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CN1202863C - 包含作为佐剂的甘油单酯或甘油二酯衍生物的抗原释放系统 - Google Patents

包含作为佐剂的甘油单酯或甘油二酯衍生物的抗原释放系统 Download PDF

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CN1202863C CNB988069660A CN98806966A CN1202863C CN 1202863 C CN1202863 C CN 1202863C CN B988069660 A CNB988069660 A CN B988069660A CN 98806966 A CN98806966 A CN 98806966A CN 1202863 C CN1202863 C CN 1202863C
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Abstract

用于施用抗原，特别是用于粘膜施用抗原的佐剂，以及含有与抗原结合的上述佐剂以及生理上可接受的载体的组合物。利用本发明佐剂组合物引起和加强免疫反应的方法。佐剂包含甘油单或二酯，甘油酯含有至少一种水溶性聚合物，例如聚氧乙烯(PEG2-30)。抗原可与佐剂结合。佐剂也可用于治疗植物。

Description

包含作为佐剂的甘油单酯或甘油二酯衍生物的抗原释放系统
相关申请
本申请是冰岛专利申请4518(1997年7月9日递交)的部分延续，这里引用了其所有涉及内容并包含于本文中。
发明背景
通常认为，肠胃外给药(肌内和皮下)抗原或疫苗是最为有效的给药途径。然而，通过注射给药有许多缺点。注射抗原或疫苗需要无菌注射器和经过培训的人员来完成，并且有可能引起疼痛和刺激，尤其是在重复注射情况下。这种给药途径也具有感染的危险。最为重要的是，很少有人能够忍受肌内注射，在注射部位可能引起硬结(组织硬化)，出血(流血)和/或坏死(组织局部坏死)。
粘膜包含大量的树枝状细胞，其是极好的抗原显露细胞。粘膜也与淋巴器官(叫作粘膜相关淋巴组织)相连，相连的淋巴器官能够加强对粘膜其它区域的免疫反应。这种粘膜的例子如鼻上皮膜，其本质上由一单层上皮细胞(假复层上皮)组成，该粘膜与两淋巴组织，增殖腺(腺样体)和扁桃体相连。鼻粘膜下扩张的毛细血管网及高密度的T和B细胞，特别适合于快速识别抗原并快速作出免疫反应。
曾经尝试鼻内施用相对特定病原体的减毒病毒、细菌和寄生虫(连同通过其它的粘膜表面给药一起)，因抗原体通常通过这一途径感染寄主。我们希望这些病原体能够通过粘膜表面引起免疫反应，因为疫苗中经修饰的活病原体遵循野生型病原体的自然感染途径，即通过亚临床感染产生免疫反应。由于粘膜给以免疫原组合物能够刺激局部产生抗体(分泌IgA抗体)，并避免了通过肠道外给药引起的问题，因此人们对此特别感兴趣。而且，粘膜给药甚至可由未经培训的人来完成，包括接受治疗的本人，以及典型的反对肠道外给药甚于粘膜给药的儿童。由于施用活的、减毒的、修饰病原体具有危险性，因此通常可取的方法是施用亚单位疫苗。然而，通过粘膜施用亚单位疫苗中纯化抗体通常只引起微弱的免疫反应。
已开发了多种释放抗原载体系统，利用这种载体系统存在的问题之一是，例如对于肌内和粘膜给药来说，抗原和/或疫苗在未经识别情况下便被吸收或降解，因此也就未引起免疫反应，特别是在鼻腔内只有短时间接触时这种情况容易发生。曾有报道一种聚乙二醇取代的辛酸/癸酸甘油酯和吐温20的混合物，将用作为粘膜佐剂(Gizurarson等，毒理学Toxicology 107：61-68(1996)；Gizurarson等，疫苗研究VaccineResearch 5：69-75(1996)；Gizurarson等，疫苗研究Vaccine Research6：41-47(1997))。然而，这种配方会在受者的给药部位引起不舒服的刺痛感。这样，就需求一种用于粘膜给以抗原的有效配方，以产生可接受的免疫反应。
EP专利0544612 A2公开了一种组合物，其含有能够通过口腔或鼻腔给药的免疫原和甘油三酯。该组合物能够增强免疫原的效果。
在一篇参考文献中(美国专利4,610,868，1986年9月9日授权)，描述了一种脂质基质载体，将其用于药物的粘膜给药。这个系统要求脂质基质载体含有一种疏水化合物，一种具有球状结构(直径为500-100000nm)的两亲性化合物生物活性剂。这里疏水化合物可能包含一种甘油酯混合物，两亲性化合物可能包含一种鞘脂。而且，这种配制物可能经过鼻区施用。由于鼻腔内会被快速清除掉及其较大的球状结构，这个系统作为鼻部配制药，可能不会被接受。因此，该系统在释放生物活性剂之前就会由纤毛将其转移至胃部。该专利没有描述使用根据本发明的佐剂物质。
日本专利309347/91(优先权日1991年11月25日)描述了一种口腔或鼻腔用免疫原组合物，其包含一种能够免疫哺乳动物的免疫原，使用了一种含有具有饱和或不饱和C6-26脂肪酸残基的甘油三酯佐剂。根据本发明，使用饱和脂肪酸不能引起免疫反应，使用甘油三酯不可能具有能够溶于佐剂的亲水集团或者使抗原与佐剂接触。
WO94/17827(优先权日1993年2月15日)描述了一种药物制剂，用于哺乳动物的抗原局部施用(通过粘膜施用)。佐剂/载体制剂选自以下物组：(a)聚氧乙烯脱水山梨糖醇单酯(b)聚氧乙烯蓖麻油(c)辛酸/癸酸甘油酯(d)神经节苷脂。
发明概要
本发明提供了一种组合物，其能够用作为抗原和疫苗施用时的佐剂，尤其是用作为粘膜施用的佐剂。本发明组合物加强了抗原与粘膜的粘连，也加强了通过粘膜对抗原的吸收。利用本发明的组合物，能够引起受体全身(例如IgG同型抗体)和局部(例如IgG同型分泌抗体)的免疫反应，并且不在上皮膜引起不能被接受的刺激。
本发明的组合物也可作为佐剂用于植物体，以刺激植物的免疫防护系统。本发明也提供了一种用于鼻内施用法的控制释放系统，其与粘膜具有生物相容性并且能够在小体积量内施用需求量的抗原。
本发明内容是关于组合物的，所说组合物包含抗原和佐剂，佐剂中含有0.01-70％v/v的甘油酯，甘油酯选自由甘油单酯和甘油二酯及其混合物组成的组，所说的甘油酯具有分子式(1)：
Figure C9880696600121
其中R1，R2和R3分别独立地选自饱和或不饱和的C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，条件是甘油酯在R1，R2和R3位置至少含有一个水溶性聚合物。佐剂也可以包含少量的甘油三酯。在一特定的实施方案中，水溶性聚合物由具有2-30个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG2-30残基或其衍生物组成。在另一实施方案中，基团R1，R2和R3中的一个或两个由结合抗原替代。
在本发明另一个的实施方案中，水溶性聚合物是有3到6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基。在本发明的另一实施方案中，甘油酯具有以下基团结构：
其中每一分子式中的R1，R2如以上的定义。
在本发明一特定的实施方案中，R1，R2和R3都选自饱和的C6-14脂肪酸，优选饱和的C8-10脂肪酸。
本发明的组合物调控对抗原的免疫应答，也就是免疫原或疫苗组合物能够在量上和/或质上增强受免疫寄主的抗体反应。这个可通过下面的过程完成，例如，通过增加产生于抗原免疫反应中的抗体的数量(例如量上的增强)，或者通过改变免疫反应的模式，例如从Th1反应到Th2反应(例如质上的增强)。
本发明也涉及引起或增加寄主体液和/或细胞介导免疫反应的方法。该方法包括给脊椎动物寄主施用有效量的免疫原组合物的方法，免疫原组合物包含抗原和佐剂，佐剂含有0.01-70％v/v选自下列物组的甘油酯：甘油单酯，甘油二酯及其混合物，所说的甘油酯具有上述的(I)到(V)的分子式。在一特定的实施方案中，通过粘膜给以组合物引起免疫反应。
本发明也涉及引起或增加接种者的体液和/或细胞介导免疫性的方法，免疫性指保护性的免疫反应。该方法包括给脊椎动物寄主施用有效量的免疫原组合物的方法，免疫原组合物包含抗原和佐剂，佐剂含有0.01-70％v/v选自下列物组的甘油酯：甘油单酯，甘油二酯及其混合物，所说的甘油酯具有上述的(I)到(V)的分子式。在一特定的实施方案中，通过粘膜给以组合物引起免疫反应。
本发明的详细描述
