CN106029697A

CN106029697A - 具有经修饰的ch2-ch3序列的犬抗体

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Publication number: CN106029697A
Application number: CN201480075969.3A
Authority: CN
Inventors: M.莫塞; 张远征; I.塔佩伊
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: RU2019102939A; AU2014368450A1; US20180346570A1; JP2020014476A; US20160333096A1; BR112016014293A2; WO2015091911A3; CN106029695A; CA2932519C; US20220204615A1; AU2021200946A1; WO2015091914A3; JP2017501168A; WO2015091914A2; AU2020210142A1; CA2932567A1; EP4124624A3; CN113402609B; JP7504952B2; DK3083694T5

Abstract

本发明公开了具有特定属性的犬化抗体。本发明也公开了针对犬PD‑1的犬化鼠类抗体，其对犬PD‑1具有高结合亲和力。本发明还公开了本发明的犬化抗体在治疗狗的癌症上的用途。

Description

具有经修饰的CH2-CH3序列的犬抗体

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2014年7月30日提交的美国临时申请系列号62/030,812、于2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,847和于2014年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,946的权益，上述所有文件的内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及具有特定属性的犬化抗体。本发明也涉及针对犬PD-1的犬化抗体，其具有特定序列并对犬PD-1具有高结合亲和力。本发明还涉及本发明的抗体在治疗狗（包括癌症治疗）上的用途。

发明背景

犬抗体（也称为免疫球蛋白G或IgG）是约150 Kd的大四聚体蛋白质。每个IgG蛋白质由两条相同的、各约25 Kd的轻链和两条相同的、各约50 Kd的重链构成。犬IgG有四个已知的IgG重链亚类，且其分别被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD表示。轻链有两个类型：κ和λ链。每一条κ 或λ 轻链均由一个可变域（VL）和一个恒定域（CL）构成。两条重链中的每一条均由一个可变域（VH）和三个恒定域（称为CH-1、CH-2和CH-3）组成。CH-1域通过称为“铰链”或作为另一种叫法“铰链区”的氨基酸序列连接至CH-2域。在人类中，IgG以四个被称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类中的一类而存在。IgG的亚类很大程度上由铰链区的序列所确定，该序列在IgG的四个亚类中彼此不同。两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链也通过二硫键连接至轻链中的一条。

用木瓜蛋白酶消化IgG抗体使抗体分子在铰链区断裂而导致形成三个片段。这些片段中的两个是相同的并且各自由与重链的VH和CH1域维系在一起的轻链组成。这些片段被称为“Fab”片段，并且其含有抗体的抗原结合位点。用木瓜蛋白酶消化所得的第三个片段被称为“Fc”，并且其含有通过二硫键维系在一起的两条重链的剩余部分。Fc因而含有由两条重链各自的CH2和CH3域所组成的二聚体。Fab使得抗体能够结合其同源表位，而Fc使得抗体能够介导免疫效应器功能如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。

本领域熟知，IgG抗体通过使其Fc部分结合至一族被称为Fc_γ受体的蛋白质来介导效应器功能如ADCC和ADCP，而CDC则是通过使Fc结合至补体的第一组分，C1q，来介导的。本领域还熟知，不同的IgG亚类在其介导这些效应器功能的能力上有所不同。例如，人类IgG1显示出强ADCC和CDC，而IgG4则显示出弱乃至无ADCC和CDC。另外，用于识别哪个IgG亚类显示出或缺乏效应器功能的方法是本领域熟知的。

用于治疗目的的依赖单克隆抗体的方法需要设计相称的抗体或抗体片段以实现所需的治疗响应。例如，一些癌症治疗方法需要治疗抗体具有增强的效应器功能，而其它的则需要显著减少或完全消除效应器功能。效应器功能的增强或消除可以通过如下实现：在抗体的Fc部分引入一个或多个氨基酸突变（置换），从而增强或减少对Fc_γ受体以及补体的第一组分的结合。现有技术中有许多的报道描述了可被引入抗体分子从而调节其效应器功能的氨基酸置换。例如，Shields 等人, [J.of Biol.Chem., 276 (9):6591-6604(2001)]公开了将天冬酰胺置换为丙氨酸（N297A），其导致非糖基化的抗体，显著减少了抗体对若干Fc_γ受体的结合。另外，Shields 等人公开了将天冬氨酸置换为丙氨酸（D265A）也显著减少了抗体对Fc_γ受体的结合。N297A和D265A置换也各自显示出显著地损害CDC。还有其它类似的报道也识别出了可能减少或消除抗体的效应器功能的置换[例如，Sazinsky 等人， Proc.Nat.Acad.Sci., 105:20167-20172 (2008), Alegre 等人,Transplantation,57:1537-1543(1994),Hutchins等人,Proc.Nat.Acad.Sci.92:11980-11984 (1994), McEarchem 等人, Blood,109:1185-1192 (2007)]。

主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体（程序性细胞死亡受体1，也被称作程序性死亡受体（PD-1））是与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族的一个成员。PD-1和类似的家族成员是含有细胞外Ig可变型（V-型）结构域（其结合它的配体）和胞质尾区（其结合信号传递分子）的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传递基序：ITIM（基于免疫受体酪氨酸的抑制基序）和ITSM（基于免疫受体酪氨酸的转换基序）。

PD-1当结合至程序性细胞死亡配体1（也被称作程序性死亡配体1（PD-L1））和/或程序性细胞死亡配体2（也被称作程序性死亡配体2（PD-L2））时减弱T-细胞应答。这些配体中的任一种与PD-1的结合会负调节抗原受体信号传递。阻断PD-L1与PD-1的结合会增强肿瘤特异性的CD8+ T-细胞免疫，同时辅助免疫系统对肿瘤细胞的清除。已经报道了鼠PD-1的三维结构、以及小鼠PD-1与人PD-L1的共晶结构[Zhang 等人,Immunity 20: 337-347(2004); Lin 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-3016 (2008)] 。

PD-L1和PD-L2是含有在细胞外区域中的IgV-和IgC-样结构域以及不具有已知信号传递基序的短细胞质区域的I型跨膜配体。PD-L1和PD-L2二者组成性地表达，或者可以在多种细胞类型（包括非造血组织以及多种肿瘤类型）中诱导。PD-L1不仅在B、T、骨髓和树突细胞(DC)上表达，而且在周围细胞（诸如微血管内皮细胞和非淋巴样器官例如心脏或肺）上表达。相反，PD-L2仅存在于巨噬细胞和DC上。PD-1配体的表达模式提示，PD-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自体反应性T-和B-细胞应答。

在任何情况下，现在非常清楚的是，PD-1在至少某些人癌症中起关键作用，可能是通过介导免疫逃避。因此，PD-L1已经被证实在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数PD-L1阴性的肿瘤细胞系中可被IFN-γ诱导[Iwai 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293-12297 (2002); Strome 等人, Cancer Res., 63:6501-6505 (2003)] 。此外，已经在许多原发性人肿瘤活组织检查中鉴别出PD-1在肿瘤浸润性淋巴细胞上的表达和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。这样的肿瘤组织包括肺、肝、卵巢、子宫颈、皮肤、结肠、神经胶质瘤、膀胱、乳房、肾、食管、胃、口腔鳞状细胞、泌尿道上皮细胞和胰腺的癌症以及头和颈的肿瘤[Brown等人, J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong 等人,Nat. Med. 8: 793-800(2002); Wintterle 等人,Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome 等人,CancerRes., 63: 6501-6505 (2003); Thompson等人,Cancer Res. 66: 3381-5 (2006);Thompson 等人,Clin. Cancer Res. 13: 1757-1761 (2007); Nomi 等人,Clin.CancerRes. 13: 2151-2157. (2007)] 。更惊人的是，在肿瘤细胞上的PD-配体表达已经与跨多个肿瘤类型的人癌症患者的不良预后相关联[综述在Okazaki和Honjo, Int. Immunol. 19:813-824 (2007)] 。

此外，Nomi 等人[Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007)]证实了通过施用PD-1或PD-L1指导的抗体在侵袭性胰腺癌的鼠模型中阻断PD-L1与PD-1的结合的治疗效果。这些抗体会有效地促进肿瘤反应性的CD8+ T细胞向肿瘤中的渗透，从而导致抗肿瘤效应物（包括IFN-γ、颗粒蛋白酶B和穿孔蛋白）的上调。类似地，抗体用于阻断PD-L1和PD-1的结合的用途，会在小鼠鳞状细胞癌模型中显著地抑制肿瘤生长[Tsushima 等人,Oral Oncol.42: 268-274 (2006)] 。

在其它研究中，用PD-L1对鼠肥大细胞瘤系的转染导致当与肿瘤特异性的CTL克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗-PD-L1单克隆抗体时，裂解被恢复[Iwai 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]。在体内，显示了阻断PD-1/PD-L1相互作用会增加继承性T细胞转移疗法在小鼠肿瘤模型中的效力[Strome 等人,Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)] 。关于PD-1在癌症治疗中的作用的其它证据来自用PD-1敲除的小鼠执行的实验，其中表达PD-L1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(导致肿瘤生长和有关的动物死亡)，但是不在PD-1缺陷型小鼠中生长[Iwai Y. 等人, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)] 。近年来，针对PD-1的抗体(包括针对人PD-1的人源化鼠单克隆抗体)已经至少在人类的癌症治疗中显示了初步成功[参见例如，US 8,354,509 B2、US 8,008,449 B2和US 7,595,048 B2]。

抗-PD-1抗体还可以用在慢性病毒感染中。在急性病毒感染以后产生的记忆性CD8+ T细胞是高度功能性的，并且构成保护性免疫的一个重要组分。相反，慢性感染经常特征在于病毒特异性的T-细胞应答的不同程度的功能缺损(耗竭)，并且该缺陷是宿主不能消除持久病原体的一个主要原因。尽管功能性的效应T细胞最初在感染的早期阶段产生，它们在慢性感染的进程中逐渐丧失功能。Barber 等人[Nature 439: 682-687 (2006)]证实，用LCMV的实验室毒株感染的小鼠发展了慢性感染，导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初形成了稳健的T细胞应答，但是最终在T细胞耗竭后屈服于感染。Barber 等人发现，通过注射阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用的抗体，可以反转慢性感染的小鼠中效应T细胞的数目和功能的下降。

本文中对任何参考文献的引用不应解释为承认：这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”得到。

发明概述

本发明提供了犬抗体的可结晶片段区（cFc区），其中所述cFc已经过基因修饰以增强、降低或消除一种或多种效应器功能。在本发明的一个方面，所述经过基因修饰的cFc降低或消除一种或多种效应器功能。在本发明的另一个方面，所述经过基因修饰的cFc增强一种或多种效应器功能。

在某些实施方案中，所述经过基因修饰的cFc区是经过基因修饰的犬IgGB Fc区。在另一个此类实施方案中，所述经过基因修饰的cFc区是经过基因修饰的犬IgGC Fc区。在具体的实施方案中，效应器功能是经增强、降低或消除的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。在另一个实施方案中，效应器功能是经增强、降低或消除的补体依赖性细胞毒性（CDC）。在又另一个实施方案中，cFc区已经过基因修饰以同时增强、降低或消除ADCC和CDC。

本发明还提供了包含经基因修饰的cFc区的犬框架和/或全长重链。因此，本发明提供了抗体的全长重链，其中所述全长重链包含本发明的经基因修饰的cFc区。此类全长重链也可以与对应的犬轻（κ或λ）链结合以形成完整的抗体。在这种具体的实施方案中，所得抗体特异性结合至特定的犬抗原。在某些此类实施方案中，犬抗原为犬PD-1。在又其它的实施方案中，犬抗原为犬PD-L1。在仍其它实施方案中，犬抗原为IL-4受体α链。在又其它实施方案中，犬抗原为犬胸腺基质淋巴细胞生成素蛋白（cTSLP）[参见U.S.7,718,772 B2，其内容以引用方式全文并入本文中]。

在某些实施方案中，经基因修饰的cFc区包含SEQ ID NO: 130（或SEQ ID NO:132）的氨基酸序列，其中下列氨基酸残基中的一至七个在所示位置由另一个氨基酸残基所取代：P4、D31、N63、G64、T65、A93或P95。用于置换P4、D31、N63、G64、T65、A93和/或P95的氨基酸单独地选自其它19种标准天然存在的氨基酸之一，如下表1中所列。本发明还提供了经基因修饰的cFc区的变体，其包含的氨基酸序列与该经基因修饰的cFc区的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%的同一性，并且保留了对ADCC和/或CDC的增强、降低或消除，所述增强、降低或消除是包含SEQ ID NO: 130（或SEQ ID NO: 132）的氨基酸序列的经基因修饰的cFc区的至少50%、75%、90%、95%或更多，其中下列氨基酸残基中的一个或多个被取代：即，在P4、D31、N63、G64、T65、A93或P95处。

在其它的实施方案中，下列氨基酸残基中的二至五个在所示位置由另一个氨基酸残基所取代：P4、D31、N63、G64、T65、A93或P95。在这种具体的实施方案中，经基因修饰的cFc区包含SEQ ID NO: 130或SEQ ID NO: 132的氨基酸序列，并具有下列置换：P4A、D31A、N63A、A93G和P95A。在相关的实施方案中，经基因修饰的cFc区包含SEQ ID NO: 130或SEQID NO: 132的氨基酸序列，并具有下列置换：P4A、D31A、N63A和P95A。在其它实施方案中，经基因修饰的cFc区包含SEQ ID NO: 130或SEQ ID NO: 132的氨基酸序列，并在D31和N63处具有置换。在这种具体的实施方案中，位置31处的天冬氨酸被谷氨酸残基、天冬酰胺残基或丙氨酸残基所取代，而位置63处的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基、组氨酸残基或丙氨酸残基所取代。在这种更具体的实施方案中，经基因修饰的cFc区包含SEQ ID NO: 130或SEQ IDNO: 132的氨基酸序列，并具有下列置换：D31A和N63A。在具体的实施方案中，经基因修饰的cFc区由包含核苷酸变化的SEQ ID NO: 129或SEQ ID NO: 131的核苷酸序列编码，所述核苷酸变化对应于其所编码的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，经基因修饰的cFc区包含SEQ ID NO: 130或SEQ ID NO:132的氨基酸序列，并在A93处具有置换。在这种具体的实施方案中，所述置换为A93G。在相关的实施方案中，所述置换为A93S。如下文实施例4中所示，A93G的置换导致补体C1q结合的增强，表明了CDC活性升高。

在相关的实施方案中，经基因修饰的cFc区还包含铰链区，所述铰链区包含SEQ IDNO: 109的氨基酸序列。在其它的实施方案中，经基因修饰的Fc区还包含铰链区，所述铰链区包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列。在仍其它的实施方案中，经基因修饰的Fc区还包含铰链区，所述铰链区包含SEQ ID NO: 111的氨基酸序列。在又其它的实施方案中，经基因修饰的Fc区还包含经基因修饰的铰链区，所述经基因修饰的铰链区包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，本发明提供了犬IgGD Fc区，其具有来自犬IgGD抗体的经基因修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区。此外，本发明提供了抗体的全长重链，其中所述全长重链包含本发明的犬IgGDFc区，所述犬IgGD Fc区具有来自犬IgGD抗体的经基因修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区。此类全长重链也可以与对应的犬轻（κ或λ）链结合以形成完整的抗体。

