MC1364A1

MC1364A1 - Composes polyethers et procede pour leur preparation

Info

Publication number: MC1364A1
Application number: MC811496A
Authority: MC
Inventors: J Westley; Min Liu Chao; B Prosser
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1980-01-30
Filing date: 1981-01-26
Publication date: 1981-10-23
Also published as: EP0035119A2; ZA81151B; GR73021B; DK149639B; ATE4217T1; HU187763B; NO156612C; ES8203964A1; IE50886B1; JPH0250918B2; DK149639C; KR840000750B1; KR830005358A; IL61971A; CA1160972A; FI810252L; DK29881A; PH16583A; ES498922A0; US4278663A

Description

1

La présente invention concerne de nouveaux composés polyéthers, à savoir les antibiotiques X-14868A et X-148688 répondant à la formule

OMe où R est un hydrogène ou un méthyle,

et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Sont également compris le nouvel antibiotique X-14868C et ses sels pharmaceutiquement acceptables, le sel de sodium ayant les caractères physiques suivants :

1) Un spectre infrarouge tel que représenté dans la figure 3;

2) Un point de fusion de 172-175°C (sel de sodium);

3) Une rotation spécifique de

(c<)D chloroforme méthanol + 49,6° +30,5°; et

4) Une microanalyse de

% C % H % Na

57,13 . 8,58 2,36

et le nouvel antibiotique X-14868D et ses sels pharmaceutiquement acceptables, le sel de sodium ayant les caractères physiques suivants :

1) Un spectre infrarouge tel que représenté dans la figure 4;

2) Un point de fusion de 194-195°C (sel de sodium);

3) Une rotation spécifique de

2

(o^,)D chloroforme méthanol

+41,1° +29,2°; et

4) Une microanalyse de

% C % H % Na

5 60,32 8,80 3,40

Ces quatre composés antibiotiques sont obtenus selon l'invention par un procédé qui implique de cultiver une sous-culture de la souche Nocardia X-14868 ATCC 31583 dans une solution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un a-10 liment azoté dans des conditions aérobies en gélose profonde puis de séparer et d'isoler les produits finaux de ladite solution.

Telle qu'elle est utilisée dans les formules développées ici données, l'expression Me représente le terme 15 méthyle.

L'organisme produisant les antibiotiques de l'invention est une nouvelle espèce appelée Nocardie sp. X-14868, Une culture de l'organisme vivant, à laquelle on a attribué la désignation de laboratoire X-14868, a été déposée à l'A-20 merican Type Culture Collection, Rockville, Maryland, aux

Etats-Unis et ajoutée à sa collection permanente de microorganismes sous le n° ATCC 31585. La culture a été identifiée comme étant une souche de Nocardia.

On a isolé le nouveau microorganisme à partir d'un 25 échantillon recueilli dans du sable de plage à Colloroy en Australie. Une souche représentative de Nocardia sp. X-14868 a les caractères suivants :

Caractères généraux

Nocardia sp. X-14868 se caractérise par son absence 30 de formation de spores -aériens, la fragmentation du mycélium substrat gram-positif au bout de plusieurs jours d'incubation, et la composition de la paroi cellulaire, faite d'acide méso-diaminopimélique, de galactose, d'arabinose et de ribose.

35 Caractéristiques de croissance

3

10

15

20

25

L'organisme est cultivé sur les milieux ISP standard (Difco) décrits par Shirling et Gottlieb "Methods for Cha-racterization of Streptomyces Species", Intern. J. System. Bacteriol., 16, pages 313-340, 1066 ainsi que sur divers autres milieux utilisés pour caractériser la culture, et énumérés ci-dessous :

Extrait de levure :

extrait de levure : 1,0%; glucose, 1,0%; gélose, 1,5%; pH 6,8

Glucose-extrait de levure-peptone:

glucose, 0,3%; extrait de levure, 0,5%; peptone, 0,5%; CaCO^, 0,75%; gélose, 1,5%; pH 7,0

Glucose-asparagine:

glucose, 1,0%; asparagine, 0,05%; K^HPO^, 0,05%; gélose, 1,5%; pH 6,8

Saccharose-nitrate :

Saccharose, 1,0%; NaNO^, 0,2%; K^HPO^, 0,1%; MgS04.7H20, 0,05%; KC1, 0,05%; gélose, 1,5%.

Les milieux utilisés dans d'autres tests sont ceux des références suivantes :

Test Références

A. Tolérance au chlorure de Gordon et Smith, "Rapidly sodium Growing Acid Fast Bacteria",

B. Hydrolyse de la caséine J. Bacteriol., 66:41-48,1953

C. Réduction du nitrate

D. Gélatine (modifiée par un Skerman, "A Guide to the "bouillon d'Actinomyces Dif- Identification of the co) auquel on ajoute 2,0% Généra of Bacteria',1

de gélose dans une gélose Williams et Williams Co., d'infusion de viande). Baltimore, 1967

E. Amidon (bouillon d'Actinomyces Difco) plus 0,25%

d'amidon soluble et 2,0%

de gélose.

4

F. Action sur le lait de tournesol (Difco)

G. Résistance au Lysozyme Gordon, "Some Criteria for the Récognition of Nocardia",J. Gen. Micro-biol., 45:355-364, 1966

10

15

20

25

30

H. Sensibilité à la pénicilline (10 disques unitaires.

On effectue des tests à 28°C et 37°C pour presque tous les milieux. La détermination des couleurs est faite au bout de 2 et 4 semaines d'incubation.

L'utilisation du carbone est déterminée par le procédé de Shirling et Gottlieb ci-dessus en utilisant le milieu ISP-9 Difco.

On centrifuge et on homogénéise un bouillon de culture de X-14868 dans ISP-1, 48 h pour obtenir une suspension lavée aux fins d'incubation.

On recherche l'aptitude des organismes à croître à 10, 28, 36, 45 et 50°C en inoculant un bouillon de milieu ISP-1 Difco. On effectue l'analyse dans la paroi cellulaire de l'isomère de l'acide diaminopimélique par le procédé de Becker et coll., Appl. Microbiol., 12,

421-423, 1964. Pour la teneur en sucre de la paroi cellulaire, on suit le procédé de Lechevalier et Lechevalier, Actinomycetales, div.publ. H. Prauser, Gustav Fischer, Iéna, p 311-316, 1970. On effectue l'analyse de l'acide nocar-domycolique par une légère modification du procédé de Lechevalier, Lechevalier, & Horan, Can. J. Microbiol. 19:965-972, 1973.

Résultats

Examen microscopique. La souche X-14868 produit un mycélium substrat qui se fragmente au bout de plusieurs jours permettant un développement mycélial extensif. Elle produit un mycélium aérien composé de touffes en forme de chapelets, mais on ne trouve pas de spores.

Analyse de la paroi cellulaire. La paroi cellulaire

5

contient l'isomère méso de l'acide diaminopimélique ainsi que du galactose et de l'arabinose (paroi cellulaire type IV de la classification de Lechevalier et Coll., Adv. Appl. Microbiol., 14, '47-72, 1971). L'organisme semble produire 5 des acides nocardomycoliques. Ces critères morphologiques et chimiques classent X-14868 dans le genre Nocardia.

Examen macroscopique. Le tableau 1 résume l'importance de la croissance, le degré de sporulation, la couleur de la masse aérienne, la couleur de l'envers du mycé-10 lium substrat et la présence éventuelle de pigements so-

lubles produits par la souche X-14868 sur divers milieux solides au bout de 4 semaines d'incubation.

