CN120006002A - 一种用于检测染色体外mycl基因扩增的探针组合及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种用于检测染色体外MYCL基因扩增的探针组合及应用。该探针组合由BAC克隆片段RP11‑318B17、RP11‑204L3、RP11‑378I20和RP11‑469B24组成。该探针组合用于检测染色体外MYCL基因扩增具有100%的杂交效率。不但方便、快速、可靠，而且成功率高，可用于制备用于检测染色体外MYCL基因扩增的试剂盒。

Description

一种用于检测染色体外MYCL基因扩增的探针组合及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种用于检测染色体外MYCL基因扩增的探针组合及应用。

背景技术

肺癌是我国目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，患病率呈现上升趋势。小细胞肺癌（Small cell lung cancer, SCLC）是一种恶性度高、预后较差的肺癌亚型，既往文献报道MYCL基因扩增是SCLC的预后不良标志物（Qin, J., et al., MYCL1 Amplificationand Expression of L-Myc and c-Myc in Surgically Resected Small-Cell LungCarcinoma. Pathology Oncology Research : POR, 2021. 27:p. 1609775）。国外的研究表明，这种MYCL扩增可能是位于染色体外环状DNA（ecDNA）上，并与不良预后相关（Pongor,L.S., et al., Extrachromosomal DNA Amplification Contributes to Small CellLung Cancer Heterogeneity and Is Ass℃iated with Worse Outcomes. CancerDiscovery, 2023.）。

最近还有文献报道，ecDNA介导的MYC基因扩增（ecMYC），包括MYC、MYCN、MYCL，能促进SCLC的化疗耐药，此外，申请人前期发表的工作提示，具有ecMYC扩增的SCLC的免疫细胞尤其是T细胞减少，呈现出显著的免疫抑制性（Zhang, J. et al. P3.13D.04Extrachromosomal MYC-Paralogs Amplification Defines ImmunosuppressiveMicroenvironment with Metastatic Potential in Small Cell Lung Cancer. Journalof Thoracic Oncology, Volume 19, Issue 10, S360 - S361），因此包括MYCL在内的染色体外MYC家族的扩增有望作为广泛期SCLC免疫联合化疗的生物标志物。

目前，MYC基因的扩增金标准采用FISH来测定，然而，市面上的成熟探针多为MYC或MYCN单色探针（如淋巴瘤中MYC扩增探针，神经母细胞瘤M中MYCN单色探针已经获批用于临床诊断），国际上曾报道MYCL断裂探针（Break-Apart Probe）用于科研实验，而国内尚无商品化的MYCL扩增探针用于临床诊断。

发明内容

基于现有技术的缺陷，本发明的第一个方面，提供一种用于检测染色体外MYCL基因扩增的FISH探针组合。

在一种实施方式中，该FISH探针组合由BAC克隆片段RP11-318B17、RP11-204L3、RP11-378I20和RP11-469B24组成，将MYCL对应两个BAC克隆片段RP11-318B17和RP11-204L3标记为相同的任意一种颜色的荧光；RP11-378I20和RP11-469B24二者标记为相同、但与RP11-318B17和RP11-204L3颜色不同的荧光标记。

在一种优选的实施方式中，RP11-318B17和RP11-204L3均标记为红色荧光，RP11-378I20和RP11-469B24均标记为绿色荧光；或者将标记的荧光颜色互换。

本发明的第二个方面，提供上述FISH探针组合在制备用于检测染色体外MYCL基因扩增的试剂中的应用。

本发明的第三个方面，提供一种检测染色体外MYCL基因扩增的试剂盒，该试剂盒包含前述的FISH探针组合。

相对于现有技术，本发明具有如下有益的技术效果：

1）本发明首次推出MYCL扩增探针（Amplification Probe）用于临床诊断，扩增探针在检测直观性、定量分析、临床指导价值和操作简便性方面均优于断裂探针，在实际应用中更适合检测已知扩增的靶向治疗相关基因，极大降低了检测成本；

2）本发明针对SCLC的FISH图像中的MYCL染色，具有良好的特异性和敏感性，可用于判读临床样本MYCL基因扩增情况；

3）本研究已经100余例开展包括阳性和阴性对照在内的MYCL探针测试，发现约10%（10/104）的患者存在MYCL基因扩增。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明实施例中选取MYCL探针内参基因图；