因此，本发明提供了犬IgGD Fc区，其还包含来自犬IgGD抗体的经基因修饰的铰链区。在这种具体的实施方案中，所述犬IgGD Fc区和经基因修饰的铰链区包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其在位置10处包含脯氨酸残基（P10）。在更具体的实施方案中，所述犬IgGD Fc区和经基因修饰的铰链区由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列编码。在其它实施方案中，所述犬IgGD Fc区还包含来自犬IgGA抗体的铰链区。在这种具体的实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区由SEQ ID NO: 7的氨基酸序列编码。在仍其它实施方案中，所述犬IgGD Fc区还包含来自犬IgGB抗体的铰链区。在这种具体的实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区由SEQ ID NO: 9的氨基酸序列编码。在又其它实施方案中，所述犬IgGD Fc区还包含来自犬IgGC抗体的铰链区。在这种具体的实施方案中，所述犬IgGD cFc区和铰链区包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，所述犬IgGD cFc区和铰链区由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列编码。本发明还提供了包含这些犬IgGD Fc区和铰链区的犬化抗体。在具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段特异性结合犬程序性死亡受体1（犬PD-1）。

因此，本发明提供了对犬PD-1具有特异性和/或具有高结合亲和力的犬化抗犬PD-1抗体。在具体的实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体还有能力阻止犬PD-1结合至犬PD-L1。在特定的实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体对犬PD-1具有高结合亲和力，并且还有能力阻止犬PD-1结合至犬PD-L2。所述特异性结合犬PD-1的犬化抗体或其抗原结合片段可包含本发明的犬IgG重链和犬κ或λ轻链。在具体的实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体为犬化鼠抗-犬PD-1抗体。本发明还涉及此类犬化抗体在治疗疾病（如癌症和/或由感染引起的那些）上的用途。

在具体的实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体包含本发明的经基因修饰的cFc区。在可供选择的实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体包含犬IgGD Fc区，其具有来自犬IgGD抗体的经基因修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区。本发明还提供了此类犬化抗-犬PD-1抗体，其包含本发明的犬框架与CDR的组合，所述CDR得自小鼠抗-犬PD-1抗体，即，三个轻链CDR：CDR轻1（CDRL1）、CDR轻2（CDRL2）和CDR轻3（CDRL3），以及三个重链CDR：CDR重1（CDRH1）、CDR重2（CDRH2）和CDR重3（CDRH3）。

在具体的实施方案中，所述犬化鼠抗-犬PD-1抗体包含本发明的IgGB或IgGC的经基因修饰的cFc区，或者可选地，包含犬IgGD Fc区连同：来自犬IgGD抗体的经基因修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区，与得自小鼠抗-犬PD-1抗体的CDR的组合。此外，本发明不仅提供了如本文所详述的具有特定CDR的犬化小鼠抗-犬PD-1抗体，还进一步提供了包含下述变体的犬化小鼠抗-犬PD-1抗体：这些CDR的经保守修饰的变体以及包含（例如，共享）相同规范结构的变体。

因此，在具体的实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体还包含互补决定区（CDR），其中所述CDR具有以下规范结构：分别对应于重链CDR1、CDR2和CDR3的H1-1、H2-1和H3-6，即，重链CDR1具有1类规范结构，重链CDR2具有1类规范结构，而重链CDR3具有6类规范结构。在甚至更具体的实施方案中，对应轻链的CDR具有以下规范结构：分别对应于轻链CDR1、CDR2和CDR3的L1-3、L2-1和L3-1。在其它实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体还包含互补决定区（CDR），其中所述CDR具有以下规范结构：分别对应于重链CDR1、CDR2和CDR3的H1-1、H2-1和H3-11。在这种甚至更具体的实施方案中，对应轻链的CDR具有以下规范结构：分别对应于轻链CDR1、CDR2和CDR3的L1-2A、L2-1和L3-1。在仍其它实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体还包含互补决定区（CDR），其中所述CDR具有以下规范结构：分别对应于重链CDR1、CDR2和CDR3的H1-1、H2-2A和H3-11。在这种甚至更具体的实施方案中，对应轻链的CDR具有以下规范结构：分别对应于轻链CDR1、CDR2和CDR3的L1-2A、L2-1和L3-1。在又其它实施方案中，所述犬化抗-犬PD-1抗体还包含互补决定区（CDR），其中所述CDR具有以下规范结构：分别对应于重链CDR1、CDR2和CDR3的H1-1、H2-2A和H3-13。在这种甚至更具体的实施方案中，对应轻链的CDR具有以下规范结构：分别对应于轻链CDR1、CDR2和CDR3的L1-4、L2-1和L3-1。

在更具体的实施方案中，本发明的犬化抗体或其抗原结合片段包含一个或多个重链互补决定区1（VH CDR1），所述重链互补决定区1具有SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQID NO: 29或SEQ ID NO: 30的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链互补决定区2（VHCDR2）包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在仍另一个实施方案中，重链互补决定区3（VH CDR3）包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 146的氨基酸序列。在这种具体的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，又包含VH CDR2，其包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35的氨基酸序列。在另一个此类实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，又包含VH CDR3，其包含SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 146的氨基酸序列。在又另一个此类实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VH CDR2，其包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35的氨基酸序列，又包含VH CDR3，其包含SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 146的氨基酸序列。在仍另一个此类实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VH CDR1，其包含SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30的氨基酸序列，又包含VH CDR2，其包含SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34或SEQID NO: 35的氨基酸序列，还包含VH CDR3，其包含SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ IDNO: 38或SEQ ID NO: 146的氨基酸序列。

在具体的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段还包含轻链互补决定区1（VLCDR1），所述轻链互补决定区1包含SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO:

15的氨基酸序列。在相关的实施方案中，轻链互补决定区2（VL CDR2）包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。在仍另一个实施方案中，轻链互补决定区3（VL CDR3）包含SEQ ID NO: 22、SEQID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。在这种具体的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VL CDR1，其包含SEQ ID NO: 13、SEQ IDNO: 14或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列，又包含VL CDR2，其包含SEQ ID NO: 16、SEQ IDNO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 21的氨基酸序列。

在另一个此类实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VL CDR1，其包含SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列，又包含VL CDR3，其包含SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。在又另一个此类实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VL CDR2，其包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20或SEQID NO: 21的氨基酸序列，又包含VL CDR3，其包含SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ IDNO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。在仍另一个此类实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段既包含VL CDR1，其包含SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ IDNO: 15的氨基酸序列，又包含VL CDR2，其包含SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 21的氨基酸序列，还包含VL CDR3，其包含SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。

本发明还提供了包含SEQ ID NO: 40的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 40具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 42的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 42具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 44的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 44具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 46的氨基酸序列或与SEQ IDNO: 46具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 48的氨基酸序列或与SEQID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 50的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 50具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 52的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 52具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 54的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 54具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 56具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 58的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 58具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ IDNO: 60的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQID NO: 62的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、SEQ ID NO: 64的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列、或SEQ ID NO: 66的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列的犬化抗体或这些犬化抗体的抗原结合片段。

在具体的实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含P、A、G或S，（ii）在位置266处包含A、G或S，（iii）在位置298处包含A、G或S，（iv）在位置299处包含G、P或A，（v）在位置300处包含T、A、G或S，（vi）在位置328处包含A、G或S并且（vii）在位置330处包含P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含P、A、G或S，（ii）在位置264处包含A、G或S，（iii）在位置296处包含A、G或S，（iv）在位置297处包含G、P或A，（v）在位置298处包含T、A、G或S，（vi）在位置326处包含A、G或S并且（vii）在位置328处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含P、A、G或S，（ii）在位置271处包含A、G或S，（iii）在位置303处包含A、G或S，（iv）在位置304处包含G、P或A，（v）在位置305处包含T、A、G或S，（vi）在位置333处包含A、G或S并且（vii）在位置335处包含P、A、G或S。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含P、A、G或S，（ii）在位置269处包含A、G或S，（iii）在位置301处包含A、G或S，（iv）在位置302处包含G、P或A，（v）在位置303处包含T、A、G或S，（vi）在位置331处包含A、G或S并且（vii）在位置333处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含P、A、G或S，（ii）在位置273处包含A、G或S，（iii）在位置305处包含A、G或S，（iv）在位置306处包含G、P或A，（v）在位置307处包含T、A、G或S，（vi）在位置335处包含A、G或S并且（vii）在位置337处包含P、A、G或S。

在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含P、A、G或S，（ii）在位置266处包含A，（iii）在位置298处包含A，（iv）在位置299处包含G、P或A，（v）在位置300处包含T、A、G或S，（vi）在位置328处包含A、G或S并且（vii）在位置330处包含P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含P、A、G或S，（ii）在位置264处包含A，（iii）在位置296处包含A，（iv）在位置297处包含G、P或A，（v）在位置298处包含T、A、G或S，（vi）在位置326处包含A、G或S并且（vii）在位置328处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含P、A、G或S，（ii）在位置271处包含A，（iii）在位置303处包含A，（iv）在位置304处包含G、P或A，（v）在位置305处包含T、A、G或S，（vi）在位置333处包含A、G或S并且（vii）在位置335处包含P、A、G或S。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含P、A、G或S，（ii）在位置269处包含A，（iii）在位置301处包含A，（iv）在位置302处包含G、P或A，（v）在位置303处包含T、A、G或S，（vi）在位置331处包含A、G或S并且（vii）在位置333处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含P、A、G或S，（ii）在位置273处包含A，（iii）在位置305处包含A，（iv）在位置306处包含G、P或A，（v）在位置307处包含T、A、G或S，（vi）在位置335处包含A、G或S并且（vii）在位置337处包含P、A、G或S。

在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含A，（ii）在位置266处包含A，iii）在位置298处包含A，（iv）在位置299处包含P，（v）在位置300处包含A，（vi）在位置328处包含G并且（vii）在位置330处包含A。在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含A，（ii）在位置264处包含A，iii）在位置296处包含A，（iv）在位置297处包含P，（v）在位置298处包含A，（vi）在位置326处包含G并且（vii）在位置328处包含A。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ IDNO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含A，（ii）在位置271处包含A，iii）在位置303处包含A，（iv）在位置304处包含P，（v）在位置305处包含A，（vi）在位置333处包含G并且（vii）在位置335处包含A。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含A，（ii）在位置269处包含A，iii）在位置301处包含A，（iv）在位置302处包含P，（v）在位置303处包含A，（vi）在位置331处包含G并且（vii）在位置333处包含A。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含A，（ii）在位置273处包含A，iii）在位置305处包含A，（iv）在位置306处包含P，（v）在位置307处包含A，（vi）在位置335处包含G并且（vii）在位置337处包含A。

在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含P，（ii）在位置266处包含A、G或S，（iii）在位置298处包含A、G或S，（iv）在位置299处包含G，（v）在位置300处包含T，（vi）在位置328处包含A并且（vii）在位置330处包含P。在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO:42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含P，（ii）在位置264处包含A、G或S，（iii）在位置296处包含A、G或S，（iv）在位置297处包含G，（v）在位置298处包含T，（vi）在位置326处包含A并且（vii）在位置328处包含P。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含P，（ii）在位置271处包含A、G或S，（iii）在位置303处包含A、G或S，（iv）在位置304处包含G，（v）在位置305处包含T，（vi）在位置333处包含A并且（vii）在位置335处包含P。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含P，（ii）在位置269处包含A、G或S，（iii）在位置301处包含A、G或S，（iv）在位置302处包含G，（v）在位置303处包含T，（vi）在位置331处包含A并且（vii）在位置333处包含P。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含P，（ii）在位置273处包含A、G或S，（iii）在位置305处包含A、G或S，（iv）在位置306处包含G，（v）在位置307处包含T，（vi）在位置335处包含A并且（vii）在位置337处包含P。

在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含P，（ii）在位置266处包含A，（iii）在位置298处包含A，（iv）在位置299处包含G，（v）在位置300处包含T，（vi）在位置328处包含A并且（vii）在位置330处包含P。在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含P，（ii）在位置264处包含A，（iii）在位置296处包含A，（iv）在位置297处包含G，（v）在位置298处包含T，（vi）在位置326处包含A并且（vii）在位置328处包含P。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含P，（ii）在位置271处包含A，（iii）在位置303处包含A，（iv）在位置304处包含G，（v）在位置305处包含T，（vi）在位置333处包含A并且（vii）在位置335处包含P。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含P，（ii）在位置269处包含A，（iii）在位置301处包含A，（iv）在位置302处包含G，（v）在位置303处包含T，（vi）在位置331处包含A并且（vii）在位置333处包含P。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含P，（ii）在位置273处包含A，（iii）在位置305处包含A，（iv）在位置306处包含G，（v）在位置307处包含T，（vi）在位置335处包含A并且（vii）在位置337处包含P。

在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含P、A、G或S，（ii）在位置266处包含A、G或S，（iii）在位置298处包含A、G或S，（iv）在位置299处包含G，（v）在位置300处包含T，（vi）在位置328处包含A、G或S并且（vii）在位置330处包含P、A、G或S。在其它此类实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含P、A、G或S，（ii）在位置264处包含A、G或S，（iii）在位置296处包含A、G或S，（iv）在位置297处包含G，（v）在位置298处包含T，（vi）在位置326处包含A、G或S并且（vii）在位置328处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含P、A、G或S，（ii）在位置271处包含A、G或S，（iii）在位置303处包含A、G或S，（iv）在位置304处包含G，（v）在位置305处包含T，（vi）在位置333处包含A、G或S并且（vii）在位置335处包含P、A、G或S。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含P、A、G或S，（ii）在位置269处包含A、G或S，（iii）在位置301处包含A、G或S，（iv）在位置302处包含G，（v）在位置303处包含T，（vi）在位置331处包含A、G或S并且（vii）在位置333处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含P、A、G或S，（ii）在位置273处包含A、G或S，（iii）在位置305处包含A、G或S，（iv）在位置306处包含G，（v）在位置307处包含T，（vi）在位置335处包含A、G或S并且（vii）在位置337处包含P、A、G或S。

在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含P、A、G或S，（ii）在位置266处包含A，（iii）在位置298处包含A，（iv）在位置299处包含G，（v）在位置300处包含T，（vi）在位置328处包含A、G或S并且（vii）在位置330处包含P、A、G或S。在其它此类实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含P、A、G或S，（ii）在位置264处包含A，（iii）在位置296处包含A，（iv）在位置297处包含G，（v）在位置298处包含T，（vi）在位置326处包含A、G或S并且（vii）在位置328处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含P、A、G或S，（ii）在位置271处包含A，（iii）在位置303处包含A，（iv）在位置304处包含G，（v）在位置305处包含T，（vi）在位置333处包含A、G或S并且（vii）在位置335处包含P、A、G或S。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO:46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含P、A、G或S，（ii）在位置269处包含A，（iii）在位置301处包含A，（iv）在位置302处包含G，（v）在位置303处包含T，（vi）在位置331处包含A、G或S并且（vii）在位置333处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含P、A、G或S，（ii）在位置273处包含A，（iii）在位置305处包含A，（iv）在位置306处包含G，（v）在位置307处包含T，（vi）在位置335处包含A、G或S并且（vii）在位置337处包含P、A、G或S。

