CH636903A5

CH636903A5 - Antibiotiques de desoxynarasine.

Info

Publication number: CH636903A5
Application number: CH1083778A
Authority: CH
Inventors: Walter Mitsuo Nakatsukasa; Gary G Marconi; Norbert Neuss; Robert L Hamill
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-10-20
Filing date: 1978-10-19
Publication date: 1983-06-30
Also published as: EP0001709B1; FI783174A7; IE47665B1; NO783545L; FR2406639A1; AR217869A1; RO77417A; AT362499B; YU241578A; ZA785804B; IL55738A0; HU179463B; IT1101615B; PH14339A; AU519966B2; EP0001709A2; AU4077678A; FR2406639B1; EP0001709A3; DK465978A

Description

Cette invention concerne le complexe antibiotique de désoxynarasine comprenant au moins deux facteurs distincts, la 20-désoxy-narasine et la 20-désoxyépi-17-narasine. Ce complexe est obtenu en cultivant une souche de l'organisme Streptomyces aureofaciens Duggar, NRRL 11181.

L'expression de complexe antibiotique telle qu'elle est utilisée dans le domaine des fermentations et dans ce document ne désigne pas un complexe chimique, mais désigne un mélange de facteurs antibiotiques distincts produits simultanément. Comme le verra le spécialiste de la production d'antibiotiques par fermentation, le rapport des différents facteurs produits dans un complexe antibiotique variera selon les conditions de fermentation utilisées.

Les sels pharmaceutiquement acceptables de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine font également partie de cette invention. Pour simplifier les discussions d'utilité, on utilise l'expression antibiotique de désoxynarasine qui désigne un

élément choisi dans le groupe comprenant le complexe antibiotique de désoxynarasine, la 20-désoxynarasine, la 20-désoxyépi-17-narasine et les sels pharmaceutiquement acceptables de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine.

35 Les antibiotiques de désoxynarasine de cette invention inhibent la croissance d'organismes qui sont pathogènes vis-à-vis des animaux et des plantes. Dans un aspect de cette activité, les antibiotiques de désoxynarasine sont des agents anticoccidiens. En outre, les antibiotiques de désoxynarasine améliorent l'efficacité de l'utili-40 sation des aliments chez les ruminants.

Le complexe antibiotique de désoxynarasine comprend la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine qui sont obtenus dans la fermentation sous la forme d'un mélange. On sépare la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine du complexe de désoxy-45 narasine et les isole sous forme de composés individuels comme décrit ci-après. Le complexe de désoxynarasine contient également des facteurs mineurs qui sont éliminés par les modes opératoires décrits. Le complexe antibiotique de désoxynarasine est soluble dans la plupart des solvants organiques, mais il est insoluble dans l'eau.

50

20-Désoxynarasine

La 20-désoxynarasine, l'un des facteurs de cette invention, a la même configuration absolue que la narasine. La structure de la 20-55 désoxynarasine est représentée dans la formule 1 :

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(1)

636 903

20-Dêsaxyêpi-l 7-nar asine

La structure de la 20-désoxyépi-17-narasine, l'autre facteur de cette invention, est représentée par la formule 2.

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(2)

L'un des meilleurs procédés permettant de différencier la narasine (facteur A de A-28086), la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine, consiste à utiliser la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) du 13C. Le tableau I résume les spectres RMN du 13C de ces composés, chacun sous forme d'acide libre, effectués dans le deutérochloroforme (données en parties par million).

Tableau I

Tableau I (suite)

Narasine

20-Désoxy-narasine

20-Désoxyépi-17-narasine

216,5

216,8

218,0

178,4

177,9

177,6

132,0

125,2

129,2

122,0

121,9

125,8

106,5

105,0

107,0

99,6

99,3

99,4

88,5

88,1

85,6

78,4

78,1

78,2

77,1

76,6

77,7

75,1

75,0

77,0

73,8

73,7

73,3

72,0

72,3

72,6

70,8

71,1

68,5

68,3

69,1

67,6

56,2

57,7

56,1

49,9

49,3

49,9

49,3

48,7

49,3

41,0

38,9

41,1

40,0

36,6

38,7

38,8

36,4

36,6

36,3

36,2

35,6

35,7

35,5

32,8

33,9

32,9

31,7

33,7

30,9

31,7

32,8

30,5

30,3

30,5

29,4

29,6

29,3

29,0

28,0

28,1

28,2

26,1

25,8

24,7

24,0

23,7

23,3

21,5

21,8

19,0

18,8

21,1

18,0

17,5

18,4

16,4

16,3

18,2

15,7

15,8

14,3

14,1

14,3

13,2

13,3

13,7

13,0

13,2

13,5

Narasine

20-Désoxy-narasine

20-Désoxyépi-17-narasine

12,1

12,5

12,1

7,0

7,3

7,7

6,3

6,5

6,4

D'autres bons procédés permettant de différencier la 20-30 désoxynarasine de la 20-désoxyépi-17-narasine et des facteurs connus de l'antibiotique A-28086 comprennent la Chromatographie sur papier et la Chromatographie sur couche mince. Par exemple, les Rf de la narasine (facteur A de A-28086), du facteur D de A-28086, de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine dans 35 divers systèmes de Chromatographie sur papier, utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme organisme de détection, sont donnés dans le tableau II.

Les Rf de ces antibiotiques dans un système chromatographique sur couche mince type en utilisant du gel de silice sont données dans 40 le tableau III.

(Tableaux en tête de la page suivante)

Les antibiotiques de désoxynarasine (20-désoxynarasine et 20-désoxyépi-17-narasine) sont solubles dans divers solvants organiques 45 comme, par exemple, le méthanol, l'éthanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le benzène, mais ils sont seulement légèrement solubles dans les solvants organiques non polaires comme l'hexane, et ils sont insolubles dans l'eau. On notera cependant que la 20-désoxynarasine sous so forme d'acide libre est instable dans les alcools, en se transformant en 20-désoxyépi-17-narasine sous forme d'acide libre. Par exemple, on dissout 435,1 mg de 20-désoxynarasine acide dans 40 ml de méthanol et on laisse reposer à la température ambiante pendant 4 h. Puis on évapore la solution à siccité sous vide; on redissout le résidu 55 dans du dioxanne et on le lyophilise et l'on obtient 417,8 mg de 20-désoxyépi-17-narasine acide.

Une autre substance, qui coïncide au point de vue chromatographique avec le composé A-28086-I qui est décrit dans le brevet des EUA N° 4036384, est produite en même temps que le complexe de 60 désoxynarasine. Bien que cette substance précipite initialement avec les antibiotiques de désoxynarasine, on l'en sépare facilement par Chromatographie sur gel de silice. Par Chromatographie sur couche mince de gel de silice, cette substance est moins polaire que la 20-désoxynarasine ou que la 20-désoxyépi-17-narasine quand on utilise «s l'acétate d'éthyle comme solvant de développement. Un réactif de vanilline par pulvérisation (3% de vanilline dans le méthanol +0,5 ml de H2S04 concentré pour 100 ml de solution) convient pour la détection. Après pulvérisation avec la vanilline et chauffage,

5

Tableau II

636 903

Rf

Système de solvant

Narasine

Facteur D de A-28086

Désoxynarasine

Epidésoxy-narasine

Eau/méthanol/acétone (12/3/1) -ajusté à pH 10,5 avec NH4OH, puis abaissé à pH 7,5 avec H3P04

0,20

0,11

0,08

0,21

Eau/méthanol/acétone (12/3/1) -ajusté à pH 10,5 avec NH4OH, puis abaissé à pH 7,5 avec HCl

0,42

0,25

0,21

0,44

1 % de méthylisobutylcétone (MIBK), 0,5% de NH40H dans l'eau

0,56

0,38

0,33

0,66

Benzène saturé d'eau

0,51

0,74

0,55

Eau/MIBK/acétate d'éthyle (98/1/1)

0,77

0,61

0,51

0,68

Tableau III

Système de solvant

Rf

Narasine

Facteur D de A-28086

Désoxynarasine

Epidésoxy-narasine

Acétate d'éthyle

0,29

0,35

0,42

0,74

cette substance donne, comme A-28086-I, une tache bleue, alors que 35 les antibiotiques de désoxynarasine donnent des taches jaune brillant qui foncent ensuite.

