MX2013013365A - Sistema integrado de alto rendimiento de deteccion de enfermidades ginocologicas. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un nuevo dispositivo y los in vitro métodos de aplicación de los mismos con utilidad en la detección de alto rendimiento, detección y tratamiento de la enfermedad de la enfermedadespecialmente las infermidades ginecologicas y cervicales. El dispositivo de multipocillo " de la presente invención consiste en un soporte sólido con múltiples áreas bien separadas, cada una acomodar una muestra de paciente, lo que lleva a la evaluación simultánea de muestras de pacientes. Los métodos de la presente invención comprenden tinción citológica convencional, tinción de Papanicolaou del cuello uterino, y la tinción inmunoquímica usando anticuerpos o combinación de anticuerpos que son capaces de unirse a los biomarcadores que se sobreexpresan en el cáncer incluyendo en el carcinoma de cuello uterino y displasia, en comparación con los controles normales. El dispositivo y los métodos de la presente invención se pueden practicar en cualquiera de los modos manual o automatizado, y se aplican a cualquier fluido biológico o suspensión de células de cualquier muestra biológica en vista de una variedad de ensayos de biología celular, y en vista de la detección y de detección de cuello uterino y otras enfermedades. La Presente Invención describen Un Nuevo Dispositivo y los Métodos de Aplicación De Los Mismos con Utilidad en la deteccion de Alto Rendimiento, deteccion y Tratamiento de la enfermedad de la Enfermedad cervical. El Dispositivo de " multipocillo " de la Presente Invención consiste en la ONU Soporte Sólido con Múltiples áreas bien separadas, Cada Una acomodar Una Muestra de Paciente, Lo Que lleva a la evaluation Simultánea de Muestras de Pacientes. Los Métodos de la Presente Invención.

Description

SISTEMA INTEGRADO DE ALTO RENDIMIENTO DE DETECCIÓN DE ENFERMIDADES GINOCOLOGICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Trastornos ginecológicos son frecuentes y sin atención medicas en muchas comunidades que carecen de los recursos y la infraestructura para realizar un tamisaje y diagnostico sofisticadas a la majoria de la población. Especialmente en las zonas rurales y algunos países, las tasas de trastornos de mu eres sin atención medica representa la mayoría de la población femenina. Por otra parte los factores culturales y económicos impeden el acceso a la atención preventiva.

Trastornos ginecológicos abarcan una amplia gama de patologías graves, incluyendo enfermedades autoinmunes, condiciones neurodegenerativas, infecciones virales y bacterianas, y las proliferaciones de células precancerosas y cancerosas y los tumores. De este grupo, el cáncer de cuello uterino es el más grave.

El cáncer cervical es de particular interés junto con las condiciones precursoras y factores de riesgo asociados tales como el VPH y otras infecciones. El cáncer cervical es el .cáncer más comúnmente diagnosticado y la tercera causa de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo. Había 555.100 nuevos casos y 309.800 muertes estimadas en 2007, el 83% de las cuales ocurrieron en el mundo en desarrollo (American Cáncer Society, ACS Global Cáncer Facts and Figures, 2007).

Desde 1957, las pruebas de las muestras de pacientes con tinción de Papanicolau, la denominada "prueba de Papanicolaou" se ha convertido en el examen rutinario en los EE.UU. y en algunos países desarrollados. Como resultado, las tasas de incidencia de cáncer de cuello uterino ha disminuido en todos los grupos raciales y las lesiones precancerosas del cuello uterino se detecta con frecuencia lleva a un tratamiento oportuno y un descenso significativo en las tasas de mortalidad.

La infección con el virus del papiloma humano (VPH ) es un factor etiológico principal en el cáncer cervical . La magnitud de la asociación de riesgo es mayor gue la de fumar y el cáncer de p>ulmón ( Unger, ER , Barr E , virus del papiloma humano y el cáncer de cuello uterino , en Emerg Infect Dis 10:2031-2032 , 2004 ) . Entre los 200 tipos de HPV conocidos , los tipos de HPV16 y HPV18 son los más comúnmente asociados con el cáncer de cuello de útero , produciendo mayor que un aumento del riesgo de 200 veces ( Castellsagué X , et al , todo el mundo etiología virus del papiloma humano de adenocarcinoma cervical y sus cofactores : . Implicaciones para el cribado y la prevención , J Nati Cáncer Inst. 5:303-315 , 2006 ) . La relación causal entre el VPH y el cáncer cervical ha sido explotada para el desarrollo de teenologías moleculares para la detección viral para superar las limitaciones de la detección citológica cervical . Prueba del VPH mediante la amplificación de ADN se utiliza ahora para complementar citología equivocada en pacientes de alto riesgo ( Boulet , 2008 ) . Actualmente las pruebas de VPH sirve como un punto final sustituto para la detección del cáncer cervical. Sin embargo, también se ha sugerido para el tamisaje primario , sobre todo en las mujeres mayores de 30 años de edad , seguido de la citología si VPH positivo ( RA Smith , Cokkinides V , Eyre HJ . Guías de la Sociedad Americana del Cáncer para la detección temprana del cáncer , CA Cáncer J Clin 55:31-44 , 2005 ) . Sin embargo la mayoría de las infecciones por VPH desaparecen espontáneamente y sólo un pequeño porcentaje de avance a CIN ( neoplasia intraepitelial cervical j o CIS ( carcinoma in situ ) . Otros factores de riesgo que contribuyen al cáncer de cuello uterino puede ser la inmunosupresión , la paridad elevada , el tabaquismo y los factores nutricionales , así como el uso a largo plazo de anticonceptivos orales ( / Centro de Información del ICO OMS sobre el VPH y el cáncer cervical , Informe sobre el VPH y las estadísticas de cáncer de cuello uterino en Brasil , 2007 ; ACS , 2010 ) El sistema de Bethesda clasifica las lesiones cervicales precancerosas como: 1) células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), 2) las lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (L-SIL) o neoplasia intraepitelial cervical (CIN I), que se caracteriza por displasia leve, 3) escamosa de alto grado lesiones intraepiteliales (HSIL) y 4) la neoplasia intraepitelial cervical, incluyendo el carcinoma in situ (CIN II, NIC III / CIS) que se caracteriza por displasia de moderada a severa. Tenga en cuenta que LSIL / HSIL nomenclatura se refiere a lesiones cervicales detectadas por citología, mientras que la nomenclatura se refiere a la displasia de CIN determinado en el análisis histológico de los tejidos del cuello uterino biopsiados (OMS / ICO, 2007).

CIN I rara (1%) se convierte en cáncer, y la mayoría de los pacientes vuelven a la normalidad, incluso si no se trata, CIN II conllevan un riesgo de progresión en cáncer de 16% en dos años y 25% después de cinco años, si no se trata. CIS es un afección neoplásica confirmada del cervix que convertirse en cáncer cervical invasor (ICC) durante un período de 10 a 12 años. Un año y cinco años de supervivencia relativa para los pacientes con cáncer de cuello uterino en los EE.UU. es de 88% y 72% respectivamente, mientras que la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con diagnóstico de cáncer de cuello uterino localizado es del 92% (ACS, 2010).

La prueba de Papanicolaou es una tinción citológica de las células cervicales recogidas a través de un sencillo procedimiento realizado en el consultorio del médico. Las células son manchadas directamente en una laminilla, a continuación, fijadas y teñidas (prueba de Papanicolaou convencional), o primero lavadas en una solución conservante liquido que adelgaza la mucosa y eliminar los restos celulares, antes de preparar una laminilla (citología de base líquida, LBC). En ambos casos, las laminillas son leídas por un citopatólogo.

La prueba de Papanicolaou y los métodos de LBC , que se basa en el examen microscópico de las células individuales en muestras de pacientes , tienen una sensibilidad limitada de 50 % y la alta susceptibilidad a la variación basada en la visión subjetiva de los téenicos ( Boulet GAV , et al. , Virus del papiloma humano en el cribado del cáncer de cuello uterino : importante papel como biomarcador , Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev 17:810-817 , 2008 ) . En un ejemplo típico , un técnico puede ver 50.000 a 300.000 células por portaobjetos para tratar de encontrar 20-30 células potencialmente anormales , y doble lectura se realiza a menudo , lo que aumenta la variabilidad . Además, estas pruebas requieren personal altamente capacitado y laboratorios bien capitalizados , por lo que las pruebas de mano de obra intensiva y costosa. Los resultados de sensibilidad relativamente baja a una alta tasa de falsos negativos , sobre todo debido a un muestreo inadecuado y la preparación de laminillas inconsistente e inadecuada . El desarrollo de la teenología de LBC ( ThinPrep , Cytyc Inc.; SurePath , TriPath Imaging, Inc. ) ha proporcionado método más estandarizado de muestreo. Por ejemplo , el procesador ThinPrep automatizado purifica de la contaminación de muestras de células de la sangre , bacterias , mucosidad , y otro material inflamatoria , antes de depositar en un portaobjetos que será analizada por un citotecnólogo . Este método detecta 65 % más LSIL en la población general de Papanicolaou convencional, y reduce por > 50 % el número de muestras de células inadecuadas , y proporciona la capacidad de realizar pruebas adicionales fuera del mismo vial . Por otra parte , los sistemas de imágenes automatizados actualmente identificar células sospechosas que se examinan posteriormente por un patólogo .

Preparación automatizada de laminillas, métodos de lectura automatizados, y el desarrollo de la tecnología de LBC han reducido la carga del análisis, así como la variabilidad intra e ínter-individual de evaluación. Sin embargo, estas tecnologías contribuyen a aumentar la infraestructura de alta teenología y los costos necesarios para la detección cervical, lo que claramente no es en beneficio de los pacientes y proveedores de atención médica en las zonas geográficas menos desarrolladas y ajustes bajos de infraestructura. En estas zonas, las lecturas visuales individuales de las pruebas de Papanicolaou siguen siendo la norma.

De acuerdo con las recomendaciones de la ACS (Smith, 2005), la detección del cáncer cervical se debe hacer cada año con la prueba de Papanicolaou o LBC. Si la prueba de Papanicolaou es anormal y revela ASCUS, la prueba del VPH se realiza, y si es positivo, las mujeres se refiere a la colposcopia. Si la prueba de Papanicolaou revela LSIL o HSIL, las mujeres son remitidas de inmediato a colposcopia. La colposcopia es el examen microscópico del cuello del útero en ácido acético o Lugol mancha para revelar células anormales, que pueden ser a su vez biopsia. Las mujeres mayores de 30 años que hayan tenido tres pruebas consecutivas con resultados normales seguidos someterse a estudios de detección cada 2-3 años con citología cervical solo, o cada 3 años con una prueba de ADN del VPH además de citología cervical. Las mujeres mayores de 70 años y más que han tenido tres o más pruebas de Papanicolaou normales en una fila, y no existe ninguna prueba de Papanicolaou anormal en los últimos 10 años, pueden dejar de screening (Smith, 2005).

Tejidos y suero biomarcadores pueden mejorar la precisión de Papanicolaou y complementar la investigación cervical actual, y se han descrito marcadores biológicos potenciales para las lesiones cervicales preneoplásicas y el cáncer cervical. Antigeno Ki - 67 es una proteina nuclear a gran expresado en las células proliferantes ( Goodson WH , et al La relación funcional entre in vivo bromo - desoxiuridina indice de etiquetado y Ki - 67 indice de proliferación en cáncer de mama humano , Cáncer Res. Treat pecho mayo de 1998 . . ; 49 ( 2 ) : 155-164 ; Scholzen T., et al la proteina Ki -67 : . de lo conocido y lo desconocido [ revisión] , J. Cell Physiol 2000 ; 182:311-22 ) Ki - 67 se expresa preferentemente durante todas las fases activas del ciclo celular ( G1 tardía - , - S , G2 y M ) , pero ausente en las células en reposo ( G0 - ) . En histopatología de diagnóstico , los anticuerpos para Ki - 67 se utilizan para las tasas de proliferación de los tumores de grado ( Cattoretti G. , et al Anticuerpos monoclonales contra partes recombinantes del antígeno Ki - 67 ( MIBland MIB3 ) detectar las células en proliferación ·bh el microondas - procesado fijado con formalina secciones de parafina J Pathol 1992 ; .168:357-63 ) . Ki -67 inmunotinción con el anticuerpo disponible comercialmente MIB -1 ha sido evaluada como una prueba auxiliar para aumentar la precisión diagnóstica de las lesiones escamosas intraepiteliales cervicales ( LSIL y HSIL , . Pirog et al Exactitud diagnóstica de las lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado del cuello uterino se ha mejorado con MILB - 1 inmunotinción , Am J Surg Pathol 26:70-75 , 2002 ) . Sin embargo , como anteriormente , el uso de este marcador no es precisa debido a la variación interobservador en el diagnóstico de LSIL .

