CN1891718A

CN1891718A - 融合免疫毒素ml－l－sec2和基因及其制备

Info

Publication number: CN1891718A
Application number: CN 200510046819
Authority: CN
Inventors: 徐明恺; 张成刚
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2005-07-06
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2007-01-10

Abstract

本发明涉及基因工程制药，具体的说是一种新型的抗人类表皮生长因子受体HER－2－金黄色葡萄球菌肠毒素C2融合免疫毒素ML－L－SEC2基因ml－l－sec2及其制备。其具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列和序列表SEQID No：2中蛋白序列。本发明以抗HER－2单链抗体作为靶向分子，以SEC2作为效应分子，经短肽连接构建成融合免疫毒素B－L－SEC2，并以表达载体pET－32a在大肠杆菌中高效表达融合免疫毒素蛋白。该融合免疫毒素可特异性识别结合HER－2受体过表达的癌细胞，并对其产生特异性细胞抑制作用。

Description

融合免疫毒素ML-L-SEC2和基因及其制备

技术领域

本发明涉及基因工程制药，具体的说是一种新型的抗人类表皮生长因子受体HER-2—金黄色葡萄球菌肠毒素C2融合免疫毒素ML-L-SEC2基因ml-l-sec2及其制备。

背景技术

免疫毒素是在现代医学生物学发展的基础上提出的一种新的治疗策略，现已广泛应用于肿瘤治疗。融合免疫毒素是由靶向分子和细胞毒性分子结合而成的产物，抗体或基因工程抗体可变区片段常作为靶向分子，近年来单链抗体片段(Single Chain Variable Fragment，scFv)因其分子量小、肿瘤穿透力强、血液清除快和半衰期短等特点而被广泛的应用于药物靶向载体的研究。

人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-2，HER-2)是一种肿瘤相关抗原，在乳腺癌和卵巢癌患者中有25-30％的过表达，并且其过表达与患者的不良预后相关。HER-2受体表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤靶向治疗的合适靶点。目前，以抗HER-2单链抗体作为导向载体对HER-2过表达的肿瘤进行靶向性治疗已经成为研究热点。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)属于C类肠毒素家族中的第二亚型。作为一种超抗原，在极低浓度时，即能与主要组织相容性复合体二类分子(MHCII)结合，刺激大部分有T细胞受体Vβ(TCRVβ)序列的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子如IL-2，IFN-γ，和TNF等，在体外和体内产生极强的肿瘤抑制作用。在国内，SEC2已经应用于临床肿瘤治疗并取得了良好的治疗效果。然而MHCII类分子主要表达于正常的人体细胞，而肿瘤组织中表达量很少，这使SEC2的肿瘤治疗缺乏特异性而产生副反应。因此寻找一种合适的可将SEC2靶向性导向肿瘤细胞的转运载体对于SEC2的肿瘤治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合免疫毒素ML-L-SEC2和基因及其制备，本发明以抗HER-2单链抗体作为靶向分子，以SEC2作为效应分子，经短肽连接构建成融合免疫毒素B-L-SEC2，并以表达载体pET-32a在大肠杆菌中高效表达融合免疫毒素蛋白。该融合免疫毒素可特异性识别结合HER-2受体过表达的癌细胞，并对其产生特异性细胞抑制作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

融合免疫毒素ML-L-SEC2，具有序列表SEQ ID No：2中蛋白序列。

融合免疫毒素ML-L-SEC2基因，具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。

所述融合免疫毒素ML-L-SEC2基因的制备，是将人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9(具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列)和金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因sec2通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接，所得到的融合免疫毒素基因具有序列表SEQ IDNo：1中碱基序列；

所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为，

GGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGAATTC；

所述金黄色葡萄球菌肠毒素C2具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

本发明具有以下优点：

1.本发明构建了新型的融合免疫毒素基因，其为人工制备的新基因，属首次制得的融合基因；其引入的连接序列保证抗体片段和肠毒素分子各自的生物学活性。

2.引用本发明，可进一步提供直接用于生产ML-L-SEC2融合免疫毒素的工程菌株。

3.该融合免疫毒素可激活肌体免疫反应，在HER-2受体过表达的肿瘤细胞周围对该肿瘤产生杀伤作用；消除全身给药引起的副反应，为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。

