CN102406936A - 一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂。本发明制备的佐剂用作鸡传染性鼻炎灭活疫苗的佐剂制成鸡传染性鼻炎灭活疫苗，可使接种鸡只后产生的抗体效价高，抗体保护期长，攻毒保护率高等优点。

Description

一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂，属于生物学领域，特别是兽用生物制品领域。

背景技术

目前市场流行的鼻炎灭活疫苗主要有两种类型，包括油佐剂和铝胶佐剂疫苗。油乳剂灭活疫苗抗体持续时间较长，但是存在不同程度的副反应。铝胶佐剂灭活疫苗不存在副反应现象，但是抗体效价低，持续时间短。

本发明所述的新型佐剂制备而成的鸡传染性鼻炎灭活疫苗，具有安全性高、无副反应、抗体产生快以及保护率高等优势，不但适用于鸡群常规免疫，有效预防疫病的发生，并且适用于发病鸡群的紧急接种，对控制本病和防止复发有较好的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的佐剂，特别是提供适用于鸡传染性鼻炎灭活疫苗的佐剂，将其用于鸡传染性鼻炎灭活疫苗的生产过程中，使生产的鸡传染性鼻炎灭活疫苗具有安全性高、无副反应、抗体产生快以及保护率高等优势，既适合于正常预防也适合于发病时的紧急接种，对控制本病和防止复发有较好的作用。

具体实施方式

本发明所述的新的佐剂是由卡波姆、钾盐、钠盐以及去离子水配制而成。

本发明所述的新的佐剂用于鸡传染性鼻炎灭活疫苗的生产过程中，替代传统佐剂，可使生产的鸡传染性鼻炎灭活疫苗具有安全性高、无副反应、抗体产生快以及保护率高等优势，既适合于正常预防也适合于发病时的紧急接种。

一、本发明的佐剂

本发明的新型佐剂，其中卡波姆是含有聚烯基聚醚交联的丙烯酸聚合物，很低的用量下(常规用量0.25％～0.5％)就能产生高效的增稠作用，常规用量在0.2％～0.4％，能替代3％～7％的常规乳化剂，可将鸡传染性鼻炎抗原包裹吸附住，接种后，在鸡只体内能缓慢释放，可使抗体效价高，持续期长。Na₂HPO₄和KH₂PO₄可以调节pH，起到缓冲液的作用。NaCl和KCl的主要作用是保持一定的离子浓度，以维持活性。

本发明所述的新的佐剂的配制：

NaCl  5～10g  (无色立方结晶或白色结晶，上海国药)，

Na₂HPO₄ 1.5～2g  (白色粉末，上海国药)，

KCl 0.1～0.5g  (无色立方晶体，常为长柱状，上海国药)，

KH₂PO₄ 0.1～0.5g  (为无色结晶或白色颗粒状粉末，上海国药)，

卡波姆 3～7g(白色疏松状粉末，北京国人逸康科技有限公司)，

去离子水1000ml，溶解后经121℃高压30min灭菌后备用。常温保存，不超过15天。

二、疫苗制造

1.疫苗生产检验用菌种

制造及检验用菌种为副鸡嗜血杆菌A型C-Hpg-8株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

2.疫苗制造

(1)生产用种子制备

1)一级种子繁殖与鉴定 取菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在含5％～10％CO₂环境中37℃培养16～18小时后，挑选数个荧光性强的典型菌苔(菌落)接种于5日龄鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液，经纯检合格后，作为-级种子。在-20℃以下保存，应不超过1个月，否则要再通过鸡胚复壮，但不应超过6代。

2)二级种子繁殖 取感染的鸡胚卵黄液，划线接种鸡肉汤琼脂乎板，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18小时，选荧光性强的典型菌苔(菌落)接种于鸡肉汤培养基中，置37℃培养16～20小时，经纯检合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，不得超过6～8小时。

(2)制苗用培养基 为半合成培养基，制造方法见附注4。

(3)制苗菌液的制备

1)菌液培养 将100ml种子液加入4000ml半合成培养基中，在37℃培养18～20小时，其间接振培养瓶二次，经纯捡确认无杂菌污染，加入0.05％甲醛溶液，置2～8℃保存。

2)制苗菌液的浓缩与灭活 用中空纤维超滤器将纯检合格的菌液浓缩，然后再用pH7.2的PBS制成悬浮液，使每1ml至少含50亿菌体(用生物制品国家标准品“中国细菌浊度标准”进行比较，设标准管含副鸡嗜血杆菌为28亿/ml)，再按体积比加入0.15％甲醛溶液和0.01％的硫柳汞，在2～8℃灭菌7日，经检验无菌生长作为制苗抗原。

