ES2267189T3

ES2267189T3 - Sistema de administracion de antigeno que comprende derivados de monoglicerido o de diglicerido como adyuvantes.

Info

Publication number: ES2267189T3
Application number: ES98935262T
Authority: ES
Inventors: Sveinbjorn Gizurarson; Vera Gudmundsdottir
Original assignee: LYFJATHROUN H F ICELANDIC; Lyfjathroun Hf Icelandic Bio Pharmaceutical Group
Current assignee: LYFJATHROUN H F ICELANDIC; Lyfjathroun Hf Icelandic Bio Pharmaceutical Group
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2018-07-09
Also published as: IS5329A; EP1003551A2; BR9810568A; WO1999002186A3; DE69834921D1; JP2001509491A; DE69834921T2; ATE329617T1; EP1003551B1; US20030099659A1; CA2295237A1; CN1262626A; WO1999002186A2; US6514503B1; KR20010021622A; CN1202863C; AU745849B2; IS4518A; AU8459898A

Abstract

Composición acuosa que comprende i) 0, 01-70% v/v de glicéridos solubles en agua como adyuvante, seleccionados de entre el grupo que consiste en monoglicéridos sustituidos y diglicéridos sustituidos, y mezclas de monoglicéridos sustituidos y diglicéridos sustituidos, presentando dichos glicéridos la fórmula (I): en la que R1, R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en ácidos grasos C6-24 saturados o insaturados y polímeros solubles en agua, con tal de que el glicérido contenga al menos un polímero soluble en agua; ii) al menos un antígeno; en el que el antígeno está en una forma disuelta o en una forma en partículas en dicha composición acuosa; iii) opcionalmente, un vehículo fisiológicamente aceptable.

Description

Sistema de administración de antígeno que comprende derivados de monoglicérido o de diglicérido como adyuvantes.

Antecedentes de la invención

La administración parenteral (intramuscular y subcutánea) de antígenos o vacunas normalmente se considera como la vía de administración más eficaz. Sin embargo, la administración mediante inyección tiene un número de desventajas. La inyección de un antígeno o de una vacuna requiere el uso de jeringuillas estériles, y la administración por un personal bien entrenado, y puede provocar dolor e irritación, particularmente en el caso de inyecciones repetidas. Esta vía de administración también presenta un riesgo de infección. Más significativamente, a menudo las inyecciones intramusculares son malamente toleradas por la persona, y pueden provocar posiblemente una induración (endurecimiento del tejido), hemorragia (sangrado) y/o necrosis (muerte local del tejido) en el sitio de la inyección.

La membrana de la mucosa contiene numerosas células dendríticas que son excelentes células presentadoras de antígenos. Las membranas de la mucosa también están conectadas con órganos linfoides, denominados tejido linfoide asociado a la mucosa, que son capaces de potenciar una respuesta inmunitaria a otras áreas de la mucosa. Un ejemplo de tal membrana de la mucosa es la membrana epitelial nasal, que consiste esencialmente de una sola capa de células epiteliales (epitelio pseudoestratificado); la membrana de la mucosa está conectada a dos tejidos linfoides, las vegetaciones adenoides y las amígdalas. La extensa red de capilares sanguíneos bajo la mucosa nasal, y la elevada densidad de células T y B, son particularmente adecuadas para proporcionar un reconocimiento rápido del antígeno, y para proporcionar una rápida respuesta inmunológica.

La administración intranasal de virus atenuados, bacterias y parásitos se ha intentado, junto con la administración a través de otras superficies de las mucosas, para patógenos particulares que normalmente infectan a un hospedante mediante esta vía. En tales casos, es de esperar que se provoque una respuesta inmunitaria por estos antígenos a través de las superficies de las mucosas, debido a que el patógeno vivo modificado de la vacuna está siguiendo la vía natural de infección o del patógeno natural, creando una inmunidad a través de una infección subclínica. La administración a la mucosa de composiciones inmunógenas es de particular interés, puesto que esta vía es capaz de estimular anticuerpos producidos localmente (anticuerpos IgA secretores), y evita los problemas ocasionados por la administración parenteral. Además, la administración a las mucosas se puede realizar típicamente mediante una persona no entrenada, incluyendo la persona a tratar, y los niños típicamente no se oponen a la administración a las mucosas como a la administración parenteral. Debido al riesgo asociado con la administración de patógenos vivos, atenuados, modificados, a menudo es deseable utilizar una vacuna subunitaria. Sin embargo, la administración a las mucosas de antígenos puros en una vacuna subunitaria está asociada normalmente con una mala respuesta
inmunitaria.

Se ha desarrollado una variedad de sistemas de vehículos para la administración de antígenos. Uno de los problemas encontrados al usar tales sistemas de vehículos, por ejemplo para la administración intranasal o a las mucosas, es que el antígeno y/o la vacuna se absorbe y se degrada sin reconocimiento y, por lo tanto, sin estimular una respuesta inmunológica, parcialmente debido al tiempo de contacto corto dentro de la cavidad nasal. Se ha descrito una mezcla de glicéridos de ácido caprílico/cáprico sustituido con polietilenglicol y Tween 20®, para uso como un adyuvante de las mucosas (Gizurarson et al., Toxicology 107:61-68 (1996); Gizurarson et al., Vaccine Research 5:69-75 (1996); Gizurarson et al., Vaccine Research 6:41-47 (1997)); sin embargo, esta formulación produce una sensación de escozor desagradable en el receptor en el sitio de administración. De este modo, existe la necesidad de una formulación eficaz para la administración a las mucosas de antígenos, para producir una respuesta inmunitaria
aceptable.

La patente EP nº 0544612A2 describe una composición que comprende un inmunógeno y un triglicérido que se puede administrar oral o nasalmente. La composición puede potenciar el efecto del inmunógeno.

En una referencia (patente U.S. nº 4.610.868; presentada el 9 de septiembre de 1989) se describe un vehículo de matriz lipídica para la administración parenteral de fármacos. Este sistema requiere un vehículo de matriz lipídica que comprende un compuesto hidrófobo, un compuesto anfipático y un agente bioactivo con una estructura globular con 500-104040 nm de diámetro. Aquí, el compuesto hidrófobo puede comprender una mezcla de glicéridos, y el compuesto anfipático puede comprender un esfingolípido. Además, esta formulación se puede administrar en el área nasal. Este sistema puede no ser aceptable como la formulación nasal, debido al aclaramiento rápido dentro de la nariz, y a la gran estructura globular. Por lo tanto, este sistema será eliminado, hacia el estómago, por los cilios antes de que se libere el agente bioactivo. Esta patente no describe el uso de la sustancia adyuvante según la invención.

En el documento JP 309347/91 (prioridad del 25 de noviembre de 1991), se describe una composición inmunógena administrada oral o nasalmente que comprende un inmunógeno capaz de inmunizar a mamíferos usando un adyuvante que comprende triglicéridos con un resto de C_{6-26} de un ácido graso saturado o insaturado. El uso de ácidos grasos saturados no induce la respuesta inmune según la invención, y el uso de triglicéridos no da las posibilidades de tener un grupo hidrófilo capaz de solubilizar el adyuvante, o de tener la posibilidad de conectar el antígeno al
adyuvante.

El documento WO 94/17827 (prioridad del 15 de febrero de 1993) describe una preparación farmacéutica para la administración tópica de antígenos a mamíferos, a través de las membranas de las mucosas. La preparación del adyuvante/vehículo se selecciona de (a) monoésteres de polioxietilensorbitán, (b) aceite de ricino polioxietilenado, (c) glicéridos caprílicos/cápricos, y (d) gangliósidos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición acuosa que se puede usar como un adyuvante para la administración de antígenos y vacunas, particularmente para la administración a las mucosas. Las composiciones de la presente invención proporcionan una adhesión mejorada del antígeno a la membrana de la mucosa, así como una absorción mejorada del antígeno a través de la mucosa. El uso de las composiciones de la invención proporciona la capacidad para provocar una respuesta inmunitaria tanto sistémica (por ejemplo, anticuerpos del isotipo IgG) como local (por ejemplo, anticuerpos secretores del isotipo IgA) en los receptores de la composición, sin provocar una irritación inaceptable de la membrana epitelial. La invención también proporciona un sistema de administración controlada para la aplicación intranasal, que es biocompatible con la mucosa, y que es capaz de administrar las cantidades requeridas de antígenos en pequeños volúmenes.

La presente invención pertenece a composiciones como se definen en la reivindicación 1.

En una realización particular, los polímeros solubles en agua consisten en restos de PEG_{2-30} de polioxietileno, o sus derivados, que tienen 2-30 unidades polioxietilénicas.

En una realización adicional de la invención, el polímero soluble en agua es un resto de PEG_{3-6} de polioxietileno que tiene 3 a 6 unidades polioxietilénicas. En una realización preferida de la invención, los glicéridos tienen una estructura seleccionada de entre el grupo que consiste en:

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(II)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{6} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- R_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

(III)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- R _{2} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- PEG_{6}

\vskip1.000000\baselineskip

(IV)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
PEG _{3} }}

H --- O --- R_{1}

\vskip1.000000\baselineskip

(V)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- PEG_{3}

en las que, en cada fórmula, R_{1} y R_{2} son tal como se han definido anteriormente.

En realizaciones particulares de la invención, R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan de ácidos grasos C_{6-14} saturados, más preferentemente ácidos grasos C_{8-16} saturados.