Las proteínas minichromosome de mantenimiento (MCM) , y particularmente MCM-2, MCM-5 y MCM-7, también son útiles para la detección de la enfermedad cervical incluyendo la displasia y el cáncer (Williams et al., Proc Nati Acad Sci EE.UU. 95:14932-14937 , 1998;. Clin Cáncer Res. 5:2121-2132, 1999) Freeman et al,, como se ha demostrado en los frotis cervicales convencionales o por tinción inmunohistoquimica de los tejidos del cuello del útero.. Resultados recientes utilizando un modelo de ratón transgénico VPH-han demostrado que MCM-7 parece más a ser un marcador especifico para la detección de la enfermedad cervical de alto grado por inmunoquimica (Cáncer Res. freno et al, 63:8173-8180, 2003..; Malinowski et al, Acta Cytol 43:696, 2004;.. la patente de EE.UU. 7.632.498 Malinowski et al, 2009)..

Quinasa dependiente de cielina inhibidor 2A (CDKN2A), también conocido como pl6 (INK4a) es un regulador del ciclo celular sobreexpresados en las lesiones preneoplásicas del cuello del útero que albergan HPV16/18 y en el cáncer cervical. pl6 (INK4a) la sobreexpresión es debido a la inactivación funcional de la proteína del retinoblastoma Rb por la proteína E7 de HPV. pl6 (INK4a) la sobreexpresión está por lo tanto relacionada con la expresión de genes de VPH activo, en lugar de la presencia viral sólo. Así, se ha propuesto que la sobreexpresión de pl6 (INK4a) puede ser utilizado como un marcador para la infección persistente por HPV de alto riesgo y la detección de las lesiones epiteliales escamosas de alto grado (HSIL;. Klaes y col La sobreexpresión de pl6 (INK4a) como específica marcador para las células epiteliales displásicas y neoplásicas del cuello uterino útero, Int J Cáncer 92:276-284, 2001; Agoff et al, pl6 (INK4a) expresión se correlaciona con el grado de neoplasia cervical, una comparación con Ki-67 expresión y detección de tipos de alto riesgo del VPH, Mod Pathol 16:665-673, 2003; Von Knebel Doeberitz et al, 2004, Patente de EE.UU. 6.709.832) .

Detección inmunohistoquímica de pl6 ( INK4a ) en biopsias de cuello uterino es de uso rutinario para discriminar entre el VPH y lesiones asociadas no VPH ( Redman R, et al . , La utilidad de pl6 ( Ink4a ) para discriminar entre la neoplasia cervical intraepitelial y no neoplásicas lesiones equívocas del cuello uterino , Arch Pathol Lab Med 132:795-799 , 2008 ), y como marcador indirecto de la infección por VPH de alto riesgo ( Mulvany NJ , et al , la utilidad diagnóstica de la pl6INK4a : . una reevaluación de su uso en las biopsias de cuello uterino . Pathology 40:335-344 , 2008 ) . Además, se está evaluando pl6INK4a inmunotinción de ThinPrep especímenes cervical por su capacidad para ayudar a la identificación de las lesiones intraepiteliales de alto grado , según la evaluación de las biopsias de seguimiento y de alto riesgo del VPH pruebas de ADN (Mcyer et al. , La evaluación de la expresión pl6INK4a en ThinPrep muestras cervicales con el ensayo de pl6INK4a de CINtec , Cáncer ,111:83 -92, 2007 ; Doeberitz et al, 2007 , Patente de EE.UU. 7.306.926 ) . Por último , se ha realizado un procedimiento basado en ELISA para la detección de pl6 ( INK4a ) utilizando lisados de proteina de las células del cuello del . útero exfoliativa para producir una mayor sensibilidad y especificidad para la displasia y el cáncer comparativemente a la prueba de ThinPrep ( Ding L , et al . , Prueba ELISA para detectar CDK2A ( expresión de pl6 ( INK4a ) en las células exfoliativa : una nueva herramienta de detección para el cáncer cervical, Mol Diagn Ther 12:395-400 , 2008 ) .

Entre los biomarcadores circulantes , carcinoma de antigenos de células escamosas (SCC ) en suero se correlaciona con el estadio tumoral , tamaño del tumor , tumor residual después del tratamiento, la enfermedad recurrente o progresiva , y la supervivencia en el carcinoma escamoso cervical ( Gaarenstroom KN , Bonfrer JMG . NACB , National Academy of Clinical Bioquímica : Directrices para el uso de los marcadores tu orales en el cáncer cervical, 2007 ) . Antígeno de SCC es un grupo de glicoproteíñas con un peso molecular ~ 45 kDa , que pertenece a la familia de los inhibidores de la proteasa de serina . Dos genes, SSC1 y SSC2 , ambos ubicados en el cromosoma 18q21.3 , código de la isoforma neutra y ácida respectivamente . La forma neutra se detecta en las células epiteliales tanto normales como malignas, mientras que la isoforma ácida se encuentra en las células tumorales y en el suero de pacientes con cáncer con carcinoma de células escamosas bien diferenciado ( Kato H , et al . , La distribución heterogénea de ácido TA- 4 en el carcinoma de células escamosas de cuello uterino ; demostración inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales , JPN J Cáncer Res 78:1246-1250 , 1987 ) . SSC1 y SSC2 son casi idénticos , sólo difieren en sus bucles de reactivos . Hay pruebas de que regular sucesos proteolíticos en procesos tanto normales como patológicas , sin embargo, tener funciones biológicas distintas ( De Bruijn HWA , et al , El valor clínico de antígeno de carcinoma de células escamosas en el cáncer de cuello uterino , tumor Biol.19 : .505-516 , 1998 ) . Los niveles elevados de SCC también se han encontrado en pacientes con carcinoma de células escamosas de otros órganos ( vulva, la vagina , la cabeza y el cuello , pulmón ) , así como en pacientes con enfermedades benignas de la piel (psoriasis , eccema ) , pulmón ( sarcoidosis ) , hígado y el riñón . Sin embargo , de acuerdo con las recomendaciones del NACB ( Gaarenstroom , 2007 ) , SCC no es un biomarcador suficientemente sensible para detectar el cáncer cervical, y su utilidad clínica en el pronóstico y vigilancia de respuesta al tratamiento necesita ser evaluado.

En conclusión, hay una necesidad de mejorar la exactitud, el rendimiento y el costo de los sistemas actuales de detección para los trastornos ginecológicos. Las composiciones, sistemas y dispositivos de la presente invención permiten de precisión, bajo costo, de alto rendimiento, e individualizado de detección rápida, de los trastornos ginecológicos, con especial aplicación al cáncer cervical. Debido inmunotinción anticuerpos representa una "prueba objetiva", anticuerpos contra biomarcadores específicos para el cáncer cervical podría así ayudar en la interpretación diagnóstica de LSIL al aumentar la precisión del diagnóstico de la citología o histopatología.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención describe nuevos dispositivos y sistemas para la detección de alto rendimiento y la detección de diferentes patologías, enfermedad ginecológica específicamente en muestras de pacientes. Específicamente, la invención proporciona un sistema para la extracción, la verificación, y cribado de alto rendimiento de muestras para detectar patologías, incluyendo las células inflamatorias para la enfermedad autoinmune, las células neuronales para las enfermedades neurodegenerativas y las células del cuello del útero. La presente invención da a conocer un sistema integral para la recogida de muestras de pacientes, muestras de codificación para el análisis y la mayoría de los resultados, el análisis con marcadores biológicos de propiedad, utilizando específicamente un proceso de selección de alto rendimiento de cribado centralizado, y la notificación de los resultados codificadas con la fuente de la muestra del paciente.

El proceso de tamisaje de alto rendimiento incluye el procesamiento paralelo de múltiples muestras de pacientes utilizando un conjunto común de téenicas de diagnóstico , incluyendo un conjunto único de marcadores para la detección de la enfermedad . Para habilitar la detección de alto rendimiento , la invención incluye un dispositivo de " multipocillo " que comprende un soporte sólido con múltiples áreas circulares separados , cada uno de acomodar una muestra de paciente , lo que lleva a la evaluación simultánea de múltiples muestras de pacientes con un conjunto común de los marcadores bioquímicos para el cribado de alto rendimiento y detección de la enfermedad . La presente invención incluye un dispositivo de manipulación robótica que transfiere muestras de los pacientes a partir de tubos cónicos codificados para el dispositivo de múltiples pocilios para garantizar la estandarización del proceso y para permitir la selección de alto rendimiento y detección de la enfermedad en las muestras recogidas . La presente invención incluye los resultados de entrada de la información de diagnóstico en una base de datos interna y la entrega a través del portal de Internet a los médicos , provedores de salud y hospitales de la fuente paciente donde se recogieron muestras clínicas .

Un nuevo anticuerpo monoclonal ( mAb ) capaz de unirse a un polipéptido marcador para el cáncer de cuello uterino se da a conocer , junto con un epitopo definido en la que la unión con el marcador tiene lugar . Una lista de secuencias presente se transmite que contiene la secuencia de aminoácidos del marcador ( SEC ID N °: 1 ) , la secuencia de polinucleótidos del gen para el marcador ( SEC ID N °: 2 ) y la secuencia de aminoácidos del epitopo en el que el mAb se une ( SEQ ID NO : 3 ) .El anticuerpo también puede contener marcadores y otras entidades funcionales que permitan la detección o localización de la marca , o el mAb , así como para la detección de la unión del anticuerpo al marcador para formar un complejo en el epítopo . La detección del marcador o el anticuerpo se lleva a cabo en el sistema de formato de alto rendimiento para el procesamiento de grandes cantidades de muestras y se lleva a cabo en paralelo con otras pruebas de Papanicolau o citológico . Por lo tanto , la aplicación del sistema en la detección , el diagnóstico y la gestión de la enfermedad de alto rendimiento de células enfermas integración de procesamiento de la información y la gestión , la manipulación y procesamiento de la muestra , de alto rendimiento de procesamiento de bioquímica y análisis microscópico .

El sistema de tamisaje de alto rendimiento incluye la recogida y el procesamiento de los especímenes derivados de cualquier fluido biológico o tejido que se procesa y se tamiza en formato de alto rendimiento con los protocolos de ensayo como se describe en este documento para el análisis, la detección, el diagnóstico, la gestión de la enfermedad y la detección de una variedad de enfermedades y afecciones ginecológicas .

El tamisa je de alto rendimiento del dispositivo y sistemas de la presente invención también pueden encontrar aplicación de utilidad en una variedad de otros ensayos basados en células y citología, así como ensayos de biología celular, incluyendo pero no limitado a la selección de fármacos y compuestos de moléculas pequeñas, y el estudio de las vías celulares.

El sistema de detección integrada de tamisaje de alto rendimiento también se compone de una nuevo formato inmunotinción y equipo de procesamiento de muestras de pacientes utilizando el dispositivo de múltiples pocilios ayudó con el manejo de máquinas robóticas para transferencia de líquidos y la codificación con códigos de barras que permetan el seguimiento e integración de las informaciones generadas durante este proceso de tamisaje en el base de datos y sistemas de información a los profesionales sanitarios. La combinación patentada de marcadores distingue rápidamente y con precisión las células de cáncer cervical de las células cervicales normales en una muestra de paciente. Por otra parte, un anticuerpo específico también detecta un antígeno que se sobre expresa en células de cáncer cervical. Por lo tanto, la presente invención toma ventaja de la utilización de estos anticuerpos específicos en un formato de amisaje de alto rendimiento para identificar las células cancerosas, lo que aumenta la precisión del diagnóstico de manera significatica comparaticemente a la evaluación visual de la morfología celular por el patólogo.

También, abarcadas por la presente invención es el uso de otros anticuerpos o combinación de anticuerpos contra los biomarcadores o combinación de biomarcadores que se asocian a las células cervicales preneoplásicas, neoplásicos o displásicos. El uso de anticuerpos contra estos biomarcadores podría mejorar en gran medida la sensibilidad actual de la prueba de Papanicolaou.