La 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine peuvent former des sels. Les sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux et d'amines pharmaceutiquement acceptables de la 20- 40 désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine font également partie de cette invention. Les sels pharmaceutiquement acceptables sont des sels dans lesquels la toxicité du composé en tant que tout vis-à-vis des animaux à sang chaud n'est pas accrue par rapport à la forme non-sel. Des sels de métaux alcalins et alcalino-terreux types 45 et appropriés de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de césium, de rubidium, de baryum, de calcium et de magnésium. Les sels d'amine appropriés de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine comprennent les sels d'ammonium et les sels 50 d'(alkyl en Ci-C4)ammonium primaires, secondaires et tertiaires et d'hydroxy(alkyl en C1-C2)ammonium primaires, secondaires et tertiaires. Les sels d'amine types comprennent ceux formés par réaction de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine avec l'hy-droxyde d'ammonium, la méthylamine, la s-butylamine, l'isopropyl- 55 amine, la diéthylamine, la diisopropylamine, l'éthanolamine, la tri-éthylamine, le 3-amino-l-propanol, etc.

On prépare les sels cationiques de métaux alcalins et alcalino-terreux de 20-désoxynarasine et de 20-désoxyépi-17-narasine, selon les modes opératoires couramment utilisés pour la préparation des 60 sels cationiques. Par exemple, on dissout la forme acide libre de l'antibiotique dans un solvant approprié comme l'acétone ou un mélange de dioxanne et d'eau; on ajoute à cette solution une solution contenant la quantité stœchiométrique de la base minérale désirée. On peut isoler le sel ainsi formé par des procédés de routine, 65 comme la filtration ou l'évaporation du solvant.

On peut préparer d'une manière similaire les sels formés avec des aminés organiques. Par exemple, on peut ajouter l'amine gazeuse ou liquide à une solution du facteur antibiotique dans une solution appropriée comme l'acétone, et on peut chasser par évaporation le solvant et l'excès d'amine.

Une méthode préférée pour la préparation d'un sel désiré de l'un des antibiotiques de désoxynarasine est un choix initial approprié du mode opératoire d'isolation, comme par exemple l'ajustement du pH du bouillon avec une base appropriée ou l'addition d'un sel cationi-que approprié au solvant d'extraction.

On sait, dans le domaine pharmaceutique vétérinaire, que la forme d'un antibiotique n'est pas importante quand on traite un animal par l'antibiotique. Dans la plupart des cas, les conditions existant dans l'animal transforment le médicament en formes autres que celle sous laquelle il est administré. La forme sel sous laquelle on peut l'administrer est donc sans importance pour le procédé de traitement. La forme sel peut cependant être choisie pour des raisons d'économie, de commodité et de toxicité.

Les nouveaux antibiotiques de cette invention sont obtenus en cultivant une souche productrice de désoxynarasine de Streptomyces aureofaciens dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu de culture approprié jusqu'à production d'une activité antibiotique substantielle. On recueille les antibiotiques en utilisant divers modes opératoires d'isolement et de purification couramment utilisés et connus dans le domaine.

L'organisme utilisable pour la préparation des antibiotiques de désoxynarasine est obtenu par mutation, induite par la n-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, de Streptomyces aureofaciens NRRL 8092. La base taxinomique sur laquelle Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 a été classé comme une souche de Streptomyces aureofaciens Duggar, est décrite dans le brevet des EUA N° 4038384.

La culture de Streptomyces aureofaciens utile pour la production des antibiotiques de désoxynarasine a été déposée et fait partie de la collection de cultures de Northern Regional Research Center, US Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois,

636903

6

61604, où elle est disponible au public sous le N° NRRL 11181. Le dépôt a été fait le 11 octobre 1977.

La culture, qui est identifiée ici comme étant NRRL 11181, a été isolée et a subi une mutation à partir d'une culture de Streptomyces aureofaciens qui a été isolée initialement d'un échantillon de sol obtenu au mont Ararat, en Turquie. L'isolât de sol initial est cultivé sur des plaques de gélose, et l'on obtient des sous-cultures en prélevant les colonies distinctes du micro-organisme de la surface de la plaque de gélose. L'un de ces isolats obtenu par culture de l'isolât de sol initial est la culture qui est identifiée ici comme étant NRRL 5758.

La culture précédente naturellement sélectionnée est de nouveau repiquée et l'on en choisit une colonie unique. On répète huit fois ce processus de sélection naturelle, et l'on choisit, pour une sélection plus poussée, un isolât d'une seule colonie à la neuvième génération.

On cultive l'isolât à la neuvième génération dans un milieu de gélose chimiquement défini avec 1 % de galactose comme seule source de carbone. On prépare une suspension de spores en agitant par ultrasons le milieu de gélose pour déloger les spores, et l'on réduit la quantité de fragments d'hyphes en filtrant la suspension sur un papier-filtre Whatman N° 1.

On cultive la suspension de spores dans un milieu liquide complexe dont le pH a été ajusté à 8,8 et qui contient 2 mg/ml de N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, pendant 72 h à 30° C. Puis on récolte les cultures poussant sur le milieu et on les homogénéise avec un broyeur de tissus.

On dilue la culture homogénéisée et on la repique sur des plaques de gélose et on fait incuber à 30° C jusqu'à ce qu'on puisse distinguer des colonies distinctes. On utilise l'une des colonies sélectionnées distinctes pour démarrer une nouvelle culture qui est identifiée ici comme NRRL 8092.

On cultive la culture identifiée comme étant NRRL 8092 dans un milieu de gélose chimiquement défini avec du glucose comme seule source de carbone. On prépare une suspension comprenant à la fois des spores et des fragments d'hyphes, en agitant par ultrasons le milieu de gélose. Puis on expose la suspension de spores et d'hyphes mélangés à 2 mg/ml de N-méthyl-N'-méthyl-N'-nitro-N-nitro-soguanidine dans un milieu liquide complexe à pH 8,8 pendant 96 h sur un agitateur à 30° C, puis on recueille la culture, on l'homogénéise et on la repique comme on l'a décrit dans l'étape immédiatement précédente. On cultive l'une des colonies individuelles choisies à partir de ces plaques de gélose pour préparer la culture qui est identifiée ici comme étant NRRL 11181.

L'homme de l'art verra que, étant donné la présente invention, il doit maintenant être possible de former des souches supplémentaires qui ont essentiellement les mêmes capacités biosynthétiques que Steptomyces aureofaciens NRRL 11181 (c'est-à-dire la possibilité de produire de la 20-désoxynarasine et de la 20-désoxyépi-17-narasine), en soumettant Streptomyces aureofaciens NRRL 5758, NRRL 8092 ou NRRL 11181, à un traitement mutagène. Bien que l'on ait utilisé la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine pour obtenir Streptomyces aureofaciens NRRL 11181, on pourrait utiliser d'autres agents mutagenes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevée, les rayons radioactifs et d'autres agents chimiques, pour induire une mutagenèse similaire. Fait donc partie de la présente invention le procédé de production du complexe antibiotique de désoxynarasine qui consiste à cultiver un Streptomyces aureofaciens ayant essentiellement les mêmes capacités biosynthétiques que NRRL 11181.