在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 40、52、56或64具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置239处包含A，（ii）在位置266处包含A，iii）在位置298处包含A，（iv）在位置299处包含G，（v）在位置300处包含T，（vi）在位置328处包含G并且（vii）在位置330处包含A。在其它此类实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 42、54、58或66具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置237处包含A，（ii）在位置264处包含A，iii）在位置296处包含A，（iv）在位置297处包含G，（v）在位置298处包含T，（vi）在位置326处包含G并且（vii）在位置328处包含A。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 44、50或60具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置244处包含A，（ii）在位置271处包含A，iii）在位置303处包含A，（iv）在位置304处包含G，（v）在位置305处包含T，（vi）在位置333处包含G并且（vii）在位置335处包含A。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 46或62具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置242处包含A，（ii）在位置269处包含A，iii）在位置301处包含A，（iv）在位置302处包含G，（v）在位置303处包含T，（vi）在位置331处包含G并且（vii）在位置333处包含A。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列（或与SEQ ID NO: 48具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列），其（i）在位置246处包含A，（ii）在位置273处包含A，iii）在位置305处包含A，（iv）在位置306处包含G，（v）在位置307处包含T，（vi）在位置335处包含G并且（vii）在位置337处包含A。

此外，本发明提供了还包含犬轻链的犬化抗体或其抗原结合片段，所述犬轻链包含SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQID NO: 102或SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。

因此，本发明还提供了包含重链和轻链的犬化抗体或其抗原结合片段，所述重链包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 72的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO: 70的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 72的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 74的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 78的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 76的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 78的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 80的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQID NO: 84的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 82的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 84的氨基酸序列。在仍另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 86的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO: 88的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 92的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 94的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。在仍另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 98的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 100的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 104的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。

本发明还提供了包含重链和轻链的犬化抗体或其抗原结合片段，所述重链包含SEQ ID NO: 40的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 72的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 72的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 78的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 46的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 78的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 48的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 50的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 84的氨基酸序列。在仍另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 52的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 90的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 56的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 58的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 96的氨基酸序列。

在仍另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 60的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO: 62的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 64的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 66的氨基酸序列，而所述轻链包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。

本发明还提供了核酸，其编码本发明的任何氨基酸序列，包含本发明的犬化抗体的CDR、cFc区、具有铰链区的cFc区以及重链和轻链。本发明还提供了包含本发明的一种或多种核酸的表达载体。本发明还提供了宿主细胞，其包含本发明的一个或多个表达载体，并且提供了使用此类宿主细胞表达本发明的犬化抗体的CDR和/或cFc区和/或具有铰链区的cFc区和/或重链和/或轻链的方法。本发明还提供了宿主细胞，其已经过基因工程改造以在不存在此类载体的情况下表达本发明的犬化抗体的CDR和/或cFc区和/或具有铰链区的cFc区和/或重链和/或轻链。在具体的实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体、多肽或宿主细胞可用于制造抗体的方法中。

在具体的实施方案中，所述抗体是重组抗体或其抗原结合片段。在相关的实施方案中，所述可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接以形成单链抗体。

在具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fab片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fab' 片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是(Fab')2片段。在仍其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是双抗体。在具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是结构域抗体。在具体的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是骆驼源化的单结构域抗体。在具体的实施方案中，所述犬化鼠抗-犬PD-1抗体或抗原结合片段会增加正在接受治疗的犬个体的免疫应答。

在某些实施方案中，当结合至犬PD-1时，所述犬化抗体或其抗原结合片段结合至下列一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144和/或SEQ ID NO: 145。

此外，本发明还提供了针对犬PD-1的犬化抗体，其包含本发明的CDR的变体，所述变体具有本文中所提供的对应的规范结构，并且/或者结合至SEQ ID NO: 144的氨基酸序列。在这种具体的实施方案中，犬化抗体-犬PD-1结合的解离常数（Kd）为1 X 10^-5 至 1 X10^-12 M。在更具体的实施方案中，针对犬PD-1的犬化抗体包含本发明的CDR的变体，所述变体具有本文所提供的对应的规范结构并且结合至SEQ ID NO: 145的氨基酸序列。本发明因此包括特异性结合犬PD-1的犬化抗体及其抗原结合片段，当其结合至犬PD-1时，所述抗体结合至SEQ ID NO: 144内的至少一个氨基酸残基。在这种具体的实施方案中，所述抗体及其抗原结合片段结合犬PD-1并且阻止犬PD-1结合至犬程序性死亡配体1（PD-L1）。

因此，在具体的实施方案中，当结合至犬PD-1时，所述犬化抗体（包含具有一个或多个变体CDR的抗体，所述抗体变体包括例如经保守修饰的变体和/或包含限定的规范结构类别的变体）结合至下列一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：SEQ ID NO:138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO:143和/或SEQ ID NO: 145。在甚至更具体的实施方案中，当结合至犬PD-1时，所述犬化抗体或其抗原结合片段结合至下列精氨酸残基中的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO: 114的R₆₂、R₆₉、R₇₂、R₇₅和R₉₀。在特定的实施方案中，当结合至犬PD-1时，所述犬化抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO: 145内的至少一个氨基酸残基。在更特定的实施方案中，当结合至犬PD-1时，所述抗体或其抗原结合片段结合至下列精氨酸残基中的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO: 114的R₆₂、R₆₉、R₇₂和R₇₅。在甚至更特定的实施方案中，当结合至犬PD-1时，所述抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO: 114的R₇₅。

本发明还提供了犬化抗体及其抗原结合片段，其以低于1 X 10^-12 M（例如，1 X10^-13 M或更低）的解离常数（Kd）结合至犬PD-1。在具体的实施方案中，所述犬化抗体及其抗原结合片段以1 X 10^-5 M 至 1 X 10^-12 M的解离常数结合至犬PD-1。在更具体的实施方案中，所述犬化抗体及其抗原结合片段以1 X 10^-7 M 至 1 X 10^-11 M的解离常数结合至犬PD-1。在仍更具体的实施方案中，所述犬化抗体及其抗原结合片段以1 X 10^-8 M 至 1 X 10^-11M的解离常数结合至犬PD-1。在又更具体的实施方案中，所述犬化抗体及其抗原结合片段以1 X 10^-8 M 至 1 X 10^-10 M的解离常数结合至犬PD-1。

本发明还提供了犬化抗体或其抗原结合片段，其以大于1 X 10⁷ M^-1s^-1的结合率（k_on）结合至犬PD-1。在具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10² M^- ¹s^-1 至 1 X 10⁷ M^-1s^-1的结合率结合至犬PD-1。在更具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10³ M^-1s^-1 至 1 X 10⁶ M^-1s^-1的结合率结合至犬PD-1。在仍更具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10³ M^-1s^-1 至 1 X 10⁵ M^-1s^-1的结合率结合至犬PD-1。在又更具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10⁴ M^-1s^-1 至 1 X 10⁵ M^-1s^-1的结合率结合至犬PD-1。

本发明还提供了犬化抗体或其抗原结合片段，其以慢于1 X 10^-7 s^-1的解离率（k_off）结合至犬PD-1。在具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10^-3 s^-1 至 1 X 10^-8 s^-1的解离率结合至犬PD-1。在更具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10^-4 s^-1 至 1 X 10^-7 s^-1的解离率结合至犬PD-1。在仍更具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段以1 X 10^-5 s^-1 至 1 X 10^-7 s^-1的解离率结合至犬PD-1。

在相关的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段激发针对肿瘤或病原体的抗原特异性记忆应答。在具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段激发体内抗体应答。在其它具体的实施方案中，所述犬化抗体或其抗原结合片段激发动物个体内的免疫应答。在更特定的实施方案中，所述动物个体为犬。在相关的实施方案中，所述动物个体为猫类。

因此，本发明的任何犬化抗体可具有一项、两项、三项、四项、五项或所有这些特性，即，前述与犬PD-1的解离常数、前述与犬PD-1结合的结合率、前述从所述犬化抗体-犬PD-1结合复合体解离的解离率、激发针对肿瘤或病原体的抗原特异性记忆应答、激发体内抗体应答和/或激发动物个体内的免疫应答。

在更具体的实施方案中，本发明的犬化抗体及其抗原结合片段结合犬PD-1并且还阻止犬PD-1结合至PD-L1。在甚至更具体的实施方案中，本发明的犬化抗体及其抗原结合片段结合犬PD-1、阻止犬PD-1结合至PD-L1并且还阻止犬PD-1结合至PD-L2。

本发明还提供了编码本发明的犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其部分的核酸。在相关的实施方案中，此类抗体或抗原结合片段可用于制备药物以治疗犬个体的癌症。可选地，或共同地，本发明提供了本发明的任何抗体或抗体片段在诊断上的用途。在又另外的实施方案中，提供了包括本文公开的任何犬化抗体或抗原结合片段的试剂盒。

本发明还包括药物组合物，其包含抗-犬抗原抗体或其结合片段（例如，抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段）连同药学上可接受的载体或稀释剂。本发明还提供了提高免疫细胞活性的方法，包括向有此需求的个体（例如，犬）施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在其它的实施方案中，所述方法用于治疗感染或传染病。在仍其它的实施方案中，本发明的犬化抗体或其抗原结合片段用作疫苗佐剂。在又另一个实施方案中，向犬施用犬化抗-TSLP抗体以治疗过敏性皮炎。

通过参考以下附图说明和详细描述会更好地理解本发明的这些和其它方面。

附图简述

图1示出了犬化单克隆抗体（mAb）针对犬PD-1的细胞外结构域的反应性，以OD 650/490对log mAb（nM）的函数的形式。通过ELISA测试了各种犬化mAb对犬PD-1的细胞外结构域的结合。所测试的四种mAb被命名为：2H9 VH4 IgGB/VL3、3B6 VH3 IgGB/ VL3、2H9 VH4 IgGB(YZZ1062)/VL3和2H9 VH4 IgGB (YZZ1068)/VL3。

图2示出了犬化mAb针对细胞表面表达的犬PD-1的反应性。通过CELISA测试了各种小鼠mAb对在CHO细胞上表达的犬PD-1的结合，以OD 450/540对log mAb（nM）的函数的形式。所测试的六种mAb被命名为：3B6 VH3/VL4、3B6 VH3/VL1、3B6 VH3/VL3、3B6 VH3/VL2、3B6VH1/VL1和3B6 m-c嵌合体。

图3示出了犬化mAb针对犬PD-1的配体阻断。测试了各种犬化mAb抑制在CHO细胞上表达的PD-1结合至PD-L1的能力（以OD 450/540对log mAb（nM）的函数的形式）。所测试的六种mAb被命名为：3B6 VH3/VL4、3B6 VH3/VL1、3B6 VH3/VL3、3B6 VH3/VL2、3B6 VH1/VL1和3B6 m-c嵌合体。

图4示出了由犬化mAb针对犬PD-1诱导的细胞因子分泌。测试了各种犬化mAb及其变体从健康狗的PBMC诱导细胞因子分泌的能力。

图5A和5B示出了犬化mAb及其变体（从1 µg/ml开始）对Fc_γRI的结合。测试了各种mAb结合至FcRI的能力。抗体被命名为：在图5A中，can 2H9 ADCC (1062) VH4/VL3、can 2H9ADCC mut 1 VH4/VL3、can 2H9 ADCC mut 2 VH4/VL3、can 2H9 IgGD VH4/VL3、can 2H9VH4/VL3和can 3B6 VH4/VL4；以及在图5B中，can 2H9 ADCC (1059) VH4/VL3、can 2H9ADCC (1060) VH4/VL3、can 2H9 ADCC (1061) VH4/VL3、can 2H9 IgGB ADCC (1068) VH4/VL3、can 2H9 VH4/VL3和can 3B6 VH4/VL4。

图6A和6B示出了犬化mAb及其变体（从1 µg/ml开始）对C1Q的结合。测试了各种mAb结合至C1Q的能力。抗体被命名为：在图6A中，can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1062) /VL3、can2H9 VH4 IgGB ADCC (mut 1)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC (mut 2)/VL3、can 2H9 VH4IgGD/VL3、can 2H9 VH4/VL3和can 3B6 VH4/VL4 IgGB；以及在图6B中，can 2H9 VH4 IgGBADCC (1059) /VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1060)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC(1061)/VL3、can 2H9 VH4 IgGB ADCC (1068)/VL3、can 2H9 VH4/VL3 IgGB和can 3B6VH4/VL4 IgGB。

图7A示出了犬PD-1与犬化抗体2G9之间交界面的表征。氨基酸位置是相对于不含信号序列的PD-1氨基酸序列，即，SEQ ID NO: 114。测定是通过化学交联、高质量MALDI质谱法和nLC-Orbitrap质谱法进行的。

图7B示出了犬PD-1与犬化抗体3B6之间交界面的表征。氨基酸位置是相对于不含信号序列的PD-1氨基酸序列，即，SEQ ID NO: 114。测定是通过化学交联、高质量MALDI质谱法和nLC-Orbitrap质谱法进行的。

发明详述

缩写

贯穿本发明的详细描述和实例，将使用以下缩写：

ADCC 抗体依赖性细胞毒性

CDC 补体依赖性细胞毒性

CDR 在免疫球蛋白可变区中的互补性决定区，针对人类抗体使用Kabat编号系统定义

CHO 中国仓鼠卵巢

EC50 导致50%效力或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体框架区：不包括CDR区域的免疫球蛋白可变区。

HRP 辣根过氧化物酶

IFN 干扰素

IC50 导致50%抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, Md. (1991)]开创的人类抗体免疫球蛋白比对和编号系统

mAb 单克隆抗体(也表示为Mab或MAb)

MES 2-(N-吗啉代)乙磺酸

MOA 作用机理

NHS 正常人血清

PCR 聚合酶链式反应

PK 药代动力学

SEB 葡萄球菌属肠毒素B

TT 破伤风类毒素

V区域在不同抗体之间在序列上可变的IgG链区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区。

定义

为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文件别处特别地定义，本文中使用的所有其它技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文（包括所附权利要求书）中使用的，词语的单数形式诸如“一个/种”和“所述”包括它们的对应复数形式，除非上下文另外清楚地指明。

“活化”在应用于细胞或受体时表示用配体活化或处理细胞或受体，除非上下文另外指出或明确地指出。“配体”包括天然的和合成的配体，例如，细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和从抗体衍生出的结合化合物。“配体”也包括小分子，例如，细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可以表示被内部机制以及被外部或环境因子调节的细胞活化。

分子的“活性”可以描述或表示分子与配体或与受体的结合，表示催化活性；表示刺激基因表达或细胞信号传递、分化或成熟的能力；表示抗原活性，表示其它分子的活性的调节等。分子的“活性”还可以表示调节或维持细胞-与-细胞相互作用(例如，粘附）的活性，或维持细胞的结构(例如，细胞膜或细胞骨架）的活性。“活性”也可以是指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫学活性]/[mg蛋白]，在生物区室中的浓度等。“活性”可以表示先天性或适应性免疫系统的组分的调节。

“施用”和“处理”当应用于动物(例如，犬实验受试者）、细胞、组织、器官或生物流体时表示外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物(例如，犬受试者、细胞、组织、器官或生物流体）的接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞发生接触。“施用”和“处理”也指用试剂、诊断剂、结合化合物或用另一种细胞体外和先体内后体外处理(例如，细胞）。

术语“个体”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬、猫或人)，且最优选犬。

如本文所用，术语“猫”指代猫科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，如猫亚科的任何成员，例如猫、狮子、老虎、美洲狮、美洲虎、豹、雪豹、黑豹、北美山狮、猎豹、猞猁、短尾猫、山猫或其任何杂交品种。猫还包括家养猫、纯种和/或杂种的伴侣猫、观赏猫、实验室猫、克隆猫以及野生或流浪猫。

