BRPI0818165B1

BRPI0818165B1 - método de produção recombinante de uma imunoglobulina heteróloga em células cho que é secretada para o meio de cultura

Info

Publication number: BRPI0818165B1
Application number: BRPI0818165-9A
Authority: BR
Inventors: Ulrich Goepfert; Hendrik Knoetgen; Erhard Kopetzki; Anne Stern
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2020-10-27
Also published as: KR20100059969A; MX2010003622A; WO2009047007A1; JP2010540583A; HRP20181833T1; EP2207881A1; AU2008309881A1; US20140335609A1; HUE039950T2; DK2592148T3; EP2592148B1; LT2592148T; PT2592148T; KR20100059967A; CA2701646C; CN101821394A; US20100249379A1; JP2011500009A; EP2592147A1; JP5642549B2

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UMA IMUNOGLOBULINA HETERÓLOGA EM CÉLULAS CHO QUE É SECRETADA PARA O MEIO DE CULTURA, ANTI-ABETA, ANTISSELEÇÃO P, ANTI-IL-13RALFA, BEM COMO CONJUGADO DE ANTICORPO ANTICD4. A presente invenção refere-se a um método para a produção recombinante de uma imunoglobulina heteróloga secretada em uma célula CHO, compreendendo as seguintes etapas: i) proporcionar uma célula CHO, a qual está adaptada ao crescimento em cultura em suspensão, adaptada ao crescimento em meio sem soro, sem micoplasma, e sem vírus, ii) proporcionar um vetor compreendendo uma origem de replicação procariótica, um primeiro ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, um segundo ácido nucléico codificando a cadeia longa da dita imunoglobulina heteróloga, um terceiro ácido nucléico codificando a cadeia curta da dita imunoglobulina heteróloga, um quarto ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção eucariótico, ill) transfectar a dita célula CHO, em que a dita transfecçâo compreende a) transfectar a dita célula CHO com o dito vetor compreendendo um quarto ácido nucléico conferindo resistência a um primeiro agente de seleção eucariótico, b) selecionar uma célula CHO por crescimento em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, c) transfectar (...).

Description

[001] A presente invenção refere-se à produção de polipeptídeos. Mais precisamente, refere-se à produção de uma imunoglobulina em uma célula mamífera, pelo que a célula mamífera é transfectada com diferentes vetores, cada um compreendendo um cassete de expressão para a imunoglobulina de interesse.

Antecedentes da Invenção

[002] Os sistemas de expressão para a produção de polipeptídeos recombinantes são bastante conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, por Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18- 33; Goeddel, D.V., e outros, Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., e Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159. Os polipeptídeos para uso em aplicações farmacêuticas são preferivelmente produzidos em células mamíferas, tais como as células CHO, as células NS0, as células SP2/0, as células COS, as células HEK, as células BHK, as células PER.C6®, ou similar. Os elementos essenciais de um plasmídeo de expressão são uma unidade de propagação de plasmí- deo procariótica, por exemplo, para E. coli, compreendendo uma origem de replicação procariótica e um marcador de seleção procariótico, um marcador de seleção eucariótico, e um ou mais cassetes de expressão para a expressão do(s) gene(s) estrutural(is) de interesse, cada um compreendendo um promotor, um gene estrutural, e um termi- nador de transcrição incluindo um sinal de poliadenilação. Para a expressão transiente em células mamíferas, uma origem de replicação mamífera, tal como a SV40 Ori ou a OriP, pode ser incluída. Como promotor, um promotor constitutivo ou induzível pode ser selecionado. Para a transcrição otimizada, uma sequência de Kozak pode ser inclu- ida na região não-traduzida em 5'. Para o processamento do mRNA, em particular, a remoção do mRNA e a terminação da transcrição, os sinais de remoção de mRNA, dependendo da organização do gene estrutural (organização de éxon/íntron), podem ser incluídos, bem como um sinal de poliadenilação.

[003] A expressão de um gene é efetuada como expressão transiente ou como permanente. O(s) polipeptídeo(s) de interesse é(são), em geral, polipeptídeos secretados e, portanto, contêm uma extensão N-terminal (também conhecida como a sequência sinal), que é necessária para o transporte/secreção do polipeptídeo através da célula pa-ra o meio extracelular. Em geral, a sequência sinal pode ser derivada de qualquer gene codificando um polipeptídeo secretado. Se for usada uma sequência sinal heteróloga, ela preferivelmente é uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para a secreção em levedura, por exemplo, a sequência sinal nativa de um gene heterólogo a ser expresso pode ser substituída por uma sequência sinal de levedura homóloga, derivada de um gene secretado, tal como a sequência sinal de invertase de levedura, a líder de fator alfa (incluindo as líderes de fator oc de Saccha- romyces, Kluyveromyces, Pichia, e Hansenula, a segunda descrita na US 5.010.182), a sequência sinal de fosfatase ácida, ou a sequência sinal de glicoamilase de C. albicans (EP 0 362 179). Na expressão em células mamíferas, a sequência sinal nativa da proteína de interesse é satisfatória, embora outras sequências de sinais de mamíferos possam ser adequadas, tais como as sequências de sinais a partir de polipeptídeos secretados de espécies iguais ou relacionadas, por exemplo, para imunoglobulinas de origem humana ou de murino, bem como sequências de sinais secretórias virais, por exemplo, a sequência sinal da glicoproteína D de herpes simples. O fragmento de DNA codificando para tal pré-segmento é ligado em quadro ao fragmento de DNA codificando um polipeptídeo de interesse.

[004] Hoje, as células CHO são amplamente usadas para a expressão de polipeptídeos farmacêuticos, em pequena escala no laboratório ou em grande escala em processos de produção. Devido à sua ampla distribuição e uso, as propriedades características e o fundamento genético das células CHO são bastante conhecidos. Portanto, as células CHO são aprovadas por autoridades reguladoras para a produção de proteínas terapêuticas para aplicação a seres humanos.

[005] Na EP 0 569 678, descrevem-se transfectantes duplos de genes do MHC como vacinas celulares para a imunoprevenção de me- tástase do tumor. A WO 97/08342 descreve um método aperfeiçoado para medir a atividade de uma sequência promotora em uma célula mamífera usando um gene relator. O uso de siRNAs anti-RhoA e anti- RhoC para inibir especificamente a síntese de RhoA ou RhoC é descrito na WO 2005/113770. Um método para a produção ou a expressão recombinante de mutante de fosfatase alcalina eucariótico em células de leveduras é descrito na US 7.202.072. A WO 2001/038557 descreve um método de examinar as células multiplamente transformadas usando a expressão bicistrônica de proteínas fluorescentes. Um método para produzir linhagens celulares eucarióticas recombinantes expressando múltiplas proteínas ou RNAs de interesse é descrito na WO 1999/47647. Os sistemas, incluindo os métodos, as composições, e os kits, para a transfecção de células com materiais de transfecção usando veículos codificados são descritos na WO 2003/076588. Na US 5.089.397, descreve-se um sistema de expressão para a produção recombinante de uma proteína desejada compreendendo células CHO transformadas com uma sequência de DNA tendo a sequência codificadora da proteína desejada sob o controle do promotor de metalotioneína II humano. Um método para produzir pro-teínas recombinantes é descrito na US 2003/00400047. Lamango e outros (Lamango, N.S., e outros, Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 238-250) descrevem a dependência da produção de pró-hormônio convertase 2 da presença do polipeptídeo neuroendocrine 7B2. A transfecção de um vetor de expressão baseado em BPV-1 em células abrigando os genomas de BPV-1 replicadores não integrados é descrita por Waldenstroem, M., e outros, Gene 120 (1992) 175-181. A US 4.912.038 descreve métodos e vetores para obter proteína tensoativa alveolar 32K canina e humana. Na WO 89/10959 descrevem-se técnicas de DNA recombinante e a expressão de polipeptídeos mamíferos em células eucarióticas geneticamente engenheiradas. Uma cotransfe- rência repetida de um vetor de expressão para o hormônio do crescimento humano e um vetor de expressão para um gene marcador de seleção é descrita em DD 287531.

