CH478738A - Verfahren zur Herstellung von D-Ribose - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von     D-Ribose       Die vorliegende Erfindung betrifft ein     Verfahren    zur  Herstellung von     D-Ribose.     



  Die bisher zur Herstellung von     D-Ribose    zur An  wendung gelangten Verfahren     (beispielsweise    durch Hy  drolyse von     Hefe-Nuklein-Säure)    hängen von der Zer  setzung von Stoffen ab, die mit der     Ribonukleinsäure     verwandt sind; infolgedessen sind diese bekannten Ver  fahren ziemlich     kostspielig.     



  Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis,  dass bei Gärungen, die mit einer     Vielzahl    von Mikro  organismen in Medien durchgeführt     werden,    die eine  verhältnismässig hohe Konzentration an Metallsalzen,  insbesondere     Kalium-    und     Magnesiumsalzen,    enthalten,  eine bemerkenswert grosse Menge von     D-Ribose    in dem  Gärungsmedium angesammelt wird, wenn diesem ge  trennt oder in Kombination ein Zusatz von bestimmten  Metallsalzen in verhältnismässig hoher Konzentration bei  gefügt wird.  



  Es hat sich dabei herausgestellt, dass die oben be  schriebene Beobachtung vom Stamm der Mikroorganis  men unabhängig ist, also auch für Stämme von Mikro  organismen gültig ist, die beispielsweise zu den Gattun  gen     Micrococcus,        Brevibacterium,        Aerobacterium,    Co  rynebacterium,     Bacillus    usw., gehören. Die Erfindung  kann auch bei Nährstoffe benötigenden Mutanten ange  wendet werden, die man durch verschiedene     mutations-          fördernde    Behandlungen erhält.  



  Das Kulturmedium kann genügende Mengen von       Sacchariden    und anderen     Kohlenstoffquellen    (beispiels  weise Glukose, Stärke,     Hydrolyse-Stärke    und Melasse),  Stickstoffquellen (beispielsweise Harnstoff, Ammonium  chlorid und     Ammoniumnitrat),    anorganische Verbindun  gen (beispielsweise     Kaliumphosphat,        Magnesiumsulfat,          Mangansulfat,        Zinksulfat,    Eisensulfat, Eisenchlorid, Zink  chlorid und     Kalziumchlorid)    sowie     stickstoffhaltige    na  türliche Stoffe (beispielsweise Flüssigkeit der Maismai  sche, Hefeextrakt,- Fleischextrakt,

       Pepton,    Hydrolyse-    Protein und Fischmehl) enthalten. Im Falle von Nähr  stoffe benötigenden     Mutationsstämmen    müssen natür  lich die     erforderlichen        Nährstoffe    dem Medium zugesetzt  werden, um das     Wachstum    dieser Mutanten zu gewähr  leisten.  



  Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von       D-Ribose    kennzeichnet sich dadurch, dass man in einem  ein     Saccharid    enthaltenden wässrigen     Näheboden    mit  0,01 bis 0,2     Gew.- /o        Magnesiumionen,    0,1 bis 1,5     Gew.-7o          Kaliumionen    und 0,0001 bis 1 g Mangan-, Eisen- und/  oder Zinkionen in<B>100</B> Milliliter Lösung einen     D-Ribose     bildenden Mikroorganismus     aerobisch    züchtet und die  erzeugte     D-Ribose    abtrennt.  



  Die Gärung wird     aerobisch,        z.B.    mit einer Rühr- oder       Belüftungs    -     Gärungs    - Anlage, beispielsweise bei einer  Züchtungstemperatur von 20 bis 40 C durchgeführt.  Nach einer Züchtungsdauer von 2 bis 8 Tagen hat sich  eine     bemerkenswert    grosse Menge von     D-Ribose    in dem  Kulturmedium und in den Zellen gebildet.  



  Nach Beendigung der Gärung kann die     D-Ribose     durch Behandlung mit einem     Ionenaustauscher-Harz,    Ad  sorption, Fällung und Extraktion gewonnen werden, wie  in den nachstehend aufgeführten Beispielen beschrieben  wird, die nur zur Erläuterung dienen und die Erfindung  in keiner Weise einschränken sollen.  



  In den folgenden Beispielen     sind,    wenn nicht aus  drücklich etwas anderes vermerkt ist, die Prozentsätze  auf das Gewicht bezogen.  