如本文中所用，在氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“置换氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“取代氨基酸残基”，并且代表了在氨基酸序列的特定位置处的具体氨基酸残基已经由不同的氨基酸所取代（或置换）。例如，一种此类置换（取代）记为IgGB或IgGC氨基酸序列Fc区的P4A，在这种情况下，IgGB Fc区或IgGC Fc区的氨基酸序列中位于氨基酸位置4处的脯氨酸残基已经被丙氨酸残基所置换（取代）。

因此，此类氨基酸置换可以经过特别设计，即，通过例如重组DNA技术在氨基酸序列中的特定位置处有目的地用丝氨酸取代丙氨酸。可选地，抗体的特定氨基酸残基或氨基酸残基串可以通过更天然的选择过程而被一个或多个氨基酸残基所取代，例如，基于细胞产生的抗体结合至抗原上给定区域（例如，含有表位或其部分）的能力，并且/或者使得该抗体包含特定的CDR，所述CDR保持与其所取代的CDR相同的规范结构。此类置换/取代可以导致“变体”CDR和/或抗体。

“治疗”或“处理”是指给犬个体或患者在内部或在外部施用治疗剂，诸如含有本发明的任何抗体或抗原结合片段的组合物，所述犬个体或患者具有一种或多种疾病征状或疑似具有疾病，所述药剂对所述疾病征状或疾病具有治疗活性。

通常地，所述药剂以有效地减轻和/或改善接受治疗的个体或群体中的一种或多种疾病征状的量施用，无论是通过诱导这样的征状的消退还是在任何临床上可测量的程度上抑制这样的征状的进展。有效地减轻任何具体疾病征状的治疗剂的量(也被称作“治疗有效量”)可以随因素诸如患者(例如，犬)的疾病状态、年龄和重量以及药物组合物在个体中引起期望应答的能力而变化。疾病征状是否已经减轻或改善，可以通过兽医或其它熟练的健康护理提供者通常地使用的任何临床测量来评估，以评估该征状的严重程度或进展状态。尽管本发明的一个实施方案(例如，治疗方法或制成品)可能不会有效地减轻每名个体中的靶疾病征状，但是它会减轻统计上显著数目的个体中的靶疾病征状，如通过本领域已知的任何统计检验来确定的，诸如Student's t-检验、chi2-检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验。

“治疗”当应用于人类、兽类(例如，犬)或研究个体时表示治疗性处理以及研究和诊断应用。“治疗”当应用于人类、兽类(例如，犬)或研究个体或细胞、组织或器官时包括本发明的犬化抗体或抗原结合片段与犬或其它动物个体、细胞、组织、生理学隔室或生理学流体的接触。

已发现，犬PD-1包含SEQ ID NO: 114的氨基酸序列[提交于2013年12月20日的美国临时专利申请号61/918,946，其内容在此全文并入本文]。在特定的实施方案中，犬PD-1由包含SEQ ID NO: 113的核苷酸序列的核酸编码。

已发现，犬PD-L1包含SEQ ID NO: 120的氨基酸序列[提交于2013年12月20日的美国临时专利申请号61/918,946，同上]。在特定的实施方案中，犬PD-L1由包含SEQ ID NO:119的核苷酸序列编码。

术语“免疫应答”表示例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞产生的可溶性大分子或肝(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致对癌细胞、被病原体感染的细胞或组织、或侵入病原体的选择性损伤、破坏、或从哺乳动物体内(例如，犬体内)消除。

犬化抗-犬抗原抗体

如本文所用的术语“犬”包括所有家养狗、狼犬（Canis lupus familiaris）或家犬，除非另外指出。

如本文所用，抗体被称为特异性结合至包含给定抗原序列（在这种情况下，犬抗原氨基酸序列的一部分，例如，犬PD-1）的多肽，如果其结合至包含所述犬抗原氨基酸序列的那一部分（例如犬PD-1）的多肽，但不结合至缺乏所述犬抗原氨基酸序列的那一部分（例如犬PD-1）的其它犬蛋白质。例如，特异性地结合包含犬PD-1的多肽的抗体可以结合犬PD-1的经FLAG®标签的形式，但将不会特异性结合其它经FLAG®标签的犬蛋白质。抗体或源于抗体的抗原结合位点的结合物“特异性”结合至其犬抗原或其变体或突变蛋白，当其对所述犬抗原或其变体或突变蛋白的亲和力比其对任何其它经测试的犬抗原的亲和力至少大10倍、更优选至少大20倍以及甚至更优选至少大100倍时。

如本文中所用，术语“抗体”指代表现出所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其采用最宽泛的意义并且具体包括但不限于单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、犬化抗体、全犬源抗体、嵌合抗体和骆驼源化单域抗体。“亲本抗体”是在对抗体进行修饰以用于预期用途（如对抗体进行犬化以用作犬治疗抗体）之前通过将免疫系统暴露于抗原而得到的抗体。

如本文中所用，除非另外指明，“抗体片段”或“抗原结合片段”指代抗体的抗原结合片段，即保留了特异性结合至被全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留了一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；纳米抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的C_H1及可变区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成双硫键。“Fab片段”可以是抗体的木瓜蛋白酶裂解产物。

“可结晶片段”（“Fc”）区含有包含抗体的C_H2和C_H3结构域的两个重链片段（即，两条相同的多肽）。所述两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过所述CH3结构域的疏水相互作用而维系在一起。在本发明中，所述四个犬IgG Fc片段中每一个的氨基酸序列是基于识别出的C_H1和C_H2结构域的边界，所述边界如Tang等人[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270 (2001)]所确定。

“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的一部分或片段，所述重链的一部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及C_H1与C_H2结构域之间的区域，使得两个Fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，从而形成F(ab')₂分子。

“F(ab')₂片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链在C_H1与C_H2结构域之间含有恒定区的一部分，使得所述两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')₂片段由两个Fab’片段构成，所述两个Fab’片段通过所述两条重链之间的二硫键维系在一起。“F(ab')₂片段”可以是抗体的胃蛋白酶裂解产物。

“Fv区”包含重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。

术语“单链Fv”或“scFv”抗体指代包含抗体的V_H和V_L域的抗体片段，其中这些域存在于单个多肽链中。通常，所述Fv多肽还包含V_H和V_L域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。[参见，Pluckthun, The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, 113卷 Rosenburg 和 Moore 编撰, Springer-Verlag, New York, 第269-315页 (1994); WO 88/01649; 以及U.S.4,946,778 和 U.S.5,260,203.]

如本文中所用，术语“规范结构”指代抗体的重链和轻链的高变区中每一个在其所处的框架内所采用的局部构象。对于每个高变区，存在少量的规范结构（通常用简单整数如1或2等表示），其可以从对应的高变区的氨基酸序列以高准确度预测（尤其是在其框架的氨基酸序列内的背景下，如下文中为对应的犬化鼠抗-犬PD-1的可变域所提供的）。可以根据对给定CDR的氨基酸序列的修饰是否将导致结合至其抗原结合伴侣的能力保持或丧失，来确定这些规范结构[参见，Chothia 和 Lesk, Canonical Structures for the hypervariableregions of immunoglobulins, J. Mol.Biol.196:901-917(1987); Chothia 等人,Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions, Nature, 34:877-883(1989); 以及 Al-Lazikani 等人, Standard Conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins,J. Mol.Biol.273:927-948 (1997)]。

“域抗体”是具有免疫功能的免疫球蛋白片段，其仅含有重链的可变区或轻链的可变区。在某些情况下，两个或更多个V_H区通过肽接头共价地接合以生成二价域抗体。二价域抗体的两个V_H区可以靶向相同或不同的抗原。

“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在某些情况下，这两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的（见下）。

在某些实施方案中，本文中的单克隆抗体还包括骆驼源化单域抗体。[参见, 例如, Muyldermans 等人, Trends Biochem.Sci.26:230 (2001); Reichmann 等人, J.Immunol.Methods 231:25 (1999); WO 94/04678; WO 94/25591; U.S.6,005,079]。在一个实施方案中，本发明提供了包含两个V_H域的单域抗体，所述V_H域经修饰而形成了单域抗体。

如本文中所用，术语“双抗体”指代具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接至同一条多肽链中的轻链可变域（V_L）的重链可变域（V_H）（V_H-V_L或V_L-V_H）。通过使用太短以致在同一条链上的两个域之间无法形成配对的接头，迫使这些域与另一条链的互补域配对并生成两个抗原结合位点。[参见, EP 0 404 097 B1; WO 93/11161; 和Holliger 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448 (1993)]。有关经工程改造的抗体变体的综述[通常参见Holliger和Hudson Nat.Biotechnol.23:1126-1136 (2005)]。

通常，本发明的抗体或抗原结合片段保持了其犬PD-1结合活性的至少10%（当与亲本抗体相比时），当该活性以摩尔为基础表示时。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保持了亲本抗体的犬抗原（例如，PD-1）结合亲和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多。还预期，本发明的犬化抗体或抗原结合片段可包含不会实质性改变其生物活性的保守或非保守氨基酸置换（称为抗体的“保守变体”或“功能保守的变体”）。

“分离的抗体”指代纯化状态，并且在此背景下意指所述分子基本上不含其它生物分子（如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物）或其它物质（如细胞碎片和生长培养基）。通常，术语“分离的”并非旨在指代完全不存在此类物质或指代不存在水、缓冲液或盐，除非其存在会在实质上妨碍本文所述的结合物的实验或治疗用途。

如本文中所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变域和来自第二抗体的恒定域的抗体，其中所述第一和第二抗体来自不同物种。[U.S. 4,816,567; 和 Morrison 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855 (1984)] 。通常，所述可变域得自来源于实验动物的抗体（“亲本抗体”），如啮齿动物，而所述恒定域序列得自动物个体抗体，例如，犬，使得相比所述亲本（例如，啮齿动物）抗体，所得嵌合抗体将不太可能在犬个体中诱发不良免疫应答。

如本文中所用，术语“犬化抗体”指代含有来自犬和非犬（例如，鼠类）抗体二者的序列的抗体形式。通常，基本上所有的犬化抗体将包含至少一个（而通常是两个）可变域，其中所有或基本上所有高变环均对应于非犬免疫球蛋白的那些（例如，如下所示例，包含6个鼠抗-犬PD-1的CDR），以及所有或基本上所有的犬框架。

术语“全犬源抗体”指代仅包含犬免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在源于小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全犬源抗体可能含有小鼠糖链。类似地，“小鼠抗体”指代仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。可选地，如果其是在大鼠中、在大鼠细胞中或在源于大鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全犬源抗体可能含有大鼠糖链。类似地，“大鼠抗体”指代仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。

每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，一般来讲，完整地抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，所述两个结合位点一般来讲是相同的。

通常，重链和轻链二者的可变域包含三个高变区，也被称为互补决定区（CDR），位于相对保守的框架区（FR）内。CDR通常侧面与所述框架区相接，使得能够结合至特定的表位。通常，从N末端到C末端，轻链和重链可变域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根据Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, 等人;National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 第5版; NIH Publ.No. 91-3242(1991);Kabat, Adv.Prot.Chem.32:1-75 (1978);Kabat, 等人, J. Biol.Chem.252:6609-6616 (1977);Chothia, 等人, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987) 或 Chothia, 等人, Nature 342:878-883 (1989)中的定义，将氨基酸分配到人类抗体的各个域中。

如本文中所用，术语“高变区”指代抗体上负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”（即，轻链可变域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3）的氨基酸残基。[参见Kabat 等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991), 通过序列定义人类抗体的CDR区; 还参见 Chothia 和Lesk, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987)，通过结构定义抗体的CDR区]。如本文中所用，术语“框架”或“FR”残基指代除了本文中定义为CDR残基的高变区残基以外的那些可变域残基。

如本文所用，术语“犬框架”指代除本文中定义为CDR残基的高变区残基以外的犬抗体的重链和轻链的氨基酸序列，在两种链中，天然犬CDR的氨基酸序列均被对应的外源CDR（例如，来自小鼠抗体的那些）所取代。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可含有一些外源非CDR残基，例如，以便在犬抗体内保持所述外源CDR的构象，并且/或者改变Fc功能，如下文所示例。

如本文中所用，“抗-犬PD-1抗体”指代针对犬PD-1的（在哺乳动物如小鼠或兔子中）并且特异性结合至犬PD-1的抗体。“特异性结合至犬PD-1”的抗体或“特异性结合至包含SEQ ID NO: 114的氨基酸序列的多肽”的抗体，是相比其它抗原表现出优先结合至犬PD-1的抗体，例如，“特异性”结合犬PD-1。所述结合不需要绝对的结合特异性。如果其结合对样品中犬PD-1的存在起决定性作用，或者如果其能够改变犬样品中犬PD-1的活性而不会过度干涉其它分子的活性，例如，不会产生不期望的结果如诊断背景下的误诊或在治疗背景下的副作用，那么抗-犬PD-1抗体被认为特异于犬PD-1。抗-犬PD-1抗体所需的特异性程度可取决于所述抗体的预期用途，并且速率由其对预期目的的适用性所限定。

因此，本发明提供了（例如，特异性地）结合犬PD-1的犬化抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段（包括分离形式）以及此类抗体或其片段的用途。在特定的实施方案中，提供了来自鼠抗-犬PD-1抗体的鼠抗-犬PD-1 CDR，已经证明，其既结合犬PD-1又阻止犬PD-1结合至其配体中的至少一种，例如，犬PD-L1。可以将这些CDR插入到本发明的经修饰的犬框架中，以制得犬化鼠抗-犬PD-1抗体，如本文所示列。

更具体地讲，本发明的“犬化鼠抗-PD-1抗体”指代这样的抗体，其包含来自鼠抗-犬PD-1抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR，连同犬框架或经修饰的犬框架。经修饰的犬框架包含如本文所示例的一个或多个氨基酸变化，所述变化进一步优化了所述犬化抗体的有效性，例如，以增强、降低或消除抗体效应器功能；以提高其对犬抗原（例如，犬PD-1）的结合并且/或者提高其阻止犬抗原（例如，犬PD-1）结合至其天然结合伴侣（例如，在这种情况下是犬PD-L1，其中抗原为犬PD-1）的能力。

“同源性”表示当将它们最佳地比对时两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当在两个对比的序列中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共有的同源位置的数目除以对比的位置的总数×100。例如，当将序列最佳地比对时，如果两个序列的10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么所述两个序列是60%同源的。通常，当比对两个序列以给出最大同源性百分比时，做出所述对比。

“分离的核酸分子”是指基因组、mRNA、cDNA或合成起源或它们的某种组合的DNA或RNA，所述DNA或RNA与在自然界中在其中发现所述分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分无关，或与在自然界中它没有与其连接的多核苷酸连接。为了本公开内容的目的，应当理解，包含特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整的染色体。除了指定的序列以外，分离的“包含”特定核酸序列的核酸分子还可以包括，多达10个或甚至多达20个或更多个其它蛋白或其部分或片段的编码序列，或可以包括可操作地连接的控制列举的核酸序列的编码区的表达的调节序列，和/或可以包括载体序列。

短语“控制序列”指代在特定宿主生物体中表达经可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子、任选地操纵子序列以及核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。

当将其与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“可操作连接的”。例如，前序列或分泌型前导的DNA被可操作连接至多肽的DNA，如果其作为前蛋白表达而参与了该多肽的分泌；启动子或增强子被可操作连接至编码序列，如果其影响了该序列的转录；或者核糖体结合位点被可操作连接至编码序列，如果其被布置成便于翻译。通常，“可操作地连接的”是指，被连接的DNA序列是连续的，且在分泌型前导序列的情况下，是连续的且在阅读相中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在便利的限制性位点处的连接反应而完成。如果不存在此类位点，则根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头（adaptor）或连接基（linker）。