Sumário da Invenção

[006] Um primeiro aspecto da presente invenção é um método para a produção recombinante de uma imunoglobulina heteróloga, a qual é secretada para o meio de cultivo em uma célula CHO, compreendendo: a) fornecer uma célula CHO, a qual está - adaptada ao crescimento em cultura em suspensão, - adaptada ao crescimento em meio sem soro, - sem micoplasma, e - sem vírus, opcional, b) fornecer um ácido nucléico compreendendo - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, e/ou uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve da dita imu- noglobulina heteróloga,

[007] pelo que um primeiro vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, o qual compreende o dito primeiro, bem como o dito segundo e/ou terceiro ácido nucléico, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um primeiro agente de seleção eucariótico, e

[008] pelo que um segundo vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, o qual compreende o primeiro, bem como o segundo e/ou o terceiro ácido nucléico idêntico àquele/àqueles no dito ácido nucléico fornecido contido no primeiro vetor de transfecção, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um segundo agente de seleção eucariótico, que é diferente do quarto ácido nucléico no dito primeiro vetor de transfecção, pelo que o dito segundo agente de seleção eucariótico é diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico, c) transfectar a dita célula CHO proporcionada e selecionar a dita célula CHO transfectada com os ditos vetores de transfecção da etapa b), em que as ditas transfecção e seleção compreendem as etapas a seguir, na seguinte ordem: (i) transfectar a dita célula CHO com o dito primeiro vetor de transfecção, (ii) selecionar uma célula CHO transfectada em (i) por cres-cimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, (iii) transfectar a dita célula CHO selecionada em (ii) com o dito segundo vetor de transfecção, (iv) selecionar uma célula CHO transfectada em (iii) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, ao qual o dito primeiro vetor de transfecção confere resistência, e contendo o dito segundo agente de seleção eucariótico, ao qual o dito segundo vetor de transfecção confere resistência, d) cultivar a dita célula CHO transfectada e selecionada da etapa c) em um meio contendo os ditos primeiro e segundo agentes de seleção eucarióticos, sob condições adequadas para a expressão dos ditos segundo e/ou terceiro ácidos nucléicos, e) recuperar a dita imunoglobulina heteróloga secretada do meio de cultivo e, com isso, produzindo uma imunoglobulina heteróloga em uma célula CHO, imunoglobulina esta que é secretada para o meio de cultivo.

[009] Em uma modalidade do método de acordo com a invenção, a dita célula CHO é uma célula CHO K1, ou uma célula CHO DG44, ou uma célula CHO XL99, ou uma célula CHO DXB11, ou uma célula CHO DP12. Em uma outra modalidade, o promotor empregado para a transcrição dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é diferente do promotor empregado para a transcrição do dito quarto ácido nuclei- co. Uma modalidade adicional é que o promotor empregado para a transcrição dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é o mesmo. Em uma modalidade, o dito promotor empregado para a transcrição dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é o promotor de CMV. Em uma outra modalidade, o dito promotor empregado para a transcrição do dito quarto ácido nucléico é o promotor de SV40. Em uma modalidade, a dita imunoglobulina heteróloga é um anticorpo anti-Aβ. Os anticorpos anti-Aβ ilustrativos são descritos, por exemplo, na WO 2003/070760.

[0010] Em uma modalidade, a dita seleção de uma célula CHO transfectada na etapa c) (ii) e/ou (iv) é por crescimento em meio de cultivo sem um agente de seleção, por 10 a 72 horas, seguido por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito pri- meiro agente de seleção eucariótico, no caso de (ii), ou os ditos primeiro e segundo agentes de seleção eucarióticos, no caso de (iv).

[0011] Em mais uma modalidade adicional, o uso de códon dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é otimizado para a tradução em células CHO. Também uma modalidade é que os ditos segundo e/ou terceiro ácidos nucléicos contêm uma sequência de ácidos nu- cleicos intrônica. Uma outra modalidade compreende que o dito primeiro vetor de transfecção e o dito segundo vetor de transfecção diferem somente no ácido nucléico conferindo resistência ao dito agente de seleção eucariótico, isto é, no dito quarto ácido nucléico, e são, por outro lado, pelo menos 95% idênticos com base na sequência de ácidos nucléicos. Em uma outra modalidade, os ditos vetores de transfecção diferem cada um somente no ácido nucléico conferindo resis-tência aos ditos primeiro, segundo e terceiro agentes de seleção euca-rióticos.

[0012] Em uma modalidade, o dito método adicionalmente compreende: após a etapa b), uma etapa b1): b1) fornecer um ácido nucléico compreendendo - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, e/ou uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve da dita imu-noglobulina heteróloga, pelo que um terceiro vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, o qual compreende o primeiro, bem como o segundo e/ou o terceiro ácido nucléico idêntico àquele/àqueles no dito ácido nucléico fornecido contido no primeiro e no segundo vetores de transfecção, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um terceiro agente de seleção eucariótico, que é diferente do quarto ácido nucléico nos ditos primeiro e segundo vetores de transfecção, pelo que o dito terceiro agente de seleção eucariótico é diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico e é também diferente do dito segundo agente de seleção eucariótico, e adicionalmente compreende, após a etapa c) (iv), as seguintes etapas (v) e (vi) (v) transfectar a dita célula CHO selecionada em (iv) com o dito terceiro vetor de transfecção, (vi) selecionar uma célula CHO transfectada em (v) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, e o dito segundo agente de seleção eucariótico, ao qual o segundo vetor de transfecção confere resistência, e o dito terceiro agente de seleção eucariótico, ao qual o terceiro vetor de transfecção confere resistência, e adicionalmente o dito meio para cultivo da dita célula CHO transfectada, na etapa d), compreende os ditos primeiro, segundo e terceiro agentes de seleção eucarióticos.

[0013] Em uma modalidade, a dita seleção de uma célula CHO transfectada na etapa c) (vi) é por crescimento em meio de cultivo sem um agente de seleção, por 10 a 72 horas, seguido por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo os ditos primeiro e segundo e terceiros agentes de seleção eucarióticos.

[0014] Em uma outra modalidade, o método de acordo com a invenção compreende uma etapa adicional f) purificar a dita imunoglobulina heteróloga produzida de modo re- combinante e recuperada, da etapa e), com uma ou mais etapas cro- matográficas.

[0015] Uma modalidade é que a dita etapa c) e a dita etapa d) são efetuadas no mesmo meio. Ainda uma outra modalidade é que o dito meio é um meio sem soro, ou um meio sem soro suplementado com componentes derivados de animais definidos, ou um meio sem componentes derivados de animais, ou um meio sem proteína, ou um meio quimicamente definido, ou um meio sem proteína definido. Em uma modalidade adicional na dita etapa d) é o dito cultivo na presença dos ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de menos do que 500 litros e o dito cultivo é na ausência dos ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de 500 litros ou mais, pelo que a dita recuperação da dita imunoglobulina heteróloga secretada é a partir do meio de cultivo sem os ditos agentes de seleção eucarióticos. Em uma modalidade adicional, o dito cultivo na dita etapa d) está compreen-dendo cultivos sequenciais, cada um com volume de cultivo crescente até um volume de cultivo final pré-estabelecido, pelo que os cultivos são efetuados na presença dos ditos agentes de seleção eucarióticos até um volume de cultivo de 1% (v/v) do volume de cultivo do cultivo final e na ausência dos ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de cultivo de mais do que 1% (v/v) do volume de cultivo do cultivo final.