Tableau 1. Caractères culturaux de Nocardia X-14868

Milieu gélosé Importance de la croissance Couleur du Couleur de l'envers du et du mycélium aérien mycélium aérien mycélium substrat

Extrait de malt de levure (ISP-2)

Croissance modérée à abondante; un peu de mycélium aérien dans des bords isolés, croissance parcheminée b

(blanc d'huître)

21e

(ocre moutarde clair)

Farine d'avoine (ISP-3)

Croissance modérée; mycélium aérien modéré

b

(blanc d'huître)

3dc

(naturel)

Sels inorganiques-Amidon (ISP-4)

Croissance clairsemée; mycélium aérien clairsemé

b

(blanc d'huître)

2dc

(naturel, chapelet)

Glycérol asparagine (ISP-5)

Faible croissance; presque pas de mycélium aérien; mycélium substrat b

(blanc d'huître)

2ge

(ocre voilé)

Extrait de levure

Croissance abondante; mycélium aérien clairsemé; croissance parcheminée b

(blanc d'huître)

3ge

(beige)

Glucose-Extrait de levure-peptone

Croissance modérée; mycélium aérien clairsemé au bord; croissance parcheminée, pigment brun soluble b

(blanc d'huître) au bord

3££

(beige)

Glucose-asparagine

Croissance modérée; un peu de mycélium aérien; croissance parcheminée

2dc (naturel, chapelet)

3Ke

(beige)

Saccharose-nitrate

Croissance clairsemée; mycélium aérien modéré

b (blanc d'huître)

translucide c (gris clair)

Note : On ne trouve de spores dans aucun mycélium aérien, sur tous les milieux examinés au bout de 4 semaines d'incubation.

a Le nuancier utilisé est celui du Color Harmony Manual, 4e éd. 1958 (Container Corporation of America, Chicago).

7

Caractères physiologiques : La souche X-14868 hydrolyse la gélatine et la caséine mais non l'amidon. La culture est résistance à un disque de 10 unités de pénicilline ainsi qu'au lysozyme à 0,005% dissous dans le bouillon lors-5 qu'on le traite selon le procédé de Gordon, J. Gen. Microbiol., 45, 355-364, 1966. La souche peptonise complètement le lait de tournesol. On ne détecte pas de production de mélanine sur ISP ainsi que sur 1, 6 ou 7.

Le Tableau 2 donne les résultats de l'utilisation du 10 carbone sur ISP 9 (Difco) par la souche X-14868 à 28°C au bout d'un mois d'incubation.

Tableau 2. Utilisation du carbone par la souche X-14868

• * cl

Source de carbone Réponse

15 Témoin non carboné

D-glucose ++

D-xylose

L-arabinose

L-rhamnose

20 D-fructose +

D-galactose +

Raffinose

D-mannitol

i-inositol

25 Salicine - +

Saccharose

Cellulose

a_, réponse négative-; + réponse douteuse; + plus de crois-30 sance que sur le témoin non carboné mais moins que sur le glucose; ++ réponse positive, égale à l'importance de la croissance sur le glucose.

Le Tableau 3 énumère des propriétés importantes pour le diagnostic, surtout métabolique.

h

8

Tableau 3. Caractères de X-14868

Test Résultat ISP 1, assombrissement 5 ISP 6, assombrissement ISP 7, mélanine

Hydrolyse de la caséine ++

Hydrolyse de la gélatine ++

Hydrolyse de l'amidon -

10 Tolérance au NaCl (%) 5% Température à laquelle la croissance est observée 28 et 36°C

Pigment de 11 envers -

pigment soluble brun sur glucose/ex-

15 trait de la levure-

peptone

Pénicilline (disque de 10 unités)

sensibilité -

Réduction des nitrates ++

20 Coloration Gram +

Coloration auto-résistante -

Catalase +

Acide diaminopimélique méso-isomère

Sucres de la paroi cellulaire galactose,

arabinose,

25 ribose

Production d'acide nocardomycolique +

La souche X-14868 peut être différenciée d'autres espèces de Nocardia sur la base des caractères biochimiques présentés au Tableau 4. Ces espèces ont été choisies pour 30 la comparaison parce qu'elles constituent le seul groupe au sein du genre Nocardia avec lequel X-14868 possède un certain degré d'affinité phénotypique.

On voit dans le Tableau 4 que très peu de données biochimiques sont disponibles pour quatre des espèces, à sa-35 voir N. transvalensis, N. formica, N. petroleophila et N.

saturnea. Cependant, ces espèces sont très différentes de

9

X-14868. N. transvalensis a été mentionné comme très similaire à N. brasiliensis, qui est incluse dans le Tableau 4. N. formica est peut-être déplacé dans le genre Nocardia et ressemble plus au genre Streptomyces. N. petroléo-5 phila et N. saturnea sont deux espèces très distinctes a-

yant peu d'affinités envers les autres espèces de Nocardia. Les membres de ces deux espèces peuvent vivre dans un milieu dépourvu de carbone aux dépends du dioxyde de carbone atmosphérique, et ceci n'est pas le cas des autres espèces, 10 y compris X-14868.

n

10

Tableau 4. Comparaison de la souche X-14868 avec d'autres espèces de Nocardia

—

ctf o

•H

£ *H O PH Ctf <H

I

ras

H 3

tJh

H Ctf

^C1

H> Pctf OO

.brasiliensis

10 d)

•H

O k

0 -P CQ Ctf

.transvalensis

(D Ctf O •H

g

O

.coeliaca

.polychromogenes

0 Ctf Pi •H tH <H Ctf U

ctf ft

.petroleophila ctf

0 £

3

"ctf co

•rH •H

A m •H

O

u s

CO V£> 00

-d" |

Utilisation du carbone

S

3

S

S3

S

s

X j

+

L-arabinose

—

L-rhamnose

—

D-fructose

+

Galactose

+

Mannitol

+

—

Inositol

+

—

Saccharose

+

—

Maltose

+

—

Mannose

+

Glycérol

+

—

Lactose

+

Paraffine

+

-

+

Acétate

+

—

Butyrate

+

—

Malate

+

Propionate

+

—

Pyruvate

+

Succinate

+

Citrate

+

Réduction du

nitrate

+

-

+

-

+

-

—

-

+

Hydrolyse de

la xanthine

+

-

+

Hydrolyse de

la gélatine

+

—

+

11

10

15

20

25

30

L'espèce Nocardia X-14868 ici décrite comprend toutes les souches de Nocardia qui produisent l'antibiotique X-14868A et qui ne peuvent être nettement différenciées de la culture Nocardia X-14868 et de ses sous-cultures y compris leurs mutants et leurs variantes. Le composé X-14868A est structurellement identifié ici et lorsque cette identification est connue, il est facile de différencier des autres les souches produisant le composé antibiotique X-14868A.

On peut préparer les sels pharmaceutiquement acceptables de l'antibiotique X-14868A par des moyens classiques. On prépare ces sels à partir de la forme acide libre de l'antibiotique par des procédés bien connus des spécialistes, par exemple en lavant l'acide libre en solution avec une base ou un sel approprié. Les exemples de telles substances basiques pharmaceutiquement acceptables capables de former des sels aux fins de l'invention comprennent les bases de métaux alcalins comme l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde de lithium, etc; les bases de métaux alcalino-terreux comme l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de barium, etc; et l'hydroxyde d'ammonium. Les sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino-terreux appropriés pour former des sels pharmaceutiquement acceptables peuvent comprendre des anions comme les carbonates, bicarbonates et sulfates.

