CN117385007A - 一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法、试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法、试剂及其应用，属于生物医学技术领域。本发明通过阴性富集CTCs和三种探针的协同作用，大幅度提高了对肺癌CTC的检出率，当单独使用8号染色体着丝粒探针(CEP8)时，检测肺癌CTCs的灵敏度为47.1％(8/17)，特异性为87.5％(21/24)，而联合三种探针同时检测时，对肺癌CTC检测灵敏度(16/17，94.1％)却显著提高，并且还保持了特异性的不变。因此，三联探针的检测方法通过准确捕获CTCs荧光信号提高了检出率，也增加了肺癌CTCs的检测灵敏度，使其能够实现快速、灵敏的临床检测。

Description

一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法、试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法、试剂及其应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是从原发肿瘤或转移灶脱落后释放入外周循环血液中具有特殊性状的肿瘤细胞，其通过内渗和外渗作用造成实质性转移，并且在转移的过程中会发生表面标志物的变化，从而形成转移灶的关键环节。近年来，随着液体活检技术兴起，CTCs检测研究逐渐成为当前肿瘤研究的热点和焦点，因其包含有关癌症的遗传和分子信息，并且其中存在的基因突变与原发性肿瘤之间是高度一致的。不仅能揭示肿瘤发生和转移的潜在机制，而且为癌症的早期诊断、疗效评估、预后评价和药物治疗监测等方面显示出重要的价值，这也是原发性肿瘤检测所达不到的。因此，CTCs不但可以反映肿瘤组织的状况，而且还能作为活检样本的替代品，用于病理诊断、疾病监测和分子测序。

目前，CTCs的可靠检测主要取决于有效的细胞分离与鉴别，即应用免疫磁珠阴性富集及免疫荧光原位杂交技术检测。阴性富集法是获取血液中的稀有细胞，通过磁场进行富集肿瘤细胞，利用免疫磁珠与非肿瘤细胞结合，使其停留在磁场中。由于部分肿瘤细胞不表达特异性抗原，阳性富集法会出现假阴性的结果，而采用的阴性富集法则避免了这一缺陷，具有更高的检出率。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是将分子生物探针与染色体特定位点结合来检测染色体异常的一门新兴的分子细胞遗传学技术，原理是用已知的标记单链核酸为探针，与待检样本中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。现有技术(CN 111812324 A)提供了一种使用CD45免疫荧光和CEP8荧光原位杂交，并监控EpCAM和Pan-CK标记物的免疫荧光联合检测肺小结节患者外周血样本，但是目前因为无法检出EpCAM和Pan-CK这两个标记物的阴性循环肿瘤细胞，所以存在很大的漏检问题。另有一个技术(CN 106970225 B)是通过CD45免疫荧光抗体联合CEP8荧光原位杂交探针一步法共染鉴定循环肿瘤细胞，但由于该技术仅用单个探针对捕获的CTCs进行检测，造成CTCs检出数量少，检测的灵敏度低。因此，目前需要迫切寻找出提高CTCs检出率和准确性的方法，为肿瘤的早期诊断提供一种新的途径。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法，所述处理方法是通过CD45抗体磁珠负向富集循环肿瘤细胞，再联合CEP8、CEP10和ALK融合探针实现的。

进一步地，所述处理方法的具体步骤如下：

(1)去除外周血中的血红蛋白；

(2)裂解红细胞；

(3)磁珠与白细胞结合：在处理样本中添加预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞，再添加预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A，混匀；

(4)去除白细胞；

(5)涂片；

(6)固定；

(7)脱水；

(8)杂交孵育：与CEP8、CEP10和ALK融合基因探针杂交；

(9)洗涤；

(10)再次孵育：加入抗人CD45抗体；

(11)洗涤；

(12)复染；

(13)阅片。

更进一步地，所述步骤(3)中，在350-450μl处理样本中添加35-45μl预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A至3.5-4.5ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至350-450μl，再添加35-45μl预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A至2-3ml，混匀。

