CN106166164A - 一种高纯度银杏叶标准提取物的制备方法及其制品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：称取原料，粉碎过筛，投入提取回流罐中；回流提取；回收酒精，真空浓缩至得到比重为1.0‑1.5的浸膏；将浸膏用纯水充分搅拌，高速离心除去沉淀，得到上清液；将上清液过大孔树脂，梯度洗脱，收集40‑60％酒精洗脱液，然后酸化，得到酸化液；将酸化液在0‑5℃温度下沉淀过夜，收集沉淀；对沉淀物用纯水充分洗涤，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物。本发明所采用设备简单，工艺简单可行，便于工业化生产；所用溶剂无毒无残留，不产生环境污染；本发明银杏叶提取物有害物除去率高，所生产标准提取物符合美国FDA要求。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体涉及一种高纯度银杏叶标准提取物的制备方法及其制品。
背景技术
银杏标准提取物是广泛应用于心脑血管疾病用药，是最广泛的中药品种之一，随着对银杏提取物的深入研究，越来越发现银杏提取物中活性成分及其他一些成分对人体的副作用，银杏酚酸使人体皮肤发生过敏性皮炎，4-O-甲基吡哆醇导致抽搐和无意识作用。银杏提取物主要含有得生物活性黄酮有30多种，其中20余种的结构已经分析清楚，各种研究表明，银杏黄酮具有抑制血小板聚结，调节血脂、扩张血管、改善脑循环、提高大脑功能、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等广泛的生物活性；银杏内酯是二萜类化合物，主要有银杏内酯A,B,C,J,M及白果内酯这几种，银杏内酯是公认的血小板活化因子受体拮抗剂，对大脑神经传递、修复保护大脑组织方面作用巨大，对心脑血管拥有良好的开发前景。我国银杏是世界银杏主产地，占全世界70％的产量，但是银杏提取物在我国却大部分只有初级提取物，含量低，内酯含量达不到要求，而且其中的有毒有害成分无法分离，结果只能给国外提供初级产品，价值很低。银杏提取物提取工艺研究概况：银杏提取物生产厂家很多，大部分都是水提或者低浓度酒精提取，然后过大孔树脂D101，然后喷雾干燥所得。其他还处于实验室研究阶段，没有走入生产应用，譬如分子膜过滤法，反向液态色谱法、超临界CO2萃取等等，这样的报道很多。现在急需研发一种提高银杏黄酮含量的新方法。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题就是如何提高银杏黄酮的含量，有效去除有害成分，而提供一种高纯度银杏叶标准提取物的制备方法及其制品。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，该制备方法包括如下步骤(所用原料均市购得到)：
步骤一：准备：称取原料，粉碎过18-22目筛，晒干，然后将其投入提取回流罐中；
步骤二：回流提取：加入银杏叶重量8-12倍的60-75％酒精，回流温度控制在65-70℃，回流时间为2.5-3.5小时；
步骤三：二次回流提取：加入银杏叶重量4-6倍的60-75％酒精，温度控制在65-70℃，回流时间为1.5-2.5小时；
步骤四：浓缩：合并两次回流液体，回收酒精，真空浓缩至得到比重为1.0-1.5的浸膏；
步骤五：除泡：将浸膏用8-12倍重量的纯水充分搅拌，用KOH碱化至pH 8.0-10，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，并至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得到上清液；
步骤六：大孔树脂过滤：将上清液过大孔树脂，梯度洗脱，收集40-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精，用8-12倍纯水充分搅拌，然后用盐酸酸化至PH3.5-4.5，得到酸化液；
步骤七：将步骤六得到的酸化液在0-5℃温度下沉淀过夜，收集沉淀；
步骤八：真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃温度下充分洗涤，pH值为6.5-7.0，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，银杏黄酮含量31％，银杏内酯11％，银杏酚酸低于1PPM、4-O-甲基吡哆醇低于1PPM，双黄酮含量低于1PPM；收得率为2.3％。
优选地，在步骤一中，所述的筛为20目。
优选地，在步骤二和步骤三中，所述的回流温度为65℃。
优选地，在步骤四中，所述的回收酒精回收至酒精含量15％以下。
优选地，在步骤四中，所述的真空度为-0.08--0.09MPa；所述的比重为1.15-1.2。
优选地，在步骤六中，所采用的大孔树脂为D201大孔树脂。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取原料，粉碎过20目筛，晒干，然后将其投入提取回流罐中；
步骤二：回流提取：加入银杏叶重量10倍的65％酒精，回流温度控制在65℃，回流时间为3小时；
步骤三：二次回流提取：加入银杏叶重量5倍的65％酒精，温度控制在65℃，回流时间为2小时；
步骤四：浓缩：合并两次回流液体，回收酒精回收至酒精含量15％以下，真空浓缩至得到比重为1.15-1.2的浸膏；
步骤五：除泡：将浸膏用10倍重量的纯水充分搅拌，用KOH碱化至pH 9.0，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，并至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得到上清液；
步骤六：大孔树脂过滤：将上清液过D201大孔树脂，梯度洗脱，收集40-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精，然后用10倍纯水充分搅拌，然后用盐酸酸化至PH4.0，得到酸化液；
