.B. in Form einer Bolusinjektion mit nachfolgenden Injektionsintervallen und/oder in Form einer Infusion durchgeführt werden. Mit der pharmeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können sowohl menschliche als auch tierische Patienten behandelt werden. Das Behandlungsverfahren wird bevorzugt bei Patienten mit den vorstehend genannten Erkrankungen angewendet.

Die Figuren zeigen:

1: Aufbau und Aktivität verschiedener FasL-Fusionsproteine.

1(a) zeigt die schematische Darstellung der Modulstruktur der monomeren Untereinheiten der verschiedenen FasL-Fusionsproteine. L, Leaderpeptid; Fas, extrazelluläre Domäne des Fas-Moleküls (bindet FasL); FasL, extrazelluläre Domäne des FasL; F, Flag-tag; PL, Linker mit Proteaseschnittstelle(n); SC40, single chain Fragment „40" (bindet FAP); TNC, Tenascin-Trimerisierungsregion. (1) L-F-FasL, löslicher Flag-getaggter FasL; (2) L-SC40-F-FasL, FAP-bindender löslicher FasL (= FasL-AMAIZE); (3) L-SC40-F-FasL-PL-Fas, FasL-Prodrug ohne freien FasL-C-Terminus (Aufbau analog zu TNF-Selektokin); (4) L-SC40-F-FasL-PL, FAP-bindender löslicher FasL mit C-terminalem PL-Rest, der dem durch Prozessierung verbleibenden Rest von L-SC40-F-FasL-PL-Fas entspricht; (5) L-Fas-PL-SC40-F-FasL, FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus; (6) L-Fas-PL-TNC-SC40-F-FasL, FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne, Variante 1; (7) L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL, FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne, Variante 2.

1(b) zeigt ein Schema der nativen Struktur von löslichem FasL (2) und FasL-Prodrug Fusionsproteinen mit freiem FasL C-Terminus in trimerer Anordnung (1) (intramolekulare Wechselwirkung der Fas und der FasL Module) und in hexamerer Anordnung (3) (intermolekulare Wechselwirkung der Fas und der FasL Module).

1(c) zeigt die Vitalität in % von HT1080-Zellen nach der Behandlung mit verschiedenen Prodrugs. HT1080-Zellen und FAP-exprimierende HT1080 Transfektanten wurden in 96-well Platten kultiviert und mit den angegebenen Konzentrationen der in „A" dargestellten Reagenzien über Nacht (üN) inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Zellvitalität bestimmt. Zur Sensitivierung der Zellen für die Fas-vermittelte Apoptose wurde CHX (2,5 μg/ml) zugegeben. Um die Effizienz der intra/intermolekularen Inhibition des FasL-Anteils durch die Fas-Region zu erfassen, wurden die Reagenzien durch sekundäre Aggregation mit einem anti-Flag mAb (M2) artifiziell aktiviert und auf FAP-negativen HT1080 Zellen analysiert. Ergebnis: Nur FasL-Prodrugs mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne werden effizient autoinhibiert und nach FAP-abhängiger Prozessierung aktiviert. Die FAP-abhängige Prozessierung der Prodrug ist in 4 gezeigt.

2: FasL-Prodrugs mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne aktivieren FAP-abhängig die nicht-apoptotische Fas-Signaltransduktion.

2 zeigt die relative IL-8-Produktion (vertikale Achse) in Abhängigkeit von der Prodrug-Konzentration [ng/ml] (horizontale Achse). HT1080-Zellen (A) und FAP-exprimierende HT1080 Transfektanten (B) wurden in 96-well Platten kultiviert und mit den auf der horizontalen Achse in ng/ml angegebenen Konzentrationen an anti-Flag quervernetztem L-F-FasL, L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL und anti-Flag quervernetztem L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL in für 6 h stimuliert. Dann wurde der IL8-Gehalt im Überstand mittels ELISA bestimmt. Ergebnis: Die FasL-Prodrug mit freien FasL-C-Terminus und TNC-Domäne ist autoinhibiert und induziert FAP-abhängig, Fas-vermittelt IL8. Die effiziente Autoinhibition der FasL-Prodrug, die sie von einem FasL-AMAIZE unterscheidet, folgt aus dem Umstand, daß die anti-Flag Quervernetzung auf FAP-negativen Zellen zu keiner IL8-Induktion führt. Die FAP-abhängige Prozessierung der Prodrug ist in 4 gezeigt.

3: Selektive Bindung von L-Fas-PL-TNC-SC40-F-FasL und L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL an Zellmembran-exprimiertes FAP.