更进一步地，所述步骤(3)中，在400μl处理样本中添加40μl预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A至4ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至400μl，再添加40μl预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A至2.5ml，混匀。

本发明的目的之二在于提供CD45抗体磁珠以及CEP8、CEP10和ALK融合探针在制备肺癌循环肿瘤细胞处理试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过阴性富集CTCs和三种探针的协同作用，大幅度提高了对肺癌CTC的检出率，当单独使用8号染色体着丝粒探针(CEP8)时，检测肺癌CTCs的灵敏度为47.1％(8/17)，特异性为87.5％(21/24)，而联合三种探针同时检测时，对肺癌CTC检测灵敏度(16/17，94.1％)却显著提高，并且还保持了特异性的不变。因此，三联探针的检测方法通过准确捕获CTCs荧光信号提高了检出率，也增加了肺癌CTCs的检测灵敏度，使其能够实现快速、灵敏的临床检测，使医生更加了解肺癌患者的实时状态，为临床治疗方案的制定带来帮助。

附图说明

图1为实施例1中CEP8和CEP10探针的检测结果图，橙色是CEP8探针，绿色是CEP10探针，当一个细胞上同时出现两个探针的结果时，需要通过数量进行判断。

图2为实施例1中ALK融合基因探针的检测结果图。

具体实施方式

实施例中使用的各种溶液的配方如表1所示：

表1

其中，10X、20X代表该溶液为10倍/20倍的浓度。

预处理液A、预处理液B皆为10×的缓冲液，洗涤缓冲液B为20×的缓冲液，洗涤缓冲液C为2％的缓冲液，以上四种组分在使用前应按要求稀释或溶解。其余组分皆为1×的缓冲液，可直接使用。

实施例1

本实施例提供了一种应用CD45免疫荧光联合CEP8、CEP10和ALK三种探针来检测肺癌循环肿瘤细胞的方法，具体步骤如下：

(1)收集样本：将每例患者的外周静脉血收集至ACD抗凝管中；

(2)去除血红蛋白：取4mL样本至50mL离心管中，补充1×预处理液A至45mL，室温，650g离心，5min，弃上清；

(3)裂解红细胞：离心后加1×预处理液B室温至45mL，室温重悬8min，650g离心，5min，弃上清至100-500μL，重悬沉淀细胞，补加1×预处理液A2mL，转移至5ml磁珠分选流式管中，300g离心，5min，弃上清，加入400μL的1×预处理液A重悬沉淀；

(4)磁珠与白细胞结合：添加40μL预处理液C，室温孵育10min，加1×预处理液A至4mL，吹打混匀，300g离心，5min，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至400μL，再添加40μL预处理液D，混匀，室温孵育5min，加1×预处理液A至2.5mL，吹打混合均匀；

(5)去除白细胞：流式管插入磁珠分选装置磁极中，静置5min，拿起磁极，快速将第一支流式管中上清液倒入第二支流式管中，再将第二支流式管放到磁极中，室温孵育5min，将上清液倒入15mL无菌离心管中，补加1×预处理液A至14mL，颠倒混匀，950g离心，5min，弃上清至约100μL；

(6)涂片：加100μL预处理液C，轻柔吹打混匀，分别涂片至两个15×15mm²的标本框中，将标本自然干燥；

(7)固定：加入1×预处理液D完全覆盖标本区域，室温固定8min；去除标本区液体，放入已预热的2×洗涤缓冲液B中静置10min；

(8)脱水：载玻片依次在75％乙醇、85％乙醇、100％乙醇中脱水3min，室温晾干；

(9)杂交孵育：分别在标本区加入CEP8、CEP10和ALK融合基因检测探针各10μl(其中CEP8和CEP10都是染色体着丝粒探针，添加到同一个标本区；ALK是融合基因检测探针，单独加在一个标本区)，各种探针的浓度无特殊要求，依据探针产品说明书直接使用即可；盖上盖玻片，吸取橡胶胶水，封住盖玻片边缘；在76℃变性5min，37℃杂交2h；

