MXPA03002229A - Proteina de fusion, a partir de un inhibidor de anticuerpos citosina-citosina (selectocina) para utilizarse como prodroga de blanco especifico. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un polipeptido que tiene de preferencia propiedades de citosina inmunomoduladoras y antitumorales, que pueden activarse mediante el procesamiento in vivo que comprende una region central con actividad biologica especifica. En su termino C de dicha region tiene una region con una unidad de procesamiento y un dominio inhibidor, mientras en el termino N de la region central, existe una region que reconoce selectivamente una macromolecula en una superficie celular o un componente de la matriz extracelular.

Description

PROTEÍNA DE FUSIÓN. A PARTIR DE UN INHIBIDOR DE ANTICUERPOS CITOSINA- CITOSINA (SELECTOCINA) PARA UTILIZARSE COMO PRODROGA DE BLANCO ESPECÍFICO La presente invención se refiere a un polipéptido que tiene de preferencia propiedades de citosina inmunomodulatoria y/o antitumorales, que pueden activarse mediante el procesamiento in vivo que comprende una región central con actividad biológica específica. En su término C, dicha región tiene una región con una unidad de procesamiento y un dominio Inhibidor, mientras en el término N de la región central, existe una región que reconoce selectivamente una macromolécula en una superficie celular o un componente de la matriz extracelular.

Hasta la fecha, ha sido posible exitosamente usar el factor de necrosis tumoral recombinante (TNF) y otras sustancias activas para el tratamiento de enfermedades de tumores, por ejemplo, solamente para Indicaciones muy limitadas (metástasis de sarcoma/melanoma de las extremidades) bajo protocolos de tratamiento complicados especiales (es decir, por medio de "perfusión de miembro aislado" supuesta), perteneciendo a varios efectos colaterales sistómicos severos que deben de estar de acuerdo como terapia limitante. A partir de estos datos clínicos puede estimarse que la eficiencia antitumoral requeriría una dosis de TNF de aproximadamente 10 a 100 veces más que el MTD (dosis máxima tolerada) que los efectos colaterales sistémicos masivos permitirían.

Además, el objeto de la presente invención es evitar o reducir las consecuencias no deseadas de un tratamiento con sustancias activas de polipóptido terapéuticamente activo tal como sustancias que contienen TNF, mientras al mismo tiempo se retiene o incluso se Intensifica el terapéuticamente activo, es decir, las propiedades antitumorales de la sustancia activa tal como TNF.

Este objeto se logra mediante las modalidades de la presente invención caracterizada en las reivindicaciones.

En particular, de conformidad con la invención un polipóptido con una secuencia de aminoácidos se hace disponible, que comprende desde el término N al C (1 ) una reglón que reconoce selectivamente una macromolécula especifica en una superficie celular y/o un componente de matriz extracelular, (2) una región que comprende un enlace péptldo, (3) una región con actividad biológica para una molécula blanco específica, (4) una región que caracteriza al menos un sitio de procesamiento y (5) una región que Inhibe la actividad biológica de la región (3) por el enlace intramolecular y/o interacción, en donde la actividad biológica de la reglón (3) pueda liberarse mediante el procesamiento in vivo de al menos un sitio de procesamiento en la región (4).

El polipóptido de conformidad con la Invención, también se refiere posteriormente como "selectocina", es una sustancia activa de construcción modular, de conformidad con una modalidad particularmente preferida, una proteína de fusión homotrimórica preferida con una citosina, de preferencia TNF o un derivado biológicamente activo o un mutante biológicamente activo, como una sustancia activa antltumoral o región (3) que libera su actividad biológica mediante unirse con otros cuatro módulos de función específicamente en el tejido enfermo, es decir, un área del tumor. Esto se logra mediante la unión del término N de la sustancia terapéuticamente activa, es decir, de la molécula TNF, con un módulo blanco (1 ) que es especifico para el tejido blanco, es decir, anticuerpos de tumor específicos o derivados de los mismos, tal como el anticuerpo scFv y por la unión del término C con un inhibidor (5) en contra de la sustancia terapéuticamente activa, en particular un inhibidor péptido, que es un dominio de enlace póptido (2), de preferencia un dominio trimerizaclón, que asegura la formación de los puentes de bisulfito covalente y además una homotrimerizaclópn estable y regular de la proteína de fusión.

Con la construcción de conformidad con la Invención, es posible lograr las concentraciones altas localmente activas de la sustancia terapéuticamente activa, es decir, el TNF, sin la ocurrencia de niveles sistémicamente elevados del agente terapéutico (es decir, TNF en el suero) y además los efectos colaterales de terapia limitantes. Al mismo tiempo, por ejemplo en el caso de TNF como un dominio terapéuticamente activo por el módulo blanco (es decir, anticuerpo) que media la presentación en el TNF activado (in situ) interno, un efecto se logra que corresponde a ese del TNF de la membrana natural, es decir, resulta en la co-activaclón de ambos tipos de receptor TNF y además la potenciación de las propiedades anti-tumorales del TNF, Mediante seleccionar la especificidad del módulo blanco, un agente terapéutico puede producirse que es igualada específicamente a/optimlzado para la entidad de tumor respectivo.

Las regiones o módulos (secuencias de aminoácidos) del pollpóptido de conformidad con la Invención se describen en detalle posteriormente con referencia de las modalidades preferidas.