Le milieu de culture utilisé pour cultiver Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie de production, de rendement optimal et de facilité d'isolement du produit, on préfère cependant certains milieux de culture. Ainsi, par exemple, les sources de glucide préférées dans une fermentation à grande échelle sont la dex-trine de tapioca et le saccharose, bien que l'on puisse également utiliser le glucose, l'amidon de maïs, le fructose, le mannose, le maltose, le lactose, etc. L'huile de maïs, l'huile d'arachide, l'huile de soja et l'huile de poisson sont d'autres sources de carbone utilisables. Une source d'azote préférée est une caséine hydrolysée par voie enzyma-tique, bien que les peptones, la farine de soja, la farine de coton, les aminoacides comme l'acide glutamique, etc., soient également utilisables. Parmi les sels minéraux nutritifs qui peuvent être incorporés dans les milieux de culture, citons les sels solubles courants pouvant fournir des ions sodium, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate, etc.

Des oligo-éléments essentiels nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme doivent également être inclus dans le milieu de culture. Ces oligo-éléments existent souvent sous forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu en quantité suffisante pour satisfaire les exigences de croissance de l'organisme.

Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'est-à-dire 0,2 ml/1) d'un agent antimoussant comme le polypropylèneglycol, aux milieux de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes.

Bien que ce ne soit pas essentiel, on améliore la production de l'antibiotique par addition d'une petite quantité d'huile, comme l'huile de soja.

Pour la production de quantités substantielles des antibiotiques de désoxynarasine, on préfère la fermentation aérobie en immersion dans des réservoirs. On peut obtenir de plus petites quantités par culture sur flacon agité. En raison du temps de latence dans la production d'antibiotiques qui est couramment associé à l'inoculation de grands réservoirs avec la forme spore de l'organisme, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume de milieu de culture avec la forme spore ou avec des fragments mycéliens de l'organisme pour obtenir une culture de l'organisme fraîche et en croissance active. On transfère l'inoculum végétatif dans un plus grand réservoir. Le milieu utilisé pour la croissance de l'inoculum végétatif peut être le même que celui utilisé pour les fermentations à plus grande échelle, mais on peut également utiliser d'autres milieux.

L'organisme producteur de désoxynarasine peut être cultivé à des températures comprises entre environ 20 et environ 40° C. Il semble que la production optimale de désoxynarasine se fasse à des températures d'environ 27-30° C.

Comme il est courant dans les processus de culture aérobie en immersion, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour une croissance efficace de l'organisme, le volume d'air utilisé dans la production en réservoir est de préférence supérieur à 0,1 volume d'air par volume de milieu de culture par minute. Pour une production efficace de l'antibiotique, le volume d'air utilisé dans la production en réservoir est de préférence supérieur à 0,25 volume d'air par volume de milieu de culture par minute. Des taux supérieurs en oxygène dissous ne diminuent pas la production de l'antibiotique.

On peut suivre la production des antibiotiques pendant la fermentation, en déterminant l'activité antibiotique d'échantillons du bouillon ou d'extraits des solides mycéliens, vis-à-vis d'organismes dont on sait qu'ils sont sensibles aux antibiotiques. Un organisme d'analyse utile pour tester les antibiotiques de la présente invention est Bacillus subtilis ATCC 6633. On effectue commodément la bioanalyse par analyse sur disque de papier sur plaques de gélose.

Un autre procédé commode de surveillance est l'analyse turbidi-métrique sur un système semi-automatisé (système d'analyse microbiologique Autoturb, marque de fabrique de Elanco) décrit par N.R. Kuzel et F.W. Kavanaugh dans «J. Pharmaceut. Sci.», 60 (5), 764 et 767 (1971). Pour tester les antibiotiques de désoxynarasine, on utilise les paramètres d'essais suivants: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 dans un bouillon nutritif (pH 7) que l'on fait incuber pendant 4 h à 37° C. On dissout les échantillons d'essai et la référence dans un mélange 1/1 de méthanol et d'eau. La référence, le facteur A de l'antibiotique A-28086, est présenté au carrousel de l'Autoturb à des concentrations de 1,2,3,4 et 5 (xg/ml.

Le pH initial du milieu de culture non inoculé varie avec le milieu utilisé. En général, le pH doit être compris entre 6,0 et 7,5. Le

5

10

1S

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

636 903

pH de récolte à la fin de la fermentation est généralement légèrement supérieur, compris entre 6,5 et 8,0.

En général, l'activité antibiotique est détectable dès le second jour de la fermentation. La production maximale de l'activité antibiotique se produit généralement entre le quatrième et le dixième jour.

Après leur production dans des conditions de fermentation aérobie en immersion, les antibiotiques de désoxynarasine précédemment décrits peuvent être recueillis du milieu de fermentation par des procédés couramment utilisés dans le domaine. Les antibiotiques produits pendant la fermentation se trouvent tant dans la masse mycélienne que dans le bouillon filtré. On effectue donc la récupération maximale des antibiotiques de désoxynarasine par une combinaison de méthodes comprenant la filtration, l'extraction et la Chromatographie par adsorption. Un solvant préféré pour séparer les antibiotiques de désoxynarasine du bouillon de fermentation entier ou filtré est l'acétate d'éthyle, bien que d'autres solvants couramment utilisés soient satisfaisants.

Un procédé particulièrement avantageux pour séparer les antibiotiques de désoxynarasine consiste à abaisser le pH du bouillon de fermentation entier à environ 3,0. A ce pH, on sépare commodément les antibiotiques de désoxynarasine de la masse mycélienne par filtration. Ce procédé est décrit pour la récupération des antibiotiques apparentés, les facteurs A, B et D de l'antibiotique A-28086 et la sa-linomycine, dans le brevet des EUA N° 4009262. Un autre aspect avantageux de ce procédé consiste à ajouter un bicarbonate, comme le bicarbonate de sodium par exemple, au bouillon entier en quantités correspondant à environ 1 g/1. En utilisant ce procédé, on sépare commodément les antibiotiques de désoxynarasine de la masse mycélienne sous forme de sels. Le méthanol est un solvant préféré permettant de séparer les antibiotiques de la masse mycélienne, mais d'autres alcools ou cétones inférieurs conviennent également.

La distillation azéotrope peut également être utilisée de façon avantageuse dans la récupération des antibiotiques de désoxynarasine. Dans ce procédé, on ajoute au bouillon de fermentation aqueux un solvant organique qui forme un azéotrope approprié avec l'eau. Ce mélange de solvant et de bouillon est soumis à une distillation azéotrope pour éliminer au moins la moitié de l'eau du bouillon, ce qui laisse un mélange d'eau et de solvant dans lequel les antibiotiques de désoxynarasine sont dissous dans le solvant organique. On peut séparer les sous-produits insolubles par des moyens appropriés comme la filtration ou la centrifugation. On peut ensuite récupérer les antibiotiques de désoxynarasine de la solution organique par des modes opératoires bien connus comme l'évaporation du solvant, la précipitation par addition d'un non-solvant ou l'extraction.

Les solvants organiques qui forment des azéotropes appropriés avec l'eau permettant d'effectuer un tel mode opératoire de récupération comprennent, à titre d'illustration, l'alcool butylique, l'alcool amylique, l'alcool hexylique, l'alcool benzylique, l'acétate de butyle, l'acétate d'amyle, le 1,2-dichloroéthane, la 3-pentanone, la 2-hexanone, le benzène, la cyclohexanone, le toluène, les xylènes, etc.

Il est particulièrement avantageux de récupérer le produit par distillation azéotrope dans les procédés de fermentation sur grande échelle. L'eau et le solvant prélevés en tête dans l'azéotrope peuvent être séparés par des techniques connues, puis recyclés pour être à nouveau utilisés. L'eau ainsi recueillie est exempte d'impuretés et ne nécessite pas un processus de rejet de l'eau.

