JP2001204470A - 迅速細菌遺伝子検査法及びキット - Google Patents
迅速細菌遺伝子検査法及びキットInfo
- Publication number
- JP2001204470A JP2001204470A JP2000056490A JP2000056490A JP2001204470A JP 2001204470 A JP2001204470 A JP 2001204470A JP 2000056490 A JP2000056490 A JP 2000056490A JP 2000056490 A JP2000056490 A JP 2000056490A JP 2001204470 A JP2001204470 A JP 2001204470A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pcr
- bacterial
- bacteria
- dna
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 title abstract 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 12
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 4
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010017964 Gastrointestinal infection Diseases 0.000 claims description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 3
- BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 8-methoxypsoralen Natural products C1=CC(=O)OC2=C1C=C1CCOC1=C2OC BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N Methoxsalen Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C1C=COC1=C2OC QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000019836 digestive system infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 229960004469 methoxsalen Drugs 0.000 claims 1
- SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N methoxypsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C(OC)=CC2=CC2=C1OC=C2 SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 5
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡ検出を利用した細菌同定および悪性細胞
の検出を、ＰＣＲ法を応用して迅速に行える細菌悪性細
胞遺伝子検査法及びキットを提供する。 【解決手段】高感度、高速ＰＣＲを行えるＤＮＡポリメ
ラーゼ、細菌からＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを行
えるＰＣＲ用緩衝液及び細菌遺伝子検出用プライマーを
必須成分とする検査液を用いてＰＣＲ法を応用し、便あ
るいは尿、または食品から採取した検体に内在あるいは
外在する細菌細胞を分離培養、ＤＮＡの抽出・定量を行
うことなく、消化管または尿路感染症、腫瘍診断あるい
は食品中の細菌検査を迅速に行える直接的な細菌遺伝子
検査法及びキット。
の検出を、ＰＣＲ法を応用して迅速に行える細菌悪性細
胞遺伝子検査法及びキットを提供する。 【解決手段】高感度、高速ＰＣＲを行えるＤＮＡポリメ
ラーゼ、細菌からＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを行
えるＰＣＲ用緩衝液及び細菌遺伝子検出用プライマーを
必須成分とする検査液を用いてＰＣＲ法を応用し、便あ
るいは尿、または食品から採取した検体に内在あるいは
外在する細菌細胞を分離培養、ＤＮＡの抽出・定量を行
うことなく、消化管または尿路感染症、腫瘍診断あるい
は食品中の細菌検査を迅速に行える直接的な細菌遺伝子
検査法及びキット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＣＲ法を応用し
て便または尿、あるいは食品類を検体とし、迅速に細菌
遺伝子を検査する方法及びキットに関するものである。
更に詳しくは、細菌遺伝子による菌種同定を、細菌培養
を行うことなくＤＮＡ検出を利用してＰＣＲ法を応用
し、便または尿を検体として迅速に細菌悪性細胞遺伝子
を、あるいは食品類を検体として迅速に細菌遺伝子を検
査方法及びキットに関する。
て便または尿、あるいは食品類を検体とし、迅速に細菌