El pollpóptido de conformidad con la invención (selectocina) hace disponible una tecnología de prodroga novedosa y se construye de conformidad a una modalidad preferida que comprende una proteína de fusión homotrlmótrica recombinante que en principio comprende una secuencia definida de los siguientes elementos estructurales (en el monómero) (término N al término C): (1 ) un murino, un fragmento del anticuerpo de cadena simple humano (scDv) de una especificidad del antlgeno definido de VH-enlace-VL; (2) un enlace póptido con propiedades de trlmerización Intrínsecas; (3) una molécula TNF que corresponde por ejemplo al TFN de tipo no cultivado o para el dominio extracelular del TNF (forma 17 kDa madura, AA 1-157, Swissprot #PO01375) o las variantes biológicamente activas del mismo; (4) un péptido de enlace variable con sitios de la separación de porteasa específicos, (5) un péptido o proteína específicamente de enlace TNF.

El módulo blanco (1 ) de preferencia es específico para una molécula de la superficie celular que se expresa en las lesiones tumorales y/o en las células endoteliales de proliferación asociadas con el proceso de la anglogónesis. De conformidad con otra modalidad preferida, el módulo blanco (1 ) es especifico para un componente de la matriz extracelular presente en las lesiones tumorales y/o las áreas de angiogénesis de las lesiones patológicas. De conformidad con una modalidad preferida adicional, el módulo blanco (1 ) es específico para un componente de la célula tumoral maligna por si misma. De preferencia la reglón o el módulo (1 ) comprende un anticuerpo (es decir, murino humano o humanizado) o un fragmento del mismo, es decir, un fragmento Fab o un fragmento del anticuerpo de cadena simple tipleo (scFv) producido de conformidad con el arte previo, de origen murino , completamente de origen humano o humanizado por el Injerto CD con especificidad para un antígeno expresado, es decir en el tejido del tumor, de preferencia, selectiva o dominantemente, por medio del cual este antígeno puede expresarse en el principio en las células malignas por si mismas, pero de preferencia expresado en la porción no maligna del tumor, las estroma o el endotelio del tumor. Dichos antlgenos de las porciones de tejidos no malignos de un tumor sólido (carcinoma) son por un lado genéticamente Invariables y por otro lado marcadores del tumor universal. Se hace en este documento la referencia, por ejemplo al complejo VEGFR o el complejo VEGFR7VEGF (como un ejemplo de los complejos ligando/receptor), asi como al integrin a?ß3, endosialin y la isoforma flrbonectina bFn como las estructuras blanco selectivas del endotelio del tumor y la protelna de activación de fibroblasto supuesta (FAP) como un marcador selectivo para un componente de la matriz extracelular presente en la estroma del tumor, que puede detectarse efectivamente por ejemplo con el svFv de alta afinidad específico. Otros ejemplos de los módulos blanco apropiados son péptldos, anticuerpos artificiales y ácidos nucleidos de imagen de espejo (Spiegelmers).

La región de enlace péptldo (2) de preferencia es un módulo de trimerizaclón y se conecta a la reglón blanco (1 ) con la región terapéuticamente activa (3). De conformidad con una modalidad particularmente preferida, el módulo de trlmerización comprende un póptido sintético o de ocurrencia natural con propiedades de trlmerización intrínsecas. Un ejemplo particularmente apropiado de dicho póptido es un dominio de la molécula tenasclna (AA 110-139, Swissprot #P10039, (pollo) o Swissprot #P24821 (humano)), Produce el enlace entre el módulo blanco (1 ) (es decir scFv) y el agente terapéutico (3) (es decir TNF) y simultáneamente asegura el enlace homotrimérico covalente do la proteína de fusión durante la biogénesis.

Como se explicó anteriormente, el módulo terapéuticamente activo (3) de preferencia contiene una secuencia de aminoácidos de una citosina o un fragmento terapéuticamente activo de la misma. De preferencia, la región (3) contiene la secuencia de aminoácidos de TNF, más preferiblemente de una protelna precursora TNF y más preferiblemente de una proteína idéntica a la molécula TNF de tipo sin procesar madura, procesada (AA 1-157, Swissprot #P01375) o los derivativos derivados de los mismos o mutantes con las propiedades de enlace del receptor selectivo o los mutantes o derivativos que se han optimizado con respecto a su bioactividad específica u otras propiedades (estabilidad, resistencia a la proteasa).

El módulo de procesamiento (4) es por ejemplo sensible a la proteasa (es decir, el sitio de procesamiento corresponde a la secuencia de reconocimiento de una Proteasa) y de preferencia su composición de aminoácido y la longitud total son tales que permite la homotrimerlzación de la protelna de fusión efectuada mediante el módulo de trimerlzación y el TNF por si mismo, pero simultáneamente también permite un enlace estable de alta afinidad del inhibidor TNF situado en el término C de la molécula (es decir, el dominio del receptor TNF extracelular) para la porción TNF, de manera que el módulo TNF para los receptores TNF expresados en las células se previene por estos medios. Además, el enlace de preferencia se constituye de manera que contenga al menos, de preferencia, varios sitios de separación selectiva para aquellas proteasas asociadas con las células o extracelulares que se detectan de preferencia selectivamente en el tejido del tumor. Los ejemplos de los sitios de separación apropiados son aquellos para el activador del plasminogen de tipo uroclnasa (uPA), el activador del plasminogen del tejido (tPA), el factor de coagulación activada Vlla, las metaloproteasas de matriz tales como MP-2 y MMP-9 y para la Proteasa FAP expresada membranosamente con alta selectividad en el estroma de los tumores. Los sitios de separación sensibles a la Proteasa particularmente preferida son aquellos metaloproteasas de matriz asociados con el proceso de dispersión metastástica y angiogónesis (es decir, la secuencia de reconocimiento MMP-9 Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys; SEC ID NO 18) de heparanasa de las enzimas que ocurren de preferencia en las lesiones necróticas y las enzimas asociadas con el cáncer de próstata (es decir PSMA, PSA, módulo de procesamiento de separación glutaril-(4-hidroxipropil)-Ala-Ser-clclohexagl¡c¡l-Gln-Ser-Leu-COOH). La estructura del enlace se selecciona de manera que la secuencia de reconocimiento de Proteasa es libremente accesible, es decir, un procesamiento efectivo mediante las proteasas especificas es posible y después de la separación de la protelna de fusión, los aminoácidos del enlace que pueden estar restantes en la molécula TNF no tienen un efecto adverso en la bioactlvldad de la región terapéuticamente activa.