Une purification plus poussée des antibiotiques de désoxynarasine comprend des opérations supplémentaires d'extraction et d'adsorption. On peut utiliser avantageusement des matériaux ad-sorbants comme le gel de silice, le charbon, Florisil ® (silicate de magnésium, de Floridin Co.), etc.

Ou bien on peut utiliser les matières solides de la culture, comprenant les constituants du milieu et le mycélium sans extraction ou séparation, mais de préférence après enlèvement de l'eau, comme source de complexe antibiotique de désoxynarasine. Par exemple, après production de l'activité antibiotique de désoxynarasine, on peut sécher le milieu de culture par lyophilisation ou séchage au tambour et le mélanger directement dans le prémélange alimentaire.

Dans un autre aspect, après production de l'activité de désoxynarasine dans le milieu de culture, on peut séparer le mycélium et le sécher pour obtenir un produit que l'on peut utiliser directement dans un prémélange alimentaire. Quand on sépare le mycélium pour une telle utilisation, l'addition de carbonate de calcium (environ 10 g/1) aide la filtration et donne un produit séché amélioré.

Dans les conditions utilisées de cette façon, on recueille la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine comme facteurs principaux de la souche de Streptomyces aureofaciens décrite précédemment et désignée par NRRL 11181. On recueille également quelques facteurs mineurs de Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 en quantités trop faibles pour permettre la caractérisation. Bien que le rapport des facteurs varie selon les conditions de fermentation et d'isolement utilisées, on obtient en général plus de 20-désoxyépi-17-narasine que de 20-désoxynarasine.

On sépare l'une de l'autre la 20-désoxynarasine et la 20-désoxy-épi-17-narasine et on les isole comme composés distincts en utilisant des procédés bien connus comme la Chromatographie sur colonne, la chormatographie sur couche mince, la répartition à contre-courant, etc. Par exemple, on utilise la Chromatographie sur colonne de gel de silice pour séparer la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine en éluant la colonne avec divers mélanges solvants. Par exemple, en utilisant des mélanges de benzène et d'acétate d'éthyle sur une colonne de gel de silice, la 20-désoxyépi-17-narasine est éluée d'abord, puis la 20-désoxynarasine est éluée. La Chromatographie sur couche mince de gel de silice, en utilisant 100% d'acétate d'éthyle comme solvant, est un procédé commode pour contrôler le cours de l'élution.

Les antibiotiques de désoxynarasine de cette invention sont des agents antibactériens. Par exemple, l'activité microbiologique relative de la 20-désoxyépi-17-narasine (acide libre) est décrite dans le tableau IV. On utilise la méthode classique de diffusion à partir de disques.

Tableau IV

Organisme d'essai

Zone d'inhibition (mm)

300 (ig/disque

30 ng/disque

Staphylococcus aureus 3055

16,9

13,8

Staphylococcus aureus 30741

19,5

15,4

Staphylococcus aureus 3130 2

19,0

17,2

Streptococcus pyogenes (groupe A)

12,0

10,0

Streptococcus sp. (groupe D)

17,0

14,6

Diplococcus pneumoniae

16,0

13,0

1 Résistant à la pénicilline G.

2 Résistant à la méthicilline.

Sous un aspect, les antibiotiques de désoxynarasine inhibent la croissance des bactéries anaérobies. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) auxquelles la 20-désoxyépi-17-narasine (acide libre) inhibe diverses bactéries anaérobies, concentrations déterminées par l'essai classique de dilution sur gélose, sont résumées dans le tableau V. Les lectures finales sont faites après une période d'incubation de 24 h.

Tableau V

Bactéries anaérobies

CIM (ng/ml)

Actinomyces israelii W855

8

Clostridium perfringens 81

16

Clostridium septicum 1128

16

Eubacterium aerofaciens 1235

16

Peptococcus asaccharolyticus 1302

8

Peptococcus prevoti 1281

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

636 903

Tableau V (suite)

Bactéries anaérobies

CIM (ng/ml)

Peptostreptococcus anaer obius 1428

4

Peptostreptococcus intermedius 1264

4

Propionibacterium acnes 79

2

Bacteroides fragilis 111

>128

L'activité contre Mycoplasma est également un autre aspect utile de l'activité antimicrobienne des antibiotiques de désoxynarasine. Les espèces de Mycoplasma, également connues sous le nom d'organismes de types pleuro-pneumonie, sont pathogènes vis-à-vis de l'homme et de divers animaux. Des agents actifs vis-à-vis de ce type d'organismes sont particulièrement recherchés dans l'industrie de la volaille. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) de la 20-désoxyépi-17-narasine sous forme d'acide libre vis-à-vis d'espèces Mycoplasma types, déterminées par des études de dilution de bouillon in vitro, sont résumées dans le tableau VI.

Tableau VI

Organismes

CIM (ng/ml)

Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma synoviae

25,0 50,0 50,0

Les antibiotiques de désoxynarasine sont également des agents antiviraux. Par exemple, la 20-désoxyépi-17-narasine est active vis-à-vis du rhinovirus type 3, du virus vaccinia, du virus herpès et du virus A de la grippe, comme le montrent les essais de suppression sur plaques in vitro, similaires à ceux décrits par Siminoff, «Applied Mi-crobiology», 9 [1], 66-72 (1961).

Dans un aspect de cette invention, on peut donc administrer un antibiotique de désoxynarasine par voie orale, locale ou parentérale, à des mammifères pour lutter contre les virus. Des niveaux de doses utiles pour la prévention ou le traitement d'une maladie virale varient entre environ 1 et environ 5 mg/kg de poids corporel, selon le virus et selon que l'on utilise le produit de façon prophylactique ou thérapeutique.

En outre, on peut utiliser des solutions contenant un antibiotique de désoxynarasine, de préférence avec un surfactif, pour décontaminer l'habitat in vitro sur lequel sont présents les virus comme les virus polio ou herpès. Des solutions contenant d'environ 1 à environ 1500 (ig/ml d'un antibiotique de désoxynarasine sont efficaces pour lutter contre les virus.

Les toxicités aiguës de la 20-désoxyépi-17-narasine (acide libre) et de la 20-désoxynarasine (sel de sodium), quand on les administre par voie intrapéritonéale à des souris, sont respectivement de 201 mg/kg et 5 mg/kg exprimées en DLS0.

L'activité anticoccidienne est une propriété importante des antibiotiques de désoxynarasine de cette invention. Par exemple, des expériences in vitro montrent que la 20-désoxynarasine (sel de sodium) et la 20-désoxyépi-17-narasine (acide libre) sont actives contre Eimeria tenella, l'organisme protozoaire le plus souvent associé à la coccidiose, à des taux aussi faibles que 0,2 ppm.

Une expérience d'alimentation chez de jeunes poulets confirme que les antibiotiques de désoxynarasine ont une activité anticoccidienne in vivo. Dans cette expérience, le sel de sodium de la 20-désoxynarasine, administré à raison de 100 ppm dans l'aliment de poulet soumis à Eimeria tenella, empêche la mortalité, améliore les gains de poids et diminue le nombre de lésions chez les poulets. Les résultats de cette expérience sont résumés dans le tableau VII.

Tableau VII

Traitement1

%

mortalité

Gain de poids (g)

Chiffre des lésions2

Témoins infectés

37,5

114

4,00

20-désoxynarasine

(100 ppm)

0

185

0,13

1 Deux cages de 4 poulets pour chaque traitement.

2 Chiffre maximal possible: 4,00.

Pour la prévention ou le traitement de la coccidiose chez la volaille, on administre aux volatiles une quantité anticoccidienne efficace de l'antibiotique de désoxynarasine, de préférence par voie orale tous les jours. L'antibiotique de désoxynarasine peut être fourni sous différentes façons, mais il est le plus commodément fourni avec un support physiologiquement acceptable, de préférence les aliments ingérés par les volatiles. Bien que l'on puisse considérer divers facteurs dans la détermination de la concentration appropriée de l'antibiotique de désoxynarasine, les taux d'administration seront généralement compris entre 0,003 et 0,03% du poids de l'aliment ne comportant pas de médicament, et de préférence compris entre 0,004 et 0,02%.