遺伝子を検査する方法及びキットに関するものである。
更に詳しくは、細菌遺伝子による菌種同定を、細菌培養
を行うことなくＤＮＡ検出を利用してＰＣＲ法を応用
し、便または尿を検体として迅速に細菌悪性細胞遺伝子
を、あるいは食品類を検体として迅速に細菌遺伝子を検
査方法及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】消化管感染症または尿路感染症などの感
染症の診断は、便あるいは尿を検体とし、該検体から菌
を分離培養した後、得られた菌集落を検鏡、染色、ＰＣ
Ｒ法などの方法で確認することによって行われている。
染症の診断は、便あるいは尿を検体とし、該検体から菌
を分離培養した後、得られた菌集落を検鏡、染色、ＰＣ
Ｒ法などの方法で確認することによって行われている。
【０００３】また、消化管または尿路悪性腫瘍の診断で
は、採取した便あるいは尿を検体として該検体から細胞
を遠心分離などの方法で回収後、検鏡して細胞の形態学
的な性状により判定されている。
は、採取した便あるいは尿を検体として該検体から細胞
を遠心分離などの方法で回収後、検鏡して細胞の形態学
的な性状により判定されている。
【０００４】食品を発生源とする食品中毒が発生した場
合には採取した食品から菌を分離培養した後、得られた
菌集落を検鏡、染色、ＰＣＲ法などの方法で確認するこ
とが行われている。
合には採取した食品から菌を分離培養した後、得られた
菌集落を検鏡、染色、ＰＣＲ法などの方法で確認するこ
とが行われている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】消化管または尿路感染
症を、患者の便または尿を検体として採取し、細菌を分
離培養し、得られた菌集落を検鏡、染色、ＰＣＲ法など
の方法で確認する診断方法は、検査に１日〜７日を要す
るだけでなく細菌の分離培養には高度な専門的知識と技
術を必要とし、外来患者を待たせて病状を判定出来るも
のではなかった。
症を、患者の便または尿を検体として採取し、細菌を分
離培養し、得られた菌集落を検鏡、染色、ＰＣＲ法など
の方法で確認する診断方法は、検査に１日〜７日を要す
るだけでなく細菌の分離培養には高度な専門的知識と技
術を必要とし、外来患者を待たせて病状を判定出来るも
のではなかった。
【０００６】また、高度な専門的知識と技術を必要とす
る細菌の分離培養を行わずに検体に直接ＰＣＲ法を適用
する方法も開発されているが、この方法でも検体の便あ
るいは尿に遠心分離、熱変性処理などの処理を行い、細
菌から遺伝子を抽出後にＰＣＲ法を行っているので少な
くとも３〜４時間を要し、迅速な診断とは言えない。
る細菌の分離培養を行わずに検体に直接ＰＣＲ法を適用
する方法も開発されているが、この方法でも検体の便あ
るいは尿に遠心分離、熱変性処理などの処理を行い、細
菌から遺伝子を抽出後にＰＣＲ法を行っているので少な
くとも３〜４時間を要し、迅速な診断とは言えない。
【０００７】消化管または尿路悪性腫瘍の診断は、検体
から細胞を遠心分離などの方法で回収後、検鏡して細胞
の形態学的な性状により判定する方法で行われているの
で該判定には時間だけでなく極めて専門的な技術を必要
とし、診断には熟練を要した。
から細胞を遠心分離などの方法で回収後、検鏡して細胞
の形態学的な性状により判定する方法で行われているの
で該判定には時間だけでなく極めて専門的な技術を必要
とし、診断には熟練を要した。
【０００８】上述の様なことから、患者から採取した便
あるいは尿を検体として、極めて短時間に、また、高度
な専門的技術を必要とせずに消化管または尿路感染症や
悪性腫瘍を迅速に診断する方法の開発が待たれていた。
あるいは尿を検体として、極めて短時間に、また、高度
な専門的技術を必要とせずに消化管または尿路感染症や
悪性腫瘍を迅速に診断する方法の開発が待たれていた。
【０００９】食品中毒の場合には、発生源の確定や菌の
同定は緊急を要する問題であり、極めて短時間に、正確
に菌を確定する技術の開発が待たれていた。
同定は緊急を要する問題であり、極めて短時間に、正確
に菌を確定する技術の開発が待たれていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】迅速診断または食品中毒
菌の迅速同定と言う課題を解決するために発明者らは鋭
意研究の結果、微量な細菌遺伝子を、ＰＣＲ法を応用し
て迅速に検出し、感染症や悪性腫瘍診断の一助とする画
期的な検査方法及び食品中の細菌を迅速に同定する検査
方法を開発するに至った。
菌の迅速同定と言う課題を解決するために発明者らは鋭
意研究の結果、微量な細菌遺伝子を、ＰＣＲ法を応用し
て迅速に検出し、感染症や悪性腫瘍診断の一助とする画
期的な検査方法及び食品中の細菌を迅速に同定する検査
方法を開発するに至った。
【００１１】本発明は、高感度で高速反応性のあるＤＮ
Ａポリメラーゼ、細菌遺伝子検出用プライマー及び細菌
のＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを可能としたＰＣＲ
緩衝液を必須成分とし、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａ
ｌｅｎを添加して検査液となし、紫外線処理を行った
後、該検査液に患者から採取した便あるいは尿を直接添
加してＰＣＲを行って細菌遺伝子を検出するもので、細