Las composiciones de la invención modulan la respuesta inmunitaria al antígeno; esto es, la composición inmunógena o de vacuna es capaz de mejorar cuantitativa y/o cualitativamente la respuesta del anticuerpo del hospedante vacunado. Esto se puede lograr, por ejemplo, aumentando el número de anticuerpos producidos con la inmunización con el antígeno (por ejemplo, una mejora cuantitativa), o alterando el perfil de la respuesta inmunitaria, tal como desde una respuesta Th1 a una respuesta Th2 (por ejemplo, una mejora cualitativa).

La composición de la invención se puede usar para provocar o aumentar una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células del hospedante, que comprende administrar a un hospedante vertebrado una cantidad eficaz de una composición inmunógena que comprende un antígeno y un adyuvante que contiene 0,01-70% v/v de glicéridos seleccionados de entre el grupo que consiste en monoglicéridos, diglicéridos, y mezclas de los mismos, teniendo dichos glicéridos las fórmulas (I) a (V) como se describe anteriormente. En una realización particular, la respuesta inmunitaria está provocada por la administración a la mucosa de la composición.

La invención también se refiere a métodos para provocar o aumentar una inmunidad humoral y/o mediada por células del vacunado, para una respuesta inmunitaria protectora, que comprende administrar a un hospedante vertebrado una cantidad eficaz de una composición de vacuna que comprende un antígeno y un adyuvante que contiene 0,01-70% v/v de glicéridos seleccionados de entre el grupo que consiste en monoglicéridos, diglicéridos, y sus mezclas, teniendo dichos glicéridos las formas (I) a (V) como se describe anteriormente. En una realización particular, la respuesta inmunitaria está provocada por la administración a la mucosa de la composición.

Descripción detallada de la invención

El sistema inmunitario usa muchos mecanismos para atacar patógenos; sin embargo, no todos estos mecanismos son activados necesariamente tras la inmunización. La inmunidad protectora inducida por la vacunación depende de la capacidad de la vacuna para provocar la respuesta inmunitaria apropiada para resistir o eliminar el patógeno. Dependiendo del patógeno, esto puede requerir una respuesta inmunitaria mediada por células y/o humoral. A menudo, es deseable reforzar la potencia inmunógena de un antígeno a fin de obtener una respuesta inmunitaria más fuerte en el organismo que se inmuniza, y para fortalecer la resistencia del hospedante al agente que lleva el antígeno. Generalmente, una sustancia que potencia la inmunogenicidad de un antígeno con el que se administra (ya sea simultáneamente o próximo en el tiempo) es conocida como un adyuvante. Como se usa en la presente memoria, el término "adyuvante", en relación a las composiciones de la invención, está destinado a englobar composiciones que tienen un efecto adyuvante tradicional (por ejemplo, que potencian la inmunogenicidad de un antígeno aumentando o alterando la respuesta del anticuerpo al mismo), así como a composiciones que potencian la presentación del antígeno a las células o tejidos apropiados (por ejemplo, un vehículo de administración de antígeno).

Para la administración intranasal, se debe aplicar un antígeno a la mucosa de tal manera que sea capaz de penetrar o de ser absorbido a través de la mucosa o del tejido linfoide hasta las células inmunocompetentes, y de forma que no se elimine por lavado mediante las secreciones nasales. También, el antígeno se debe de administrar sobre la mucosa nasal de tal manera que las células que presentan el antígeno absorban el antígeno y lo transporten al sistema linfoide local. A fin de penetrar el moco, el vehículo de administración debe tener cierto grado de biocompatibilidad con la mucosa, y por tanto debe tener un cierto grado de hidrofilia e hidrofobia.

El trabajo descrito en la presente memoria se refiere a la utilidad de las composiciones descritas en este documento como adyuvantes de la mucosa. En consecuencia, la presente invención se refiere a composiciones acuosas, por ejemplo composiciones inmunógenas o de vacuna, que comprenden un antígeno y un adyuvante que contiene 0,01-70% v/v de glicéridos seleccionados de entre el grupo que consiste en monoglicéridos, diglicéridos, y sus mezclas. Por ejemplo, los monoglicéridos y/o los diglicéridos pueden estar sustituidos. Los monoglicéridos y diglicéridos que se incorporan en las composiciones de la presente invención se representan mediante la fórmula general
(I):

(I)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- R _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- R_{2}

en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en ácidos grasos C_{6-24} saturados o insaturados, polímeros solubles en agua, con la condición de que el glicérido contenga al menos un polímero soluble en agua. El adyuvante también puede contener pequeñas cantidades de triglicéridos.

Se puede seleccionar cualquier ácido graso C_{6-24} saturado o insaturado, incluyendo, pero sin limitarse a, restos de ácidos grasos derivados de ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido araquidónico, ácido propiónico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Los restos de ácidos grasos pueden ser un único resto o una mezcla de dos o más restos. Estos pueden derivar de fuentes naturales o sintéticas, tales como grasas y aceites. Se pueden usar glicéridos comercialmente disponibles, o se pueden sintetizar enzimáticamente por medio de lipasas, incluyendo lipasas tanto específicas como no específicas, que colocan a los ácidos grasos en sitios específicos tales como 1; 2; 1,2; 1,3; e igualmente estructuras racémicas específicas, etc. Por ejemplo, se suspende glicerina (0,92 g), adsorbida sobre 1 g de gel de sílice, con 20 ml de tBuOMc. Se añadieron a la suspensión caprilato de vinilo (3,4 g) y lipasa (50 mg) de Rhizopus delemar. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 96 horas, y el progreso de la reacción se monitorizó por medio de TLC. Tras la eliminación de los componentes sólidos mediante filtración, y la evaporación del disolvente, se obtuvo una mezcla de reacción bruta que contenía aproximadamente 91% de glicérido 1,3-dicaprílico.

El polímero soluble en agua puede ser el que haga al glicérido más hidrófilo (preferentemente totalmente soluble sin el uso de tensioactivo) en disoluciones acuosas, particularmente vehículos fisiológicamente aceptables para la administración de vacunas. Un polímero soluble en agua deseable es aquel que sea biocompatible con el tejido al que se administra, particularmente las mucosas. Los polímeros solubles en agua adecuados que tienen estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, derivados de polietilenglicol (incluyendo, pero sin limitarse a, amino-PEG, PEG nucleófilo, PEG-tiol, succinato de PEG, PEG-succinimida, tresilato de PEG, PEG carboximetilado, ácido PEG-propiónico, PEG-silanos, PEG-fosfolípidos, biotin-PEG y disulfuro de PEG-ortopiridilo), glucofurol, propilenglicol, dextranos y sacáridos.

Se prefieren polímeros de polietilenglicol que tienen desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 30 unidades de polietilenglicol (PEG_{2,30}), siendo más preferibles aquellos que tienen aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6 unidades de polietilenglicol (PEG_{3-6}). Se puede incorporar en la fórmula del glicérido uno o dos restos de PEG, otros polímeros solubles en agua, o combinaciones. El resto soluble en agua puede estar en una cualquiera de las posiciones R_{1}, R_{2} o R_{3} del glicérido.

Los polímeros se pueden unir al glicérido mediante enlaces covalentes formados química o enzimáticamente. Los polímeros se pueden acilar al glicérido, o se pueden enlazar usando enlaces de tipo éster, tales como, por ejemplo, mediante la síntesis a través de esterasas. Por ejemplo, se puede mezclar Solketal con un cloruro de polímero en trietanolamina y triclorometano, con lo que después los enlaces de glicerina libres se desprotegen calentando en ácido acético acuoso diluido. Con exceso de cloruro de caproilo en presencia de trietilamina y 4-dimetilaminopiridina como catalizador, los ácidos grasos se enlazan a los enlaces de glicerina libres. El resultado de esta síntesis será un glicérido polimérico de caproilo.

El antígeno se puede unir al resto glicérido mediante unión covalente. En otra realización de la invención, la composición comprende una mezcla de monoglicéridos y diglicéridos, de tal forma que la relación en % v/v de monoglicéridos a diglicéridos está en el intervalo de 0,1:99,9 a 99,9:0,1, y preferentemente en el intervalo de 5:95 a 95:5. En una realización adicional de la invención, el polímero soluble en agua es un resto de PEG_{3-6} de polioxietileno que tiene 3 a 6 unidades de polioxietileno. La invención se refiere además a las composiciones descritas, en las que los glicéridos tienen una estructura seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(II)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{6} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- R_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

(III)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- R _{2} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- PEG_{6}

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(IV)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
PEG _{3} }}

H --- O --- R_{1}

\vskip1.000000\baselineskip

(V)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- PEG_{3}

en las que R_{1} y R_{2} son tal como se ha definido anteriormente.

En una realización de la invención, R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan de ácidos grasos C_{6-14} saturados, más preferentemente ácidos grasos C_{3-10} saturados. En otra realización de la invención, los glicéridos tienen una concentración desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 20%, y preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 15% en peso. En realizaciones particulares de la invención, los carbonos quirales en el glicérido están en forma S o R.

Las composiciones adyuvantes de la invención modulan la respuesta inmunitaria al antígeno, esto es, la composición inmunógena o de vacuna es capaz de provocar una inmunidad mediada por células del hospedante vacunado para generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo una respuesta inmunitaria protectora, frente al antígeno patógeno.

