CN102406925A - 一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法 - Google Patents
一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法发明，属于兽用生物技术领域。本发明是这样实现的，制备好A型和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液、鸡毒支原体抗原液，A型和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混匀，得到副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液，将副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液与鸡毒支原体抗原液按体积比为1∶1～1∶1.5的比例混匀后倒入乳化罐内搅拌，同时缓缓加入杨树皮类脂，使杨树皮类脂在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，继续搅拌乳化30～60分钟。疫苗容易吸收、无毒副作用、免疫产生时间短、免疫持续期长，免疫效果好，能有效预防鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体病。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品制备与禽病防治技术领域，尤其涉及一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法。
背景技术
鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起的一种急性呼吸系统传染病，主要特征为面部肿胀、鼻腔有浆液性到粘液性分泌物和结膜炎，发病率很高，呈世界性分布。鸡毒支原体病(MG)是鸡的一种慢性呼吸道传染病，具有分布广泛、感染率高的特点，以呼吸道发生啰音、咳嗽、流鼻液和窦部肿胀为特征。传染性鼻炎或鸡毒支原体单独感染可致死鸡只，但危害更甚的是常继发或并发感染大肠杆菌病、传染性支气管炎等多种细菌病和病毒病。
这两种病的共同特点是造成育成鸡发育不良、蛋鸡产蛋明显下降(比正常低10～40％)，使用药物治疗时，极易产生耐药性，病情常反复发作，无法从根本上消除带菌状态。由于患病鸡的饲料利用率和产蛋率的低下以及医疗费用所带来的经济损失，使这两种病成为养禽业面临着代价最高的疾病问题之一。因此研制鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联灭活疫苗具有重大现实意义。
目前，国内使用的疫苗为鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联油乳剂灭活疫苗，存在粘度大难注射，矿物油难吸收，注射局部易发生肿胀，免疫产生时间长、免疫持续期短等缺点，亟待需要寻求一种易吸收、无毒副作用、效果好的新型佐剂疫苗来防治该病。
杨树皮类脂系从杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性物质，具有高度的天然生物学活性，富含大量的磷脂、甾醇、不饱和脂肪酸、糖脂以及多种常量、微量元素、多种维生素、18种必需氨基酸等。其中杨树皮类脂中含有的多糖类、有机酸、甾醇、甙类、黄酮类物质在动物体内协调统一，可以大大提高动物体的免疫机能。多糖类具有促胸腺体液反应、刺激网状内皮系统，提高机体特异性免疫反应能力；有机酸具有增强机体免疫功能的作用，能够刺激和促进单核吞噬细胞功能，对抗免疫抑制对免疫器官的抑制作用；甙类能够加速抗体的产生、促进淋巴细胞转化和增强网状内皮系统功能等作用。国内也有用类脂做为佐剂制备疫苗的报道，其中，专利号为ZL03142556.9的发明专利公开了杨树皮类脂做为疫苗佐剂的使用方法：(1)500～1000转/分搅拌一种抗原和/或抗原组合物，同时缓缓加入杨树皮类脂佐剂，使杨树皮类脂佐剂在混合物中的终浓度达到4～6％(W/V)；(2)将上述混合物通过乳化压力为10～15MPa，剪切压力为45～60MPa的均质机内乳化，乳化温度在20～30℃之间，制得含杨树皮类脂佐剂的疫苗。使用该方法制得的疫苗效果好，但类脂含量高、制造成本高，且免疫持续时间不长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有疫苗的缺陷，提供一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，依本发明所制备的疫苗容易吸收、无毒副作用、免疫产生时间短、免疫持续期长，免疫效果好，能有效预防鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体病，且制造成本低。
本发明的技术方案是这样实现的，一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，按照以下步骤制备：
一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO2体积含量为5％、温度为37℃的环境中培养16～18h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的3-5个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种于6～7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃温度下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种。
二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养17～18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2～8℃保存，不得超过6～8h。
制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37～38℃温室中静止培养18～20h，期间每隔6～8h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液。
菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，通过比浊法测定含菌量，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液。
(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备：其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同。
(3)鸡毒支原体抗原液的制备，按照以下步骤进行：
一级种子繁殖：将CM培养基1ml注入冻干菌种瓶使菌种复原，再将体积为CM培养基体积1/10的鸡毒支原体菌种接种于CM培养基中，在温度为36～37℃条件下培养24～48h，待接种后的CM培养基的PH值与接种前的PH值相比下降0.5～0.8时停止培养，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级种子，在-25℃以下保存不超过60天。
二级种子繁殖：取一级种子，按体积为CM培养基体积1/10的量接种于CM培养基，置36～37℃温度下培养24～48h，经纯粹检验合格后，作为二级种子，在2-8℃保存不超过5天。
制苗用菌液制备：再以纯粹检验合格的二级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出三级种子，再以纯粹检验合格的三级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出四级种子，比照二级种子繁殖方法做种子扩大培养，菌种繁殖传代不超过8代，最后一代纯粹检验合格，经活菌计数测定，活菌数不低于108.5ccu/ml，得到制苗用菌液。
菌液浓缩与灭活：将制得的制苗用菌液作8倍浓缩后，加入体积为浓缩物体积1/500的甲醛，在温度为37℃条件下灭活20h，期间每隔6h摇动1次浓缩物，经无菌和灭活检验合格得到鸡毒支原体抗原液，置2-8℃保存不超过20天。
(4)疫苗的制备：将上述制得的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混匀，得到副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液，将副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液与鸡毒支原体抗原液按体积比为1∶1～1∶1.5的比例混匀后倒入乳化罐内，用混合机以750～850r/min的转速搅拌，同时缓缓加入杨树皮类脂，使杨树皮类脂在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，然后将混合机转速提高到2500～3000r/min继续乳化30～60分钟，即得到疫苗，疫苗中A型副鸡嗜血杆菌和C型副鸡嗜血杆菌的最终含菌量均为10亿cfu/ml、鸡毒支原体的最终含量为108.0ccu/ml。
上述鸡肉汤琼脂板是这样制备的：取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g混合，用4mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的PH至7.4，116℃灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I(NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混匀，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0.05％、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10％，然后将混合溶液倒入直径为90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉汁是取鸡胸脯肉泥1份加蒸馏水4份，4℃浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的。
上述半合成培养基是这样制备的：取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入1000ml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7.2～7.4，116℃灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和10ml的质量百分浓度为0.5％的辅酶I(NADH)水溶液。
上述CM培养基是这样制备的：将PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5.0g、去离子水1000ml、浓度为1％的酚红1ml混合溶解后，在温度为115℃压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟，置2～8℃保存，使用前加入猪血清130ml、25％的酵母浸出液100ml和80万单位/ml青霉素溶液1.2ml，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH值为7.8～8.0。
上述浓度为1％的酚红的制作过程：(1)1mol/L氢氧化钠的制备，取常温下的澄清的氢氧化钠饱和溶液56.0ml，加煮沸过的常温注射用水1000ml即制得1mol/L氢氧化钠；(2)称取10.0g酚红粉末加入到20.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液中搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(3)向未溶解的酚红粉末中再加入20ml的1mol/L氢氧化钠溶液搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(4)如果酚红粉末未完全溶解，则可再加少量1mol/L氢氧化钠溶液，但不得超过20.0ml，将溶液倒入1000ml刻度容器中；(5)加煮沸过的常温注射用水向刻度容器中补足溶液至1000ml，摇匀后分装小瓶，经116℃灭菌15分钟，置2～8℃保存。
上述25％的酵母浸出液的制作过程：取新鲜酵母250g加入到1000ml双蒸水中充分搅拌，使酵母溶解完全，煮沸30分钟，煮完冷却后，以2800r/min转速离心25分钟，提取上清液分装，在温度为115℃、压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟。