[0016] A produtividade das ditas células é, em uma modalidade, sobre 40 gerações, não menos do que 70% e não mais do que 130% da produtividade após 10 gerações de cultivo como cultivo em batelada separada. Em uma outra modalidade, a produtividade das ditas células CHO sobre 60 gerações é não menos do que 50% e não mais do que 150% da produtividade após 10 gerações de cultivo como cultivo em batelada separada. Ainda em uma modalidade adicional, a produtividade da dita célula CHO é pelo menos 1,5 g/l da dita imunoglobulina heteróloga dentro de 21 dias como cultivo em batelada alimentada.

[0017] Um segundo aspecto da presente invenção é uma célula CHO obtenível com o seguinte método: a) fornecer uma célula CHO, a qual está - adaptada ao crescimento em cultura em suspensão, - adaptada ao crescimento em meio sem soro, - sem micoplasma, e - sem vírus opcional, b) fornecer um ácido nucléico compreendendo - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada de uma imunoglobulina heteróloga, e/ou uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve de uma imu-noglobulina heteróloga, pelo que um primeiro vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, o qual compreende o dito primeiro, bem como o segundo e/ou o terceiro ácido nucléico, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um primeiro agente de seleção eucariótico, e pelo que um segundo vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, o qual compreende o primeiro, bem como o segundo e/ou o terceiro ácido nucléico idêntico àquele/àqueles no dito ácido nucléico fornecido contido no primeiro vetor de transfecção, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um segundo agente de seleção eucariótico, que é diferente do quarto ácido nucléico no dito primeiro vetor de transfecção, pelo que o dito segundo agente de seleção eucariótico é diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico, c) transfectar a dita célula CHO, em que a dita transfecção compreen- de as etapas a seguir, na seguinte ordem: (i) transfectar a dita célula CHO com o dito primeiro vetor de transfecção, (ii) selecionar uma célula CHO transfectada em (i) por cres-cimento selecionado em um meio de cultivo contendo um primeiro agente de seleção eucariótico ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, (iii) transfectar a dita célula CHO selecionada em (ii) com o dito segundo vetor de transfecção, (iv) selecionar uma célula CHO transfectada em (iii) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, ao qual o dito primeiro vetor de transfecção confere resistência, e o dito segundo agente de seleção eucariótico, ao qual o segundo vetor de transfecção confere resistência.

Descrição Detalhada da Invenção

[0018] Os métodos e as práticas conhecidos para uma pessoa versada na técnica, que são úteis para realizar a presente invenção, são descritos, por exemplo, em Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I a III (1997), Wiley and Sons; Sambro- ok, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

[0019] Os métodos cromatográficos gerais e o seu uso são conhecidos para uma pessoa versada na técnica. Ver, por exemplo, Chromatography, 5- edição, Part A: Fundamentals and Techniques, Heitmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, Nova York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdã, Paises Baixos, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., e Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, Nova York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., e outros (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; ou Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., e outros (eds), John Wiley & Sons, Inc., Nova York.

[0020] Para a purificação das imunoglobulinas heterólogas produzidas de modo recombinante emprega-se frequentemente uma combinação de diferentes etapas de cromatografia em coluna. Geralmente, uma cromatografia por afinidade com a Proteína A é seguida por uma ou duas etapas de separação adicionais. A etapa de purificação final é uma assim chamada "etapa de polimento" para a remoção de impurezas e contaminantes residuais como as imunoglobulinas agregadas, as HCP (proteínas das células hospedeiras) residuais, o DNA (ácido nucléico da célula hospedeira), os vírus, ou as endotoxinas. Para esta etapa de polimento utiliza-se frequentemente um material de troca aniônica em um modo de fluxo passante.

[0021] Métodos diferentes são bem estabelecidos e amplamente usados para a recuperação e a purificação de proteínas, tais como a cromatografia por afinidade com proteínas microbianas (por exemplo, a cromatografia por afinidade com a proteína A ou a proteína G), a cromatografia por troca iônica (por exemplo, troca catiõnica (resinas de carboximetila), troca aniônica (resinas de amino etila) e troca de modo misto), a adsorção tiofílica (por exemplo, com o beta-mercaptoetanol e outros ligantes de SH), a cromatografia por interação hidrofóbica ou adsorção aromática (por exemplo, com fenil-sefarose, resinas aza- arenofílicas, ou ácido m-aminofenilborônico), a cromatografia por afinidade com quelato de metal (por exemplo, com material de afinidade por Ni(ll) e Cu(ll), a cromatografia por exclusão de tamanho, e os métodos eletroforéticos (tais como eletroforese em gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

[0022] O termo "aminoácido", conforme usado neste pedido, significa o grupo de carbóxi oc-aminoácidos que, diretamente ou na forma de um precursor, podem ser codificados por um ácido nucléico. Os aminoácidos individuais são codificados por ácidos nucléicos consistindo em três nucleotídeos, assim chamados códons ou trincas de bases. Cada aminoácido é codificado por pelo menos um códon. A codificação do mesmo aminoácido por diferentes códons é conhecida como "degeneração do código genético". O termo "aminoácido", conforme usado neste pedido, significa os carbóxi oc-aminoácidos de ocorrência natural e está compreendendo a alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), a arginina (arg, R), a asparagina (asn, N), o ácido aspártico (asp, D), a cisteína (cys, C), a glutamina (gin, Q), o ácido glutâmico (glu, E), a glicina (gly, G), a histidina (his, H), a isoleu- cina (ile, I), a leucina (leu, L), a lisina (lys, K), a metionina (met, M), a fenilalanina (phe, F), a prolina (pro, P), a serina (ser, S), a treonina (thr, T), o triptofano (trp, W), a tirosina (tyr, Y), e a valina (vai, V).

[0023] Um "ácido nucléico" ou uma "sequência de ácidos nuclei- cos", termos estes que são usados de modo intercambiável neste pedido, refere-se a uma molécula polimérica consistindo nos nucleotídeos individuais (também chamados bases) a, c, g, e t (ou u no RNA), por exemplo, ao DNA, ao RNA, ou às suas modificações. Esta molécula de polinucleotídeos pode ser uma molécula de polinucleotídeos de ocorrência natural ou uma molécula de polinucleotídeos sintética ou uma combinação de uma ou mais moléculas de polinucleotídeos de ocorrência natural com uma ou mais moléculas de polinucleotídeos sintéticas. Estão também incluídas por esta definição as moléculas de polinucleotídeos de ocorrência natural, nas quais um ou mais nucleotídeos são trocados (por exemplo, por mutagênese), removidos, ou adicionados. Um ácido nucléico pode estar isolado, ou integrado em um outro ácido nucléico, por exemplo, em um cassete de expressão, um plasmídeo, ou no cromossomo de uma célula hospedeira. Um ácido nucléico é caracterizado por sua sequência de ácidos nucléicos con-sistindo em nucleotídeos individuais.

[0024] Para uma pessoa versada na técnica, são bastante conhecidos os procedimentos e os métodos para converter uma sequência de aminoácidos, por exemplo, de um polipeptídeo, em uma sequência de ácidos nucléicos correspondente codificando esta sequência de aminoácidos. Portanto, um ácido nucléico é caracterizado por sua sequência de ácidos nucléicos consistindo em nucleotídeos individuais e também pela sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado por ela.

[0025] Um "polipeptídeo" é um polímero consistindo em aminoácidos unidos por ligações peptídicas, quer seja produzido naturalmente, quer seja sinteticamente. Os polipeptídeos de menos do que cerca de 20 resíduos de aminoácidos podem ser referidos como "peptídeos", ao passo que as moléculas consistindo em dois ou mais polipeptídeos ou compreendendo um polipeptídeo de mais do que 100 resíduos de aminoácidos podem ser referidas como "proteínas". Um polipeptídeo pode também compreender componentes que não sejam aminoácidos, tais como grupos carboidrato, íons de metais ou ésteres de ácidos carboxílicos. Os componentes que não são aminoácidos podem ser adicionados pela célula, na qual o polipeptídeo é expresso, e podem variar com o tipo de célula. Os polipeptídeos são definidos neste documento em termos de sua estrutura de cadeia principal de aminoácidos ou do ácido nucléico codificando os mesmos. As adições, tais como os grupos carboidrato, geralmente não são especificadas, porém podem estar presentes, apesar disso.