图2为阳性病理样本结果；

图3为阴性病理样本结果；

图4为NCI-H889人小细胞肺癌细胞系染色结果；

图5为外周血培养细胞检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明以下各实施例、对比例以及测试设计的主要原料和设备来源如下：

以下实施例中所述样本为104例来源于北京大学人民医院胸外科手术切除SCLC病理样本，经基因组测序验证其中10例已知为MYCL基因扩增阳性。

实施例1 MYCL DNA FISH探针的制备

通过http://genome.ucsc.edu/查找位于染色体1p34区段的MYCL基因（基因组坐标：chr1:39,895,428-39,901,917，参考版本：GRCh38/hg38，下同）及两侧对应的细菌人工染色体（BAC克隆），选择可覆盖MYCL基因的两个克隆。两个克隆尽量重叠度高，且尽量保证MYCL基因位于两个克隆所覆盖的基因组DNA片段的中间。最终选择了RP11-318B17 （chr1:39,799,550-39,957,743）和RP11-204L3（chr1:39,817,299-40,003,043）两个BAC克隆，片段长度为203kb。

选取同位于1号染色体的异臂探针OR14I1（1q44）当内参，对应两个BAC克隆，RP11-378I20（chr1:248,538,648-248,714,123）和RP11-469B24（chr1:248,553,488-248,655,656）。荧光原位杂交MYCL计数探针及其内参探针基因组定位及长度如图1所示。从Invitrogen公司购置相应的BAC克隆，将BAC克隆培养后提取质粒，利用切口平移法，将MYCL对应两个BAC克隆片段（RP11-318B17和RP11-204L3）用TRITC标记的dUTP标记为红色荧光，将内参基因OR14I1（1q44）对应两个BAC克隆片段（RP11-378I20和RP11-469B24）用Fluorescein标记的dUTP标记为绿色荧光。将标记好的探针与Human Cot-1 DNA、杂交缓冲液、纯化水按比例配置成探针杂交液，-20度避光冷冻保存。

实施例2 MYCL DNA FISH探针的准确度检测

将3微米厚度小细胞肺癌组织病理切片（来自北京大学人民医院胸外科，患者均已签署知情同意书）置于65±1度恒温箱烤片过夜。取出后放入二甲苯中浸泡30min，再放入无水乙醇中浸泡10min。接着放入100%、85%、70%梯度乙醇和纯化水中复水各3min，再放入纯化水中100±5度煮片20min。取出晾干后，在样本区域滴加100微升胃蛋白酶反应液，消化5min。迅速放入2SSC中洗涤5min，最后放入室温70%、85%、100%梯度乙醇中依次脱水各3min，取出晾干。加10微升的杂交液至干燥2222mm盖玻片上，将样本片翻转，使样本朝下，迅速盖上，反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布；用封片胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；将玻片放在85±1度的热台上，变性5min；迅速将玻片放入37±1度的水浴中预热；去除封片胶和盖玻片，将玻片放入2SSC溶液中洗涤10min；再转入0.1%NP-40/2SSC溶液中洗涤5min；然后室温70%乙醇脱水3min。取出玻片在暗处晾干后，滴加10微升DAPI复染剂至干燥的2222mm盖玻片上，反转样本片，使盖玻片载玻片的目标区域接触，反转后轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

结果判定方法：参照通行的双色计数探针使用标准，在暗室中用Olympus B51荧光显微镜DAPI/FITC/TexasRed三色滤光镜激发，100倍物镜下观察间期细胞，判别荧光信号。用广州安必平公司提供的荧光原位杂交软件分析图像，评估整个切片的探针杂交情况。每一例切片的整个核心区域至少有100个互不重叠的细胞核，并观察到明确的荧光信号，才能确定荧光原位杂交检测有效。

结果判定内容：

1）在40×物镜下扫描整张切片，满意的标本应是75%以上癌细胞核中有杂交信号。观测与否存在异质性。

2）在100×物镜下找到清晰的肿瘤区域，观测肿瘤细胞核的荧光信号并进行计数，在50个核内计数MYCL(红色)和OR14I1(绿色)信号，分别记录MYCL和OR14I1的信号总数及平均拷贝数，再计算MYCL与OR14I1平均拷贝数的比值。