上述副鸡嗜血杆菌菌株为A型C-Hpg-8株(编号为CVCC 254)和C型Hpg-668株(编号为CVCC 256)，鸡毒支原体菌株为CR株(编号为CVCC 1651)均来源于中国兽医药品监察所，上述佐剂杨树皮类脂来源于美科尔(河北)生物技术有限公司。
上述菌液的浓缩采用高速离心、中空纤维过滤、超滤浓缩方式中的任一种。
本发明中，优选的浓缩采用超滤浓缩方式。
纯粹检验、无菌检验和灭活检验，均按《中华人民共和国兽药典》方法进行。
本发明的有益效果是，本发明制备的鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗，给鸡注射后在机体内能够被很好的吸收，无残留，对注射局部无任何不良反应，可同时预防鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体2种疾病。因注射应激小，产蛋高峰期注射不会影响产蛋率。采用超滤浓缩方法，可最大程度的降低对菌体的损伤和减少菌体的损失。本发明得到制备疫苗时杨树皮类脂的最佳含量，与现有技术相比，减少了杨树皮类脂的用量，降低了疫苗生产成本，采用混合机制备疫苗，减化了生产工艺流程，提高了疫苗的物理稳定性，延长了疫苗的保存期。与传统的油乳剂疫苗相比，用本发明所制备的疫苗的免疫持续期由原来的120天左右延长到180天左右，免疫持续期延长了50％；与依照ZL03142556.9的发明公开的类脂使方法制备的疫苗相比，本发明所制备的疫苗的免疫持续期延长了80天，免疫持续期延长了80％，使用本发明所制备的鸡传染性鼻炎类脂灭活疫苗可以减少疫苗接种次数，拉长接种时间间距，减少了接种疫苗的开支，可大大节约养殖业生产成本。另外由于本疫苗中含有大量的VE等可提高产蛋率的营养成分，注射后会不同程度地提高产蛋鸡的产蛋率。
以矿物油为佐剂加入鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体抗原按常规方法制备油乳剂苗(鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联油乳剂灭活疫苗)、依照ZL03142556.9的方法制备的鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联疫苗，与本发明制备的鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗进行对比试验。
对比项目及结果如下表所示：
通过下列实施例对本发明进行更具体的说明，应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1，鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备，按以下步骤进行：
(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，按照以下步骤制备：
一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO2体积含量为5％、温度为37℃的烛缸中培养16h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的5个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种于6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃温度下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种。
二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养17h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2～8℃保存，不得超过6～8h。
制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37℃温室中静止培养20h，期间每隔8h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液。
菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液用超滤浓缩方法进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，通过比浊法测定含菌量，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液。
(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备：其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同。
(3)鸡毒支原体抗原液的制备，按照以下步骤进行：
一级种子繁殖：将CM培养基1ml注入冻干菌种瓶使菌种复原，然后将体积为CM培养基体积1/10的鸡毒支原体菌种接种于CM培养基中，在温度为36℃条件下培养48h，待接种后的CM培养基的PH值与接种前的PH值相比下降0.5时停止培养，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级种子，在-25℃以下保存不超过60天。
二级种子繁殖：取一级种子，按体积为CM培养基体积1/10的量接种于CM培养基，置36℃温度下培养48h，经纯粹检验合格后，作为二级种子，在2-8℃保存不超过5天。
制苗用菌液制备：再以纯粹检验合格的二级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出三级种子，再以纯粹检验合格的三级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出四级种子，比照二级种子繁殖方法进一步做种子扩大培养，菌种繁殖传代不超过8代，最后一代纯粹检验合格，经活菌计数测定，活菌数不低于108.5ccu/ml，得到制苗用菌液。
菌液浓缩与灭活：将制得的制苗用菌液用超滤浓缩方法作8倍浓缩后，加入体积为浓缩物体积1/500的甲醛，在温度为37℃条件下灭活20h，期间每隔6h摇动1次浓缩物，经无菌和灭活检验合格得到鸡毒支原体抗原液，置2～8℃保存不超过20天。