Las composiciones adyuvantes según la invención se pueden usar para provocar toda respuesta inmunitaria al antígeno en un vertebrado tal como un hospedante mamífero. Por ejemplo, el antígeno se puede seleccionar del grupo que incluye, pero que no se limita a, la toxina del tétanos, el virus de la gripe, el toxoide diftérico, gpl 20 de VIH, la proteasa de IgA, el péptido B de la insulina, vibriones, salmonelas, Spongospora subterranea, el virus sincitial respiratorio (RSV) (por ejemplo, una vacuna subunitaria de RSV), proteínas de la membrana externa de Haemophilus influenza, la ureasa de Helicobacter pylori y proteínas pilínicas recombinantes de Neisseria meningitidis y N. gonorrohoene, o una porción del mismo que retiene la capacidad para estimular una respuesta inmunitaria. La capacidad de las porciones de un antígeno dado para estimular una respuesta inmunitaria se puede evaluar mediante métodos reconocidos en la técnica, tales como el inmunoensayo enzimático frente a péptidos específicos dentro de una porción para detectar anticuerpos que reconocen esa porción particular (respuesta humoral), o un ensayo de hipersensibilidad de tipo retrasado frente a péptidos específicos en esa porción para detectar una respuesta inmunitaria mediada por células frente a los mismos.

El término "antígeno" pretende incluir una molécula que contiene uno o más epítopos que estimulan un sistema inmunitario del hospedante para producir una respuesta inmunológica humoral, celular y/o secretora. El antígeno puede ser un antígeno subunitario, así como bacterias, virus, protozoos, hongos, parásitos u otros microbios muertos, atenuados o inactivados. El antígeno puede ser, por ejemplo, una proteína, un péptido, un polisacárido, un lípido o un antígeno de ADN. Los antígenos adecuados pueden derivar de, por ejemplo, las especies Pasteurella, Actinobacillus, Chlarnydia, Moraxella, Neisseria, Streptococcus, Haemophilus, Salmonella y Eimerla, así como de rotavirus, virus del herpes (por ejemplo, BHV-1, EHV-1), PRV, parvovirus, virus de la rabia, virus de la gripe, virus paragripales, virus de la hepatitis, VIH, picomavirus, antígenos tumorales, hormonas, análogos de hormonas, y similares.

El antígeno en la composición según la invención es adecuado para inducir la vacunación, la inmunización, el tratamiento de la alergia, el tratamiento del cáncer, el tratamiento de una enfermedad infecciosa, el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o el tratamiento de una enfermedad que se ve afectada por el sistema inmunitario. Por lo tanto, el antígeno puede ser una vacuna, tal como una vacuna antibacteriana, antivírica, antifúngica, antipriónica, antiparasitaria, o componentes producidos por microorganismos tales como proteasas de IgA, proteína p38, proteína p43 o mucinasa. El antígeno también puede ser un alérgeno, tal como ácaro del polvo doméstico, alérgeno de gato doméstico, polen de ballica, polen de artemisa pequeña, mosca enana, clara de huevo, proteína de la leche, veneno de abeja, alérgeno de avispón de cara blanca, etc., o componentes responsables de la inducción de enfermedades autoinmunitarias, tales como miclina, péptido B de insulina, y similares. El antígeno también se puede usar como una vacuna para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tales como herpes, VIH, papiloma, cándida, esclerosis múltiple, tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes, hipo- e hipertiroidismo, psoriasis, artritis, o el tratamiento de cáncer.

Los antígenos adecuados para las composiciones de vacuna de la presente invención incluyen cualquier entidad capaz de producir una respuesta inmunológica mediada por células o por anticuerpos, dirigida específicamente contra esa entidad en un vertebrado expuesto al antígeno. Se puede emplear uno o más antígenos. El antígeno o antígenos pueden derivar de microorganismos patógenos que incluyen virus, bacterias, micoplasmas, hongos, protozoos y otros parásitos. Además, el antígeno o antígenos pueden derivar de fuentes distintas de microorganismos, por ejemplo células o alérgenos del cáncer. El antígeno o antígenos pueden ser total o parcialmente un microorganismo patógeno, o total o parcialmente una proteína, glicoproteína, glicolípido, polisacárido o lipopolisacárido, que esté asociado con el organismo.

Los microorganismos patógenos, de los que pueden derivar o se pueden producir los antígenos con el fin de obtener vacunas, son bien conocidos en el campo de las enfermedades infecciosas, como se enumeran en, por ejemplo, Medical Microbiology, Segunda Edición, (1990) J.C. Sherris (ed.), Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York.

El antígeno se puede usar en forma de partículas, o disuelto. La formulación es especialmente adecuada para antígenos disueltos; sin embargo, también son fáciles de preparar en la formulación las formas en partículas. Para la vacunación y la inmunización, la forma en partículas a menudo ha sido ventajosa, pero, para inducir tolerancia, por ejemplo para el tratamiento de alergia o de enfermedades autoinmunitarias, se prefiere un antígeno
disuelto.

La actividad del adyuvante inmunológico de un adyuvante, ya sea solo o con un antígeno particular, se puede evaluar usando métodos conocidos en la técnica, tales como ELISA, ensayos de hemoaglutinación y ensayos de neutralización. Como se usa en la presente memoria, "actividad adyuvante inmunológica" pretende significar la capacidad para potenciar una respuesta inmunológica en un hospedante al que se administran el adyuvante y el antígeno. Típicamente, el adyuvante se administrará con el antígeno, ya sea en la misma mezcla o como (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional nº WO 93/05789), o al mismo tiempo pero en una composición o formulación separada. La actividad adyuvante incluye, pero no se limita a, la capacidad para potenciar la respuesta inmunológica al antígeno aumentando la inmunogenicidad del antígeno, o reduciendo la dosis o cantidad de antígeno requerida para producir una respuesta inmunitaria.

Como se usa en la presente memoria, una "respuesta inmunitaria" o "respuesta inmunológica" a un antígeno particular pretende incluir la producción de una respuesta secretora, mediada celularmente, humoralmente o por anticuerpos, frente al antígeno (o una respuesta generalizada). La manifestación de la respuesta en el hospedante inmunizado puede incluir la producción de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), la proliferación de linfocitos B y/o T, la estimulación de linfocitos T citotóxicos que reconocen células que presentan al antígeno, la expansión de poblaciones de células T, y la potenciación de señales que provocan la diferenciación, activación o crecimiento de células del sistema inmunitario.

Típicamente, la administración de los adyuvantes provocará o dará como resultado una respuesta inmunitaria potenciada frente a un antígeno de interés. En este contexto, "potenciada" pretende significar que la respuesta inmunitaria al antígeno es cuantitativamente mayor y/o cualitativamente mejor en presencia del adyuvante que en ausencia del adyuvante. Las comparaciones de las respuestas inmunitarias en presencia y ausencia de los adyuvantes se pueden realizar mediante métodos normales, tales como comparaciones de los títulos de anticuerpos mediante radioinmunoensayo o ELISA de formulaciones que comprenden el adyuvante y el antígeno, y controles apropiados. La respuesta inmunitaria potenciada puede ser el resultado de un efecto directo sobre el sistema inmunitario del individuo (por ejemplo, una estimulación de células T y B para aumentar la respuesta al antígeno), o puede resultar de una presentación más ventajosa del antígeno a la mucosa (por ejemplo, proporcionando una mejor adhesión a la mucosa para permitir un período de contacto más prolongado entre el antígeno y la mucosa, o potenciando la absorción del antígeno a través de la mucosa, por ejemplo aumentando la permeabilidad de la mucosa).

Los adyuvantes se pueden usar como se describe en la presente memoria para potenciar la respuesta inmunológica a un antígeno. En una realización particular, el adyuvante es un adyuvante de la mucosa. Por ejemplo, el adyuvante se puede usar en una composición para inmunizar a un mamífero frente a un patógeno particular o antígeno subunitario, o para estimular una respuesta inmunitaria frente a un antígeno particular.

La composición de la presente invención se administra a un mamífero, particularmente a un ser humano u otro primate, como una dosis inmunológicamente eficaz de una composición inmunógena o de vacuna que comprende un antígeno y una cantidad adyuvante de un adyuvante de la invención. Como se usa en la presente memoria, una "cantidad adyuvante" o una "cantidad eficaz" del adyuvante, pretende significar una cantidad que potencie una respuesta inmunitaria frente a un antígeno coadministrado. Por ejemplo, las dosis desde aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 40%, y más particularmente desde aproximadamente 0,1% hasta aproximadamente 20%, serán típicamente eficaces para proporcionar un efecto adyuvante; sin embargo, se producirán variaciones en estas dosis, dependiendo del adyuvante particular. Además, la dosis particular dependerá de la edad, del peso y del estado médico del mamífero a tratar, así como del método de administración. Las dosis adecuadas se determinarán fácilmente por la persona experta.

La composición acuosa de la presente invención se puede administrar opcionalmente en un vehículo acuoso farmacéutica o fisiológicamente aceptable, tal como una disolución salina fisiológica o tamponada con fosfato, o agua. La formulación, que incluye los elementos según la invención, puede ser una suspensión, y puede proporcionar el adyuvante en mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión, y/o uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados son, por ejemplo, fosfátidos de origen natural, por ejemplo lecitina, o lecitina de haba de soja, productos de condensación de óxido de etileno con, por ejemplo, un ácido graso, un alcohol alifático de cadena larga, o un éster parcial derivado de ácidos grasos y un hexitol o un anhídrido de hexitol, por ejemplo estearato de polioxietileno, monooleato de polioxietilensorbitol, monooleato de polioxietilensorbitán, etc. Los agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, gomas de origen natural tales como, por ejemplo, goma arábiga, goma de xantana, o goma de tragacanto; celulosas tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina (por ejemplo Avicel® RC 591), metilcelulosa; alginatos tales como, por ejemplo, alginato de sodio, etc. Los ejemplos adecuados de conservantes para uso en las formulaciones según la invención son parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o de propilo, y cloruro de benzalconio.