4.融合免疫毒素分子的大小是抗体分子的1/3，克服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，抗肿瘤的作用更为明显。

附图说明

图1为人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中：1为ml3.9的PCR扩增产物，2为DL2000DNA分子量标准；

图2为SEC2基因sec2的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中：1为DL2000DNA分子量标准，2为sec2的PCR扩增产物；

图3为融合免疫毒素表达载体pET-32a-ml-l-sec2的双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中1为DL15000DNA分子量标准，2为pET-32a-ml-l-sec2的NcoI和XhoI双酶切验证，3为pET-32a-ml-l-sec2的NcoI和NotI双酶切验证，4为pET-32a-ml-l-sec2的EcoRI和XhoI双酶切验证，5为DL 2000DNA分子量标准；

图4为融合免疫毒素的大肠杆菌异源表达SDS-PAGE电泳图，其中：1为诱导的融合免疫毒素的全细胞表达，2为诱导的融合免疫毒素的可溶性表达，3为诱导的融合免疫毒素的包涵体表达，4为蛋白分子量标准(由上至下分别为116，66，45，35，25，18，14KD)，5为诱导的pET-32a空载体；

图5为表达的融合免疫毒素的蛋白免疫印记检测图，其中：1为预染的蛋白分子量标准，2为融合免疫毒素的蛋白免疫印记检测结果。

具体实施方式

实施例1

一种人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9具有序列表SEQ ID No：3中碱基序列。

ATGGCCCAGG TGCAGCTGGT GCAGTCTGGG GCAGAGGTGA AAAAGCCCGG 50

GGAGTCTCTG AAGATCTCCT GTAAGGGTTC TGGATACAGC TTTACCAGCT 100

ACTGGATCGC CTGGGTGCGC CAGATGCCCG GGAAAGGCCT GGAGTACATG 150

GGGCTCATCT ATCCTGGTGA CTCTGACACC AAATACAGCC CGTCCTTCCA 200

AGGCCAGGTC ACCATCTCAG TCGACAAGTC CGTCAGCACT GCCTACTTGC 250

AATGGAGCAG TCTGAAGCCC TCGGACAGCG CCGTGTATTT TTGTGCGAGA 300

CATGACGTGG GATATTGCAG TAGTTCCAAC TGCGCAAAGT GGCCTGAATA 350

CTTCCAGCAT TGGGGCCAGG GCACCCTGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG 400

GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC TCTGGCGGTG GCGGATCGCA GTCTGTGTTG 450

ACGCAGCCGC CCTCAGTGTC TGCGGCCCCA GGACAGAAGG TCACCATCTC 500

CTGCTCTGGA AGCAGCTCCA ACATTGGGAA TAATTATGTA TCCTGGTACC 550

AGCAGCTCCC AGGAACAGCC CCCAAACTCC TCATCTATGA TCACACCAAT 600

CGGCCCGCAG GGGTCCCTGA CCGATTCTCT GGCTCCAAGT CTGGCACCTC 650

AGCCTCCCTG GCCATCAGTG GGTTCCGGTC CGAGGATGAG GCTGATTATT 700

ACTGTGCCTC CTGGGACTAC ACCCTCTCGG GCTGGGTGTT CGGCGGAGGA 750

ACCAAGCTGA CCGTCCTAGG TGCG 774

(1)SEQ ID No：3的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：774碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9。

(2)人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9的制备上游引物V-F：5’-TTA T CC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAGTCT-3’；

下游引物V-R：5’-TTC T GC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTTGGTC-3’，

横线所示为添加的酶切位点，上下游分别为NcoI和NotI。

PCR反应体系为：10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板含scFv-ml的质粒DNA 0.1μg、Pyrobest DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。