Nocardia X-14868, cultivée dans des conditions appropriées, produit le composé X-14868A. On prépare un bouillon de fermentation contenant Nocardia X-14868 en inoculant des spores ou mycelia de l'organisme produisant le composé X-14868A dans un milieu approprié puis en les cultivant dans des conditions aérobies. Pour la production du X-14868A, la culture sur un milieu solide est possible, mais pour la production en grandes quantités, la culture dans un milieu liquide est préférable. La température de culture peut varier sur un large intervalle, 20-35°C, dans lequel l'organisme peut croître, mais on

12

préfère une température de 26-30°C et un pH pratiquement neutre. Dans la fermentation aérobie en immersion de l'organisme pour la production de l'antibiotique X-14868A, le milieu peut contenir comme source de carbone 5 une huile de glycéride que l'on trouve dans le commerce ou un hydrate de carbone comme le glycérol, le glucose, le maltose, le lactose, la dextrine, l'amidon, etc, à l'état pur ou brut et, comme source d'azote, une matière organique comme la farine de soja, les distillats solubles, 10 la farine d'arachide, la farine de poisson, l'extrait de levure, la liqueut de maïs macérée, etc, et, si on le désire, des sources inorganiques d'azote comme les nitrates et les sels d'ammonium. Il peut également contenir des sels minéraux comme le sulfate d'ammonium, le sulfate de 15 magnésium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le phosphate de potassium, le carbonate de calcium, etc, et des agents tampons comme le citrate ou le phosphate de sodium et des traces de sels de métaux lourds. Dans les procédés de culture en gélose profonde aérée, on utilise 20 de préférence un agent anti-mousse comme la paraffine liquide, les huiles grasses ou les composés siliconés. On peut utiliser plus d'un type de source de carbone, de source d'azote ou de source d'anti-mousse pour la production de l'antibiotique X-14868A.

25 Le Tableau 5 ci-dessous présente l'activité anti microbienne de l'antibiotique X-14868A et des trois composants secondaires X-14868B, X-14868C et X-14868D.

Tableau 5

Concentration minimale inhibitrice (mcg/ml) d'antibiotiques

Microorganisme

X-14868A X-14868B X-14868C

X-14868D

Cocci G (+)

Streptococcus faecium ATCC 8043 Staphylococcus aureus ATCC 6538p

Sarcina lutea ATCC 9341

0,313 6,25 12,5

1,57 6,25 12,5

0,79 62,5 250

0,19 12,5 62,5

Bâtônnets G (+)

Bacillus megaterium ATCC 8011 Bacillus sp. E TOC 27859 Bacillus" subtilis NRRL 558 Bacillus sp.

Filaments G (+)

Mycobacterium phlei ATCC 355 Streptomyces cellulosae ATCC 3313

Moisissures

Paecilomyces varioti ATCC 26820 Penicillum digitatum ATCC 28621

Levure

Candida albicans NRRL 477 Saccharomyces cerevisiae' NRRL 4226

12,5 0,39 12,5 6,25

12,5 25

250 1000

7,5 0,79 25

12,5

25 25

500 1000

100

*

125

6,25 250 125

250 500

* *

61,5

1,57 62,5 25

62,5 125

* *

y

* Inactif à 1 mg/ml contre les moisissures et les levures testées.

14

Comme l'indique le Tableau 5, l'antibiotique

5

10

X-14868A et ses trois composants secondaires possèdent la propriété d'affecter de façon défavorable la croissance de certaines bactéries gram-positives. Ils seraient donc utiles dans les solutions de lavage utilisées à des fins hygiéniques comme pour se laver les mains et pour nettoyer l'équipement, le sol ou le mobilier des pièces ou laboratoires contaminés.

Le Tableau 6 ci-dessous présente l'activité anticoc-

cidienne par rapport à celle d'un témoin non traité infecté (TNI) et un témoin non traité non infecté (TNN) en suivant le procédé expérimental exposé ci-dessous.

Groupe Conc.,%

TNI TNN

X-14868A 0,002

Sel de sodium0,001 Lot-1

0,0005

X-14868A 0,002 Sel de sodium Lot-1A

Grain de poids,%

100 37

39 81

96 60

Tableau 6

Degré moyen d'infection Mortalité Niveau de lésion intestinale

% Supérieur Médian Caecum Moy.

0 0,0 0,0 0,0 0,0

20 2,7 2,0 3,0 2,6

0 0,0 0,0 0,0 0,0

0 0,2 0,0 0,0 0,07

0 0,4 0,3 0,0 0,2

0 0,0 0,0 0,0 0,0

16

Procédé expérimental. Cette expérience utilise dix poulets par groupe d'administration. On emploie dix poulets comme témoins pondéraux et dix noulets comme témoins infectés. On administre le médicament 48 h avant l'infec-5 tion. On mélange un gramme du médicament expérimental dans un mélangeur mécanique avec une quantité suffisante d'aliment pour poulets pour obtenir le dosage souhaité. L'infection consiste en environ 300 000 oocystes, administrés oralement au moyen d'une pipette, de Eimeria acervuli-10 na, E. mivati, E. maxima, E. necatrix & E. tenella. L'expérience dure 6 jours puis on autopsie les animaux survivants pour détecter les lésions macroscopiques dans le caecum. On classe les animaux expérimentaux selon le nombre de survivants et le nombre de lésions intestinales. 15 Les résultats sont exprimés sous la forme du degré moyen d'infection (DMI). Un degré moyen d'infection inférieur à 2,5 est considéré comme significatif.

On prépare les compositions coccidio-statiques de l'invention contenant comme ingrédient actif l'antibiotique 20 X-14868A ou ses sels pharmaceutiquement acceptables ou le bouillon non filtré séché en mélangeant l'ingrédient actif avec un ingrédient inerte. L'ingrédient actif peut comprendre un aliment, des matières de remplissage, etc. Le terme "ingrédient inerte" désigne une matière qui ne fonc-25 tionne pas comme agent anti-parasitaire, p. ex. un cocci-diostat, qui est inactive par rapport à l'ingrédient actif et qui peut être ingérée sans danger par les animaux à traiter, et ainsi cette matière inerte est une matière qui est inactive aux fins de l'invention. •

30 L'ingrédient actif, lorsqu'il est administré par voie orale aux animaux domestiques sensibles à la cocci-diose, en particulier aux volailles comme les dindons et les poulets, comme composant de la nourriture, maîtrise effectivement la maladie soit en la prévenant soit en la 35 soignant, lorsqu'elle s'est manifestée. En outre, les volailles traitées maintiennent leur poids ou présentent

17

un gain effectif de poids lorsqu'on les compare aux témoins. Ainsi, les compositions de l'invention ne maîtrisent pas seulement la coccidiose, mais aident également à améliorer l'efficacité de la transformation de la nour-5 riture en gains de poids.

La concentration effective de l'ingrédient actif dans la nourriture animale peut naturellement être ajustée aux besoins individuels et peut varier sur un large intervalle. Les critères limitants de la concentration sont 10 que la concentration minimale est telle qu'une quantité

suffisante d'ingrédient actif est fournie pour obtenir la maîtrise désirée sur la coccidiose, et que la concentration maximum est telle que la quantité de composition ingérée ne produit pas d'effet secondaire nocif ou indésira-15 ble.

Ainsi, par exemple, un pré-mélange alimentaire ou un aliment complet contient suffisamment d'ingrédients actifs pour fournir d'environ 0,003% à environ 0,001% en poids de la consommation alimentaire quotidienne. On utilise de 20 préférence d'environ 0,0005% à 0,001% en poids. Généralement, environ 0,0005% de l'ingrédient actif suffit pour maîtriser et combattre la coccidiose. Des quantités supérieures à 0,001%, tout en étant efficaces contre la coccidiose, ne présentent généralement pas de meilleurs ré-25 sultats que 0,001%, et dans certains cas peuvent avoir des conséquences indésirables sur la croissance, l'efficacité de la nourriture et la mortalité.