菌の分離培養や菌体からのＤＮＡの抽出、定量作業を省
略することにより、遺伝子の人為的な喪失がなくなるだ
けでなく、作業者の習熟度による結果変動がない。
Ａポリメラーゼ、細菌遺伝子検出用プライマー及び細菌
のＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを可能としたＰＣＲ
緩衝液を必須成分とし、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａ
ｌｅｎを添加して検査液となし、紫外線処理を行った
後、該検査液に患者から採取した便あるいは尿を直接添
加してＰＣＲを行って細菌遺伝子を検出するもので、細
菌の分離培養や菌体からのＤＮＡの抽出、定量作業を省
略することにより、遺伝子の人為的な喪失がなくなるだ
けでなく、作業者の習熟度による結果変動がない。
【００１２】本発明では検体から細菌の検出を行う場合
にはＤＮＡポリメラーゼ内に混入している大腸菌ＤＮＡ
を除去する目的で検査液に８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒ
ａｌｅｎを添加して紫外線ランプを用いてソラレン・紫
外線処理を約２分間行い、続いてＰＣＲを行うが、細菌
由来の遺伝子を検出する場合以外にはソラレン・紫外線
処理を行う必要がない。
にはＤＮＡポリメラーゼ内に混入している大腸菌ＤＮＡ
を除去する目的で検査液に８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒ
ａｌｅｎを添加して紫外線ランプを用いてソラレン・紫
外線処理を約２分間行い、続いてＰＣＲを行うが、細菌
由来の遺伝子を検出する場合以外にはソラレン・紫外線
処理を行う必要がない。
【００１３】本発明の特徴の一つである、高感度、高速
ＰＣＲを行うためのＤＮＡポリメラーゼとしては宝酒造
（株）製のＴＡＫＡＲＡ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼが有用であり、また、細菌からＤＮＡの抽出作業を行
うことなくＰＣＲを可能としたＰＣＲ緩衝液としては
（株）島津製作所製のＳＨＩＭＡＤＺＵ Ａｍｐｄｉｒ
ｅｃｔが有用であるが、本発明はそれに限定されるもの
ではない。
ＰＣＲを行うためのＤＮＡポリメラーゼとしては宝酒造
（株）製のＴＡＫＡＲＡ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼが有用であり、また、細菌からＤＮＡの抽出作業を行
うことなくＰＣＲを可能としたＰＣＲ緩衝液としては
（株）島津製作所製のＳＨＩＭＡＤＺＵ Ａｍｐｄｉｒ
ｅｃｔが有用であるが、本発明はそれに限定されるもの
ではない。
【００１４】本発明は、検体から遺伝子の抽出を行うこ
となく直接ＰＣＲ法に供することが可能なため、検査開
始から１時間以内で判定出来る。
となく直接ＰＣＲ法に供することが可能なため、検査開
始から１時間以内で判定出来る。
【００１５】また、本発明では目的とする菌に特異的な
ＰＣＲプライマーを設定して、該プライマーに反応する
か否かで判定を行うので高度な専門的技術を必要とする
ことなく、迅速に、正確に診断を行うことが出来る。
ＰＣＲプライマーを設定して、該プライマーに反応する
か否かで判定を行うので高度な専門的技術を必要とする
ことなく、迅速に、正確に診断を行うことが出来る。
【００１６】本発明を従来から一般的に行われている細
菌遺伝子を応用した診断方法と比較すると、従来法で
は、便あるいは尿から採取した細菌の分離培養に１乃至
３日、ＤＮＡ抽出に２乃至５時間、ＤＮＡ定量に１０乃
至２０分、ＰＣＲに２乃至３時間、電気泳動に１０乃至
１５分を要した。
菌遺伝子を応用した診断方法と比較すると、従来法で
は、便あるいは尿から採取した細菌の分離培養に１乃至
３日、ＤＮＡ抽出に２乃至５時間、ＤＮＡ定量に１０乃
至２０分、ＰＣＲに２乃至３時間、電気泳動に１０乃至
１５分を要した。
【００１７】食品中毒を発生した食品を検体とする、食
品中の細菌検査の場合も便あるいは尿を検体とする場合
とほぼ同程度の所要時間を要した。
品中の細菌検査の場合も便あるいは尿を検体とする場合
とほぼ同程度の所要時間を要した。
【００１８】これに対して本発明では、ソラレン・紫外
線処理に２分、ＰＣＲに３０乃至４０分、電気泳動に１
０乃至１５分と非常に時間短縮が可能となる。
線処理に２分、ＰＣＲに３０乃至４０分、電気泳動に１
０乃至１５分と非常に時間短縮が可能となる。
【００１９】ＰＣＲ終了後、電気泳動を省略し、ＰＣＲ
産物をエチジウムブロマイドやＳＹＢＲグリーンなどの
色素で直接染色して比色することにより、判定すること
も可能である。また、パーキンエルマー社製などのリア
ルタイム定量ＰＣＲシステムを組み合わせてＰＣＲ施行
中に同時判定をすることも可能となる。
産物をエチジウムブロマイドやＳＹＢＲグリーンなどの
色素で直接染色して比色することにより、判定すること
も可能である。また、パーキンエルマー社製などのリア
ルタイム定量ＰＣＲシステムを組み合わせてＰＣＲ施行
中に同時判定をすることも可能となる。
【００２０】更に、細菌の検出を行う場合には高感度、
高速ＰＣＲを可能とするために使用されるＤＮＡポリメ
ラーゼである、ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ内に混入