(10)洗涤：取出载玻片，撕去橡胶胶水；将载玻片放入43℃预热的洗涤缓冲液A，去盖玻片；2×洗涤缓冲液B中静置2次，每次5min，再用0.2％洗涤缓冲液C洗标本区2次；

(11)再次孵育：吸去多余液体，加入用2％洗涤缓冲液C配置好的抗人CD45抗体至标本区，避光33-37℃孵育过夜；

(12)洗涤：用0.2％洗涤缓冲液C洗标本区2次，吸净残留液体；

(13)复染：封片剂瞬时离心后，液面处取10μL封片剂，加至标本区，盖片，观察；

(14)阅片：采用奥林巴斯BX53显微镜观察载玻片；

(15)结果判定：CEP8异常或CEP10异常或ALK基因断裂且CD45-和DAPI+特征的细胞是循环肿瘤细胞(CTCs)。CEP8和CEP10探针检测结果如图1所示，其中蓝色是DAPI信号用于观察细胞核形态；橙色是CEP8探针，绿色是CEP10探针，用于观察细胞核内杂交信号点的数量；红色是CD45的信号用于观察细胞膜染色情况。最终的结果是以单个细胞核，有三个及以上的探针信号点，CD45染色后无信号的细胞为特征细胞(CTCs)并进行计数，图1为鉴定捕获的细胞，其中①②③细胞未被CD45染红色，同时核中有多个(>2个)荧光杂交信号，这三个细胞为循环肿瘤细胞；④细胞被CD45染红色，核中两个探针分别含有2个荧光信号点，该细胞为血液细胞(白细胞)。

ALK融合基因探针检测结果如图2所示，ALK融合基因检测探针的两端用红与绿两个颜色分别标记，一旦ALK基因发生断裂重排或倒转，红绿信号便出现分离则为阳性(图2中①号细胞)，而没有发生断裂的则呈现为黄色荧光信号则为阴性(图2中②号细胞)。若阳性细胞≥15个，判断患者发生ALK重组。

因此，以上两种不同探针如果出现其中一个指标异常或两个指标均出现异常(即CEP8和CEP10异常≥4或ALK基因断裂≥15个)，则可判断为肺癌循环肿瘤细胞。查看整张载玻片后，统计所有肿瘤细胞的个数，即为该样本所含肿瘤细胞数量。

实施例2

使用实施例1所述的方法鉴定肺癌和肺小结节患者循环肿瘤细胞，具体包含如下步骤：

(1)收集样本：抽取17例肺癌和24例良性肺结节患者的外周血4mL至ACD抗凝管中；

(2)去除血红蛋白：取4mL样本至50mL离心管中，补充1x预处理液A至45mL。室温，650g离心，5min，弃上清；

(3)裂解红细胞：离心后加1×预处理液B室温至45mL，室温重悬8min，650g离心，5min，弃上清至100-500uL，重悬沉淀细胞，补加1×预处理液A2mL。转移至5ml磁珠分选流式管中，300g离心，5min，弃上清，加入400uL的1×预处理液A重悬沉淀；

(4)磁珠与白细胞结合：添加40uL预处理液C，室温孵育10min。加1×预处理液A至4mL，吹打混匀，300g离心，5min，弃去上清液。加入1×预处理液A重悬细胞至400uL。再添加40μL预处理液D，混匀。室温孵育5min，加1×预处理液A至2.5mL，吹打混合均匀；

(5)去除白细胞：流式管插入磁极中，静置5min，拿起磁极，快速将第一支流式管中上清液倒入第二支流式管中。再将第二支流式管放到磁极中，室温孵育5min，将上清液倒入15mL无菌离心管中，补加1×预处理液A至14mL，颠倒混匀，950g离心，5min，弃上清至约100uL；