De conformidad con una modalidad preferida del polipóptido de conformidad con la invención, el módulo inhibidor (5) es un receptor para una cltosina o un fragmento del mismo. Además, el módulo Inhibidor de preferencia caracteriza al menos un sitio de enlace para la región terapéuticamente activa (3). Cuando el TNF se usa en la región (3), el módulo Inhibidor de preferencia comprende el dominio extracelular parcial o completo de un receptor TNF humano, es decir huTNFRI (sinónimo con p55/60TNFR; Swissprot #P19438, AA 1 -90 o fragmentos de esta molécula, por ejemplo, AA, 1-157 o AA 60-120). Otras proteínas enlazan específicamente a TNF, por ejemplo, el dominio extracelular de huTNFR2 (banco de datos E BL # 32315) o las proteínas de origen viral tales como por ejemplo la protefna T2, asi como los péptidos sintéticos respectivamente derivados del mismo, que tienen la habilidad de enlazar al TNF e Interferir con el enlace TNF a los receptores TNF de la membrana celular, son asimismo apropiados. Debido al enlace u orientación del Inhibidor con el módulo terapéuticamente activo, la protelna de fusión de conformidad con la invención es biológicamente activa en este estado, es decir, es la forma pro (prodroga).

El polipóptido de conformidad con la invención puede incluir dominios adicionales. Por ejemplo, las secuencias de marcado apropiadas pueden agregarse para simplificar la purificación de las proteínas producidas por la recombinación y para simplificar el análisis in vltro. Además, es decir, una etiqueta myc-Hlse derivada del vector POPE puede agregarse al término C en la región (5), de preferencia al fragmento TNFR. Además el marcado de las secuencia se conoce por aquellos expertos en la técnica.

La selectocina TNF preferida de conformidad con la invención es una molécula homotrlmérlca covalentemente unida que consiste de la fusión de tres dominios de función explicados en detalle posteriormente, el módulo del anticuerpo especifico del tumor, el TNF y el bloqueo de la protelna de enlace TNF (dominio del receptor extracelular o del péptido derivado del mismo) as( como los enlaces funcionales Intermedios con las propiedades de trlmerización o los sitios de separación de proteasa específicos, que en este estado completo es inactivo tanto como está concernida la actividad TNF. Después de la administración in vivo, la selectocina primero se enriquece específicamente en el área del tumor por la porción del anticuerpo y se procesa ahí mediante las proteasas formadas por el tumor por si mismo o mediante el sistema vascular del tumor/estroma del tumor reactivo (es decir, FAP, uPA, tPA, MMP2, Factor Vlla), es decir, la inhibición del péptido (5) se separa aparte. Después de la separación proteolltlca selectiva, el péptido inhibidor/fragmento TNFR se disocia de la molécula TNF trimérica, la última además llega a ser bloactiva (es decir, la actividad biológica de la región se libera mediante procesar el sitio de procesamiento en la región (4)). El TNF procesado de esta manera ahora se enlaza respectivamente a los receptores TNF celulares, dado que estos como moléculas homomultimétlmerlcas tienen una afinidad considerablemente mayor que los fragmentos del receptor soluble monomérico. La selectivita de la actividad TNF por lo tanto se logra con la selectocina de conformidad con la invención por medio de dos mediciones: por un lado vía el enriquecimiento selectivo scFv-mediado de la prodroga inactiva en el tumor y su retención incluso después de la activación proteolltlca y por otro lado vía la conversión en sitio específica de la prodroga mediante las proteasas que pueden detectarse en actividad significante exclusivamente o de preferencia en el área del tumor. Además, una actividad preferencial adicional de la selectocina se logra mediante el enlace mediado por scFv del TNF a los antígenos de la membrana, a saber una actividad biológica mejorada comparada con la molécula TNF (soluble) convencionalmente usada, cuya actividad es similar a esa de la molécula TNF-membrana natural: debido a la fijación mediada scFv del TNF, el equilibrio de disociación en el TNFR2 se cambió hacia un enlace más estable y además su activación se logra. Se conoce que la activación simultánea de ambos TNFR puede conducir a un mecanismo de señales cooperativa y resulta en reacciones celulares estrechadas, en particular la activación de las células endotellales y la inducción de apoptosis en las células tumorales que en este respecto son resistentes al TNF (soluble) convenclonalmente usado.

Las modalidades particularmente preferidas del pollpóptido de conformidad con las secuencias de aminoácidos características de la Invención mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO ) y la Figura 5 (SEC ID NO 3).

Un objeto adicional de la presente invención para un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptldo de conformidad con la Invención. El término "ácido nucleico" denota una molécula de ácido nucleico modificada o sintética, semi-sintética, natural de deoxiribonucleótidos y/o ribonucleótldos y/o nucleótidos modificados. Las modalidades preferidas del ácido nucleico de conformidad con la invención contiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO 2) y la Figura 5 (SEC ID NO 4).

Además, un vector que contiene el ácido nucleico anteriormente definido se hace disponible de conformidad con la invención. El vector de preferencia es capaz de la expresión y/o la amplificación en una célula procarlótica y/o eucariótica. A este término, el vector de preferencia contiene elementos reguladores apropiados tales como promotores, mejoradores, terminación de secuencias, etc. El vector también puede usarse para la integración estable del ácido nucleico de conformidad con la invención dentro del material genético de una célula huésped.