3 zeigt die relative Zellzahl (vertikale Achse) gegen die logarithmische Intensität (horizontale Achse) von HT1080-Zellen (HT1080-wt) und FAP-transfizierten HT1080-Zellen (HT1080-FAP) nach der Inkubation mit verschiedenen Prodrugs (A-C). HT1080-Zellen und FAP-exprimierende HT1080 Transfektanten wurden mit den FasL-Prodrugs sowie L-SC40-F-FasL als Positivkontrolle inkubiert. Nach Waschen der Zellen wurden die verbleibenden Zell-gebundenen Moleküle mittels FITC-markiertem anti-Flag M2 durch FACS-Analysen nachgewiesen.

4: Endogene Matrix-Metalloproteasen (MMPs) vermitteln die Prozessierung und Aktivierung der FasL-Prodrug (L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL) auf FAP- exprimierenden HT1080 Zellen.

4(a) zeigt eine Western-Blot-Analyse von mit Prodrug inkubierten HT1080-Zellen. L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL wurde für 16 Stunden zu HT1080 und HT1080-FAP-Transfektanten gegeben. In einem Teil der Ansätze wurde zusätzlich der selektive MMP-Inhibitor Ilomastat zugegeben. Anschließend wurde der Mediumüberstand der Zellen gelelektrophoretisch aufgetrennt und anschließend im Western-Blot mittels anti-Flag analysiert.

4(b) zeigt die Vitalität in % von HT1080-Zellen nach der Behandlung mit verschiedenen Prodrugs. HT1080-FAP Zellen wurden mit den angegebenen Kombinationen der FasL-Prodrug (L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL), mit anti-FasL (NOK-1), anti-FAP (MB36) und Ilomastat über Nacht inkubiert. Dann wurde die Vitalität der Zellen bestimmt. – = Negativkontrolle, unbehandelte Zelten.

5: Kodierende DNA-Sequenz (oben) und Aminosäuresequenz (Einbuchstabencode, unten) eines erfindungsgemäßen Polypeptids „FasL Prodrug" der Modul-Struktur L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL.

6: Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids „FasL Prodrug" der Modul-Struktur L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL (SEQ ID Nr. 1).

7: DNA-Sequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids „FasL Prodrug" der Modul-Struktur L-Fas-TNC-PL-SC40-F-FasL (SEQ ID Nr. 2).