[0026] O termo "imunoglobulina" inclui as diversas formas de estruturas de imunoglobulinas, incluindo as imunoglobulinas completas e os conjugados de imunoglobulinas. A imunoglobulina empregada na presente invenção é preferivelmente um anticorpo humano, ou um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico, ou um anticorpo com antígenos de células T reduzidos (ver, por exemplo, o WO 98/33523, o WO 98/52976, e o WO 00/34317). A engenharia genética dos anticorpos é, por exemplo, descrita em Morrison, S.L., e outros, Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5.202.238 e US 5.204.244; Riechmann, L, e outros, Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., e outros, Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. As imunoglobulinas podem existir em uma variedade de formatos, incluindo, por exemplo, o Fv, o Fab, e o F(ab)2, bem como as cadeias individuais (scFv) ou os diacorpos (por exemplo, Huston, J.S., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988) 5879- 5883; Bird, R.E., e outros, Science 242 (1988) 423-426; em geral, Hood e outros, Immunology, Benjamin N.Y., 2^ edição (1984); e Hunkapil- ler, T. e Hood, L, Nature 323 (1986) 15-16).

[0027] O termo "imunoglobulina completa" significa uma imunoglobulina que compreende duas assim chamadas cadeias curtas e duas assim chamadas cadeias longas. Cada uma das cadeias longa e curta de uma imunoglobulina completa contém um domínio variável (região variável) (geralmente a parte amino terminal da cadeia de polipeptí- deos) compreendendo regiões de ligação que são capazes de interagir com um antígeno. Cada uma das cadeias longa e curta de uma imunoglobulina completa compreende uma região constante (geralmente a porção carboxila terminal). A região constante da cadeia pesada medeia a ligação do anticorpo i) às células contendo um receptor de Fc gama (FcyR), tais como as células fagocíticas, ou ii) às células contendo o receptor de Fc neonatal (FcRn), também conhecido como receptor de Brambell. Ela também medeia a ligação a alguns fatores, incluindo os fatores do sistema de complemento clássico, tal como o componente (C1q). O domínio variável da cadeia leve ou longa de uma imunoglobulina, por sua vez, compreende diferentes segmentos, isto é, quatro regiões de armação (FR) e três regiões hipervariáveis (CDR).

[0028] O termo "conjugado de imunoglobulina" significa um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio de uma cadeia pesada ou curta de uma imunoglobulina conjugado, via uma ligação pep- tídica, a um polipeptídeo adicional. O polipeptídeo adicional é um peptídeo que não é a imunoglobulina, tal como um hormônio, ou receptor do crescimento, ou peptídeo antifusogênico, ou fator de complemento, ou similar. Os conjugados de imunoglobulinas ilustrativos são descritos na WO 2007/045463.

[0029] O termo "imunoglobulina heteróloga" significa uma imunoglobulina que não é produzida naturalmente por uma célula mamífera ou pela célula hospedeira. A imunoglobulina produzida de acordo com o método da invenção é produzida por meios recombinantes. Tais métodos são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem a expressão da proteína em células eucarióticas, com a recuperação e o isolamento subsequentes da imunoglobulina heteróloga, e normalmente a purificação até uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a produção, isto é, a expressão, de uma imunoglobulina, um ácido nucléico codificando a cadeia leve e um ácido nucléico codificando a cadeia pesada são inseridos, cada um, em um cassete de expressão por métodos-padrão. Os ácidos nucléicos codificando as cadeias curta e longa da imunoglobulina são prontamente isolados e se- quenciados usando procedimentos convencionais. As células de hibri- domas podem servir como uma fonte de tais ácidos nucléicos. Os cassetes de expressão podem ser inseridos em (um) plasmídeo(s) de ex-pressão, que é(são) então transferido(s) para as células hospedeiras, as quais normalmente não produzem imunoglobulinas. A expressão é efetuada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas e a imunoglobulina é recuperada das células após a lise ou do sobrenadante da cultura.

[0030] Um "polipeptídeo isolado" é um polipeptídeo que está essencialmente livre de componentes celulares contaminantes, tais como o carboidrato, o lipídio, ou outras impurezas proteináceas associadas ao polipeptídeo na natureza. Tipicamente, uma preparação de polipeptídeo isolado contém o polipeptídeo em uma forma altamente purificada, isto é, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, mais do que 95% puro, ou mais do que 99% puro. Um modo de mostrar que uma preparação de proteína particular contém um polipeptídeo isolado é pelo surgimento de uma única banda após a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS) da preparação de proteína e a coloração com Azul Brilhante de Coomassie do gel. Entretanto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipeptídeo em formas físicas alternativas, tais como os dímeros ou as formas alternativamente gli- cosiladas ou derivadas.

[0031] O "DNA heterólogo" ou o "polipeptídeo heterólogo" refere- se a uma molécula de DNA ou um polipeptídeo, ou uma população de moléculas de DNA ou uma população de polipeptídeos, que não existe naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. As moléculas de DNA heterólogas a uma célula hospedeira particular podem conter DNA derivado da espécie da célula hospedeira (isto é, DNA endógeno), desde que o DNA do hospedeiro seja combinado com um DNA que não é do hospedeiro (isto é, DNA exógeno). Por exemplo, uma molécula de DNA que contém um segmento de DNA que não é do hospedeiro, codificando um polipeptídeo operavelmente ligado a um segmento de DNA do hospedeiro que compreende um promotor, é considerada ser uma molécula de DNA heteróloga. Inversamente, uma molécula de DNA heteróloga pode compreender um gene estrutural endógeno operavelmente ligado a um promotor exógeno.

[0032] Um peptídeo ou polipeptídeo codificado por uma molécula de DNA que não é do hospedeiro é um peptídeo ou polipeptídeo "hete- rólogo".

[0033] O termo "célula" ou "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual um ácido nucléico, por exemplo, codificando um polipeptídeo heterólogo, pode ser, ou é, transfectado. O termo "célula" inclui tanto as células procarióticas, que são usadas para a propagação dos plasmídeos, quanto as células eucarióticas, que são usadas para a expressão de um ácido nucléico e a produção do polipeptídeo codificado. Em uma modalidade, as células eucarióticas são células mamíferas. Em uma outra modalidade, a célula mamífera é uma célula CHO, preferivelmente uma célula CHO K1 (ATCC CCL-61 ou DSM ACC 110), ou uma célula CHO DG44 (também conhecida como CHO- DHFR[-], DSM ACC 126), ou uma célula CHO XL99, uma célula CHO- T (ver, por exemplo, Morgan, D., e outros, Biochemistry 26 (1987) 2959-2963), ou uma célula CHO-S, ou uma célula Super-CHO (Pak, S. C. O., e outros Cytotechnology. 22 (1996) 139-146). Se estas células não estiverem adaptadas ao crescimento em meio sem soro ou em suspensão, uma adaptação antes do uso no método atual é para ser feita. Conforme usada neste documento, a expressão "célula" inclui a presente célula e a sua progénie. Assim, as palavras "transformante" e "célula transformada" incluem a presente célula primária e as culturas derivadas dela, sem consideração pelo número de transferências ou subcultivos. Entende-se também que todas as progénies podem não ser precisamente idênticas no teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou involuntárias. Está incluída a progénie variante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme examinada na célula originalmente transformada.