Bien qu'une quantité supérieure à 0,001% soit efficace pour combattre la coccidiose, cette quantité est l'in-30 tervalle supérieur préféré pour des raisons économiques,

c'est-à-dire que c'est dans cet intervalle que le coût par unité d'efficacité est le plus bas. Des quantités inférieures à 0,0003% ne sont pas efficaces pour combattre la coccidiose. On préfère une limite inférieure de 0,0006% 35 car elle assure l'efficacité. La quantité la plus appréciée, c'est-à-dire environ 0,0005% en poids de la consom

18

10

15

20

25

30

mation quotidienne d'aliment de la volaille, est particulièrement efficace car elle obtient l'effet maximum avec une dose minimum.

La dose optimum varie naturellement selon la taille de l'animal. Lorsqu'on utilise les antibiotiques selon l'invention pour traiter ou prévenir la coccidiose, on peut tout d'abord les mélanger avec un ingrédient alimentaire ou un support pour en faire un pré-mélange additif alimentaire, un concentré alimentaire ou un supplément additif alimentaire. Un additif, concentré ou pré-mélange alimentaire est un article conçu pour être dilué pour produire un aliment complet, c'est-à-dire unarticle conçu pour la consommation par un animal directement ou que l'on peut diluer plus avant pour produire un aliment complet ou qui peut être ingéré et utilisé comme supplément à d'autres rations. Les suppléments, concentrés et pré-mélanges alimentaires contiennent un pourcentage relativement élevé de coccidiostats, c'est-à-dire d'ingrédient actif ajouté à un support approprié et mélangé de manière à donner une dispersion pratiquement uniforme du coccidiostat dans le support. Les supports appropriés sont des solides qui sont inertes par rapport à l'ingrédient actif et qui peuvent être ingérés sans danger par les animaux à traiter. Comme supports typiques on peut citer les aliments pour volaille du commerce, les grains de céréales moulus, les sous-produits céréaliers, les concentrés de protéines végétales (soja, arachide, etc), les sous-produits de fermentation, les sels, le calcaire, les composés inorganiques, etc, ou leurs mélanges. On peut préparer des dispersions liquides en utilisant de l'eau ou une huile végétale comprenant de préférence un agent tensio-actif, un agent é-mulsifiant, etc, dans la dispersion liquide, comme l'acide éthylènediaminetétraacétique, etc, et des solvants. N'importe quel support approprié ou matériau diluant peut fonctionner comme ingrédient inerte dans la forme solide de l'agent anti-parasitaire pourvu qu'il soit inerte vis-à-vis de la matière active et qu'il soit non toxique vis-à-vis de l'animal auquel il s'agit de l'administrer.

19

L'ingrédient actif peut être mélangé en une pâtée, une boulette, ou sous n'importe quelle configuration avec le support inerte ou le matériau diluant solide par n'importe quelle technique commode. Par exemple, on peut former des compositions en broyant finement ou en pulvérisant l'ingrédient actif et l'ingrédient inerte en utilisant n'importe quel broyeur ou pulvérisateur du commerce, l'aliment étant ou non présent. Si l'aliment n'est pas présent lorsqu'on effectue le broyage ou la pulvérisation, la matière obtenue peut être répartie, selon l'invention, dans n'importe quel aliment commodément disponible. Les aliments typiques pour volaille qui peuvent être administrés avec l'ingrédient actif de l'invention peuvent contenir plusieurs ingrédients, par exemple des produits céréaliers à haute énergie comme le maïs, le blé, la farine de blé "red dog", le millet, la farine d'avoine, etc, des produits céréaliers à moyenne et basse énergie comme l'avoine , 1'orge, la farine de blé, le remoulage, la recoupe standard, etc; des graisses stabilisées; des protéines végétales comme la farine de soja, la farine de gluten, de maïs, la farine d'arachide, etc; des protéines animales comme la farine de poisson, les fractions solubles de poisson, les restes de viande, etc; les sources de facteurs de croissance non identifiés et d'autres supports de vitamine B comme les produits laitiers séchés, la levure de bière séchée, les distillats solubles séchés, les fractions solubles de fermentation, etc; la farine de luzerne déshydratée; et divers additifs spéciaux comme la riboflavine additionnelle, la vitamine B^ , le pentothénate de calcium, la niacine, la choline, la vitamine K et la vitamine E, etc, ainsi que la vitamine A stabilisée, la vitamine D-^ (stérols animaux D-activés); les suppléments de calcium et de phosphore comme le phosphate dicalcique, la farine d'os passée à la vapeur, le phosphate défluoré, le calcaire, etc; le sel iodé, le sulfate de manganèse, le carbonate de zinc, ion supplément antibiotique; la méthio-nine ou son analogue hydroxy, et un antioxydant.

S

20

10

15

20

25

30

Comme il apparaît d'après ce qui précède, les compositions coccidiostatiques sont conçues pour l'ingection orale. Elles peuvent être ajoutées à l'apport alimentaire normal fourni à l'animal traité ou peuvent être administrées par d'autres procédés, comme par incorporation dans un comprimé, une pilule ou un bol administré de force à l'animal. L'administration de l'ingrédient actif doit être considérée selon l'animal particulier d'après les pratiques d'élevage rencontrées.

Les composants secondaires X-14868B, C et D présentent également line activité anticoccidienne lorsqu'ils sont testés in vitro. On a également montré que X-14868B est actif in vivo.

On a également trouvé que l'antibiotique X-14868A présente une activité comme promoteur de la croissance des ruminants, c'est-à-dire des animaux ayant une panse fonctionnelle, par ex. le bétail. On trouvera un examen du mécanisme par lequel la nourriture est digérée, dégradée et métabolisée par ion ruminant dans le brevet américain n° 3 839 557 qui décrit l'emploi de certains antibiotiques pour améliorer l'utilisation de.la nourriture par les ruminants et qui est ici mentionnée à titre de référence. Les ruminants économiquement importants comprennent le bétail, les moutons et les chèvres.

L'efficacité de l'antibiotique X-14868A pour modifier le rapport d'acides gras volatils produits dans la panse (pour améliorer ainsi l'utilisation de la nourriture par les ruminants) est démontrée au moyen de l'expérience in vitro suivante :

On obtient le liquide de la panse chez un bouvillon fistulé. On donne au bouillon la ration suivante :

Mais : 89,93%

Farine de luzerne : 5,000%

Farine d'huile de soja : 3,00%

Calcaire : 0,80%

NaCl : 0,60%

21

Phosphate dicalcique : 0,50%

Oligo-éléments : 0,025%

Additifs pour pré-mélange vitaminé : 0,1%

Vitamine A, UIT : 4,0003 5 Vitamine D2, UI : 0,801

Vitamine D, UIT : 3,002

On fait immédiatement passer le liquide de la pase à travers un tamis. Pour chaque fermentation, on ajoute 75 ml du liquide obtenu à un ballon de 250 ml con-10 tenant :

A g de grains finement broyés: ration de foin

80%:20%;

1 ml d'une solution aqueuse de glucose à 18% (1 millimole par ballon);

15 1,5 ml d'une solution aqueuse d'urée à 3,1% (0,76

millimole par ballon);

60 micromoles de chacun des 10 acides aminés essentiels (arginine, histidine, leucine, méthionine, thréonine, valine, lysine, isoleucine, phénylalanine, tryptophane);

20 1 ml d'une solution aqueuse de médicament expérimen tal pour donner 10 ou 25 microgrammes/ml (volume total calculé de mélange de fermentation de 80 ml);

On fait incuber chaque flacon à 38°C dans un bain d'eau agité équipé d'une hotte de dégagement. On fait con-25 tinuellement passer du dioxyde de carbone à travers la hotte. Au bout de 4 heures d'incubation, on centrifuge une quantité de 10 ml du liquide de fermentation à 14000 tpm (environ 30 000 g) pendant 20 min. On ajoute 3 ml de surnageant à 1 ml de solution d'acide métaphosphorique à 25% 30 contenant 23 micromoles d'acide 2-méthylvalérique comme standard interne. On laisse reposer le liquide obtenu à la température ambiante pendant 30 min. On filtre le liquide à travers un filtre Millipore de 0,22 millimicrons et on refroidit jusqu'à ce qu'on effectue les analyses de chroma-35 tographie de partage gaz-liquide pour les acides gras volatils.