している大腸菌ＤＮＡを除去するためにソラレン・紫外
線処理が必要であるが、細菌以外の検体の場合には不要
なので、一層、迅速な検査が可能となる。
高速ＰＣＲを可能とするために使用されるＤＮＡポリメ
ラーゼである、ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ内に混入
している大腸菌ＤＮＡを除去するためにソラレン・紫外
線処理が必要であるが、細菌以外の検体の場合には不要
なので、一層、迅速な検査が可能となる。
【００２１】検出された細菌の詳細な種類を正確かつ迅
速に判定する場合には、ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基
配列を、塩基配列決定法あるいはＤＮＡチップを用いて
検査することによって細菌の正確な菌種同定が出来る。
速に判定する場合には、ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基
配列を、塩基配列決定法あるいはＤＮＡチップを用いて
検査することによって細菌の正確な菌種同定が出来る。
【００２２】
【実施例】以下、本発明を実施例にて具体的に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
が、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】滅菌処理をしたプラスチックチューブに下
記の溶液を作製した。 滅菌蒸留水 ２３μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ａ液 １０μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｉ液 １０μｌ ＤＮＴＰ（１０ｍＭ） ４μｌ ８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ液（２．５ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯ） ０．５μｌ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ 上記の溶液に３６５ｎｍの紫外線を１ｃｍの距離から２
分間照射する。次に細菌検出用ユニバーサルプライマー
（１０ｐｍｏｌ／μｌ）としてセンスプライマーとアン
チセンスプライマーの各々１μｌを添加して検査液とし
た。
記の溶液を作製した。 滅菌蒸留水 ２３μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ａ液 １０μｌ Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｉ液 １０μｌ ＤＮＴＰ（１０ｍＭ） ４μｌ ８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ液（２．５ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯ） ０．５μｌ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ 上記の溶液に３６５ｎｍの紫外線を１ｃｍの距離から２
分間照射する。次に細菌検出用ユニバーサルプライマー
（１０ｐｍｏｌ／μｌ）としてセンスプライマーとアン
チセンスプライマーの各々１μｌを添加して検査液とし
た。
【００２４】採取した便に対して約２〜１０倍量の生理
食塩水あるいはトリス−ＥＤＴＡ緩衝液あるいはナトリ
ウム−燐酸−ＥＤＴＡ緩衝液などを加えて攪拌し、静置
法、遠心分離法、濾紙・フィルターによる濾過法などの
方法で不純物を除去後、その約１μｌを前記検査液に添
加して試験検体を作製した。該試験検体をサーマルサイ
クラーに設置し、９８℃／１秒、６８℃／１０秒のＰＣ
Ｒプロトコールを３０回実行した。
食塩水あるいはトリス−ＥＤＴＡ緩衝液あるいはナトリ
ウム−燐酸−ＥＤＴＡ緩衝液などを加えて攪拌し、静置
法、遠心分離法、濾紙・フィルターによる濾過法などの
方法で不純物を除去後、その約１μｌを前記検査液に添
加して試験検体を作製した。該試験検体をサーマルサイ
クラーに設置し、９８℃／１秒、６８℃／１０秒のＰＣ
Ｒプロトコールを３０回実行した。
【００２５】尿を検体とする場合には遠心分離して沈殿
物を採取し、該沈殿物を直接あるいは約２〜１０倍量の
生理食塩水あるいはトリス−ＥＤＴＡ緩衝液あるいはナ
トリウム−燐酸−ＥＤＴＡ緩衝液などで希釈後、その約
１μｌを用いて便を検体とする場合と同様の操作を行っ
た。
物を採取し、該沈殿物を直接あるいは約２〜１０倍量の
生理食塩水あるいはトリス−ＥＤＴＡ緩衝液あるいはナ
トリウム−燐酸−ＥＤＴＡ緩衝液などで希釈後、その約
１μｌを用いて便を検体とする場合と同様の操作を行っ
た。
【００２６】ＰＣＲした試験検体の８μｌを採取し、エ
チジウムブロマイド含有１％アガロースゲルで１００Ｖ
／１５分間の電気泳動を行った。電気泳動終了後のゲル
に紫外線を照射し、エチジウムブロマイドで染色された
遺伝子のバンドを観察し、バンドの出現したものを陽性
と判定した。
チジウムブロマイド含有１％アガロースゲルで１００Ｖ
／１５分間の電気泳動を行った。電気泳動終了後のゲル
に紫外線を照射し、エチジウムブロマイドで染色された
遺伝子のバンドを観察し、バンドの出現したものを陽性