(4)疫苗的制备：将上述制得的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混匀，得到副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液，将副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液与鸡毒支原体抗原液按体积比为1∶1的比例混匀后倒入乳化罐内，用混合机以750r/min的转速搅拌，同时缓缓加入杨树皮类脂，使杨树皮类脂在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0％，然后将混合机转速提高到2500r/min继续乳化60分钟，即得到疫苗，疫苗中A型副鸡嗜血杆菌和C型副鸡嗜血杆菌的最终含菌量均为10亿cfu/ml、鸡毒支原体的最终含量为108.0ccu/ml。
上述鸡肉汤琼脂板是这样制备的：取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g混合，用4mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的PH至7.4，116℃灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I(NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混匀，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0.05％、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10％，然后将混合溶液倒入直径为90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉法是取鸡胸脯肉泥1份加蒸馏水4份，4℃浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的。
上述半合成培养基是这样制备的：取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入1000ml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7.2～7.4，116℃灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和10ml的质量浓度为0.5％的辅酶I(NADH)水溶液。
上述CM培养基是这样制备的：将PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5.0g、去离子水1000ml、浓度为1％的酚红1ml混合溶解后，在温度为115℃压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟，置2～8℃保存，使用前加入猪血清130ml、25％的酵母浸出液100ml和80万单位/ml青霉素溶液1.2ml，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH值为7.8～8.0。
上述浓度为1％的酚红的制作过程：(1)1mol/L氢氧化钠的制备，取常温下的澄清的氢氧化钠饱和溶液56.0ml，加煮沸过的常温注射用水1000ml即制得1mol/L氢氧化钠；(2)称取10.0g酚红粉末加入到20.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液中搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(3)向未溶解的酚红粉末中再加入20ml的1mol/L氢氧化钠溶液搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(4)如果酚红粉末未完全溶解，则可再加少量1mol/L氢氧化钠溶液，但不得超过20.0ml，将溶液倒入1000ml刻度容器中；(5)加煮沸过的常温注射用水向刻度容器中补足溶液至1000ml，摇匀后分装小瓶，经116℃灭菌15分钟，置2～8℃保存。
上述25％的酵母浸出液的制作过程：取新鲜酵母250g加入到1000ml双蒸水中充分搅拌，使酵母溶解完全，煮沸30分钟，煮完冷却后，以2800r/min转速离心25分钟，提取上清液分装，在温度为115℃、压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟。
上述副鸡嗜血杆菌菌株为A型C-Hpg-8株(编号为CVCC 254)和C型Hpg-668株(编号为CVCC 256)，鸡毒支原体菌株为CR株(编号为CVCC 1651)均来源于中国兽医药品监察所，上述佐剂杨树皮类脂来源于美科尔(河北)生物技术有限公司。
实施例2，鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备，按以下步骤进行：
(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，按照以下步骤制备：
一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO2体积含量为5％、温度为37℃的环境中培养18h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的3个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种于7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃温度下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种。
二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2～8℃保存，不得超过6～8h。
制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在38℃温室中静止培养18h，期间每隔6h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液。
菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液用中空纤维过滤方法进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，通过比浊法测定含菌量，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/1000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液。
(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备：其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同。
(3)鸡毒支原体抗原液的制备，按照以下步骤进行：
一级种子繁殖：将CM培养基1ml注入冻干菌种瓶使菌种复原，然后将体积为CM培养基体积1/10的鸡毒支原体菌种接种于CM培养基中，在温度为37℃条件下培养48h，待接种后的CM培养基的PH值与接种前的PH值相比下降0.8时停止培养，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级种子，在-25℃以下保存不超过60天。
二级种子繁殖：取一级种子，按体积为CM培养基体积1/10的量接种于CM培养基，置37℃温度下培养24h，经纯粹检验合格后，作为二级种子，在2-8℃保存不超过5天。
制苗用菌液制备：再以纯粹检验合格的二级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出三级种子，再以纯粹检验合格的三级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出四级种子，比照二级种子繁殖方法做种子扩大培养，菌种繁殖传代不超过8代，最后一代纯粹检验合格，经活菌计数测定，活菌数不低于108.5ccu/ml，得到制苗用菌液。
菌液浓缩与灭活：将制得的制苗用菌液用中空纤维过滤方法作8倍浓缩后，加入体积为浓缩物体积1/500的甲醛，在温度为37℃条件下灭活20h，期间每隔6h摇动1次浓缩物，经无菌和灭活检验合格得到鸡毒支原体抗原液，置2～8℃保存不超过20天。
(4)疫苗的制备：将上述制得的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混匀，得到副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液，将副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液与鸡毒支原体抗原液按体积比为1∶1.5的比例混匀后倒入乳化罐内，用混合机以850r/min的转速搅拌，同时缓缓加入杨树皮类脂，使杨树皮类脂在混合物中的最终体积百分比浓度为3.8％，然后将混合机转速提高到2500r/min继续乳化60分钟，即得到疫苗，疫苗中A型副鸡嗜血杆菌和C型副鸡嗜血杆菌的最终含菌量均为10亿cfu/ml、鸡毒支原体的最终含量为108.0ccu/ml。
所述鸡肉汤琼脂板、半合成培养基、CM培养基的制备方法与实施例1相同。
上述副鸡嗜血杆菌菌株为A型C-Hpg-8株(编号为CVCC 254)和C型Hpg-668株(编号为CVCC 256)，鸡毒支原体菌株为CR株(编号为CVCC 1651)均来源于中国兽医药品监察所，上述佐剂杨树皮类脂来源于美科尔(河北)生物技术有限公司。
对比试验
以矿物油为佐剂加入鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体抗原按常规方法制备油乳剂苗(鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联油乳剂灭活疫苗)、依照ZL03142556.9的方法制备的鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联疫苗，与本发明制备的鸡传染性鼻炎和鸡毒支原体抗原制备的类脂灭活疫苗进行对比试验，对比项目及结果如下表所示：
实施例中所涉及疫苗的检验方法如下：
(1)物理性状，外观应为乳黄白色均匀乳剂，无水油分层。粘度，用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需要的时间，应在5秒以内。(2)无菌检验，按《中华人民共和国兽药典》方法进行，应无菌生长。(3)安全检验，用40～60日龄的SPF鸡8只，每只皮下注射疫苗1ml，观察14日，应无异常反应。(4)效力检验，鸡传染性鼻炎部分：用2～3月龄的SPF鸡8只，每只皮下注射疫苗0.5ml。1个月后，连同条件相同的对照鸡4只，各眶下窦内注射菌液0.2ml(50～100万活菌)，观察14日，对照鸡全部发病，免疫鸡至少保护6只，或对照鸡3只发病，免疫鸡至少保护7只为合格。鸡毒支原体部分：取40～60日龄SPF鸡8只，颈背部或大腿肌肉注射疫苗，每只0.5ml，30日后，连同条件相同的对照鸡6只，在2～3m3的密室(室温应为15～30℃，相对湿度为50～70％)内喷雾攻击强毒培养物500～600ml，喷雾持续时间应不少于5分钟，雾滴在2μm左右。观察14日，剖检观察气囊病变，对其评分，对照组至少4只鸡，每只气囊出现2份以上病变，免疫组鸡平均气囊损伤保护率应在60％以上，疫苗判为合格。
保护率计算方法及公式以气囊病变程度来计算保护率，将试验鸡每侧气囊按病变程度分为五个等级。0分-正常的气囊，清洁透明而薄；1分-气囊稍有增厚和轻度浑浊，局部有少数灰色或黄色渗出物斑点；2分-部分气囊区域由可见的灰色和黄色渗出物，同时伴有气囊中度增厚；3分-大片气囊不满黄色干酪样渗出物；4分-整个气囊不满黄色干酪样渗出物，气囊失去弹性。
气囊保护率计算公式：
Claims (3)
1.一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备，按照以下步骤制备：
一级菌种制备：取A型副鸡嗜血杆菌菌种划线接种于鸡肉汤琼脂平板上，在CO2体积含量为5％、温度为37℃的环境中培养16～18h，挑选符合菌株特性的直径为1mm的3-5个典型菌落用10ml灭菌鸡肉汤稀释后接种于6～7日龄SPF鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.2ml，在37℃温度下继续孵化，收集30h内死亡胚的卵黄液，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级菌种；
二级菌种制备：取一级菌种，按体积为半合成培养基体积1/200的量接种于半合成培养基中，在温度为37℃条件下培养17～18h，经纯粹检验确认无杂菌后，即为二级菌种，并置于2～8℃保存，不得超过6～8h；