PCR反应条件为：

第一阶段95℃，5分钟；

第二阶段94℃，50秒；55℃，50秒；72℃，90秒；共30个循环；

第三阶段72℃，10分钟；

(3)PCR产物的回收：PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见附图1所示)，切下大小为770bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；

(4)回收后产物的双酶切：回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶NcoI和NotI充分消化，消化产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收。

实施例2

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因sec2，源于金黄色葡萄球菌，具有序列表SEQ ID No：5中碱基序列。

GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGTTGCACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAATATGAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAGCAACTAAAGTTATGTCTGTAGATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTATAACATTAGTGATAAAAAACTAAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGAGTTATTAAATGAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATGAAGTAGTTGATGTGTATGGATCAAATTACTATGTAAACTGCTATTTTTCATCCAAAGATAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGGTAAAACTTGTATGTATGGAGGAATAACAAAACATGAAGGAAACCACTTTGATAATGGGAACTTACAAAATGTACTTATAAGAGTTTATGAAAATAAAAGAAACACAATTTCTTTTGAAGTGCAAACTGATAAGAAAAGTGTAACAGCTCAAGAACTAGACATAAAAGCTAGGAATTTTTTAATTAATAAAAAAAATTTGTATGAGTTTAACAGTTCACCATATGAAACAGGATATATAAAATTTATTGAAAATAACGGCAATACTTTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACCAATCTAAATATTTAATGATGTACAACGACAATAAAACGGTTGATTCTAAAAGTGTGAAGATAGAAGTCCACCTTACAACAAAGAATGGA

(1)SEQ ID No：5的信息(参见序列表)

(A)序列特征

*长度：717碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：金黄色葡萄球菌

(2)SEC2基因sec2的制备

上游引物sec2-F：5’-TCT GAA TTC GAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’

下游引物sec2-R：5’-ATA CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’

横线所示为添加的酶切位点，上下游分别为EcoRI和XhoI。

PCR反应体系为：10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板含sec2的质粒DNA 0.1μg、PyrobestDNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。

PCR反应条件为：

第一阶段95℃，5分钟；

第二阶段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，90秒；共30个循环；

第三阶段72℃，10分钟；

(3)PCR产物的回收：PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见附图2所示)，切下大小为720bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；

(4)回收后产物的双酶切：回收后的PCR产物经限制性核酸内切酶EcoRI和XhoI充分消化，消化产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，再次胶回收。

实施例3

编码连接短肽的DNA Linker序列，具有如下碱基序列(寡聚核苷酸链)：

GGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGAATTC

(1)DNA Linker序列基因的制备

1)DNA Linker序列基因的设计合成：

设计并合成两条寡聚核苷酸链：

正向链L-F：5’- G GCC GCA AGC GGC TCA GGA TCT GGA TCA GGA TCTGGC G-3’；

反向链L-R：5’- AA TTC GCC AGA TCC TGA TCC AGA TCC TGA GCCGCT TGC-3’