と判定した。
【００２７】
【実施例２】採取した食品に２〜１０倍量の生理食塩水
を加え、ミキサーで攪拌、粉砕した後、静置法、遠心分
離法、または濾過法によって不純物を除去して検体と
し、その約１μｌを実施例１で作製した検査液に添加し
て試験検体を作製した。
を加え、ミキサーで攪拌、粉砕した後、静置法、遠心分
離法、または濾過法によって不純物を除去して検体と
し、その約１μｌを実施例１で作製した検査液に添加し
て試験検体を作製した。
【００２８】
【実施例３】細菌の菌種を同定するために、本発明の方
法で増幅したＰＣＲ産物を直接シークエンス反応に用い
て該細菌の塩基配列を決定した。また、本発明の方法の
ＰＣＲ溶液中にシークエンスプライマーを加え、増幅反
応とシークエンス反応を同時に行い、所要時間の短縮を
可能とした。
法で増幅したＰＣＲ産物を直接シークエンス反応に用い
て該細菌の塩基配列を決定した。また、本発明の方法の
ＰＣＲ溶液中にシークエンスプライマーを加え、増幅反
応とシークエンス反応を同時に行い、所要時間の短縮を
可能とした。
【００２９】
【実施例４】ＤＮＡチップを用いて細菌の菌種を同定す
るために、各菌種に特異的なプローブを必要数だけＤＮ
Ａチップ上に固定し、本発明の方法で増幅したＰＣＲ産
物をＤＮＡチップ上にハイブリダイズ反応させた。ＰＣ
Ｒ産物とハイブリダイズしたプローブが菌種と同定され
た。
るために、各菌種に特異的なプローブを必要数だけＤＮ
Ａチップ上に固定し、本発明の方法で増幅したＰＣＲ産
物をＤＮＡチップ上にハイブリダイズ反応させた。ＰＣ
Ｒ産物とハイブリダイズしたプローブが菌種と同定され
た。
【００３０】
【発明の効果】本発明は、便あるいは尿、または食品を
検体とし、そこに存在する内在性あるいは外来性の細胞
や細菌遺伝子を、その抽出操作なしに迅速に検出するも
のであり、その結果、消化管感染症または尿路感染症の
診断、消化管または尿路悪性腫瘍の診断、または食品を
仲介する食品中毒の細菌検査を迅速に、確実に行うこと
を可能とした。
検体とし、そこに存在する内在性あるいは外来性の細胞
や細菌遺伝子を、その抽出操作なしに迅速に検出するも
のであり、その結果、消化管感染症または尿路感染症の
診断、消化管または尿路悪性腫瘍の診断、または食品を
仲介する食品中毒の細菌検査を迅速に、確実に行うこと
を可能とした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大島 譲二 埼玉県熊谷市久保島1785−２ Ｆターム(参考） 4B024 AA13 AA20 HA20 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR62 QS02 QS25 QX01
Claims (4)
- 【請求項１】便あるいは尿を検体とし、該検体を直接、
高感度で高速ＰＣＲを可能とするＤＮＡポリメラーゼ、
細菌遺伝子検出用プライマー及びＤＮＡを抽出すること
なくＰＣＲを可能とするＰＣＲ用緩衝液を必須成分とし
て８−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎを添加し、紫外
線処理してなる検査液に添加してＰＣＲを行うことを特
徴とする、ＰＣＲ法を応用した迅速で直接的な細菌遺伝
子検査法及びキット。 - 【請求項２】上記検体が食品であることを特徴とする請
求項１に記載の迅速で直接的な細菌遺伝子検査法及びキ
ット。 - 【請求項３】消化管又は尿路感染症、あるいは消化管又
は尿路悪性腫瘍の診断を迅速に行うことを特徴とする請
求項１に記載の迅速で直接的な細菌悪性細胞遺伝子検査
法及びキット。 - 【請求項４】上記ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基配列
を、塩基配列決定法あるいはＤＮＡチップを用いて検査
し、細菌の詳細な種類を決定することを特徴とする迅速
で直接的な細菌悪性細胞遺伝子検査法及びキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000056490A JP2001204470A (ja) | 2000-01-27 | 2000-01-27 | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000056490A JP2001204470A (ja) | 2000-01-27 | 2000-01-27 | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001204470A true JP2001204470A (ja) | 2001-07-31 |
Family
ID=18577427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000056490A Pending JP2001204470A (ja) | 2000-01-27 | 2000-01-27 | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001204470A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014127806A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Daiken Medical Co., Ltd. | Dna amplifying kit |