(6)涂片：加100μL预处理液C，轻柔吹打混匀，分别涂片至两个15×15mm²的标本框中，将标本自然干燥；

(7)固定：加入1×预处理液D完全覆盖标本区域，室温固定8min；去除标本区液体，放入已预热的2×洗涤缓冲液B中静置10min；

(8)脱水：载玻片依次在75％乙醇、85％乙醇、100％乙醇中脱水3min，室温晾干。

(9)杂交孵育：分别在标本区加入CEP8、CEP10和ALK融合基因检测探针，盖上盖玻片，吸取橡胶胶水，封住盖玻片边缘；在76℃变性5min，37℃杂交2h；

(10)洗涤：取出载玻片，撕去橡胶胶水；将载玻片放入43℃预热的洗涤缓冲液A，去盖玻片；2×洗涤缓冲液B中静置2次，每次5min，再用0.2％洗涤缓冲液C洗标本区2次；

(11)再次孵育：吸去多余液体，加入用2％洗涤缓冲液C配置好的抗人CD45抗体至标本区，避光33-37℃孵育过夜；

(12)洗涤：用0.2％洗涤缓冲液C洗标本区2次，吸净残留液体；

(13)复染：封片剂瞬时离心后，液面处取10μL封片剂，加至标本区，盖片，观察；

(14)阅片：在奥林巴斯BX53显微镜观察载玻片；

(15)结果判定：CEP8和CEP10异常≥4或ALK基因断裂≥15个且CD45-和DAPI+特征的细胞是肺癌循环肿瘤细胞(CTCs)。查看载玻片后，统计肿瘤细胞的个数，即为该样本所含肿瘤细胞数量。

由表2和表3的结果显示，仅靠单个荧光标记的8号染色体着丝粒探针能检测到患者血液中CTCs数量较少，大大的增加了CTCs的漏检率，并且检测肺癌CTCs的灵敏度为47.1％(8/17)，特异性为87.5％(21/24)。而本发明应用CEP8、CEP10和ALK三联探针(人类8号染色体着丝粒探针(CEP8)购买于广州易锦生物技术有限公司，产品货号是FP037；人类10号染色体着丝粒探针(CEP10)购买于厦门龙进生物科技有限公司，产品货号为DF252；人类ALK基因探针购买于广州易锦生物技术有限公司，产品货号是FP501)的方法能检测到更多的CTCs，有利于提高检出率，并且在保持特异性(21/24，87.5％)不变的情况下，极大的提升了灵敏度(16/17，94.1％)。说明本发明联合三种探针检测CTCs的方法效果相对较好。

表2检测肺癌和肺小结节患者CTCs染色数量(个)

表3应用本实施检测肺癌和肺小结节患者外周血样本CTCs鉴定结果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法，其特征在于，所述处理方法是通过CD45抗体磁珠负向富集循环肿瘤细胞，再联合CEP8、CEP10和ALK融合探针实现的。

2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述处理方法的具体步骤如下：

(1)去除外周血中的血红蛋白；

(2)裂解红细胞；

(3)磁珠与白细胞结合：在处理样本中添加预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞，再添加预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A，混匀；

(4)去除白细胞；

(5)涂片；

(6)固定；

(7)脱水；

(8)杂交孵育：与CEP8、CEP10和ALK融合基因探针杂交；

(9)洗涤；

(10)再次孵育：加入抗人CD45抗体；

(11)洗涤；

(12)复染；

(13)阅片。

3.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在350-450μl处理样本中添加35-45μl预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A至3.5-4.5ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至350-450μl，再添加35-45μl预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A至2-3ml，混匀。

4.根据权利要求3所述的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在400μl处理样本中添加40μl预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A至4ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至400μl，再添加40μl预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A至2.5ml，混匀。

5.CD45抗体磁珠以及CEP8、CEP10和ALK融合探针在制备肺癌循环肿瘤细胞处理试剂中的应用。