Cette invention concerne également des compositions alimentaires anticoccidiennes pour la volaille comprenant un aliment approprié et d'environ 35 à environ 180 g/t d'un antibiotique de désoxynarasine.

L'aptitude à améliorer l'efficacité de l'utilisation des aliments chez les animaux est une autre propriété importante des antibiotiques de désoxynarasine. Par exemple, les antibiotiques de désoxynarasine améliorent l'efficacité de l'utilité des aliments chez les ruminants qui ont une fonction du rumen développée.

Comme décrit, l'efficacité de l'utilisation des glucides chez les ruminants est accrue par des traitements qui stimulent la flore du rumen de l'animal à produire des propionates plutôt que des acétates ou des butyrates. L'efficacité de l'utilisation des aliments peut être contrôlée en observant la production et la concentration de propionates dans les fluides du rumen, en utilisant des méthodes comme celles décrites dans le brevet des EUA N° 4038384.

Les résultats des essais in vitro avec la 20-désoxynarasine (sel de sodium) et la 20-désoxyépi-17-narasine (acide libre), montrant le rapport des concentrations en acides gras volatils (AGV) dans des flacons traités aux concentrations dans des flacons témoins, sont donnés dans le tableau VIII.

(Tableau en tête de la page suivante)

Les antibiotiques de désoxynarasine de cette invention sont typiquement efficaces pour augmenter les propionates et donc l'efficacité de l'utilisation des aliments, quand on les administre à des ruminants par voie orale à des doses d'environ 0,05 à environ 5,0 mg/ kg/d. On obtient les résultats les plus intéressants à des taux d'environ 0,1 à environ 2,5 mg/kg/d. Une méthode préférée pour l'administration d'un antibiotique selon cette invention consiste à le mélanger avec les aliments pour animaux; cependant, il peut être administré d'autres façons, par exemple dans des comprimés, des potions, des bols ou des capsules. La préparation de ces diverses formes po-sologiques peut être effectuée par les procédés bien connus dans le domaine vétérinaire. Chaque unité posologique doit contenir une quantité du composé de cette invention directement proportionnelle à la dose quotidienne appropriée pour l'animal à traiter.

Cette invention concerne en outre des compositions alimentaires conçues pour l'engraissement de ruminants comme le bétail et les moutons. Ces compositions alimentaires comprennent un aliment et de 1 à 30 g/t d'un antibiotique de désoxynarasine.

La dysenterie porcine est une maladie courante dans le monde, et provoque actuellement des pertes importantes chez les éleveurs de porcs. Le brevet des EUA N° 3947586 décrit que les antibiotiques

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

Tableau Vili

636 903

Composé

Dose (Hg/ml)

Rapport des traités aux témoins

% molaire d'acétate

% molaire de propionate

% molaire de butyrate

AGV totaux

20-Désoxyépi-17-narasine

10

0,9093

1,2665*

0,6560

1,0325

20-Désoxyépi-17-narasine

5

0,9237

1,1836*

0,8201

1,0487

20-Désoxyépi-17-narasine

2

0,9581

1,0858

0,9414

1,0717

20-Désoxynarasine

1

0,8727

1,4597*

0,3942

1,2096

20-Désoxynarasine

0,3

0,9084

1,3799*

0,4582

1,1829

20-Désoxynarasine

0,1

0,9504

1,2148*

0,6870

1,1892

* Statistiquement significatif (P<0,01) par l'essai de la différence la moins significative à deux extrémités (R.G.D. Steel et J.H. Torries, «Principles and Procédures of Statistics», McGraw-Hill, New York, N.Y., 1960, p. 106).

du type polyéther sont utiles dans la prévention et le traitement de la 20 dysenterie porcine. Comme les antibiotiques de désoxynarasine sont de nouveaux membres de la catégorie des antibiotiques du type polyéther, ils doivent également être efficaces dans le traitement et la prévention de la dysenterie porcine, il est préférable d'incorporer une quantité efficace d'un antibiotique de désoxynarasine dans les 25 aliments. Les antibiotiques de désoxynarasine de cette invention doivent être typiquement efficaces dans la prévention ou la lutte contre la dysenterie porcine, quand on les administre à des porcs par voie orale à des doses d'environ 35 à environ 150 g/t de composé actif. Un taux particulièrement préféré doit être d'environ 100 g de 30 composé actif par tonne. Bien que la méthode d'administration préférée consiste à mélanger le composé avec l'aliment des animaux, il peut également être administré d'autres façons, par exemple sous forme de comprimés, de potions, de bols ou de capsules. Chaque unité posologique doit contenir une quantité de l'antibiotique de 35 cette invention directement proportionnelle à la dose quotidienne appropriée pour l'animal à traiter.

Cette invention concerne en outre des compositions alimentaires pour porcs comprenant un aliment approprié et une quantité efficace d'antibiotique de désoxynarasine. Comme décrit, une quantité 40 efficace d'antibiotique de désoxynarasine est typiquement une quantité comprise entre environ 35 et environ 150 g/t d'aliment.

Les antibiotiques de désoxynarasine sont des agents antiviraux et sont également actifs vis-à-vis des bactéries anaérobies, comme Clostridium perfringens. Les antibiotiques de désoxynarasine sont donc 45 intéressants pour le traitement,ou la prévention des entérites chez la volaille, les porcs, le bétail et les moutons et dans le traitement de l'entérotoxémie chez les ruminants.

Certains composés de désoxynarasine (la 20-désoxynarasine et ses sels) présentent des propriétés de fixation d'ions et de transport 50 d'ions et sont donc des agents ionophores (porteurs d'ions) (voir B.C. Pressman, «Alkali Metal Chelators—The Ionophores», in «Inorganic Biochemistry,» vol. 1, G.L. Eichhorn, Elsevier, 1973). Ces composés peuvent être utilisés quand on désire l'élimination sélective d'un cation particulier. Des exemples de telles utilisations 55 comprennent l'élimination et la récupération des ions argent des solutions utilisées en photographie, l'élimination des cations toxiques des effluents dans l'environnement, et le dessalement de l'eau de mer. On peut utiliser un composé de désoxynarasine comme un composant d'une électrode spécifique aux ions (voir le brevet des 60 EUA N° 3753487). Ces composés modifient la perméabilité aux cations des membranes naturelles ou artificielles. On peut donc utiliser un composé de désoxynarasine comme un composant d'une membrane utilisée pour le transport sélectif des cations vis-à-vis d'un gradient de concentration. Une application potentielle de ces 65 propriétés se trouve dans la récupération des métaux lourds et précieux sur une base industrielle [voir E.L. Cussler, D.F. Evans, et Sister M.A. Matesick, «Science», 172, 377 (1971)].

Dans un autre aspect encore, la 20-désoxynarasine et ses sels sont actifs comme inhibiteurs de l'enzyme ATPase. L'ATPase, qui est une enzyme sensible aux métaux alcalins que l'on trouve dans les membranes cellulaires, est utilisée dans l'énergie nécessaire pour le transport actif. Le transport actif désigne la série d'opérations nécessitant de l'énergie grâce auxquelles les fluides intracellulaires et extracellulaires maintiennent leurs compositions. Les inhibiteurs de l'ATPase réduisent l'énergie nécessaire pour le transport actif. Des essais in vitro ont montré que la 20-désoxynarasine (sel de sodium) inhibe l'ATPase utilisée dans le transport des cations dans la mito-chondrie du foie à une concentration demi-efficace de 0,065 |tg/ml.