上下游分别添加NotI和EcoRI粘末端，所编码的甘氨酸丝氨酸短肽为(GS)₂序列。

2)寡聚核苷酸链的退火：

10×退火杂交缓冲液(SSC)成分：1.5mol/L NaCl，0.3M柠檬酸三钠·2H₂O，以HCl调pH至7.0；

退火反应体系：10×SSC buffer 1μl，正反寡聚核苷酸链各5pmol，无菌超纯水补齐体积至10μl；

退火反应条件：94℃ 10min；0℃ 10min；72℃ 20min

实施例4融合免疫毒素基因具有序列表SEQ ID No：1的碱基序列。

ATGGCCCAGG TGCAGCTGGT GCAGTCTGGG GCAGAGGTGA AAAAGCCCGG 50

GGAGTCTCTG AAGATCTCCT GTAAGGGTTC TGGATACAGC TTTACCAGCT 100

ACTGGATCGC CTGGGTGCGC CAGATGCCCG GGAAAGGCCT GGAGTACATG 150

GGGCTCATCT ATCCTGGTGA CTCTGACACC AAATACAGCC CGTCCTTCCA 200

AGGCCAGGTC ACCATCTCAG TCGACAAGTC CGTCAGCACT GCCTACTTGC 250

AATGGAGCAG TCTGAAGCCC TCGGACAGCG CCGTGTATTT TTGTGCGAGA 300

CATGACGTGG GATATTGCAG TAGTTCCAAC TGCGCAAAGT GGCCTGAATA 350

CTTCCAGCAT TGGGGCCAGG GCACCCTGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG 400

GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC TCTGGCGGTG GCGGATCGCA GTCTGTGTTG 450

ACGCAGCCGC CCTCAGTGTC TGCGGCCCCA GGACAGAAGG TCACCATCTC 500

GTGGTGTGGA AGGAGGTCCA AGATTGGGAA TAATTATGTA TGGTGGTACG 550

AGCAGCTCCC AGGAACAGCC CCCAAACTCC TCATCTATGA TCACACCAAT 600

CGGCCCGCAG GGGTCCCTGA CCGATTCTCT GGCTCCAAGT CTGGCACCTC 650

AGCCTCCCTG GCCATCAGTG GGTTCCGGTC CGAGGATGAG GCTGATTATT 700

ACTGTGCCTC CTGGGACTAC ACCCTCTCGG GCTGGGTGTT CGGCGGAGGA 750

ACCAAGCTGA CCGTCCTAGG TGCGGCCGCA AGCGGCTCAG GATCTGGATC 800

AGGATCTGGC GAATTCGAGA GTCAACCAGA CCCTACGCCA GATGAGTTGC 850

ACAAATCAAG TGAGTTTACT GGTACGATGG GTAATATGAA ATATTTATAT 900

GATGATCATT ATGTATCAGC AACTAAAGTT ATGTCTGTAG ATAAATTTTT 950

GGCACATGAT TTAATTTATA ACATTAGTGA TAAAAAACTA AAAAATTATG 1000

ACAAAGTGAA AACAGAGTTA TTAAATGAAG ATTTAGCAAA GAAGTACAAA 1050

GATGAAGTAG TTGATGTGTA TGGATCAAAT TACTATGTAA ACTGCTATTT 1100

TTCATCCAAA GATAATGTAG GTAAAGTTAC AGGTGGTAAA ACTTGTATGT 1150

ATGGAGGAAT AACAAAACAT GAAGGAAACC ACTTTGATAA TGGGAACTTA 1200

CAAAATGTAC TTATAAGAGT TTATGAAAAT AAAAGAAACA CAATTTCTTT 1250

TGAAGTGCAA ACTGATAAGA AAAGTGTAAC AGCTCAAGAA CTAGACATAA 1300

AAGCTAGGAA TTTTTTAATT AATAAAAAAA ATTTGTATGA GTTTAACAGT 1350

TCACCATATG AAACAGGATA TATAAAATTT ATTGAAAATA ACGGCAATAC 1400

TTTTTGGTAT GATATGATGC CTGCACCAGG CGATAAGTTT GACCAATCTA 1450

AATATTTAAT GATGTACAAC GACAATAAAA CGGTTGATTC TAAAAGTGTG 1500

AAGATAGAAG TCCACCTTAC AACAAAGAAT GGA 1533

(1)SEQ ID No：1的信息(参见序列表)

(A)序列特征

*长度：1533碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：CDNA

(C)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工序列

(2)融合基因的制备

将退火后的linker片段、经NcoI和NotI双酶切的scFv-ml片段、经EcoRI和XhoI双酶切的sec2片段和经NcoI和XhoI双酶切的pET-32a片段按摩尔比例为3∶3∶3∶1的比例混合，以T4DNA连接酶16℃连接，构建融合免疫毒素表达载体pET-32a-ml-l-sec2。连接产物转化E.coli AD494(DE3)感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约JohnWiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，以100μg/ml的氨卞青霉素和15μg/ml的卡那霉素抗性筛选转化子。