Por último , la presente invención incluye una composición y un dispositivo para la detección de la enfermedad cervical y de selección basada en una célula de suspensión de células de muestras de paciente . En el proceso de selección , una pluralidad de muestras de pacientes conservadas son analizados por el procesamiento en paralelo en un formato de alto rendimiento seguida de un análisis de la tinción logrado con un ( INK4a ) anticuerpo anti - pl6 , que se localiza en el núcleo de la célula y el citoplasma . El tamisa e de alto rendimiento asistido de robótica que transieren las muestras clínicas de pacientes de manera específica y precisa y a donde se contempla el uso de anticuerpos monoclonales y / o policlonales contra los biomarcadores específicos expresados por las células de cáncer de cuello uterino . La presente invención contempla el uso de una combinación triple anticuerpo contra pl6 ( INK4a ) , un biomarcador indicativo de la presencia de la infección del cuello uterino por el virus del papiloma humano , y anti Ki - 67 , un biomarcador sabe que se expresa en el núcleo de cáncer células proliferativas, para facilitar el examen de diagnóstico de alto rendimiento de las muestras de pacientes En una realización preferida , la presente invención contempla el uso de cada uno de los anticuerpos de manera individuales ou combinados, el eanticuerpo contra pl6 ( INK4a ) , el anticuerpo contra la Ki - 67 y el contra MJC441 ( anti-gen H.sapiens DISCO ( Gene ID : 27185 , NM_018662.2 ) específico de cáncer biomarcador expresada por células de cáncer cervical . La combinación de marcadores facilita aún más la discriminación entre las células normales y cancerosas proliferativa y permite la detección reproducible y estandarizada logrando un diagnostico seguro que se realiza a alto rendimiento para las muestras clínicas de pacientes .

El sistema integrado también proporciona la capacidad de cuantificar la reacción específica antígeno-anticuerpo, a su vez facilitar la automatización del proceso de detección de cáncer cervical. En el presente ejemplo se utiliza una reacción colorimétrica, pero otros sistemas de detección son abarcados por la presente invención. La inmunotinción basada sobre la lectura colorimétrica de la reactividad de células representa una análisis precisa, rentable, fácil de usar y más adecuada comparativemente a la evaluación visual de las intensidades de tinción y al examen morfológico de las celules por el patólogo.

La presente invención proporciona varias mejoras y aplicaciones de utilidad de los mismos comparativemente de los procedimientos actuales de detección de cuello uterino: i) múltiples capacidad única de tamisa e de alto rendimiento, ii) aumentar la precisión en la interpretación de diagnóstico en comparación con la evaluación de la morfología celular sola, debido al uso adicional de anticuerpos específicos, iii) el uso de biomarcadores específicos y novedosos indicativos de la presencia de infección por virus de papilomas humanos en las células del cuello del útero, indicativos de la capacidad proliferativa de las células y específicos para las células cancerosas, iv) la integration de sistema robótica que permite un tamisaje de alto rendimiento, y el sistema centralizado e integrado hace que toda el amisaje de diagnóstico se realiza a una medida de costo-efectivo, fácil de usar y cuantitativo de la reacción antígeno-anticuerpo .

Las características de la presente invención, y sus aplicaciones a la detección de detección de enfermedades cervicales a alto rendimiento resultara en un grand beneficio para el diagnostico de cáncer cervico uterino particularmente en los países de bajos recursos y infrastructuras y a los países desarrollados y en desarrollo.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un esquema de flujo de procesamiento de las muestra / flujo de datos de datos del sistema de la invención.

Figura 2: La inmunodetección de MJC441 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino Panel izquierdo: Diagrama que ilustra la ubicación del punto 4 líneas celulares de cáncer de cuello uterino en el ensayo MPAT. Igual cantidad de proteínas de los extractos de cada línea celular se colocan, por duplicado, en la membrana MPAT en una matriz de 6 columnas y 4 filas, y se ensayó con mAb MJC441. Las proteínas son a partir de sobrenadantes de cultivo de tejidos con (s +) o sin (-s) de suero de ternera fetal (FCS), o a partir de extractos de células (x), como se indica. Las líneas celulares son: Ca Ski (a), ME-180 (b), C- 33A (c), y SiHa (d).

Panel derecho: .inmunodetección MPAT (descrito en el Ejemplo 6) de MJC441 ya sea secretada en los sobrenadantes de cultivo de tejidos o se expresa en líneas celulares de cáncer de cuello uterino, usando mAb MJC441, tal como se describe en el Ejemplo 4. Intensidad del punto se refiere a los niveles de expresión.

Figura 3: Detección de MJC441 por inmunohistoquímica mAb MJC441 se utilizó para detectar MJC441 en los tejidos del cuello del útero del paciente por IHC utilizando microareglos (microarrays) de tejidos (TMA). TMA muestras clínicas se resumen en la Tabla 1. Como se describe en detalle en el Ejemplo 5, TMA diapositivas fueron tratados para la recuperación de antigenos, la inactivación de la peroxidasa endógena, asi como el bloqueo de biotina endógena y la unión no especifica. Las láminas fueron incubadas con mAb MJC441, seguido de anticuerpo secundario biotinilado. La inmunodetección se basa en la reacción de peroxidasa de estreptavidina seguido por el sustrato cromógeno AEC, y la contratinción de hematoxilina.

Los paneles A y B: tinción de cáncer de cuello uterino (A) y los tejidos adyacentes normales del mismo paciente (B) con el mAb MJC441, desde el núcleo 24 de cuello uterino cáncer de TMA; Ampliación: 20X.

Los paneles C y D: tinción de dos casos de cáncer de cuello uterino de diferentes pacientes con mAb MJC441, desde .el 96 TMA básico; Ampliación: 20X.

Figura 4: La inmunotinción de cáncer cervical y mezclar linea celular normal con mAb MJC441.

La inmunotinción se.muestra en este documento el uso de un mAb de control negativo (A) y mAb MJC441 (B); ampliación: 40X. En la imagen, flechas rojas apuntan a las células normales, las flechas verdes a las células cancerosas. Como se ha descrito en el ejemplo 6 una mezcla de células normales (fibroblastos de embriones humanos MRC5) y células de lineas celulares de cáncer cervical CaSki o C33A, se mezclaron en una proporción de 1:1, y dejar reposar ON para adherirse a 37 ° C en 15 pocilios diapositivas multiprueba . El dia siguiente después de la permeabilización, las células se hicieron reaccionar con el mAb sin diluir MJC441 seguido de inmunodetección y hematoxilina como tinción de contraste descrito en el Ejemplo 6.

Figura 5: La inmunotinción de muestras cervicales paciente con mAb MJC441 dispositivo de múltiples pocilios Las células cervicales de una muestra del paciente en solución conservante se colocan en capas en un pozo del dispositivo de múltiples pocilios de la presente invención, se fijaron en etanol al 95%, se secó al aire y se enjuagó con PBS, después se fijaron y se tiñeron con mAb MJC441. La inmunodetección y hematoxilina contratinción se realizó como se describe en el Ejemplo 7; ampliación: 40X.

Descripción de los microarreglos (microarrays) de tejido de cáncer de cuello del útero humanos (TMA) de 24 o 96 núcleos usa en este documento. El 24 TMA básico incluye la contraparte tejido adyacente normal de cada tejido enfermo de cáncer de cuello uterino. El 96 TMA básico núcleo de 48 muestras por duplicado, incluidos los casos de cáncer cervical, y normal, benignos (pólipos cervicales) e inflamación (cervicitis crónica) los tejidos del cuello uterino. Todos los tejidos fueron de la resección quirúrgica. Se indica el cáncer de cuello uterino subtipo histológico.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención incluye un paquete de servicios integrados de un kit a los médicos privados , proveedores de salud y hospitales. El kit contiene típicamente un espéculo , un cepillo y instrucciones detalladas sobre cómo recoger las muestras clínicas , un tubo cónico de policarbonato con un líquido de conservación para preservar las células y microorganismos infecciosos para evitar su degradación. El kit también contiene etiquetas de códigos de barras o otros identificadores únicos paciente fijados a la muestra clínica ( s ) del paciente y para cualquiera de varios formatos de recopilación de datos que recopilan información clínica del paciente y su médico o información del proveedor de la salud La presente invención incluye la recogida y entrega de barras codificadas viales que contienen las muestras clínicas de los pacientes y la barra de hojas de datos codificados de información clínica y los médicos paciente o información del proveedor de la salud para comunicar el identificador y una muestra a un procesamiento centralizado y el centro de tamisaje de alto rendimiento para la detección de la enfermedad y su clasificación . A su llegada, las muestras codificadas y la información clínica del paciente, del doctor y la información del proveedor de salud privado o publico se introducen en una base de datos en el centro de detección de diagnóstico centralizado antes de su procesamiento. El sistema integrado comprende eguipo para la recogida y transferencia de las muestras clínicas de laspacientes a, tinción citológicas convencionales y los marcadores de I propiedad aplicados al dispositivo de múltiples pocilios para el tamisaje de alto rendimiento, incluyendo hematoxilina convencional o hematoxilina y ( H & E ) tinción con eosina , y tinción de Papanicolaou convencional.

Entre cada etapa de la comunicación, es decir, entre el paciente y el proveedor, el proveedor de laboratorio, y volver a la paciente y para proporcionar un sistema codificada puede ser utilizada para preservar la privacidad del paciente mediante la eliminación de la identidad del paciente a partir de la muestra. En uno de tales sistemas el paciente se proporciona un código de clave que no se puede acceder por el laboratorio, y la detección se lleva a cabo anónimamente hasta que los resultados se devuelven al proveedor de que se asocia anónimos resultados codificados para el laboratorio con muestras de pacientes y sus informaciones clínicas y personales. Este proceso codificado evita todos los errores que pueden ocurir durante el procesemiento y asi segura la anonimidad de la paciente y un diagnostico seguro en lo mismo tiempo.

El sistema combina las muestras clínicas de la paciente codificadas en el multiwell para el procesamiento y análisis de múltiples muestras simultáneamente. Para el procesamiento en paralelo el sistema de la invención utiliza un dispositivo de "multipocillo" para análisis y tamisaje de alto rendimiento. El multiwell tiene un soporte sólido con múltiples áreas circulares bien separadas, cada uno con capacidad de una muestra del paciente, lo que lleva a la evaluación simultánea de múltiples muestras de pacientes y múltiples marcadores de enfermedad.

Una ves que el procesamiento y el análisis llega acabo los datos individuales resultantes de cualquiera de los ensayos realizados se correlacionan para cada paciente de forma individual y un informe de datos específico del paciente se genera para y se envía a la destinación de donde llego la muestra de la paciente sea al médico o al proveedor después de la decodificación con un identificador único.

Véase la Figura 1.

El dispositivo de múltiples pocilios comprende aproximadamente 40 numerados (1-40) zonas circulares (o pozos) de 15 mm de diámetro dispuestos en una matriz. El número de pocilios en la matriz y asi el diámetro del formato de ensayo (por ejemplo, el número de células) puede ser alterada de acuerdo con el tipo de ensayo y el número de muestras en el ensayo basado en células relevante.

El dispositivo de múltiples pocilios se hace preferiblemente de policarbonato, sin embargo, otros materiales están abarcados por la presente invención, tales como, pero no limitados a: vidrio, acrílico, plexiglás, poliestireno, polipropileno, etc. Modificaciones de material del dispositivo con respecto a facilitar la adsorción de proteínas, o asegurar la compatibilidad con las soluciones orgánicas o acuoso del procedimiento o otras modificaciones como es conocido por los expertos en las artes, se engloban en la presente invención.

El dispositivo de múltiples pocilios se recubre con un material tal como una película de teflón o otros materiales conocidos en la téenica a la partición de la superficie en áreas circulares para evitar la contaminación cruzada entre las muestras. A medida que la capa puede ser de diferente espesor, las áreas circulares pueden ser delineadas por un borde de diferente grosor y altura, convirtiendo la zona en un pozo de diferente profundidad Haciendo referencia a la Figura 1, un sistema de tamisaje de alto rendimiento para el tamisaje de muestra del paciente utiliza un vial codificado que contiene las muestras de pacientes en solución conservante se recibe y se coloca en un portamuestras de 40 inversiones. Un robot de manipulación de líquidos transfiere muestras de pacientes de los viales individuales a una placa de múltiples pocilios codificada. Cuando las muestras se dividen de forma que más de uno va a acomodar una muestra del mismo paciente, el código se aplica a más de una voluntad de acuerdo. Tinción de Papanicolaou o otros análisis, incluyendo inmunotinción usando la combinación de anticuerpos descritos en este documento, se lleva a cabo en pocilios múltiples recipientes de tinción. Varias placas de pocilios múltiples, se pueden combinar en un bastidor para aumentar el rendimiento, mientras que un sistema automatizado de alto rendimiento mueve los bastidores de múltiples pocilios de una cubeta de tinción a otro, permitiendo el proceso de tinción de varios pasos.