如本文中所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称均包括后代。因此，词语“转化子”和“经转化的细胞”包括原发性个体细胞以及源于其的培养物，而无论转移的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所以并非所有后代均将具有完全相同的DNA内容。包括了在经初始转化的细胞中所筛选出的具有相同功能或生物活性的突变后代。当有意采用不同的名称时，其（区别）从上下文中将是明确的。

如本文中所用，“种系序列”指代未经重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用未经重排的免疫球蛋白序列的任何合适来源。人类种系序列可得自，例如，美国国家卫生研究院（National Institutes of Health）国家关节炎和肌肉骨骼及皮肤病研究所（NationalInstitute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases）网站上的JOINSOLVER®种系数据库。小鼠种系序可得自，例如，如Giudicelli等人，[Nucleic AcidsRes.33:D256-D261 (2005)]中所述。

犬化抗体的特性

在犬中，存在称为A、B、C和D的四种IgG重链。这些重链代表了四个不同的狗IgG亚类，被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。这四种重链的DNA和氨基酸序列由Tang等人首次识别出[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270 (2001)]。这些重链的氨基酸和DNA序列也可得自GenBank数据库。例如，IgGA重链的氨基酸序列具有登录号AAL35301.1，IgGB具有登录号AAL35302.1，IgGC具有登录号AAL35303.1，而IgGD具有登录号（AAL35304.1）。犬抗体还包含两种类型的轻链，κ和λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列可得自GenBank数据库。例如，κ轻链氨基酸序列具有登录号ABY 57289.1，而λ轻链具有登录号ABY 55569.1。在本发明中，所述四个犬IgG Fc片段中每一个的氨基酸序列是基于识别出的CH1和CH2结构域的边界，所述边界由Tang等人（同上）确定。

开发治疗性单克隆抗体是一个复杂的过程，其需要协调一套复杂的活动以生成所需的抗体。这些包括优化抗体的特异性、亲和力、功能活性、在经工程改造的细胞系中的表达水平、长期稳定性；消除或增强效应器功能；以及开发商业上可行的制造和纯化方法。考虑到本发明的目标，并且除了活化免疫系统细胞的能力之外，针对犬PD-1的犬化或犬单克隆抗体最优地具有三项额外的属性：

1. 缺乏效应器功能如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）；

2. 相对长的体内半衰期；和

3. 易于使用工业标准技术（如基于蛋白质A层析的技术）进行大规模纯化。

没有任何天然存在的犬IgG亚类满足所有这些标准。例如，虽然IgGB可以使用蛋白质A纯化，但其具有高水平的ADCC活性。IgGC也具有相当高的ADCC活性。另一方面，虽然IgGA弱结合至蛋白质A，但其显示出不期望的ADCC活性。此外，IgGC和IgGD均不能在蛋白质A柱上纯化，尽管IgGD未显示出ADCC活性。另外，IgGC具有短的血清半衰期，因为其不结合至犬FcRn受体。本发明通过提供经修饰的特异于犬抗原（例如，犬PD-1）的犬IgG抗体而克服了这个难题；此类抗体缺乏效应器功能（如ADCC和CDC）、表现出相对长的半衰期并且可以使用工业标准的蛋白质A层析容易地进行纯化。

迄今为止，先前尚未描述过如下的经基因修饰的犬IgG：其同时缺乏ADCC和CDC效应器功能并且另外，可以通过蛋白质A层析法进行纯化。如本文中所公开的，在犬IgG中的一个位置上的单个置换（类似于人类或小鼠IgG中的置换）如N297A或D265A，不会完全消除对应的犬抗体中的ADCC和CDC效应器功能。例如，虽然人类或鼠类抗体的N297和D265置换各自均导致废除了对Fc_γ受体和C1q的结合，但是单独的置换均没有完全废除犬抗体对C1q的结合。相反，如下文进一步公开的，为了在IgGB或IgGC亚类的犬抗体中同时消除ADCC和CDC，其证明了有必要在犬抗体的Fc中产生双重置换，所述双重置换同时结合了天冬酰胺至丙氨酸置换和天冬氨酸至丙氨酸置换。此外，完全出乎意料地，一个已经证明在人类抗体中降低效应器功能的置换竟然导致对应的犬IgG对Fc_γR和C1q的结合增加。

为了生成缺乏效应器功能的犬IgGB和IgGC的变体，可以生成经修饰的犬IgGB或经修饰的犬IgGC重链。识别出了同时存在于这些犬可结晶片段区（cFc）中的总共七个氨基酸残基，以用于此类可能的置换。这七个氨基酸残基是：P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95，在SEQ ID NO: 130的氨基酸序列（就犬IgGB Fc而言）和SEQ ID NO: 132的氨基酸序列（就犬IgGC Fc而言）中皆如此。因此，SEQ ID NO: 2的氨基酸序列不同于SEQ ID NO: 130的氨基酸序列，因为其在位置：4、31、63、64、65、93和95处的氨基酸残基分别是脯氨酸（P）、天冬氨酸（D）、天冬酰胺（N）、甘氨酸（G）、苏氨酸（T）、丙氨酸（A）和脯氨酸（P），而在SEQ ID NO: 130的氨基酸序列中，全部七个位置均为“X”（或三字母代码“Xaa”），意味着这七个氨基酸位置可以是二十个天然氨基酸中的任一个（参见下表1的第1列中的列表）。类似地，SEQ ID NO:4的氨基酸序列不同于SEQ ID NO: 132的氨基酸序列，因为其在位置4、31、63、64、65、93和95处的氨基酸残基在全部七个位置上均被列为“X”（或三字母代码“Xaa”），意味着这七个氨基酸位置可以是二十个天然氨基酸中的任一个。SEQ ID NO: 2的氨基酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码，而SEQ ID NO: 4的氨基酸序列由SEQ ID NO: 3的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，所述cFc包含SEQ ID NO: 130的氨基酸序列，并具有下列置换：P4（A、G或S）、D31（A、G或S）、N63（A、G或S）、G64（A或P）、T65（A、G或S）、A93（G或S）和P95（A、G或S）；其中P4（A、G或S）表示在位置4处的脯氨酸残基被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸残基所取代，而类似地，G64（A或P）表示在位置64处的甘氨酸残基被脯氨酸或丙氨酸残基所取代，等等。在具体的实施方案中，所述cFc包含SEQ ID NO: 130的氨基酸序列，并具有下列置换：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。

在相关的实施方案中，所述cFc包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列，其含有7个标为Xaa的氨基酸，并具有下列氨基酸残基：A4、A31、A63、G64、T65、G93和A95，即，在SEQ ID NO:132的氨基酸序列的基础上具有下列五（5）个氨基酸残基变化：P4A、D31A、N63A、A93G和P95A，而所述七个氨基酸残基中剩余的两个，G64和T65，依然保持来自SEQ ID NO: 132的氨基酸序列不变。

SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 66的氨基酸序列在七个氨基酸位置处均含有“X”（或三字母代码“Xaa”），意味着这七个氨基酸位置可以是列于下表1的第1列中的二十个天然氨基酸中的任一个。值得注意的是，SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64和SEQID NO: 66在其各自的序列内包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。在所述氨基酸序列的这七个位置中的一处或多处的氨基酸残基的特定实例在上下文中均有描述，并且因此被包括在SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO: 66的单独氨基酸序列的种类里，以及包含这些序列的犬化抗体内。

下文中提供的表10将cIgGB Fc（SEQ ID NO: 130和SEQ ID NO: 2）和cIgGC Fc（SEQ ID NO: 132和SEQ ID NO: 4）的所述可被取代的七个氨基酸位置（如本文所公开）与包含这些cFc氨基酸序列（即，SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64和SEQ ID NO: 66）的全长犬重链的所述位置具体关联起来。因此，可以通过使用下表10而容易地将全长序列IgGB或IgGC中的实际位置与其包含的cFc的所述位置对应起来。

在具体的实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 40、52、56或64，其（i）在位置239处包含P、A、G或S，（ii）在位置266处包含D、A、G或S，（iii）在位置298处包含N、A、G或S，（iv）在位置299处包含G、P或A，（v）在位置300处包含T、A、G或S，（vi）在位置328处包含A、G或S并且（vii）在位置330处包含P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 42、54、58或66，其（i）在位置237处包含P、A、G或S，（ii）在位置264处包含D、A、G或S，（iii）在位置296处包含N、A、G或S，（iv）在位置297处包含G、P或A，（v）在位置298处包含T、A、G或S，（vi）在位置326处包含A、G或S并且（vii）在位置328处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 44、50或60，其（i）在位置244处包含P、A、G或S，（ii）在位置271处包含D、A、G或S，（iii）在位置303处包含N、A、G或S，（iv）在位置304处包含G、P或A，（v）在位置305处包含T、A、G或S，（vi）在位置333处包含A、G或S并且（vii）在位置335处包含P、A、G或S。在仍其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 46或62，其（i）在位置242处包含P、A、G或S，（ii）在位置269处包含D、A、G或S，（iii）在位置301处包含N、A、G或S，（iv）在位置302处包含G、P或A，（v）在位置303处包含T、A、G或S，（vi）在位置331处包含A、G或S并且（vii）在位置333处包含P、A、G或S。在又其它实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO: 48，其（i）在位置246处包含P、A、G或S，（ii）在位置273处包含D、A、G或S，（iii）在位置305处包含N、A、G或S，（iv）在位置306处包含G、P或A，（v）在位置307处包含T、A、G或S，（vi）在位置335处包含A、G或S并且（vii）在位置337处包含P、A、G或S。

本发明还提供了经修饰的犬IgGD，其包含来自IgGA、IgGB或IgGC的铰链区以取代其天然IgGD铰链区。可选地，可以如表5中所示通过用脯氨酸残基取代丝氨酸残基来基因修饰所述IgGD铰链区。此类修饰可导致缺乏fab臂交换的犬IgGD。可以使用重组DNA技术的标准方法来构建所述经修饰的犬IgGD[例如，Maniatis 等人, Molecular Cloning, ALaboratory Manual (1982)]。为了构建这些变体，编码犬IgGD氨基酸序列的核酸可以经修饰从而编码所述经修饰的IgGD。然后将所述经修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白质表达。编码所述具有置换的铰链区的犬IgGD Fc的核酸由SEQ ID NO: 7、9和11的核苷酸序列示例，其编码SEQ ID NO: 8、10和12的氨基酸序列。编码具有经修饰的IgGD铰链区的犬IgGD Fc的核酸包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。

本发明还提供了全长犬重链，其可以与对应的轻链匹配以得到犬化抗体。因此，本发明还提供了犬化鼠抗-犬抗原抗体（包括分离的犬化鼠抗-犬PD-1抗体）和使用所述抗体或其抗原结合片段治疗疾病（例如，在犬中治疗癌症）的方法。

此外，本发明提供了犬化鼠抗-犬PD-1抗体或抗原结合片段，其结合至犬PD-1并且阻止犬PD-1结合至犬PD-L1。在某些实施方案中，所述犬化鼠抗-犬PD-1抗体包含如本文所述的经修饰的犬IgGB Fc、经修饰的犬IgGC Fc或经修饰的缺乏fab臂交换的犬IgGD。

所述结合犬抗原（例如，犬PD-1）的抗体或其抗原结合片段可包含一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的鼠抗-犬抗体的互补决定区（CDR）。所述一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR可以独立地选自下文提供的那些的CDR序列。在另外的实施方案中，所述结合PD-1的抗体或其抗原结合片段包含犬抗体κ轻链和犬抗体重链IgG，所述轻链包含鼠类轻链CDR-1、CDR-2和/或CDR-3，所述重链包含鼠类重链CDR-1、CDR-2和/或CDR3。因此，本发明还提供了全长犬重链，其可以与例如对应的轻链匹配以得到犬化抗体[参见下表2，其中提供了七组鼠抗-犬PD-1 CDR的序列，例如，1B5、2G9、2H9、3B6、4D12、5G5和7C9]。

在其它实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PD-1并且具有犬抗体κ轻链和犬抗体重链IgG，同时仍然具有所需的结合与功能特性，所述轻链包含一至六个不同的CDR，所述CDR与SEQ ID NO: 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和/或26的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性，所述重链包含一至六个不同的CDR，所述CDR与SEQ ID NO: 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和/或146的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含犬框架，同时仍然具有所需的结合与功能特性，所述框架由IgG重链序列与κ轻链的组合所构成，所述轻链含有一个或多个上述CDR氨基酸序列并具有0、1、2、3、4或5个保守或非保守氨基酸置换。

序列同一性指代当两个多肽序列进行最佳比对时，这两条多肽的氨基酸在等同位置处相同的程度。如本文中所用，当两个序列的氨基酸残基完全相同时，其中一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100%“相同”。因此，当两个氨基酸序列50%的氨基酸残基相同时，其中一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列50%“相同”。序列比较在给定蛋白质（例如，蛋白质或被比较的多肽的一部分）所包含的相邻的氨基酸残基区块上进行。在具体的实施方案中，考虑到了可能另行改变两个氨基酸序列之间对应程度的所选的缺失或插入。

序列相似性包括相同的残基和不相同的、生化上相关的氨基酸。讨论了共享相似特性并且可互换的生化上相关的氨基酸。

“经保守修饰的变体”或“保守置换”指代蛋白质中的氨基酸与具有相似特性（例如，电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚度，等等）的其它氨基酸的置换，这样可以经常做出变化而不会改变所述蛋白质的生物活性。本领域技术人员会认识到，通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸置换不会实质性改变生物活性[参见，例如，Watson 等人,Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.Co., 第224页 (第4版;1987)]。另外，结构上或功能上相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。在下表1中直接示出了示例性保守置换。

本发明也预见到本发明的抗体的功能保守变体。如本文中所用的“功能保守变体”表示这样的抗体或片段：其中一个或多个氨基酸残基已经被改变，而没有改变期望的性质，诸如抗原亲和力和/或特异性。这样的变体包括但不限于用具有类似性质的氨基酸替换一个氨基酸，诸如上表I的保守氨基酸置换。

核酸

本发明还包括编码本文中公开的犬化鼠抗-犬PD-1抗体及其抗原结合片段的免疫球蛋白链的核酸（参见以下实施例）。

本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法（其中选择算法的参数以在各个参照序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配）执行对比时，所述免疫球蛋白多肽的氨基酸序列与本文提供的CDR和/或犬cFc和/或抗体的氨基酸序列具有至少约70%同一性，优选地至少约80%同一性，更优选地至少约90%同一性和最优选地至少约95%同一性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。本发明还提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当用BLAST算法（其中选择算法的参数以在各个参照序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配）执行对比时，所述免疫球蛋白多肽的氨基酸序列与任何参照氨基酸序列具有至少约70%相似性，优选地至少约80%相似性，更优选地至少约90%相似性和最优选地至少约95%相似性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。

如本文中所用，核苷酸和氨基酸序列百分比同一性可以使用C、 MacVector(MacVector, Inc. Cary, NC 27519) 、 Vector NTI (Informax, Inc. MD)、 OxfordMolecular Group PLC (1996) 和 Clustal W 算法，采用比对默认参数以及默认同一性参数来确定。这些商购程序也可采用相同或类似的默认参数而用于确定序列相似性。可选地，可以使用在默认过滤条件下的Advanced Blast搜索，例如，使用采用默认参数的GCG（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7,Madison, Wisconsin）堆积程序。

