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CN1481793A - 一种银杏叶提取物及含有它的注射液 - Google Patents

一种银杏叶提取物及含有它的注射液 Download PDF

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CN1481793A CNA031500544A CN03150054A CN1481793A CN 1481793 A CN1481793 A CN 1481793A CN A031500544 A CNA031500544 A CN A031500544A CN 03150054 A CN03150054 A CN 03150054A CN 1481793 A CN1481793 A CN 1481793A
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Wang Feng
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Abstract

本发明涉及一种银杏叶提取物，该提取物通过以下方法制备：鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8－10，过滤，滤液用酸调pH3－8，优选5－6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮含量。本发明还涉及银杏叶注射液，其制备包括进一步将上述提取物制成注射液。本发明的银杏叶提取物和注射液有效成分如总黄酮、银杏内酯等含量高，治疗效果优异。

Description

一种银杏叶提取物及含有它的注射液
发明领域
本发明涉及一种总黄酮、银杏内酯等含量高的银杏叶提取物，及含有它的注射液，又称为舒血宁注射液。
背景技术
银杏叶注射液在临床治疗中已使用多年，对扩张血管、改善微循环及血流变、清除自由基、减轻有害物的损害等都有很好的效果，市面上有关银杏叶制剂品种很多，如，银杏叶注射液、天宝片等。
银杏叶在9月下旬至10月上旬时总黄酮、银杏内酯有效成份含量最高，此时提取收率也最高。而干燥后的叶片中总黄酮、银杏内酯有效成份含量则有不同程度的下降，存贮时间越长含量下降越多。
现有的提取工艺都是采用干银杏叶进行提取，且提取工艺使用的有机溶剂多，如乙醇、丙酮，成本较高，技术复杂。
有鉴于此，本发明提出一种利用采收后的鲜银杏叶，高效提取总黄酮及银杏内酯有效成份并制成银杏叶注射液的方法。
发明内容
本发明采用的新鲜的银杏叶进行提取。一般来说，用当年的干银杏叶提取，总黄酮含量只能达到6％，用次年的干银杏叶提取总黄酮含量降至4％。而采用本发明的方法，用新鲜的银杏叶进行提取，总黄酮、银杏内酯、白果内酯都能达到国际标准：总黄酮达22～26％，银杏内酯达2.5～4.5％，白果内酯达2～4％。而且本发明工艺简单，有机溶剂用量也较少。
因此，本发明的目的是提供一种银杏叶提取物，该提取物通过以下方法制备：
鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8-10，过滤，滤液用酸调pH3-8，优选5-6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮及银杏内酯含量。
其中，用乙醇提取一般包括用3-8倍量50-95％，优选约70％乙醇及任选的少量抗氧化剂回流提取2-5小时，共提取2-5次。调pH的碱可以是氢氧化钙，碳酸氢钠，碳酸钠，碳酸钾等，调pH的酸例如可以是盐酸，乙酸，硫酸等。
热水提取中热水的温度例如可以是60℃到100℃，也可以更高。
冷藏的温度一般为-30℃到5℃，优选约-5到5℃，更优选约0℃。冷藏时间例如可以为2分钟到72小时，优选约1-20小时。
本发明的另一个目的是提供银杏叶注射液的制备方法，该方法包括以下工序：
鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8-10，过滤，滤液用酸调pH3-8，优选5-6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮及银杏内酯含量，获得银杏叶提取物；
将上述提取物用注射用水制成针剂，浓度使得相当于生药0.5-5g/ml注射液。