Para la aplicación a la mucosa rectal o vaginal, las formulaciones adecuadas para uso según la invención incluyen supositorios (de tipo suspensión), enemas, y cápsulas de gelatina rectales (disoluciones o suspensiones). Las bases farmacéuticamente aceptables apropiadas para supositorios incluyen manteca de cacao, ácidos grasos esterificados, gelatina glicerada, y diversas bases solubles o dispersables en agua, como polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos con polioxietilensorbitán. También se pueden incorporar diversos aditivos, por ejemplo potenciadores o tensioactivos.

Para la aplicación a la mucosa nasal, son composiciones adecuadas para uso según la invención los pulverizadores y aerosoles nasales para inhalación. En una formulación nasal típica, la sustancia activa está presente en forma de una formulación en partículas opcionalmente dispersa en un vehículo adecuado. Los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables, y otros materiales farmacéuticamente aceptables, presentes en la composición, tales como diluyentes, potenciadores, agentes aromatizantes, conservantes, y similares, se seleccionan todos según la práctica farmacéutica convencional de una manera comprensible por las personas expertas en la técnica. Después de la administración de una formulación nasal, el antígeno se puede adsorber sobre la mucosa nasal. Se cree que la adsorción a la mucosa conduce a un efecto menos irritante que cuando se emplea, por ejemplo, un vehículo líquido tal como aquel que contiene un potenciador o promotor de la penetración. Otras superficies de la mucosa que son adecuadas para la administración de las formulaciones son la nariz, los pulmones, la boca, los ojos, los oídos, el aparato digestivo, el aparato genital, la vagina, el recto o la piel, o, en los peces, las agallas.

Para la aplicación a la piel, las formulaciones pueden contener vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales, incluyendo microesferas y liposomas. Las formulaciones incluyen cremas, ungüentos, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, disoluciones, suspensiones, bastoncillos, pulverizadores, pastas, emplastos, y otros tipos de sistemas de administración de fármacos transdérmicos. La formulación se puede administrar como una pulverización nasal, como gotas nasales, como polvo nasal, espuma nasal, o como un ungüento nasal, a la superficie de la mucosa, o a los adenoides de la nariz, o como una pulverización oral, gotas orales, polvo oral, espuma oral o como un ungüento oral, especialmente dirigido al área de la boca o a las amígdalas de la garganta. La formulación también puede estar en forma de colirios.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir antioxidantes, agentes tamponantes, conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración, agentes quelantes, agentes formadores de geles, bases para ungüentos, perfumes, y agentes protectores de la piel. Los ejemplos de antioxidantes son hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico y sus derivados, tocoferol y sus derivados, hidroxianisol butilado, y cisteína. Los ejemplos de conservantes son parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o de propilo, y cloruro de benzalconio. Los ejemplos de humectantes son glicerina, propilenglicol, sorbitol, y urea. Los ejemplos de potenciadores de la penetración son propilenglicol, DMSO, trietanolamina, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 2-pirrolidona y sus derivados, alcohol tetrahidrofurfurílico, y Azone®. Los ejemplos de agentes quelantes son EDTA sódico, ácido cítrico, y ácido fosfórico. Los ejemplos de otros excipientes son aceites comestibles tales como aceite de almendra, aceite de ricino, manteca de cacao, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de amapola, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de haba de soja, aceite de girasol, y aceite de semilla de té; y polímeros tales como carmelosa, carmelosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, quitosano, pectina, goma de xantana, carragenano, goma de algarrobilla, goma arábiga, gelatina, y alginatos. Los ejemplos de bases para ungüentos son cera de abeja, parafina, palmitato de cetilo, aceites vegetales, ésteres de sorbitán con ácidos grasos (Span), polietilenglicoles, y productos de condensación entre ésteres de sorbitán con ácidos grasos y óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitán (Tween®). Las formulaciones mencionadas anteriormente para la administración tópica también se pueden aplicar a la piel, a las agallas de los peces, o a las superficies externas o semillas de plantas. Las formulaciones también pueden ser adecuadas para la aplicación directa o para la introducción en un orificio u orificios pertinentes, o en el organismo, por ejemplo los orificios rectal, uretral, vaginal u oral. La formación se puede aplicar simplemente de forma directa sobre la parte a inmunizar, tal como, por ejemplo, la
mucosa.

Muchas formulaciones para la mucosa necesitan algunas mezclas más especializadas de excipientes. Por lo tanto, muchas formulaciones pueden comprender uno o más tensioactivos y/o promotores de la absorción y/o polímeros que absorban agua y/o sustancias que inhiban la degradación enzimática y/o alcoholes, agentes para el control del pH, solubilizantes, estabilizantes, agentes para el control de HLB, agentes para el control de la viscosidad, conservantes, agentes para el control de la presión osmótica, propelentes, desplazadores del aire, agua y sus mezclas. Los tensioactivos se pueden seleccionar de nonoxinol, octoxinol, Tweens, Spans, laurilsulfato de sodio, monopalmitato de sorbitán; los promotores de la absorción se pueden seleccionar de éteres de alcoholes polioxietilénicos, sales biliares y sus derivados, ácido fusídico y sus derivados, ácido oleico, lecitina, lisolecitinas, Tweens 20-85, mono-/di- y triglicéridos, quitosano, ciclodextrano; los polímeros que absorben agua se pueden seleccionar de glucofuroles y sus derivados, polietilenglicol 200-7500 y sus derivados, polivinilpirrolidona, poli(ácido acrílico), propilenglicol, gelatina, celulosa y sus derivados; las sustancias que inhiben la degradación enzimática se pueden seleccionar de aprotinina, DFP, carbopol; los aceites se pueden seleccionar de aceites vegetales, aceite de haba de soja, aceite de cacahuete, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de girasol, Miglyols; los agentes para el control del pH se pueden seleccionar de ácido acético, ácido clorhídrico, ácido nítrico, metafosfato potásico, fosfato potásico, acetato de sodio, amoníaco, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, borato de sodio, trolamina; los solubilizantes se pueden seleccionar de alcohol, alcohol isopropílico, glucofurol, agua, polietilenglicol 200-7500; los estabilizantes tales como ciclodextrinas; los agentes para el control de HLB se pueden seleccionar de Tween® 20-85, Span 20-80, Brij 30-98, goma arábiga; los agentes para el control de la viscosidad se pueden seleccionar de celulosa y sus derivados, Tweens® y sus derivados, polietilenglicol y sus derivados, alcohol cetílico, glicerina, propilenglicol, sorbitol, gelatina; los conservantes se pueden seleccionar de sal de benzalconio, alcohol bencílico, fenol, timerosal, nitrato de fenilmercurio, alcohol feniletílico, clorobutanol, cloruro de cetilpiridinio; los agentes para el control de la presión osmótica se pueden seleccionar de dextrosa, cloruro de sodio, manitol; y los propelentes se pueden seleccionar de diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetano, tricloromonofluorometano y otros propelentes que no dañan la capa de ozono, tales como butano; el agente de desplazamiento del aire puede ser nitrógeno.

Para las composiciones líquidas, es esencial que la cantidad eficaz del antígeno se pueda administrar en un volumen apropiado. Para la administración nasal, el volumen no debe superar aproximadamente 300 \mul para un paciente humano. Un volumen más grande puede ser desagradable para el paciente, y escurrirá por la nuez anteriormente a través de las fosas nasales, o posteriormente hacia la faringe. El resultado es que una parte del antígeno y/o de la vacuna se pierde desde el sitio de absorción. El volumen es preferentemente desde aproximadamente 20 \mul hasta aproximadamente 125 \mul, y se administra preferentemente en una fosa nasal. Para la administración al área bucal y rectal, se debe de usar un volumen que no supere los 10 ml. Para la administración a los ojos y a los oídos, se debe de usar un volumen que no supere los 300 \mul. Para la administración a los pulmones, se debe de usar un volumen que no supere los 2 ml. Para la administración a la vagina, se debe de usar un volumen que no supere 30 ml. Para la administración al aparato digestivo, se debe de usar un volumen que no supere 100 ml.

La composición de vacuna puede comprender opcionalmente componentes adicionales, tales como agentes tamponantes, conservantes y adyuvantes, tales como aceites vegetales o sus emulsiones, sustancias tensioactivas, por ejemplo hexadecilamina, ésteres de octadecilaminoácidos, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N',N'-bis-(2-hidroxietil-propanodiamina), metoxihexadecilglicerol, y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo pirano, sulfato de dextrano, poli 1C, carbopol, péptidos, por ejemplo dipéptido muramílico, dimetilglicina, tuftsina; complejos estimulantes inmunitarios; emulsiones de aceites; lipopolisacáridos tales como MPI.50 (lípido A monofosforílico 3-O-desacilado (RTBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana); geles minerales, y oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los antígenos en la composición de la presente invención también se pueden incorporar en liposomas, cocleatos, polímeros biodegradables tales como polilactida, poliglicolida y polilactida-co-glicolidas, o ISCOMS (complejos inmunoestimulantes), y también se pueden emplear ingredientes activos suplementarios.

Los antígenos en la composición de la presente invención también se pueden administrar en combinación con toxinas bacterianas y sus derivados atenuados como adyuvantes adicionales o moléculas portadoras. Otras moléculas portadoras adecuadas incluyen seroalbúminas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulinas, inmunoglobulina, ovoalbúmina, polisacáridos (por ejemplo, sefarosa, agarosa, celulosa), partículas de virus inactivos, y copolímeros de aminoácidos. Los antígenos en la composición de la invención también se pueden administrar en combinación con linfoquinas, incluyendo, pero sin limitarse a, interleuquina-2, IFN-\gamma y GM-CSF. Los antígenos de la invención también se pueden expresar in vivo tras la administración de ADN que codifica estos antígenos.