(4)佐剂的配制

本发明所述的新的佐剂的配制：

NaCl 5～10g，Na₂HPO₄ 1.5～2g，KCl 0.1～0.5g，KH₂PO₄ 0.1～0.5g，卡波姆3～7g，去离子水1000ml，溶解后经121℃高压30min灭菌后备用。

(5)配苗

将浓缩鼻炎菌液用灭菌PBS(0.1mol/L，pH 7.0～7.2)稀释一定比例后与新型佐剂按4∶1比例进行混合并搅拌摇匀，保证每1ml疫苗中含有10亿菌数(用生物制品国家标准品“中国细菌浊度标准”进行比较判定)。

三、疫苗检验：

1.无菌检验 按《规程》进行，无菌生长。

2.安全检验 用2～3月龄的健康易感鸡8只，每只皮下注射疫苗1ml，观察14日，应无异常反应。

3.效力检验 用2～3月龄的健康易感鸡8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1个月后，连同条件相同的对照鸡4只，各眶下窦内注射C-Hp8-8菌株鸡肉汤16小时培养物0.2ml(50～100万活菌)，观察14日，对照鸡全部发病(面部出现一侧或两例眶下窦及周围肿胀并有流鼻涕或兼有流泪者)，免疫鸡至少保护6只，或对照鸡3只发病，免疫鸡至少保护7只为合格。

4.甲醛、硫柳汞含量测定 分别按《中国兽药典》规定方法进行，应符合《制品检验的有关规定》≤0.4％。

本发明的积极意义

本发明涉及的一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂。本发明制备的佐剂用作鸡传染性鼻炎灭活疫苗的佐剂制成鸡传染性鼻炎灭活疫苗，可使接种鸡只后产生的抗体效价高，抗体保护期长，攻毒保护率高等优点。

实施例1

1 菌种

制造及检验用菌种为副鸡嗜血杆菌A型C-Hpg-8株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

2 疫苗制造

(1)生产用种子制备

1)一级种子繁殖与鉴定 取菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在含5％～10％CO₂环境中37℃培养16～18小时后，挑选数个荧光性强的典型菌苔(菌落)接种于5日龄鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液，经纯检合格后，作为-级种子。在-20℃以下保存，应不超过1个月，否则要再通过鸡胚复壮，但不应超过6代。

2)二级种子繁殖 取感染的鸡胚卵黄液，划线接种鸡肉汤琼脂乎板，在含5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18小时，选荧光性强的典型菌苔(菌落)接种于鸡肉汤培养基中，置37℃培养16～20小时，经纯检合格后，即为二级种子。在2～8℃保存，不得超过6～8小时。

(2)制苗用培养基 为半合成培养基，制造方法见附注4。

(3)制苗菌液的制备

1)菌液培养 将100ml种子液加入4000ml半合成培养基中，在37℃培养18～20小时，其间接振培养瓶二次，经纯捡确认无杂菌污染，加入0.05％甲醛溶液，置2～8℃保存。

2)制苗菌液的浓缩与灭活 用中空纤维超滤器将纯检合格的菌液浓缩，然后再用pH7.2的PBS制成悬浮液，使每1ml至少含50亿菌体(用生物制品国家标准品“中国细菌浊度标准”进行比较，设标准管含副鸡嗜血杆菌为28亿/ml)，再按体积比加入0.15％甲醛溶液和0.01％的硫柳汞，在2～8℃灭菌7日，经检验无菌生长作为制苗抗原(参见《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》)。

(4)佐剂的配制：

NaCl  5～10g  (无色立方结晶或白色结晶，上海国药)，

Na₂HPO₄ 1.5～2g  (白色粉末，上海国药)，

KCl 0.1～0.5g  (无色立方晶体，常为长柱状，上海国药)，

KH₂PO₄ 0.1～0.5g  (为无色结晶或白色颗粒状粉末，上海国药)，

卡波姆 3～7g(白色疏松状粉末，北京国人逸康科技有限公司)，

去离子水1000ml，溶解后经121℃高压30min灭菌后备用。

(5)配苗

将浓缩鼻炎菌液用灭菌PBS(0.1mol/L，pH 7.0～7.2)稀释一定比例后与新型佐剂按4∶1比例进行混合并搅拌摇匀，保证每1ml疫苗中含有10亿菌数(用生物制品国家标准品“中国细菌浊度标准”进行比较判定)。