其中，用乙醇提取一般包括用3-8倍量50-95％，优选约70％乙醇及任选的少量抗氧化剂回流提取2-5小时，共提取2-5次。调pH的碱可以是氢氧化钙，碳酸氢钠，碳酸钠，碳酸钾等，调pH的酸例如可以是盐酸，乙酸，硫酸等。
热水提取中热水的温度例如可以是60℃到100℃，也可以更高。
冷藏的温度一般为-30℃到5℃，优选约-5到5℃，更优选约0℃。冷藏时间例如可以为2分钟到72小时，优选约1-20小时。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了银杏提取物，其特征在于由以下方法制备：
取鲜银杏叶洗净干燥后用带打浆机打成浆，加3-8倍量60-95％，优选约70％乙醇及抗氧化剂(例如基于鲜银杏叶总重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小时，共提取2-5次，合并醇提取液加入碱水溶液中调PH8-10，静置2-6小时，过滤，再用酸，优选盐酸回调PH3-8，减压回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量热蒸馏水搅匀煮沸10-25分钟，20-40分钟后过滤，滤渣再加热水煮两次合并滤液，冷藏过夜再次滤去不溶物，滤液上大孔树脂柱用蒸馏水洗去盐分，再用梯度乙醇从低浓度到高浓度洗脱，收集30％-80％乙醇洗脱部分，回收乙醇至无醇味，得浓银杏叶提取液，任选检测含量，获得银杏叶提取液。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了银杏叶注射液，其特征在于由以下方法制备：
银杏叶提取液的制备：取鲜银杏叶洗净干燥后用带打浆机打成浆，加3-8倍量60-95％，优选约70％乙醇及少量抗氧化剂(例如基于鲜银杏叶总重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小时，共提取2-5次，合并醇提取液加入碱水溶液中调PH8-10，静置2-6小时，过滤，再用酸，优选盐酸回调PH3-8，减压回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量热蒸馏水搅匀煮沸10-25分钟，20-40分钟后过滤，滤渣再加热水煮两次合并滤液，冷藏过夜再次滤去不溶物，滤液上大孔树脂柱用蒸馏水洗去盐分，再用梯度乙醇从低浓度到高浓度洗脱，收集30％-80％乙醇洗脱部分，回收乙醇至无醇味，得浓银杏叶提取液，任选检测含量，获得银杏叶提取液；
取上步之浓银杏叶提取液适量，补足量注射用水(相当于0.5g-5g生药/ml)并加0.05-0.25％针用活性炭，0.02％-0.06％抗氧化剂，例如NaHSO3、0.02％-0.06％EDTA-Na2煮沸5-25分钟过滤，滤液再过超微滤膜(例如分子截留量为一万的超微滤膜)，灌装，根据需要分别制成不同规格针剂，熔封后灭菌(例如100℃灭菌15-30分钟)即得可供肌注或静滴的银杏叶注射液成品。
本发明的提取原理及技术要点为：
提取全程不可遇铁，否则黄酮变黑。
抗氧剂例如NaHSO3，抗坏血酸等避免黄酮受热破坏降低收率。
鲜叶中含大量叶绿素及鞣质等杂质，在碱性乙醇中可产生沉淀去除掉。但碱性过高乃使总黄酮母核破坏故控制在PH10为佳。
用HCL回调至PH5.5时黄酮较稳定耐热利于精制。
大孔树脂选D-101型，可很好地吸附总黄酮，而CaCl2等盐分不被吸附随水分洗出。
30％乙醇可洗出双黄酮等无效成分。
EDTA-Na2(乙二胺四乙酸一二钠)可防止微量金属离子促总黄酮氧化，从而使针剂稳定。
实施例
以下通过实施例来进一步说明本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于说明，不构成对本发明范围的限制。
实施例1
取鲜银杏叶1000g，用打浆机粉碎成糊，加5000ml70％的乙醇及1gNaHSO3回流提取3小时，过滤再将滤渣同样提取2次过滤，合并3次滤液加饱和石灰水调PH10，产生污绿色沉淀，静置4小时以上，过滤，加盐酸调PH5.5，减压回收乙醇得到黑棕色粘稠物约300g，加1500ml热蒸馏水煮沸15分钟，过滤，滤渣再同样提取两次合并黄色水提液在0℃冷藏过夜过滤后上大孔树脂柱(用800g树脂可完全吸附)控制滴速至水流尽后先以30％乙醇洗杂质，至流出液无色后，再以50％乙醇洗脱至流出液无色为止，对50％乙醇洗脱液回收乙醇至无醇味得浓银杏叶提取液约450ml，检测含量，即可。
实施例2