Las vacunas se pueden administrar a un ser humano o a un animal mediante una variedad de vías, incluyendo, pero sin limitarse a, las vías de administración parenteral, intraarterial, intradérmica, transdérmica (tal como mediante el uso de polímeros de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intraocular, sublingual, intravenosa, subcutánea, oral e intranasal. En una realización preferida, la composición se administra a través de una mucosa. La cantidad de antígeno empleado en tales vacunas variará dependiendo de la identidad del antígeno. El ajuste y la manipulación de los intervalos establecidos de dosis usados con antígenos portadores tradicionales para la adaptación a la vacuna están dentro de las capacidades de los expertos en la materia. Las vacunas están destinadas para uso en el tratamiento de animales de sangre caliente tanto inmaduros como adultos, y, en particular, de seres humanos. La administración de las composiciones de la invención también se puede lograr usando métodos de terapia génica (véanse, por ejemplo, la patente U.S. 5.580.859 y las publicaciones de solicitudes PCT publicadas nº WO 93/19183 de Robinson et al. y WO 97/44446 de Malone et al.).

La acción adyuvante para la mucosa, de los adyuvantes de la invención, tiene un número de implicaciones importantes. La capacidad adyuvante para la mucosa puede aumentar la concentración de anticuerpos protectores producidos frente a un antígeno administrado a través de las mucosas en el organismo vacunado. Como resultado, se puede lograr una vacunación eficaz con una cantidad de antígeno más pequeña que la que se requeriría normalmente. Esta reducción en la cantidad requerida de antígeno puede conducir a un uso más amplio de las vacunas, que son difíciles y costosas de preparar. Adicionalmente, el uso de adyuvantes de la invención puede potenciar la capacidad de los antígenos que sean débilmente antigénicos o pobremente inmunógenos, particularmente cuando se administran a través de las mucosas, para provocar una respuesta inmunitaria. También puede proporcionar una vacunación más segura cuando el antígeno es tóxico a la concentración requerida normalmente para la inmunización eficaz a través de las mucosas. Reduciendo la cantidad de antígeno, se reduce el riesgo de reacción tóxica. También puede proporcionar una vacunación más segura para permitir el uso de una formulación de antígeno o de vacuna que sea segura a través de la vía de las mucosas, pero tóxica mediante la vía parenteral.

Típicamente, los regímenes de vacunación exigen la administración de antígeno durante un período de semanas o meses, a fin de estimular una respuesta inmunitaria "protectora". Una respuesta inmunitaria protectora es una respuesta inmunitaria suficiente para evitar la infección o reducir la gravedad de la infección (en comparación con la gravedad de la infección en ausencia de la respuesta inmunitaria provocada), ocasionada por un patógeno o patógenos particulares a los que está dirigida la vacuna. El uso de adyuvantes en la composición de la invención puede reducir el transcurso de tiempo de los regímenes eficaces de vacunación. En algunos casos, puede dar como resultado la generación de una respuesta protectora en una única dosis. Las composiciones de la presente invención también son útiles terapéuticamente, para reducir el número y la gravedad de episodios sintomáticos en los pacientes ya infectados con el antígeno. Las composiciones de vacunas también se pueden usar como una inmunización de refuerzo oral para los antígenos administrados parenteralmente.

La formulación es especialmente adecuada para seres humanos, incluyendo infantes, adolescentes, jóvenes, adultos y ancianos. La naturaleza de la formulación proporciona la capacidad para potenciar la respuesta inmunitaria frente a una variedad de patógenos, y por lo tanto la formulación se puede usar para personas con diversas patologías, tales como seres humanos con una enfermedad, por ejemplo, pacientes a los que se les ha extirpado el bazo, pacientes con cáncer, pacientes que usen fármacos contra el cáncer, pacientes que usan fármacos antiasmáticos, pacientes que usan fármacos antiinflamatorios, pacientes con hiper- e hipotiroides.

La formulación también es adecuada para la administración a un animal, tal como caballos, ovejas, perros, gatos, vacas, cerdos, cabras, conejos, animales salvajes y animales de laboratorio tales como ratones, ratas, cobayas, hámsters, conejos, perros, gatos o monos; a pájaros tales como pollos, pavos, patos, avestruces, pájaros tropicales o pájaros salvajes; o a peces tales como peces de piscifactorías, por ejemplo salmón, o peces de acuarios. Para animales, puede ser necesario ajustar la concentración de cada componente. Por ejemplo, para las ovejas, la cavidad nasal tiene una humedad extremadamente elevada, lo cual puede requerir la adición, a la formulación, de excipientes que absorban el agua, y, para peces, puede ser necesario microencapsular la formulación o que esté en una forma tal que la formulación será absorbida por las agallas.

Las composiciones adyuvantes de la invención también se pueden usar para potenciar la bioactividad (por ejemplo, la inmunogenicidad) y/o la captación de agentes bioactivos (por ejemplo, antígenos) en plantas. Los agentes bioactivos que se pueden usar en combinación con las composiciones adyuvantes de la invención pueden ser, por ejemplo, herbicidas, insecticidas, fungicidas, reguladores del crecimiento de las plantas, fertilizantes y vacunas. Muchos agentes bioactivos apropiados están comercialmente disponibles y se pueden aplicar generalmente a las tasas recomendadas por el proveedor. La cantidad particular de ingrediente bioactivo para uso en las formulaciones de la invención variará con la planta específica o con el medio de crecimiento de la planta con el que está en contacto, con la localización general de una aplicación, es decir, áreas protegidas tales como invernaderos en comparación con áreas expuestas tales como los campos, y con el tipo de formulación (por ejemplo, aerosol, líquida, sólida). La formulación se puede usar sobre cualquier tipo de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, malezas (por ejemplo, cola de zorra, bromo, garrachuelo, capín, pata de gallo, raigrás, maleza italiana), plantas de cosechas (por ejemplo, trigo, avenas, sorgo, maíz, remolachas, cánola, haba de soja, algodón, tabaco, patata, árboles frutales, pepino, tomate, plátano, judías, pimientos, melones) y plantas ornamentales (arbustos, árboles, flores). La formulación se puede aplicar a las hojas, a las semillas, a las frutas, a la corteza o a la madera, o se puede mezclar con el medio de crecimiento (por ejemplo, turba o suelo). La formulación se puede aplicar a las plantas individualmente (por ejemplo, con un aplicador pulverizador), o en masa (por ejemplo, desde un avión). La administración de antígenos a una planta usando las composiciones adyuvantes de la invención se puede usar para inmunizar a las plantas frente a patógenos (por ejemplo, mediante la generación de anticuerpos vegetales, o mediante la activación de resistencia adquirida local y sistémica (véase, por ejemplo, Agrios, Plant Pathology, cuarta edición (Academic Press, 1997), páginas 108-114, y referencias citadas allí).

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos de la presente invención, y no se deben de interpretar como limitativos del alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo I Toxoide del tétanos

Se administró intranasalmente a ratones (BALB/c) una formulación de 5 \mul que contiene 1,5 \mul de la vacuna antitetánica (Lyfjuthroun, Reykjavik, Islandia) en las siguientes formulaciones: (I) disolución salina isotónica; (II) 20% de PEG_{6}-CCG (Softigen®; Hüls AG, Witten, Alemania), que es una mezcla de monoglicérido/diglicérido de ácido caprílico y cáprico que contiene 6 unidades polioxietilénicas (PEG_{6}) en disolución salina isotónica; y (III) una mezcla al 20% de una mezcla de monoglicéridos/diglicéridos de ácido caprílico y cáprico (Imwitor®) solubilizada con Tween 20 (22:78) en disolución salina isotónica (CCG-polisorbato 20 (CCG-PS): documento WO 94/17827). Cuatro semanas después de la primera vacunación, los ratones recibieron una revacunación que contiene las mismas vacunas. Una semana más tarde, se extrajeron muestras de sangre, y se obtuvieron las siguientes respuestas de IgG del
suero:

TABLA I

Formulación	Respuesta de IgG sérica
I	0,01
II	2,1
III	0,65

Estos resultados muestran que la PEG_{6}-CCG no tóxica (formulación II) produce una respuesta de IgG significativamente potenciada en comparación con una formulación de vacuna como se describe en el documento WO 94/17827 (formulación III).

Ejemplo II Virus de la gripe

Se inmunizaron veinte ratones Balb/c con la vacuna antigripal (moléculas de HA a partir de la cepa Harbin). Las moléculas de HA de la gripe se formularon con 0%, 1%, 5% y 20% de PEG_{6}-CCG según la invención. Cuatro semanas después de la inmunización primaria, los ratones recibieron una revacunación que contiene las mismas formulaciones. Una semana después de la administración de la revacunación, se lograron los siguientes resultados:

\newpage

% de adyuvante		Conc. IgG (suero)

0%		1,1
1%		4,2
5%		6,8
20%		8,4

Ejemplo III

Se administró intranasalmente a ratones (BALB/c) 5 \mul de una formulación que contiene 20% de PEG_{6}-CCG, que es una mezcla de monoglicéridos/diglicéridos de ácido caprílico y cáprico que contiene 6 unidades polioxietilénicas (PEG_{6}), en disolución salina isotónica, con adición de los siguientes antígenos: (I) 1 \mug de la vacuna del virus de la gripe IIA por ratón; (II) 1,5 Lf (límite de floculación) de la vacuna antitetánica; (III) 1,5 Lf de la vacuna antidiftérica; (IV) 1 \mug de la vacuna anti-rgp 120 del VIH; (V) 1 \mug de proteasa de IgA como vacuna, y (VI) 1 \mug de péptido B de insulina. Cuatro semanas después de la primera vacunación, los ratones recibieron una revacunación que contiene las mismas vacunas. Una semana más tarde, se extrajeron muestras de sangre y se analizaron.