免疫系统运用许多机制防止病原体的侵袭，然而，并没有必要在免疫后将所有这些机制都激活。由接种引起的保护性免疫，取决于疫苗引起适当的免疫反应从而抵抗或消除病原体的能力。取决于病原体，这一过程需要细胞介导和/或体液免疫反应。为了在受免疫的有机体内获得较强的免疫反应，并加强寄主对抗原承受剂的抵抗力，经常可取的办法是增强抗原的致免疫能力。通常来说，能够增强抗原的致免疫能力并与抗原一起施用(或者同时或者时间上紧随前后)的物质，作为佐剂被人们所了解。如这里所使用的本发明组合物中的术语“佐剂”，意在包含具有传统佐剂效果的组合物(例如，通过增加或改变上述的抗体反应增强抗原的致免疫能力)，也包含增强抗原对适当组织或细胞递呈能力的组合物(例如抗原释放载体)。
对于鼻内施用方法来说，抗原必须施用于粘膜，以这种方式施用以致于抗原能够进入或通过被粘膜或淋巴组织吸收进入免疫活性细胞，这样抗原就不会在鼻分泌过程中被清洗掉。抗原也应施用在鼻粘膜上，在这种方式下抗原递呈细胞吸收抗原并将其转运至局部淋巴系统。为了使抗原能够进入粘膜，释放载体必须具有一定程度的生物相容性(与粘膜表面膜)，因此也必须具有一定程度的亲水性和疏水性。
这里所描述的工艺过程涉及使用这里所说的组合物为粘膜佐剂。相应地，本发明涉及组合物，例如，免疫原或疫苗组合物。这些组合物包含一种抗原和一种佐剂，佐剂含有0.01-70％v/v选自下列物组的甘油酯：甘油单酯，甘油二酯及其混合物。例如，甘油单酯和/或甘油二酯可以被替代。加入本发明组合物的甘油单酯和甘油二酯可用下列通式表示(I)：
其中的R1，R2和R3独立选自下列物质组成的组：饱和或不饱和的C6-24脂肪酸，水溶性聚合物及其混合物，条件是甘油酯含有至少一个水溶性聚合物。佐剂也可以包含少量的甘油三酯。
可以选择任何饱和的或不饱和的C6-24脂肪酸，包括但不限于下列脂肪酸衍生而来的脂肪酸残基：己酸，癸酸，辛酸，花生四烯酸，丙酸，月桂酸，十四酸，棕榈酸，油酸，亚油酸和亚麻酸。脂肪酸残基可能是单个残基或者两个或多个残基的混合体。它们可从天然的或合成的来源，如脂和油衍生而来。商业途径获得的甘油酯可以直接用，也可将其通过脂肪酶合成，包括特异性酶和非特异性酶，这些酶将脂肪酸放置在特定的位置(如1；2；1，2；1，3)和特定的外消旋结构上等。例如，吸附在1g硅胶上的甘油(0.92g)悬浮在20ml叔丁基甲醚中。将乙烯辛酸酯(3.4g)和来自Rhizopus delemar的脂肪酶(50mg)加入悬浮液中。室温下搅拌混合物96小时并通过TLC监测反应进程。过滤除去固相成分和蒸发溶剂后，可得到粗的反应混合物，其含有大约91％的1，3-双辛酸甘油酯。
水溶性聚合物可以是这样一些物质，其可以使甘油酯在水性溶液中的亲水性(优选不使用表面活性剂即可完全溶解)，特别是用于疫苗给药的生理上可接受载体。理想的水溶性聚合物与施用部位组织，特别是粘膜具有生物相容性。适合的具有这些特性的水溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇，聚乙二醇的衍生物(包括但不限于氨基-PEG，亲核性-PEG，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸酯，PEG-琥珀酰亚胺，PEG-2，2，2-三氟乙磺酰酯(tresylate)，羧甲基化-PEG，PEG-丙酸，PEG-硅烷，PEG-磷脂，生物素-PEG，PEG-邻吡啶基二硫化物)，呋喃糖，丙二醇，葡聚糖和糖类。
优选的是具有约2到30个聚乙二醇单元(PEG2-30)的聚乙二醇聚合物，其中最为优选的是含3到6个单元聚乙二醇的聚合物。一份或两份PEG，其它水溶性聚合物或化合物可以合并在甘油酯分子式中。水溶性部分可以在甘油酯的R1，R2和R3任一位置上。
聚合物可通过化学反应或酶反应形成的共价键挂接在甘油酯上。聚合物可以酰化或通过酯键连接在甘油酯上，例如，通过酯酶介导的合成。例如，溶解缩酮(solketal)可与在三乙醇胺和氯仿中的聚合物氯化物混合，随后通过在稀醋酸溶液中加热，使游离甘油键去保护。三乙胺和4-二甲基氨基吡啶中过量的己酰氯作为催化剂，促使脂肪酸与游离甘油键连接。结果是这种合成物为己酰/聚合物甘油酯。
在本发明的一实施方案中，基团R1，R2和R3中的一个或两个由结合抗原所取代。抗原通过共价键结合于甘油酯部分。在本发明的另一实施方案中，组合物包含甘油单酯和甘油二酯的混合物，两者的体积比例(v/v％)在范围0.1∶99.9到99.9∶0.1内，优选的范围是从5∶95到95∶5。在本发明的另一实施方案中，水溶性聚合物是聚氧乙烯的PEG3-6残基(有3-6个聚氧乙烯单元)。本发明进一步涉及所描述的组合物，其中的甘油酯的结构选自下列分子式组：
Figure C9880696600171
其中的R1和R2如上所定义。
在本发明的一实施方案中，R1，R2和R3选自饱和C6-14脂肪酸，优选饱和C8-10脂肪酸。在本发明的另一实施方案中，甘油酯的重量百分含量从大约0.1％到大约99％，优选从大约0.5到大约20％，更优选从大约1％到大约15％。在本发明的一特定实施方案中，甘油酯中的手性碳为S-或R-型。
本发明佐剂组合物调控对抗原的免疫反应，也就是说，免疫原或疫苗组合物能够激发接种寄主体内的细胞介导的免疫性，从而产生免疫反应。例如，对病原体抗原的保护性免疫反应。
根据本发明，本发明涉及抗原可以与一种或多种佐剂结合，这种配制物可用于引起脊椎动物(例如哺乳动物)体内对抗原的免疫反应。例如，抗原可从包括下列物质(但不限于这些物质)的群组中选择：破伤风毒素(tetanus toxin)，流行性感冒病毒，白喉类毒素，IIIVgp 120，IgA-蛋白酶，胰岛素肽B，弧菌糖(vibriose)，沙门氏菌，Spongosporasubterranea，呼吸道合胞病毒(RSV)(例如RSV亚单位疫苗)，Haemophilusinfluenza外膜蛋白质，Helicobacter pylori脲酶，Neisseriameningitidis和N.gonorrohoeae重组菌毛蛋白或者其中保留有刺激免疫反应能力的部分。给定抗原一部分的激发免疫反应能力，可通过本领域已知的方法测定，例如针对某部分中特定肽的酶免疫分析，检测能够识别特定部分(体液反应)的抗体；或者针对该部分中特定肽的延迟类型过敏性分析，检测其中的细胞介导的免疫反应。
术语“抗原”意在包括含有一个或多个抗原决定部位的分子，抗原决定部位刺激寄主免疫系统产生体液，细胞和/或分泌性免疫学反应。本发明抗原可以是抗原的一亚单位，也可以是杀死的，减毒的或灭活的细菌，病毒，原生动物，真菌，寄生虫或其它的微生物。抗原可能是，例如蛋白质，肽，多糖，脂类或DNA抗原。合适的抗原可从以下物质分离：例如，巴斯德氏菌属(Pasteurella)，放线菌属(Actinobacillus)，衣原体属(Chlamydia)，Morasella，奈瑟氏菌属(Neisseria)，链球菌属(Streptococcus)，嗜血杆菌属(Haemophilus)，沙门氏菌NTK(Salmonella)，艾美球虫属(Eimeria)的物种，以及轮状病毒，疱疹病毒(例如BHV-1，EHV-1)，PRV，细小病毒、狂犬病病毒，流感病毒，副流感病毒，肝炎病毒，HIV，细小核糖核酸病毒，肿瘤抗原，激素，激素类似物等等。
在按照本发明的配方中的抗原适于诱导接种疫苗、免疫、变态反应治疗、癌症治疗、传染性疾病治疗、自身免疫疾病治疗和受免疫系统影响的疾病的治疗。因此，抗原可以是疫苗，如抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗蛋白感染素(朊病毒)、抗寄生虫疫苗或组分，这样的疫苗可以由诸如IgA-蛋白酶、蛋白质p38、蛋白质p43或粘多糖酶之类的微生物产生。抗原也可以是变应原，如房尘微粒(house dust mite)、驯养猫变应原、黑麦草花粉、短豚草花粉、蠓、卵白、牛奶蛋白质、蜜蜂毒液、白面大黄蜂变应原等或负责诱导自免疫疾病(如髓磷脂、胰岛素肽B等等)的组分。抗原也可以用作为治疗诸如疱疹、HIV、乳头状瘤(pappiloma)、念珠菌属、多发性硬化症之类的传染性疾病，治疗诸如糖尿病、甲状腺机能减退和甲状腺机能亢进、牛皮癣、关节炎之类的自身免疫疾病或治疗癌症的疫苗。
适用于本发明疫苗组合物的抗原包括任何能够产生抗体或特异性定向该脊椎动物体(暴露于抗原中)的细胞介导的免疫反应的实体。可以使用一或多种抗原。抗原可以得自包括病毒、细菌、支原体、真菌、原生动物和其它寄生物的病原微生物。此外，抗原也可以得自微生物以外的其它源，如癌细胞或变应原。抗原可以是全部或部分病原微生物，或有机体有关的全部或部分蛋白质、糖蛋白、糖脂、多糖或与脂多糖。