以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法: Altschul,S.F., 等人, J. Mol.Biol.215:403-410 (1990); Gish, W., 等人, Nature Genet.3:266-272 (1993); Madden, T.L., 等人, Meth.Enzymol.266:131-141(1996); Altschul,S.F., 等人, Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (1997); Zhang, J., 等人, GenomeRes.7:649-656 (1997); Wootton, J.C., 等人, Comput.Chem.17:149-163 (1993);Hancock, J.M.等人, Comput.Appl.Biosci.10:67-70 (1994); 比对打分系统:Dayhoff,M.O., 等人, "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of ProteinSequence and Structure, vol. 5, suppl. 3.M.O.Dayhoff (ed.), pp. 345-352,(1978); Natl.Biomed.Res.Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., 等人, "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequenceand Structure, vol. 5, suppl. 3."(1978),M.O.Dayhoff (ed.), pp. 353-358(1978), Natl.Biomed.Res.Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J.Mol.Biol.219:555-565 (1991); States, D.J., 等人, Methods 3:66-70(1991);Henikoff, S., 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919 (1992); Altschul,S.F., 等人, J. Mol.Evol.36:290-300 (1993); 比对统计: Karlin, S., 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268 (1990); Karlin, S., 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877 (1993); Dembo, A., 等人, Ann.Prob.22:2022-2039 (1994); 以及Altschul, S.F."Evaluating the statistical significanceof multiple distinct local alignments." in Theoretical and ComputationalMethods in Genome Research (S. Suhai, ed.), pp. 1-14, Plenum, New York(1997)。

本发明还提供了包含本发明的核酸（包括分离的核酸）的表达载体，其中所述核酸可操作地连接至控制序列，当用所述载体转染宿主细胞时，所述控制序列被宿主细胞识别。还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞和用于生产本文中公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在培养基中培养携带编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，和从宿主细胞或培养基分离所述抗原或其抗原结合片段。

例如，犬化鼠抗-犬PD-1抗体可以通过本领域已知的方法重组产生。可用作用于表达本文中公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，且包括许多可从美国通常培养物保藏中心(ATCC)得到的永生化的细胞系。这些包括，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，诸如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，如下生产抗体：将所述宿主细胞培养足以允许所述抗体在宿主细胞中的表达的时间段，或者更优选地，使所述抗体分泌进宿主细胞在其中生长的培养基中。

使用标准的蛋白纯化方法，可以从培养基回收抗体。此外，使用许多已知技术，可以增强本发明的抗体(或源自它的其它部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是一种用于增强在特定条件下的表达的常见方案。与欧洲专利号0216 846、0 256 055和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4关联地完整地或部分地讨论了GS系统。

一般而言，在特别的细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗体的特别的糖基化模式将取决于用于生产所述抗体的特别的细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码的、或者包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，独立于所述抗体可能具有的糖基化模式。类似地，在特别的实施方案中，具有仅包含未岩藻糖基化的N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体已经被证实通常地在体外和在体内表现出比它们的岩藻糖基化的相应物更有效的效力[参见例如，Shinkawa 等人,J. Biol.Chem.278:3466-3473(2003); 美国专利号6, 946,292和7,214,775]。

本发明还包括本文中公开的犬化鼠抗-犬PD-1抗体的抗体片段。所述抗体片段包F(ab)₂片段，其可以通过例如胃蛋白酶对IgG的酶切割来生产。Fab片段可以通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)₂来生产。Fab片段是通过二硫键附加至V_H-C_H1链的V_L-C_L链。F(ab)₂片段是两个又通过两个二硫键附加的Fab片段。F(ab)₂分子的Fab部分包括二硫键位于其中间的Fc区部分。F_V片段是V_L或V_H区域。

在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如，犬恒定区，诸如IgGA、IgGB、IgGC和IgGD犬重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如，犬轻链恒定区，诸如λ或κ犬轻链区域或其变体。作为例子，且非限制性地，所述犬重链恒定区可以来自IgGB，且所述犬轻链恒定区可以来自κ。

抗体工程

本发明的犬化鼠抗-犬PD-1抗体可经工程改造以包括亲本（即，犬）单克隆抗体的犬框架中的修饰，例如以改善抗体的特性，如下文详述。

本文所述的交叉阻断的犬化抗体及其抗原结合片段可以基于其在标准结合测定法（例如，BIACore®、ELISA，如下文中示例的，或流式细胞术）中与IB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5和/或2G9中任一者交叉竞争的能力来识别。例如，可使用标准ELISA测定法，其中重组犬PD-1蛋白被固定在平板上，对其中一个抗体进行荧光标记并且评价未标记的抗体竞争胜过所述经标记的抗体的结合的能力。另外或可选地，可将BIAcore®分析用于评估抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制例如IB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5和/或2G9结合至犬PD-1的能力证明，所述测试抗体可以与IB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5和/或2G9竞争结合犬PD-1，因而可能，在一些情况下，像IB5、3B6、4D12、7C9、2H9、5G5和/或2G9一样结合至犬PD-1上的相同表位。如上所述，像本发明的任何抗-犬PD-1抗体或片段一样结合至相同表位的抗体及片段也构成本发明的一部分。

药物组合物和施用

为了制备药物或无菌组合物，将犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。[参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences和U.S.Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA(1984)]。

治疗剂和诊断剂的制剂可通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以例如，冻干粉末、混悬液、水溶液或悬浮液的形式制备[参见，例如，Hardman, 等人(2001) Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, NewYork, NY; Gennaro (2000) Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, 等人（编撰）(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY;Lieberman, 等人（编撰）(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets, MarcelDekker, NY; Lieberman, 等人（编撰）(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems, Marcel Dekker, NY; Weiner 和 Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity andSafety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗-PD-1抗体在乙酸钠溶液（pH 5-6）中稀释至适当浓度，并为了张度而加入NaCl或蔗糖。可以加入另外的试剂（诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80）以增强稳定性。

单独地或与另一种试剂联合地施用的抗体组合物的毒性和治疗效果可以通过标准药物操作在细胞培养物或实验动物中确定，例如，确定LD₅₀ (对群体的50%致命的剂量)和ED₅₀ (对群体中的50%治疗上有效的剂量)。有毒和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀) 。在具体方面，具有高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究得到的数据可以用于阐明用在犬中的剂量的范围。这样的化合物的剂量优选地在包括ED₅₀几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可根据所采用的剂型和施用途径而在此范围内变化。

施用模式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、经肠、胃肠外；肌肉内、皮下、真皮内、骨髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入法、局部、皮肤、透皮或动脉内。在具体实施方案中，可以通过侵袭性途径（诸如通过注射）来施用犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段。在本发明的其它实施方案中，静脉内地、皮下地、肌肉内地、动脉内地、肿瘤内地或通过吸入、气雾剂递送，施用犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。通过非侵袭性途径(例如，口服地；例如，在丸剂、胶囊剂或片剂中) 的施用也在本发明范围内。

还可以通过输注来施用本文中公开的药物组合物。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块形式的例子包括: 美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分配药物的可植入的微量输液泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流可植入的输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多个腔隔室的渗透药物递送系统。许多其它这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的。

或者，可以局部性而非全身性方式施用犬化鼠抗-犬PD-1抗体抗体，例如常常以长效制剂或持续释放制剂的形式，将抗体直接注射到有关节炎的关节或病原体诱导的病变（由免疫病理学所表征）处。此外，可在靶向的药物递送系统中施用抗体，例如，在由组织特异性抗体所包被的脂质体中，靶向，例如，有关节炎的关节或病原体诱导的病变（由免疫病理学所表征）。脂质体将被靶向病变组织并被其选择性地吸收。

施用方案取决于若干因素，包括治疗抗体的血清或组织转换率、症状的水平、治疗抗体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以实现靶疾病状态的改善，同时使不希望的副作用最小化。因此，递送的生物试剂的量部分地取决于特定治疗性抗体和要治疗的病症的严重程度。选择治疗抗体的适当剂量的指南是现成的[参见, 例如, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire, UK (1996);Kresina (编撰) Monoclonal Antibodies, Cytokines andArthritis, Marcel Dekker, New York, NY (1991); Bach (编撰) MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, NewYork, NY (1993);Baert, 等人New Engl. J. Med.348:601-608 (2003); Milgrom 等人New Engl. J. Med.341:1966-1973 (1999); Slamon 等人New Engl. J. Med.344:783-792 (2001);Beniaminovitz 等人New Engl. J. Med.342:613-619 (2000); Ghosh 等人New Engl. J. Med.348:24-32 (2003); Lipsky 等人New Engl. J. Med.343:1594-1602(2000)]。

对适当剂量的确定是由兽医，例如，使用已知的或在本领域中涉嫌影响治疗的参数或因素而作出的。通常，剂量以略低于最佳剂量的量开始，并在之后以小增量递增直到相对于任何不良副作用达到所需的或最佳的效果。重要的诊断措施包括，对例如，炎症或所产生的炎性细胞因子的水平的症状的那些诊断措施。

可以通过连续输注或通过例如每天1次、每周1-7次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每季度1次、每半年1次、每年1次等施用的剂量来提供本文中公开的抗体或其抗原结合片段。可以例如静脉内地、皮下地、局部地、口服地、鼻地、直肠地、肌肉内地、大脑内地、脊椎内地或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常是至少0.05 μg/kg体重，更通常是至少0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、0.25 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/ml、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg或更多[参见，例如，Yang, 等人New Engl.J. Med.349:427-434 (2003); Herold, 等人New Engl. J. Med.346:1692-1698 (2002);Liu, 等人J. Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456 (1999); Portielji, 等人CancerImmunol.Immunother.52:133-144 (2003)] 。还可以提供剂量以达到犬化鼠抗-犬PD-1抗体在个体的血清中的预定靶浓度，诸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300µg/ml或更多。在其它实施方案中，每周、每2周、“每4周”、每月、每2月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500 mg/个体皮下地或静脉内地施用本发明的犬化鼠抗-全PD-1抗体。

如本文中所用的“抑制”或“治疗”或“处理”包括与病症有关的征状的发展的延迟和/或这样的病症的症状的严重性的减少。该术语还包括改善既有的失控的或不希望的征状，阻止另外的征状，和改善或阻止这样的征状的基础原因。因而，该术语表示，已经给脊椎动物受试者赋予有益的结果，所述脊椎动物受试者具有病症、疾病或征状或具有发展这样的病症、疾病或征状的潜力。

如本文中所用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”表示这样的本发明的犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段的量：当单独地或与另外的治疗剂组合地施用给细胞、组织或受试者时，所述量有效地造成疾病或病症的一种或多种征状或这样的疾病或病症的进展的可测量的改善。治疗有效剂量还表示，足以导致征状的至少部分改善的结合化合物的量，例如，有关的医学状况的治疗、治愈、预防或改善，或这样的状况的治疗、治愈、预防或改善的速率的增加。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量表示单独的该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量表示产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合地、连续地还是同时地施用。有效量的治疗剂将导致诊断测量或参数改善至少10%；经常至少20%；优选地至少约30%；更优选地至少40%，和最优选地至少50%。在使用主观测量来评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。

其它联合疗法

如前面描述的，犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其它治疗剂(诸如化学治疗剂)一起共同施用。所述抗体可以连接至所述试剂(作为免疫复合物)，或可以与所述试剂分开施用。在后一种情况(分开施用)下，所述抗体可以在所述试剂之前、之后或并行地施用，或可以与其它已知的疗法一起共同施用。

试剂盒

还提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述组分包括、但不限于与一种或多种另外组分组合的如本文所讨论的特异性地结合PD-1的抗体或抗原结合片段(例如，犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段)，所述另外组分包括但不限于如本文中讨论的药学上可接受的载体和/或化学治疗剂。所述结合组合物和/或所述化学治疗剂可以配制为纯的组合物或在药物组合物中与药学上可接受的载体相组合。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括在一个容器中(例如，在无菌的玻璃或塑料小瓶中)的本发明的结合组合物(例如，犬化鼠抗-犬PD-1抗体或其药物组合物)和在另一个容器中(例如，在无菌的玻璃或塑料小瓶中)的其药物组合物和/或化学治疗剂。

如果试剂盒包括用于胃肠外施用给受试者的药物组合物，所述试剂盒也可以包括用于执行这样的施用的装置。例如，所述试剂盒可以包括一个或多个皮下针头或如上面讨论的其它注射装置。所述试剂盒还可以包括包装说明书，其包括关于所述试剂盒内的药物组合物和剂型的信息。通常，这样的信息会帮助宠物主人和兽医有效地和安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，以下关于本发明的组合的信息可以提供在插页中：药代动力学、药效动力学、临床研究、效力参数、适应症和用法、禁忌证、警告、注意、不良反应、超量给药、适当剂量和施用、供应规格、适当贮存条件、参考文献、生产商/分销商信息和专利信息。

为了方便，可以将本文中公开的抗体或特异性结合剂与关于执行诊断或检测测定的说明书一起提供在试剂盒（即，预定量的试剂的包装组合）中。在用酶标记抗体的情况下，所述试剂盒将包括所述酶需要的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可能包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以宽泛地变化，以提供实质上优化测定的灵敏度的试剂溶液的浓度。具体地，所述试剂可以提供为干粉，经常是冻干的，其包括在溶解后会提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

实施例

实施例1

犬PD-1和PD-L1

犬PD-1和PD-L1：

于2013年12月20日提交的美国临时专利申请号61/918,946，据此全文以引入方式并入，提供了：SEQ ID NO: 113的犬PD-1（cPD-1）的全长核苷酸序列[SEQ ID NO: 133包括信号序列]；SEQ ID NO: 114的对应的经过翻译的氨基酸序列[SEQ ID NO: 134包括信号序列]；编码犬PD-1的细胞外结构域（ECD）的核苷酸序列，SEQ ID NO: 115；犬PD-1的ECD的氨基酸序列，SEQ ID NO: 116；犬PD-1 ECD加GT接头以及人类IgG1 Fc基因的Fc部分的核苷酸序列，SEQ ID NO: 117；和犬PD-1 ECD加GT接头以及人类IgG1 Fc基因的Fc部分的氨基酸序列，SEQ ID NO: 118[SEQ ID NO: 137包括信号序列]。

美国临时专利申请号61/918,946还提供了：SEQ ID NO: 119的犬PD-L1（cPD-L1）的全长核苷酸序列[SEQ ID NO: 135包括信号序列]；SEQ ID NO: 120的对应的经过翻译的氨基酸序列[SEQ ID NO: 136包括信号序列]；编码犬PD-L1的细胞外结构域（ECD）的核苷酸序列，SEQ ID NO: 121；犬PD-L1的ECD的氨基酸序列，SEQ ID NO: 122；犬PD-L1 ECD加GT接头以及人类IgG1 Fc基因的Fc部分的核苷酸序列，SEQ ID NO: 123；和犬PD-L1 ECD加GT接头以及人类IgG1 Fc基因的Fc部分的氨基酸序列，SEQ ID NO: 124。