(3)融合基因的验证

将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA(质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，经双酶切鉴定(参见附图3所示)，并以鉴定正确的重组克隆质粒为模板，用T7启动子和终止子为引物，以Sanger双脱氧末端终止法测序证实。

实施例5融合免疫毒素的表达及活性鉴定

(1)融合免疫毒素的表达：接种转化了pET-32a-ml-l-sec2质粒的AD494(DE3)单菌落于含100μg/ml的氨卞青霉素和15μg/ml的卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1％接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG，30℃诱导表达6小时。离心收集菌体，以5×上样缓冲液处理(缓冲液配方和处理方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P81和P87)，12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析表达产物。

(2)融合免疫毒素的生物学活性：以蛋白免疫印记法鉴定表达的融合免疫毒素的免疫原性：将异源表达的融合免疫毒素蛋白以SDS-PAGE分离，半干转膜仪转至硝酸纤维膜，2％脱脂牛奶封闭，以兔抗SEC2抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体依次处理，NBT/BCIP显色试剂盒显色。(所用缓冲液和具体操作方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P166)。

结果：在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带，诱导蛋白分子量约为72kD(参见附图4所示)。该融合免疫毒素可被抗SEC2抗体特异性识别结合(参见附图5所示)，保持了原SEC2蛋白的免疫原性。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院沈阳应用生态研究所

<120>融合免疫毒素ML-L-SEC2和基因及其制备

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1533

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1533)

<223>

<400>1

atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag ccc 48

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1 5 10 15

ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc 96

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

agc tac tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag 144

Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

tac atg ggg ctc atc tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac agc ccg 192

Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro

50 55 60

tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gtc gac aag tcc gtc agc act 240

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr

65 70 75 80

gcc tac ttg caa tgg agc agt ctg aag ccc tcg gac agc gcc gtg tat 288

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc agt agt tcc aac tgc gca 336

Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala

100 105 110

aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc 384

Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc 432

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

gga tcg cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca 480

Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro

145 150 155 160

gga cag aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg 528

Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly

165 170 175

aat aat tat gta tcc tgg tac cag cag ctc cca gga aca gcc ccc aaa 576

Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys

180 185 190

ctc ctc atc tat gat cac acc aat cgg ccc gca ggg gtc cct gac cga 624

Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pr0 Asp Arg

195 200 205

ttc tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg 672

Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly

210 215 220

ttc cgg tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gcc tcc tgg gac tac 720

Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr

225 230 235 240

acc ctc tcg ggc tgg gtg ttc ggc gga gga acc aag ctg acc gtc cta 768

Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250 255

ggt gcg gcc gca agc ggc tca gga tct gga tca gga tct ggc gaa ttc 816

Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Phe

260 265 270

gag agt caa cca gac cct acg cca gat gag ttg cac aaa tca agt gag 864

Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu

275 280 285

ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat 912

Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr

290 295 300

gta tca gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat 960

Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp

305 310 315 320

tta att tat aac att agt gat aaa aaa cta aaa aat tat gac aaa gtg 1008

Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val

325 330 335

aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa 1056

Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu

340 345 350

gta gtt gat gtg tat gga tca aat tac tat gta aac tgc tat ttt tca 1104

Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser

355 360 365

tcc aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat 1152

Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr

370 375 380

gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta 1200

Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu

385 390 395 400

caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 1248

Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser

405 410 415

ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca gct caa gaa cta gac 1296

Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp

420 425 430

ata aaa gct agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt 1344

Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe

aac agt tca cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac 1392

Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn

450 455 460

ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt 1440

Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe

465 470 475 480

gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat 1488

Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp

485 490 495

tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca aag aat gga 1533

Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly

500 505 510

<210>2

<211>511

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1 5 10 15

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro

50 55 60

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala

100 105 110

Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly

165 170 175

Ash Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys

180 185 190

Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly

210 215 220

Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr

225 230 235 240

Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250 255

Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Phe

260 265 270

Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu

275 280 285

Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr

290 295 300

Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp

305 310 315 320

Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val

325 330 335

Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu

340 345 350

Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser

355 360 365

Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr

370 375 380

Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu

385 390 395 400

Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser

405 410 415

Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp

420 425 430

Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe

435 440 445

Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn

450 455 460

Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe

465 470 475 480

Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp

485 490 495

Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly

500 505 510

<210>3

<211>774

<212>DNA

<213>人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(774)