El sistema permite el análisis de múltiples muestras simultáneamente . En la medida , que tiene aplicación de utilidad como un formato de alto rendimiento para una variedad de ensayos basados en células incluyendo la citología convencional y la inmunotinción de células , se realiza habitualmente en portaobjetos de vidrio individuales . Mientras que diferentes patologías se contemplan en este documento , las formas de realización preferidas de la presente invención se centran en cáncer de cuello uterino . El aparato de los componentes del sistema están emparejados a los procesos de información y pasos discretos para realizar un seguimiento y combinar de manera segura las muestras de los pacientes a través del consumo , tratamiento, análisis e informe de los resultados de vuelta al paciente, el médico o profesional de la salud. El flujo de información se inicia con muestras codificadas recibidas con singular o cifrado de identificación del paciente, y una lista de las pruebas solicitadas, por lo general dirigidos junto con la información del proveedor de salud. Estos datos se introducen en la base de datos central del centro de cribado de diagnóstico antes de la elaboración. El identificador único del paciente está· ligado a uno o más pozos del mapa de múltiples pocilios (fila / columna) para cada ensayo relevante que se va a realizar para ese paciente . Los datos obtenidos como salida para cada paciente y para cada formato de ensayo realizado se introducen y se fusionaron en la base de datos , ensamblados en un informe del paciente , y enviar la información a través de un portal de conexión segura y cifrada para el proveedor de paciente , médico o servicio de salud sanitario .

Las muestras cervicales. Las muestras cervicales se obtienen a partir de un paciente individual o contacto principal de un paciente, típicamente un proveedor local de asistencia sanitaria. Las muestras son con código de barras y opcionalmente provisto de un identificador único que tiene una llave / cerradura datos seguros o identificador de cifrado que coincide con la identificación segura del paciente a la muestra. La muestra se recoge a partir de un cuello uterino paciente, ya sea médico o profesional de la salud recogió, o auto-recogió, incluyendo células, tejido o fluido corporal, utilizando cualquier dispositivo, incluyendo, pero no limitado a cepillo, esponja, espátula, raspando o frotando un área o mediante el uso de una aguja para aspirar fluidos corporales. Las muestras cervicales también se pueden derivar de, pero no limitado a, los tejidos frescos o congelados humanos, tejidos embebidos en parafina, muestra de biopsia, células cervicales exfoliadas, o muestras de la mucosa cervical, o muestras de lavado cervicovaginal.

Las muestras comprenden células del cuello uterino, en suspensión, deriva de muestra cervical recogido según la citología de base líquida tal como, pero no limitado a, la preparación de ThinPrep ® (CYTYC, Inc.), o SurePath ® (TriPath Imaging, Inc.). De hecho, en formas de realización particular de la presente invención las células cervicales derivar a partir de alícuotas ThinPrep.

La suspensión de células del cuello uterino puede utilizar solución propietaria citológico conservante, otra citología a base de alcohol o soluciones de tipo inmunohistoquimica, o las células del cuello del útero en suspensión en soluciones no conservantes, tales como tampón fosfato salino (PBS).

Con el sistema de la presente invención, las muestras pueden procesarse en paralelo y evaluados por, examen con microscopio tinción citológica, así como la combinación inmunotinción con anticuerpo específico descrito en este documento.

Tinción de hematoxilina de alto rendimiento se demuestra en (Ejemplo 1). Las células de una muestra del cuello uterino paciente en solución conservante se depositan en un área circular del dispositivo de múltiples pocilios. Muestras múltiples se manejan al mismo tiempo, manchadas y evaluaron visualmente bajo el microscopio.

La pluralidad de muestras conservadas se deposita en el dispositivo de múltiples pocilios, que ha sido primero UV irradiada para permitir la unión celular. Están abarcados Otros métodos para la unión celular.

Después de depositar las muestras conservadas en el de múltiples pocilios, las células se fijan en etanol 95% y todo el dispositivo de múltiples pocilios se seca al aire a temperatura ambiente, o alternativamente en .una cámara de 37-40 ° C, después se enjuagó con PBS. Los restos celulares se borran y la tinción hematoxilina se realiza en toda la gama. La matriz de las muestras se examinó visualmente bajo un microscopio y el resultado reportado para todas las muestras en la matriz.

Papanicolau tinción de muestras cervicales de pacientes utilizando el dispositivo de múltiples pocilios. El sistema incluye la tinción de las células normales y anormales en el dispositivo de múltiples pocilios con cualquier .mancha citológico, incluyendo la tinción de Papanicolau usado en el cribado de citología cervical en combinación con los biomarcadores descritos anteriormente.

En esta forma preferida (Ejemplo 2), 50 muestras de displasia de cuello uterino normales y 50 pacientes cervicales en solución conservante, incluyendo, pero sin limitarse a muestras ThinPrep, comprendiendo este último bajo y alto grado de displasia de y las muestras de ASCUS, fueron procesados mediante una simple centrifugación y la etapa de resuspensión. Procesamiento de la muestra clínica incluyó la decantación de la muestra cervical paciente en solución conservante y usando 2 mi de la solución restante para sedimentar las células del cuello del útero mediante centrifugación a baja velocidad. Las muestras se transfirieron a un bloque de 96 mi profunda bien 2,2 para el procesamiento de alto rendimiento.

Después, el sedimento celular se resuspendió en etanol al 95 % , y una fracción del sedimento celular resuspendido se depositó manualmente en el dispositivo de múltiples pocilios , una muestra de un paciente por cada área circular . Las muestras fueron teñidas utilizando soluciones de tinción de Papanicolaou y leídos por un patólogo ciego al diagnóstico inicial de la muestra. Los resultados del diagnóstico obtenido mediante presente invención reconocen las muestras normales, normales y muestras de la enfermedad como anormal a tasas muy elevadas .

Se entiende que estas muestras cervicales de pacientes se recogieron ya sea por un profesional de la salud o auto -recogidos , ya sea en forma de ThinPreps SurePath o muestras , o de otras sustancias como se describe anteriormente. Otros procesamientos de muestra se contemplan para su concentración de la muestra , la purificación , la clarificación de moco , sangre, y otros restos celulares, otros métodos de enriquecimiento de muestras y procesamiento, incluyendo pero no limitado a el método manual BD SurePath mediante el cual una muestra del cuello uterino se enriquece después del paso en una densidad gradiente , se centrifugaron , se resuspendieron y se deposita en una sola diapositiva por sedimentación por gravedad a través de una cámara de sedimentación .

Tal como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo policlonal, monoclonal, recombinante, molécula de tamaño completo o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, pero no limitado a, Fab, scFv, fragmento de cadena única variable, affibodies, diacuerpos, y cualquier otro fragmento de anticuerpo retener el sitio de unión determinante antigénico relevante. El término "anticuerpo" se usa indistintamente en este documento para referirse a cualquiera de las especies anteriores. Por lo tanto, los anticuerpos incluyen anticuerpos producidos in vitro, así como anticuerpos generados in vivo en una especie capaz de la respuesta inmune. Métodos para producir, anticuerpos recombinantes, monoclonales y policlonales fragmentos de los mismos son conocidos por el experto en la téenica (Colligan et al, Current Protocols in Immunology, Wilcy Intersciences;. Kohler y otros, Nature 256:495-497, 1975; La presentación en fagos de péptidos y proteínas - Un manual de laboratorio, BB Kay, Winter J. & McCafferty J., Eds, Academic Press, 1996).

Anticuerpos específicos contra los biomarcadores específicos pueden ayudar en la interpretación diagnóstica de lesiones preneoplásicas y displasia en la detección del cáncer cervical, mediante la identificación de marcadores específicos que se sobreexpresan en las condiciones precancerosas o cancerosas. A continuación se describe Tal un nuevo marcador. La inmunotinción puede servir como un complemento a la interpretación morfológica por el patólogo, al proporcionar una mayor precisión a la histopatología o diagnóstico basado en la citología.

MJC441 Marker .MJC441 es Homo sapiens gen DISC1 (Gene ID: 27185; NM_018662.2), que codifican la proteína alterada en la esquizofrenia 1 (DISC1), integrada por 854 aminoácidos, con MW prevista de 93.611 Da (UniProt Q9NRI5; NP_061132.2). Esta proteína, que alberga motivos bobina en espiral, está implicado en la regulación de varios aspectos de la neurogénesis embrionario y adulto, incluyendo el crecimiento de neuritas y el desarrollo cortical a través de su interacción con otras proteínas. Una aberración cromosómica participación de los DISC1 segrega genes con la esquizofrenia y los trastornos psiquiátricos relacionados en una familia escocesa. Hay múltiples conocidas variantes de splicing alternativo e isoformas, especialmente en el cerebro (proporcionado por NCBI Ref Seq; Pruitt, 2012).

Inmunodeteccion of MJC441 en celulas cervicales de cáncer Las células que contiene VPH como (Ca esquí, ME-180 y SiHa) y las lineas celulares que no contienen VPH como (C-33) de cuello uterino cáncer de células no fueron cultivadas en absencia de suero de ternera fetal para facilitar la detección de marcadores potencialmente secretadas en su sobrenadante de cultivo. El procedimiento de inmunodetección, se describe en detalle en el Ejemplo 3. Como se ejemplifica en el Ejemplo 4, se prepararon extractos de proteínas a partir de células y sus sobrenadantes de cultivo celular, y la igualdad de cantidades fueron vistos en la MPAT, y se hicieron reaccionar con el mAb MJC441, seguido por la detección de los complejos antígeno-anticuerpo.

Como se ilustra en la Figura 2, la fuerte expresión de MJC441 se observa en extractos de Ca Ski, ME-180 y las líneas celulares SiHa, así como en la no-VPH que contienen C-33A. La secreción se observa principalmente en el sobrenadante del cultivo celular sin suero de ternera fetal (carril-s) de la cultura de Ca Ski .

MJC441 expresión en tejodos de cáncer cervical cáncer tissues por inmunohestoquimica La inmunohistoquímica (IHC) es una practica comúnmente en procedimiento de diagnóstico in vitro utilizado para determinar el estado normal o de enfermedad de una biopsia de te ido del paciente. La biopsia de te ido del paciente es primero fijado en formol e parafina y embebido, luego se seccionaron a 3-5 micrómetros de espesor y montado sobre vidrio microscopio tratado desliza para mejorar la adherencia del tejido. Los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo relevante frente a un marcador celular en un procedimiento descrito en detalle en el Ejemplo 5. Microarrays de tejido (TMA) también se pueden utilizar en lugar de laminilla individuales. TMA, como se conoce en la téenica, permite el análisis de la reactividad de un anticuerpo, o la expresión de biomarcadores en un gran número de muestras de pacientes que permitan el establecimiento de biomarcador prevalencia en la población.

En el ejemplo detallado en este documento, el procedimiento de inmunotinción comprende el uso de anti-IgG de ratón biotinilado anticuerpo secundario seguido de estreptavidina ligado a peroxidasa de rábano picante, finalmente seguido de la adición de sustrato AEC. Otros procedimientos de inmunotinción conocidos en el campo están abarcados por la presente invención. Por ejemplo, los protocolos basados en diferentes sistemas de detección y etiquetado, tales como fosfatasa alcalina, biotina-estreptavidina , o fluoróforos también se pueden realizar con éxito dentro del alcance de la presente invención. Por otra parte, mientras que la mayoría de los tejidos deben someterse a un pre-tratamiento para inactivar la peroxidasa endógena si se utiliza tinción a base de peroxidasa, dicho pre tratamiento no es necesario cuando se utiliza sistema de imagen basado en la fluorescencia, y el protocolo se modifica en consecuencia.

Modificaciones y alternativos conocidos por los expertos en la téenica están abarcados por la presente invención, tales como, pero no limitado a lo siguiente: cualquier método para la fabricación de antígenos más accesible a la unión al anticuerpo se puede usar en la práctica de la invención, incluyendo los métodos de recuperación de antígeno conocidos en la técnica, los protocolos alternativos de selección y tinción (tales como el uso del sustrato DAB en lugar de AEC), métodos alternativos de bloqueo de biotina endógena, o bloquear la unión no específica de sustrato.