抗原可以得自其中或抗原为疫苗目的产生自其中的病原微生物是传染性疾病领域所熟知的，例如《医学微生物学》Medical Microbiology(1990年第二版，J.C.Sherris编辑，Elsevier科学出版公司，纽约)所列的病原微生物。
可以以颗粒形式或溶解形式利用抗原。制剂尤其适于溶解的抗原，然而，颗粒形式也易于制备成制剂。就接种和免疫来说，颗粒形式常常是有利的，然而，对于诱导耐受性(例如，对于治疗变应性和自身免疫疾病)来说，溶解形式的抗原是优选的。
利用本领域技术人员所知的方法，如ELISAs、血细胞凝集测定和中和测定，可以评价按照本发明的、单独或于颗粒抗原结合的佐剂的免疫辅助活性。正如本文所使用的，“免疫辅助活性”旨在于意指在佐剂和抗原施用于其中的宿主中加强免疫反应的能力。典型地，佐剂以相同的混合物或组合物形式(参见，例如国际公开号WO 93/05789)，或者在同一时间以分开的组合物或制剂形式与抗原一起施用。抗原可以与佐剂结合(例如共价结合)或仅仅与佐剂混合。佐剂也可以在施用抗原之前或之后施用。佐剂活性包含但不限于加强抗原的免疫反应的能力(通过增加抗原的免疫原性或通过减少产生免疫反应所需的抗原剂量和水平来加强)。
正如本文所使用的，与特定抗原的“免疫反应”或“免疫性反应”旨在于包含分泌物、细胞、体液的产生或抗体介导的与抗原的反应(或一般性反应)。在免疫的宿主中的反应的表现可以包含抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体)的产生，B和/或T淋巴细胞的增殖，识别抗原呈递细胞的细胞毒T淋巴细胞的刺激，T细胞群的暴露和导致免疫系统的细胞的分化、激活或生长的信号的加强。
典型地，本发明的佐剂的施用将导致或产生与感兴趣抗原之间的加强的免疫反应。在本上下文中，“加强的”旨在于意指：在有佐剂的情况下，与抗原之间的免疫反应在数量上大于和/或在质量上好于缺少佐剂时的免疫反应。利用常规方法，例如利用制剂(包含佐剂和抗原)与适当对照之间的放射免疫测定或ELISA的抗体滴度比较，可以实现存在或缺少佐剂的免疫反应的比较。加强的免疫反应可能是对个体的免疫系统的直接影响的结果(例如加强与抗原之间的反应的T和B细胞引导)，或者可能是由于抗原向粘膜的更有利呈递(例如通过提供与粘膜之间的更好的粘连以使抗原和粘膜之间能长期地接触，或者增强抗原通过粘膜的吸收作用，如通过增加粘膜的透过性)所致。
正如本文所描述的，本发明的佐剂可以用作为增强抗原的免疫反应的佐剂。在特定具体实施方案中，佐剂是粘膜佐剂。例如，佐剂可以用于使哺乳动物受到免疫而抗具体的病原体或亚抗原的组合物、或者引导特定抗原的免疫反应的组合物中。
本发明方法包含向哺乳动物(尤其是人或灵长类动物)施用免疫学有效剂量的、包含抗原和佐剂量的本发明佐剂的免疫原性或疫苗组合物。正如本文所使用的，“佐剂量”或“有效量”的佐剂旨在于意指加强共施用的抗原的免疫反应的量。例如，典型地，大约0.01％至大约40％(尤其是大约0.1％至大约20％)的剂量将有效地提供佐剂效应；然而，这些剂量范围的变化将取决于具体的佐剂。此外，具体的剂量将取决于接受治疗的哺乳动物的年龄、重量和治疗状况以及施药方法。合适的剂量易于由本领域技术人员确定。
疫苗或免疫原性组合物可随意地以药学上或生理学上可接受的载体(例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水、水、葡萄糖、乙醇诸如丙三醇或丙二醇之类的多元醇或其组合物)施用。按照本发明的制剂可以是悬液、乳剂或分散剂，并且可以提供与分散剂或湿润剂、悬浮试剂和/或一或多种防腐剂混合的佐剂。例如，合适的分散剂或湿润剂是天然产生的磷脂(如卵磷脂或大豆卵磷脂)，氧化乙烯与例如脂肪酸、长链脂肪醇或偏酯(得自脂肪酸)和己糖醇或己糖醇酐的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇一油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯等)。例如，合适的悬浮试剂是天然产生的树胶(如阿拉伯胶、黄原胶或黄蓍胶)；纤维素，如羧甲基纤维素钠、微晶纤维素(如AvicelRC 591)、甲基纤维素；藻酸盐，如藻酸钠等。用于按照本发明的制剂中的防腐剂的合适例子是对羟基苯甲酸酯类，如对-羟基苯甲酸甲基或丙基酯和苯扎氯铵。
对于在直肠或阴道粘膜方面的应用，按照本发明使用的合适制剂包含栓剂(乳剂或悬液类型)、灌肠剂和直肠明胶胶囊(溶液或悬液)。药学上可接受的合适栓剂基质包含可可豆脂、酯化的脂肪酸、用甘油处理过的明胶和各种如聚乙二醇和聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯一样的水溶性或水扩散性基质。也可以掺入各种添加剂，如增强剂或表面活性剂。
对于在鼻粘膜方面的应用，鼻喷雾和用于吸入的气雾剂是按照本发明使用的合适组合物。在典型的鼻用制剂中，活性物质以可选分散于合适载体中的颗粒制剂形式存在。存在于组合物中的药学上可接受的载体和赋形剂以及可有可无的药学上可接受的其它物质(如稀释剂、增强剂、调味剂、防腐剂等等)，均可以本领域技术人员所知的方法按照常规药学实践选得。在施用按照本发明的鼻用制剂之后，抗体可以吸附在鼻粘膜上。一般认为，相比于例如使用液体载体(如包含穿透增强剂或促进剂的液体载体)来说，抗体在粘膜上的吸附将产生较少的刺激效应。适于施用本发明制剂的其它粘膜表面是鼻、肺、口、眼、耳、胃肠道、生殖道、阴道、直肠或皮肤或鱼的鳃。这样的制剂也适于在植物的种子或叶上使用。
对于在皮肤上的使用，按照本发明的制剂可以包含常规的、无毒的、药学上可接受的、包括微囊和脂质体的载体和赋形剂。制剂包括乳膏、软膏、洗液、搽剂、凝胶、水凝胶、溶液、悬液、棒状物、喷雾、糊剂、膏药和其它种类的透皮的药物释放系统(transdermal drug deliverysystems)。在实施方案中，制剂可以以鼻用喷雾剂、鼻用粉剂、鼻滴剂鼻用泡沫或鼻用软膏形式施用于粘膜表面或鼻腺样增殖体上，或者以口用喷雾剂、口用滴剂、口用粉剂、口用泡沫或口用软膏直接地施用于口腔或口部的扁桃体上。制剂也可以是滴眼剂形式。
药学上可接受的赋形剂可以包括乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、穿透增强剂、螯合剂、凝胶形成剂、软膏基质、香料和皮肤防护剂。乳化剂的例子是天然产生的树胶(如阿拉伯胶或黄蓍胶)、天然产生的磷脂(如大豆卵磷脂)和脱水山梨糖醇一油酸酯衍生物。抗氧化剂的例子是burylated羟基苯甲醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物，生育酚及其衍生物，丁基化羟基苯甲醚和半胱氨酸。防腐剂的例子是对羟基苯甲酸酯类(如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯)和洁而灭。湿润剂的例子是甘油、丙二醇、山梨醇和尿素。穿透增强剂的例子是丙二醇、DMSO、三乙醇胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮及其衍生物，四氢呋喃甲醇和Azone。螯合剂的例子是EDTA钠盐、柠檬酸和磷酸。其它赋形剂的例子是食用油，如杏仁油、蓖麻油、可可豆脂、椰子油、玉蜀黍油、棉籽油、亚麻籽油、橄榄油、棕榈油、花生油、罂粟籽油、菜籽油、芝麻油、豆油、向日葵籽油和茶籽油；和聚合物类的食用油，如carmelose、sodium carmelose、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、脱乙酰壳多糖、果胶、黄原胶、角叉菜胶、槐树豆胶、阿拉伯树胶、明胶和藻酸盐。软膏基质的例子是蜂蜡、石蜡、鲸蜡素、植物油、脂肪酸的脱水山梨糖醇酯(Span)、聚乙二醇和脂肪酸的脱水山梨糖醇酯与氧化乙烯的缩合产物(如聚氧乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯(吐温))。以上提到的用于局部施用的制剂也可以应用于皮肤、鱼腮或植物外表上或植物种子中。本发明的制剂也适于直接使用或适于引入身体的有关管孔中，如直肠、尿道、阴道或口腔。制剂可以简单地直接施用于将要免疫的部分上，如粘膜。