Un objeto adicional se refiere de conformidad con la invención a una célula huésped que contiene el ácido nucleico anterior y/o el vector anterior. Las células huésped apropiadas, por ejemplo son todas células de mamífero tales como COS o células CHO.

La presente invención asimismo hace disponible un método para la producción del polipéptido de la invención, que comprende las etapas (a) cultivo de las célula huésped anterior en un medio de cultivo bajo las condiciones apropiadas y (b) aislamiento del polipéptido de la Invención de las células huésped y/o el medio de cultivo.

El polipéptido de conformidad con la invención se produce de preferencia mediante la expresión con la ayuda de los sistemas de expresión apropiados, de preferencia como el producto secretado de los transfectantes estables seleclonables de la linea celular CHO DG44 o después de la expresión transitoria en las células COS7. Otros sistemas de expresión eucariótica correspondientes al estado de la técnica son por ejemplo Pichia pastoris, células de mamífero o insectos con los vectores de expresión para la secreción apropiado para el sistema celular respectivo, es decir como se describió para las células de Insectos y de mamíferos en Brocas et al. (Inmunotecnología 3:173-184, 1997). Los vectores pPICZalpha (INVITROGEN) son asimismo apropiados para la expresión y la secreción en la levadura Pichia pastoris.

El polipéptido de conformidad con la Invención, el ácido nucleico y/o el vector pueden usarse ventajosamente para la producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades patológicas.

Un desarrollo adicional de la presente invención por lo tanto se refiere a una composición farmacéutica que contiene una cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con la invención y/o el ácido nucleico de conformidad con la invención y/o del vector de conformidad con la invención, opclonalmente combinado con uno o más agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables, dlluyentes y/o portadores. La composición farmacéutica de preferencia se usa para el tratamiento terapéutico de carcinosis y/o enfermedades infecciosas y/o enfermedades metabólicas. Los campos particularmente preferidos de la aplicación de la composición farmacéutica son el tratamiento de los tumores sólidos asi como la angiogénesis en las lesiones patológicas. La composición farmacéutica de conformidad con la invención puede tomar cualquier forma reconocida para ser apropiada en este campo profesional. De preferencia es sólido, líquido o en la forma de un aerosol.

La presente invención además asimismo comprende un método de tratamiento que Incluye la administración de una cantidad terapéuticamente adecuada de la composición farmacéutica de conformidad con la invención para un paciente en necesidad del tratamiento. Los modos apropiados de administración de la composición farmacéutica son conocidos por aquellos expertos en la técnica y comprenden por ejemplo oral, intravenosa, intra-arterial, Intramuscular, nasal, rectal y aplicación tópica. Una administración intravenosa puede llevarse a cabo por ejemplo, en la forma de una inyección de bolo con intervalos de inyección subsecuentes y/o en la forma de una Infusión. Ambos pacientes animales y humanos pueden tratarse con la composición farmacéutica de la presente invención. El método de tratamiento de preferencia se usa para pacientes con las enfermedades anteriormente mencionadas.

Las Figuras muestran: La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO 1 , superior) y la secuencia de nucleótido cADN correspondiente (SEC ID NO 2, inferior) de la prodroga selectocina W24 de conformidad con la invención.

La Figura 2 muestra representaciones fotográficas de un gel SDS-PAGE marcado con Coomassie (C) y de la hibridación Western (W) correspondiente después de la incubación con antl-c-myc-mAK 9E10. La prodroga W24 se expresó en las células CHO-DG44 y se purificaron por medio de IMAC. La protelna purificada se aplicó bajo reducción (red.) y también bajo condiciones no reductoras, en donde; T = trímero D = dímero M = monómero.

La Figura 3 es una representación fotográfica de un análisis de hibridación Western de un gel de SDS al 12% después de la detección con anti-c-myc-mAK 9E10. Ruta 1 : prodroga purificada W24 después de la incubación con PBS. Ruta 2: prodroga W24 purificada después de la Incubación con PBS más tPA, en donde: A = fragmento del receptor TNF.

La Figura 4 es una representación gráfica de los resultados de una prueba de inducción de apoptosis en las células Kym1 con la prodroga W24 activada con tripsina ( ¦ ) o la prodroga W24 no activada (T), en donde: B = ODB60 C = log[pW24] ng/µ? La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO 3, superior) y la secuencia de nucleótidos cADN correspondiente (SEC ID NO 4, Inferior) de la prodroga selectocina W33 de conformidad con la invención.

La Figura 6 (A) muestra representaciones fotográficas de un gel SDS-PAGE marcado con Coomasie y la hibridación Western correspndlente después de la incubación con anti-c-myc-mAK 9E10. La prodroga W32 (E) se expresó en las células CHO-DG44 y se purificó por medio de I AC. La protelna purificada se aplicó bajo reducción y también bajo condiciones no reductoras, (B) es una representación gráfica de los resultados para determinar el KD, apP- De laprodroga W32 con respecto al enlace FAP por medio del análisis FACS. Las células HT1080#33 positivas FAP (o) y las células de control HT negativas (·) se Incubaron con las diluciones en serie de la prodroga W32 y la porción de enlace celular se detectó por medio de la intensidad de Inmunofiuorescencia indirecta (D). La concentración de prodroga usada se muestra en contra de la intensidad de fluorescencia mediana (MFI).