实施例2

按照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2000，本发明以下简称《规程》)上的检验方法对疫苗进行检验。

1.无菌检验 按《规程》进行，无菌生长。

2.安全检验 用2～3月龄的健康易感鸡8只，每只皮下注射疫苗1ml，观察14日，应无异常反应。

3.效力检验 用2～3月龄的健康易感鸡8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1个月后，连同条件相同的对照鸡4只，各眶下窦内注射C-Hp8-8菌株鸡肉汤16小时培养物0.2ml(50～100万活菌)，观察14日，对照鸡全部发病(面部出现一侧或两例眶下窦及周围肿胀并有流鼻涕或兼有流泪者)，免疫鸡至少保护6只，或对照鸡3只发病，免疫鸡至少保护7只为合格。

4.甲醛、硫柳汞含量测定 分别按《中国兽药典》规定方法进行，应符合《制品检验的有关规定》≤0.4％。

实施例3

1.疫苗安全性测定

本疫苗经颈部皮下和胸部肌肉途径接种2～3月龄的健康易感鸡8只，每只皮下注射疫苗1ml，观察14日，试验鸡饮食和健康状况无异常反应，处死后注射部位解剖，无肉芽增生等副反应。

2.免疫鸡血清抗体的检测

疫苗经翅根肌肉免疫63日龄SPF鸡，0.5ml/只，共8只，分别在免疫后不同时间段采血分离血清，用Hpg-8株检测抗原检测血清抗体，以抗原抗体50％出现凝集反应的血清最大稀释倍数定为血清的抗体效价。

表1 疫苗免疫后免疫鸡血清抗体的检测结果

(表格中数据是以血清稀释倍数表示抗体价)。

从试验鸡免疫后抗体消长规律来看，免疫后11d即能产生保护性抗体，在31～40d期间抗体效价达到顶峰，从40d以后抗体开始逐步下降，至90d出现抗体价低于4现象，按照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗规程》推断其保护期可达到3个月。

3.疫苗一次免疫的免疫持续期的测定

本疫苗经胸部肌肉或腿部肌肉途径接种60日龄的健康易感鸡40只，每只注射疫苗0.5ml，设立对照20只，分别在免疫后30d、60d、90d、120d和150d随机取免疫组8只和4只对照，利用C-Hpg-8冻干菌株350倍稀释后经眶下窦接种0.2ml/只，攻毒结果如下：

表2 疫苗一次免疫的免疫持续期的测定

根据攻毒试验结果，本疫苗免疫后90d内保护率达到《鸡传染性鼻炎灭活疫苗规程》标准，对照组4/4明显发病。

通过对以上试验结果得出结论：本发明所述的新型佐剂制备的鸡传染性鼻炎灭活疫苗疫苗，具有安全性高、无副反应、抗体产生快以及保护率高等优势

附注：

1 鸡肉汁

取鸡胸脯肉泥1份加蒸馏水2份，在2～8℃浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤。

2 鸡肉汤培养基

鸡肉汁                                                            100ml

酪蛋白陈                                                          1g

氯化钠                                                            0.5g

调pH至7.2，115℃灭菌30分钟，用前加入过滤除菌的新鲜酵母浸出液20ml，灭活的健康鸡血清10ml，作种子培养。

3 鸡肉汤琼脂

在鸡肉汤中加入1.5％琼脂粉热溶即成。但要在倒平板前(50～60℃时)加入0.05％辅酶I(NADH)和10％过滤除菌的健康鸡血清。

4 半合成培养基

以氢氧化钠溶液(2mol/L)调pH至7.2～7.4，115℃灭菌40分钟。临用前加入灭活的健康鸡血清(滤过除菌)30～60ml和0.5％辅酶I(NADH)水溶液8～10ml。

Claims (2)

1.一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂，其特征在于制备方法为：

取NaCl 5～10g，Na₂HPO₄ 1.5～2g，KCl 0.1～0.5g，KH₂PO₄ 0.1～0.5g，卡波姆3～7g，溶于去离子水1000ml中，溶解后经121℃高压30min灭菌后备用。

2.如权利要求1所述一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂的应用，其特征在于将浓缩鼻炎菌液用灭菌PBS稀释一定比例后与该鸡传染性鼻炎灭活疫苗佐剂按4∶1比例进行混合并搅拌摇匀制备而成鸡传染性鼻炎灭活疫苗。