实施例2

鼠抗-犬PD-1抗体

生成抗-犬PD-1单克隆抗体：

在17天的周期内，为总共三只Balb/c小鼠进行多次免疫接种（每次10 µg）。免疫抗原是犬PD-1 ECD-Fc融合蛋白。在免疫后，从各小鼠采集血清并测试其与犬PD-1 ECD-HIS标签蛋白的反应性。将具有最高血清抗-PD-1 ECD-HIS效价的小鼠的脾脏细胞融合到骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞系中。融合后大约2周，通过ELISA测试来自假定杂交瘤细胞的上清液对PD-1 ECD-HIS标签蛋白的反应性。将在ELISA中产生强阳性信号的杂交瘤通过有限稀释进行亚克隆并再次测试对PD-1 ECD-HIS标签蛋白的反应性。

确认单克隆抗体针对犬PD-1的反应性：

通过ELISA确认了由杂交瘤分泌的抗体对犬PD-1 ECD的反应性。使用CELLine生物反应器（Integra-biosciences）培养杂交瘤细胞10-30天。最初将细胞保持在补充有4 mM L谷氨酰胺和10% 超低IgG胎牛血清（FBS）的DMEM中（来自Gibco）。将杂交瘤细胞接种到CELLine生物反应器细胞室的15 mL相同培养液（FBS浓度提高至20%）中，细胞密度为大约2x106个细胞/mL。外部腔室充入1 L的营养培养液（含4 mM L谷氨酰胺和2%标准FBS的DMEM）。在3-7天内将细胞室中的杂交瘤细胞扩张至大约2.5x107个细胞/mL。然后，从细胞室中收获10 mL的细胞悬浮液并补充新鲜培养液以允许细胞再扩张和后续收获。根据需要重复此过程以从各个杂交瘤克隆得到足够量的mAb。将收获的细胞悬浮液离心并将上清液用0.2微米过滤膜过滤。对于抗体纯化，使用蛋白质G Sepharose 4 Fast flow的5 mL柱（GE Healthcare）通过重力流纯化各克隆的上清液。在用pH 8.0的TrisEDTA（TE）缓冲液洗涤后，使用0.1 M 甘氨酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合的抗体，接着使用1 M Tris（pH 8.0）进行pH中和。浓缩抗体并使用Centriprep® YM-10，10 kDa NMWL离心过滤装置（Millipore）将缓冲液交换成磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）。使用分光光度法对抗体浓度定量。

通过ELISA测试经纯化的抗-犬PD-1 mAb与经HIS标签的犬PD-1 ECD域的反应性，如下：将经HIS标签的犬PD-1 ECD蛋白在包被缓冲液（碳酸盐/碳酸氢盐，pH 9.0）中稀释至10 µg/mL并以100 µl/孔分配到96孔平底ELISA平板（NUNC）中。将平板在4℃温育过夜。然后将平板用含有0.05% Tween® 20的磷酸盐缓冲生理盐水（PBST）洗涤三次。接着，向每孔中加入200 µl阻断缓冲液（含5%脱脂奶的PBST）并将平板在37℃温育60分钟。然后将平板用PBST洗涤三次。接着，向适当列的第一孔中加入100 µl测试mAb（稀释于阻断缓冲液中）。然后将测试mAb 2倍稀释至适当的平板位置。将平板在37℃温育60分钟以后，将平板用PBST洗涤3次。接着，将100µl/孔的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG (KPL)的1:2,000稀释液加入平板，然后将平板在37℃温育60分钟。然后，将平板用PBST洗涤3次，并将100µl/孔的3,3’,5,5’四甲基联苯胺、(TMB)底物(得自KPL)加入平板。允许颜色反应在37℃进行5-20分钟，然后在650nm测量吸光度。

表达犬PD-1蛋白的CHO细胞：

将全长犬PD-1基因克隆进质粒p96793中。在该质粒中，犬PD-1蛋白的表达由hCMV启动子驱动。将CHO DXB11细胞(dhfr-)维持在补充了10%胎牛血清的MEM-α(Gibco)中。

使用Lipofectamine (Invitrogen)，通过脂质体介导的基因递送，在含有大约6x106个细胞的75 cm²烧瓶中，进行用质粒p96793对CHO细胞的转染。48小时以后，将细胞在补充了10%FBS和400µg/mL潮霉素B的、不含核苷的MEM-α培养基(选择性培养基)中传代。对dhfr+、潮霉素抗性的细胞的集合执行有限稀释克隆。通过免疫荧光测定，评估克隆的犬PD-1表达。简而言之，将细胞单层固定在含有80%丙酮的96孔板中。然后将固定的且干燥的细胞单层与多克隆山羊抗-人PD-1抗体(R&D Systems)一起温育1小时。将平板用PBS洗涤，然后与荧光素-标记的兔抗-山羊IgG抗体(KPL)一起温育1小时。将平板用PBS洗涤。将表现出荧光的克隆扩增，并建立细胞储备物。

小鼠mAb对在CHO细胞上表达的犬PD-1蛋白的反应性：

使用表达PD-1的CHO细胞，通过基于细胞的测定，确定小鼠抗-犬PD-1 mAb与CHO细胞上的犬PD-1的反应性。简而言之，将表达犬PD-1的CHO细胞在50µl培养基(DMEM/HAM’s F12,10%FBS)中培养至80-100%汇合。接着，加入50µl含有不同浓度的纯化的mAb的培养基在37℃保持1小时。在用PBS-Tween洗涤3次以后，加入100µl在培养基中1:1000稀释的山羊抗-小鼠辣根过氧化物酶(HRP)在37℃保持1小时。用PBS-Tween洗涤另外3次以后，用过氧化物酶底物(TMB)使结合的mAb显影。在微量培养板读数器中测量由过氧化物酶活性引起的在450 nm的吸光度增加。

表征小鼠抗-犬PD-1抗体：

如上所述，以及在于2013年12月20日提交的美国临时专利申请号61/918,946中（据此全文以引用方式并入），通过多个参数对小鼠抗-犬PD-1抗体进行表征，包括：通过ELISA其与犬PD-1的ECD的反应性、其与在CHO细胞表面上表达的PD-1的反应性、其阻止PD-1与PD-L1结合的能力以及其结合至来自健康狗和患癌狗的PBMC细胞的能力。所选七种小鼠抗-犬PD-1抗体（分别标示为IB5、2G9、2H9、3B6、4D12、5G5和7C9）的CDR的氨基酸序列具有很高的同源性，如下表2中所示。

实施例3

犬化抗体的犬化和表征

为了生产犬化抗体，有必要识别出编码犬IgG的重链和轻链的DNA序列。犬重链的核苷酸和氨基酸序列可以得自NCBI基因和蛋白质数据库。犬IgG有四种已知IgG亚类：IgGA、IgGB、IgGC和IgGD，以及两种类型的轻链：κ和λ。表7列出了未经修饰的犬Fc片段的氨基酸和核苷酸SEQ ID NO。

不受任何特定方法的约束，产生具有各种犬和小鼠序列含量的抗PD-1单克隆抗体变体的方法涉及以下常规方案：

i) 确定小鼠mAb的VH和VL链的核苷酸序列；

ii) 识别小鼠mAb的H和L链CDR；

iii) 识别合适的犬IgG的H和L链；

iv) 确定犬IgG H和L链的核苷酸序列；

v) 用编码相应的小鼠CDR的核苷酸序列分别取代编码内源性犬H和L链CDR的核苷酸序列；另外，任选地用选自小鼠框架区的残基取代一些犬框架残基；

vi) 合成步骤（v）的核苷酸并将其插入合适的表达质粒中；将质粒转染到适当的细胞（例如，HEK 293细胞）中；

vii) 从HEK 293上清液中纯化表达的抗体；以及

viii) 测试经纯化的抗体对犬PD-1的结合。

依照以上步骤进行一组实验，得到一组具有各种犬和小鼠序列含量的变体犬化抗体。

犬化mAb对在CHO细胞上表达的犬PD-1蛋白的反应性：

使用表达PD-1的CHO细胞，通过基于细胞的测定，确定犬化抗-犬PD-1 mAb与CHO细胞上的犬PD-1的反应性。简而言之，将表达犬PD-1的CHO细胞在50µl培养基(DMEM/HAM’s F12,10%FBS)中培养至80-100%汇合。接着，加入50µl含有不同浓度的纯化的mAb的培养基在37℃保持1小时。在用PBS-Tween洗涤3次以后，加入100µl在培养基中1:1000稀释的山羊抗-狗辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体在37℃保持1小时。用PBS-Tween洗涤另外3次以后，用过氧化物酶底物(TMB)使结合的mAb显影。在微量培养板读数器中测量由过氧化物酶活性引起的在450 nm的吸光度增加。

小鼠抗-犬PD-1 mAb和犬化小鼠抗-犬PD-1 mAb与犬PD-1的结合研究

直接通过氨基偶联将大约70共振单位（RU）的犬PD-1抗原固定。通过基于无标记表面等离子体共振的技术（例如，Biacore® T200），用300秒的结合时间、1200秒的解离时间，在50、100、200 (x2) 400和800纳摩尔（nM）的浓度，进行亲和力测量。使用了1:1结合的拟合模型。通过氨基偶联将抗原（犬PD-1）固定在传感器芯片上，并将下表14中所示的四种抗体用作流过抗原表面的被分析物。结果表明，本发明的抗-犬PD-1抗体对犬PD-1抗原的结合亲和力很强，具有纳摩尔和甚至亚纳摩尔的解离常数（Kd）。此外，小鼠抗-犬PD-1单克隆抗体和来自相同克隆的对应的犬化小鼠抗-犬PD-1单克隆抗体得到了惊人相似的Kd值（参见下表14）。

由犬化抗-犬PD-1 mAb造成的配体阻断：

对于与犬PD-1（cPD-1）反应的犬化抗体而言，使用基于细胞的ELISA（CELISA）测定法，其基于表达犬PD-1的CHO细胞系。简而言之，将cPD-1 CHO细胞以4x10⁴个细胞/孔置于96孔平板中，并将细胞在37℃温育18-24小时直到其95-100%汇合。抽走细胞培养液，将平板用PBS加0.05% Tween® 20洗涤3次，并用CHO培养液洗涤1次。从30 µg/mL开始，在CHO培养液中对犬化抗-cPD-1 mAb进行了3倍连续稀释，并且以50 µL/孔向平板中加入各抗体稀释液。然后将平板在37C、5% CO₂中摇动温育30 min。在50 µL/孔的CHO培养液中加入人类PD-L1-Fc至4 µg/ml，而不移除或洗涤所述经温育的抗-PD-1 mAb，然后在37C、5% CO₂中摇动温育45 min。将平板用PBS加0.05% Tween® 20洗涤6次。以100 µl/孔加入抗-人类Fc-HRP（Calbiochem）（以1:2500稀释于CHO培养液中）并在37℃/5% CO₂中温育30-60 min。（抗-人类Fc-HRP不会结合犬Fc。）将平板用PBS加0.05% Tween® 20洗涤5次。以100 µl/孔加入TMB微孔底物并随后在室温下温育10分钟。用100 µl/孔 1.5 M 磷酸停止反应。在酶标仪（ELISA reader）上测量A450 – A620。

从狗PBMC的细胞因子释放：

使用Ficoll分离，从得自健康狗和患癌狗的EDTA血样制备PBMC。将细胞洗涤3次，并在96孔平板中以2.5 x 10⁵个细胞/孔的浓度一式三孔地重悬浮于完全组织培养液中。用1 µg/ml的伴刀豆球蛋白A活化细胞。以各种浓度加入测试抗体并将培养物温育96小时。对照包括：与conA及无抗体温育的细胞，或与conA及不相关的同型匹配抗体温育的细胞。培养96小时后，收集上清液并使用商用犬IFN-_γ ELISA试剂盒（R&D Systems）分析IFN释放[参见，图4]。

实施例4

经基因修饰的犬IgG

为了生成缺乏效应器功能的犬IgG变体，生成了一批突变型犬IgGB重链。这些变体可在重链氨基酸序列的Fc部分包含下列单个或组合的置换中的一个：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。将变体重链（即，含有此类氨基酸置换）克隆到表达质粒中，并连同含有编码轻链的基因的质粒一起转染入HEK 293细胞中。评价从HEK 293细胞表达和纯化的完整抗体对Fc_γRI和C1q的结合，以评估其介导免疫效应器功能的潜力。表3列出了编码经基因修饰的犬化重链的质粒、犬化重链以及在这些重链中的所述基因修饰的实例。变体重链用于评估经基因修饰的mAb中的效应器功能。所有这些重链均包含来自2H9鼠抗-犬PD-1抗体的CDR。

Fc _γ RI结合:

结合至FcR_γI是对抗体介导ADCC的能力的测量。为了评估犬化抗体的这一特性，进行了测量犬化抗体结合至Fc_γRI的测定，如下：用100 µl/孔的2.5 µg/mL PD-1 HIS涂布96孔平板。在2-7℃温育过夜。使平板平衡至室温15分钟。将平板用含有0.05% Tween® 20的磷酸盐缓冲生理盐水（PBST）洗涤3次，并随后用200 µL/孔的5% NFDM（脱脂干奶）将孔阻断。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤3次。在5% NFDM中，从1 µg/mL开始制作抗体的2倍稀释液。加入100 µL/孔经稀释的抗体。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔稀释至1 µg/mL的重组人类CD64蛋白（R&D systems）。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔稀释至1:3000的生物素酰化-抗-CD64抗体（R&D systems）。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔稀释至1:7500的链亲和素-HRP抗体（R&Dsystems）。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔 TMB底物。在15-30℃温育10分钟。使用ELISA读板机在450-540 nm 读板。

结果: 图5A表明，标示为can2H9 ADCC mut-1 VH4/VL3的犬化mAb（具有基因修饰D31A）或标示为can2H9 ADCC mut-2 VH4/VL3的mAb（具有基因修饰N63A）显示出对Fc_γRI的结合近乎完全丧失。另一方面，标示为can2H9 ADCC (1062) VH4/VL3的mAb（含有组合的基因修饰D31A加N63A）缺乏可检测到的对Fc_γRI的结合。在图5A中，can2H9 IgGD VH4/VL3是含有来自犬IgGD的Fc的犬化抗体，而can3B6 VH4/VL4 IgGB是不会结合至包被抗原（PD-1HIS）的犬化抗体，并且标示为can2H9 VH4/VL3的犬化mAb是含有未修饰的IgGB Fc的抗体。图5B表明，标示为can2H9 ADCC(1059) VH4/VL3的犬化mAb（含有基因修饰P4A）和标示为can2H9 ADCC (1061) VH4/VL3的mAb（含有基因修饰P95A）显示出对Fc_γRI的结合显著降低，而标示为can2H9 ADCC(1060) VH4/VL3的mAb（含有基因修饰A93G）显示出对Fc_γRI的结合有轻微降低。另一方面，含有五处基因修饰（D31A、N63A、P4A、A93G、P95A）的标示为can2H9IgGB ADCC (1068) VH4/VL3的mAb完全缺乏对Fc_γRI的结合。

C1q结合:

结合至补体的第一组分，C1q，是对抗体介导CDC的能力的测量。为了评估犬化抗体的这一特性，进行了测量犬化抗体结合至C1q的测定，如下：用2.5µg/mL PD-1 HIS涂布96孔平板。在2-7℃温育过夜。平衡至室温15分钟。用PBST洗涤3次。用200 µL/孔 5% BSA阻断。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤3次。在5% BSA中，从1 µg/mL开始制作抗体的2倍稀释液。加入100 µL/孔经稀释的抗体。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔稀释至4 µg/mL的C1q蛋白。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔稀释至1:3000的山羊-抗-C1q抗体。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔稀释至1:10000的驴-抗-山羊-HRP抗体。在36-38℃温育60分钟。用PBST洗涤6次。加入100 µL/孔TMB底物。在15-30℃温育10分钟。在ELISA读板机上于450-540 nm 读数。