| WO2014127804A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Daiken Medical Co., Ltd. | Pathogen diagnosis system |
| WO2014127805A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Daiken Medical Co., Ltd. | Diagnosis method of pathogen |
-
2000
- 2000-01-27 JP JP2000056490A patent/JP2001204470A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014127806A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Daiken Medical Co., Ltd. | Dna amplifying kit |
| WO2014127804A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Daiken Medical Co., Ltd. | Pathogen diagnosis system |
| WO2014127805A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Daiken Medical Co., Ltd. | Diagnosis method of pathogen |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102535489B1 (ko) | 미생물 검출 방법 및 특성 규명 방법 | |
| US20200149120A1 (en) | Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof | |
| JPH03133379A (ja) | タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法 | |
| CN115029459A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用 | |
| EP3212792B1 (en) | Nucleic acid modifying agents and uses thereof | |
| CN108410951B (zh) | 一种新的核酸提取试剂及其应用 | |
| WO2010102460A1 (zh) | 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒 | |
| CN111518877B (zh) | 用于微量样本分型检测多房棘球蚴和细粒棘球蚴的一管法巢式实时定量pcr检测试剂盒 | |
| US20220098645A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
| CN114196766A (zh) | 用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法 | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| WO2021179469A1 (zh) | 检测病原体的组合物、试剂盒及方法 | |
| CN111254226A (zh) | 用于快速检测犬瘟热病毒的引物组、荧光可视化rt-lamp试剂盒及方法 | |
| JP6318239B2 (ja) | 真菌核酸の抽出方法 | |
| JP2001204470A (ja) | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット | |
| JP4510222B2 (ja) | 細菌の鑑別方法 | |
| CN107460249A (zh) | 一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒 | |
| CN108034721B (zh) | 检测白血病nup98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒 | |
| JP2001169778A (ja) | 迅速細菌遺伝子検査法及びキット | |
| CN112342317A (zh) | Ihhnv病毒lamp-crispr等温检测用的核酸序列组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN113512598A (zh) | 百日咳杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN110964849A (zh) | 一种消除非洲猪瘟病毒检测假阳性的方法及检测非洲猪瘟病毒的试剂盒 | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| CN102776275B (zh) | 一种用于结核杆菌目视检测引物组及其试剂盒 |