许多粘膜制剂需要一些专用的赋形剂混合物。因此，许多制剂可以包含一或多种表面活性剂和/或吸收促进剂和/或吸水聚合物和/或抑制酶促降解物质和/或醇、有机溶剂、油、pH控制剂、增溶剂、稳定剂、HLB控制剂、粘度控制剂、防腐剂、渗透压控制剂、喷射剂、排气剂、水及其混合物。表面活性剂可以选自壬苯聚醇、辛苯聚醇、吐温、司盘钠、月桂基硫酸酯、脱水山梨糖醇一棕榈酸酯；吸收促进剂可以选自聚氧乙烯醇醚、胆汁酸盐及其衍生物、梭链孢酸及其衍生物、油酸、卵磷脂、溶血卵磷脂、吐温20-85、单-/双-和三甘油酯、shitosan、环糊精；吸水聚合物可以选自glycofurol及其衍生物、聚乙二醇200-7500及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、丙二醇、明胶、纤维素及其衍生物；抑制酶促降解的物质可以选自抑肽酶、DFP、聚羰乙烯；油可以选自植物油、豆油、花生油、椰子油、玉米油、橄榄油、向日葵籽油、Miglyols；pH控制剂可以选自乙酸、盐酸、硝酸、偏磷酸钾、磷酸钾、乙酸钠、氨、碳酸钠、氢氧化钠、硼酸钠、三乙醇胺；增溶剂可以选自乙醇、异丙醇、water glycofurol、聚乙二醇200-7500；稳定剂如环糊精；HLB控制剂可以选自吐温20-85、司盘20-80、Brij 30-98、阿拉伯胶；粘度控制剂可以选自纤维素及其衍生物、吐温及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、鲸蜡醇、甘油、丙二醇、山梨醇、明胶；防腐剂可以选自苯扎铵盐、苯甲醇、苯酚、硫柳汞、硝酸苯汞、苯乙醇、氯丁醇、氯化十六烷基吡啶；渗透压控制剂可以选自右旋糖、氯化钠、甘露醇；以及喷射剂可以选自二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、三氯氟甲烷和其它无臭氧损害的喷射剂(如丁烷)；排气剂可以是氮。
对于液体组合物来说，最本质的问题是有效量的抗原可通过适量体积施用。对于人类受体，通过鼻腔施用的体积应不超过约300μl。过量体积将不能被患者接受，并且提前从鼻孔或从后面的咽部排出。结果是一部分抗原和/或疫苗在吸收部位损失掉了。体积量优选是从大约20μl到大约125μl而且最好是施用到一个鼻孔中。在口腔或直肠处施用，用药体积应不超过10ml。施用于眼部或耳部时，用药体积应不超过300μl。肺部施用，体积应不超过2ml。阴道内施用，用药体积不超过30ml。肠胃道内施用，用药体积不超过100ml。
疫苗组合物也可选择性的包含其它附加的组分，如缓冲剂，防腐剂，乳化剂，佐剂；佐剂如植物油或其乳液；表面活性物质，如十六胺，十八烷氨基酸酯，十八胺，溶血卵磷脂，溴化二甲基双十八基铵，N，N-dicoctadecyl-N′-N′bis(2-羟乙基-丙二胺)，甲基十六基甘油；多胺，如吡喃，葡萄糖硫酸酯，聚IC，carbopol；肽，如胞壁酰基二肽，二甲基甘氨酸，他福新；刺激免疫复合物，油乳剂，脂多糖类，如MPL(3-O-脱酰基单磷酰脂A(RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，蒙大拿)；矿物胶，以及免疫刺激性寡核苷酸。本发明的抗原也可混入下列物质：脂质体，cochleates，能进行生物降解的聚合物如聚乳酸，聚糖脂以及聚乳酸-连-聚糖脂，或者ISCOMS(免疫刺激性复合物)，也可能是使用的补充的活性成分。
本发明抗原也可和细菌类毒素以及他们的减毒衍生物(作为佐剂或载体分子)一起施用。其它适合的载体分子包括血清白蛋白，键孔纠缠(keyholelimpet)血蓝蛋白，免疫球蛋白分子，免疫球蛋白，卵清蛋白，多糖(琼脂糖凝胶，琼脂糖，纤维素)，灭活病毒微粒，氨基酸共聚体。本发明抗原也可和淋巴因子一起施用，包括但不限于，白介素-2，IFN-γ和GM-CSF。在施入这些DNA编码的抗原后，其也可在活体内得到表达。
疫苗可通过不同的途径施用给人或动物，包括但不限于，肠胃外，动脉内，皮内，透皮(例如施用缓释聚合物)，肌内，腹膜内，眼内，舌下，静脉内，皮下，口腔或鼻内施用途径。在一优选的实施方案中，通过粘膜施用组合物。在这种疫苗中抗原的用量根据抗原不同而不同。调节和人为控制所用的传统载体抗原的剂量范围，以适应本发明疫苗，这是本领域技术人员能力范围之内的事情。本发明疫苗可用于治疗未成年或成年的温血动物，特别是人。施用本发明的免疫原或疫苗组合物也可使用基因治疗方法完成(参见，如美国专利5,580,859和已公开的PCT申请公开WO 93/19183(Robinson等)和WO 97/44446(Malone等))。
本发明以粘膜佐剂为佐剂具有许多重要的潜在意义。粘膜的辅助性可增加免疫体中产生的保护抗原的浓度，该保护抗原是抵抗粘膜给予的抗原的。作为结果，有效的疫苗对抗原的需求要少于通常的需求量。这种抗原需求量的减少可导致配制十分困难和昂贵疫苗的广泛应用。另外，若抗原是弱抗原或弱免疫原，利用本发明的佐剂可增强其引起免疫反应的能力，尤其是通过粘膜施用时。当在正常有效粘膜免疫法需要浓度下抗原有毒时，它也可提供安全的接种疫苗。通过减少抗原的量，也就减小了发生毒性反应的风险。它也可通过另一途径提供安全的接种疫苗，就是使抗原或疫苗配制物通过粘膜施用途径是安全的，而通过肠道外施用途径则是毒性的。
典型地，为了刺激“保护性”免疫反应，接种规定要求在一段时期(几星期或几个月)内施用疫苗。“保护性”免疫反应是足够阻止疫苗所针对特定的某种或某些病原体的感染或减少感染的严重程度(与没有免疫反应时的感染严重性相比)的免疫反应。利用本发明佐剂可能减少有效接种规定的时间过程。在一些情况下，单一剂量的本发明佐剂就可能导致产生保护性反应。本发明疫苗组合物在治疗疾病上也是有用的，可减小已受感染患者中发作症状人数数量和发作症状的严重程度。本发明疫苗组合物也可用作为肠道外施用抗原的口腔辅助剂免疫。
根据本发明描述的配制物特别适用于人，包括幼儿，儿童，青年，成年人和老人。该配制物的性质就是增强对各种病原体的免疫反应，因此它可用于不同条件下的受验者，比如患病的人，例如脾切除患者，癌症患者，使用抗癌药物的患者，使用平喘药物的患者，使用消炎药物的患者，甲亢或甲状腺功能衰退的患者。
本发明的配制物也适用于动物，如马，羊，狗，猫，牛，猪，山羊，兔子；野生动物如小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，野兔，野狗，野猫或者猴子；鸟类如鸡，火鸡，  鸭子，鸵鸟，热带鸟或野生鸟；或者鱼类，比如饲养鱼类，例如鲑鱼或水族馆鱼类。对于动物，每一组分浓度需要调配。例如对于羊来说，鼻腔湿度很大，配制物中就需要增加有吸水赋形剂；对于鱼来说，配制物需要微囊包封，或者是能够被鱼腮吸收的其它形式。
本发明也可用于增加植物体内的生物活性(例如致免疫性)和/或吸收生物活性剂(例如抗原)。能够和本发明佐剂组合物协同使用的生物活性剂可能是，例如，除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，植物生长调节剂，肥料和疫苗。需要适合的生物活性剂可通过商业渠道获得，通常可按照商家建议的比例使用。用于本发明配制物中的特定量生物活性剂成分，随以下条件不同而变化，与生物活性剂接触的特定植物或植物生长介质，通常使用的场所(也就是被遮盖地域(如温室)相对的外露地域(如田间))，以及配制物的类型气溶胶、溶剂、固体制剂。该配制物可用于任何类型植物，包括但不限于，草类(例如，黑草，雀麦草，马唐曹，稗草，牛筋草，黑麦草(Italian grass))，谷类植物(例如小麦，燕麦，高梁，玉米，甜菜，canola，大豆，棉花，烟草，马铃薯，果树，黄瓜，番茄，香蕉，豆类，辣椒，甜瓜类)以及观赏植物(灌木，树，花)。配制物可施用于叶，种子，果实，树皮或树干，或者可以与生长培养基(泥炭或土壤)混合在一起。配制物可以单独施用(例如用喷雾器)或集中施用(例如从飞机上)。利用本发明的佐剂配制物给植物释放抗原，可使植物对病原体具有免疫性(例如，通过产生植物抗体或激活局部或全身的获得的抗性(参见，例如，Agrios，植物病理学Plant Pathology，第四版(学术出版社Academic Press，1997)，108-114页，以及其中引用的参考文献))。
提供下面的实施例是为了解释本发明，并不是构造对本发明的限制范围。贯穿在本申请中的所有引用(参考文献，专利及公开的专利申请)内容，在这里都合并于此作为参考。
实施例
实施例I-破伤风类毒素