La 20-désoxynarasine et ses sels sont également des agents cardiotoniques potentiels. Dans des essais utilisant une oreillette de cobaye isolée, par exemple, la 20-désoxynarasine augmente la con-tractilité cardiaque. La réponse à cet essai est exprimée comme un pourcentage de la tension de contraction maximale qui pourrait être provoquée par une dose de norêpinéphrine (10_4M). La 20-désoxynarasine (sel de sodium), à une concentration 10~5M, donne une augmentation moyenne (+ erreur type) de la tension de contraction de 43,8 ± 1,4 (n=4) %. Pour une description plus détaillée de cet essai, voir le brevet des EUA N° 3985893.

L'invention comprend donc le procédé permettant d'améliorer la force de contraction du muscle cardiaque chez un mammifère à sang chaud, qui consiste à administrer une dose non toxique efficace de 20-désoxynarasine ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. Une dose non toxique efficace est une dose dans l'intervalle d'environ 30 à environ 500 ng/kg de poids corporel. Un intervalle de dose préféré est d'environ 30 à environ 100 ng/kg de poids corporel. Pour ce procédé, on utilise l'antibiotique par voie parentérale, de préférence par perfusion intraveineuse. Une méthode d'administration appropriée est le goutte-à-goutte, où l'antibiotique est incorporé dans une solution intraveineuse classique comme une solution de dextrose.

La 20-désoxynarasine est de préférence administrée à des doses inférieures à environ 100 (ig/kg jusqu'à ce qu'on observe l'amélioration recherchée de la force de contraction. Puis la quantité de 20-désoxynarasine administrée peut être réglée par la vitesse de perfusion nécessaire pour maintenir la réponse désirée. Comme avec l'administration clinique d'autres agents inotropes, la dose de 20-désoxynarasine administrée peut varier dans un cas clinique donné comme des facteurs tels que la tolérance de l'individu à la 20-désoxy-narasine, la nature de la maladie du cœur, par exemple le degré d'en-dommagement du muscle cardiaque, et l'âge et l'état physique général du patient.

Le procédé de cette invention comprenant l'utilisation de l'agent inotrope positif, la 20-désoxynarasine, peut être utilisé dans divers cas cliniques classés de manière générale comme choc affectant le cœur. De tels troubles comprennent, par exemple, l'infarctus du

636903

10

myocarde, la crise cardiaque et les chocs post-opératoires affectant le cœur.

Pour illustrer plus complètement le fonctionnement de cette invention, on donne les exemples suivants.

Exemple 1

A. Fermentation en flacon agité

On prépare une culture de Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 et on la maintient sur une culture de gélose inclinée ayant la composition suivante:

Ingrédient

Quantité

k2hpo4

2g

MgS04'7H20

0,25 g nh4no3

2g

CaC03

2,5 g

FeS04-7H20

0,001 g

MnCI2-7H20

0,001 g

ZnS04-7H20

0,001 g

Glucose

10 g

Gélose

20 g

Eau désionisée q.s. 1 1

pH (non ajusté)

7,7

On inocule la culture inclinée avec Streptomyces aureofaciens

NRRL 11181, et on la fait incuber à 30° C jusqu'à 7 d. La culture inclinée mûre est recouverte de sérum de bœuf stérile et grattée avec une anse stérile pour libérer les spores. On lyophilise dans un maximum de 6 pastilles la suspension résultante de spores et de fragments mycéliens dans le sérum de bœuf.

On utilise une pastille lyophilisée ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante:

Ingrédient Quantité

Glucose 20 g

Farine de soja 15 g

Liqueur de macération de maïs 10 g

CaC03 2 g

Eau du robinet q.s. 11

pH ajusté à 6,5 par addition de NaOH 5N

On fait incuber à 30° C pendant quelque 24 à 48 h le milieu végétatif inoculé, dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml, sur un agitateur tournant sur un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/min.

On utilise le milieu végétatif incubé décrit précédemment (50 ml) pour inoculer 250 ml de l'un des milieux de fermentation suivants:

Milieu I

Ingrédient Quantité

Dextrine de tapioca* 60 g

Caséine hydrolysée par voie enzymatique** 6 g

Hydrolysat enzymatique de caséine*** 2 g

CaC03 2 g

MgS04-7H20 0,5 g

Mélasse noire 15 g

Huile de soja raffinée 5,0 ml/1

Eau du robinet q.s. 11

pH (non ajusté) 6,6

* Stadex 11, A.E. Staley, Decatur, Illinois, USA.

** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, USA. *** N-Z Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, New York, USA.

Milieu II

Ingrédient Quantité

Dextrine de tapioca* 30 g

Glucose 15 g

Caséine hydrolysée par voie enzymatique** 3 g

Hydrolysat enzymatique de caséine*** 1 g

Extrait de levure 2,5 g

Ingrédient Quantité

CaC03 2 g

MgS047H20 1 g

Mélasse noire 15 g

Huile de soja raffinée 5,0 ml/1

Eau du robinet q.s. 11

pH (non ajusté) 6,4

* Stadex 11, A.E. Staley, Decatur, Illinois, USA.

Milieu III

Ingrédient Quantité

Farine de soja 25 g

Glucose 20 g

CaC03 2,0 g

Na2S0410H20 1,0 g

Huile de soja raffinée 20 ml

Oléate de méthyle 20 ml

FeS04-7H20 0,6 g

MnCl2-4H20 0,3 g

Acide ascorbique 0,018 g

Eau désionisée q.s. 11

pH (non ajusté) 6,5

On fait incuber la fermentation jusqu'à 10 d à 30° C sur un agitateur rotatif à 250 tr/min avec un arc de 5 cm.

B. Fermentation en réservoir

On effectue la fermentation en réservoir en utilisant les milieux végétatifs et de fermentation décrits dans la partie A pour la fermentation en flacon agité. Pour la fermentation en réservoir, on utilise 10 ml du milieu végétatif pour inoculer 400 ml d'un milieu végétatif de second stade dans un flacon Erlenmeyer de 21. Après 24 h d'incubation à 30° C, on utilise 800 ml du milieu végétatif de second stade pour inoculer 1001 de milieu de fermentation dans un réservoir de fermentation de 1651. Le pH du milieu, après stérilisation à 121°C pendant 45 min, est environ 6,8+0,1. On laisse la fermentation se faire pendant 10 d à 30+ 1°C. On aère le réservoir avec de l'air stérile à un taux de 0,5 volume d'air par volume de milieu de culture par minute, en agitant à l'aide d'agitateurs classiques à 300 tr/min.

Exemple 2

Séparation du complexe de désoxynarasine

On abaisse à 3,0 par addition de HCl concentré le pH du bouillon de fermentation entier (41) obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant le milieu II, et on agite pendant 1 h. On filtre la solution résultante avec un adjuvant de filtration (125 g d'Hyflo Super-Cel, une terre de diatomées, Johns-Manville Corp.). On extrait par portions le gâteau mycélien séparé, en utilisant un mélangeur, avec un total de 21 de méthanol qui contient 50 g de NaHC03 par litre. On évapore sous vide le filtrat méthanolique jusqu'à un volume d'environ 450 ml. On ajuste le pH de cette solution à 7,5 par addition d'acide chlorhydrique concentré. On extrait la solution résultante deux fois avec CHC13 (500 ml). On réunit les extraits chloroformiques, on les sèche sur sulfate de sodium et on les filtre. On évapore le filtrat sous vide et l'on obtient 2,0 g du complexe de désoxynarasine brut.