22

On trouvera dans le tableau suivant les analyses en chromatographie de partage gaz-liquide (CGL) de quatre fermentations in vitro et de deux fois deux fermentations, avec 10 et 25 ppm, respectivement, d'antibiotique X 14868A.

Tableau 7

Rapports molaires de propionate (C^) à l'acétate (C2)

plus n-butyrates (nC^) dans des fermentations de panse in vitro

Acides gras volatils

Rapport molaire d'AGV

Composés

Concentration

C3/(C2+nC4)

% de témoin positif

Témoin négatif

0

0,203

51,8

X-14868A

5 ppm

0,323

82,5

50 ppm

0,358

91,2

Témoin positif

50 ppm

0,392

100,0

(Monensine)

/

24

Comme le montre le Tableau 7 le rapport du propionate (C^) à l'acétate et au n-butyrate est significative-ment amélioré. Avec l'augmentation des propionates par rapport aux acétates dans les hydrates de carbone, l'efficacité des hydrates de carbone et donc de l'utilisation de la nourriture est améliorée.

L'administration de l'antibiotique X-14868A (appelé ci-dessous "antibiotique" ou "composé antibiotique,) empêche et traite la cétose et améliore l'utilisation de la nourriture. Le mécanisme étiologique de la cétose est une déficience de la production de composés de propionate. Le traitement actuellement recommandé est l'administration d'acide propionique ou d'aliments qui produisent de préférence des propionates. Il est évident qu'encourager la production de propionate à partir d'aliments ordinaires réduira l'incidence de la cétose.

On a trouvé que l'antibiotique X-14868A augmente l'efficacité de l'utilisation de la nourriture chez les animaux lorsqu'on le leur administre oralement. La façon la plus facile d'administrer l'antibiotique consiste à le mélanger dans la nourriture de l'animal.

Cependant, l'antibiotique peut être utilement administré selon d'autres modes. Par exemple, on peut l'incorporer en comprimés, potions, bols ou capsules, et l'administrer aux animaux. Les formulations du composé antibiotique dans ces formules de base peuvent être réalisées au moyen de procédés bien connus en pharmacie vétérinaire .

On produit facilement des capsules en remplissant des capsules de gélatine avec n'importe quelle forme souhaitée des antibiotiques désirés. Si on le désire, on peut diluer l'antibiotique avec un diluant inerte en poudre, comme un sucre, l'amidon, ou la cellulose cristalline purifiée afin d'augmenter son volume pour plus de commodité lorsqu'on remplit les capsules.

On prépare des comprimés de l'antibiotique par les

25

procédés pharmaceutiques classiques. Outre l'ingrédient actif, un comprimé contient généralement une base, un désintégrant, un absorbant, un liant et un lubrifiant. Les bases typiques comprennent le lactose, le sucre glace fin, le chlorure de sodium, l'amidon et le mannitol. L'amidon est également un bon désintégrant, comme l'acide alginique. On utilise également quelquefois des agents tensio-actifs comme le laurylsulfate de sodium et le sul-fosuccinate de dioctyl-sodium. Les absorbants communément utilisés comprennent également l'amidon et le lactose tandis que le carbonate de magnésium est également utile pour les substances huileuses. Les liants fréquemment utilisés sont la gélatine, les gommes, l'amidon, la dex-trine et divers dérivés cellulosiques. Parmi les lubrifiants communément utilisés on peut mentionner le stéarate de magnésium, le talc, la cire de paraffine, divers savons métalliques et le polyéthylèneglycol.

L'administration du composé antibiotique peut s'effectuer sous forme de bol à diffusion lente. Ces bols sont faits comme des comprimés sauf qu'il est fourni un moyen pour retarder la diffusion de l'antibiotique. Les bols sont faits pour diffuser pendant de longues périodes. La lente dissolution est facilitée par le choix d'une forme hautement insoluble dans l'eau de l'antibiotique. On ajoute une substance comme de la limaille de fer p'our augmenter la densité du bol et le maintenir immobile au fond de la panse.

La dissolution de l'antibiotique est retardée par l'emploi d'une matrice de matériaux insolubles dans lesquels le médicament est enveloppé. Par exemple, des susb-tances comme les cires végétales, les cires minérales purifiées et les matériaux polymériques insolubles dans l'eau sont utiles.

On prépare des potions de l'antibiotique très facilement en choisissant une forme soluble dans l'eau de l'antibiotique. Si pour quelque raison on désire une for

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me soluble, on peut faire une suspension. Une potion peut également être formulée sous la forme d'une solution dans un solvant physiologiquement acceptable comme un polyéthylèneglycol.

On peut préparer des suspensions de formes insolubles de l'antibiotique dans des corps non solvants comme les huiles végétales telles que l'huile d'arachide,

de maïs ou de sésame, dans un glycol comme le propylène-glycol ou un polyéthylèneglycol; ou dans l'eau, selon la forme de l'antibiotique choisie.

Des adjuvants physiologiquement acceptables appropriés sont nécessaires pour maintenir l'antibiotique en suspension. Les adjuvants peuvent être choisis parmi les épaississants, comme la carboxyméthylcellulose, la polyvinyl-pyrrolidone, la gélatine et les alginates. De nombreuses classes d'agents tensio-actifs servent à mettre en suspension l'antibiotique. Ainsi, la lécithine, les produits d'addition alcoylphénol/polyéthylèneoxyde, les naphtalè-nesulfonates, les alcoylbenzènesulfonates, et les esters de polyoxyéthylènesorbitan sont utiles pour faire des suspensions dans des corps non solvants liquides.

En outre, de nombreuses substances qui affectent l'hydrophilie, la densité et la tension superficielle du liquide peuvent aider à faire des suspensions dans certains cas. Par exemple, les antimousses siliconés, les glycols, le sorbitol et les sucres peuvent être des agents suspenseurs utiles.

L'antibiotique susceptible d'être mis en suspension peut être présenté à l'éleveur sous la forme d'une suspension, ou d'un mélange sec de l'antibiotique et des adjuvants à diluer avant l'emploi.

L'antibiotique peut aussi être administré dans l'eau de boisson des ruminants. L'incorporation dans l'eau de boisson s'effectue en ajoutant une forme soluble dans l'eau, ou pouvant être mise en suspension dans l'eau, de l'antibiotique à l'eau en quantité convenable. La formula

27

tion de l'antibiotique aux fins d'addition à l'eau de boisson suit les mêmes principes que la formulation des potions .

La manière la plus pratique de traiter les animaux avec le composé antibiotique consiste à formuler le composé dans l'apport alimentaire. N'importe quel type d'aliment peut être additionné des composés antibiotiques, y compris les nourritures sèches communes, les a-liments liquides et les aliments en boulettes.

Les procédés de formulation des médicaments dans les nourritures animales sont bien connus. Il est habituel de faire un pré-mélange médicamenteux concentré comme matière première pour les aliments médicamenteux. Par exemple, les pré-mélanges médicamenteux typiques peuvent contenir d'environ 2 à environ 800 g de médicament par kg de prémélange. Ce large intervalle résulte du large intervalle de concentration de médicament que l'on peut souhaiter dans l'aliment final. Les prémélanges peuvent être liquides ou solides.