对小鼠(Balb/c)进行鼻内施用5μl的含1.5μl破伤风类毒素(Lyfjathroun，冰岛雷克雅末克)的配制物，配制物配方如下：(I)等渗盐水；(II)20％PEG6-CCG(Softigen；Hüls AG，Witten，德国)，是在等渗盐水中的含6个聚氧乙烯(PEG6)单元的辛酸和癸酸单甘油酯/甘油二酯混合物；(III)20％的用吐温20(22∶78)溶解在等渗盐水中的辛酸和癸酸甘油单酯/甘油二酯混合物(CCG-多乙氧基醚20(CCG-PS)；WO94/17827)(Imwitor)。在第一次接种后四周，小鼠再次接受疫苗含量相同的接种。一周后，提取血液样品，获得如下的血清IgG反应：
                       表1
    配制物     血清IgG反应
    I     0.01
    II     2.1
    III     0.65
这些结果表明，与WO 94/17827中描述的疫苗配制物(配制物III)相比，无毒的PEG5-CCG(配制物II)产生了显著增强的IgG反应。
实施例II流感病毒
用流行性感冒病毒疫苗(来自Harbin株的HA分子)对二十只Balb/c小鼠免疫。用0％，1％，5％和20％根据本发明的PEG6-CCG配合流行性感冒HA分子。在首次免疫后四周再次对小鼠进行疫苗含量相同的注射接种。注射接种一周后，得到以下结果：
            ％佐剂            Cone.IgG(血清)
            0％                   1.1
            1％                   4.2
            5％                   6.8
            20％                  8.4
实施例III
对小鼠(Balb/c)进行鼻内施用5μl配制物，配制物含20％PEG6-CCG，是在等渗盐水中的含6个聚氧乙烯(PEG6)单元的辛酸和癸酸甘油单酯/甘油二酯混合物，加入的抗原如下：(I)1μg HA流行性感冒病毒疫苗/小鼠；(II)1.5Lf(絮状反应单位)破伤风类毒素疫苗；(III)1.5Lf白喉类毒素疫苗；(IV)1μg rgp 120HIV疫苗；(V)1μg作为疫苗的IgA-蛋白酶；以及(VI)1μg胰岛素肽B。在第一次接种后四周，小鼠接受疫苗含量相同的辅助剂。一周后，提取血液样品并分析。
实施例IV破伤风类毒素和白喉类毒素
对人类志愿者从鼻内施用100μl的配制物，配制物含12Lf破伤风类毒素和12Lf白喉类毒素疫苗，各配方如下：(I)等渗盐水；(II)PEG6-CCG，是在等渗盐水中的含6个聚氧乙烯(PEG6)单元的辛酸和癸酸甘油单酯/甘油二酯混合物；(III)等渗盐水中5％的PEG-CCG；(IV)等渗盐水中1％的PEG-CCG。在第一次接种后四周，参与者再次接受疫苗含量相同的接种。在研究期间，每周从每一志愿者身上取样(血液和唾液样品)，进行IgG和IgA分析。
实施例V
对小鼠(Balb/c)施用在20％ PEG6-CCG中的1.5Lf的破伤风类毒素疫苗，PEG6-CCG是在等渗盐水中的含6个聚氧乙烯(PEG6)单元的辛酸和癸酸甘油单酯/甘油二酯混合物。配制物施用过程如下：(I)5μl鼻内施入；(II)5μl口腔粘膜施入；(III)5μl阴道施入；(IV)5μl直肠施入；以及(V)5μl皮肤施入。在第一次接种后四周，小鼠接受疫苗含量相同的辅助剂。一周后，提取血液样品。
对十五只小鼠(Balb/c)用流行性感冒疫苗(来自Nanchang株的HA分子)接种。流行性感冒分子用5％根据本发明的PEG6-CCG配制，通过鼻腔，口腔和直肠途径施用。在首次接种后四周，再次以相同的配制物含量及相同的施用途径为小鼠注射接种。一周后，得到以下结果：
                途径            吸光度(OD 492nm)
                鼻腔                0.300
                口腔                0.334
            直肠                0.155
实施例VI
一种配制物含10％的PEG6-CCG，是在等渗盐水中的含6个聚氧乙烯(PEG6)单元的辛酸和癸酸甘油单酯/甘油二酯混合物，选定的疫苗组合物施用方法如下：(I)5Lf破伤风类毒素施用给小鼠；(II)6Lf破伤风类毒素施用给兔子；(III)20Lf破伤风类毒素施用给绵羊；(IV)12Lf破伤风类毒素施用给人类志愿者；(V)3μg弧菌糖(vibriose)疫苗施用给鲑鱼；(VI)3μg沙门氏菌疫苗施用给小鸡；以及(VII)3μg Spongosporasubterranea抗原施用给马铃薯植株。在第一次接种后四周，施用疫苗含量相同的辅助剂。一周后，抽取血液样品(除了(VII)中的植物样品)，对于(VII)中的植物，在施用辅助剂一个月后用真菌对其进行感染。
实施例VII
对小鼠(Balb/c)进行鼻腔施用5μl的配制物，配制物含有：(I)破伤风类毒素或(II)肺炎球菌，协同辛酸和癸酸的甘油单酯和甘油二酯。这种前疫苗的施用浓度为20％。在第一次接种后四周，小鼠接受疫苗含量相同的辅助剂。一周后，抽取血液样品。
为了估计通过鼻腔施用之后PEG6-CCG对疫苗抗原的作用，利用一定量的病毒和细菌抗原作实验，这些抗原包括流行性感冒疫苗，呼吸道合胞病毒(RSV)亚单位疫苗，未分类的Hemophilus influenta外膜蛋白(OMPs)，Helicobacter pylori脲酶，Neisseria meningitides与N.gonorrhoeae的重组菌毛蛋白。该分析的结果在下列实施例中阐明。
实施例VIII流行性感冒疫苗
该实施例总结对佐剂辅助效果的评价，评价CCG-PS和PEG-CCG对A/Udorn疫苗(monopool分裂流行性感冒疫苗，Wyeth Lederle疫苗以及儿科学West Henrietta，NY)免疫反应的辅助作用，评价局部免疫反应对呼吸道的保护作用(免受递减疾病感染)。
                                     表2
组编号  免疫原 剂量/途径/体积
 A  A/Udorn/307072(H3N2) 1.8×105TCID50/IN/5μl
 B  无 无
 C  A/Udorn疫苗 1.0μg HA/IM/50μl
 D  A/Udorn疫苗 1.0μg HA/IN/50μl
 E  10％CCG-PS中的A/Udorn疫苗 1.0μg HA/IN/50μl
 F  5％PEG6-CCG中的A/Udorn疫苗 1.0μg HA/IN/50μl
BALB/c小鼠，每组8只
Vax：0天，19天和38天
感染：第70天
病毒滴定：第74天
HA-血细胞凝集素
从ELISA和血细胞凝集抑制分析的血清学数据表明，与CCG-PS配制物相比，PEG6-CCG配制物引起的血清IgGI和HI滴度较高。与肠道外施用标准疫苗比较，从鼻腔施用PEG6-CCG配制物产生了全身抗体反应。
ELISPOT数据证明了PEG6-CCG象第一代CCG-PS配制物的能力，增强对流行性感冒疫苗的局部免疫反应，这一结论同样可通过下列事实得到证明：与仅通过鼻腔施用疫苗相比，发现通过PEG6-CCG施用疫苗的受体鼻腔淋巴组织中分泌IgA的B细胞数量增加。通过肌内施用疫苗并不产生高于未免疫小鼠背景值的局部免疫反应。
表3PEG6-CCG配制物促进对鼻腔施入的流行性感冒验疫苗的体液抗体反应
免疫原/途径 IIIGMT  IgGIGMT  IgG2aGMT 分泌IgA的细胞/104鼻淋巴细胞
A/Udorn/IN 512  19,426  436,556  463
无 8  13  13  1
A/Udorn vax/IM 215  48,537  1,254  6
A/Udorn vax/IN 25  732  73  22
A/Udorn vax/CCG-PS/IN 181  20,556  228  150
A/Udorn vax/PEG6-CCG/IN 512  88,533  173  73
如下表所示，先前暴露于感染病毒的小鼠，在随后用同种病毒侵染时得到完全保护。从肺或鼻组织不能再回收病毒。相反的，在未免疫小鼠肺或鼻组织，很容易用A/Udorn病毒感染。小鼠在接受肠胃外或无佐剂施用鼻内疫苗后，可从所有小鼠的鼻组织中回收病毒。这些数据表明，由CCG-PS和PEG6-CCG辅助的疫苗引起的免疫反应，保护上呼吸道免受病毒的侵染。那些接受有CCG-PS和PEG6-CCG辅助的疫苗(鼻腔施入)动物，从其鼻腔组织回收的病毒数量大大减少。对下呼吸道的保护作用明显独立于疫苗组合物及其施用途径。