步骤七：将步骤六得到的酸化液在0-5℃温度下沉淀过夜，收集沉淀；
步骤八：真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃温度下充分洗涤，pH值为7.0，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，银杏黄酮含量31％，银杏内酯11％，银杏酚酸低于1PPM、4-O-甲基吡哆醇低于1PPM，双黄酮含量低于1PPM；收得率为2.3％。
本发明还提供了所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法所制得的银杏叶标准提取物。
(三)有益效果
本发明所采用设备简单，工艺简单可行，便于工业化生产；所用溶剂无毒无残留，不产生环境污染；本发明银杏有害物除去率高，所生产标准提取物符合美国FDA要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
下面所使用的溶剂、KOH、HCL均为食用级或者分析纯，不得使用工业级。
实施例1
1，取银杏叶(干)500KG，(HPLC检测含有银杏黄酮0.72％，萜二内酯0.29％)，粉碎过20目筛，投入回流提取罐；
2，第一次回流提取：65％酒精5000公斤，温度控制在65℃回流时间3小时；
3，第二次回流：65％酒精2500公斤，温度控制在65℃，回流2小时；
4，浓缩：合并两次回流液体，回收酒精，真空浓缩至比重1.2的浸膏173公斤。
5，除泡：173公斤浸膏加1730公斤纯水，KOH碱化至PH9.0，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得上清液1860公斤。
6，大孔树脂过滤：上清液过D201大孔树脂，梯度洗脱，收集40％-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精后用10倍水充分搅拌，然后盐酸酸化至PH4.0；
7，酸化液在0-5℃下沉淀过夜，收集沉淀39公斤；
8，洗涤真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃下充分洗涤，PH到6.5-7.0即可，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，经HPLC分析得银杏黄酮含量30.69％，银杏内酯11.72％，银杏酚酸、4-O-甲基吡哆醇，双黄酮含量均低于1PPM，收得银杏标准提取物11.36公斤。
实施例2
1，取银杏叶(干)500KG，(HPLC检测含有银杏黄酮0.76％，萜二内酯0.31％)，粉碎过20目筛，投入回流提取罐；
2，第一次回流提取：65％酒精5000公斤，温度控制在65℃回流时间3小时；
3，第二次回流：65％酒精2500公斤，温度控制在65℃，回流2小时；
4，浓缩：合并两次回流液体，回收酒精，真空浓缩至比重1.2的浸膏179公斤。
5，除泡：179公斤浸膏加1790公斤纯水，KOH碱化至PH9.0，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得上清液1910公斤。
6，大孔树脂过滤：上清液过D201大孔树脂，梯度洗脱，收集40％-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精后用10倍水充分搅拌，然后盐酸酸化至PH4.0；
7，酸化液在0-5℃下沉淀过夜，收集沉淀46公斤；
8，洗涤真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃下充分洗涤，PH到6.5-7.0即可，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，经HPLC分析得银杏黄酮含量30.27％，银杏内酯10.97％，银杏酚酸、4-O-甲基吡哆醇，双黄酮含量均低于1PPM，收得银杏标准提取物12.77公斤。
实施例3
1，取银杏叶(干)500KG，(HPLC检测含有银杏黄酮0.69％，萜二内酯0.25％)，粉碎过20目筛，投入回流提取罐；
2，第一次回流提取：65％酒精5000公斤，温度控制在65℃回流时间3小时；
3，第二次回流：65％酒精2500公斤，温度控制在65℃，回流2小时；
4，浓缩：合并两次回流液体，回收酒精，真空浓缩至比重1.2的浸膏165公斤。
5，除泡：165公斤浸膏加1650公斤纯水，KOH碱化至PH9.0，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得上清液1790公斤。
6，大孔树脂过滤：上清液过D201大孔树脂，梯度洗脱，收集40％-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精后用10倍水充分搅拌，然后盐酸酸化至PH4.0；
7，酸化液在0-5℃下沉淀过夜，收集沉淀33公斤；
8，洗涤真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃下充分洗涤，PH到6.5-7.0即可，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，经HPLC分析得银杏黄酮含量30.19％，银杏内酯11.05％，银杏酚酸、4-O-甲基吡哆醇，双黄酮含量均低于1PPM，收得银杏标准提取物10.15公斤。
对比例1
采用山东农业大学的银杏提取纯化工艺，乙醇浸提-树脂吸附法，工艺为：
银杏叶用70％酒精12倍叶子重量，55-60℃浸提3小时，浸提2次，合并滤液，浓缩至比重1.2，10倍水加入浸膏稀释充分搅拌，高速离心沉淀，去上清液，过D101大孔树脂柱，水洗涤树脂至无色，再用70％酒精洗脱，得洗脱液，对洗脱液浓缩，喷雾干燥得银杏叶提取物。
具体用500公斤银杏叶(分析黄酮含量0.81％，内酯0.32％)以上工艺提取得银杏叶提取物16.7公斤.