制苗用菌液的制备：将二级菌种按体积为半合成培养基体积1/40的量接种于半合成培养基中，在37～38℃温室中静止培养18～20h，期间每隔6～8h摇晃一次，经纯粹检验确认无杂菌污染，加入体积为半合成培养基体积1/2000的甲醛灭活24h，得到制苗用菌液；
菌液的浓缩与灭活：将纯粹检验合格的制苗用菌液进行浓缩，浓缩后含菌量不少于50亿cfu/ml，通过比浊法测定含菌量，再分别加入体积为浓缩菌液体积1/1000的甲醛和体积为浓缩菌液体积1/10000的硫柳汞，混匀后在4℃条件下灭活2天，经无菌检验合格得到A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液；
(2)C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备：其制备方法与A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液的制备方法相同；
(3)鸡毒支原体抗原液的制备，按照以下步骤进行：
一级种子繁殖：将CM培养基1ml注入冻干菌种瓶使菌种复原，再将体积为CM培养基体积1/10的鸡毒支原体菌种接种于CM培养基中，在温度为36～37℃条件下培养24～48h，待接种后的CM培养基的PH值与接种前的PH值相比下降0.5～0.8时停止培养，经纯粹检验确认无杂菌后，作为一级种子，在-25℃以下保存不超过60天；
二级种子繁殖：取一级种子，按体积为CM培养基体积1/10的量接种于CM培养基，置36～37℃温度下培养24～48h，经纯粹检验合格后，作为二级种子，在2-8℃保存不超过5天；
制苗用菌液制备：再以纯粹检验合格的二级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出三级种子，再以纯粹检验合格的三级种子为基础、比照二级种子繁殖方法繁殖出四级种子，比照二级种子繁殖方法做种子扩大培养，菌种繁殖传代不超过8代，最后一代纯粹检验合格，经活菌计数测定，活菌数不低于108.5ccu/ml，得到制苗用菌液；
菌液浓缩与灭活：将制得的制苗用菌液作8倍浓缩后，加入体积为浓缩物体积1/500的甲醛，在温度为37℃条件下灭活20h，期间每隔6h摇动1次浓缩物，经无菌和灭活检验合格得到鸡毒支原体抗原液，置2-8℃保存不超过20天；
(4)疫苗的制备：将上述制得的A型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液和C型副鸡嗜血杆菌灭活抗原菌液按体积比为1∶1的比例混匀，得到副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液，将副鸡嗜血杆菌灭活混合抗原菌液与鸡毒支原体抗原液按体积比为1∶1～1∶1.5的比例混匀后倒入乳化罐内，用混合机以750～850r/min的转速搅拌，同时缓缓加入杨树皮类脂，使杨树皮类脂在混合物中的最终体积百分比浓度为2.0～3.8％，然后将混合机转速提高到2500～3000r/min继续乳化30～60分钟，即得到疫苗，疫苗中A型副鸡嗜血杆菌和C型副鸡嗜血杆菌的最终含菌量均为10亿cfu/ml、鸡毒支原体的最终含量为108.0ccu/ml；
所述鸡肉汤琼脂板是这样制备的：取鸡肉汁100ml、酪蛋白胨1g、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g混合，用4mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的PH至7.4，116℃灭菌30分钟，倒板前加入辅酶I(NADH)和过滤除菌的健康鸡血清混匀，使得混合溶液中辅酶I(NADH)的质量浓度为0.05％、过滤除菌的健康鸡血清的体积百分比浓度为10％，然后将混合溶液倒入直径为90mm的平皿中，放平冷却即得到鸡肉汤琼脂板；所述鸡肉汁是取鸡胸脯肉泥1份加蒸馏水4份，4℃浸泡过夜，煮沸30分钟，除去肉渣，澄清过滤得到的；
所述半合成培养基是这样制备的：取多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g，放入1000ml纯化水中搅均，调节所得溶液的PH至7.2～7.4，116℃灭菌40分钟，临用前加入60ml的灭活健康鸡血清和10ml的质量百分浓度为0.5％的辅酶I(NADH)水溶液；
所述CM培养基是这样制备的：将PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5.0g、去离子水1000ml、浓度为1％的酚红1ml混合溶解后，在温度为115℃压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟，置2～8℃保存，使用前加入猪血清130ml、25％的酵母浸出液100ml和80万单位/ml青霉素溶液1.2ml，用氢氧化钠溶液调节培养基的pH值为7.8～8.0；
所述浓度为1％的酚红的制作过程：(1)1mol/L氢氧化钠的制备，取常温下的澄清的氢氧化钠饱和溶液56.0ml，加煮沸过的常温注射用水1000ml即制得1mol/L氢氧化钠；(2)称取10.0g酚红粉末加入到20.0ml的1mol/L氢氧化钠溶液中搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(3)向未溶解的酚红粉末中再加入20ml的1mol/L氢氧化钠溶液搅拌后静置5～10分钟，将溶解部分倒入1000ml刻度容器中；(4)如果酚红粉末未完全溶解，则可再加少量1mol/L氢氧化钠溶液，但不得超过20.0ml，将溶液倒入1000ml刻度容器中；(5)加煮沸过的常温注射用水向刻度容器中补足溶液至1000ml，摇匀后分装小瓶，经116℃灭菌15分钟，置2～8℃保存；
所述25％的酵母浸出液的制作过程：取新鲜酵母250g加入到1000ml双蒸水中充分搅拌，使酵母溶解完全，煮沸30分钟，煮完冷却后，以2800r/min转速离心25分钟，提取上清液分装，在温度为115℃、压力为0.106MPa条件下灭菌20分钟。
2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述菌液的浓缩采用高速离心、中空纤维过滤、超滤浓缩方式中的任一种。
3.根据权利要求2所述的一种鸡传染性鼻炎、鸡毒支原体二联类脂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述菌液的浓缩采用超滤浓缩方式。
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