表4CCG-PS和PEG6-CCG辅助的鼻内流感疫苗引起免疫反应保护上呼吸
                      道免受病毒侵染
    免疫原/途径   ％阳性鼻     ％阳性肺 从鼻组织回收的病毒GMT 从肺组织回收的病毒gMT
 A/Udorn/IN  0  0  200  200
 无 100  75  53,724  40,788
 A/Udorn vax/IM 100  0  30,211  200
 A/Udorn vax/IN 100  25  6,324  563
 A/Udorn vax/CCG-PS/IN 75  0  2,081  200
 A/Udorn vax/PEG6-CCG/IN 25  25  621  1002
200ICID50≤400(检测时的分析限制)，所有的阴性样品都赋值200
实施例IX  RSV F蛋白
该实施例总结对佐剂辅助效果的评价，评价CCG-PS和PEG-CCG对RSV F蛋白免疫反应的辅助作用，评价局部免疫反应对呼吸道的保护作用(免受下降疾病感染)。
                                表5
组编号 免疫原 剂量/途径/体积 Vax时间表
A  F蛋白 3μg/IN/5μl 第0，7，14天
B  20％CCG-PS中的F蛋白 3μg/IN/5μl 第0，7，14天
C  5％PEG6-CCG中的F蛋白 3μg/IN/5μl 第0，7，14天
D  明矾上的F蛋白 3μg/IM/100μl 第0天
E  RSV A2 2×106pfu/IN/50μl 第0天
BALB/c小鼠，每组10只
F蛋白特异性血清抗体反应-鼻内施用带有F蛋白/PBS的疫苗，引起滴度大约为26,000的循环IgG抗F反应。然而，通过F蛋白与CCG-PS或者PEG6-CCG结合，在统计上提高了整个IgG，IgG1和IgG2a的滴度值(P＜0.05)(见表6)。此外，只有用PEG6-CCG配制的疫苗才引起显著的血清IgA滴度值。连续进行此项观察，可能会发现PEG6-CCG的不同免疫属性。
F蛋白特异性粘膜lg反应-IgA，通过对用F/PEG6-CCG免疫的小鼠的鼻腔和阴道清洗物进行观察，其反映这种疫苗复合物引起了血清IgA激活(见表6)。本次实验中，发现小鼠鼻腔清洗物中的IgA水平，要高于用活体RSV感染的小鼠水平。
              表6用F蛋白和CCG-PS和PEG6-CCG化合物
                     鼻内接种的BALB/c小鼠的免疫反应
免疫原 血清GMT NW VW
IgG IgG1  IgG2a IgA IgG  IgA IgG IgA
F蛋白 26,322+/-51,020 2,909+/5,770 ＜100 ＜100 ＜25 ＜25 ＜25 ＜25
F蛋白CCG-PS 115,336+/-32,747 4,423+/-5,079 254+/-457 ＜100 ＜25 ＜25  223 261
F蛋白PEG6-CCG 111,761+/-108,591 9,218+/-7,565 626+/-665 381+/-50 ＜25  103 ＜25 443
F蛋白A1OII 71,756+/-36,340 43,136+/-19,917 1,553+/-1,099 ＜100 ＜25 ＜25 258 ＜25
RSV A2 79,236+/-32,310 5,962+/-5,251 20,819+/-7,258 752+/-50 ＜25 ＜25 ＜25 594
27天时抽取小鼠血液样品，对每一小鼠样品通过ELISA分析血清抗体滴度。类似地，在28天的时候，接取粘膜清洗物样品并分析抗F蛋白特异性IgG和IgA。IgA在支气管肺泡清洗(BAW)中检测。VW＝阴道清洗物，NW＝鼻腔清洗物
实施例X-无分类的Haemophilus influenzae(NTHi)外膜蛋白(OMP)rP4
这个实验是在BALB/c小鼠体内通过鼻腔施入NTHi重组P4蛋白之后，比较CCG-PS和PEG6-CCG粘膜佐剂对其的活性。
在第0天和21天通过鼻内施入疫苗总体积为5μl。在0，21和28天时抽取小鼠血液样品。进行支气管肺泡清洗(BAW)和阴道清洗(VW)并在28天时收集唾液样品。
释放在CCG-PS或PEG6-CCG中的重组NTHi外膜P4蛋白，明显增强了血清IgG抗体滴度(对重组P4蛋白)。在两种释放载体之间，血清IgA和IgG滴度(对重组P4蛋白)无明显差别(28天时p为0.05)。而且，在CCG-PS或PEG6-CCG中的1μg的重组P4蛋白的释放引起了唾液和阴道清洗物中很好的IgA抗体对重组P4蛋白滴度值。
很明显，在特异性抗体滴度方面，PEG6-CCG等于CCG-PS。然而，值得注意的是，只有PEG6-CCG配制物引起了可证实的rP4特异性鼻内IgA抗体反应。
                               表7
  免疫原                 28天的抗rP4 ELISA滴度
  血清     血清     鼻腔     唾液     阴道
  IgG     IgA     IgA     IgA     IgA
  盐水中的NTHi rP4   207     79     ＜10     ＜10     ＜10
 20％CCG-PS中的NTHirP4   16,635     1,295     ＜10     128     125
 PEG6-CCG中的NTHi rP4   14,336     830     52     164     92
另外，1μg在CCG-PS或PEG6-CCG中的重组P4蛋白的释放，明显增加了有反应的小鼠数量(与仅在盐水中释放的相比较)。
                            表8
    小鼠#     盐水     CCG-PS     PEG6-CCG
    1     3,840     25,946     22,654
    2     3,042     23,280     20,768
    3     297     19,540     13,034
    4     109     14,192     10,166
    5     1     7,606     9,628
    几何平均±SD     207±1,835     16,635±7,346     14,336±16,136
28天时的IgG反应，滴度值动大到小排列。
实施例XI-H.pylori r脲酶
这个实验是在BALB/c小鼠体内通过鼻腔施入10μl重组H.pylori脲酶之后，比较CCG-PS和PEG6-CCG粘膜佐剂对其的活性。
在0天和21天通过鼻内施入疫苗。在0，21和28天时抽取小鼠血液样品。进行支气管肺泡清洗(BAW)和阴道清洗(VW)并在28天时收集唾液样品。
释放在CCG-PS或PEG6-CCG载体中的重组H.pylori脲酶蛋白，明显增强了继发的血清IgG抗体滴度(对重组脲酶蛋白)。两者在对重组脲酶蛋白的血清IgG滴度方面无明显差别。在两释放载体之间，对重组脲酶蛋白的血清IgG滴度无明显差别(P＞0.05)。然而，在本实验分析的任一粘膜分泌物中，从CCG-PS或PEG6-CCG中释放的重组脲酶蛋白，没有引起可检测的IgA抗体(对重组脲酶蛋白)。
                        表9
 免疫原     血清IgG
 盐水中5μg重组H.pylori脲酶蛋白     ＜100
 20％CCG-PS中5μg重组H.pylori脲酶蛋白     64,787±45,033
 5％PEG6-CCG中5μg重组H.pylori脲酶蛋白     40,489±28,674
血清IgG抗重组脲酶ELISA终点滴度，用在28天时收集的个体血清样品(每组5只)测定。
实施例XII-N.meningiridis r菌毛蛋白
在本实验中，利用N.meningiridis菌毛蛋白作为疫苗抗原研究PEG6-CCG的粘膜佐剂活性。
对每组(5只)BALB/c小鼠进行鼻内接种总体积为10μl，疫苗为5μg的重组N.meningiridis菌毛蛋白(r菌毛蛋白)释放在20％ CCG-PS或5％PEG6-CCG或盐水中，在0，14，21和28天时抽取血样。在30天时进行支气管肺泡清洗(BAW)和阴道清洗(VW)并收集唾液样品。