实验例1
银杏总黄酮HPLC测定(食品科技2006，03王婧等北京营养元食品研究所)
1，检测方法：
1)材料与仪器
磷酸、盐酸、甲醇、标准品(山柰素、槲皮素、异鼠李素)、纯净水
WATER 2487型高压液相色谱、超声波震荡器、DHT磁力搅拌器
2)方法
色谱条件：色谱柱钻石C18(250*4.6 5微米)柱温40℃，检测波长370nm
流动相：甲醇：0.4％磷酸＝60：40(体积比)，流速1.0ML/MIN，进样量20UL
3)定量方法：外标法
4)计算：
总黄酮＝2.51槲皮素量+2.63山奈素量+2.39异鼠李素量
实验例2
银杏内酯检测
RP-HPLC测定银杏内酯含量的方法(崔大明，长春中医药科大学，吉林农业大学学报2013、35(4))
实验例3
4-O-甲基吡哆醇测定
GC-MS检测4-O-甲基吡哆醇
实验例4
银杏酚酸测定
RP-HPLC测定银杏酚酸含量的方法(严宏凤，江苏淮阴工学院学报2008 10)
表：检测结果
| 样品 | 银杏黄酮 | 银杏内酯 | 4-O-甲基吡哆醇 | 银杏酚酸 |
| 实施例1 | 30.69％ | 11.72％ | 小于1PPM | 小于1PPM |
| 实施例2 | 30.27％ | 10.97％ | 小于1PPM | 小于1PPM |
| 实施例3 | 30.19％ | 11.05％ | 小于1PPM | 小于1PPM |
| 对比例 | 24.9％ | 6.82％ | 15毫克/公斤 | 27毫克/公斤 |
表中结果表明：对比传统提取工艺，本发明在除去银杏提取物中有害物质有明显改进效果具有良好的推广应用意义。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取原料，粉碎过18-22目筛，晒干，然后将其投入提取回流罐中；
步骤二：回流提取：加入银杏叶重量8-12倍的60-75％酒精，回流温度控制在65-70℃，回流时间为2.5-3.5小时；
步骤三：二次回流提取：加入银杏叶重量4-6倍的60-75％酒精，温度控制在65-70℃，回流时间为1.5-2.5小时；
步骤四：浓缩：合并两次回流液体，回收酒精，真空浓缩至得到比重为1.0-1.5的浸膏；
步骤五：除泡：将浸膏用8-12倍重量的纯水充分搅拌，用KOH碱化至pH 8.0-10，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，并至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得到上清液；
步骤六：大孔树脂过滤：将上清液过大孔树脂，梯度洗脱，收集40-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精，用8-12倍纯水充分搅拌，然后用盐酸酸化至PH3.5-4.5，得到酸化液；
步骤七：将步骤六得到的酸化液在0-5℃温度下沉淀过夜，收集沉淀；
步骤八：真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃温度下充分洗涤，pH值为6.5-7.0，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，银杏黄酮含量31％，银杏内酯11％，银杏酚酸低于1PPM、4-O-甲基吡哆醇低于1PPM，双黄酮含量低于1PPM；收得率为2.3％。
2.根据权利要求1所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述的筛为20目。
3.根据权利要求1所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，在步骤二和步骤三中，所述的回流温度为65℃。
4.根据权利要求1所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，在步骤四中，所述的回收酒精回收至酒精含量15％以下。
5.根据权利要求1所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，在步骤四中，所述的真空度为-0.08--0.09MPa；所述的比重为1.15-1.2。
6.根据权利要求1所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，在步骤六中，所采用的大孔树脂为D201大孔树脂。
7.根据权利要求1-6任一项所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
步骤一：准备：称取原料，粉碎过20目筛，晒干，然后将其投入提取回流罐中；
步骤二：回流提取：加入银杏叶重量10倍的65％酒精，回流温度控制在65℃，回流时间为3小时；
步骤三：二次回流提取：加入银杏叶重量5倍的65％酒精，温度控制在65℃，回流时间为2小时；
步骤四：浓缩：合并两次回流液体，回收酒精回收至酒精含量15％以下，真空浓缩至得到比重为1.15-1.2的浸膏；
步骤五：除泡：将浸膏用10倍重量的纯水充分搅拌，用KOH碱化至pH 9.0，加入0.2％吐温80，高速搅拌自动除去泡沫，并至不产生泡沫，然后高速离心除去沉淀，得到上清液；
步骤六：大孔树脂过滤：将上清液过D201大孔树脂，梯度洗脱，收集40-60％酒精洗脱液，5个BV洗脱液，回收酒精，然后用10倍纯水充分搅拌，然后用盐酸酸化至PH4.0，得到酸化液；
步骤七：将步骤六得到的酸化液在0-5℃温度下沉淀过夜，收集沉淀；
步骤八：真空干燥：对沉淀物用纯水在0-5℃温度下充分洗涤，pH值为7.0，然后真空条件下干燥得到标准银杏叶提取物，银杏黄酮含量31％，银杏内酯11％，银杏酚酸低于1PPM、4-O-甲基吡哆醇低于1PPM，双黄酮含量低于1PPM；收得率为2.3％。
8.权利要求1-7任一项所述的高纯度银杏叶标准提取物的制备方法所制得的银杏叶标准提取物。
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