La formulation des nourritures pour ruminants contenant les quantités convenables d'antibiotique pour un traitement utile est bien comprise. Il suffit de calculer la quantité de composé que l'on souhaite administrer à chaque animal, de tenir compte de la quantité de nourriture que l'animal absorbe chaque jour et de la concentration de composé antibiotique dans le prémélange à utiliser, et de calculer la concentration appropriée de composé antibiotique, ou de prémélange, dans la nourriture.

Tous les procédés de formulation, de mélange et de réduction en boulettes des aliments qui sont normalement utilisés dans l'alimentation des ruminants sont entièrement appropriés pour préparer les aliments contenant le composé antibiotique.

Comme on l'a montré, l'administration orale de l'antibiotique modifie dans un sens favorable la production de propionates par rapport à la production d'acétates dans la

28

panse. On peut donc supposer que le même traitement serait également bénéfique aux animaux monogastriques qui fermentent la matière végétale fibreuse dans le caecum car on s'attendrait à ce qu'une modification bénéfique du rapport propionate/acétate se produise après administration orale du présent antibiotique. Les chevaux, les porcs et les lapins sont des exemples d'animaux qui digèrent une partie de leur nourriture par fermentation caecale.

L'antibiotique X-14868A a également montré son activité comme agent dans le traitement ou la prévention de la dysenterie porcine. On examine l'activité du composé contre Treponema hyodisentariae, agent étiologique de la dysenterie porcine. On trouvera dans le Tableau ci-dessous les résultats qui représentent une expérience comparée suivant des procédés expérimentaux bien connus par rapport à un agent connu dans le traitement et la prévention de la dysenterie porcine.

Tableau 8

Concentration minimale inhibitrice (m /Jg/ml)

Souche de T.hyodysenteriae X-14868A Ipronidazole

1 0,05 0,63

2 0,05 0,63

3 0,05 0,63

4 0,05 2,5 Moyenne 0,05 1,1

Pont également partie de l'invention les nouveaux composés secondaires dénommés X-14868B, C et D. Ces composés présentent une activité anticoccidienne in vitro contre une E. tenella comme on le voit ci-dessous.

Activité in vitro contre E. tenella

Composé PPM efficace contre E. tenella

X-14868B 0,1

X-14868C 10,0

X-14868D 10,0

29

La formule développée du composé X-14868B est la suivante :

OMe

15

Les spectres d'absorption infrarouge des composés respectifs sont les suivants :

X-14868A - Figure 1

X-14868B - Figure 2

20 X-14868C - Figure 3

X-14868D - Figure 4

Le Tableau 9 présente les constantes physiques de divers composants produits par fermentation du Nocardia X-14868.

Tableau 9

Constantes physiques des composantes de X-14868

Composant N°

P^.°C (c* )D,rotation spécifique chloroforme méthanol

%C

*Microanalyse %H

résultats %Na trouvés %0Me

X-14868A

193-195 +40,6°

+23,8°

60,11

8,54

2,38

12,10

X-14868B

172,5-174 +46,1°

+34,8°

60,97

8,60

1,23

14,87

X-14868C

172-175 +49,6°

+30,5°

57,13

8,58

2,36

10,25

X-14868D

194-195 +41,1°

+29,2°

60,32

8,20

3,40

* Microanalyse calculée pour les composés A et B

P.M.

%C

%E

%Na

%0Me

X-14868A:

C47H79°17Na

939,25

60,10

8,50

2,45

13,22

X-14868B:

C96Hl63034Na,N20

1902,36

60,61

8,75

1,21

16,54

31

Les exemples suivants servent à préciser l'invention sans la limiter.

Exemple 1

Fermentation en ballon agité de Nocardia X-14868

5 On cultive et on conserve la culture produisant l'an tibiotique X-14868A sur un milieu en biseau gélosé à l'amidon-caséine ayant la composition suivante (grammes/l d'eau distillée):

Amidon soluble 10,0

10 Caséine 1,0

K2HP04 0,5

MgSO^ (anhydre) 0,5

Gélose 20,0

Ajuster le pH à 4 avec NaOH avant de passer à l'au-15 toclave à une pression de 1,05 kg/cm pendant 20 min.

On inocule le milieu en biseau avec la culture de Nocardia x-14868 à 28°C pendant 7 à 14 jours. On utilise alors un morceau de gélose contenant des mycelia provenant du milieu en biseau de gélose ayant connu une bonne crois-20 sance pour inoculer un erlenmeyer de 500 ml contenant 1000 ml de milieu d'inoculation stérilisé ayant la composition suivante (gramme/1 d'eau distillée):

Pulpe de tomate 5,0

Distillats solubles 5,0

25 Peptone 5,0

Levure séchée sans maertume 5,0

Amidon de maïs 20,0

CaCO^ 1,0

k2hpo4 1,0

30 Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH avant stérilisation.

On incube le milieu d'inoculation inoculé à 28°C pendant 72 h sur un agitateur rotatif fonctionnant à ' 250 tpm.

On utilise une fraction de 3 ml (3%, v/v) de la 35 culture obtenue pour inoculer un erlenmeyer de 500 ml

32

contenant 100 ml de milieu de production stérilisé ayant la composition suivante (grammes/litre d'eau distillée):

Glycérol 40,0

Peptone 5,0

5 Cérélose 2,0

Amidon de pomme de terre 2,0

Gruau de soja dégraissé 5,0 Levure séchée sans amertume 5,0

NaCl 5,0

10 CaCO^ 0,2

Ajuster le pH à 6,4 avant de passer à l'autoclave.

On fait incuber le milieu inoculé à 28°C pendant 5 jours sur un agitateur rotatif tournant à 250 tpm. On estime la puissance de l'antibiotique X-14868A dans le 15 bouillon de fermentation en dosant contre Staphylococcus aureus ATCC 6538P utilisant un dosage de diffusion sur gélose avec plaque à cuvettes.

Exemple 2

Isolément du sel de sodium de l'antibiotique 20 X-14868A et du sel de sodium de l'antibiotique X-14868B à partir d'une fermentation en ballon agité:

Etape A: On rassemble (5 litres) l'ensemble du bouillon de 50 erlenmeyers d'^ litre contenant chacun 100 ml, au bout de 5 jours de fermentation, et on extrait 2 fois a-25 vec £ volume d'acétate d'éthyle. Après avoir agité pendant | h on sépare la couche de solvant et on la concentre en une huile (4 g) sous une pression réduite. On dissout l'huile dans le diéthyléther et on chromatographie sur une colonne de 200 g de gel de silice remplie d'une 30 bouillie de diéthyléther. On élue la colonne avec un gradient entre 2 litres de diéthyléther et 2 litres de dié-thyléther/acétone (9:1) puis 2 litres de diéthlyéther/ acétone (1:1) puis 2 litres de chlorure de méthylène/alcool éthylique (7:3). On recueille des fractions de 40 ml 35 chacune et on rassemble les fractions n° 18-75, on retire le solvant sous une pression réduite et on dissout le résidu

33

(1,66 g) ainsi obtenu dans l'acétate d'éthyle et on le lave 2 fois avec un volume égal d'HCl 1 N, puis on le lave 2 fois avec un volume égal de ^2^0^ (saturé à la température ambiante). On sèche la phase solvant sur 5 Na2S0^, et en ajoutant du n-hexane, on obtient des cris taux de sel de sodium de l'antibiotique X-14868A. La recristallisation à partir de l'acétate d'éthyle/n-hexane donne l'échantillon analytique du sel de sodium de l'antibiotique X-14868A; 193-194°C.