[0034] O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-se aos processos de transcrição e/ou tradução que ocorrem dentro de uma célula. O nível de transcrição de uma sequência de ácidos nucléicos de interesse em uma célula pode ser determinado de acordo com a quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula. Por exemplo, o mRNA transcrito de uma sequência de interesse pode ser quantificado por RT-PCR ou por hibridização Northern (ver Sambrook, e outros, 1989, supra). Os polipeptídeos codificados por um ácido nucléico de interesse podem ser quantificados por diversos métodos, por exemplo, por ELISA, por ensaio quanto à atividade biológica do polipeptídeo, ou por emprego de ensaios que sejam independentes de tal atividade, tais como o Western blotting ou o ra- dioimunoensaio, usando imunoglobulinas que reconhecem e se ligam ao polipeptídeo (ver Sambrook, e outros, 1989, supra).

[0035] Um "cassete de expressão" refere-se a uma construção que contém os elementos reguladores necessários, tais como o promotor e o sítio de poliadenilação, para a expressão de pelo menos o ácido nucléico contido em uma célula.

[0036] Um "vetor de transfecção" é um ácido nucléico (também designado como molécula de ácido nucléico) que proporciona todos os elementos requeridos para a expressão dos ácidos nucléicos codifica- dores/gene(s) estrutural(is) compreendidos no vetor de transfecção em uma célula hospedeira. Um vetor de transfecção compreende uma unidade de propagação de plasmídeo procariótica, por exemplo, para E. Coli, por sua vez compreendendo uma origem de replicação procariótica, e um ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, o vetor de transfecção adicionalmente compreende um ou mais ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção eucariótico, e um ou mais ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo de interesse. Os ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção e o(s) ácido(s) nucleico(s) codificando um polipeptídeo de interesse preferivelmente são colocados, cada um, dentro de um cassete de expressão, pelo que cada cassete de expressão compreende um promotor, um ácido nucléico codificador, e um termi- nador de transcrição incluindo um sinal de poliadenilação. A expressão gênica é normalmente colocada sob o controle de um promotor, e tal gene estrutural é dito estar "operavelmente ligado ao" promotor. Similarmente, um elemento regulador e um promotor de núcleo estão operavelmente ligados se o elemento regulador modular a atividade do promotor de núcleo.

[0037] Um promotor refere-se a uma sequência de polinucleotídeos que controla a transcrição de um gene/gene estrutural ou uma sequência de ácidos nucléicos à qual ele esteja operavelmente ligado. Um promotor inclui sinais para a ligação da RNA polimerase e a iniciação da transcrição. O(s) promotor(es) usado(s) será(ão) funcional(is) no tipo de célula da célula hospedeira na qual a expressão da sequência selecionada for contemplada. Um grande número de promotores, incluindo os promotores constitutivos, induzíveis e reprimíveis a partir de uma variedade de diferentes fontes, é bastante conhecido na técnica (e identificado em banco de dados, tais como o GenBank) e está disponível como, ou dentro de, polinucleotídeos clonados (a partir de, por exemplo, depósitos, tais como ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais). Um "promotor" compreende uma sequência de nucleotídeos que orienta a transcrição de um gene estrutural operavelmente ligado. Tipicamente, um promotor está localizado na região não-codificadora ou não-traduzida em 5' de um gene, proximal ao sítio de iniciação transcricional de um gene estrutural. Os elementos da sequência dentro dos promotores que atuam na iniciação da transcrição são frequentemente caracterizados por sequências de nucleotídeos de consenso. Estes elementos dos promotores incluem os sítios de ligação da RNA polimerase, as sequências TATA, as sequências CAAT, os elementos específicos para diferenciação (DSEs; McGehee, R.E., e outros, Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560), os elementos de resposta do AMP cíclico (CREs), os elementos de resposta do soro (SREs; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58), os elementos de resposta de glicocorticoides (GREs), e os sítios de ligação para outros fatores de transcrição, tais como CRE/ATF (O'Reilly, M.A., e outros, J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943), AP2 (Ye, J., e outros, J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728-25734), SP1, a proteína de ligação ao elemento de resposta do cAMP (CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264) e fatores de octâmeros (ver, em geral, Watson e outros, eds., Molecular Biology of the Gene, 4- ed. (The Benja- min/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), e Lemaigre, F.P. e Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14). Entre os promotores eucarióticos que foram identificados como promotores fortes para a expressão de alto nível estão o promotor inicial de SV40, o promotor tardio principal de adenovirus, o promotor de metalotioneína 1 de camundongo, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous, o fator de alongamento 1 alfa do hamster chinês (CHEF-1, ver, por exemplo, a US 5.888.809), o EF-1 alfa humano, a ubiquitina, e o pro-motor inicial imediato de citomegalovírus humano (CMV IE).

[0038] O "promotor" pode ser constitutivo ou induzível. Um intensi- ficador (isto é, um elemento de DNA de atuação em cis que atua sobre um promotor para aumentar a transcrição) pode ser necessário para atuar em conjunção com um promotor sozinho, e pode ser incluído como um elemento regulador transcricional. Frequentemente, o segmento de polinucleotídeo contendo o promotor incluirá os intensifica- dores também (por exemplo, CMV ou SV40).

[0039] Um "intensificador", conforme usado neste documento, re- fere-se a uma sequência de polinucleotídeos que intensifica a transcri- ção de um gene ou sequência codificadora à qual ele está operavel- mente ligado. Ao contrário dos promotores, os intensificadores são relativamente independentes da orientação e da posição e foram encontrados 5' ou 3' (Lusky, M., e outros, Mol. Cell Bio., 3 (1983) 1108-1122) à unidade de transcrição, dentro de um intron (Banerji, J., e outros, Cell, 33 (1983) 729-740), bem como dentro da sequência codificadora propriamente dita (Osborne, T.F., e outros, Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305). Portanto, os intensificadores podem ser colocados a montante ou a jusante do sítio de iniciação da transcrição ou em distâncias consideráveis do promotor, embora, na prática, os intensificadores possam sobrepor-se física e funcionalmente com os promotores. Um grande número de intensificadores, a partir de uma variedade de diferentes fontes, é bastante conhecido na técnica (e identificado em bancos de dados, tais como o Genbank) e está disponível como, ou dentro de, sequências de polinucleotídeos clonadas (a partir de, por exemplo, depósitos tais como o ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais). Diversos polinucleotídeos compreendendo as sequências promotoras (tais como o promotor de CMV comumente usado) também compreendem os intensificadores. Por exemplo, todos os promo-tores fortes listados acima podem também conter intensificadores fortes (ver, por exemplo, Bendig, M., M., Genetic Engineering 7 (Academic Press, 1988) 91-127).

[0040] Um "ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção" é um ácido nucléico que permite que as células que o carregam sejam especificamente selecionadas ou eliminadas, na presença de um agente de seleção. Tal ácido nucléico é também designado como marcador de seleção. Tipicamente, um marcador de seleção conferirá resistência a um agente de seleção (fármaco) ou reduzirá um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeira. Um marcador de seleção pode ser positivo, negativo, ou bifuncional. Um marcador de seleção positivo útil é um gene de resistência ao antibiótico. Este marcador de seleção permite que as células transformadas com ele sejam positivamente selecionadas na presença do agente de seleção correspondente, isto é, sob o crescimento selecionado na presença, por exemplo, do antibiótico correspondente. Uma célula não transformada não é capaz de crescer ou sobreviver sob as condições de crescimento seletivas, isto é, na presença do agente de seleção, na cultura. Os marcadores de seleção positivos permitem a seleção das células que carregam o marcador, enquanto os marcadores de seleção negativos permitem que as células que carregam o marcador sejam seletivamente eliminadas. Os marcadores de seleção eucarióticos incluem, por exemplo, os genes para a aminoglicosídeo fosfotransferase (APH) (conferindo resistência aos agentes de seleção, tais como, por exemplo, a higromicina (hyg), a neomicina (neomicina fosfotransferase II, neo), e G418), a di-hidrofolato redutase (DHFR) (conferindo resistência ao agente de seleção metotrexato), a timidina quinase (tk), a glutamina sintetase (GS), a asparagina sintetase, a triptofano sintetase (conferindo resistência ao agente de seleção indol), a histidinol desi- drogenase (conferindo resistência ao agente de seleção histidinol D), a citidina desaminase, a adenosina desaminase e os ácidos nucléicos conferindo resistência à puromicina, bleomicina, fleomicina, cloranfeni- col, Zeocina, e ácido micofenólico. Os ácidos nucléicos marcadores de seleção adicionais são descritos, por exemplo, em WO 92/08796 e WO 94/28143. Os marcadores de seleção procarióticos incluem, por exemplo, o gene de beta-lactamase (conferindo resistência ao agente de seleção ampicilina).