Las proteínas tienen diferente localización dentro de la célula dependiendo de su función: pueden ser secretadas ( tales como factores de crecimiento , hormonas , neuropéptidos ) , presente en la superficie celular ( tales como glicoproteírías, glicolípidos y receptores ) o se producen dentro de la célula ( en el citosol , o en particular, sub- compartimentos celulares tales como el núcleo el aparato de Golgi , el retículo endoplásmico ). Las proteínas se pueden localizar en las estructuras celulares a través de la utilización de los correspondientes anticuerpos por una variedad de téenicas conocidas por los expertos en las artes, que se pueden realizar en suspensión de células de mamífero o células adherentes , y que se describen en ( Current Protocols in Immunology , Wilcy Interscience , John E. Colligan et al . ) , tales como, pero no limitado a , inmunohistoquímica , inmunofluorescencia ( IF ) utilizando FACScan ( FACS ) , citometría de flujo ( FC ) y IF indirecta , si no también la microscopía electrónica y otras técnicas de imagen que proporciona información acerca localización de nuevas estructuras subcelulares . Por IHC , la tinción específica de mAb contra un marcador puede estar localizado en cualquiera de los dos núcleos , membrana celular o citosol. El conocimiento de la localización biomarcador es importante en el diseño de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas .

La asociación de MJC441 para cáncer de cuello uterino se pone de manifiesto por medio de IHC. Uso de mAb MJC441, se detecta la presencia del marcador MJC441 en los tejidos de pacientes con cáncer de cuello uterino en comparación con homólogos normales, tal como se describe en el Ejemplo 5.

Para confirmar IHC preliminar, mAb MJC441 fue probado en un TMA de 24 núcleos que comprende 12 casos de carcinoma de células escamosas (TNM en estadio I, grado I a III) y 12 casos de tumor correspondiente normal adyacente (NAT) muestras (es decir, el cáncer y la muestra normal del mismo paciente). Información de la muestra clínica se resume en la Tabla 1. Como se ilustra en la Figura 3 (panel A frente a B), mAb MJC441 dio tinción fuerte y específica de los tejidos de cáncer en comparación con los tejidos normales adyacentes. Estroma Incidental mancha puede ser consecuencia de que el mAb purificado.

Tabla 1 TMA 24 secciones: 12 cáncer cervical 12 NAT, Incluyendo: TMA 96 secciones: 48 muestras en duplicado, incluyendo mAb MJC441 también fue probado en un TMA de 96 secciones de tejodos, incluyendo 39 casos de cáncer de cuello uterino y 9 controles. Como se resume en la Tabla 1, la mayoría de los casos fueron el carcinoma de células escamosas de la etapa TI y T2, con grados que van desde I a III, así como carcinoma in situ, y pocos adenocarcinoma adicional y casos de carcinoma adenoescamosas. Los controles incluyeron normal (4), benigna (3 pólipos cervicales), y muestras de la inflamación (2 cervicitis crónica). Como se ilustra en la Figura 3 (paneles C y D), se observó una fuerte tinción específica de cáncer de cuello uterino. mAb MJC441 casos de cáncer consistentemente teñidas con poca o ninguna tinción de los controles, lo que demuestra la prevalencia de MJC441 en la población de pacientes de cáncer de cuello uterino.

Los datos presentados en este documento IHC en cáncer de cuello uterino TMA confirman la utilidad de MJC441 como uh marcador de cáncer de cuello uterino.

La in unotinción de cáncer cervical y mezclada con línea celular normal con mAb MJC441 mAb MJC441 detecta células de cáncer cervical en una población celular mixta, una condición experimental imitando una muestra de paciente cervical en solución conservante. Como se ha descrito en el Ejemplo 6, los fibroblastos normales de las líneas celulares MRC5 se mezclaron en una proporción de 1:1 a las células de una línea celular de cáncer de cuello uterino. La mezcla de células se incubó con mAb MJC441 como anticuerpo primario, a continuación, se detectó la interacción antígeno-anticuerpo con un anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa, y, finalmente, teñidas con el sustrato DAB.

Como se muestra en la Figura 4 (panel B), mAb MJC441 específicamente manchas de células de cáncer cervical dentro de una población de células normales, como lo demuestra el precipitado marrón formado por el reactivo DAB. Esto contrasta con el mAb de control negativo (Figura 4, panel A) que produce ninguna tinción de las células, si el cáncer o normal. Note las flechas verdes que apuntan a las células cancerosas, y las flechas rojas que señalan a las células normales.

En general, el mAb MJC441 es capaz de discriminar y mancha específicamente células de cáncer cervical en una población mixta que contiene las células normales, una condición experimental imitando una muestra de paciente de cuello uterino, tal como un ThinPrep o otra muestra de cuello uterino del paciente en solución conservante.

Inmunotincion de células cervical de paciente con anticuerpo mAB MJC441 usando el multi pocilios Una parte alícuota de la muestra cervical paciente en solución conservante se acoda primero en un área circular del dispositivo de múltiples pocilios, se fijaron en 95% de etanol y se secó al aire. La muestra de células se trata a continuación en un protocolo análogo a una inmunotincion de células, tal como se describe en el Ejemplo 7.

Como se ilustra en la Figura 5, el mAb MJC441 específicamente manchas células displasia de cuello uterino en comparación con las células normales. En general, estos datos muestran que el mAb MJC411 reacciona con el marcador MJC441 en líneas celulares extractos de proteínas totales por cáncer de cuello uterino y se secreta de al menos la línea celular Ca Ski. mAb MJC441 manchas los tejidos de cáncer de cuello uterino, pero muestra tinción de las celulas normales homólogos de tejidos adyacentes por IHC, con alta prevalencia de cáncer de cuello uterino, como lo demuestra IHC en cáncer de cuello uterino TMA. Además, el mAb MJC411 específicamente manchas las células de cáncer cervical dentro de una población de células normales en un ensayo de inmunotinción de células. Por último, mAb MJC411 manchas células displasia de cuello uterino del paciente en un ensayo de inmunotinción realizada en la laminilla de múltiples pocilios de la presente invención.

. MJC441 se puede utilizar como un marcador independiente o en combinación con los otros marcadores comerciales descritos en este documento en diversas aplicaciones de diagnóstico, incluyendo en IHC de biopsias cervicales del paciente, y la inmunotinción de células de especímenes cervicales del paciente en solución conservante, tal como, pero no limitado a ThinPrep. mAb MJC441 es útil en la inmunotinción como un complemento de la tinción de Papanicolaou tradicional para la detección de cáncer de cuello uterino, como la tinción de anticuerpos facilita, y mejorar la lectura y la precisión de la evaluación microscópica de la morfología celular Cuando inmunotinción se combina con el alto rendimiento ofrecido por el dispositivo de múltiples pocilios, y su marcador MJC441 mAb proporcionan una mejora significativa para la detección de cáncer de cuello uterino y de detección en la configuración de infraestructura clínicos bajo a moderado.

Como se discutió anteriormente, la inmunotinción puede servir como un complemento a la interpretación morfológica de muestras de células de pacientes por el patólogo. La inmunotinción de múltiples muestras cervicales se puede realizar simultáneamente en el dispositivo de múltiples pocilios utilizando anticuerpos disponibles comercialmente, comúnmente utilizados, así como anticuerpos contra marcadores novedosos, tales como mAb MJC441, tal como se describe a continuación. El uso de anticuerpos contra antígenos conocidos por tener diferentes localizaciones celulares, es decir, núcleo, citoplasma o membrana, puede ayudar aún más el diagnóstico patólogo basado en la citología o la histología solo .

La inmunotinción de muestras cervicales de pacientes utilizando cóctel de anticuerpos en el dispositivo de múltiples pocilios o en formato de ELISA de tipo. La invención también proporciona un procedimiento de inmunotinción sobre la base de una suspensión de células conservadas derivadas de una muestra clínica humana, y una combinación de anticuerpos reaccionó simultáneamente y se analizó en el dispositivo de múltiples pocilios o en un formato de tipo ELISA de múltiples pocilios. La suspensión de células se deriva de una muestra del cuello uterino, y la combinación de anticuerpos detecta displasia cervical, lesiones preneoplásicas o neoplásicas en una muestra cervical.

El sistema de la presente invención incluye imunodetection paralelo de muestras conservadas y codificados en una matriz usando anticuerpos contra pl6 (INK4a), anticuerpos contra Ki-67, VPH, y cualquier otra enfermedad infecciosa del cuello uterino, así como anticuerpos contra los biomarcadores que son sobre-expresado en células cervicales displásicas, preneoplásicas o malignos. El nuevo biomarcador MJC441 describe en este documento, que se expresa diferencialmente en el cáncer de cuello de útero en comparación con los tejidos de pacientes normales y mAb contra el marcador, es utilizado por el procesamiento en paralelo en combinación con anti Ki-67 y anti-pl6 (INK4a) para detectar células anormales del cuello uterino en un muestra del paciente para mejorar la información clínica recogida en una serie de muestras de citología convencional.

La inmunotinción se puede realizar ya sea en el dispositivo de pocilios múltiples (Ejemplo 7) o en un formato de ELISA de tipo placa de 96 pocilios convencional (Ejemplo Cuando el ensayo de inmunotinción utiliza el dispositivo de múltiples pocilios, la matriz de las muestras de pacientes conservadas se trata simultáneamente con etanol al 95% para preservar las características estructurales de muestras, y se secó al aire para permitir la unión de las células a la superficie de múltiples pocilios durante el procedimiento.

Cuando la inmunotinción se lleva a cabo en un formato de tipo ELISA, las células del paciente se fijan con etanol, a continuación, se puede tratar ya sea como células adherentes o en suspensión de células. Tenga en cuenta que cuando se trata de células en suspensión, cada paso del procedimiento es seguido por una etapa de centrifugación suave para asegurarse de células se recogen en la parte inferior del pozo .

La matriz de las muestras se tratan simultáneamente con H202 en vista de inactivación de la peroxidasa antes de la tinción·de anticuerpos, si se utiliza un método de tinción a base de peroxidasa. Entonces inmunotinción con anticuerpos específicos se realiza.

La combinación de anticuerpo primario se usa aquí es anti-r?b (INK4a), anti Ki 67 y anti-MJC441, seguido de anticuerpo secundario conjugado con biotina, y por estreptavidina conjugada con peroxidasa. El procedimiento de inmunotinción comprende 'de manera óptima el uso de anti-IgG de ratón biotinilado anticuerpo secundario seguido de estreptavidina ligado a peroxidasa de rábano picante.

Otros procedimientos incluyen inmunotinción-fos fatasa alcalina, fluoróforos, o sistemas de etiquetado poliméricos (donde una estructura de polímero está acoplado a peroxidasa de rábano picante, o otra enzima, así como para la detección de un anticuerpo secundario). Las células cervicales deben someterse a un pre-tratamiento para inactivar la peroxidasa endógena si -se utiliza tinción a base de peroxidasa. Pretratamiento no es necesario cuando se utiliza sistema de imagen basado en la fluorescencia, y el protocolo se modificó en consecuencia.

Cuando el ensayo de inmunotinción utiliza el dispositivo de múltiples pocilios el sustrato de la peroxidasa puede ser el precipitante DAB o AEC sustratos, para permitir un nuevo examen microscópico de la matriz de las muestras de pacientes. Por otra parte, el formato de tipo ELISA requiere un sustrato soluble para permitir la lectura de densidad óptica a través de un lector de microplacas. En efecto, los complejos antígeno-anticuerpo se visualizan mediante la adición de un sustrato soluble, tal como, pero no limitados a tetra-metil-bencidina (TMB). La inmunorreactividad se obtuvo mediante la medición de la densidad óptica (DO) de la reacción colorimétrica a través de un lector de placas a la longitud de onda apropiada.

La ventaja del formato de tipo ELISA es proporcionar para la cuantificación de la reactividad antigeno-anticuerpo por una lectura colorimétrica, en lugar de por una lectura visual semi-cuantitativa basada en el examen microscopio, como cuando se utiliza el dispositivo de múltiples pocilios.

Para aprovechar al máximo la información proporcionada por el anticuerpo tinción cóctel, esta invención abarca el uso de un anticuerpo cóctel compuesto de tanto anticuerpos primarios de conejo y de ratón. Por lo tanto, la etapa de detección puede utilizar tanto anti-conejo y anti-ratón·secundaria anticuerpos, cada uno vinculado a cualquiera de peroxidasa o fosfatasa alcalina enzimas, permitiendo así tinción doble o múltiple con espectralmente distincts cromóforos colorimétricos o fluorescentes .