Ejemplo IV Toxoide tetánico y toxoide diftérico

Se administró intranasalmente a voluntarios humanos 100 \mul de una formulación que contiene 12 Lf del toxoide tetánico y 12 f.f. de la vacuna del toxoide diftérico, en las siguientes formulaciones: (I) disolución salina isotónica; (II) PEG_{6}-CCG, que es una mezcla de monoglicéridos/diglicéridos de ácido caprílico y cáprico que contiene 6 unidades de polioxietileno (PEG_{6}), en disolución salina isotónica; (III) 5% de PEG_{6}-CCG en disolución salina isotónica; y (IV) 1% de PEG_{6}-CCG en disolución salina isotónica. Cuatro semanas después de la primera vacunación, los participantes recibieron una revacunación que contiene las mismas vacunas. Durante el estudio, se tomaron muestras a cada voluntario (muestra de sangre y de saliva) semanalmente para el análisis de IgG e IgA.

Ejemplo V

Se les administra a ratones (BALB/c) 1,5 Lf de la vacuna del toxoide tetánico en 20% de PEG_{6}-CCG, que es una mezcla de monoglicéridos/diglicéridos de ácido caprílico y cáprico que contiene 6 unidades polioxietilénicas (PEG_{6}), en disolución salina isotónica. La formulación se administra (I) 5 \mul intranasalmente; (II) 5 \mul oralmente en la mucosa de la boca; (III) 5 \mul vaginalmente; (IV) 5 \mul rectalmente; y (V) 5 \mul dérmicamente. Cuatro semanas después de la primera vacunación, los ratones recibieron una revacunación que contiene las mismas vacunas. Una semana más tarde, se extrajeron muestras de sangre.

Se inmunizaron quince ratones Balb/C con la vacuna antigripal (moléculas IIA procedentes de la cepa Nanchang). Las moléculas de HA de la gripe se formularon con 5% de PEG_{6}-CCG según la invención, y se administraron intranasal, bucal y rectalmente. Cuatro semanas después de la inmunización primaria, los ratones recibieron una revacunación que contiene las mismas formulaciones, mediante la misma vía. Una semana después de la administración de la revacunación, se lograron los siguientes resultados:

Vía		Adsorbancia (OD 492 nm)

Nasal		0,300
Bucal		0,334
Rectal		0,155

Ejemplo VI

Se administra una formulación, que contiene 10% de PEG_{6}-CCG, que es una mezcla de monoglicéridos/diglicéridos de ácido caprílico y cáprico que contiene 6 unidades polioxietilénicas (PEG_{6}), en disolución salina isotónica, y una composición de vacuna seleccionada, según lo siguiente: (I) 1,5 Lf del toxoide tetánico a ratones; (II) 6 Lf del toxoide tetánico a conejos; (III) 20 Lf del toxoide tetánico a ovejas; (IV) 12 Lf del toxoide tetánico a voluntarios humanos; (V) 3 \mug de vacuna de vibriones a salmón; (VI) 3 \mug de vacuna de salmonela a pollos; y (VII) 3 \mug de antígeno de Spongospora subterranea a plantas de patata. Cuatro semanas después de la primera vacunación, se administró una revacunación que contiene las mismas vacunas. Una semana más tarde, se extrajeron muestras de sangre (excepto para la planta en (VII)). Para la planta en (VII), la planta de patata se expuso a los hongos un mes después de la administración de la revacunación.

Ejemplo VII

Se administró intranasalmente a ratones (BALB/c) 5 \mul de la formulación que contiene (I) toxoide tetánico, o (II) neumococo, acoplada a monoglicéridos y diglicéridos de ácido caprílico y cáprico. Esta provacuna se administra en una concentración al 20%. Cuatro semanas después de la primera vacunación, los ratones recibieron una revacunación que contiene las mismas vacunas. Una semana más tarde, se extrajeron muestras de sangre.

Para evaluar los efectos de PEG_{6}-CCG sobre los antígenos de la vacuna tras la administración intranasal, se llevaron a cabo experimentos usando un número de antígenos víricos y bacterianos, incluyendo la vacuna antigripal, la vacuna subunitaria del virus sincitial respiratorio (RSV), las proteínas de membrana externa (OMP) de Haemophilus influenza no tipables, la ureasa de Helicobacter pylori, proteínas pilínicas recombinantes de Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae. Los resultados de este análisis se exponen en los siguientes ejemplos.

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Ejemplo VIII

Vacunas antigripales

Este ejemplo resume la evaluación de los efectos adyuvantes de CCG-PS y PEG-CCG sobre la respuesta inmunitaria frente a una vacuna A/Udorn (una vacuna antigripal dividida de monoconjunto; Wyeth Lederle Vaccines and Pediatrics, West Henrietta, NY), y la contribución de la respuesta inmunitaria local a la protección del aparato respiratorio frente a la enfermedad descendente.

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TABLA 2

Grupo	Inmunógeno	Dosis/vía/volumen
A	A/Udorn/307072(H3N2)	1,8x10^{5}TCID_{50}/IN/5 \mul
B	Ninguno	Ninguna
C	Vacuna A/Udorn	1,0 \mug HA/LM/50 \mul
D	Vacuna A/Udorn	1,0 \mug HA/IN/5 \mul
E	Vacuna A/Udorn en 10% CCG-PS	1,0 \mug HA/IN/5 \mul
F	Vacuna A/Udorn en 5% PEG_{6}-CCG	1,0 \mug HA/IN/5 \mul
Ratones BALB/c, 8 por grupo
Vax: días 0, 19 y 38
Exposición: día 70
Titulación del virus: día 74
HA - hemaglutinina

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Los datos serológicos procedentes tanto de los ensayos ELISA como el de la inhibición de hemaaglutinación (HI) indicaron que la formulación de PEG_{6}-CCG indujo títulos de TgGI y HI en el suero mayores que los que indujo la formulación de CCG-PS. La formulación de PEG_{6}-CCG introducida intranasalmente generó una respuesta de anticuerpos sistémica comparable a la provocada mediante una vacuna estándar administrada parenteralmen-
te.

Los datos de ELISPOT confirman esa capacidad de PEG_{6}-CCG, al igual que la formulación de CCG-PS de primera generación, para elevar la respuesta inmunitaria local frente a la vacuna de la gripe, según se demuestra mediante el aumento del número de células B que segregan IgA encontradas en los tejidos linfoides nasales, en comparación con la provocada por la administración intranasal de la vacuna sola. La vacuna administrada intramuscularmente no dio como resultado una respuesta local por encima del fondo encontrado en ratones sin tratar.

TABLA 3 La formulación de PEG_{6}-CCG facilita respuestas de anticuerpos humorales frente a la vacuna de la gripe administrada nasalmente

Inmunógeno/vía	HI GMT	IgG1 GMT	IgG2a GMT	Células que segregan
				IgA/10^{4} células
				linfoides nasales
A/Udorn/IN	512	19.426	436.556	463
Ninguno	8	13	13	1
A/Vac. Udorn/IM	215	48.537	1.254	6
A/ Vac. Udorn/IM	25	732	73	22
A/ Vac. Udorn/CCG-PS/IN	181	20.556	228	150
A/ Vac. Udorn/PEG_{6}-CCG/IN	512	88.533	173	73

Como se muestra en la tabla a continuación, los ratones expuestos previamente al virus infeccioso están completamente protegidos a partir de la exposición subsiguiente con el virus homólogo. El virus no se pudo recuperar desde el tejido pulmonar ni nasal. Por el contrario, los ratones sin tratamiento son infectados fácilmente con el virus A/Udorn, tanto los tejidos pulmonar como nasal. El virus también se recuperó del tejido nasal de todos los ratones que recibieron la vacuna intranasal no adyuvada o parenteral. Estos datos sugieren que las respuestas inmunitarias provocadas por la vacuna adyuvada con CCG-PS o PEG_{6}-CCG protegen a las vías respiratorias superiores de la exposición al virus. La recuperación del virus a partir del tejido nasal se redujo significativamente en aquellos animales que recibieron la vacuna intranasal adyuvada con CCG-PS o PEG_{6}-CCG. Es evidente cierta protección de las vías respiratorias inferiores, independientemente de la formulación de la vacuna o de la vía de administración.

TABLA 4 Las respuestas inmunitarias provocadas por la vacuna de la gripe intranasal adyuvada con CCG-PS o PEG_{6}-CCG protegen al aparato respiratorio de la exposición al virus

Inmunógeno/vía	% nariz positiva	% pulmón positivo	Recuperación de	Recuperación de
			virus a partir de la	virus a partir del
			nariz GMT	pulmón GMT
A/Udorn/IN	0	0	200	200
Ninguno	100	75	53.724	40.788
A/ Vac. Udorn/IM	100	0	30.211	200
A/ Vac. Udorn/IM	100	25	6.324	563
A/ Vac. Udorn/CCG-PS/IN	75	0	2.081	200
A/ Vac. Udorn/PEG_{6}-CCG/IN	25	25	621	1002
200 ICID_{50} = < 400 (límite de detección del ensayo), a todas las muestras negativas se les asignó un valor de 200.

Ejemplo IX Proteína F de RSV

Este ejemplo resume la evaluación de los efectos adyuvantes de CCG-PS y PEG_{6}-CCG sobre la respuesta inmunitaria a la proteína F de RSV, y la contribución de la respuesta inmunitaria local a la protección del aparato respiratorio frente a una enfermedad descendente.