[0041] A expressão de um gene é efetuada como expressão transiente ou como permanente. O(s) polipeptídeo(s) de interesse é(são), em geral, polipeptídeos secretados e, portanto, contém(êm) uma extensão N-terminal (também conhecida como a sequência sinal), que é necessária para o transporte/secreção do polipeptídeo através da parede celular para o meio extracelular. Em geral, a sequência sinal pode ser derivada de qualquer gene codificando um polipeptídeo secretado. Se uma sequência sinal heteróloga for usada, ela preferivelmente é uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para a secreção em levedura, por exemplo, a sequência sinal nativa de um gene heterólogo a ser expresso pode ser substituída por uma sequência sinal de levedura homóloga, derivada de um gene secretado, tal como a sequência sinal de invertase de levedura, a líder de fator alfa (incluindo as líderes de fator oc de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, e Hansenula, a segunda descrita na US 5.010.182), a sequência sinal de fosfatase ácida, ou a sequência sinal de glicoamilase de C. albicans (EP 0 362 179). Na expressão em células mamíferas, a sequência sinal nativa da proteína de interesse é satisfatória, embora outras sequências de sinais de mamíferos possam ser adequadas, tais como as sequências de sinais a partir de polipeptídeos secretados de espécies iguais ou relacionadas, por exemplo, para imunoglobulinas de origem humana ou de murino, bem como sequências de sinais secretórias virais, por exemplo, a sequência sinal da glicoproteína D de herpes simples. O fragmento de DNA codificando para tal pré-segmento é ligado em estrutura, isto é, operavelmente ligado, ao fragmento de DNA codificando um polipeptídeo de interesse.

[0042] O primeiro aspecto da presente invenção é um método para a produção recombinante de uma imunoglobulina heteróloga secretada em uma célula CHO, o qual compreende: a) fornecer uma célula CHO, a qual está adaptada ao cres-cimento em cultura em suspensão, adaptada ao crescimento em meio sem soro, e sem micoplasma; b) fornecer um vetor de transfecção, o qual compreende os seguintes elementos: - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga e uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve da dita imunoglobulina heteróloga, - uma quarta sequência de ácidos nucléicos conferindo re-sistência a um agente de seleção eucariótico, pelo que cada uma das ditas primeira a quarta sequências de ácidos nucléicos está contida em um cassete de expressão, c) transfectar e selecionar a dita célula CHO, em que as ditas transfecção e seleção compreendem as etapas a seguir, na seguinte ordem: (i) transfectar a dita célula CHO com o vetor de transfecção compreendendo os ditos primeiro a terceiro ácidos nucléicos e uma quarta sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um primeiro agente de seleção eucariótico, (ii) selecionar uma célula CHO transfectada em (i) por cres-cimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, (iii) transfectar a dita célula CHO selecionada em (ii) com um vetor de transfecção compreendendo os ditos primeiro a terceiro ácidos nucléicos e uma quarta sequência de ácidos nucléicos, diferente daquela no vetor de transfecção usado em (i), conferindo resistência a um segundo agente de seleção eucariótico diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico, (iv) selecionar uma célula CHO transfectada em (iii) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito pri- meiro e o dito segundo agente de seleção eucariótico, d) cultivar a dita célula CHO transfectada e selecionada da etapa c) em um meio de cultivo contendo os ditos primeiro e segundo agentes de seleção eucarióticos, sob condições adequadas para a ex-pressão dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos, e) recuperar a dita imunoglobulina heteróloga secretada do meio de cultivo e, com isso, produzir de modo recombinante uma imu-noglobulina heteróloga.

[0043] O método de acordo com a invenção é adequado para a produção de uma imunoglobulina heteróloga secretada em grande escala, isto é, industrialmente. O cultivo de uma célula para a produção de um polipeptídeo desejado em grande escala geralmente consiste em uma sequência de cultivos individuais, em que todos os cultivos, exceto o cultivo final, isto é, em grande escala, isto é, o último na sequência, são efetuados até atingir-se certa densidade de célula no vaso de cultura. Se for atingida a densidade de célula predeterminada, o cultivo inteiro, ou uma fração dele, é usado para inocular o vaso de cultivo seguinte, o qual tem um volume maior, até 1000 vezes o volume do cultivo precedente. Todos os cultivos que servem como uma base para pelo menos um cultivo adicional em um volume maior são designados como fermentações com direcionamento das sementes. Somente no cultivo em grande escala, isto é, no cultivo que não for pretendido servir como a base para um cultivo adicional em um volume maior, que é também designado como fermentação principal, o ponto final do cultivo é determinado dependendo da concentração da imunoglobulina heteróloga secretada produzida no meio de cultivo. O termo "grande escala", conforme usado neste pedido, significa o cultivo final de um processo de produção industrial. De preferência, um cultivo em grande escala é efetuado em um volume de pelo menos 100 I, mais preferivelmente de pelo menos 500 I, mais preferivelmente ainda de pelo menos 1000 I até um volume de 20.000 I. Em uma modalidade, o meio de cultivo final, isto é, em grande escala, não contém um agente de seleção eucariótico.

[0044] Em uma modalidade, o cultivo da dita célula CHO transfectada é efetuado na presença do dito agente de seleção eucariótico em um volume de menos do que 500 litros e o cultivo da dita célula CHO transfectada é efetuado na ausência dos ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de 500 litros ou mais e que a dita recuperação da dita imunoglobulina heteróloga secretada é a partir do meio de cultivo sem os ditos agentes de seleção eucarióticos. Em uma modalidade adicional, o cultivo está compreendendo os cultivos sequenciais com volume de cultivo crescente até um volume de cultivo final, pelo que os cultivos são efetuados na presença dos ditos agentes de seleção eucarióticos até um volume de cultivo de 1% (v/v) do volume de cultivo do cultivo final ou principal e na ausência de todos os ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de cultivo de mais do que 1% (v/v) do volume de cultivo do cultivo final. Em uma modalidade adicional, o dito cultivo está compreendendo os cultivos com direcionamento das sementes sequenciais com volume de cultivo crescente, pelo que cada um dos cultivos com direcionamento das sementes é efetuado na presença dos ditos agentes de seleção eucarióticos e a fermentação principal é efetuada na ausência de todos os ditos agentes de seleção eucarióticos. Em uma modalidade, o cultivo da dita célula CHO transfectada é efetuado na presença do dito agente de seleção eucariótico nas fermentações com direcionamento das sementes e o cultivo da dita célula CHO transfectada é efetuado na ausência dos ditos agentes de seleção eucarióticos na fermentação principal e que a dita recuperação da dita imunoglobulina heteróloga secretada é a partir do meio de cultivo principal não contendo os ditos agentes de seleção eucarióticos. Nestas modalidades, os agentes de seleção eucarió- ticos são adicionados durante a fase de crescimento e omitidos durante a fase de produção da dita célula CHO. O termo "fase de produção" significa o cultivo de uma célula CHO em um grande volume, isto é, a fermentação principal, após o que a imunoglobulina heteróloga produzida é recuperada.