Exemple 3

Isolement de la désoxynarasine et de l'épidésoxynarasine

On dissout 2 g de complexe de désoxynarasine brut, obtenu comme décrit dans l'exemple 2, dans une quantité minimale de benzène et on l'applique sur une colonne de 1,5 x 22 cm de gel de silice (Merck 7729). Les fractions isolées, les solvants utilisés et les quantités obtenues sont indiqués dans le tableau suivant.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

636 903

Fraction

Volume

Solvant

Rapport

Rendement (mg)*

1

3,01

Benzène

100%

24

2

2,01

Benzène/Acétate d'éthyle

9/1

20

3

600 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

85

4

300 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

5

300 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

7

6

900 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

18

7

2,01

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

22

8

300 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

7

9

450 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

22

10

450 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

9

11

1,21

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

7

12

1,21

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

5

13

1,01

Benzène/Acétate d'éthyle

4/1

12

14

1,01

Benzène/Acétate d'éthyle

3/1

14

15

1,51

Benzène/Acétate d'éthyle

3/1

28

16

1,51

Benzène/Acétate d'éthyle

3/1

100

17

450 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

3/1

26

18

900 ml

Benzène/Acétate d'éthyle

3/1

70

19

1,01

Benzène/Acétate d'éthyle

3/1

54

20

300 ml

Acétate d'éthyle

100%

12

21

150 ml

Acétate d'éthyle

100%

180

22

150 ml

Acétate d'éthyle

100%

125

23

450 ml

Acétate d'éthyle

100%

170

24

300 ml

Méthanol

100%

40

25

450 ml

Méthanol

100%

1100

* Obtenu après séchage sur Na2S04, filtration et évaporation du filtrat à siccité sous vide.

On contrôle les fractions par CCM, en utilisant un système solvant d'acétate d'éthyle. Les fractions 16-17 (126 mg) contiennent la 20-désoxyépi-l 7-narasine. Les fractions 18 à 23 contiennent un mélange de 20-désoxynarasine et de 20-désoxyépi-17-narasine. 35

On Chromatographie par CCM preparative, en utilisant un mélange solvant d'acétate d'éthyle, un mélange de 20-désoxy-narasine et de 20-désoxyépi-17-narasine, obtenu comme décrit précédemment pour les fractions 18-23. On dissout le mélange (105 mg 40 sur une plaque et 130 mg sur une autre plaque) dans une petite quantité de CH2C12 et on le place sur une plaque préparative de gel de silice (Merck). Après avoir laissé la plaque se développer, on observe à la lumière ultraviolette les deux substances séparées. On enlève de la plaque chacune des zones représentant les deux substan- 45 ces et on les extrait avec un mélange 4/1 de dichlorure de méthylène et de méthanol. Dans ce système, la désoxynarasine est le composant se déplaçant le plus lentement. De la plaque contenant 105 mg de substance, on recueille 7,5 mg de 20-désoxyépi-l 7-narasine et 56 mg de 20-désoxynarasine. 50

Exemple 4

Autre possibilité d'isolement de la 20-désoxynarasine

On ajuste à environ 3 le pH d'un bouillon de fermentation entier (951) par addition de HCl, puis on l'agite pendant 1 h. On ajoute 55 3% d'un adjuvant de filtration (Hyflo Super-Cel) et on filtre le bouillon. On extrait le gâteau mycélien séparé deux fois avec environ 45 1 d'acétone qui contient 50 g de NaHC03 par litre. On réunit les extraits acétoniques et on les concentre sous vide, ce qui donne environ 101 d'une solution aqueuse. On ajuste à 8,0 par addition de HCl 5N so le pH de cette solution, et on extrait la solution résultante trois fois avec un demi-volume de CH2C12. On réunit les extraits acétoniques et on les concentre sous vide, ce qui donne environ 10 1 d'une solution aqueuse. On ajuste à 8,0 par addition de HCl 5N le pH de cette solution, et on extrait la solution résultante trois fois avec un demi- 65 volume de CH2C12. On réunit les extraits de CH2C12 et on les évapore sous vide, ce qui donne un résidu huileux. On reprend ce résidu dans 500 ml de la phase supérieure du système solvant 10/7/1

d'hexane, de méthanol et d'eau. On extrait la phase supérieure six fois avec des portions de 300 ml de la phase inférieure. On réunit ces extraits et on les concentre sous vide jusqu'à un résidu. On dissout ce résidu dans du dioxanne; on lyophilise la solution de dioxanne et l'on obtient 19,4 g de complexe de désoxynarasine.

On combine (40 g) plusieurs échantillons obtenus de la même manière, on les dissout dans du toluène et on les tintroduit sur une colonne de gel de silice dans un chromatographe en phase liquide (Waters' Associates Prep. LC/System 500). On élue la colonne avec un système solvant 9/1 de toluène et d'acétate d'éthyle à un débit de 250 ml/min, en recueillant des fractions ayant un volume de 250 ml. On contrôle par CCM le contenu des fractions. On réunit les fractions 37-52 et on les concentre sous vide, ce qui donne un résidu que l'on redissout dans du dioxanne et qu'on lyophilise, pour obtenir 7,8 g de substance purifiée riche en 20-désoxynarasine. On rechro-matographie cette substance sur le chromatographe précédent.

Après élution de 50 fractions avec le système solvant 9/1 de toluène et d'acétate d'éthyle, on change le solvant d'élution et l'on utilise 100% d'acétate d'éthyle. On réunit les fractions 51-53 et on les évapore sous vide, ce qui donne un résidu que l'on dissout dans du dioxanne et qu'on lyophilise pour obtenir 1,12 g de 20-désoxynarasine sous la forme de son sel de sodium.

Exemple 5

Préparation de la 20-désoxynarasine sous forme acide libre

On dissout 200 mg du sel de sodium de la 20-désoxynarasine dans 10 ml d'acétate d'éthyle. On lave cette solution avec 10 ml de HCl 0,1N, puis deux fois avec 5 ml d'eau. On évapore la couche organique résultante à siccité et l'on obtient un résidu que l'on redissout dans du dioxanne et qu'on lyophilise, ce qui donne 139,6 mg de 20-désoxynarasine (acide libre) sous forme d'un solide blanc.

Exemple 6

Aliment pour poulet permettant de lutter contre la coccidiose On prépare un aliment énergétique et équilibré conçu pour

636 903

nourrir des poulets pour qu'ils grossissent rapidement, selon la recette suivante:

Ingrédients

(%)

(kg)

Maïs jaune broyé

50

1000

Farine de soja extraite par

solvant, sans enveloppes, fine

ment moulue, 50% de pro

téine

30,9

618

Graisse animale (suif de bœuf)

6,5

130

Farine de poisson séché, avec

matières solubles (60% de

protéine)

5,0

100

Matières solubles de distillation

du maïs

4,0

80

Phosphate dicalcique, qualité ali

mentaire

1,8

36

Prémélange de vitamines (com

prenant les vitamines A, D, E,

K, et B12, la choline, la

niacine, l'acide pantothénique,

la riboflavine, la biotine, avec

du glucose comme charge)

0,5

10

Sel (NaCl)

0,3

6

Prémêlange d'oligo-éléments

(représentant MnS04, ZnO,

Kl, FeS04, CaC03)

0,1

2

Acide 2-amino-4-hydroxybuty-

rique (homologue hydroxylé

de la méthionine)

0,1

2

On mélange avec cet aliment, selon des techniques classiques, le complexe antibiotique de désoxynarasine, la 20-désoxynarasine ou la 20-désoxyépi-l 7-narasine (environ 0,01% en poids). Des poulets nourris avec cet aliment, avec de l'eau à volonté, sont protégés de la coccidiose.

Exemple 7

Aliment amélioré pour bétail bovin

On prépare un aliment pour bovin riche en grains et équilibré comme suit:

Ingrédients

(%)

(kg)

Maïs finement broyé

67,8

1356

Epis de maïs broyés

10

200

Ingrédients

(%)

(kg)

Farine de luzerne déshydratée,

17% de protéine

5

100

Farine de soja sans enveloppes,

extraite par solvant, 50% de

protéine

10

200

Mélasse de canne à sucre

5

100,0

Urée

0,6

12,0

Phosphate dicalcique, qualité ali

mentaire

0,5

10,0

Carbonate de calcium

0,5

10,0

Chlorure de sodium

0,3

6,0

Prémélange d'oligo-éléments

0,03

0,6

Prémélange de vitamines A et

d2*

0,07

1,4

Prémélange de vitamine E**

0,05

1,0

Propionate de calcium

0,15

4,0

* Contenant par kilo: 4400000 UI de vitamine A; 500000 UI de vitamine D2 et 385,7 g de farine de soja avec 1% d'huile ajouté.