La naturaleza integrada del sistema descrito en este documento facilita la lectura microscopio, manejo y manipulación, lectores de microplacas manejo y manipulación, y cualquier otra inspección de la muestra o la instrumentación cuantitativa para el manejo, incluyendo semi- automatizado, y versiones automatizadas completamente de la inmunotinción de procesamiento de muestras citológicas, tensos o componente de la lectura.

Los métodos de la presente invención son usos in vitro de los dispositivos y sistemas para la detección de alto rendimiento y la detección de diferentes patologías, específicamente enfermedad ginecológica en muestras de pacientes. Las etapas del procedimiento se componen de manipulación de las muestras ex vivo de pacientes después de la recogida, con varios modos de prueba y de procesamiento de alto rendimiento y de detección de muestras para detectar patologías, incluyendo las células inflamatorias de las enfermedades autoinmunes, las células neuronales de las enfermedades neurodegenerativas y las células cervicales. Los métodos utilizan el sistema integrado para la colección de muestras de pacientes, la codificación de las muestras para el análisis y la mayoría de los resultados, análisis de marcadores biológicos de propiedad, utilizando específicamente un proceso de selección centralizada de alto rendimiento, y la notificación de los resultados codificadas que se correlacionan con la fuente o la identificación de la muestra del paciente.

Los métodos de tamisaje de alto rendimiento utilizan el procesamiento paralelo de múltiples muestras de pacientes utilizando un conjunto común de téenicas de diagnóstico, incluyendo un conjunto único de marcadores para la detección de la enfermedad. Para habilitar la detección de alto rendimiento, los pasos de proceso que usan el dispositivo "multipocillo" que comprende un soporte sólido con múltiples áreas circulares separados, cada uno de acomodar una muestra de paciente, lo que lleva a la evaluación simultánea de múltiples muestras de pacientes con un conjunto común de los marcadores bioquímicos para el cribado de alto rendimiento y detección de la enfermedad. Los métodos son capaces de aumento de la eficiencia utilizando un dispositivo de manipulación robótica que transfiere muestras de los pacientes a partir de tubos cónicos codificados para el dispositivo de múltiples pocilios para garantizar la estandarización del proceso y para permitir la selección de alto rendimiento y detección de la enfermedad en las muestras recogidas .

Además de los aspectos del sistema, los métodos de la invención incluyen un único flujo de información procedente de la transformación de alto rendimiento permitido por el sistema integrado. Los métodos incluyen la entrada de los resultados de la información de diagnóstico en una base de datos interna y la entrega a través del portal de Internet a los médicos, proveedores de salud y hospitales de la fuente paciente donde se recogieron muestras clínicas..

A los componentes de análisis de la metodología novedosa incluyen el uso de anticuerpos, preferentemente en combinación, y que incluye tanto anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles y de propiedad (Ab) capaces de unirse a un polipéptido marcador para el cáncer de cuello de útero. La detección del marcador o el anticuerpo se lleva a cabo en el sistema de formato de alto rendimiento para el procesamiento de grandes cantidades de muestras y se lleva a cabo en paralelo con otras pruebas de Papanicolau o citológico. Por lo tanto, la metodología se aplica manipulación de la muestra y el procesamiento, cribado de alto rendimiento de las células enfermas, la detección y la gestión de la enfermedad en una plataforma integrada..

La metodología de cribado de alto rendimiento integrada también está compuesto por el uso de un nuevo formato de inmunotinción y equipos de procesamiento de la muestra para las muestras de pacientes utilizando el dispositivo de múltiples pocilios asistido con las máquinas de manejo de líquidos robóticos y el seguimiento de códigos de barras y sistemas de integración y presentación de informes de base de datos a los proveedores de cuidado de la salud. El uso de una combinación patentada de marcadores rápidamente y con precisión distingue células de cáncer cervical de células cervicales normales en una muestra de paciente. Por otra parte, un anticuerpo especifico también detecta un antigeno que se sobreexpresa en células de cáncer cervical. Por lo tanto, la presente invención toma ventaja de la utilización de estos anticuerpos específicos en un formato de alto rendimiento para identificar las células cancerosas, lo que aumenta la precisión diagnóstica en la evaluación visual de la morfología celular por el patólogo.

Por último, la metodología contempla el uso de la combinación de triple anticuerpo contra pl6 (INK4a), anti Ki-67, y anti MJC441 (anti-gen H.sapiens DISCO (Gene ID: 27185, NM_018662.2)) biomarcador específico de cáncer expresado por células de cáncer cervical. La combinación de marcadores facilita aún más la discriminación entre las células normales y cancerosas proliferativa y permite la detección reproducible y estandarizada de alto rendimiento de muestras clínicas de pacientes.

EXAMPLOS Las siguientes abreviaturas se usan a lo largo. ddH20: agua doblemente destilada; hr: hora, min: minutos; sec: segundos; ON: durante la noche, rpm: revoluciones por minuto; RT : temperatura ambiente.

Ejemplo 1: tinción hematoxilina de muestras cervicales de pacientes utilizando dispositivo de múltiples pocilios.

Una fracción de un paciente de la muestra del cuello uterino individuales en solución conservante (e.i. 250 microlitros de volumen, aproximadamente 50-100.000 células) se coloca sobre una única área -circular del dispositivo de múltiples pocilios. Múltiples muestras por lo tanto pueden ser manipulados y evalúan simultáneamente. El dispositivo ha sido irradiado previamente UV para permitir la unión celular. Sin embargo, los métodos alternativos para la unión celular pueden ser utilizados dependiendo del material del dispositivo está hecho de. Las células se fijaron en etanol al 95% y se secaron al aire ya sea a temperatura ambiente o en una cámara de 37-40 ° C, después se enjuagó con PBS. Borrado de los desechos celulares superiores, las células están listas para cualquier mancha citológico.

Para la tinción de hematoxilina, dispositivo de múltiples pocilios se enjuaga con ddH20, y se cubre con unas pocas gotas de solución débil hematoxilina de Mayer durante 2 min-1. Dispositivo de múltiples pocilios se enjuaga dos veces con solución de H20 grifo o azulado (de Scott agua del grifo, o de sodio o solución de carbonato de litio para asegurarse de pH alcalino) para teñir los núcleos de células en azul, y una vez con ddH20. Medio de montaje se puede aplicar según sea apropiado para la preservación de diapositivas.

Alternativamente, el dispositivo de múltiples pocilios se observa inmediatamente bajo el microscopio utilizando diferentes aumentos ya sea como es o se seca al aire.

Ejemplo 2: tinción de Papanicolau de muestras cervicales de pacientes utilizando el dispositivo de múltiples pocilios. 100 viales ThinPrep que comprenden 50 muestras normales y 50 muestras de displasia cervical, cervicales o muestras de pacientes equivalentes en solución conservante, se procesaron a través de un sencillo método de preparación se describe a continuación, depositados en el dispositivo de múltiples pocilios de la presente invención, se tiñeron con soluciones de tinción de Papanicolaou y leídos por un patólogo ciego para el diagnóstico original de las muestras. Muestras clínicas de displasia cervical componen: 16 LSIL, HSIL 16 y 18 ASCUS.

Muestras cervicales del paciente en solución conservante se procesaron de la siguiente manera. En pocas palabras, los viales se decantaron de la mayoría de los fluidos y aproximadamente 2 mi de la solución que contiene la célula restante se transfirió a un bloque de 96 mi profunda bien 2,2 para el procesamiento de tamisaje de alto rendimiento. El bloque se centrifugó a 2000 rpm a 4 ° C durante 10-15 minutos a sedimentar las células, el sobrenadante se decantó y el sedimento celular se resuspendió en etanol al 95%.

Típicamente, se utiliza un volumen de 200 microlitros, y se ajusta en función del tamaño de los gránulos.100 microlitros se vio entonces en el dispositivo de múltiples pocilios, usando una punta de pipeta para extender ligeramente la muestra sobre toda la superficie circular, y el resto se almacena para más ensayos. El dispositivo de múltiples pocilios se dejó secar durante 15 minutos antes de la tinció .

Para la tinción de Papanicolau , se utilizan dispositivos de vidrio de múltiples pocilios preferentemente , y se tiñeron en recipientes de plástico poco profundas de tamaño adecuado , utilizando 60 mi de soluciones de tinción , y 100 mi de las soluciones de lavado para permitir incluso la tinción y lavado a fondo de la superficie del dispositivo con agitación suave . La tinción soluciones de tinción ThinPrep utilizados ( Hologic ) , aunque soluciones de tinción Papanicolau de otras fuentes se abarcan en la presente invención , y fue la siguiente : H20 destilada : 10 min ; ThinPrep -tinte nuclear : 5 min ; dH20 : 10 seg ; ThinPrep Enjuague Solución: 1 min; dH20 : 30 seg ; ThinPrep azulado Solución: 30 seg ; dH20 : 30 segundos , el 50 % de alcohol: 30 segundos , 95 % de alcohol : 30 seg ; ThinPrep Naranja G: 2 min , 95 % de alcohol : 15 segundos , 95 % de alcohol : 15 seg ; ThinPrep EA Solución: 4 min , 95 % de alcohol : 1 min , 95 % de alcohol : 1 min , 100 % de alcohol : 30 sec , 100% de alcohol : 30 sec: 100 % de alcohol : 30 seg ; xileno : 30 seg : xileno : 1 min ; xileno : 3 min . Placas de pocilios múltiples, se montaron con medio de montaje orgánico y leídos por un patólogo . Alternativamente , si se utilizan dispositivos de plástico en lugar de vidrio de múltiples pocilios , las etapas de deshidratación en 100 % de alcohol , y los pasos de compensación de xileno se omiten , y se sustituye con pasos de rehidratación , el uso de varios lavados en la disminución de la fuerza de alcohol seguido por un lavado con agua destilada , antes para montaje con medio de montaje acuoso.

Ejemplo 3: Teenología de Matriz de proteína de micro arreglo: La tecnología de matriz de proteína de microarreglo (MPAT) es un inmunoensayo múltiplex proteína matriz para el análisis simultáneo de múltiples muestras biológicas en las mismas condiciones.

El soporte sólido de una matriz de proteína de la matriz se compone de un número diferente de cámaras o compartimentos de diferentes tamaños, dependiendo del alcance de la investigación. En su formato más simple, la MPAT se compone de 96 cámaras. Las muestras biológicas se han manchado o impresos (ver más abajo) en una disposición de matriz dentro de cada compartimento en una membrana de nitrocelulosa. La misma matriz de muestras clínicas, incluyendo normal y enfermo, o la misma matriz de extractos de proteínas de diferentes líneas celulares de cáncer se imprime en cada cámara. Cada compartimento individual se recubre entonces con un anticuerpo distinto (policlonal, fragmento de anticuerpo monoclonal, Fab, monoespecí fíeos, de cadena sencilla, affibodies, o cualquier otra versión recombinante de anticuerpos convencionales o combinatoria), y se procesa para la detección de los complejos antigeno-anticuerpo.

Análisis de muestras de Proteínas: Proteína muestras analizadas por MPAT puede derivar de tejidos frescos y congelados, ya sea normal o enfermedad, incluso de los pacientes con cáncer, enfermedades benignas o inflamatorias, y los controles normales. Las muestras de proteína se pueden derivar a partir de cultivos de células, líneas celulares de cáncer, y los sobrenadantes celulares de cáncer, e incluso de tipos de células microdissected o de un compartimento subcelular dada. Las muestras de proteínas también pueden derivar de los sueros del paciente o cualquier otro fluido biológico del paciente, y preparado como se describe en los Ejemplos a continuación.

Impresión de los extractos de proteínas totales: Extractos de muestras de proteínas individuales o bien pueden ser depositados y manchado manualmente o impresos con un sistema robótico (Genomic Solutions Flexys, PBA Robótica, Reino Unido). Cantidades de proteina rutinaria iguales (250 ni de 1 mg / mi de una solución madre de proteínas de células cáncerosas) de cada muestra se imprimen en un formato de matriz de la membrana MPAT, por duplicado o triplicado, siempre que se considere apropriado La membrana se incuba a continuación durante 30 min en 2% de H202 (peróxido de hidrógeno) solución para inhibir la peroxidasa endógena presente en las muestras clínicas, se enjuagó dos veces en tampón Tris-solución salina (TNE: 10 Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de NaCl, 2,5 M EDTA) y después se bloquearon durante 30 minutos con una solución de 1% de leche seca no grasa en tampón Tris-solución salina que contiene 0,1% (w / v) de Tween 20 (TNET).