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids
Das mit einem N-terminalen Targeting-Modul versehene FasL-Modul wurde durch gentechnisches N-terminales Anhängen des ligandenbindenden Moduls des korrespondierenden Rezeptors Fas inhibiert, welches jedoch durch Tumor-assoziierte Proteasen abgespalten werden kann. Hierzu wurde das Rezeptorfragment mittels eines Linkers angehängt, der entsprechenden Schnittstellen enthält (1). Durch sein Targeting-Modul kann diese als L-Fas-TNC-PL-SC40-FasL bezeichnete FasL-Prodrug im Zielgebiet angereichert werden (3, 4(b)). Dieses FasL-Fusionsprotein wird FAP-abhängig prozessiert und somit aktiviert (1, 3, 4). Das aktivierte Fusionsprotein induziert Zelltod (1, 4(b)) bzw. nicht-apoptotische Fas vermittelte zelluläre Reaktionen, z.B. IL8- Produktion (2).
Beispiel 2: Eine nach dem Schema des TNF-Selektokins (WO 02/22833) aufgebaute FasL-Prodrug ist zwar prozessierbar aber nicht oder nur sehr wenig aktiv.
Das FasL-Modul wurde durch gentechnisches C-terminales Anhängen des ligandenbindenden Moduls des korrespondierenden Rezeptors Fas inhibiert, welches jedoch durch Tumor-assoziierte Proteasen abgespalten werden kann. Hierzu wurde das Rezeptorfragment mittels eines Linkers angehängt, der entsprechende Schnittstellen enthält. Durch ein N-terminates Antikörper-Targeting-Modul kann dieses als L-SC40-F-FasL-PL-Fas bezeichnete FasL-Fusionsprotein im Zielgebiet angereichert werden. Dieses FasL-Fusionsprotein wird nicht FAP-abhängig aktiviert (1(c)), obwohl eine Prozessierung stattfindet. Folgestudien zeigten, daß die kurzen C-terminalen Aminosäuren-Additionen, die nach Prozessierung am nativen C-Terminus des FasL verbleiben (wie im Konstrukt L-SC40-F-FasL-PL exemplarisch nachvollzogen), die Aktivität des FasL drastisch reduzieren (1(c)).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, umfassend von N- nach C-terminal (1) eine Region, welche die biologische Aktivität der Region (4) durch intramolekulare oder intermolekulare Bindung und/oder Wechselwirkung hemmt, (2) eine Region, die mindestens eine Prozessierungsstelle aufweist, (3) eine Region, die ein spezifisches Makromolekül auf einer Zelloberfläche und/oder eine Komponente der extrazellulären Matrix selektiv erkennt, und (4) eine Region mit einer biologischen Aktivität für ein spezifisches Zielmolekül, wobei die biologische Aktivität der Region (4) durch Prozessierung in vivo der mindestens einen Prozessierungsstelle in Region (2) freisetzbar ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Region (4) eine Aminosäuresequenz eines Zytokins oder ein Fragment davon enthält.
Polypeptid nach Anspruch 2, wobei das Zytokin ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, ein biologisch wirksames Derivat oder eine biologisch wirksame Mutante davon ist.
Polypeptid nach Anspruch 3, wobei das Zytokin Fas-Ligand (FasL), ein biologisch wirksames Derivat oder eine biologisch wirksame Mutante davon ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das spezifische Zielmolekül der Region (4) ein Zellmembran-gebundener Zytokinrezeptor ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mindestens eine Prozessierungsstelle in Region (2) eine Spaltstelle für eine Protease aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die Protease ein Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator (uPA), Gewebsplasminogen-Aktivator (tPA), aktivierter Gerinnungsfaktor VIIa, eine Matrix-Metalloprotease oder eine FAP-Protease ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Region (1) mindestens eine Bindungsstelle für die Region (4) aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 8, wobei die Region (1) ein Rezeptor für ein Zytokin oder ein Fragment davon ist.
Polypeptid nach Anspruch 9, wobei der Rezeptor die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines Rezeptors der TNF-Rezeptorfamilie und/oder ein TNF-Ligand-bindendes Virus-Protein oder eine biologisch aktive Mutante dieser Domäne oder eine synthetische TNF-Ligand-bindende Verbindung umfaßt.
Polypeptid nach Anspruch 10, wobei der Rezeptor die vollständige oder partielle extrazelluläre Domäne eines humanen Fas-Rezeptors und/oder ein FasL-bindendes Virus-Protein oder eine Mutante davon oder eine synthetische FasL-bindende Verbindung umfaßt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Polypeptid zwischen der Region (1) und der Region (2) oder zwischen der Region (2) und der Region (3) ein Trimerisierungsmodul aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 12, wobei das Trimerisierungsmodul ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Peptid mit intrinsischen Trimerisierungseigenschaften umfaßt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Polypeptid am N-Terminus und/oder zwischen zwei benachbarten Regionen mindestens eine detektierbare Markierung aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 14, wobei die detektierbare Markierung zwischen der Region (3) und der Region (4) liegt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Region (3) für ein Zelloberflächenmolekül spezifisch ist, welches in Tumorläsionen und/oder proliferierenden Endothelzellen, die mit dem Prozeß der Angiogenese assoziiert sind, exprimiert wird.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Region (3) für eine Komponente der extrazellulären Matrix spezifisch ist, die in Tumorläsionen, und/oder Angiogenesebereichen pathologischer Läsionen vorhanden ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Region (3) für eine Komponente der malignen Tumorzelle selbst spezifisch ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Region (3) ein muriner, humanisierter oder humaner Antikörper oder ein Fragment davon mit definierter Antigenspezifität ist.
Polypeptid nach Anspruch 19, wobei das Antikörperfragment ein scFv- oder Fab-Fragment ist.
Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 kodiert.
Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach Anspruch 21.
Vektor nach Anspruch 22, der zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zelle befähigt ist.
Wirtszelle, enthaltend die Nukleinsäure nach Anspruch 21 und/oder den Vektor nach Anspruch 22 oder 23.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 20, umfassend die Schritte (a) des Züchtens der Wirtszelle nach Anspruch 24 in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen und (b) des Isolierens des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 20 aus den Wirtszellen und/oder dem Kulturmedium.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend in pharmazeutisch wirksamer Menge das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und/oder die Nukleinsäure nach Anspruch 21 und/oder den Vektor nach Anspruch 22 oder 23, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln und/oder Trägern.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 zur therapeutischen Behandlung solider Tumoren und/oder der Angiogenese in pathologischen Läsionen eines Patienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 oder 27, die fest, flüssig oder aerosolartig ist.