结果: 图6A表明，标示为can2H9VH4 IgGB ADCC (mut-1)/VL3的犬化mAb（具有基因修饰D31A）或标示为can2H9 VH4 IgGB ADCC (mut-2)/VL3的mAb（具有基因修饰N63A）显示出对C1q的结合显著降低。另一方面，标示为can2H9 VH4 IgGB ADCC (1062)/VL3的mAb（含有组合的基因修饰D31A加N63A）缺乏可检测到的对C1q的结合。

在图6A中，can2H9 VH4 IgGD/VL3是含有来自犬IgGD的Fc的犬化抗体，而can3B6VH4/VL4 IgGB是不会结合至包被抗原（PD-1 HIS）的犬化抗体，并且标示为can2H9 VH4/VL3IgGB的犬化mAb是含有未突变的IgGB Fc的抗体。图6B表明，标示为can2H9 VH4 IgGB ADCC(1059)/VL3的犬化mAb（含有P4A置换）和标示为can2H9 VH4 IgGB ADCC (1061)/VL3的mAb（含有P95A置换）显示出对C1q的结合显著降低，而标示为can2H9 VH4 IgGB ADCC(1060)/VL3的mAb（含有A93G置换）显示出对C1q的结合有所增强。另一方面，含有五处置换（D31A、N63A、P4A、A93G、P95A）的标示为can2H9 VH4 IgGB ADCC (1068) /VL3的mAb完全缺乏对C1q的结合。在图6B中，标示为can3B6 VH4/VL4 IgGB是不会结合至包被抗原（PD-1 HIS）的犬化抗体，而标示为can2H9 VH4/VL3 IgGB的犬化mAb是含有未突变的IgGB Fc的抗体。

* 置换是在氨基酸序列SEQ ID NO: 2和4的P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95处；或在核苷酸序列SEQ ID NO: 1和3的编码那些氨基酸的核苷酸处。^#如下表5中所示，在IgGD的铰链区中的单个氨基酸置换。

可能的特定置换是在P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95处。

# 第一列列出了SEQ ID NO.；剩余列列出了对应的氨基酸位置。对于两个天然的氨基酸序列（SEQ ID NO. 130和132），还提供了天然氨基酸残基的单字母代码。

实施例5

抗-犬PD-1抗体的表位定位

引言

抗体与其同源蛋白抗原的相互作用是通过该抗体的特定氨基酸（对位）与靶抗原的特定氨基酸（表位）的结合来介导的。表位是通过免疫球蛋白引起特定反应的抗原决定簇。其由所述抗原表面上的一组氨基酸组成。

目标蛋白质可含有若干由不同抗体识别的表位。由抗体识别的表位被划分为线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中氨基酸连续序列的伸展所形成，而构象表位由如下所述的氨基酸所构成：所述氨基酸在一级氨基酸序列中是不连续的（例如，相距甚远的），但当三维蛋白质折叠时被汇聚到一起。

表位定位指代识别出由抗体在其靶抗原上所识别的氨基酸序列（即，表位）的方法。识别出由单克隆抗体（mAb）在靶抗原上所识别的表位具有重要应用。例如，其可以有助于开发新的治疗剂、诊断剂和疫苗。表位定位还可以有助于选择最佳的治疗性mAb并帮助阐明其作用机制。表位信息还可以阐明独特的癌症表位并定义疫苗的保护或致病作用。

表位定位可以使用多克隆或单克隆抗体进行，并且根据表位的疑似性质（即，线性的对构象的）采用若干方法用于表位识别。定位线性表位更加直截了当并且相对容易进行。出于此目的，用于线性表位定位的商业性服务经常采用肽扫描。在这种情况下，化学合成一组重叠的靶蛋白的短肽序列，并测试其结合目标抗体的能力。该策略快速、高通量，并且执行起来相对便宜。另一方面，定位不连续的表位在技术上更富挑战性，并且需要更专门的技术如单克隆抗体连同其靶蛋白的X射线共结晶、氢-氘（H/D）交换和/或结合酶消化的质谱法。

使用ProImmune®微阵列定位PD-1表位：

为了识别出形成针对抗-PD-1 mAb的表位的氨基酸，化学合成了总共28个肽，所述肽长15个氨基酸并且有10个氨基酸的重叠。此重叠肽的文库经过设计以覆盖全长犬PD-1蛋白。肽-抗体结合的测定通过如下进行：将抗体样品附接至ProArray Ultra®肽微阵列，然后与荧光标记的第二抗体温育。全部的肽都是单独合成的，并且随后与ProImmune® 鼠类IgG对照并排结合至ProArray Ultra®玻片表面。此经过优化的方法确保了肽以紧密模仿对应的蛋白质区的性质的方式呈现在阵列上，从而规避了游离肽自身固有的物理化学变化并得到相容的、结合的肽和蛋白质阵列平台。将测试被分析物（肽）分配到ProArray Ultra®玻片上的离散点中，并且适当的gal文件使得能够将所得到的阵列特征精确比对回沉积的被分析物。使用经过验证的阻断缓冲液阻断ProArray Ultra®玻片，以减少mAb的非特异性结合。然后将其与mAb样品温育，接着与特定的荧光标记的第二抗体温育。在若干个洗涤步骤之后，干燥ProArray Ultra®阵列并使用高分辨率的荧光微阵列扫描系统扫描。在扫描所述荧光标记的ProArray Ultra®玻片之后，扫描仪记录了图像，使用图像分析软件评价所述图像 – 使得能够对与所扫描的微阵列玻片上的每个荧光点相关的荧光强度水平进行解释和定量。此实验的结果表明，所述犬PD-1肽中的一些被所评价的mAb中的一些所识别。所述mAb的身份以及被这些mAb所识别的氨基酸序列列于表12中。此研究表明，mAb 2H9识别出位于犬PD-1的细胞外结构域中的表位，所述表位由SEQ ID NO: 138所代表的氨基酸序列构成，而mAb 1A1识别的表位包含由SEQ ID NO: 138所代表的氨基酸序列以及由SEQ ID NO:139所代表的氨基酸序列所表示的重叠氨基酸序列。

使用质谱法定位PD-1表位：

为了识别出由抗-犬PD-1所识别的潜在的不连续的表位，使用了基于化学交联和质谱法检测的方法（CovalX® Instrument Incorporated）。将此技术应用于犬PD-1的表位定位导致识别出由指定的mAb所识别的表位的至少部分（列于表13中）。从表13中可以看出，mAb3B6在由SEQ ID NO:140所代表的氨基酸序列内识别出位于犬PD-1的细胞外结构域中的表位的至少一部分，而 mAb 2G9在由SEQ ID NO: 141所代表的氨基酸序列内识别出表位的至少一部分。另一方面，mAb 1E4和mAb 1B5分别在由SEQ ID NO:142所代表的氨基酸序列内和由SEQ ID NO: 143所代表的氨基酸序列内识别出表位的至少一部分。

如图9A中所描述，通过化学交联、高质量MALDI质谱法和nLC-Orbitrap质谱法进行的测定显示，由犬化抗体2G9所识别的犬PD-1上的表位包含SEQ ID NO: 114的R₆₂、R₆₉、R₇₂和R₇₅。由犬化抗体3B6所识别的犬PD-1上的表位的类似测定包含SEQ ID NO: 114的R₇₅和R₉₀。因此，R₇₅似乎是犬PD-1的一个或多个表位中特别重要的氨基酸残基。有趣的是，在进行了这些分析之后，发现1A1的CDR的氨基酸序列与2G9的相同。PD-1上2G9结合的区与1A1结合的区之间的一致性（通过这两种截然不同的方法所得到）表明，此区含有PD-1表位所包含的氨基酸残基，所述PD-1表位由抗-犬PD-1抗体所识别（参见，下表12和13）。

此外，由本发明的阻断抗体所识别的PD-1的氨基酸序列的区是在犬PD-1的细胞外结构域内。所识别的区包含在以下肽中（参见，下表12和13）。

NQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVM*RLPNGRDFHMSIVAARLNDS (SEQ ID NO:144)

在此肽中，用粗体标示出了更短的肽。此更短的肽是用ProImmune®微阵列识别出的（参见，表12）。

DRIEPGRDRRFRVM*RLPNGR (SEQ ID NO: 145)

值得注意的是，SEQ ID NO: 114的R₆₂、R₆₉、R₇₂和R₇₅均既被所述更长的肽（SEQ ID NO:144）所包含又被所述更短的肽（SEQ ID NO: 145）所包含，而SEQ ID NO: 114的R₉₀仅在所述更长的肽中。这五个精氨酸残基似乎是犬PD-1的一个或多个表位中重要的氨基酸残基。如表6-8中所指出的，标星号的甲硫氨酸残基（*）也有报道是苏氨酸残基。

* 此甲硫氨酸残基也有报道是苏氨酸残基。

^#1A1的CDR与2G9的那些是相同的。

* 此甲硫氨酸残基也有报道是苏氨酸残基。

^# 1E4的CDR与2G9的那些最密切相关。

本文中所引用的所有参考文献均以与其各自单独出版的相同程度引入作为参考，数据库条目（例如，Genbank序列或GeneID条目）、专利申请或专利均被具体且单独指明以引入作为参考。申请人根据37 C.F.R. §1.57(b)(1)意图用该通过引用并入的声明来表示每个和每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，它们中的每一个按照37 C.F.R. §1.57(b)(2)清楚地鉴别即使这样的引用不紧接于通过引用并入的专门声明。如果包含的话，在说明书中包含的通过引用并入的专门声明不以任何方式弱化该通过引用并入的一般声明。本文中对参考文献的引用并非旨在承认该参考文献为相关的现有技术，其也并不构成任何对这些出版物或文件的内容或日期的承认。

本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些内容以外，本领域技术人员从前述描述和附图会明白本发明的不同改变。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能实践本发明。除了本文显示和描述的那些内容以外，本领域技术人员从前述描述会明白本发明的不同改变，并且所述改变落入所附的权利要求书的范围内。

Claims

1.犬可结晶片段区（cFc区），其包含选自SEQ ID NO: 130和SEQ ID NO: 132的氨基酸序列；其中在指定位置的一至七个氨基酸残基被置换，所述指定位置选自P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。

2.根据权利要求1的Fc区，其中所述被置换的一至七个氨基酸残基的所述置换选自P4A、D31A、N63A、G64A、T65A、A93G和P95A。

3.犬化抗体，其包含根据权利要求1或2的cFc区。

4.根据权利要求3的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬化抗体特异性结合犬程序性死亡受体1（犬PD-1）。

5.根据权利要求4的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述cFc区还包含铰链区，所述铰链区包含选自SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 112的氨基酸序列。

6.根据权利要求4或5的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含重链互补决定区1（VHCDR1）、重链互补决定区2（VH CDR2）和重链互补决定区3（VH CDR3），所述重链互补决定区1包含选自SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列；所述重链互补决定区2包含选自SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ IDNO: 34和SEQ ID NO: 35的氨基酸序列；所述重链互补决定区3包含选自SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38和SEQ ID NO: 146的氨基酸序列。

7.根据权利要求4、5或6的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含轻链互补决定区1（VLCDR1）、轻链互补决定区2（VL CDR2）和轻链互补决定区3（VL CDR3），所述轻链互补决定区1包含选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15的氨基酸序列；所述轻链互补决定区2包含选自SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ IDNO: 20和SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；所述轻链互补决定区3包含选自SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。

8.根据权利要求3的犬化抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO: 40、SEQ IDNO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ IDNO: 64和SEQ ID NO: 66的氨基酸序列；其中所述犬化抗体包含cFc区，所述cFc区包含SEQID NO: 130或SEQ ID NO: 132的氨基酸序列，其中在所述cFc区的指定位置处，七个氨基酸残基中的至少一个被不同的氨基酸残基所替换，所述七个氨基酸残基选自SEQ ID NO: 130或SEQ ID NO: 132的P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。

9.根据权利要求8的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含犬轻链，所述犬轻链包含选自SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQ IDNO: 102和SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。

10.具有铰链区的犬可结晶片段区（cFc区）；其中所述cFc区和铰链区包含选自SEQ IDNO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。

11.犬化抗体，其包含根据权利要求10的cFc区和铰链区。

12.根据权利要求11的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬化抗体特异性结合犬程序性死亡受体1（犬PD-1）。

13.根据权利要求12的分离的犬化抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQID NO: 86、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO: 104和SEQ ID NO: 106的氨基酸序列。

14.根据权利要求13的犬化抗体或其抗原结合片段，还包含犬轻链，所述犬轻链包含选自SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 96、SEQID NO: 102和SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。

15.根据权利要求4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14的犬化抗体或其抗原结合片段，其具有以下一项、两项、三项、四项、五项或全部特性：

（i）以1 X 10^-5 M至1 X 10^-12 M的解离常数（Kd）结合至犬PD-1；

（ii）以1 X 10² M^-1s^-1至1 X 10⁷ M^-1s^-1的结合率（k_on）结合至犬PD-1；

（iii）以1 X 10^-3 s^-1至1 X 10^-8 s^-1的解离率（k_off）结合至犬PD-1；

（iv）激发针对肿瘤或病原体的抗原特性记忆应答；

（v）激发体内抗体应答；和

（vi）激发动物个体内的免疫应答。

16.分离的犬化抗体或其抗原结合片段，其特异性结合犬程序性死亡受体1（犬PD-1），其中当结合至犬PD-1时，所述抗体结合至SEQ ID NO: 144内的至少一个氨基酸残基；其中所述抗体及其抗原结合片段结合犬PD-1并且阻止犬PD-1结合至犬程序性死亡配体1（PD-L1）。

17.根据权利要求4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的犬化抗体或其抗原结合片段，其中当结合至犬PD-1时，所述抗体结合至SEQ ID NO: 144内的至少一个氨基酸残基；其中所述抗体及其抗原结合片段结合犬PD-1并且阻止犬PD-1结合至犬程序性死亡配体1（PD-L1）。

18.根据权利要求16或17的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合至选自SEQID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ IDNO: 143和SEQ ID NO: 145的一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基。

19.根据权利要求16、17或18的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合至SEQID NO: 145内的至少一个氨基酸残基。

20.根据权利要求16、17、18或19的犬化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合至选自SEQ ID NO: 114的R62、R69、R72、R75和R90的一个或多个氨基酸残基。

21.犬化抗体或其抗原结合片段，其在与犬PD-1的结合上，与根据权利要求4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的一种或多种犬化抗体交叉竞争；其中所述抗体及其抗原结合片段结合犬PD-1并且阻止犬PD-1结合至PD-L1。

22.核酸，其编码根据权利要求4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的犬化抗体的重链或轻链。

23.根据权利要求22的核酸，其编码选自SEQ ID NO: 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和146的一个或多个氨基酸序列。

24.表达载体，其包含根据权利要求23或24的分离的核酸。

25.宿主细胞，其包含根据权利要求24的一个或多个表达载体。

26.药物组合物，其包含根据权利要求4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体或稀释剂。

27.提高免疫细胞活性的方法，其包括向有此需求的个体施用治疗有效量的根据权利要求26的药物组合物。

28.根据权利要求27的方法，其中所述方法用于：

a. 治疗癌症；

b. 治疗感染或传染性疾病；或

c. 作为疫苗佐剂。