当疫苗用PEG6-CCG为载体施用IN后，可证明其明显的粘膜佐剂效果。28天时，相对于空白对照组(用盐水配制疫苗的)，对于接受5μg r菌毛蛋白释放于PEg6-CCG中配制成的疫苗的小鼠来说，其鼻腔和阴道清洗物中sIgA增加了16和32倍。相对于PEG6-CCG，CCG-PS配制物鼻腔清洗物中sIgA滴度仅增加了2倍，而阴道清洗物中增加了11倍。这些数据表明PEG6-CCG对于重组N.meningiridis菌毛蛋白蛋白来说，可能是一种改善了的释放载体。
                                    表10
    免疫原   血清IgA   鼻腔IgA   阴道IgA
 盐水中n.mening r菌毛蛋白   6,168     12     15
 20％CCG-PS中n.mening r菌毛蛋白   178,867     26     166
 5％PEG6-CCG中n.mening r菌毛蛋白   135,994     194     482
实施例XIII-GC r菌毛蛋白
在本实验中，用重组GC菌毛蛋白作为疫苗抗原调查PEG6-CCG的粘膜佐剂活性。
对每组(5只)BALB/c小鼠进行鼻内接种体积为10μl，疫苗中有10μg重组GC菌毛蛋白(r菌毛蛋白)及有或没有5％ PEG6-CCG，在0，14和28天时抽取血样。在29天时进行阴道清洗。
当疫苗用PEG6-CCG为载体施用IN后，可证明其明显的粘膜佐剂效果。28天时，接受10μg r菌毛蛋白释放于PEG6-CCG中配制成的疫苗的小鼠，其血清抗r菌毛蛋白IgA和IgG分别增加了2和5倍。整体细胞ELISA滴度也稍有增加(10,570对6,843)。阴道清洗物中sIgA增加4倍以上。
                         表11
    免疫原   血清IgA   血清IgG   整体细胞IgG   阴道清洗物IgA
 盐水中r菌毛蛋白   301   6,422     6,843     351
 5％PEG6-CCG中r菌毛蛋白   609   34,358     10,570     1,517
本实验中未收集鼻腔清洗物
本实验不包括CCG-PS
实施例XIV-评价粘膜佐剂的接受和耐受能力
在一临床研究中评价两种粘膜佐剂(CCG-PS和PEG6-CCG)的接受能力和忍受能力。本次研究包括了二十九个健康个体(15男，14女)，年龄都在18岁或以上。
处理方法包括五种不同的鼻腔喷射药剂。前两种含等渗盐水的药剂对于调查者和受验者都是明确的。将这两种盐水药剂立即用于两鼻孔，作为受验者和调查者评价检测佐剂的比较基础。其它的药剂，含有盐水(NS)，CCG-PS(RV)和PEG6-CCG(SG)，对于调查者和受验者都是盲目的。将三种药剂施用于鼻腔内，每种之间间隔30分钟，施用顺序如下：
              表12
        药剂1-药剂2-药剂3
鼻孔顺序 佐剂顺序 #受验者
右-左-右(RLR)  NS-RV-SGNS-SG-RVRV-SG-NSSG-RV-NS  5433
左-右-左(LRL)  NS-RV-SGNS-SG-RVRV-SG-NSSG-RV-NS  3234
收集调查者和受验者两方的评价。调查者的评价，通过调查者在每次用药后的三十分钟内给鼻腔内打分，对鼻腔红色程度、鼻腔分泌的增加和目视副反应进行综合判断。
受验者的评价通过说明刺激性给出，将每一药剂施用后0，5，10，20和30分钟后的刺激性与已知的盐水佐剂药剂相比较。受验者也将每次处理后的刺激感程度按大小排列。
总结调查者给定每种佐剂的评分。总结受验者在每一时间点给定每种佐剂的刺激性评分，每一时间点受验者的评分总和起来代表总的刺激性评分(受验者给定的)。统计方法是Mantel-Haenszelχ2检验法(MH)。分析中统计显著性水平是0.05。
二十三位受验者评价CCG-PS为“比盐水确切具有更大刺激性或更不舒服”(施药后立即感觉)(见表13)。对23位受验者中的20位来说，在20分钟内，明显的刺激性减小到最轻或没有，其他三人在施药后30分钟仍感到强烈刺激性。同时，调查者汇报相对于这三位受验者的，与CCG-PS有关的次要(2/3)或主要(1/3)刺激性。
相反的，12位受验者(统计显著性不同于CCG-PS)评价PEG6-CCG为“比盐水确切具有更大刺激性或更不舒服”(施药后立即感觉)(见表13)。对12位受验者中的9位来说，在20分钟内，明显的刺激性减轻。12中其他三人及另外一附加的受验者在施药后30分钟末仍感到与PEG6-CCG有关的强烈刺激性。
总结每一时间点对佐剂的刺激性评分。在0和5分钟时间点上，CCG-PS明显比PEG6-CCG更具有刺激性(P＜0.01，表13)。对两种佐剂刺激性的评分在最终时间点上并无差别。
在所有与接受3种未知药剂的刺激性之间进行直接比较(也就是，互相比较，不是与盐水比较)，CCG-PS是最具刺激性的佐剂。根据受验者中76％的人反映，CCG-PS是最刺激的佐剂。
                         表15
            盐水              CCG-PS             softigen
    差值  0   1  2  总和  0   1   2  总和  0    1   2  总和
总分钟0   26  3      3    1   5   23   51   1   16  12   405   28  1      1    2   13  14   41   7   20  2    2410   28  1      1    9   13  7    27   9   18  2    2220   28  1      1    19  7   3    13   12  14  3    2030   28              22  4   3    10   17  8   4    16
注意：与盐水比较的差别代码：0＝无不同；1＝略有不同；2＝十分不同
注意：RS＝先接受CCG-PS再接受Softigen；SR＝先接受PEG6-CCG再接受CCG-PS。
当就优选的实施方案特别解释和描述本发明时，应由本领域的技术人员所理解，其中在形式和细节上作出的各种变化，并未偏离本发明的精神和范围(附加权利要求书中限定的)。

Claims (45)

1.一种含水组合物，包含：
i)作为佐剂的0.01-70％v/v的水溶性甘油酯，甘油酯选自以下物质构成的组：取代甘油单酯，取代甘油二酯和取代甘油单酯与取代甘油二酯的混合物，所述物质具有分子式(I)：
其中的R1，R2和R3选自下列物质组成的组：饱和或不饱和C6-24脂肪酸，和水溶性聚合物，条件是甘油酯含有至少一个水溶性聚合物；
ii)至少一种抗原，其中抗原在所述水溶液中以溶解形式或颗粒形式存在；以及
iii)可选的生理上可接受的载体。
2.根据权利要求1的组合物，其中脂肪酸选自饱和和不饱和C6-14脂肪酸。
3.根据权利要求2的组合物，其中脂肪酸选自饱和C8-10脂肪酸。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中水溶性聚合物是具有2-30个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG2-30残基，氨基-PEG，亲核性-PEG，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸酯，PEG-琥珀酰亚胺，PEG-2，2，2-三氟乙磺酰酯，羧甲基化-PEG，PEG-丙酸，PEG-硅烷，PEG-磷酯，生物素-PEG或PEG-邻吡啶基二硫化物。
5.根据权利要求4的组合物，其中的水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基。
6.根据权利要求5的组合物，其中的甘油酯具有选自以下化合物组的结构：
7.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1。
8.根据权利要求7的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
9.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中取代甘油酯浓度以重量计从0.5％到20％。
10.根据权利要求9的组合物，其中取代甘油酯浓度以重量计从1％到15％。
11.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中甘油酯中的手性碳是S-或R-型，或者两者的混合形式。