[0045] Em uma outra modalidade do método de acordo com a invenção, a produtividade da célula CHO é sobre 40 gerações, não menos do que 70% e não mais do que 130% da produtividade após 10 gerações de cultivo como cultivo em batelada separada. Em uma modalidade, a produtividade das ditas células CHO é, sobre 60 gerações, não menos do que 50% e não mais do que 150% da produtividade após 10 gerações de cultivo como cultivo em batelada separada. A produtividade da dita célula CHO é pelo menos 1,5 g/l da dita imunoglobulina heteróloga dentro de 21 dias como cultivo em batelada alimentada, em uma outra modalidade. Em uma modalidade, a produtividade específica da célula CHO obtida com o método de acordo com a invenção é mais do que 1 p.g/106 células/d, mais do que 5 pig/106 células/d, ou mais do que 10 p.g/106 células/d. Em uma modalidade, a imunoglobulina heteróloga secretada é uma imunoglobulina heteróloga secretada completamente processada. O termo "imunoglobulina heteróloga secretada completamente processada" significa uma imunoglobulina i) que é secretada para o meio de cultivo e cujas sequências de sinais foram clivadas, ii) que compreende uma região de ligação ao antígeno, iii) que tem modificações secundárias, tais como sacarídeos ou polissacarídeos unidos, e/ou ligações de dissulfeto corretamente formadas.

[0046] Em uma modalidade da invenção, a imunoglobulina heteróloga é um anticorpo anti-Aβ. Em uma outra modalidade, o domínio variável da cadeia pesada do dito anticorpo anti-Aβ compreende uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3. Em uma modalidade adicional, o domínio variável da cadeia leve do dito anticorpo anti-Aβ compreende uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 4, 5 ou 6. Em uma modalidade adicional, o dito anticorpo anti-Aβ compreende um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. Ainda em uma modalidade adicional, o dito anticorpo anti-Aβ compreende um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 10, 11 ou 12.

[0047] Em uma modalidade da invenção, a imunoglobulina heteróloga é um anticorpo antisselectina P. Em uma modalidade adicional, o dito anticorpo antisselectina P compreende um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 13, 14, ou 15. Ainda em uma modalidade adicional, o dito anticorpo antisselectina P compreende um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 16, 17 ou 18.

[0048] Em uma modalidade da invenção, a imunoglobulina heteróloga é um anticorpo anti-IL-13Roc. Em uma modalidade adicional, o dito anticorpo anti-IL-13Roc compreende um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22 ou 23. Ainda em uma modalidade adicional, o dito anticorpo anti-IL-13Roc compreende um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27 ou 28.

[0049] Em uma modalidade da invenção, a imunoglobulina heteróloga é um conjugado de anticorpo anti-CD4. Em uma outra modalidade, o domínio variável da cadeia pesada do dito anticorpo anti-CD4 no dito conjugado compreende uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 29, 30 ou 31. Em uma modalidade adicional, o domínio variável da cadeia leve do dito anticorpo anti-CD4 no dito conjugado compreende uma CDR3 com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 32, 33 ou 34. Em uma modalidade adicional, o dito anticorpo anti-CD4 no dito conjugado compreende um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 35, 36 ou 37. Ainda em uma modalidade adicional, o dito anticorpo anti-CD4 no dito conjugado compreende um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 38, 39 ou 40.

[0050] Uma célula mamífera utilizável para a produção em grande escala de terapêuticos, isto é, polipeptídeos pretendidos para o uso em seres humanos, tem de satisfazer critérios distintos. Entre outros estão estes que ela tem de ser cultivável em meio sem soro, preferivelmente em meio sem componentes derivados de mamíferos não definidos, ou em meio sem soro suplementado com componentes derivados de mamíferos definidos. O soro é uma mistura de multiplicidade de compostos. Normalmente o soro bovino tem sido usado para o cultivo de células mamíferas. Com o problema que surge de doenças transmissíveis de uma espécie para outra, o uso de soro e outros compostos derivados de mamíferos não definidos tem de ser evitado. O termo "composto derivado de mamífero não definido", conforme usado neste pedido, significa os compostos que são derivados de um mamífero, especialmente preferidos de uma vaca, um porco, uma ovelha, ou um cordeiro, e cuja composição pode ser especificada para menos do que 80%, preferivelmente para menos do que 90% (p/p). Um "composto derivado de mamífero definido" é um composto que é obtido de um mamífero, especialmente preferido de uma vaca, um porco, uma ovelha, ou um cordeiro, e cuja composição pode ser espe- cificada para mais do que 95% (p/p), preferivelmente para mais do que 98% (p/p), mais preferivelmente para mais do que 99% (p/p). Um exemplo de um composto derivado de mamífero definido é o colesterol da lã ovina, e a galactose de leite bovino. Em uma modalidade, o meio pode ser suplementado com compostos derivados de não-mamíferos definidos ou não definidos. Um exemplo de tal composto derivado de não-mamífero é o óleo de fígado de bacalhau.

[0051] Portanto, em uma modalidade da presente invenção, o meio usado no cultivo é um meio sem soro, ou um meio sem soro suplementado com componentes derivados de mamíferos definidos, ou um meio sem componentes derivados de mamíferos, ou um meio sem proteína, um meio sem proteína suplementado com componentes derivados de mamíferos definidos, ou um meio quimicamente definido, ou um meio sem componentes derivados de mamíferos, ou um meio sem proteína definida. Os exemplos de um meio sem componentes derivados de mamíferos são o meio CD CHO da Invitrogen Corp., ou o ProCHO4 disponível da Gibco. Um exemplo de um meio sem proteína é o HyQ SFM4CHO disponível da Hyclone.

[0052] Em uma outra modalidade do método de acordo com a invenção, está o método começando com a primeira transfecção e terminando com a recuperação da imunoglobulina heteróloga secretada, efetuada no mesmo meio. O termo "no mesmo meio" significa, no presente pedido, que começando com a primeira transfecção e terminando com a recuperação da imunoglobulina heteróloga secretada a partir do meio de cultivo, o mesmo meio é usado. Isto não significa que os mesmos aditivos têm de ser adicionados ao meio em todas as etapas, isto é, o meio pode ser suplementado com aditivo diferente em etapas diferentes do método. Os aditivos são compostos que são adicionados a um meio na totalidade até menos do que 20% (p/p), em uma modalidade até menos do que 15% (p/p), em uma outra modalidade até me- nos do que 10% (p/p). Em uma modalidade, o meio usado no método de acordo com a invenção é o mesmo meio em todas as etapas e é um meio adequado para a produção em grande escala da imunoglobulina heteróloga secretada.

[0053] Verificou-se surpreendentemente que com o método de acordo com a invenção pode ser obtida uma célula CHO transfectada múltipla que tem características similares de crescimento e uma produtividade aperfeiçoada em comparação com uma célula CHO transfectada uma vez. O termo "características similares de crescimento" significa que a célula CHO transfectada múltipla cresce até pelo menos 50% da densidade da célula, dentro do mesmo tempo, que a célula CHO transfectada uma vez. Em uma outra modalidade, a dita célula CHO transfectada múltipla cresce até pelo menos 90% da densidade de célula que a célula transfectada uma vez. Ainda em uma modalidade adicional, o tempo de duplicação da célula transfectada múltipla é no máximo 150% daquele da célula transfectada uma vez. Em uma modalidade, a dita célula CHO transfectada múltipla é uma célula CHO transfectada duas ou três vezes. Em uma outra modalidade, a célula transfectada múltipla tem um rendimento volumétrico aperfeiçoado em um meio de cultura. A produtividade global de um processo de fermentação em grande escala é mais bem determinada pelo rendimento volumétrico, isto é, a quantidade de polipeptídeo por volume de unidade do cultivo. Este rendimento volumétrico é o produto da densidade da célula, a produtividade específica de cada célula e o tempo de cultivo. Assim, um cultivo com baixa densidade de célula, porém alta produtividade específica, terá o mesmo rendimento volumétrico, no mesmo tempo, que um cultivo com alta densidade de célula, porém baixa produtividade específica, no mesmo tempo de cultivo. Assim, com a célula CHO transfectada múltipla e o método de acordo com a invenção, uma célula CHO é obtenível com características similares de crescimento, porém um rendimento volumétrico/produtividade aperfeiçoados, em comparação com as células CHO transfectadas uma vez.