10 Etape B: A partir des fractions n° 161-215, après avoir retiré le solvant sous une pression réduite, puis dissous le résidu dans l'acétate d'éthyle et l'avoir lavé avec HC1 1 N, puis après l'avoir lavé avec Na2C0^ (saturé à la température ambiante), lavé et séché sur Na2S0^, 15 après addition de n-hexane, on obtient des cristaux de sel de sodium de l'antibiotique X-14868B. P^ 172,5-174°C.

Exemple 5

Fermentation en cuve de Nocardia X-14868

On cultive et on garde la culture de Nocardia 20 X-14868 produisant l'antibiotique X-14868A sur un milieu en biseau de gélose à 1'amidon-caséine ayant la composition suivante (g/1 d'eau distillée):

Amidon soluble 10,0

Caséine 1,0

25 K2HP04 0,5

MgSO^ (anhydre) 0,5

Gélose 20,0

Ajuster le pH' à 7,4 avec NaOH avant de passer à l'autoclave.

30 On inocule le milieu en biseau avec la culture de

Nocardia X-14868 et on fait incuber à 28°C pendant 7 à 14 jours. On utilise alors un morceau de gélose contenant des mycelia du milieu en biseau gélosé ayant connu une bonne croissance pour préparer un inoculum végétatif en 35 inoculant un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de mi lieu d'inoculum avec la composition suivante (g/1 d'eau

34

distillée):

Pulpe de tomate Distillats solubles Peptone

Levure séchée sans amertume

Amidon de maïs

5,0 20,0 1,0 1,0

5,0 5,0 5,0

CaCO^

k2hpo4

On ajuste le pH à 7,0 avant de passer à l'autoclave .

On fait incuber le milieu inoculé pendant 72 h à 28°C sur un agitateur rotatif fonctionnant à 250 tpm.

On utilise 60 ml (3% v/v) de ce bouillon de culture pour inoculer un erlenmeyer de 6 litres contenant 2 litres de milieu d'inoculation ayant la composition suivante (gramme/litre d'eau distillée):

On ajuste le pH à 7,0 avant de passer à l'autoclave .

On fait incuber le milieu inoculé pendant 72 h à 28°C sur un agitateur rotatif fonctionnant a 250 tpm.

On utilise 4 litres de cette culture pour inoculer 230 1 du milieu de production suivant dans un fermentateur de 380 litres (gramme/litre d'eau du robinet):

Pulpe de tomate Distillats solubles Peptone

Levure séchée sans amertume Amidon de maïs

5,0 5,0 5,0 5,0 20,0 1,0 1,0

CaCO^

k2hpo4

Amidon de pomme de terre

Glycérol

Peptone

Céréales

40,0 5,0 2,0 2,0

35

Gruau de soja dégraissé 5,0 Levure séchée sans amertume 5,0 NaCl 5,0

CaCO^ 0,2

Antimousse 0,1

On ajuste le pH du milieu à 6,4 avant de stériliser pen-

p dant 1 h 1/4 avec 4,2 kg/cm de vapeur.

On aère le milieu inoculé avec de l'air comprimé à raison de 90 litres/minute et on agite avec des agitateurs à 280 tpm. La fermentation s'effectue à 28°C pendant 5 jours.

On estime la puissance de l'antibiotique X-14868A dans le bouillon de fermentation en dosant contre Staphy-lococcus aureus ATCC 6538P en utilisant un dosage de diffusion sur gélose avec plaque à cuvettes.

Exemple 4

Isolément des sels de sodium de l'antibiotique X-14868A; C et D d'une cuve de fermentation de Nocardia X-14868.

Etape A: Au bouillon entier d'une fermentation de 230 1 comme il est dit dans l'exemple 3 on ajoute, après une croissance de 115 heures, un volume égal d'acétate d'éthyle. Après avoir agité pendant 1 h on sépare la couche de solvant et on la concentre à 4,2 1 sous une pression réduite. On lave 2 fois l'extrait de solvant concentré avec un volume égal d'HCl 1 N, puis on lave 2 fois avec un volume égal de ^2^0^ (saturé à la température ambiante). On sèche la phase solvant sur Na2S0^ et on concentre en une huile sous une pression réduite. On dissout l'huile dans le n-hexane et on l'extrait une fois avec de l'acétonitrile puis 2 fois avec de 1'acétonitrile/métha-nol (8:2). On rassemble les extraits d'acétonitrile et d'acétonitrile/méthanol (8:2), et on retire le solvant sous line pression réduite. On dissout l'huile obtenue dans le diéthyléther, on la traite avec du charbon, on filtre et en ajoutant du n-hexane on obtient des cristaux de sel de

36

10

15

20

25

30

sodium brut de l'antibiotique X-14868A. On dissout les cristaux d'antibiotique bruts dans le chlorure de méthylène et on les soumet à une chromatographie sur une colonne de 600 g de gel de silice remplie d'une bouillie de chlorure de méthylène. On élue la colonne avec 4 1 de diéthyléther/ acétone/hydroxyde d'ammonium (8/2/0,02). On recueille des fractions de 45 ml chacune et on rassemble les fractions 13-15. On retire le solvant sous une pression réduite, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle puis on le lave 2 fois avec HC1 1 N et 2 fois avec N&2CO3 (saturé à la température ambiante), on sèche sur Na2S0^. On concentre la phace acétate d'éthyle et une huile et on la dissout dans le chlorure de méthylène, et par addition de n-hexane on obtient le sel de sodium cristallin de l'antibiotique X-14868A. Pf 193-195°C.

Etape B : On chromatographie la liqueur-mère des cristaux bruts de sel de sodium de l'antibiotique X-14868A (décrit dans l'étape A ci-dessus) sur une colonne de 1 kg de gel de silice remplie d'une bouillie de chlorure de méthylène. On élue la colonne avec 1 litre de n-hexane puis un gradient entre 4 litres de diéthyléther/n-hexane (7:3) et 4 litres de diéthyléther/acétone (8:2). On recueille des fractions de 40 ml chacune et on rassemble les fractions n° 43-80. On retire le solvant sous une pression réduite et on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on le lave avec HC1 1 N, puis on lave avec NagCO^ aqueux (saturé à la température ambiante) et on traite au charbon. Après filtration, on concentre la phase acétate d'éthyle en une huile. 'On dissout l'huile dans le diéthyléther et l'addition de n-hexane donne une quantité supplémentaire de sel de sodium de l'antibiotique X-14868A. Pf 193-195°C.

Etape C : Les fractions n° !22-40 de la colonne de gel de silice décrite ci-dessus dans l'étape A donnent le sel de sodium cristallin de l'antibiotique X-14868C. Pf 172-175°C.

Etape D: On rassemble la liqueur-mère du sel de sodium

37

cristallin de l'antibiotique X-14868A décrite dans l'étape B et les fractions 16-21 de la colonne de gel de silice décrite dans l'étape A, on concentre et on soumet à une chromatographie sur une colonne de 600 g de gel de silice remplie d'une bouillie de chlorure de méthylène. On élue la colonne avec 4 litres de diéthyléther/hexane ( 1 :1 ) ; 4 litres de diéthyléther/acétone/n-hexane/hydroxyde d'ammonium (6:2:2:0,002); 2 litres de diéthyléther/acétone (8:2). On recueille des fractions de 40 ml chacune. On rassemble les- fractions n° 71-98 et la cristallisation donne une quantité supplémentaire de sel de sodium cristallin de l'antibiotique X-14868A. On rassemble également les fractions n° 141-172, on retire le solvant sous une pression réduite et la cristallisation à partir du diéthyléther/n-hexane donne le sel de sodium de l'antibiotique X-14868D. Pf 194-195°C.

Exemple 5

Préparation du sel de thallium de l'antibiotique X-14868A.