  <I>Beispiel 1</I>       Brevibaeterium        ammoniagenes        ATCC        No.    6872 wird  verwendet. Es wird unter Rühren in dem Impfkultur  medium gezüchtet, das     2%    Glukose,     1%        Pepton,        1%     Hefeextrakt und     0,25%        NaCI    enthält und dann in 30     Mil-          liliter-Portionen    in einen 250     Milliliter-Erlenmeyerkolben     gegeben, in welchem es 24 Stunden lang bei 30 C bleibt.

    Ein unten angeführtes Gärungsmedium, das in 20 Milli-           liter-Portionen    in den 250     Milliliter-Erlenmeyerkolben     eingeführt wird, wird mit ungefähr 10     Vol.-%    der oben  angeführten Impfkultur geimpft. Das Gärungsmedium  wird ebenfalls bei 30 C unter Rühren gezüchtet.  



  <I>Zusammensetzung des Gärungsmediums:</I>  100 Gramm Glukose, 6 Gramm Harnstoff, 10 Gramm       KH.-P04,    10 Gramm     K,HP04,    10 Gramm     MgSO,        -7H1!0,     30     y        Biotin,    0,1 Gramm     CaCl2    -     2H20    und 2 Gramm       MnSO,    -     4H20    werden mit Wasser zu einem Liter er  gänzt, wonach der     pH-Wert    vor der Sterilisation auf  8,0 eingestellt wird.  



  Auf diese Art und Weise werden in dem 120 Stunden  gezüchteten Gärungsmedium 11 Milligramm     D-Ribose     pro Milliliter erzeugt. Eine ähnliche Ansammlung von       D-Ribose    wird ebenfalls in den Zellen festgestellt. Die  Glukose wird beinahe vollständig verbraucht.  



  Die Zellen werden aus diesem Gärungsmedium ent  fernt und ein Liter des Filtrates wird mit Salzsäure auf  einen     pH-Wert    von 5,0 eingestellt und dann durch eine       Harz-Dia-Ionen-Kolonne    SK     No.    1     (H-Typ)    geschickt.  



  Danach wird     destilliertes    Wasser durch die Kolonne  geschickt und     Ribose-Anreicherungen    in den Ausflüssen  werden gesammelt und wieder durch eine     Dia-Ionen-          Kolonne    SA     No.    21A (OH-Typ) geschickt, wobei der       pH-Wert    unverändert beibehalten wird. Die     Ribose-An-          reicherungen    der     Ausflüsse    werden zusammen gesam  melt, auf einen     pH-Wert    von 6,5 eingestellt und dann  unter verringertem Druck bei 50 C konzentriert.

   Die  konzentrierte Lösung entfärbt man mit     Aktivkohlepulver     und lässt sie dann nach Zusatz von Alkohol in einem  Kühlraum stehen. Man erhält     Ribose    in kristallinischer  Form (Ausbeute 8,6 Gramm).  



  <I>Beispiel 2</I>       Brevibacterium        ammoniagenes        ATCC        No.   <I>6872</I> wird  für die Gärung verwendet. Für das Impfpräparat werden  30 Milliliter eines wässrigen Kulturmediums, das     2%     Glukose,     1%        Pepton,        1%    Hefeextrakt und     0.25%    Na  triumchlorid enthält, in einen     Erlenmeyerkolben    einge  führt und sterilisiert, wonach man den oben angeführten  Stamm unter Rühren in diesem Medium bei 30 C wäh  rend 24 Stunden wachsen lässt.

   Das Gärungsmedium, das  die folgende Zusammensetzung hat, wird in 250     Milli-          liter-Erlenmeyerkolben    in einzelnen, 20     Milliliter-Portio-          nen    hergestellt und sterilisiert,     anschliessend    mit der  oben beschriebenen Impfkultur geimpft und nach der  Impfung während des weiteren Wachstums bei 30 C  gerührt.  
EMI0002.0048     
  
    Glukose <SEP> 10 <SEP> % <SEP> MgSO, <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>  Harnstoff <SEP> 1,0% <SEP> Biotin <SEP> 30/Liter
<tb>  KH,P04 <SEP> 1,0% <SEP> CaCl2 <SEP> - <SEP> 211_O <SEP> <B>0,010/,</B>
<tb>  K,HP04 <SEP> 1,0%       Nach der Sterilisation wird der     pn-Wert    auf 8,0 ein  gestellt.  