1.若MYCL/OR14I1＜2.0，MYCL判读为阴性（无扩增）；

2.若MYCL/OR14I1≥2.0，MYCL判读为阳性（扩增）。

本实施例共检测104例来源于北京大学人民医院胸外科手术切除SCLC病理样本，通过本实施例方法检测可以准确区分确认10例MYCL阳性和94例MYCL阴性。结果如图2-3所示，红绿荧光强度均2+，满足判读标准。阳性病理样本杂交结果图显示（图2），阳性病理样本中主要表现为多红2绿的阳性信号结果，而阴性病理样本则为2红2绿（图3）。

实施例3 MYCL DNA FISH探针的灵敏度检测

1.质粒提取：使用市售商品化质粒提取试剂盒（QIAfilter Plasmid Maxi Kit，QIAGEN 凯杰），按照试剂盒说明书步骤对MYCL和OR14I1对应BAC克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，通过Nanodrop 2000对DNA进行定量。

2.质粒DNA荧光标记：

1）使用切口平移的方法对BAC克隆质粒DNA进行荧光标记，其中MYCL对应克隆质粒DNA标记TRITC标记的dUTP荧光素；OR14I1对应克隆质粒DNA标记Fluorescein标记的dUTP。严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系，探针标记反应体系如下所示：

2）体系配制完成后震荡混匀离心，25℃标记2小时，80℃孵育10分钟灭活酶。

3.对标记产物后使用醋酸钠沉淀核酸，高速离心后获得标记探针。纯化步骤如下：

1）按3M醋酸钠：无水乙醇=1：25的比例混合配制成纯化液；

2）对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩。按照产物：纯化液=5:13的体积比例，将标记产物加入含纯化液的1.5 mL离心管中，旋涡混匀后瞬离，将混合物置于-80℃超低温冰箱静置30~60分钟。13000转离心2分钟沉淀探针，弃去上清，避光干燥。

3）加入200μL的70%乙醇轻柔漂洗沉淀，短暂离心充分去除乙醇，45℃烘干3分钟。

4）最后溶于2 μL纯化水中，即得标记后的MYCL(红色)和OR14I1(绿色)探针原料，避光保存。

为了评估实施例1制备的探针的性能，使用实施例1中的探针分别对NCI-H889人小细胞肺癌细胞系进行测试，分析50个中期分裂相或间期细胞，分析杂交信号的荧光亮度、杂交效率、杂交位置是否正确等，结果参见图4：可见对应的MYCL(1p34)和OR14I1(1q44)染色体位点应分别被标记为红色和绿色荧光，信号明亮且无染色体位点之间的交叉杂交现象，表明本实施例的杂交效率为100％(50/50)。

实施例4 MYCL(1p34)探针杂交效率检测

细胞滴片处理步骤：

【仪器及材料】

以下仪器及材料需自备：

<样本处理 > 20×PBS（上海生工）；50ml和15ml尖底离心管、离心机、移液器或一次性带刻度吸管、冰箱、计时器。

细胞保存液：2g聚乙二醇1500（Sigma P5402）溶于100ml 50%乙醇中；

低渗液（0.075mol/L KCl)：准确称取5.59 g 氯化钾，加入500ml纯水，充分溶解后，定容至1升；

固定液：体积比3:1的甲醇:冰醋酸，化学通风橱中配制，充分混匀；

<制片 > 防脱载玻片（武汉博士德）、移液器、显微镜。

<玻片乙醇老化 > 无水乙醇；平板加热器（上海博通BHW-05A）、24×50mm的盖玻片（上海生工）、纱布、方形盖子（长×宽≈ 9cm×13cm，可以同时处理4片载玻片）、镊子。

<玻片预处理 > 20×PBS（上海生工）；70%、85%、100%梯度乙醇；圆形玻璃染色缸（上海生工）；恒温水浴锅（37±1 ℃）；

胃蛋白酶溶液：400μl 1mol/L的HCl加入40ml水中，置于37±1℃水浴中，使用前加入20μl 10%胃蛋白酶（上海生工），混匀，使用一天后更换；

4%多聚甲醛：900 ml去离子水中加入500μl 1mol/L NaOH，加热到 65-70℃；边搅拌边加入40g多聚甲醛（上海生工），持续搅拌直到溶解；冷却至室温后加入100 ml的10×PBS；用HCl调节pH到7.3；过滤除菌，2～8℃避光保存；