12.根据权利要求1-3中任一项的组合物，进一步包含一种或多种选自下列的组分：表面活性剂，吸收促进剂，吸水聚合物，抑制酶降解的物质，醇，pH调节剂，增溶剂，稳定剂，HLB调节剂，粘度调节剂，防腐剂，渗透压调节剂，喷射剂，空气交换剂，水及其混合物。
13.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中抗原是一种免疫原。
14.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中抗原是一种疫苗。
15.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中的抗原用于治疗自身免疫疾病。
16.根据权利要求1的组合物在制造药物中的用途，其中，所述药物用于诱导接种疫苗、免疫、过敏反应治疗、癌症治疗、传染病治疗或自身免疫疾病治疗。
17.根据权利要求16的用途，其中施用是通过皮肤表面或粘膜表面进行的。
18.根据权利要求17的用途，其中，粘膜表面选自鼻、肺、口、眼、耳、胃肠道、生殖道、阴道和直肠的粘膜表面。
19.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中水溶性聚合物是具有2-30个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG2-30残基，氨基-PEG，亲核性-PEG，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸酯，PEG-琥珀酰亚胺，PEG-2，2，2-三氟乙磺酰酯，羧甲基化-PEG，PEG-丙酸，PEG-硅烷，PEG-磷酯，生物素-PEG或PEG-邻吡啶基二硫化物，并且其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1。
20.根据权利要求19的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
21.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基，并且其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1。
22.根据权利要求21的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
23.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中甘油酯具有选自下列的结构：
Figure C988069660005C1
并且，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1。
24.根据权利要求23的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
25.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基，并且其中甘油酯的浓度按重量计从1％到15％。
26.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；甘油酯的浓度按重量计从1％到15％。
27.根据权利要求26的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
28.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有2-30个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG2-30残基，氨基-PEG，亲核性-PEG，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸酯，PEG-琥珀酰亚胺，PEG-2，2，2-三氟乙磺酰酯，羧甲基化-PEG，PEG-丙酸，PEG-硅烷，PEG-磷酯，生物素-PEG或PEG-邻吡啶基二硫化物；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；抗原以颗粒形式存在。
29.根据权利要求28的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
30.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有2-30个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG2-30残基，氨基-PEG，亲核性-PEG，PEG-硫醇，PEG-琥珀酸酯，PEG-琥珀酰亚胺，PEG-2，2，2-三氟乙磺酰酯，羧甲基化-PEG，PEG-丙酸，PEG-硅烷，PEG-磷酯，生物素-PEG或PEG-邻吡啶基二硫化物；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；抗原以溶解形式存在。
31.根据权利要求30的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
32.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；抗原以颗粒形式存在。
33.根据权利要求32的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
34.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；抗原以溶解形式存在。
35.根据权利要求34的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
36.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中甘油酯具有选自下列的结构：
Figure C988069660007C1
并且，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；抗原以颗粒形式存在。
37.根据权利要求36的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
38.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中甘油酯具有选自下列的结构：
并且，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；抗原以溶解形式存在。
39.根据权利要求38的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
40.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；甘油酯的浓度按重量计从1％到15％；抗原以颗粒形式存在。
41.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；甘油酯的浓度按重量计从1％到15％；抗原以溶解形式存在。
42.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；甘油酯的浓度按重量计从1％到15％；抗原以颗粒形式存在。
43.根据权利要求42的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
44.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中，水溶性聚合物是具有3-6个聚氧乙烯单元的聚氧乙烯PEG3-6残基；取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从0.1∶99.9到99.9∶0.1；甘油酯的浓度按重量计从1％到15％；抗原以溶解形式存在。
45.根据权利要求44的组合物，其中取代甘油单酯和取代甘油二酯的％-v/v比例从5∶95到95∶5。
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