La Figura 7 (A) es una representación gráfica de los resultados de una prueba de inducción de apoptosis en las células Kym1 con la prodroga no activada W32 ( ¦ ), la prodroga activada con tripsina W32 (?) o el tipo TNF sin tratar (·). Se muestra un representativo de tres experimentos. La representación fotográfica de un gel SDS-PAGE marcado con Coomassie bajo condiciones de reducción de la prodroga W32 purificada con IMAC (ruta Izquierda) y de la prodroga W32 purificada IMAC después de la activación tripsina (ruta derecha) se inserta. La flecha corresponde a la MW esperada de la prodroga W32 activada. (B) es una representación gráfica de los resultados de una prueba de inducción de apoptosis en las células Kym1 en un co-cultivo con la presentación de la prodroga, las células FAP-positivas (HT1080#33) así como con las células de control FAP negativas (HT1080). HT1080 + la prodroga no activada W32 (?), HT 080 + la prodroga W32 activada con tripsina W32 (?), HT1080#33 + la prodroga W32 no activada ( A ), HT1080#33 + prodroga W32 activada con tripsina ( ¦ ). (C) es una representación gráfica de un experimento correspondiente al mostrado en (B), pero la activación de tripsina tomó lugar solamente después del enlace a las células HT y la fijación subsecuente. HT1080 + prodroga W32 no activada (o), HT1080 + la prodroga W32 activada con tripsina (D), HT1080#33 + la prodroga W32 no activada (·), HT1080#33 + la prodroga W32 activada con tripsina (¦ ). En cada una de las representaciones gráficas de (B) y (C), se muestra un representativo de tres experimentos, en donde: F = reí. Señal (%).

La presente invención se explica en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Ejemplos de la secuencia de las selectoclnas TNF Los ejemplos de la secuencia de una selectocina TNF con múltiples sitios de separación múltiples en el enlace y los varios fragmentos del receptor: 1. scFv - TDtBna,cin -hu TNF (AA1-157)-enlace - huTNFRI (AA 1 -190). 2. scFv - TDtenaecm -hu TNF (AA1 -157)-enlace - huTNFRI (AA 60-120).

En otra variante, los sitios de separación endógenos potenciales en la molécula huTNF se remueven mediante el intercambio de aminoácidos (TNFmut 183F, R131 Q) mientras se mantiene la secuencia de enlace y la secuencia del receptor como se muestran anteriormente por medio de ejemplo.

Como el dominio de trlmerización, se usa el dominio de espiral embobinado del tenascln-C (AA 1 10-139), que se conserva altamente en varias especies: Ejemplo de la secuencia AA: Pollo: ACGCAAAPIVKDLLSRLEELEGLVSSLREQ (Swissprot #P 10039, SEC ID NO 5)* Humano: ACGCAAAPDVKELLSRLEELENLVSSLREQ (Swissprot #P24821 , SEC ID NO 6)# * Nies, D.E., Hemesath, T.J., Kim., Gulc er, J.R. y Stefansson, K. La secuencia completa cADN del hexabrachion humano (Tenascin). Se repite una protelna de multi-domlnio que contiene el factor de crecimiento epidérmico único. J. Biol. Chem. 266 (5), 2818-2823 (1991 ).

# Sprlng, J., Beck, K. y Chlquet-Enhrlsmann, R. Dos funciones coronarias del tenascin: disección de los sitios activos de los fragmentos de tenascin recombinantes. Célula 59 (2), 325-334 (1989).

Ejemplo 2: Secuencia del enlace Una secuencia de procesamiento de conformidad con la invención es por ejemplo un enlace con los sitios de separación de Proteasa para la trombina, tPA, Factor Vlla y uPA (secuencia de aminoácidos inferior, SEC ID NO 7; secuencia de nucleótldos cADN superior, SEC ID NO 8): TCCGGAATGTACCCCAGAGGATCGArCGGCGCCCCCTTCGGCCGCGG GCCCCCTTCGTACGCATC S G M Y P R G S I G A P F G R G A P F V R I I Tromblna ¡ I tPA I | FactorVIIa | GAGGGTCGGGTC E G R V | UPA I Ejemplo 3: Expresión, purificación y caracterización funcional de la prodroga de selectocina TNF W24 Prodroga W24 La prodroga W24 de selectocina TNF consiste de los siguientes componentes (del término N al C, los residuos de aminoácidos (AA) son relativos a la SEC ID NO 1 ): 1. AA 1-19: Secuencia de póptido conductor 2. AA 20-285: scFv OS4 (especificidad: FAP humano; cf. Mersmann (2000) Dissertation Universitat Stuttgart [Universidad de Stuttgart], Verlag Grauer, Stuttgart, ISBN 3-86186- 335-9; Rippmann 1999, Dissertation Universitat Stuttgart, ISBN 3-86186-2821 -6). 3. AA 286-315: Dominio de trimerizaclón de tenascin (pollo, ver lo anterior) AA 316-321 : Enlace. 4. AA 322-486: Forma mutada de la proteína precursora TNF humana natural (forma de la membrana kDa 26, Swissprot #P01375, 233 AA) con las omisiones del N-termlnal 56 AA y de AA 78-89 (????1-5ß, 78-ß?). es decir la omisión del dominio citoplásmlco, el dominio transmembrana y el sitio de separación TACE del polipóptido precursor TNF. 5. AA 487-512: Enlace con los sitios de separación de proteasa (cf. Ejemplo 2). 6. AA 513-639: Fragmento de TNFR1 humano que contiene los dominios extracelulares 1 -3 (Swissprot #P19438, AA 12-138; cf. Hlmmler et al. (1990) ADN y la Biología Celular 9, 705-715). 7. AA 640-652 myc tag. 8. AA 653-658 His tag.