<223>

<400>3

atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aaa aag ccc 48

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1 5 10 15

ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc 96

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

agc tac tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag 144

Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

tac atg ggg ctc atc tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac agc ccg 192

Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro

50 55 60

tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gtc gac aag tcc gtc agc act 240

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr

65 70 75 80

gcc tac ttg caa tgg agc agt ctg aag ccc tcg gac agc gcc gtg tat 288

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc agt agt tcc aac tgc gca 336

Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala

100 105 110

aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc 384

Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc 432

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

gga tcg cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct gcg gcc cca 480

Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro

145 150 155 160

gga cag aag gtc acc atc tcc tgc tct gga agc agc tcc aac att ggg 528

Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly

165 170 175

aat aat tat gta tcc tgg tac cag cag ctc cca gga aca gcc ccc aaa 576

Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys

180 185 190

ctc ctc atc tat gat cac acc aat cgg ccc gca ggg gtc cct gac cga 624

Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg

195 200 205

ttc tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg 672

Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly

210 215 220

ttc cgg tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gcc tcc tgg gac tac 720

Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr

225 230 235 240

acc ctc tcg ggc tgg gtg ttc ggc gga gga acc aag ctg acc gtc cta 768

Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250 255

ggt gcg 774

Gly Ala

<210>4

<211>258

<212>PRT

<213>人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9

<400>4

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1 5 10 15

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro

50 55 60

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala

100 105 110

Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly

165 170 175

Ash Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys

180 185 190

Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly

210 215 220

Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr

225 230 235 240

Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250 255

Gly Ala

<210>5

<211>717

<212>DNA

<213>Staphylococcus aureus

<220>

<22l>CDS

<222>(1)..(717)

<223>

<400>5

gag agt caa cca gac cct acg cca gat gag ttg cac aaa tca agt gag 48

Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu

1 5 10 15

ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat 96

Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr

20 25 30

gta tca gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat 144

Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp

35 40 45

tta att tat aac att agt gat aaa aaa cta aaa aat tat gac aaa gtg 192

Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val

50 55 60

aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa 240

Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu

65 70 75 80

gta gtt gat gtg tat gga tca aat tac tat gta aac tgc tat ttt tca 288

Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser

85 90 95

tcc aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat 336

Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr

100 105 110

gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta 384

Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu

115 120 125

caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 432

Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser

130 135 140

ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca gct caa gaa cta gac 480

Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp

145 150 155 160

ata aaa gct agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt 528

Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe

165 170 175

aac agt tca cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac 576

Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn

180 185 190

ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt 624

Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe

195 200 205

gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat 672

Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp

210 215 220

tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca aag aat gga 717

Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly

225 230 235

<210>6

<211>239

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus

<400>6

Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu

1 5 10 15

Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr

20 25 30

Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val

50 55 60

Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu

65 70 75 80

Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser

85 90 95

Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr

100 105 110

Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu

115 120 125

Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser

130 135 140

Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp

145 150 155 160

Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe

165 l70 175

Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn

180 185 190

Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe

195 200 205

Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp

210 215 220

Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly

225 230 235

Claims

1.融合免疫毒素ML-L-SEC2，其特征在于：具有序列表SEQ ID No：2中蛋白序列。

2.融合免疫毒素ML-L-SEC2基因，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo：1中碱基序列。

3.一种权利要求2所述融合免疫毒素ML-L-SEC2基因的制备，其特征在于：人源性抗HER-2的单链抗体基因ml3.9和金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因sec2通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接，所得到的融合免疫毒素基因具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列；

所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为，

GGCCGCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGAATTC；