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CN105816868A - 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗 - Google Patents

一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗 Download PDF

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CN105816868A CN201610160877.6A CN201610160877A CN105816868A CN 105816868 A CN105816868 A CN 105816868A CN 201610160877 A CN201610160877 A CN 201610160877A CN 105816868 A CN105816868 A CN 105816868A
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Abstract

本发明的鸡滑液囊支原体灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的YBF‑MS1株，已保藏于位于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年3月3日，保藏号为：CCTCC M 2016080。本发明的疫苗能够产生较高水平的抗体，持续期长，有交叉保护性，免疫后鸡滑液囊支原体的发病率明显减少，能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市，用本发明的鸡滑液囊支原体YBF‑MS1株制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗是防控该病的关键，同时也能弥补市场空缺。

Description

一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)又称鸡传染性滑膜炎，是由鸡滑液囊支原体引起鸡和火鸡等的一种急性或慢性传染病。鸡传染性滑膜炎是Olson等(1964)首先报道的。本病以侵害关节滑液，腱鞘膜为主，其特征为关节、腱鞘和足掌肿胀等。鸡群感染该病可导致明显的跛行、生长发育迟缓及胴体降级等，本病可垂直传播，导致种鸡发病期间所产种蛋孵出的雏鸡发病。鸡滑液囊支原体感染已遍及全球，呈世界性分布，主要侵害商品肉鸡、蛋鸡和种鸡，本病一年四季均可发生，但以冬春季节易发。鸡滑液囊支原体感染一般多见于4～16周龄的鸡，发病率一般为5％～15％，死亡率约为1％～10％。由于本病发展缓慢，病程长，一旦在鸡群中感染，根除很困难，因此在鸡群中长期蔓延，导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增高、产蛋量下降等。鸡群如存在该病原时，易发生混合感染，加剧病情，死亡率增高，造成严重的经济损失。鸡滑液囊支原体在禽支原体的血清分类中为S型，滑液囊支原体只有1个血清型，经DNA-DNA杂交试验表明，不同的菌株之间几乎没有差异。目前临床上预防鸡滑液囊支原体感染主要是适当药物投放，对于预防本病起到一定作用，但对于已经出现了典型的临床症状的，应用药物的作用并不明显，不但存在药物残留影响食品安全的风险，而且也不能根除鸡体内的鸡滑液囊支原体，很容易产生耐药性，给该病的控制增加了难度。由于该病能够垂直传播，一旦发病，其种蛋就不宜使用。疫苗免疫接种是控制鸡滑液囊支原体病的更有效的预防措施。因此，筛选毒力强、免疫原性好的鸡滑液囊支原体菌株，并制备疫苗就显得尤为重要。目前国外已有商品化疫苗；国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，用于鸡滑液囊支原体病的免疫预防。
本发明的鸡滑液囊支原体灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株(MycoplasmasynoviaeYBF-MS1)，已保藏于位于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年3月3日，保藏号为：CCTCCNO:M2016080。
其中YBF-MS1株的灭活采用甲醛灭活；
本发明的疫苗，其制备方法如下：
1)按照培养瓶容积60％～80％加入鸡滑液囊支原体液体培养基，pH值为7.6～7.8、种子接种量为10％、培养温度为37℃、振荡速度为90～100r/min、培养24～30小时收获菌液置2～8℃保存；
2)用连续流离心的方法将培养物作浓缩至每毫升活菌含量不低于5×109CCU，浓缩后立即灭活；
3)菌液灭活：
将浓缩后的菌液无菌导入灭活罐内，按照浓缩菌液数量，计量加入10％甲醛溶液，开动搅拌电机慢速搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0.2％；37℃搅拌灭活12～16小时，灭活后的菌液置2～8℃保存；
4)油相制备：取注射用白油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-805份，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后备用；
水相制备：将灭活检验合格的浓缩菌液，加入终浓度为5％吐温-80，充分混匀即为水相；
乳化：取油相3份加入适当的无菌容器中，开动剪切机10000r/min搅拌10分钟，然后缓缓加入水相2份，再以15000r/min搅拌5分钟完成制备。
本发明的疫苗能够产生较高水平的抗体，持续期长，有交叉保护性，免疫后鸡滑液囊支原体的发病率明显减少，能够有效预防鸡滑液囊支原体的流行。国内尚无鸡滑液囊支原体疫苗上市，用本发明的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗是防控该病的关键，同时也能弥补市场空缺。
具体实施方式
本发明所用的培养基及其制备方法如下：
1.1液体培养基制备：
1.1.1基础液配制取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存。
1.1.2培养基配制基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25％酵母浸出液200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1％辅酶I溶液30ml、1％L-半胱氨酸溶液30ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
1.2固体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、琼脂粉15.0g，去离子水加至1000ml，上述成分混合后加热溶解，定量分装，以116℃灭菌30分钟后，置2～8℃保存。使用前将100ml固体培养基加热溶解，当温度降到60℃左右时，添加灭活马血清20.0ml、25％酵母浸出液20ml、1％辅酶I溶液3.0ml、1％L-半胱氨酸溶液3.0ml、8万单位/ml青霉素1.2ml。用1mol/L的氢氧化钠溶液调培养基pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
下面结合具体实施案例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1、菌株的筛选
1鸡滑液囊支原体生产用培养基
1.1改良CM液体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25％酵母浸出液200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1％辅酶I溶液30ml、1％L‐半胱氨酸溶液30ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
1.2改良CM固体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、琼脂粉15.0g去离子水加至1000ml，上述成分混合后加热溶解，定量分装，以116℃灭菌30分钟后，置2～8℃保存。使用前将100ml固体培养基加热溶解，当温度降到60℃左右时，添加灭活马血清20.0ml、25％酵母浸出液20ml、1％辅酶I溶液3.0ml、1％L‐半胱氨酸溶液3.0ml、8万单位/ml青霉素1.2ml。用1mol/L的氢氧化钠溶液调培养基pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
2鸡滑液囊支原体分离、鉴定
2.1病原菌分离：
2015年3月份，在青岛一养鸡场，已注射了鸡滑液囊支原体疫苗的鸡群中发生了典型的传染性滑膜炎症状。从发病鸡上取肿胀跗关节、足掌及龙骨囊肿内容物，接种于改良CM液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养24～48小时，待接种后的液体培养基的颜色由猩红变成橘黄时收获，传代，取第2代(F2代)菌液进行鉴定。
2.2病原菌鉴定
2.2.1形态观察鸡滑液囊支原体分离株(命名为：YBF‐MS1株)经吉姆萨染色，菌体形态为多形态的球状菌。
2.2.2生化特性鸡滑液囊支原体分离株YBF‐MS1株能发酵葡萄糖及麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖，不能分解精氨酸；细菌L型鉴定均为阴性；可凝集鸡的红细胞。
2.2.3培养特性鸡滑液囊支原体分离株YBF‐MS1株在含有辅酶I的改良CM液体培养基中生长良好，培养24～30小时，呈轻度浑浊生长，培养基颜色由猩红变成橘黄(培养基pH值下降0.7及以上)；接种含有辅酶I的改良CM固体培养基上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养3～5日，在低倍镜下可见圆形、隆起，表面光滑的菌落，典型菌落呈“煎蛋状”。本菌在不含有辅酶I的培养基中不生长。
2.2.4纯粹检验鸡滑液囊支原体分离株YBF‐MS1株按2010年版《中国兽药典》附录进行检验，结果纯粹。
2.2.5特异性
2.2.5.1代谢抵制试验在加有鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株菌液的改良CM液体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清，出现了特异性代谢抑制作用，培养基颜色未发生变化。
2.2.5.2生长抑制试验加有鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株菌液的改良CM固体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清，出现了特异性代谢抑制作用，培养基未见支原体菌落生长。
2.2.5分子生物学鉴定用鸡滑液囊支原体特异性引物进行PCR扩增，结果YBF‐MS1株能扩增出约595bp的特异性片段。
鸡滑液囊支原体分离YBF‐MS1株通过以上各项鉴定结果表明，均符合鸡滑液囊支原体特性。
2.3鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株VlhA基因序列测定与分析
2.3.1引物设计根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因，比对后针对保守区设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成。该引物扩增片段大小为595bp，引物序列如下所示：
FvolA：CATTGCTCCTGCTGGTATAG
RvolA：TTGGAAGTCAAGTCCTGGTT
2.3.2DNA模板的制备取YBF‐MS1株培养物5.0ml，12000r/min离心15min，弃上清，沉淀用1.0ml双蒸水重悬，100℃水浴10min后，12000r/min离心15min收集上清，即为PCR模板，‐20℃保存备用。
2.3.3PCR扩增及测序PCR扩增体系为：10×PCRBuffer2.5μl，dNTPs1.0μl，引物F0.5μl，引物R0.5μl，模板DNA5.0μl，Taq酶0.25μl，双蒸水15.25μl。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸5min。取10μlPCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳鉴定，同时以标准株作为阳性对照，结果出现了与标准参考株WVU1853株相同的约595bp的特异性条带，说明该分离株为鸡滑液囊支原体。
2.3.4测序与分析根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因序列，针对保守区设计了一对引物，并进行扩增，经测序扩增出约为595bp大小的VlhA基因片段；该发明菌株与其它不同地方的分离菌株的同源性仅为95％。
2.4毒力试验将活菌量约为106CCU/ml鸡滑液囊支体YBF‐MS1株菌液，爪垫注射49日龄SPF鸡10只，0.2ml/只；另设10只作对照，爪垫注射培养基，0.2ml/只。攻毒后按常规饲养，观察14日，记录试验鸡发病情况。
攻毒结果表明，发病鸡的临床症状主要为攻毒爪不敢着地或跛行；典型症状为足掌部、趾关节肿胀；个别发病鸡出现跗关节肿胀，精神不振、羽毛粗乱；所有攻毒鸡均未出现呼吸道症状。发病鸡趾关节和足掌部剖检可见肉芽增生组织、脓性粘液或纤维素性干酪物，跗关节肿胀部位剖检可见灰白色脓性粘液或纤维素性干酪样物质，剖检所有攻毒鸡气囊、气管、肺脏等器官均未见异常(表1)。
表1：毒力试验结果
2.5免疫原性的测定将鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株灭活检验合格的浓缩菌液(灭活前活菌量约为5×109CCU/ml)，加入5％吐温‐80制备水相，按照2:3比例与油相混合乳化，制备灭活疫苗。分别以0.1ml、0.25ml、0.5ml颈部皮下注射21日龄SPF鸡各10只，另设不免疫对照10只。免疫后28日，各组试验鸡均用活菌量约为106CCU/ml的YBF‐MS1株菌液爪垫注射攻毒，每只0.2ml。观察14日内试验鸡发病情况。试验结果表明，以0.1ml免疫21日龄SPF鸡，免后28日试验鸡的保护率为4/10；以0.25ml和0.5ml免疫21日龄SPF鸡，免后28日试验鸡的保护率为8/10和9/10；对照鸡8/10发病。由表2结果可见，鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株的最小免疫保护剂量为0.25ml。
表2：免疫原性试验结果
实施例2：鸡滑液囊支原体灭活疫苗生产方法
1材料
1.1菌种制备疫苗用的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株。
1.2培养基改良CM液体培养基由青岛易邦生物工程有限公司提供。
1.3检测试剂平板凝集抗原、阳性血清以及阴性血清均由青岛易邦生物工程有限公司提供。
1.4SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.5剪切机T25型，德国IKA公司生产。
1.6高速冷冻连续流离心机GR22GIII型，购自日本日立公司。
2方法
2.1生产用种子的制备
2.1.1一级种子繁殖将鸡滑液囊支原体YBF-MS1株E3、E7、E12代冻干种子分别用改良CM液体培养基复原，按10％将种子液分别接种于改良CM液体培养基中，置37℃，150r/min振荡培养，观察培养基颜色变化，待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养，收获，记录实际培养时间。定量分装，注明菌株名称、装量、日期，经纯粹检验合格后，作为一级种子。-15℃以下保存备用。
2.1.2二级种子繁殖取一级种子液按10％接种改良CM液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养，观察培养基颜色变化，待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养，收获，记录实际培养时间，经镜检合格后，作为二级种子，置2～8℃保存备用。
2.1.3三级种子繁殖取二级种子液按10％接种改良CM液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养，观察培养基颜色变化，待培养基颜色由猩红变成橘黄停止培养，收获，记录实际培养时间，经镜检合格后，作为三级种子，置2～8℃保存备用。
2.2制苗用培养基改良CM液体培养基由本课题组制备。
2.3制苗用菌液制备
2.3.1菌液培养采用万瓶培养YBF-MS1株。按万瓶容积60％～80％加入pH值7.6～7.8改良CM液体培养基，按10％加入YBF-MS1株的三级种子液进行培养，培养温度为37℃，振荡速度为90～100r/min，培养基颜色由猩红变成橘黄收获菌液，记录实际培养时间，取样进行半成品检验。
2.3.2菌液浓缩用连续流离心的方法将菌液作5倍浓缩，浓缩后立即灭活。
2.3.3菌液灭活将浓缩菌液无菌导入灭活瓶内，按照浓缩菌液数量，计量加入10％的甲醛溶液，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0.2％，37℃振摇灭活12～16小时(以瓶内温度达到37℃开始计时)，灭活后的菌液置2～8℃保存备用。
2.4半成品检验
2.4.1活菌计数(CCU/ml)将培养好的YBF-MS1株菌液用改良CM液体培养基以10倍系列稀释至1010，再将109以2×109、4×109、8×109倍释释，分别将活菌计数试管置37℃，150r/min振荡培养，观察7日(以培养基颜色由猩红变色到橘黄的最终管作为活菌的最高浓度)。
2.4.2纯粹检验按2010年版《中国兽药典》附录进行检验。
2.4.3灭活检验按2010年版《中国兽药典》附录进行检验。
2.5疫苗制备
2.5.1油相制备取注射用白油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-805份，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后备用。
2.5.2水相制备将灭活检验合格的浓缩菌液，加入终浓度为5％吐温-80，充分混匀即为水相。
2.5.3乳化取油相3份加入适当的无菌容器中，开动剪切机10000r/min搅拌10分钟，然后缓缓加入水相2份，再以15000r/min搅拌5分钟。
2.5.4分装定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
2.6成品检验
2.6.1性状
2.6.1.1外观分别吸取每批疫苗各5ml放一清洁玻璃管中，仔细观察疫苗的颜色、有无杂质等。
2.6.1.2剂型分别取清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水表面，观察扩散情况。
2.6.1.3稳定性分别吸取每批疫苗各10ml加入离心管中，3000r/min离心15分钟，观察管底析出水相的量。
2.6.1.4黏度分别按2010年版《中国兽药典》附录进行测定。
2.6.2装量检查分别按2010年版《中国兽药典》附录进行检验。
2.6.3无菌检验分别按2010年版《中国兽药典》附录进行检验。
2.6.4安全检验取21日龄SPF鸡各30只，随机分为3组，每组10只，颈部皮下注射1201批、1202批和1203批疫苗，每只1.0ml(2羽份)，观察14日内试验鸡有无因注射疫苗而引起的局部或全身不良反应。
2.6.5效力检验取21日龄SPF鸡40只，随机分成4组，每组10只。第1组颈部皮下注射1201批疫苗，第2组颈部皮下注射1202批疫苗，第3组颈部皮下注射1203批疫苗，每只0.5ml(1羽份)。第4组不免疫作对照。免疫后28日，将所有试验鸡采血，检测平板凝集抗体效价；同时将所有试验鸡用活菌量约为106CCU/ml的YBF-MS1株菌液爪垫注射进行攻毒，每只0.2ml。观察14日内试验鸡发病情况。
2.6.6甲醛残留量测定分别按2010年版《中国兽药典》附录进行测定。
3结果
3.1生产用种子的制备结果用YBF-MS1株E3、E7、E12冻干种子分别制备一级种子80ml、80ml和60ml，标明收获日期、菌种代次、培养时间后进行纯粹检验，-15℃保存。分别用纯粹检验合格的一级种子制备了二级种子和三级种子各1批，将镜检合格的三级种子液进行扩大培养，用于制备1201、1202、1203批鸡滑液囊支原体灭活疫苗。详见表3、表4。
表3：YBF-MS1株生产种子培养时间和pH值变化
表:4：YBF-MS1株生产种子制备及检验汇总表
3.2疫苗半成品生产及检验结果用YBF-MS1株三级种子各制备了3批半成品，活菌量均不低于109CCU/ml，纯粹检验及浓缩后灭活检验均合格。详见表5。
表5：鸡滑液囊支原体YBF-MS1株半成品检验结果汇总表
3.3水相配制结果共制备水相3批，分别为16863ml、16595ml、12353ml。详见表:6。
表6：鸡滑液囊支原体水相配制汇总表
3.4疫苗制备与分装用剪切机按水相:油相＝2:3的乳化比例进行，制备了3批鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)，批号分别为1201、1202、1203，配苗总量分别为42158ml、41488ml、30883ml，分装规格均为100ml/瓶。详见表:7、表8。
表7：疫苗制备汇总表
批次 水相 油相 配苗总量
1201 16863ml 25295ml 42158ml
1202 16595ml 24893ml 41488ml
1203 12353ml 18530ml 30883ml
表:8：疫苗制备与分装汇总表
批次 生产日期 分装规格 分装瓶数 疫苗总量
1201 2012.10.17 100ml/瓶 407瓶 40700ml
1202 2012.10.25 100ml/瓶 401瓶 40100ml
1203 2012.11.02 100ml/瓶 296瓶 29600ml
3.5性状检验和装量检查结果3批次疫苗外观均呈乳白色；取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均不扩散，均为油包水型；吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，3批疫苗均无水相析出；黏度测定结果分别为47.8cP、45.6cP、46.4cP。详见表:9。
表9：鸡滑液囊支原体灭活疫苗性状检验结果
3.6无菌检验结果按2010年版《中国兽药典》分别对3批疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长。详见表:10。
表10：鸡滑液囊支原体灭活疫苗无菌检验结果
3.7安全检验结果每批疫苗分别用21日龄SPF鸡各10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，连续观察14日，所有试验鸡精神、采食及饮水均未见明显异常，注射部位和全身均无不良反应。详见表:11。
表11：3批疫苗安全性检验结果
3.8效力检验结果试验结果表明，3批疫苗免疫后28日的平板凝集抗体均8/10以上≥1:8，对照组10/10<1:2；3批疫苗免疫后28日攻毒，3批免疫鸡7/10～8/10保护，对照鸡9/10发病。详见表12。
表12：3批疫苗免后28日效力检验结果
3.9甲醛残留量测定3批疫苗分别按2010年版《中国兽药典》进行检验，结果表明，3批疫苗中甲醛残留量均符合规定。详见表:13。
表13：3批疫苗甲醛残留量测定结果
4结果分析
4.1由实验室试制和检验结果可见，用鸡滑液囊支原体YBF-MS1株制备的3批疫苗免疫原性良好，各批次间差异较小，证明本发明筛选的菌种繁殖稳定性好，培养和浓缩工艺是可行的。
4.2本发明采用甲醛溶液对浓缩菌液进行灭活，37℃灭活，加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，搅拌灭活16小时。本发明共试制YBF-MS1株菌液各3批，按此灭活工艺灭活后进行检验，结果均灭活彻底，证明本发明的灭活工艺是可行的。
4.3本发明按水相:油相为2:3的混合，用剪切机15000r/min，乳化5分钟，共制备了3批疫苗，批号为1201、1202、1203，批量为42158ml、41488ml、30883ml，经检验3批疫苗的性状、装量检查、无菌检验、甲醛残留量、安全和效力均符合该疫苗质量标准的要求，证明本发明的乳化工艺是可行的，同时还证明该生产工艺合理可行。
实施例3、本发明制备的鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种安全性试验：
1材料
1.1试验用SPF鸡21日龄、200日龄产蛋SPF鸡均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，提前1周购回后在青岛易邦生物工程有限公司实验动物房负压隔离器内饲养，观察无异常后使用。
1.2疫苗鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)，由实验室试制，批号分别为：1201、1202、1203。
2方法
2.1单剂量接种安全试验取21日龄SPF鸡分为2组，每组10只。第1组颈部皮下注射1201批灭活苗，0.5ml/只；第2组颈部皮下注射生理盐水，0.5ml/只，隔离器内饲养，观察14日，记录精神、采食、饮水等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。
2.2单剂量重复接种安全试验取21日龄SPF鸡分为2组，每组10只。第1组颈部皮下注射1201批灭活苗，0.5ml/只，于免疫后14日以同样剂量再接种1次；第2组颈部皮下注射生理盐水，0.5ml/只。隔离器内饲养，二免后观察14日，记录精神、采食、饮水，二免后第15日剖检，观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。
2.3一次超剂量接种安全试验
2.3.1对SPF雏鸡的一次超剂量接种安全试验取21日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，1～3组分别颈部皮下注射1201、1202、1203批灭活苗；第4组颈部皮下注射生理盐水。注射剂量均为1.0ml/只，注射前称重，分别在隔离器内饲养，连续观察14日，记录精神、采食、饮水情况。观察结束称重，剖检观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。
2.3.2对SPF成鸡的一次超剂量接种安全试验用200日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组颈部皮下注射1201批灭活苗；第2组颈部皮下注射1202批灭活苗；第3组颈部皮下注射1203批灭活苗；第4组颈部皮下注射生理盐水。注射剂量均为1.0ml/只。隔离器内饲养，观察30日，记录试验鸡精神、饮水、采食及产蛋率。
3结果
3.1单剂量接种安全试验结果试验结果表明，疫苗单剂量接种后，观察14日，注射部位及全身均没有引起不良反应，剖检观察，注射局部均吸收良好，无肿胀，炎症等。在整个观察期内试验鸡精神、采食、饮水均正常。结果见表14。
表14：21日龄SPF鸡单剂量接种的安全试验
3.2单剂量重复接种安全试验结果试验结果表明，疫苗单剂量重复接种后，观察14日。疫苗二次接种后，观察14日，在整个观察期内试验鸡精神、采食及饮水均正常，疫苗组与对照组注射部位及全身均没有引起不良反应，二免后第15日剖检观察，注射局部均吸收良好，无肿胀、炎症等。结果见表15。
表15：21日龄SPF鸡单剂量重复接种的安全试验
注：“※”表示首免后14日加强免疫一次，0.5ml/只。
3.3一次超剂量接种安全试验结果试验结果表明，疫苗一次超剂量接种后，观察14日，雏鸡和产蛋鸡注射部位及全身均没有引起不良反应。疫苗注射组与对照组SPF鸡增重无明显差异，剖检观察，注射局部疫苗吸收均良好，无肿胀、炎症等，在整个观察期内试验鸡精神、采食、饮水均正常。产蛋鸡试验结果表明，灭活苗在产蛋期内免疫对产蛋期蛋鸡是安全的，产蛋率基本不受影响。结果见表:16、表17。
表16：SPF雏鸡一次超剂量接种的安全试验
表:17：SPF成鸡一次超剂量接种的安全试验
试验结果表明，将灭活苗单剂量、单剂量重复和超剂量接种。在整个观察期内试验鸡精神、采食、饮水均正常，注射部位及全身没有引起任何不良反应，生长发育均良好，注射局部疫苗均吸收良好。一次超剂量接种180日龄处于产蛋期的SPF产蛋鸡，试验鸡的产蛋率及蛋壳质量与对照鸡的基本一致。证明该灭活苗是安全可靠的。
实施例4：本发明制备的鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)抗体消长规律及免疫持续期的试验
1材料
1.1疫苗实验室试制的鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)，批号分别为1201、1202、1203。
1.221日龄SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.3检验用菌株鸡滑液囊支原体YBF-MS1株(冻干菌种，E5代)，由青岛易邦生物工程有限公司提供。
1.4检测试剂平板凝集抗原、阳性血清以及阴性血清均由青岛易邦生物工程有限公司提供。
2方法
2.1分组用3批灭活苗，每批疫苗分别免疫21日龄SPF鸡40只，颈部皮下注射疫苗，每只0.5ml(1羽份)，另40只不免疫作对照，同条件下隔离饲养。
2.2抗体检测上述免疫鸡于免疫后21日、28日、2个月、4个月、6个月、7个月各组随机抽取10只采血，分离血清，检测平板凝集抗体效价。
2.3攻毒保护将上述3批灭活苗免疫鸡于接种后21日、28日、6个月、7个月各取免疫鸡和对照鸡各10只，分别用活菌量约为106CCU/ml的鸡滑液囊支原体YBF-MS1株菌液爪垫注射进行攻毒，每只0.2ml，攻毒后观察14日。
3结果
3.1免疫持续期试验抗体检测结果用灭活苗接种组，接种后21日，4/10及以上抗体效价达到1:8；接种后28日～7个月，8/10及以上鸡的平板凝集抗体在1:8及以上；未免疫对照组鸡的平板凝集抗体均小于1:2。结果见表18。