Anticuerpos: Posteriormente, cada cámara o cada matriz de muestras se cubrieron con un anticuerpo primario o combinación primaria de anticuerpos. Rutinariamente anticuerpos se diluyen apropiadamente en solución de bloqueo, seguido de 1 hora de incubación a temperatura ambiente con agitación constante. Solución de bloqueo es TNET que contiene 1% de leche en polvo sin grasa o soluciones de bloqueo equivalentes .

La detección de complejos antígeno-anticuerpo: La membrana se lavó 5 veces durante 5 min cada uno en TNET, a continuación, se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios para todos o alguno de los anticuerpos primarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Roche) diluido 1:10.000 en solución de bloqueo. La membrana es entonces más lavados 5 veces, como se describe anteriormente. La reactividad complejo antigeno-anticuerpo-anti-anticuerpo se midió por quimioluminiscencia, usando el SuperSignal West Dura Extended Duration Substrato (Pierce). La imagen se captura utilizando una cámara CCD (dispositivo de carga acoplada; UVP modelo bioquímicos, CCD cámara de grado 0, con cuarto oscuro diseñado para quimioluminiscencia, fluorescencia y visible).

Alternativamente, en lugar de un sistema de detección quimioluminiscente y basado en un sistema de adquisición de imagen basado en cámara CCD , un sistema basado en fluorescente se puede utilizar, por ejemplo, incorporando el uso de la Odisea sistema de adquisición de imágenes por infrarrojos Li-Cor . El protocolo MPAT se modifica entonces en consecuencia. Inhibición de la peroxidasa no es necesario . La membrana se aclaró dos veces en tampón Tris - solución salina , y luego bloqueada durante 30 minutos en solución de bloqueo Odysscy ( Li-Cor ) . Combinación de anticuerpo primario se diluye apropiadamente en solución de bloqueo Odyssey , seguido de 1 hora de incubación a TA . La membrana se lavó 5 veces durante 5 min cada uno en TNET a continuación, se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios marcados con un colorante fluoresecent ( IgG -IRDye 800CW ) diluido 1:10.000 en solución de bloqueo Odysscy . La membrana es entonces lavados 5 veces más , como se describe anteriormente . El complejo antígeno-anticuerpo -anti - anticuerpo se mide por detección de fluorescencia infrarroja directa . La intensidad de cada complejo se captura como una imagen mediante el escaneo de la membrana con Odyssey sistema de imagen de infrarrojos en el canal de 800 nm a 84 m de resolución . Protocolos basados en diferentes sistemas de detección y etiquetado , tales como fosfatasa alcalina , biotina - estreptavidina , y fluoróforos como se ha descrito también se puede realizar con éxito dentro del alcance de la presente invención .

Los siguientes controles internos pueden ser proporcionados de modo rutinario: i) la misma matriz de muestras se superpone con tampón en lugar de con el anticuerpo primario, seguido por el anticuerpo secundario, revelando de esta manera el fondo del anticuerpo secundario (sin control de anticuerpo), y ii) la misma matriz de muestras se superpone con suero pre-inmune o no secretor hibridoma o tampón de dilución, seguido de anticuerpo secundario, lo que revela la unión no especifica de inmunoglobulinas de ratón.

Examplo 4: Immunodeteccion de MJC441 celulas de cáncer cervical Líneas celulares de cáncer: se utilizaron las siguientes líneas celulares de cáncer de cuello uterino: CaSki (línea humana cervical carcinoma epidermoide de células, se sabe que contiene un genoma de HPV16 integrado en alrededor de 600 copias por célula, así como HPV18 secuencias relacionadas), ME-180 (cuello uterino humano línea celular de carcinoma, conocido por llevar el ADN del VPH, con mayor homología con HPV39 que a HPV18), SiHa (línea de células humanas de carcinoma de células escamosas del cuello uterino, dice que contiene integrada HPV16 genoma, en uno y cincuenta y nueve copias por célula) y C33 (línea cervical carcinoma humanos, células derivadas de la biopsia del cáncer de cuello uterino, negativo para ADN del VPH). HEL299 (fibroblastos de pulmón embrionario) y MRC5 (línea celular fetl de 14 semanas de edad) fueron utilizados como controles normales. Todas las líneas celulares se cultivaron en los medios de comunicación de acuerdo a las recomendaciones de ATCC.

Preparación de extractos de proteínas a partir de líneas celulares de cáncer: líneas celulares de cáncer (al redador de 107) se hacen crecer en cultivo según las recomendaciones de la ATCC, con 10% de suero de ternera fetal, 100 mg / mi de estreptomicina y penicilina hasta 80% de confluencia, se recogieron, se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en tampón de fosfato (pH 8,0) y se rompieron en el siguiente tampón: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, 1% de NP40, y una solución de vanadato 1 mM que contenia los siguientes inhibidores de proteasas: PMSF , aprotinina, leupeptina a l, 2 y 4 mM, respectivamente. El lisado celular se centrifugó durante 5 min a 14.000 rpm. La concentración de proteina de los extractos celulares de cáncer se determina usando un patrón de BSA del BCA (ácido bicinconínico) Juego de reactivos de ensayo de proteínas .(Pierce, Rockford, IL) utilizando una dilución 1:200 de extracto, y. Un lector de microplacas (Vmax, Molecular Device) se utiliza para leer la absorbancia a 570 nm. Se utiliza la solución madre de extractos de proteínas a 1 mg / mi.

Preparación de los sobrenadantes de cultivo de células: los sobrenadantes del cultivo de tejido (TCS) se centrifugó para eliminar los desechos celulares y los sobrenadantes se precipitó por adición lenta de 1-1,5 volúmenes de acetona enfriada con hielo. La precipitación se llevó a cabo en hielo o a -20 ° C durante 1 hora. Después de 15 min de centrifugación a 4 0 C utilizando rotores de pre-enfriados, los tubos se invierten para eliminar por completo los sobrenadantes. Los pellets se centrifugar rápidamente para eliminar por completo las últimas gotas del sobrenadante.

Finalmente gránulos se dejaron secar durante 5-10 min bajo el capó, y se resuspendieron en 2,5 mi de Tris 50 mM, pH 7. Las muestras se homogeneizaron con sonicador, siempre que sea necesario, y la concentración de proteínas se mide a través de un ensayo BCA (véase más arriba). Las muestras se diluyeron a 1 mg / mi de soluciones de trabajo.

Para preparar TCS sin suero fetal de ternera (FCS) para facilitar el análisis de las proteínas secretadas potencialmente por análisis de inmunodetección de líneas celulares de cáncer (por MPAT o Western blot), las células se cultivan hasta 70% de confluencia, se retiró el medio completo y se reemplaza con medio sin suero fetal de ternera (FCS) y se cultivaron durante 25 horas a 37 ° C. Sobrenadante de cultivo celular sin FCS se precipita entonces como arriba.

MPAT: extractos proteicos de las líneas celulares de cáncer y de los sobrenadantes de cultivo de células se impriman con robots en el MPAT por duplicado y se procesaron como se describe en el Ejemplo A utilizando el mAb de la presente invención.

Examplo 5: Tinción de células de cáncer cervicales en tejido de muestras de tejos cervical para inmuhistoquimica. Con el anticuerpo mAb MJC441 Para demostrar la especificidad de MJC441 y mAb MJC441, y su uso en aplicaciones de diagnóstico en la histología del cáncer de cuello uterino, laminillas con tejido o arreglo de te ido se presentan a donde se encuentra los tejidos de cáncer de cuello uterino y los tejidos de pacientes benignos, y los tejidos de controles normales (emparejado, es decir, del mismo paciente, o sin emparejar) se .puede utilizar de la siguiente manera.

Sección de 5-microns de tejido cervical humano fijados con for alina embebidos en parafina o microarrays de tejidos se desparafinan por cada laminilla en el horno a 60 ° C durante 30 min seguido por inmersión en tres baños de xileno durante 5 min cada uno. Los portaobjetos se rehidrataron por inmersión en dos baños de etanol 100% durante 5 min cada uno, y luego en etanol al 95%, 70% baños de etanol durante 3 min cada uno, y finalmente remojan en agua.

La peroxidasa endógena se bloqueó por tratamiento de laminilla con solución de peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 10 min a TA, a continuación, lavar dos veces en PBS durante 3 min cada uno. La recuperación del antigeno se obtiene por diapositivas de calefacción en una olla a presión con toda la presión durante 5 min en 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA pH 9, o en Tris-citrato de sodio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6. Los portaobjetos se enfriaron luego a la temperatura ambiente en el mismo tampón durante 10-20 min, se enjuagaron en agua del grifo durante 3 minutos, y último, se sumergieron en tampón Tris.

Para bloquear la biotina endógena, que puede ser un problema en algunos tejidos, los portaobjetos se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en una solución de estreptavidina en PBS (100 g / mi), se lavó con tampón Tris, seguido de incubación con una solución de biotina (500 mg / mi) en PBE (PBS con 1% de BSA, 1 mM de EDTA, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4) durante 30-60 min a TA, y se lavaron en PBS. La unión no especifica se bloqueó aún más mediante el tratamiento de los portaobjetos durante 15 min a RT en 3% de suero de caballo diluido en PBE.

Los portaobjetos se incubaron con mAb MJC441 como anticuerpo primario (ya sea sobrenadante del cultivo celular sin diluir, o 01:02- 1:20 apropiadamente diluida en tampón PBE) durante 30 min a 37 ° C, o 1 hora a TA o durante la noche a 4 ° C en una cámara de humedad, luego enjuagar 3 veces durante 5 minutos cada una en tampón Tris. Los portaobjetos se cubrieron con una dilución 1:1000 de anticuerpo secundario biotinilado en tampón PBE, y se incubaron durante 30 min a 37 ° C o 1 hora a TA, después se lavaron 3 veces durante 5 min cada uno en tampón Tris. Los portaobjetos se cubrieron después con una dilución 1:1000 de estreptavidina conjugada con peroxidasa diluida en PBE (sin azida), y se incubaron durante 30 min a 37 ° C o 1 hora a TA, después se lavaron 3 veces durante 5 min cada uno en tampón Tris.

Por último, unas pocas gotas de solución de sustrato AEC (1 mi de 4 mg / mi de solución madre de AEC en DMF, más 15 mi de 0,1 M de acetato de Na pH 5, y 15 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30%) se utilizan para cubrir las laminillas. La reacción se deja proseguir durante 10-40 min, luego se visualizaron bajo el microscopio, y se detuvo con agua normal siempre que sea apropiado. Los portaobjetos se enjuagaron en agua, y por contraste con unas pocas gotas de solución débil hematoxilina de Mayer durante 1-2 min. Los portaobjetos se sumergieron en una solución de bicarbonato de sodio al 0,1% hasta los núcleos se vuelven azules. Los portaobjetos se cubrieron con medio de montaje acuoso, colocados en un horno a 70 ° C y luego se deja secar durante 10-20 min o durante la noche a TA.

Examplo 6: inmunotincion de células del cuello cervical cancerosas y normales con mAb MJC441 Una mezcla de las células normales (MRC5 fibroblastos de embriones humanos) y las células de cáncer de cuello uterino lineas celulares CaSki o C33A, se mezclaron en una proporción de 1:1, y deje reposar durante la noche para que se pegan a 37 0 C en 15 pocilios diapositivas multiprueba. El dia siguiente, las células se enjuagaron con PBS, se fijaron en etanol al 95% y luego se permeabilizaron en Tritón 0,2% en PBS durante 5 min a TA. Para evitar la unión no específica, las células se incubaron con una solución de PBE (PBS con 1% de BSA, 1 raM EDTA, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4) antes de la adición de anticuerpo primario.

Las células se hacen reaccionar entonces con mAb MJC441 sin diluir durante 1 hora a 37 ° C seguido de incubación con biotina de cabra AffiniPure-SP-conjugado anti-IgG de ratón (H + L; 1 g / mi en PBS) como anticuerpo secundario. La inmunorreactividad se detectó por incubación con 40-50 mi de estreptavidina peroxidasa (1 mg / mi en PBS), seguido por tinción con sustrato DAB. Hematoxilina se utilizó para contrateñir los núcleos de células en azul.