La secuencia de aminoácidos (SEC ID NO 1 ) y la secuencia de ADN de codificación correspondiente (SEC ID NO 2) se mostró en la Figura 1 . El W calculado de la porción de protelna es 70.3 kDa.

Expresión y Purificación La prodroga W24 se purificó a partir del sobrenadante CHO por medio de IMAC de conformidad con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). En un gel SDS-PAGE marcado con Coomassie, 400 ng (20 µ?) de este se aplicó bajo las condiciones no reductores y reductores, 2 µ? se usó en la hibridación Western con un anti-c-myc-mAk 9E10; cf. Figura 2. La expresión de la construcción monomérica, dimórlca y trimérica se detectó.

Separación de la prodroga W24 por tPA La prodroga purificada W24 (600 ng) se incubó en PBS (50 µ?) se incubó en PBS (50 µ?) o en PBS + tPA (5 µg de tPA en 50 µ? de PBS) en 37° C por 16 horas. Después de 12% de SDS-PAGE (reducción) y la hibridación Western, la detección se llevó a cabo con anti-c-myc-mAk 9E10, seguido por el suero IgG anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. La apariencia de una banda debajo de 33 kDa en el nivel del tamaño esperado del fragmento TNFR de separación (aproximadamente 1 kDa), el término C del cual se lleva un tag myc en el lote con tPA muestra la digestión parcial de la prodroga W24; cf. Figura 3. La selectocina TNF activada no puede mostrarse con este método de detección.

Activación proteolltlca de la prodroga W24 mediante tripsina 20,000 kyml de las células en 50 µ? de medio de cultivo estándar (10 % de FCS) se colocaron el día previo en placas de 96 pocetas (valores de 4 veces) y el día siguiente se agregó una dilución de la prodroga W24 de 50 µ?. La activación de la tripsina de la prodroga W24 IMAC purificada (2 µg) se llevó a cabo en un volumen total de 50 µ? de PBS con una concentración final de 100 µ9/??? de tripsina. La reacción se detuvo después de 5 min. de incubación a temperatura ambiente con 200 µ? de RPMl/10% de FCS. La vitalidad se determinó después de 16 horas por marcado MTT. Los resultados muestran (Figura 4) que la selectocina TNF no procesada no tiene bioactlvldad (inducción a la apoptosls) más a una concentración de aproximadamente 2-3 µ?/Gp?, mientras la selectocina activada por la tripsina tiene una alta bioactividad especifica comparable al TNF tipo no procesado (LD50 = 0.5 ng/ml). La determinación del LD50 muestra un incremento de aproximadamente 4,000 veces en actividad debido al procesamiento.

Ejemplo 4: Prodroga W33 La construcción de la prodroga W33 tiene las misma propiedades funcionales como la prodroga W24 del Ejemplo 3, pero difiere de ella por un mayor enlace sensible a la proteasa (AA 487-520) y un fragmento TNFR más corto (AA 521 -582; Swissprot #P19438, AA 54-1 15 del TNFR1 humano; cf. Himmler et al. (1990) ADN y Biología celular 9, 705-715). La secuencia de aminoácidos (SEC ID NO 3) y la secuencia de codificación cADN (SEC ID NO 7) de la prodroga W33 se muestran en la Figura 5.

Ejemplo 5: Expresión, purificación y caracterización funcional de la prodroga selectocina TNF W32 Prodroga W32 Otra construcción (prodroga W32) se produjo que corresponde funcionalmente a la prodroga W24 del Ejemplo 3, pero contiene como módulo blanco (1 ) un fragmento de anticuerpo diferente (scFv M036), que se aisló Independientemente de una librería de gen Ig murino y se seleccionó para el FAP murlno/humano cruzando la reactividad. En contraste, la especificidad blanco de la prodroga W24 del Ejemplo 3 se basa en scFv OS4, que exclusivamente reconoce el FAP humano.

Caracterización bioquímica y actividad de enlace del antlgeno de la prodroga selectocina TNF W32 La prodroga W32 se expresó como construcción W24 (Ejemplo 3), purificada por medio de IMAC y analizada por SDS-PAG E/hibridación Western; cf. Figura 6A.

Además, el KD, ,??. de la prodroga W32 para el enlace FAP se determinó por medio del análi sis FACS; cf. Figura 6B. El KD, app. se calculó de la concentración en la cual la señal media máxima se obtuvo. Esto dio un valor de 2.4 x 10"10 .

Actividad TNF do la prodroga W32 En la prueba de apoptosis Kym-1 (cf. Ejemplo 3 para el procedimiento), la prodroga W32 activada tiene una actividad comparable al TNF de ocurrencia natural, puesto que la construcción no procesada desarrolla la actividad apoptótlca solamente en concentraciones mucho más altas; cf. Figura 7A.

Además, una Inducción de apoptosis juxtatrópica de la prodroga W32 activada se estudió en co-cultlvo con las células que presentan la prodroga. Para esto, las células de control HT1080 FAP negativas o las células HT1080#33 FAP positivas se incubaron con diluciones seriales de la prodroga o la prodroga activada con tripsina, se lavaron, fijaron, se co-cultivaron con Kym-1 y la vitalidad de las células se determinó después de 16 horas; cf. Figura 7B. En un experimento adicional con de otra manera lotes similares, la activación de tripsina de la prodroga tuvo lugar solamente después del enlace de las células y la fijación subsecuente de las células; cf. Figura 7C. En ambos casos se encontró una inducción de apoptosis juxtatrópica significante mediante la prodroga activada.