** Grains séchés de distillation du maïs avec matières solubles contenant 44 000 UI d'acétate de d-a-tocophéryle par kilo.

On mélange avec cet aliment, selon des techniques classiques, le complexe antibiotique de désoxynarasine, la 20-désoxynarasine ou la 20-désoxyépi-l 7-narasine (environ 0,004% en poids). L'aliment mélangé est comprimé en pastilles. A une dose d'ingestion quotidienne moyenne de 6,8 kg d'aliment par animal, cet aliment fournit environ 300 mg d'antibiotique par animal par jour.

Exemple 8

Aliment amélioré pour porcs

On prépare un mélange par des procédés classiques en utilisant les ingrédients suivants :

Ingrédients

(g/kg)

Composé actif

150,0

Silicate de calcium

20,0

Carbonate de calcium (farine

de coquille d'huître)

830,0

Poids total

1000

On ajoute ce prémélange à un aliment industriel pour porcs en utilisant des techniques de mélange classiques, pour obtenir un taux final de composé actif de 100 g/t.

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

R

Claims

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1. 20-Désoxynarasine physiologiquement active, de formule r-H 01 . I

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2. La 20-désoxyépi-17-narasine, sous forme de complexe antibiotique des deux substances, et ses sels physiologiquement acceptables, à titre de composés selon la revendication 1.

3. Procédé de production du complexe antibiotique de désoxy-narasine défini dans la revendication 2, qui consiste à cultiver un Streptomyces aureofaciens ayant essentiellement les mêmes possibilités biosynthétiques que NRRL 11181, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique, et à recueillir le complexe antibiotique sous la forme des acides ou de leurs sels physiologiquement acceptables.

4. Procédé selon la revendication 3, où le Streptomyces aureofaciens est l'organisme identifié comme étant NRRL 11181.

5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, où on isole du milieu de culture le complexe antibiotique de désoxynarasine ou ses sels physiologiquement acceptables.

6. Procédé selon la revendication 5, où on isole du complexe antibiotique de désoxynarasine la 20-désoxynarasine, la 20-désoxyépi-17-narasine ou un de leurs sels physiologiquement acceptables.

7. Utilisation d'un antibiotique de désoxynarasine selon la revendication 1 pour augmenter l'efficacité de l'utilisation des aliments chez les animaux ruminants, qui consiste à administrer par voie orale à ces animaux une quantité efficace augmentant la quantité de propionates du complexe antibiotique de désoxynarasine, de 20-35 désoxynarasine, de 20-désoxyépi-17-narasine ou d'un de leurs sels physiologiquement acceptables.

8. Composition alimentaire, comprenant un aliment pour bétail et de la 20-désoxynarasine, de la 20-désoxyépi-17-narasine, du complexe antibiotique de désoxynarasine ou un de leurs sels physiologi-

40 quement acceptables selon la revendication 1.

9. Composition selon la revendication 8, comprenant un aliment pour volaille et de la 20-désoxynarasine, de la 20-désoxyépi-17-narasine, le complexe antibiotique de désoxynarasine ou.de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

« 10. Composition selon la revendication 8, comprenant un aliment pour porcs et de la 20-désoxynarasine, de la 20-désoxyépi-17-narasine, le complexe antibiotique de désoxynarasine ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

11. Culture biologiquement pure du micro-organisme Strepto-50 myces aureofaciens qui est identifié comme étant NRRL 11181, pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 3, ladite culture ayant l'aptitude de produire de la 20-désoxynarasine ou de la 20-désoxyépi-17-narasine par fermentation dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de 55 sels minéraux.

Le complexe antibiotique de désoxynarasine, comprenant la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine, est produit par fermentation aérobie en immersion de Streptomyces aureofaciens NRRL 11181. On sépare et on isole par Chromatographie la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine. Le complexe de désoxynarasine, la 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-narasine, sont des agents antibactériens et anticoccidiens et augmentent également l'efficacité de l'utilisation des aliments chez les ruminants.

De nouveaux antibiotiques améliorés continuent à être nécessaires en médecine vétérinaire. Par exemple, la coccidiose continue à

être un problème très important dans l'industrie de la volaille. La 60 coccidiose résulte de l'infection par une ou plusieurs espèces de Eimeria ou Isospora (pour un résumé, voir Lund et Farr dans «Diseases of Poultry», 5e éd., Biester and Schwarte, éd., Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1965, pp. 1056-1096). Les pertes économiques dues à la coccidiose sont importantes, et nécessitent de meil-65 leurs agents anticoccidiens.

La promotion de la croissance chez les ruminants, comme le bétail et les moutons, est un autre but économiquement intéressant de la science vétérinaire. Est d'un intérêt particulier la promotion de

3

636 903

la croissance obtenue en augmentant l'efficacité de l'utilisation des aliments (ou rendement alimentaire). On connaît bien le mécanisme de l'utilisation de la partie nutritive principale (glucides) des aliments pour ruminants. Les micro-organismes contenus dans le rumen de l'animal dégradent les glucides en monosaccharides, puis transforment ces monosaccharides en pyruvates. Les pyruvates sont métabolisés par des procédés microbiologiques en donnant des acétates, des butyrates ou des propionates, collectivement appelés acides gras volatils (AGV). Pour une discussion plus détaillée, voir Leng dans «Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant», Phillipson et al., éd., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, Grande-Bretagne, 1970, pp. 408-410.

L'efficacité relative de l'utilisation des AGV est décrite par McCullough dans «Feedstuffs», 19 juin 1971, p. 19; Eskeland et al. dans «J. An. Sci.», 22, 282 (1971), et Church et al. dans «Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants», vol. 2,1971, pp. 622 et

625. Bien que les acétates et les butyrates soient utilisés, les propionates sont utilisés avec une plus grande efficacité. En outre, quand trop peu de propionate est disponible, les animaux peuvent être atteints de cétose. Un composé bénéfique stimule donc les animaux à 5 produire une plus grande proportion de propionates à partir des glucides, en utilisant ainsi l'efficacité de l'utilisation des glucides et en réduisant également l'incidence de la cétose.

La 20-désoxynarasine et la 20-désoxyépi-17-narasine sont de io nouveaux antibiotiques de type polyéther; ils sont très proches de l'antibiotique de type polyéther de la technique antérieure, la nara-sine (facteur A de l'antibiotique A-28086; brevets des EUA N° 4035481 et N° 4038384). La structure de la narasine proposée dans ce brevet et par Occolowitz et al. [«Biomed. Mass Spectrome-15 try», 3,271-277 (1976)] a été récemment confirmée par H. Seto et al. [«J. Antibiotics», 30 (6) 530-532 (1977)] et est:

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-t leurs sels physiologiquement acceptables.

2

REVENDICATIONS

3

Comme Seto et al. l'indiquent, la narasine est très proche de la salinomycine (salinomycine=4-diméthylnarasine). Plus récemment, J.W. Westley et al. ont décrit les épimères en C17 de la désoxy-(0-8)-salinomycine [« J. Antibiotics», 30 (7) 610-612 (1977)]. Bien que les épimères de la désoxysalinomycine soient des homologues des épi-mères de désoxynarasine de cette invention, il n'y a pas de mode opératoire chimique connu par lequel on pourrait préparer les épimères de désoxynarasine à partir des épimères de désoxysalinomycine.