取鲜银杏叶1000g，用打浆机粉碎成糊，加5000ml70％的乙醇及1gNaHSO3回流提取3小时，过滤再将滤渣同样提取2次过滤，合并3次滤液加饱和石灰水调PH10，产生污绿色沉淀，静置4小时以上，过滤，加盐酸调PH5.5，减压回收乙醇得到黑棕色粘稠物约300g，加1500ml热蒸馏水煮沸15分钟，过滤，滤渣再同样提取两次合并黄色水提液在0℃冷藏过夜过滤后上大孔树脂柱(用800g树脂可完全吸附)控制滴速至水流尽后先以30％乙醇洗杂质，至流出液无色后，再以50％乙醇洗脱至流出液无色为止，对50％7醇洗脱液回收乙醇至无醇味得浓银杏叶提取液约450ml，检测含量，备用。
将上步所得浓银杏叶提取液加注射用水600ml并加1g针用活性炭及0.4gNaHSO3、0.4gEDTA-Na2煮沸15分钟，趁热过滤，再用超微滤膜精滤，于充氮气条件下灌装熔封(2ml/支)于100℃灭菌15分钟，制得银杏叶注射液成品，避光保存。
试验一、本发明银杏叶注射液治疗脑梗死临床试验
本发明舒血宁注射液为银杏叶提取物制剂。其中主要分为总黄酮醇甙、银杏内脂。其有效成分能调节血管张力，改善脏器血液循环及末梢微循环。银杏内酯B具有很强的PAF受体阻断作用，抑制PAF活性，降低全血粘度，血浆粘度及血浆纤维蛋白原，改善血液流动特性，减少微血栓形成，并且它是一个较强的自由基清除剂，有较强的抗氧化和清除自由基作用。我院对入院96例急性脑梗死病人进行了疗效对比分析。
病例选择：本观察病例为住院患者，入选病人均符合1995年全国第四次脑血管会议修订标准，并经脑CT或脑MRI证实。病人治疗前后神经功能缺损评分采用欧洲评分标准。治疗组50例，重型20例、中型18例、轻型12例：对照组46例，重型21例、中型16例、轻型9例。治疗组梗死部位：基底节24例、放射冠10例、脑干2例、脑叶4例、丘脑5例、多发腔梗5例；对照组梗死部位：基底节22例、放射冠8例、脑干1例、脑叶6例、丘脑3例、多发腔梗6例。
治疗方法：治疗组舒血宁注射液(每2毫升含总黄酮醇甙1.68毫克、含银杏内脂A0.12毫克)20毫升加入5％葡萄糖氯化钠注射液250毫升静脉滴注，qd，14天为一疗程；脑多肽注射液20毫升加入5％葡萄糖氯化钠注射液250毫升静脉滴注，qd，14天为一疗程；奥力保克  10毫克，qd，po，30天为一疗程。对照组血塞通注射液8毫升加入5％葡萄糖氯化钠注射液250毫升静脉滴注，qd，14天为一疗程；脑多肽、奥力保克用法同前。两组病人依病情需要加用甘露醇等治疗，两组病人于治疗前后分别采静脉血，进行血流变学检查。
疗效判定：1、基本痊愈：临床症状和体征基本消失。2、显效：瘫痪肢体肌力恢复到4至5级，语言障碍部分恢复。3、有效：瘫痪肢体肌力2级以上，语言障碍部分恢复。4、无效：临床症状和体征无变化。5、恶化：病情加重。
结果
1、临床疗效：
                   表1、两组病人临床疗效比较
组  别 例  数  基本痊愈 显  效 有  效 无  效 恶  化
治疗组     50     8     18     20     3     1
对照组     46     4     16     18     5     3
2、血液流变学变化：
               表2：两组病人血液流变学变化
    项  目     治疗前     治疗后
治疗组 全血比粘度
全血低切比粘度 7.68±1.92  6.56±1.01
全血高切比粘度 5.51±3.01  4.92±2.66
血浆比粘度 1.53±0.18  1.21±0.21
纤维蛋白原 4.32±1.38  3.24±1.25
对照组 全血比粘度
全血低切比粘度 7.81±1.86  7.02±0.87
全血高切比粘度 6.01±2.9  5.82±2.4
血浆比粘度 1.4±60.20  1.3±80.17
纤维蛋白原 4.27±1.26  4.0±11.18
上述数据经统计学处理后，P＜0.05
两组显效率分别为85％和56％，治疗组与对照组治疗前后神经功能缺损评分减少明显(p＜0.001)两组治疗后血流变学指标间有显著差异(p＜0.05)两组比较治疗组效果更好(p＜0.05)，结论：本发明舒血宁注射液加用脑细胞活化剂及钙离子拮抗剂治疗脑梗死效果更佳。
本资料显示本发明舒血宁注射液是一种强有力的自由基清除剂，有较强的抗氧化和清除自由基作用，可减轻脑水肿，预防动脉硬化的发生，还可以抗血小板聚集，降低血浆纤维蛋白原，抑制血栓的形成，增加脑血流，可使病人反应意识加快、记忆改善，改善脑供氧状态，促进脑代谢作用，通过观察证明舒血宁注射液治疗脑梗塞疗效明显、迅速、安全，值得推广。