1%多聚甲醛（水:26ml +20xPBS:2ml +4%的多聚甲醛:10ml +1M的MgCl2:2ml）。

<样品和探针同时变性 >20×20mm盖玻片（上海生工）、镊子、橡皮胶（rubbercement）、平板加热器、杂交盒、恒温水浴锅（37±1℃）

<杂交后洗涤及复染 >20×SSC（上海生工）；镊子；圆形玻璃染色缸；恒温水浴锅（37±1℃）；70%、85%、100%梯度乙醇；24×24mm的盖玻片；

洗液I (50%甲酰胺/2×SSC)：16ml纯水 +4ml 20×SSC +20ml 甲酰胺，总体积40ml；

洗液II (2×SSC)：36ml 纯水 +4ml 20×SSC，总体积40ml；

洗液III(2×SSC/0.1% NP-40)：35.96ml纯水 +4ml 20×SSC +40μl NP-40，总体积40ml。

洗液IV (0.4×SSC/0.3% NP-40)：39.08ml纯水 +800μl 20×SSC +120μl NP-40，总体积40ml。

【检验方法】

1、样品处理

1.1 取外周血2～3ml（肝素钠抗凝）2000rpm离心5min，去上清。

1.2 取1ml细胞加入10ml的0.075 M KCl,吹打混匀，静置3min。

1.3 37±1℃水浴箱低渗30min。

1.4 加固定液1ml，吹打混匀，室温预固定10min。

1.5 吹打混匀，2000rpm离心5min。

1.6 去上清，沉淀加固定液5ml～10ml，吹打混匀，室温静置10min。

1.7 2000rpm离心5min，去上清。

1.8 可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀洗白洗干净（此步骤不需室温静置10min）。

2、制片

2.1 取一张干净的载玻片；

2.2 重悬细胞后分别取3μl，10μl和30μl悬液滴加到载玻片上的不同位置，注意不要重叠；

2.3 室温下晾干；

2.4 用20×物镜在相差显微镜下观察三个区域的细胞密度，记录细胞没有明显重叠，且数量在100～200个以上所加的细胞悬液量；

a)如果细胞密度及数目合适，继续步骤2.5；

b)如果滴加30μl悬液的区域仍然细胞数目太少，另取30μl悬液重复滴到该区域，晾干，观察；

c)如果滴加3μl悬液的区域仍然细胞数目太多，用新鲜固定液稀释细胞悬液，重复步骤2.1～2.4；

2.5 另取一张干净的载玻片，分为左右两个区域，分别滴加适量的细胞悬液；

2.6 在相差显微镜下观察，如果细胞碎片太多，则需要做预处理并且选择合适的杂交区域；

注意:每个病例至少需要多制一张片，细胞滴片可置于放有无水乙醇的密闭容器中，在-20±5℃可以保存一年。剩余的细胞悬液可以在2～8℃保存一个月，以便必要时重新制片。

3、玻片乙醇老化

3.1 将热台加热到95±1 ℃；

3.2 取出24×50mm的盖玻片（无水乙醇保存），擦干备用；

3.3 取一块折叠为方形的4～8层纱布，浸透无水乙醇；

3.4 在载玻片的杂交区域上各滴加160μl的无水乙醇；

3.5 轻轻盖上24×50mm的盖玻片，轻压紧；

3.6 将载玻片置于95±1 ℃预热的热台上，盖上浸透了无水乙醇的纱布（完全覆盖载玻片），再盖上事先准备好的方形盖子（完全覆盖载玻片），计时2分钟；

3.7 从热台上去除盖子、纱布，取下载玻片，轻轻去除盖玻片，继续预处理步骤。

备注：也可选择另一方法老化玻片，制片后室温放置过夜或56℃烤片1小时，然后继续预处理步骤。

4、玻片预处理

4.1 玻片放入37±1℃的1×PBS中孵育5分钟；

4.2 取出玻片，再将其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化7～15分钟（可通过预试验确定酶效力）；