Ejemplo 6: Construcción de los pollpéptidos de la selectoclna W24 y W33 de conformidad con la invención Las proteínas de fusión se producen como sigue: 1 . El fragmento del anticuerpo de cadena sencilla (scFv) OS4 (referido posteriormente como OS4) es la versión del F19 FAP especifico humanizado por el transplante CDR (Rettlg et al. 1988) y descrito en Rippmann J.F. (Dissertation Univ. Stuttgart, Verlag Grauer, Stuttgart, 1999) asi como Rippmann et al. (App EnvMIcroblol 64:4862-4869, 1998), 2. En el vector de expresión eucariótico pG1 D105 (descrito en EP 0 953 639) con la cinta de expresión para la cadena de inmunoglobulina pesada de mAb F19, la última se intercambio por medio de BstE2 y Nae1 para la cinta OS4 de minicuerpo que consiste de scFv OS4; región de bisagra CH3 de un hulgGI ; myc/hls tag del plásmldo pW7 (descrito en Wüest, T., Dissertation Univ. Stuttgart, 2001 ). El fragmento Fe (región de bisagra y la reglón CH3 del lgG1 humano) se removió selectivamente por una digestión Not1/BamH1. 3. La secuencia cADN del dominio de trlmerlzaclón (es decir AA 1 10-139 de tenascin de pollo) se amplificó mediante la lectura de prueba PCR por medio del iniciador 1 (SEC ID NO 10) y (SEC ID NO 1 1 ), como un resultado del cual los sitios de penetración Not1 y Kpn1 se introdujeron. El fragmento TNF se amplificó por medio del iniciador 3 (SEC ID NO 12) y 4 (SEC ID NO 13) de un mutante TNF de membrana de no separación (membrana TNF, TNFdenta1-12, Grell et al., Cell 83:793-802, 1995), como un resultado del cual el sitio de separación Kpn1 se Introdujo en el extremo 5', los sitios de separación Acc3 y BamH1 se introdujeron en el extremo 3' y una secuencia de codificación para el enlace póptido TyrGIyGlyGlySer (SEC ID NO 9) se Introdujo entre los segmentos de secuencia de codificación para el tenascin y los dominios TNF, Los dos fragmentos se Insertaron dentro del intermediarlo de clonación digerido Not1/BamH1 descrito bajo 2, usando los sitios de separación Not1 , Kpn1 y BamH1. 4. La clonación del enlace sensible a la proteasa y al fragmento del receptor 1 TNF humano se llevó a cabo vía varios intermediarios. Para esto, el fragmento del receptor 1 TNF (dominios ricos en cisterna 1 -3; AA 12-138; Swissprot #10039) se amplificó con PCR con los iniciadores 5 (SEC ID NO 14) y 6 (SEC ID NO 15) del plásmido pADBTNF-R (Hlmmler et al. ADN Cell Blol 9:705-715, 1990) y se reampllflcó con los iniciadores 7 (SEC ID NO 16) y 6 (SEC ID NO 15) como un resultado del cual los sitios de separación Acc3, BamH1 y un enlace 5' del fragmento TNFR se [slc]lntroduJo a esos códigos para los sitios de separación de proteasa. Este fragmento se clonó vía los sitios de separación Acc3/BamH1 dentro del Intermediario descrito en 3. 5. Una modificación del enlace sensible a la proteasa en el fragmento TNFR1 del enlace se introdujo vfa la amplificación PCR con los Iniciadores 8 (SEC ID NO 17) y 6 (SEC ID NO 15). El fragmento obtenido además se insertó en los sitios de separación Cla1 y BamH1 dentro del Intermediario descrito bajo 4, reemplazando el fragmento TNFR del enlace previamente obtenido. El plásmido de la expresión eucariótica pW24 producido de esta manera permitió la expresión de la prodroga selectocina W24 TNF. 6. En una modalidad adicional de la prodroga selectocina TNF, un receptor TNF se amplifica PCR con los inciadores 9 y 10, resultando en una secuencia con un enlace 5' de codificación para AA 54-115 del TNFR1 humano. Este fragmento se insertó dentro del pW24 vía los sitios de penetración SaM y BamH1 y reemplaza el fragmento TNFR1 de enlace contenido en el mismo. El plásmido de expresión resultante pW33 permitió la expresión de la prodroga selectocina TNF W33. 7. Para obtener una prodroga selectocina TNF (W24 y W33), las células CHO-DG44 con las construcciones descritas bajo 5 y 6, se transfirieron con lipofectamina (Gibco-BRL) de conformidad con las instrucciones del fabricante y subsecuentemente seleccionados por medio de hipoxantina y timldlta libre (HT-) medio CHO-S-SFM (Life Technologies) para la Integración estable de las construcciones dentro del genoma. La expresión incrementada se obtuvo por un incremento por etapas del metotrexato del reactivo de selección (0.1 ; 1 ; 10 µ?). Ambos W24 y W33 se purificaron de los sobrenadantes de cultivo bajo condiciones estériles por medio de cromatografía de afinidad metálica Inmovilizada (IMAC) como se describió en Rlppmann et al. (Appl EnvMicrobiol 64:4862-4869, 1998) y se almacenaron a 4° C para uso adicional.

Todas las etapas de amplificación PCR se realizaron mediante procedimientos estándares comunes con los siguientes iniciadores. Todas las construcciones se secuenclaron para verificar su secuencia de ADN. Los sitios de penetración relevantes se Imprimieron en negritas.