On lave une solution de 51 mg de sel de sodium de l'antibiotique X-14868A dans le chlorure de méthylène avec HC1 1 N, puis on lave à l'eau et on lave 4 fois avec une solution aqueuse de carbonate de thallium. On sépare le solvant et on le concentre en un faible volume sous une pression réduite et après addition de n-hexane on récupère le sel de thallium cristallin de l'antibiotique X-14868A. La recristallisation à partir du diéthyléther/n-hexane donne des cristaux appropriés à l'analyse aux rayons X.

Exemple 6

Préparation du sel de calcium de l'antibiotique X-14868A.

On lave une solution de 200 mg de sel de sodium de l'antibiotique X-14868A dans l'acétate d'éthyle une première fois avec HC1 1 N, puis 3 fois avec une solution aqueuse d'hydroxyde de calcium (saturé à la température ambiante). On sépare le solvant et on le retire sous une pression réduite. On récupère le sel de calcium de l'antibiotique X-14868B sous la forme d'une mousse solide blanche.

38

Exemple 7

Fermentation en ballon agité de Nocardia X-14868

On cultive et on maintient la culture produisant l'antibiotique X-14868A sur un milieu gélosé en biseau à l'amidon, et à la caséine ayant la composition suivante (gramme/litre d'eau distillée):

Amidon soluble 10,0

Caséine 1,0

K2HC04 0,5

MgSO^ (anhydre) 0,5

Gélose 20,0

On ajuste le pH à 7,4 avant de passer à l'auto-clave à une pression de 1,05 kg/cm pendant 20 min.

On inocule le milieu en biseau avec une culture de Nocardia X-14868 et on fait incuber à 28°C pendant 7 à 14 jours. On utilise alors un morceau de gélose contenant des mycelia provenant du milieu en biseau gélosé ayant connu une bonne croissance pour inoculer un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu d'inoculation stérilisé ayant la composition suivante (gramme/litre d'eau distillée):

Pulpe de tomate 5,0

Distillats solubles 5,0

Peptone 5,0

Levure séchée sans amertume 5,0

Amidon de maïs 20,0

CaCO-j 1,0

k2hpo4 " 1,0

Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH avant stérilisation.

On fait incuber le milieu d'inoculation inoculé à 28°C pendant 72 h sur un agitateur rotatif fonctionnant à 250 tpm.

On utilise alors une fraction de 3 ml (3% v/v) de

39

la culture obtenue pour inoculer un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu de production stérilisé ayant la composition suivante (gramme/litre d'eau distillée):

On fait incuber le milieu inoculé à 28°C pendant 7 jours sur un agitateur rotatif fonctionnant à 250 tpm. On estime la puissance de l'antibiotique X-14868A en dosant contre Staphylococcus aureus ATCC 6338P en utilisant un dosage de diffusion sur gélose avec plaque à cuvettes.

Cérélose Amidon

Farine de soja

Hydrolysat de caséine (acide

Mélasse

CaC03

Eau du robinet q.s.p.1 1 pH 7,1

45,0 20,0 15,0 1,0

3,0 2,5

40

Claims

REVENDICATIONS

1) Procédé de préparation de composés polyéthers qui implique de cultiver une sous-culture de la souche Nocardia X-14868 ATCC 31585 dans une solution aqueuse d'hydra-

5 te de carbone contenant un aliment nutritif azoté dans des conditions aérobies en gélose profonde puis de séparer et d'isoler les produits finaux de ladite solution.

2) Procédé selon la revendication 1 où le produit final isolé est l'antibiotique X-14868A de formule

10

OMe où R est un hydrogène,

ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

3) Procédé selon la revendication 1 où le produit final isolé est l'antibiotique X-14868B de formule

25 OMe

35

41

où R est un méthyle,

ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

4) Procédé selon la revendication 1 où le produit final isolé est l'antibiotique X-14868C ayant sous forme de sel de sodium les caractères physiques suivants :

1) Un spectre infrarouge tel que représenté dans la figure 3;

2) Un point de fusion de 172-175°C (sel de sodium);

3) Une rotation spécifique de (oOD chloroforme méthanol +49,6° +30,5°

et 4) Une microanalyse de

% C % H % Na

57,13 8,58 2,36

5) Procédé selon la revendication 1 où le produit final isolé est l'antibiotique X-14868D ayant comme sel de sodium les caractères physiques suivants:

1) Un spectre infrarouge tel que représenté dans la figure 4;

2) Un point de fusion de 194-195°C (sel de sodium);

3) Une rotation spécifique de

(o^)D chloroforme méthanol

+41,1° +29,2°

et 4) Une microanalyse de

% C % H % Na

60,32 8,80 3,40

6) Procédé de préparation de préparations pharmaceutiques qui implique d'incorporer un composé tel qu'exposé dans l'une quelconque des revendications 1-5 en une formulation galénique.

7) Procédé de préparation de préparations pharmaceutiques pour le traitement et la prophylaxie des maladies bactériennes et/ou de la coccidiose qui implique d'incorporer un composé tel qu'exposé dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 en une formulation galénique.

\

42

8) Procédé de préparation de préparations pharmaceutiques pour le traitement et la prophylaxie de la dysenterie des porcs qui implique d'incorporer un composé tel qu'exposé dans la revendication 1 en une formulation galénique.

5 9) Procédé de préparation de prémélange ou de composi tions pour la consommation immédiate comme agents favorisant la croissance des ruminants qui implique d'incorporer un composé tel qu'exposé dans la revendication 2 en une formulation sans danger.pour l'animal, de préférence dans 10 une nourriture animale.

10) Prémélange ou composition pour consommation immédiate comme agents favorisant la croissance des ruminants, comprenant un composé tel qu'exposé dans la revendication 2.

11) Composés polyéthers lorsqu'ils sont préparés selon 15 le procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou par un de ses équivalents chimiques évidents.

12) Antibiotique X-14868A de formule

20

25

OMe

Me

_ CA AnO4

Me H Me H H H 0R

nu Me

30

35

où R est un hydrogène,

et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, qu'ils soient préparés selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 2 ou par un de ses équivalents chimiques évidents .

13)

Antibiotique X-14868B de formule

43

OMe ni Me

.Me c02H •

où R est un méthyle,

et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, qu'ils soient préparés selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 3 ou par un de ses équivalents chimiques évidents.

14) Antibiotique X-14868C ayant sous forme de sel de sodium les caractères physiques suivants :

1) Un spectre infrarouge tel qu'exposé dans la figure 3;

2) Un point de fusion de 172-175°C (sel de sodium),

3) Une rotation spécifique de qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué dans la revendication 4 ou par un de ses équivalents chimiques évidents.

(c< )D chloroforme +49,6°

méthanol +30,5°

et 4) Une microanalyse de

% C %. H % Na

60,32 8,80 3,40

15) Antibiotique X-14868D ayant sous forme de sel de sodium les caractères physiques suivants :

1) Un spectre infrarouge tel qu'exposé dans la fi

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gure 4;

2) Un point de fusion de 194-195°C (sel de sodium);

3) Une rotation spécifique de

(o()D chloroforme méthanol

5 .+41,1° +29,2°

et 4) Une microanalyse de

% C % H % Na

60,32 8,80 3,40

qu'il soit préparé selon le procédé tel que revendiqué 10 dans la revendication 5 ou par un de ses équivalents chimiques évidents.

16) L'invention telle que décrite ci-dessus.

17) Composé polyéther de formule

15

20

OMe

Me

OMe

1 f^Cl Cl .

Me H Me H H H ^

25

où R est un hydrogène ou un méthyle,

et ses sels compatibles comme agents favorisant la croissance chez les ruminants.