试验二、本发明注射液治疗急性脑梗死效果评价
资料与方法
1、研究对象 急性脑梗死患者按1995年全国第四次脑血管学术会议通过的《各类脑血管病诊断要点》，并经头颅CT或MRI证实的脑梗死患者60例，用抛币法随机分为本发明舒血宁治疗组和维脑路通对照组，治疗组男18例，女12例，年龄37-75岁，平均62.4岁，其中重型病人3例，中型病人19例，轻型病人8例；对照组男19例，女11例，年龄41-74岁，平均61.5岁；其中重型3例，中型17例，轻型10例，两组患者在年龄、性别、神经功能缺损评分、合并病和并发症经卡方检验均无显著差别。
2、治疗方法 治疗组用本发明舒血宁注射液10ml+10％葡萄糖200ml+胰岛素4u每日1次静滴，14日为1个疗程。对照组用维脑路通1g+10％葡萄糖200ml+胰岛素4u，两组均同时用毕奥星15ml+生理盐水200ml静滴14日1疗程，依病情需要加用甘露醇脱水治疗。在治疗前和14日后分别采静脉血检测NO、ET、SOD和MDA，四周后进行神经功能缺损评分和ADL评分。
3、实验室检查 全部病人于入院当天和第二天清晨采空腹血，NO用硝酸还原酶法，ET用放射免疫分析法，SOD用邻苯三酚自氧化酶法，MDA用硫代巴比妥TBA法，均铵说明书方法专业技师严格操作。
4、疗效判定 参照第四次全国脑血管病会议评分标准：基本痊愈：功能缺损减少90-100％，病残程度为0级；显著进步：功能缺损减少46-90％，病残程度为1-3级；进步：功能缺损减少18-45％；无变化：功能缺损减少或增加17％；恶化：功能缺损评分增加18％或死亡。总有效率为基本痊愈+显著进步+进步。ADL量表：显效：治疗后量表积分下降≥2/3；有效：积分下降1/3-2/3；无效：积分下降不足至1/3。
5、统计学处理  实验数据处理均经统计软件包SPSS1.0分析处理。方法采用t检验和x2检验。
结果
1、本发明注射液与对照组治疗前后实验室结果见表1。
2、本发明注射液与对照组治疗前后神经功能缺损评分见表2。
3、本发明注射液与对照治疗前后ADL积分比较见表3。
表1  本发明注射液与对照组治疗前后实验室检查比较(x±s)
组别 NO  ET  SOD MDA
治疗前  治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
本发明 59.03±11.81  36.23±14.17**▲ 88.48±15.89 66.34±9.58*▲ 49.91±12.34 62.58±18.32*▲ 4.59±1.23  4.19±1.03
对照组 54.34±9.18  40.41±5.66* 90.85±18.21 84.62±16.23  47.65±18.23 49.23±15.61 4.38±1.02  4.29±1.11
与对照组比较：*p＜0.05 **P＜0.0 1，治疗前后比较▲p＜0.05
表2
两组治疗前后神经功能缺损评分比较(X±S)
组别 例数  治疗前  治疗后
本发明 30  36.5±4.8  12.85±3.3**▲
对照组 30  34.9±6.5  24.64±5.7*
与对照组比较：*p＜0.05 **P＜0.01，治疗前后比较▲▲p＜0.01
表3  两组治疗前后ADL评分比较(X±S)
组别 例数 显效 有效 无效 总有效率
本发明 30  11  14  5  83.33▲
对照组 30  6  13  11  63.33
▲与对照组比较p＜0.01
讨论：急性脑梗死的病理生理机制复杂，与多种致病因素有关，其中NO、ET是局部血流调节因子，其动态平衡对维持脑血管舒缩功能有密切关系，当脑梗死后由于脑组织缺血缺氧，应激使ET增高，通过ET-A受体激活磷酸酯酶C产生三磷酸肌醇，继而引起Ca2+内流，并产生自由基，而NO在脑缺血时则有神经毒和神经保护双重作用。目前研究提示NO产生在最初几个小时具有神经保护作用。当脑梗死后NO迅速上升，24小时达到高峰，在脑梗死早期数分钟内产生的NO是有利的，但数小时后到数天内产生的NO则对神经有毒性。脑梗死后由于血管内皮因子的异常激发了大量自由基产生，远远超过机体的清除能力，造成自由基堆积和脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物。MDA是氧自由基攻击脂质导致过氧化物的代谢终产物，其含量反映了体内氧自由基的生成水平及其对脑组织的损伤程度。SOD可以催化超氧银离子生成H2O2和O2，SOD，可以保护脑组织，是清除氧自由基的主要指标。本研究结果提示本发明注射液可以降低NO和ET的毒性作用，.提高SOD含量，从而有效拮抗过氧化损伤，清除自由基，保护脑细胞和减少细胞凋亡。另外银杏内酯B具有很强的PAF受体阻断作用，抑制PAF活性，降低全血粘度、血浆粘度及纤维蛋白元，减少血栓形成和改善微循环，能有效治疗脑梗死而无明显毒副作用，是治疗和预防急性脑梗死的颇具应用前景的良药。