表18：灭活苗免疫后抗体效价检测结果
3.2免疫持续期试验攻毒保护结果用3批灭活苗分别免疫21日龄SPF鸡，于免后21日、28日、6个月、7个月时，分别抽取试验鸡和对照鸡各10只进行攻毒。结果显示，免疫后21日攻毒，免疫组达到5/10～6/10的保护，对照组8/10发病；免疫后28日攻毒，免疫组均达到8/10的保护，对照组7/10发病；免疫后6个月免疫组达到9/10～10/10的保护，对照组4/10发病；免疫后7个月免疫组达到9/10～10/10的保护，对照组3/10发病。结果见表:19。
表19：灭活苗免疫后的攻毒保护试验结果
:攻毒保护结果显示，试验鸡于疫苗接种后21日可产生抗体，28日抗体达到高峰，维持4个月后开始缓慢下降至免后7个月，免疫鸡的抗体仍有8/10及以上为1:8；灭活苗免后28日攻毒，对照鸡7/10发病，3批免疫鸡24/30保护(6/30发病)；免疫后6个月，对照鸡4/10发病，3批免疫鸡28/30保护(2/30发病)；免疫后7个月，对照鸡3/10发病，3批免疫鸡29/30保护(1/30发病)。该试验还表明，易感日龄和非易感日龄免疫SPF鸡的抗体效价均能达到8/10及以上不低于1:8，说明该疫苗的免疫期应至少为免疫后7个月。为了确保疫苗的免疫效果，将鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)免疫期确定为6个月。
以上结果说明本发明所制备的鸡滑液囊支原体灭活疫苗(YBF-MS1株)安全有效适合推广应用。
对比实验表明，用目前市场上出售的鸡滑液囊支原体疫苗进行免疫，再用本发明筛选的YBF‐MS1株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明YBF‐MS1株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于YBF‐MS1株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。

Claims (5)

1.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的YBF-MS1株。
2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的YBF-MS1株的保藏编号为CCTCCM2016080。
3.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的YBF-MS1株的灭活采用甲醛灭活。
4.权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，包括如下的步骤
1)按照培养瓶容积60％～80％加入鸡滑液囊支原体液体培养基，pH值为7.6～7.8、种子接种量为10％、培养温度为37℃、振荡速度为90～100r/min、培养24～30小时收获菌液置2～8℃保存；
2)用连续流离心的方法将培养物作浓缩至每毫升活菌含量不低于5×109CCU，浓缩后立即灭活；
3)菌液灭活：
将浓缩后的菌液无菌导入灭活罐内，按照浓缩菌液数量，计量加入10％甲醛溶液，开动搅拌电机慢速搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的终浓度为0.2％；37℃搅拌灭活12～16小时，灭活后的菌液置2～8℃保存；
4)油相制备：取注射用白油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-805份，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却后备用；
水相制备：将灭活检验合格的浓缩菌液，加入终浓度为5％吐温-80，充分混匀即为水相；
乳化：取油相3份加入适当的无菌容器中，开动剪切机10000r/min搅拌10分钟，然后缓缓加入水相2份，再以15000r/min搅拌5分钟完成制备。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鸡滑液囊支原体液体培养基，其制备方法如下：
1)基础液配制：
取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水加至1000ml、1％酚红溶液1ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分钟，冷却后置2～8℃保存；
2)培养基配制：
基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25％酵母浸出液200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1％辅酶I溶液30ml、1％L-半胱氨酸溶液30ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
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