4.3 取出玻片，再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟；

4.4 取出玻片，再将其放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；

4.5 取出玻片，再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟；

4.6 取出玻片，再将其放入1×PBS室温洗涤3分钟；

4.7 取出玻片，再将其放入70%、85%、100%梯度乙醇脱水各3分钟；然后取出玻片，室温晾干。

备注：如果是新鲜样品，也可按以下步骤替代4.1-4.8：

a：将滴好的玻片置于室温的2×SSC（PH7.0）溶液中浸泡2min；

b：依次在室温70%，85%，100%的乙醇中浸泡2min脱水；然后取出玻片，室温晾干。

5、样品和探针同时变性

5.1 将杂交液取出，留置室温，低速离心；

5.2 吸取10μl杂交液至干燥20x20mm盖玻片上，将样本片翻转，使样本朝下，迅速盖上，反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布，避免产生气泡，作好标记；

5.3 用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；

5.4 将玻片放在78±1℃的热台上，变性2分30秒（注意:使用前必须确认温度准确）；

5.5 迅速将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37±1℃孵育过夜（约16小时）；

5.6 继续杂交后洗涤步骤。

6、杂交后洗涤及复染

6.1 洗涤前30分钟，将配制好的洗液I, 洗液II, 洗液III，放入37±1℃的水浴中，测量以确保温度合适；

6.2 取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；

6.3 迅速将玻片放入提前预热的盛有洗液I的染色缸中，37±1℃洗涤15分钟；

6.4 取出玻片，再将其放入盛有洗液II的染色缸中，37±1℃洗涤15分钟；

6.5 取出玻片，再将其放入盛有洗液III的染色缸中，37±1℃洗涤5分钟；

6.6 取出玻片，室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3分钟；

6.7 取出玻片，垂直放置于纸巾上，在暗处晾干；

6.8 滴加10μl DAPI复染剂至干燥的24x24mm盖玻片上，反转样本片，使盖玻片与载玻片的目标区域接触，反转后轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

备注：如果是新鲜样品，也可按以下步骤来替代6.3-6.5：

a：将玻片置于72℃洗液IV（0.4×SSC/0.3% NP-40）中2分钟；

b：室温置于洗液III（2×SSC/0.1% NP-40）中30秒钟；然后继续6.6-6.8步骤。

注意事项： 上述所列举试剂均在圆形染色缸中配制（每种试剂体积均为40ml），每个染色缸最多可放入5片切片。非室温溶液，在操作开始前需提前预热反应试剂至指定温度。在洗涤过程中，可间隔2～3分钟轻轻晃动染色缸，提高洗涤效果。

7、结果分析

相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察。

7.1 使用合适的滤镜，在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；

7.2 调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时, 要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；

7.3 扫视几个细胞区域，要求细胞核边界完整，DAPI染色均匀、核无重叠，绿色和红色信号点清晰；跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数；需要主观辨别的核不计数；

7.4 从选择区域的左上角开始分析，从左到右扫视，观察多个视野；转到100×物镜，调整焦距，在核的不同层次找到所有信号点；在每个核内计数信号点；调焦找到每个核内的所有信号点，计数一个区域内的两种信号，只计数每种颜色有1个或更多FISH信号的，没有信号或只有一种颜色信号的核不计数；记录观察到的细胞总数（信号数目正常及异常）；

7.7 按照相关探针说明书设定阴性阈值。进行计数及结果判定。

【检验结果】

结果如图5所示，分析50个外周血培养细胞，可见信号明亮且无染色体位点之间的交叉杂交现象，外周血培养细胞杂交为2红2绿。表明本实施例的杂交效率为100％(50/50)。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种用于检测染色体外MYCL基因扩增的FISH探针组合，该FISH探针组合由BAC克隆片段RP11-318B17、RP11-204L3、RP11-378I20和RP11-469B24组成，将MYCL对应两个BAC克隆片段RP11-318B17和RP11-204L3标记为相同的任意一种颜色的荧光；RP11-378I20和RP11-469B24二者标记为相同、但与RP11-318B17和RP11-204L3颜色不同的荧光标记。

2.根据权利要求1所述的FISH探针组合，其特征在于，RP11-318B17和RP11-204L3均标记为红色荧光，RP11-378I20和RP11-469B24均标记为绿色荧光；或者将标记的荧光颜色互换。

3.权利要求1或2所述的FISH探针组合在制备用于检测染色体外MYCL基因扩增的试剂中的应用。

4.一种检测染色体外MYCL基因扩增的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的FISH探针组合。