Examplo 7: Inmunotincion de muestras cervicales de pacientes con mAb MJC441 o con coctail de anticuerpos monoclonales Muestras cervicales de pacientes en solución conservante (250 ml) se superponen en las áreas circulares del dispositivo de múltiples pocilios. Las células se fijaron con etanol al 95%, se secó al aire para asegurar la adherencia, y se enjuagó con PBS. Tenga en cuenta que las células deben ser tratados con H202 para inactivar la peroxidasa endógena, si se utiliza un sistema de detección a base de peroxidasa. Para bloquear las células endógenas biotina se incuban durante 30 min a temperatura ambiente en una solución de estreptavidina en PBE sin azida (100 mg / mi), seguido de un en uague PBST. Luego, las células se incubaron adicionalmente con una solución de biotina (500 mg / mi) en PBE (PBS con 1% de BSA, 1 mM EDTA, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4) seguido de tres lavados con PBST, a continuación, las células se centrifugan y el sobrenadante se desecha.

Las células se trataron a continuación para inmunotinción con el mAb MJC441 o cóctel de anticuerpos (sin diluir o diluido apropiadamente en PBS con 1% de BSA, 1 mM EDTA, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4), lo suficiente para cubrir las células. El anticuerpo primario o un cóctel anticuerpo primario se incubaron durante 1 hora a 37 ° C. Entonces, para la detección, una anticuerpo secundario IgG anti-ratón biotinilado (Jackson Lab.) diluido a 1 mg / mi en PBE se añade a, y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. El anticuerpo secundario es seguido por estreptavidina ligado a peroxidasa de rábano picante (Jackson Lab.) diluido a 1 mg / mi en PBE, y se incubó durante 15 min a TA.

La reacción se desarrolló mediante la adición de un sustrato de peroxidasa recién preparada, tales como AEC (sustrato 3-amino-9-etilcarbazol) seguido de incubación a TA. El desarrollo de color se examina bajo el microscopio y la reacción se detuvo con PBS que contenía 0,05% de azida.

Contratinción de hematoxilina se realiza para núcleos de las células de color en azul, y el dispositivo de múltiples pocilios se observa bajo el microscopio.

Ejemplo 8: La inmunotinción de la muestra cervical de paciente con un solo anticuerpo o un cóctel de anticuerpos utilizando un formato de tipo ELISA. Este ejemplo describe cómo inmunotinción se puede realizar utilizando comercialmente disponible y de uso común anticuerpos monoclonales, asi como nuevo marcador de anticuerpo de la presente invención, o cualquier otra combinación de los mismos. Este ejemplo demuestra por lo tanto aún más la utilidad de la inmunotinción como un complemento a la evaluación microscópica de la morfología celular en el cribado cervical. Además, el formato de tipo ELISA permite la cuantificación tinción.

En este ejemplo, el concepto de formato de dispositivo de múltiples pocilios se extiende al formato de ELISA de tipo comúnmente conocido, tal como una placa de 96 pocilios de fondo plano o equivalente.

Este ensayo implica células -adherentes o células en suspensión. Placas de 96 pocilios de cultivo de tejidos son preferiblemente tratada para la adhesión celular, a menos que el protocolo se utiliza en el modo de suspensión de células, tal como se describe a continuación. Tenga en cuenta que cuando se trata de células en suspensión, cada paso del procedimiento es seguido por una etapa de centrifugación suave para asegurarse de células se recogen en la parte inferior del pozo.

Por último, la reactividad de antígeno-anticuerpo se puede cuantificar mediante lectura colorimétrica, en lugar de por una lectura visual semi-cuantitativa basada en examen con microscopio.

En esta forma de realización, una alícuota (250 ml de volumen) de cada muestra de paciente de cuello uterino en solución conservante, tal como, pero no limitado a un Thin Prep, se deposita en cada pocilio de una placa de 96 pocilios. Las células cervicales son tratadas para inactivar la peroxidasa endógena con un volumen apropiado de solución de peróxido de hidrógeno al 1% diluida en PBS (200 ml / pocilio) durante 30 min a TA con agitación suave a 400 rpm. Después de la inactivación de peroxidasa, las células se lavan tres veces con PBS, se centrifugaron y el sobrenadante se desecha.

En este punto, las células se resuspendieron en etanol al 95% para un paso de fijación y secado al aire a temperatura ambiente para promover la adhesión celular al pozo. Alternativamente, las células se centrifugaron suavemente en cada paso, si se trata como células en suspensión.

Para bloquear las células endógenas biotina se incuban durante 30 min a temperatura ambiente en una solución de estreptavidina en PBE sin azida (100 mg / mi), seguido de un enjuague PBST. Luego, las células se incubaron adicionalmente con una solución de biotina (500 mg / mi) en PBE (PBS con 1% de BSA, 1 M EDTA, 1,5 mM de NaN3, pH 7,4) seguido de tres lavados con PBST, a continuación, las células se centrifugan y el sobrenadante se desecha. la placa está lista para inmunotinción tratamiento. Todos los pasos de incubación son 30 min largo y realizado a TA bajo agitación 400 rpm para el resto del procedimiento.

Las placas se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente, que puede ser o bien un único anticuerpo o un cóctel de anticuerpos, es decir, una combinación de anticuerpos, que pueden incluir disponibles comercialmente anticuerpos comúnmente utilizados, y / o anticuerpos contra los biomarcadores novedosos como se describe. A los efectos de esta forma de realización, el anti-pl6 (INK4a), Ki-67 y MJC441 se utilizan como anticuerpos primarios, añadió a las células (50 ml / pocilio de una dilución apropiada en tampón PBE) y se incubó durante 30 min a TA. Las células se lavan tres veces con PBST para eliminar el anticuerpo primario no unido (específicamente, los pozos se llenan con tampón, las placas se centrifugaron 10 min a 1500 rpm, y el sobrenadante se descarta) Un anticuerpo secundario conjugado con biotina (para el propósito de la invención, un anticuerpo de cabra anti IgG de ratón conjugado en biotina) se añade a continuación a cada pocilio (50 ml de una solución de lpg/ml el anticuerpo secundario biotinilado en tampón PBE) y las células se incubaron como se ha descrito anteriormente (30 min, RT, 400 rpm). Las células se lavan tres veces con PBST para eliminar el exceso de anticuerpo secundario como se describe anteriormente. Las células se centrifugaron durante 10 min a 1500 rpm, y el sobrenadante se aspiró cuidadosamente, preferiblemente con vacio.

Estreptavidina conjugada con peroxidasa se añade a cada pocilio (50 ml de una dilución lpg/ml en tampón PBE sin azida) y las células se incuban 15 min a TA con agitación 400 rpm, como se describió anteriormente. Después de un lavado con PBST y dos lavados con PBS, los complejos antigeno-anticuerpo se visualizan mediante la adición de 50 m? de solución de sustrato TMB a cada pocilio, seguido de incubación durante 10-40 minutos a temperatura ambiente y agitando 400 rpm. El color azul aparecerá en 10 minutos con fuerza variable sobre la base de la cantidad de células por pocilio y sobre la concentración de antigeno. La reacción se detiene mediante la cumplimentación pozos con H2S04, girando la solución de azul a un color amarillo que se lee a 450 nm. La inmunorreactividad se anotó utilizando un lector de placas ELISA colorimétrico. Alternativamente, después de un giro rápido, el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a una placa fresca y lectura inmunorreactividad.

Para propósitos de cuantificación, controles deben incluirse tales como células de una muestra cervical normal con el anticuerpo primario, y las células de cada muestra de paciente con y sin el anticuerpo primario, número equivalente de células, etc

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES

1 . Un sistema de alto rendimiento de procesamiento de muestras de los pacientes para la detección del cáncer cervical que comprende: una pluralidad de muestras cervicales de pacientes conservadas en solución , en el que la pluralidad de muestras de pacientes individuales que contienen las células cervicales se depositan en pocilios individuales de un dispositivo de múltiples pocilios, a donde un pocilio contiene las muestras de células del cuello uterino de una sola paciente en el dispositivo de múltiples pocilios, y a donde las células del cuello uterino se mantienen en una solución conservante de citología líquida; aparatos y reactivos para la tinción citológica de la pluralidad de muestras de los pacientes mediante la exposición de forma simultánea la pluralidad de pozos individuales del dispositivo de múltiples pocilios a una mancha citológico; una combinación de anticuerpos específicamente reactivos con cáncer de cuello uterino marcadores inmunológicamente hacen reaccionan con la muestra del paciente; aparato para examinar microscópicamente las células del cuello uterino citológicamente manchadas y reaccionado inmunológicamente para determinar la presencia o ausencia de células anormales

2 . El sistema de la reivindicación 1 , en el que la tinción de hematoxilina citológico o es tinción de Papanicolau .

3 . El sistema de la reivindicación 1, en donde , el sistema comprende además un aparato automatizado para la tinción ci.tológica .

4 . El sistema de la reivindicación 1 , que comprende además medios electrónicos para hacer coincidir la muestra del paciente con una identificación del paciente .

5 . El sistema de la reivindicación 1 , en el que la combinación de anticuerpos incluye anti-pl6 , anti-Ki - 67 anticuerpos monoclonales, anticuerpos anti - MJC441 o combinaciones de los mismos .

6 . Un método in vitro para alta rendimiento de procesamiento de las muestras de paciente, que comprende : asegurar muestras de paciente conservadas que tienen cada una codificado de identificación y exploración al paciente ; depositar una pluralidad de muestras de pacientes en un dispositivo de múltiples pocilios , en el que una célula individual del dispositivo de múltiples pocilios se identifica con una sola muestra del paciente ; que expresa simultáneamente las muestras de pacientes con citológica para identificar células anormales en las muestras de pacientes ; inmunológicamente reaccionar cada muestra de paciente con una pluralidad de anticuerpos ; y examinando microscópicamente las muestras de los pacientes para la presencia o ausencia de células anormales .

7 . El método de la reivindicación 6 , en el que la etapa de exponer las muestras de los pacientes o manchas citológicas comprende exponer las células en la muestra de hematoxilina o mancha de Papanicolau .

8 . El método de la reivindicación 6 , en el que el método se compone además de la manipulación automatizada del dispositivo de múltiples pocilios durante la tinción citológica , reacciones inmunológicas , o examen microscópico

9 . El método de la reivindicación 6 , que comprende además la introducción de información codificada de paciente en una base de datos y hacer coincidir electrónicamente resultados del examen microscópico de una identificación del paciente .

10 . El método de la reivindicación 6 , en el que la reacción inmunológica se compone de la exposición de las muestras de los pacientes a una combinación de anticuerpos que comprende anti- MJC441 , anti - pl6 , o anti - Ki - 67 y combinaciones de los mismos .

11 . El método de la reivindicación 10 que comprende además la etapa de hacer reaccionar un anticuerpo secundario con cualquiera de anti- pl6 , anti - Ki - 67 , o anti - MJC - 44 . RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención describe un nuevo dispositivo y los in vitro métodos de aplicación de los mismos con utilidad en la detección de alto rendimiento , detección y tratamiento de la enfermedad de la enfermedadespecialmente las infermidades ginecológicas y cervicales . El dispositivo de " multipocillo " de la presente invención consiste en un soporte sólido con múltiples áreas bien separadas , cada una acomodar una muestra de paciente , lo que lleva a la evaluación simultánea de muestras de pacientes . Los métodos de la presente invención comprenden tinción citológica convencional f tinción de Papanicolaou del cuello uterino , y la tinción inmunoquimica usando anticuerpos o combinación de anticuerpos que son capaces de unirse a los biomarcadores que se sobreexpresan en el cáncer incluyendo en el carcinoma de cuello uterino y displasia , en comparación con los controles normales . El dispositivo y los métodos de la presente invención se pueden practicar en cualquiera de los modos manual o automatizado , y se aplican a cualquier fluido biológico o suspensión de células de cualquier muestra biológica en vista de una variedad de ensayos de biología celular , y en vista de la detección y de detección de cuello uterino y otras enfermedades . La Presente Invención describen Un Nuevo Dispositivo y los Métodos de Aplicación De Los Mismos con Utilidad en la detección de Alto Rendimiento , detección y Tratamiento de la enfermedad de la Enfermedad cervical. El Dispositivo de " multipocillo " de la Presente Invención consiste en la ONU Soporte Sólido con Múltiples áreas bien separadas , Cada Una acomodar Una Muestra de Paciente , Lo Que lleva a la evaluation Simultánea de Muestras de Pacientes . Los Métodos de la Presente Invención