TABLA 5

Grupo	Inmunógeno	Dosis/vía/volumen	Calendario de vacunación
A	Proteína F	3 \mug/IN/5 \mul	Día 0, 714
B	Proteína F en CCG-PS al 20%	3\mug/IN/5 \mul	Día 0, 714
C	Proteína F en PEG_{6}-CCG al 5%	3 \mug/IN/5 \mul	Día 0, 714
D	Proteína F en Alum	3 \mug/IM/100 \mul	Día 0
E	RSV A2	2x10^{6} pfu/IN/50 \mul	Día 0
Ratones BALB/c, 10 por grupo

Respuestas de anticuerpos del suero específicas de la proteína F. La vacunación intranasal con proteína F/PBS provocó una respuesta anti-F de IgG circulantes, con un título de aproximadamente 26.000. Sin embargo, combinando la proteína F con CCG-PS o PEG_{6}-CCG, se obtuvieron (véase la Tabla 6) títulos estadísticamente elevados (p < 0,05) de IgG total, IgG1 e IgG2a. Además, sólo se provocó un título de IgA sérico significativo por la vacuna formulada con PEG_{6}-CCG. Esta observación se ha hecho consistentemente, y puede ser el resultado de diferentes propiedades inmunológicas de PEG_{6}-CCG.

Respuestas de Ig de la mucosa específicas de la proteína F. Se observó IgA en los lavados nasales y vaginales de ratones vacunados con F/PEG_{6}-CCG, lo que refleja la estimulación de IgA sérica por esta combinación de vacuna (véase la Tabla 6). En este experimento, se encontró que el nivel de IgA en los lavados nasales fue mayor que el presente en ratones que se recuperan de una infección con RSV vivo.

TABLA 6 Respuesta inmunitaria de ratones BALB/c vacunados intranasalmente con combinaciones de proteína F y CCG-PS o PEG_{6}-CCG

Inmunógeno	sueros GMT	NW	VW
	IgG	IgGI	IgG2a	IgA	IgG	IgA	IgG	IgA
Proteína F	26.322	2,909	770 < 100	< 100	< 25	< 25	< 25	< 25
	+/- 51.020	+/- 5.770
Proteína F	115.336 +/-	14,423 +/-	254 +/-	< 100	< 25	< 25	223	261
CCG-PS	32.747	5.079	457
Proteína	111.761	9.218	626	381 +/-	< 25	103	< 25	443
PEG_{6}-CCG	+/- 108.591	+/- 7.565	+/- 665	50
Proteína	71.756	43.136	1.553	< 100	< 25	< 25	258	< 25
AIOU	+/- 36.340	+/- 19.917	+/- 1.099
RSV A2	79.236	5.962	20.819	752 +/-	< 25	< 25	< 25	594
	+/- 32.310	+/- 5.251	+/- 7.258	50

Los ratones se desangraron en el día 27, y los ratones individuales se analizaron para determinar los títulos de los anticuerpos séricos mediante ELISA. De forma similar, se tomaron muestras reunidas de lavado de la mucosa en el día 28, y se analizaron para determinar IgG e IgA específicas anti-proteína F. No se detectó IgA en los lavados broncoalveolares (BAW). VW = lavado vaginal, NW = lavado nasal.

Ejemplo X Proteína de la membrana externa (OMP) rP4 de Haemophilus influenzae no tipable (NTHi)

Este experimento comparó las actividades adyuvantes de la mucosa de CCG-PS y PEG_{1}-CCG para la proteína P4 recombinante de NTHi tras la administración intranasal en ratones BALB/c.

Las vacunas se administraron intranasalmente los días 0 y 21 en un volumen total de 5 \mul. Los ratones se desangraron en los días 0, 21 y 28. Se realizaron lavados broncoalveolares (BAW) y lavados vaginales (VW), y se recogieron muestras de saliva en el día 28.

La proteína P4 de la membrana externa de NTHi recombinante, suministrada en CCG-PS o PEG_{6}-CCG, aumentó significativamente los títulos de anticuerpos IgG séricos para la proteína P4 recombinante. No hubo ninguna diferencia significativa en los títulos de IgA e IgG séricas a la proteína P4 recombinante entre los dos vehículos de administración (P, 0,05 en el día 28). Además, 1 \mug de proteína P4 recombinante, suministrada en CCG-PS o PEG_{6}-CCG, indujo buenos títulos de anticuerpos IgA a P4 recombinante en los lavados de saliva y vaginales.

Parece que PEG_{6}-CCG fue equivalente a CCG-PS en términos de títulos de anticuerpos séricos específicos. Sin embargo, merece la pena destacar que sólo la formulación de PEG_{6}-CCG indujo una respuesta demostrable de anticuerpos IgA nasal específica de rP4.

TABLA 7

Inmunógeno	Título Anti-rP4 mediante ELISA en el día 28
	Suero	Suero	Nasal	Saliva	Vaginal
	IgG	IgG	IgA	IgA	IgA
rP4 de NTHi en disolución salina	207	79	< 10	< 10	< 10
rP4 de NTHi en CCG-PS al 20%	16.635	1,295	< 10	128	125
rP4 de NTHi en PEG_{6}-CCG	14.336	830	52	164	92

Además, 1 \mug de proteína P4 recombinante, suministrada en CCG-PS o PEG_{6}-CCG, potenció significativamente el número de ratones respondedores, en comparación con la suministrada en disolución salina sola.

TABLA 8

Ratón nº	Disolución salina	CCG-PS	PEG_{6}-CCG
1	3.840	25.946	22.654
2	3.042	23.280	20.768
3	297	19.540	13.034
4	109	14.192	10.166
5	1	7.606	9.628
Media geométrica \pm SD	207 \pm 1.835	16.635 \pm 7.346	14.336 \pm 6.136

Respuesta de IgG en el día 28

Los títulos están clasificados desde el más elevado hasta el más bajo.

Ejemplo XI Ureasa recombinante de H. pylori

Este experimento comparó las actividades adyuvantes de la mucosa de CCG-PS y PEG_{6}-CCG para ureasa de H. pylori recombinante tras la administración intranasal en un volumen de 10 \mul en ratones BALB/c.

Las vacunas se administraron en los días 0 y 21. Los ratones se desangraron en los días 0, 21 y 28. Se realizaron lavados broncoalveolares (BAW) y lavados vaginales (VW), y se recogieron muestras de saliva en el día 28.

La proteína ureasa de H. pylori recombinante, suministrada en el vehículo de PEG_{6}-CCG o CCG-PS, potenció significativamente los títulos de anticuerpos IgG séricos secundarios para la proteína ureasa recombinante. No hubo ninguna diferencia significativa en los títulos de IgG séricos para la proteína de ureasa recombinante. No hubo ninguna diferencia significativa en los títulos de IgG séricos para proteína de ureasa recombinante entre los dos vehículos de administración (P > 0,05). Sin embargo, 5 \mug de proteína ureasa recombinante, suministrada en CCG-PS y PEG_{6}-CCG, no indujo anticuerpos IgA detectables a ureasa recombinante en ninguna de las secreciones mucosales analizadas en este experimento.

TABLA 9

Inmunógeno	IgG sérica
rUreasa de H. pylori 5 \mug en disolución salina	< 100
rUreasa de H. pylori 5 \mug en CCG-PS al 20%	64.787 \pm 45.033
rUreasa de H. pylori 5 \mug en PEG_{6}-CCG al 5%	40.489 \pm 28.674

Los títulos de punto final mediante ELISA de anti-ureasa recombinante IgG séricos se determinaron sobre muestras de suero individuales (5 por grupo), recogidas en el día 28.

Ejemplo XII Proteína pilínica recombinante de N. meningitidis

En este ejemplo, se estudió la actividad adyuvante de la mucosa de PEG_{6}-CCG usando la proteína pilínica recombinante de N. meningitidis como un antígeno de vacuna.

Se inmunizaron intranasalmente grupos de 5 ratones BALB/c en un volumen de 10 \mul con 5 \mug de proteína pilínica recombinante de N. meningitidis (rPilina) suministrada en 20% de CCG-PS, 5% de PEG_{6}-CCG o en disolución salina, en los días 0, 14 y 21, y se desangraron en el día 28. Se realizaron lavados broncoalveolares (BAW), lavados vaginales (VW), y se recogieron muestras de saliva en el día 30.

Se demostró un efecto adyuvante de la mucosa significativo cuando se administró la vacuna IN en el vehículo de PEG_{6}-CCG. Con 5 \mug de rPilina suministrada en PEG_{6}-CCG, la sIgA en los lavados nasal y vaginal aumentó 16 y 32 veces, en comparación con el grupo de control con disolución salina, en el día 28. En contraste con la formulación de PEG_{6}-CCG, la formulación de CCG-PS mostró sólo un incremento de 2 veces de los títulos de sIgA en los lavados nasales, y un incremento de 11 veces en los lavados vaginales. Estos datos sugieren que PEG_{6}-CCG puede ser un vehículo de administración mejorado para la proteína pilínica recombinante de N. meningitidis.

TABLA 10

Inmunógeno	IgA sérica	IgA nasal	IgA vaginal
rPilina de N. mening en disolución salina	6.168	12	15
rPilina de N. mening en CCG-PS al 20%	178.867	26	166
rPilina de N. mening en PEG_{6}-CCG al 5%	135.994	194	482

Ejemplo XIII rPilina de GC

En este ejemplo, se investigó la actividad adyuvante de la mucosa de PEG_{6}-CCG usando pilina recombinante de GC como un antígeno de vacuna.