Claims (8)

1、一种银杏叶提取物，该提取物通过以下方法制备：
鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8-10，过滤，滤液用酸调pH3-8，优选5-6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮含量及银杏内酯含量。
2、根据权利要求1的银杏叶提取物，其中用乙醇提取包括用3-8倍量50-95％乙醇及任选的少量抗氧化剂回流提取2-5小时，共提取2-5次。
3、根据权利要求1的银杏叶提取物，其中冷藏的温度一般为-30℃到5℃，优选约-5到5℃，更优选约0℃，冷藏时间为2分钟到72小时，优选约1-20小时。
4、银杏叶注射液，该注射液由以下方法制备：
鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8-10，过滤，滤液用酸调pH3-8，优选5-6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮及银杏内酯含量，获得银杏叶提取物；
将上述提取物用注射用水制成针剂。
5、根据权利要求4的银杏叶注射液，其中用乙醇提取包括用3-8倍量50-95％乙醇及任选的少量抗氧化剂回流提取2-5小时，共提取2-5次。
6、根据权利要求1的银杏叶注射液，其中冷藏的温度一般为-30℃到5℃，优选约-5到5℃，更优选约0℃，冷藏时间为2分钟到72小时，优选约1-20小时。
7、银杏提取物，其特征在于由以下方法制备：
取鲜银杏叶洗净干燥后用带打浆机打成浆，加3-8倍量60-95％，优选约70％乙醇及抗氧化剂(例如基于鲜银杏叶总重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小时，共提取2-5次，合并醇提取液加入碱水溶液中调PH8-10，静置2-6小时，过滤，再用酸，优选盐酸回调PH3-8，减压回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量热蒸馏水搅匀煮沸10-25分钟，20-40分钟后过滤，滤渣再加热水煮两次合并滤液，冷藏过夜再次滤去不溶物，滤液上大孔树脂柱用蒸馏水洗去盐分，再用梯度乙醇从低浓度到高浓度洗脱，收集30％-80％乙醇洗脱部分，回收乙醇至无醇味，得浓银杏叶提取液，任选检测含量，获得银杏叶提取液。
8、银杏叶注射液，其特征在于由以下方法制备：
银杏叶提取液的制备：取鲜银杏叶洗净干燥后用带打浆机打成浆，加3-8倍量60-95％，优选约70％乙醇及少量抗氧化剂(例如基于鲜银杏叶总重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小时，共提取2-5次，合并醇提取液加入碱水溶液中调PH8-10，静置2-6小时，过滤，再用酸，优选盐酸回调PH3-8，减压回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量热蒸馏水搅匀煮沸10-25分钟，20-40分钟后过滤，滤渣再加热水煮两次合并滤液，冷藏过夜再次滤去不溶物，滤液上大孔树脂柱用蒸馏水洗去盐分，再用梯度乙醇从低浓度到高浓度洗脱，收集30％-80％乙醇洗脱部分，回收乙醇至无醇味，得浓银杏叶提取液，任选检测含量，获得银杏叶提取液；
取上步之浓银杏叶提取液适量，补足量注射用水(相当于0.5g-5g生药/ml)并加0.05-0.25％针用活性炭，0.02％-0.06％抗氧化剂，例如NaHSO3、0.02％-0.06％EDTA-Na2煮沸5-25分钟过滤，滤液再过超微滤膜(例如分子截留量为一万的超微滤膜)，灌装，根据需要分别制成不同规格针剂，熔封后灭菌(例如100℃灭菌15-30分钟)即得可供肌注或静滴的银杏叶注射液成品。
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