  Danach werden verschiedene Arten von Metallsalzen  getrennt zugesetzt und     Mangansalze    und andere metal  lische     Salze    werden ebenfalls in Mischungen dem wie  oben beschrieben hergestellten Kulturmedium zugesetzt.  Die Mengen von     D-Ribose,    die sich nach 96 Stunden  Züchtung angesammelt haben, sind in Tabelle 1 ange  geben:

    
EMI0002.0053     
  
    Tabelle <SEP> 1
<tb>  Art <SEP> des <SEP> metal- <SEP> Konzentration <SEP> Erzeugte <SEP> D  lischen <SEP> Ions <SEP> des <SEP> Zuschlages <SEP> Ribose-menge
<tb>  O <SEP> 0 <SEP> 0,08 <SEP> mg/ml
<tb>  Fe-- <SEP> 0,05% <SEP> 4,2 <SEP> > >
<tb>  Mn-- <SEP> 0,05% <SEP> 7,9 <SEP>   <SEP>  
<tb>  Co- <SEP> 0,05% <SEP> 0,0 <SEP>   <SEP>  
<tb>  Ni-"-" <SEP> 0,05% <SEP> 0,0 <SEP>   <SEP>  
<tb>  Zn++ <SEP> 0,05% <SEP> 3,0 <SEP>   <SEP>  
<tb>  Mn- <SEP> -f- <SEP> Fe- <SEP> 0,05% <SEP> -I-- <SEP> 0,05% <SEP> 8,3 <SEP>   <SEP>  
<tb>  Mn++ <SEP> -f- <SEP> Zn++ <SEP> 0,05% <SEP> -I- <SEP> 0,05% <SEP> 7,7 <SEP> > >
<tb>  Mn- <SEP> -I- <SEP> Co- <SEP> 0,05% <SEP> -I- <SEP> 0,05% <SEP> 0,0 <SEP>   <SEP>  
<tb>  <I>MW-'</I> <SEP> -I-- <SEP> Ni- <SEP> 0,05 .o <SEP> -f- <SEP> 0,05% <SEP> 0,

  0 <SEP>   <SEP>         <I>Beispiel 3</I>  Bei Verwendung des gleichen Stammes und der glei  chen Züchtungsbedingungen wie im Beispiel 2 wird die  Menge des dem Medium zugesetzten     MnS04    -     4H20    ver  ändert. Nach 96 Stunden haben sich folgende     D-Ribose-          Mengen    angesammelt:

    
EMI0002.0058     
  
    Tabelle <SEP> 2
<tb>  Menge <SEP> von
<tb>  zugesetztem <SEP> Mn-H- <SEP> Erzeugte <SEP> D-Ribose-Menge
<tb>  0 <SEP> % <SEP> 0,1 <SEP> Milligramm/Milliliter
<tb>  <B>0,0001%</B> <SEP> 2,0 <SEP>   <SEP>  
<tb>  <B>0,0008%</B> <SEP> 3,8 <SEP>   <SEP>  
<tb>  0,008 <SEP> % <SEP> 7,4 <SEP>   <SEP>  
<tb>  0,004 <SEP> % <SEP> 10,7 <SEP>   <SEP>  
<tb>  0,08 <SEP> % <SEP> 6,5 <SEP> > >
<tb>  0,4 <SEP> % <SEP> 5,1 <SEP>   <SEP>  
<tb>  <U>0,8 <SEP> %</U> <SEP> 1,2 <SEP>   <SEP>         <I>Beispiel 4</I>  Der verwendete Stamm ist     Micrococcus        glutamicus          KY   <I>3803</I>     (ATCC        No.    15455).

   Das     Gärungsverfahren    und  die Zusammensetzung des     Impfkulturmediums    sind die  gleichen wie in Beispiel 1.  



  Die Zusammensetzung des Gärungsmediums wird un  ten angegeben.  



       Zusammensetzung   <I>des</I>     Gärungsmediums:     100 Gramm Glukose, 3 Gramm Harnstoff, 2 Gramm       KH2P04,    1 Gramm     Kf!HP04,    1 Gramm     MgS04    -     7H20,     10 Gramm     Biotin,    0,1 Gramm     CaCl,    -     2H20    und 2  Gramm     MnS0,    -     4H20    werden mit Wasser zu einem  Liter ergänzt und der     pH-Wert    wird vor der Sterilisation  auf 8,0 eingestellt.  



  Nach 120 Stunden Züchtung haben sich 8,2 Milli  gramm     D-Ribose    in jedem Milliliter des Gärungsmediums  angesammelt.  