Se inmunizaron intranasalmente grupos de 5 ratones BALB/c en un volumen de 10 \mul con 10 \mug de pilina recombinante de GC (rPilina), con o sin 5% de PEG_{6}-CCG, en los días 0 y 14, y se desangraron en el día 28. Los lavados vaginales se recogieron en el día 29.

Se demostró un efecto adyuvante significativo cuando la vacuna se administró IN en el vehículo de PEG_{6}-CCG. Con 10 \mug de rPilina suministrada en PEG_{6}-CCG, los títulos de anticuerpos séricos anti-IgA e IgG rpilínica aumentó 2 y 5 veces en el día 28, respectivamente. También aumentaron ligeramente (10.570 frente a 6.843) los títulos de ELISA de células completas. La sIgA en los lavados vaginales aumentó más de 4 veces.

TABLA 11

Inmunógeno	IgA sérica	IgG sérica	IgG de célula	IgA de lavado
			completa	vaginal
rPilin en salina	301	6.422	6.843	351
rPilin en PEG_{6}-CCG al 5%	609	34.358	10.570	1.517

No se recogieron lavados nasales en este experimento.

No se incluyó CCG-PS en este experimento.

Ejemplo XIV Evaluación de la aceptabilidad y tolerabilidad de adyuvantes de la mucosa

Se evaluaron en un estudio clínico la aceptabilidad y la tolerabilidad de dos adyuvantes de la mucosa (CCG-PS y PEG_{6}-CCG). Se alistaron en el estudio veintinueve individuos sanos (15 hombres y 14 mujeres), de 18 años de edad o mayores.

El tratamiento consistió en cinco dosis de pulverización intranasal. Las dos primeras dosis que contienen disolución salina isotónica no eran conocidas por el investigador ni por los sujetos. Estas dos dosis de disolución salina se dieron simultáneamente en ambas fosas nasales, sirviendo como las bases de comparación para los sujetos y para el investigador para evaluar los adyuvantes de ensayo. Las otras dosis, que contienen disolución salina (NS), CCG-PS y PEG_{6}-CCG (SG), no fueron conocidas de antemano ni por el investigador ni por los sujetos. Las tres dosis de ensayo se administraron intranasalmente, separándose cada dosis mediante un intervalo de treinta minutos, y se administraron según el siguiente régimen:

TABLA 12 Dosis 1 - Dosis 2 - Dosis 3

Secuencia de las fosas nasales	Secuencia del adyuvante	Nº de sujetos
Derecha-izquierda-derecha (RLR)	NS-RV-SG	5
	NS-SG-RV	4
	RV-SG-NS	3
	SG-RV-NS	5
Izquierda-derecha-izquierda (RLR)	NS-RV-SG	3
	VS-SG-RV	2
	RV-SG-NS	3
	SG-RV-NS	4

Se recogieron las evaluaciones tanto del investigador como de los sujetos de los adyuvantes. Las evaluaciones del investigador se puntuaron mediante el investigador para la cavidad nasal treinta minutos después de cada dosificación, y fue un juicio global del enrojecimiento, aumento de secreción y efectos secundarios macroscópicos de la cavidad nasal.

Las evaluaciones de los sujetos se dieron por los sujetos para la irritabilidad en contraste con la disolución salina desconocida a 0, 5, 10, 20 y 30 minutos después de cada dosificación de los adyuvantes. Los sujetos también clasificaron el grado relativo de irritación asociada con cada tratamiento.

Las puntuaciones de la evaluación del investigador se resumieron para cada adyuvante. Las puntuaciones de irritabilidad por los sujetos se resumieron en cada punto de tiempo para cada adyuvante, y las puntuaciones de evaluación de los sujetos en cada punto de tiempo se resumieron para representar la irritabilidad total puntuada por los sujetos. El método estadístico fue la prueba de chi al cuadrado de Mantel-Haenszel (MH). El nivel de significancia estadística fue 0,05 en el análisis.

Veintitrés sujetos puntuaron a CCG-PS como "definitivamente mucho más irritante o desagradable que la disolución salina" inmediatamente después de la dosificación (Tabla 13). Dentro de los 20 minutos, la irritación aparente se redujo hasta lo menos irritante, o nada irritante, para 20 de los 23 sujetos. Los otros 3 sujetos aún sintieron una fuerte irritación 30 min después de la dosificación. Mientras, el investigador dio a conocer una irritación menor (2/3) o mayor (1/3) asociada con CCG-PS para estos 3 sujetos.

Por el contrario, doce sujetos (una diferencia estadísticamente significativa de CCG-PS) valoraron a PEG_{6}-CCG como "definitivamente mucho más irritante o desagradable que la disolución salina" inmediatamente después de la dosificación (Tabla 13). Dentro de los 5 minutos, la fuerte irritación se redujo hasta una irritación ligera para 9 de los 12 sujetos. Los otros 3 de los 12 sujetos, más un sujeto adicional, sintieron una fuerte irritación asociada con PEG_{6}-CCG al final del período de seguimiento de 30 minutos después de la dosificación.

Las puntuaciones de la irritación se sumaron en cada punto de tiempo mediante adyuvante. CCG-PS fue significativamente más irritante que PEG_{6}-CCG en los puntos de tiempo de 0 y 5 minutos (p < 0,01, Tabla 13). Las puntuaciones de irritación para los dos adyuvantes no fueron estadísticamente diferentes en los puntos de tiempo finales.

En una comparación directa de la irritación asociada con 3 de las dosis desconocidas recibidas (es decir, comparadas entre sí, no por comparación con la disolución salina), CCG-PS fue el adyuvante más irritante. CCG-PS fue el adyuvante más irritante según el 76% de los sujetos (22/29).

TABLA 15 Aceptabilidad - evaluación de los sujetos

Disolución salina	CCG-PS	Softigen
Diferencia	0	1	2	suma	0	1	2	suma	0	1	2	suma
Todos	0	26	3		3	1	5	23	51	1	16	12	40
los
min.
	5	28	1		1	2	13	14	41	7	20	2	24
	10	28	1		1	9	13	7	27	9	18	2	22
	20	28	1		1	19	7	3	13	12	14	3	20
	30	28				22	4	3	10	17	8	4	16
\begin{minipage}[t]{160mm} Nota: Código de diferencia en comparación con la disolución salina: 0 = no diferente; 1 = ligeramente diferente; 2 = muy diferente \end{minipage}
Nota: RS = recibe CCG-PS primero, después Softigen; SR = recibe PEG_{6}-CCG primero, después CCG-PS

Aunque la presente invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a sus realizaciones preferidas, se entenderá por los expertos en la materia que se pueden hacer diversas modificaciones en la forma y detalles sin apartarse del alcance de la invención tal como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Composición acuosa que comprende

i): 0,01-70% v/v de glicéridos solubles en agua como adyuvante, seleccionados de entre el grupo que consiste en monoglicéridos sustituidos y diglicéridos sustituidos, y mezclas de monoglicéridos sustituidos y diglicéridos sustituidos, presentando dichos glicéridos la fórmula (I):

(I)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- R _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- R_{2}

: en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan del grupo que consiste en ácidos grasos C_{6-24} saturados o insaturados y polímeros solubles en agua, con tal de que el glicérido contenga al menos un polímero soluble en agua;

ii): al menos un antígeno; en el que el antígeno está en una forma disuelta o en una forma en partículas en dicha composición acuosa;

iii): opcionalmente, un vehículo fisiológicamente aceptable.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que los ácidos grasos se seleccionan de ácidos grasos C_{6-14} saturados e insaturados.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que los ácidos grasos se seleccionan de ácidos grasos C_{8-10} saturados e insaturados.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que los polímeros solubles en agua consisten en restos de PEG_{2-30} de polioxietileno, o sus derivados, que tienen 2-30 unidades polioxietilénicas.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que el polímero soluble en agua es un resto de PEG_{3-6} de polioxietileno que tiene 3 a 6 unidades polioxietilénicas.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que los glicéridos tienen una estructura seleccionada de entre el grupo que consiste en:

(II)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{6} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- R_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

(III)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- R _{2} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- PEG_{6}

\vskip1.000000\baselineskip

(IV)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
PEG _{3} }}

H --- O --- R_{1}

\vskip1.000000\baselineskip

(V)

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- PEG _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R _{1} }}

H --- O --- PEG_{3}

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la relación en % v/v de monoglicéridos sustituidos a diglicéridos sustituidos es desde aproximadamente 0,1:99,9 hasta aproximadamente 99,9:0,1, y preferentemente desde aproximadamente 5:95 hasta aproximadamente 95:5.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que los glicéridos tienen una concentración desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 20%, preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 15% en peso.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que los carbonos quirales en el glicérido están en forma S o R, o sus mezclas.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además uno o más componentes seleccionados de entre el grupo que consiste en tensioactivos, promotores de la absorción, polímeros que absorben agua, sustancias que inhiben la degradación enzimática, alcoholes, agentes para el control del pH, solubilizantes, estabilizantes, agentes para el control de HLB, agentes para el control de la viscosidad, conservantes, agentes para el control de la presión osmótica, propelentes, desplazadores del aire, agua, y sus mezclas.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 anteriores, que es una composición inmunógena.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 anteriores, que es una composición de vacuna.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 anteriores, en la que el antígeno se usa para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

14. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de un medicamento para inducir una vacunación, inmunización, tratamiento de la alergia, tratamiento del cáncer, tratamiento de enfermedades infecciosas o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que la administración es a través de una superficie de la piel o de una superficie de la mucosa.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la superficie de la mucosa se selecciona del grupo de superficies de la mucosa de la nariz, de los pulmones, de la boca, de los ojos, de los oídos, del aparato digestivo, del aparato genital, de la vagina, del recto.