Iniciador 1 (SEC ID NO 10) Not1 5' TAA ATA GGG GCC CAC AGC CAG GCG GCC GCC TGT GGC TGT GCG GCT GC 3' Iniciador 2 (SEC ID 1 1 ) Kpn1 5' ATA AAT GGT ACC CTG CTC CCG GAG GGA GGA 3' Iniciador 3 (SEC ID NO 12) Kpn1 5' GAG AGG GTA CCG GAG GTG GGT CTG GCC CCC AGA GGG AAG AG 3' Iniciador 4 (SEC ID NO 13) BamH1 Acc3 5' TTG TTC GGA TCC ACG ACC CTC GAT TCC GGA CAG GGC AAT GAT CCC AAAG 3' Iniciador 5 (SEC ID NO 14) BamH1 5' CTC GGG ATC CGG CGG TGG CAG ATC TGG CGG GGG TGG GGT CGA CAG TGT GTG TCC CCA AGG 3' Iniciador 6 (SEC ID NO 15) BamH1 5' CCT GCG GAT CCG GTG CAC ACG GTG TTC TG 3' Iniciador 7 (SEC ID NO 16) Acc3 Cla1 5' GCC TTC CGG AAT GTA CCC CAG AGG ATC GAT TGG TGG CAG ATC TGG CGG 3' Iniciador 8 (SEC ID NO 17) Cla1 5' AGT GGA TCG ATC GGC GCC CCC TTC GGC CGC GGC GCC CCC TTC GTA CGC ATC GAG GGT CGG GTC GAC AGT GTG TGT C 3"

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1 . Polipóptido con una secuencia de aminoácidos, comprendiendo desde el término N al término C (1 ) una región que reconoce selectivamente una macromolécula especifica en una superficie celular y/o un componente de la matriz extracelular, (2) una región que comprende un enlace péptldo; (3) una región con una actividad biológica para una molécula blanco específica, (4) una región que caracteriza al menos un sitio de procesamiento y (5) una región que inhibe la actividad biológica de la región (3) mediante la interacción y/o enlace Intramolecular, en donde la actividad biológica de la región (3) puede liberarse mediante el procesamiento in vivo de al menos un sitio de procesamiento en la reglón (4).

2. El polipóptido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la región (3) contiena una secuencia de aminoácidos de una citosina o un fragmento del mismo.

3. El polipóptido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la citosina es un factor de necrosis tumoral (TNF) o un derivado biológicamente activo o un mutante biológicamente activo del mismo.

4. El polipóptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula blanco especifica de la región (3) es un receptor de citosina de enlace de membrana celular,

5. El polipóptido de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, en donde la reglón (3) comprende residuos de aminoácido 322 a 486 de la SEC ID NO 1 .

6. El polipéptldo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos un sitio de procesamiento en la región (4) es un sitio de separación para una proteasa.

7. El polipéptldo de conformidad con la reivindicación 5, en donde la proteasa es un activador de tipo plasminogen uroclnasa (uPA), un activador plasminogen (tPA), el factor de coagulación activado Vlla, una metaloproteasa de matriz o una proteasa FAP.

8. El polipéptldo de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en donde la reglón (4) comprende residuos de aminoácidos 487 a 512 de la SEC ID NO 1 o residuos de aminoácido 487 a 520 de la SEC ID NO 3.

9. El polipéptldo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la reglón (5) tiene al menos un sitio de enlace para la reglón (3).

10. El polipéptldo de conformidad con la reivindicación 9, en donde la región (5) es un receptor para una citosina o un fragmento de la misma.

11 . El polipéptldo de conformidad con la reivindicación 10, en donde el receptor comprende el dominio extracelular parcial o completo de un receptor TNF humano y/o una protelna de virus de enlace TNF o un mutante del mismo o un compuesto de enlace TNF sintético.

12. El polipéptldo de conformidad con la reivindicación 1 1 , en donde la reglón (5) comprende residuos de aminoácidos 5 3 a 639 de la SEC ID NO 1 o residuos aminoácidos 521 a 582 de la SEC ID NO 3.

13. El pollpóptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el enlace póptido en la región (2) es un módulo de trlmerización y conecta la región (1 ) a la región (3).

14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, en donde el módulo de trimerización comprende un póptido sintético de ocurrencia natural con propiedades de trimerlzación intrínsecas.

15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, en donde la región (2) comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO 5 o la SEC ID NO 6.

16. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la región (1 ) es específica para una molécula de superficie celular que se expresa en lesiones tumorales y/o células endotellales de proliferación asociadas con el proceso de angiogénesls.

17. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la región (1 ) es específica para un componente de la matriz extracelular presente en las lesiones tumorales y/o las áreas de anglogónesis de las lesiones patológicas.

18. El polipéptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la región (1 ) es específica para un componente de la célula tumoral maligna del mismo.

19. El polipéptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la reglón (1 ) es un anticuerpo humano, murino o humanizado o un fragmento del mismo con la especificidad definida del antígeno.

20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 19, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento scFv o Fab.

21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, en donde la región (1 ) comprende residuos de aminoácido 20 a 285 de la SEC ID NO 1 .

22. El ácido nucleico que comprende una codificación de la secuencia de nucleótldos para el polipóptido de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 21 .

23. El vector que contiene el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22.

24. El vector de conformidad con la reivindicación 23, que es capaz de la expresión y/o la amplificación en una célula eucariótica y/o procariótica.

25. La célula que contiene el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22 y/o el vector de conformidad con la reivindicación 23 ó 24.

26. El método para la producción del polipóptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 21 , que comprende las etapas de (a) cultivación de la célula huésped de conformidad con la reivindicación 25 en un medio de cultivo bajo condiciones apropiadas y (b) aislamiento del polipóptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 21 de las células huésped y/o el medio de cultivo.

27. La composición farmacéutica que contiene una cantidad farmacéuticamente efectiva del polipóptido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 21 y/o del ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22 y/o el vector de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, opcionalmente combinado con uno o más agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables, diluyentes y/o portadores.

28. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27 para el tratamiento terapéutico de tumores sólidos y/o angiogénesis en las lesiones patológicas.