  Das Gärungsmedium wird auf einen     pH-Wert    von  4,5 eingestellt, während 10 Minuten auf 70 C erhitzt  und zentrifugiert um die Zellen     abzuscheiden.    Aus der  sich ergebenden     Flüssigkeit    wird ein Liter der oben  schwimmenden Flüssigkeitsschicht abgetrennt und mit  wässrigem     NaOH    auf einen     pH-Wert    von 7,8 eingestellt  und mit 50 Gramm zugesetzter gepresster Brothefe wäh  rend 10 Minuten bei 37 C zur Reaktion gebracht, um  die Restglukose zu verbrauchen. Die Flüssigkeit wird  zentrifugiert und die     obenschwimmende    Flüssigkeits  schicht wird gemäss dem gleichen Verfahren wie in Bei-      spiel 1 beschrieben, behandelt.

   Man erhält 5,7 Gramm  kristalliner     Ribose.     



  <I>Beispiel 8</I>       Baciltus        cereus        (ATCC        No.    9139) wird in einem im  Beispiel 2 beschriebenen Medium gezüchtet und auf ein  Medium mit der folgenden Zusammensetzung übertra  gen und darin während 102 Stunden unter Zusatz von       Mn-    und     Zn-        (0,05%    bzw.     0,02%)    gezüchtet. Die Men  ge von angesammelter     D-Ribose    beträgt 7,1 Milligramm  pro Milliliter des Gärungsmediums.

    
EMI0003.0011     
  
    Glukose <SEP> 10 <SEP> a/o <SEP> NH,CI <SEP> <I>0,7 /o</I>
<tb>  <B>K2HPO4</B> <SEP> 0,6% <SEP> <B>KH2PO1</B> <SEP> 0,6%
<tb>  MgS04 <SEP> - <SEP> <B>7H20</B> <SEP> 0,6% <SEP> Hefeextrakt <SEP> <B>1,0%</B>       Die gemäss dem obigen erhaltene     D-Ribose    ergibt  nach der gleichen Behandlung wie im Beispiel 1 5,7  Gramm kristalliner     Ribose.     



  <I>Beispiel 6</I>       Brevibacterium        ammoniagenes        (ATCC        No.    6872) wird  in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 2 gezüch  tet. Das     Impfkulturmedium    wird in Portionen von 150  Millilitern in     2-Liter-Erlenmeyerkolben    gegeben, 18 Stun  den lang unter Rühren gezüchtet und dann in     5-Liter-          Gärungskolben    (in Portionen von 3 Litern) eingeführt,  worin es mit einem     Belüftungsvolumen    von 3     Liter/Mil-          liliter    und unter Rühren mit 400 U/min. weiter gezüchtet  wird.

   Die     Zusammensetzung    des wässrigen Gärungsmit  tels ist folgende:       10%        Glukose;        1,07,        KH@P04;        1,0%        K@HP04;        1,0%          MgS04    -     7H20;    100     y/Liter        Biotin;        0,010/,        CaCl2    . 2H20;       0,2a/o    Harnstoff und     O,loo        MnSO,        -4H,0.     



  Das     pH    des Gärungsmediums wird mit Harnstoff auf  einen geeigneten Wert eingestellt. Nach 66 Stunden Züch  tung haben sich 12,7 Milligramm     D-Ribose    in jedem    Milliliter des Gärungsmediums angesammelt. Die     D-Ri-          bose    wird in der gleichen Art und Weise wie im Beispiel 2  behandelt. Man erhält 30 Gramm     D-Ribose-Kristalle.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem ein Saccharid ent haltenden wässrigen Nährboden mit 0,01 bis 0,2 Gew.-0/, Magnesiumionen, 0,1 bis 1,5 Gew.-% Kaliumionen und 0,0001 bis 1 g Mangan-, Eisen- und/oder Zinkionen in 100 Milliliter Lösung einen D-Ribose bildenden Mikro organismus aerobisch züchtet und die erzeugte D-Ribose abtrennt. UNTERANSPRÜCHE 1.

   Verfahren nach Patentanspruch, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mikroorganismus der Mi- crococcus-Gattung. 2. Verfahren nach Unteranspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Micrococcus glutamicus (ATCC No. 15455). 3. Verfahren nach Patentanspruch, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mikroorganismus der Brevi- bacterium-Gattung. 4.

   Verfahren nach Unteranspruch 3, gekennzeichnet durch die Verwendung von Brevibacterium ammoniage- nes (ATCC No. 6872). 5. Verfahren nach Patentanspruch, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mikroorganismus der Ba- cillus-Gattung. 6. Verfahren nach Unteranspruch 5, gekennzeichnet durch die Verwendung von Bacillus cereus (ATCC No. 9139).