[0054] A imunoglobulina heteróloga secretada pode ser recuperada do meio de cultivo com métodos cromatográficos conhecidos para uma pessoa de habilidade na técnica. Portanto, em uma modalidade, o método de acordo com a invenção compreende a etapa final de purificar a dita imunoglobulina heteróloga com uma ou mais etapas croma- tográficas.

[0055] Um vetor adequado para uso no método de acordo com a invenção compreende uma origem de replicação procariótica, e um primeiro ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, e/ou um segundo ácido nucléico codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, e/ou um terceiro ácido nuclei- co codificando a cadeia leve da dita imunoglobulina heteróloga, e um quarto ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção eucariótico.

[0056] O primeiro ácido nucléico compreendido confere resistência à adição de um agente de seleção procariótico ao meio de cultivo. Os agentes de seleção procarióticos ilustrativos são, por exemplo, a am- picilina, a canamicina, o cloranfenicol, a tetraciclina ou a eritromicina. O termo "um ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção", e os seus equivalentes gramaticais, significa no presente pedido que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucléico pode neutralizar o dito agente de seleção por modificação ou degradação ou pode agir contra o efeito do dito agente de seleção. Assim, uma célula compreendendo um ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção tem a capacidade de sobreviver e proliferar-se com o agente de seleção presente no meio de cultivo. Os agentes de seleção eucarióticos ilustrativos são, por exemplo, a neomicina, a higromicina, a pu- romicina, o metotrexato, a geneticin® (G418) ou o ácido micofenólico. O agente de seleção é escolhido com a condição que o agente de seleção procariótico e o eucariótico não sejam um metal.

[0057] A transfecção da célula CHO proporcionada, de acordo com o método em conformidade com a invenção, é efetuada como etapas sequenciais de transfecção e seleção. As células CHO adequadas no método de acordo com a invenção são, por exemplo, uma célula CHO K1, ou uma célula CHO DG44, ou uma célula CHO XL99, ou uma célula CHO DXB11, ou uma célula CHO DP12, ou uma célula super-CHO. Dentro do escopo da presente invenção, as células trans- fectadas podem ser obtidas com substancialmente qualquer tipo de método de transfecção conhecido na técnica. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser introduzido nas células por meio de eletroporação ou microinjeção. Alternativamente, podem ser usados reagentes de lipofecção, tais como FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha), X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha), Lipofec- tAmine (Invitrogen Corp., EUA), e nucleotransfection (AMAX Corp.). Ainda alternativamente, o ácido nucléico pode ser introduzido na célula por sistemas de vetores virais apropriados, baseados em retrovirus, lentivírus, adenovirus, ou vírus adeno-associados (Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 101 (2004) 5313-5314).

[0058] Após a transfecção, as células transfectadas positivas são selecionadas na presença de agentes de seleção, isto é, por crescimento selecionado. Verificou-se surpreendentemente que mais do que um agente de seleção eucariótico pode estar presente no meio de cultivo, não interferindo com o crescimento e a expressão do polipeptídeo heterólogo, se a célula CHO cultivada tiver sido transfectada com todos os ácidos nucléicos correspondentes requeridos que conferem resistência a estes agentes de seleção eucarióticos de acordo com a presente invenção. Verificou-se também que as células CHO podem ser cultivadas na presença concomitante de três agentes de seleção eucarióticos, sem uma redução do tempo de duplicação até mais do que 150% do tempo de duplicação da célula CHO não transfectada ou transfectada uma vez. Portanto, a célula CHO transfectada múltipla compreende ácidos nucléicos, os quais estão, em cada etapa de transfecção do método de acordo com a invenção, compreendendo um ácido nucléico diferente, não previamente transfectado, como o quarto ácido nucléico, o qual confere uma nova resistência, não já presente na dita célula CHO, a um agente de seleção eucariótico diferente. Portanto, após a segunda etapa de transfecção, uma célula transfectada com êxito é selecionada por cultivo na presença concomitante de dois agentes de seleção eucarióticos diferentes. Após a terceira transfecção, a célula transfectada pode ser cultivada para a seleção na presença concomitante de três agentes de seleção eucarióticos diferentes.

[0059] Desse modo, o vetor empregado nas diferentes etapas de transfecção de acordo com o método em conformidade com a invenção é pelo menos 95% idêntico no nível de ácido nucléico, exceto pelo ácido nucléico que confere resistência a um agente de seleção eucariótico, isto é, o quarto ácido nucléico.

[0060] Para a expressão de uma imunoglobulina heteróloga secretada, o vetor com o qual a célula CHO é transfectada e que compreende um ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção eucariótico também compreende um ácido nucléico codificando a cadeia leve da dita imunoglobulina heteróloga e/ou um ácido nucléico codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga. Se o vetor compreender somente um ácido nucléico codificando a cadeia leve da dita imunoglobulina ou a cadeia pesada da dita imunoglobulina, a dita célula CHO é também transfectada, em cada etapa, por um outro vetor compreendendo um ácido nucléico codificando a outra cadeia correspondente da dita imunoglobulina.

[0061] Em uma modalidade, a primeira até a quarta sequência de ácidos nucléicos compreendida nos vetores de transfecção de acordo com a invenção (isto é, o primeiro, o segundo e o terceiro vetores de transfecção) está contida em um cassete de expressão. Um "cassete de expressão" refere-se a uma construção que contém os elementos reguladores necessários, tais como o promotor e o sítio de poliadenila- ção, para a expressão de pelo menos o ácido nucléico contido em uma célula, por exemplo, um promotor, um ácido nucléico a ser expresso, e um terminador de transcrição incluindo um sinal de poliadenilação. O promotor contido no cassete de expressão determina a quantidade de transcrição do ácido nucléico operavelmente ligado e, com isso, ele determina a quantidade da tradução do dito ácido nucléico. Um primeiro promotor induzindo uma quantidade maior de tradução de um ácido nucléico comparado a um segundo promotor é chamado um "promotor mais forte" em relação ao dito segundo promotor. Pretende-se produzir a imunoglobulina heteróloga secretada e não o polipeptídeo que confere resistência a um agente de seleção. Assim, a capacidade do mecanismo de transcrição e tradução das células hospedeiras tem de ser separada correspondentemente. Portanto, em uma modalidade, o promotor empregado para a transcrição dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é diferente do promotor empregado para a transcrição do dito quarto ácido nucléico. Em uma outra modalidade, a quantidade de transcrito dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos codifi-cando as cadeias da dita imunoglobulina heteróloga é maior do que a quantidade de transcrito do dito quarto ácido nucléico conferindo resistência a um agente de seleção. Assim, o promotor empregado para a expressão dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é mais forte do que o promotor empregado para a expressão do dito quarto ácido nucléico. Em uma outra modalidade, o promotor empregado para a transcrição dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é o mesmo, porém é diferente do promotor do dito quarto ácido nucléico. Em uma modalidade, o promotor para a expressão dos ditos segundo e terceiro ácidos nucléicos é o promotor de CMV, ou uma variante dele, e o promotor para a expressão do dito quarto ácido nucléico é o promotor de SV40, ou uma variante dele.

[0062] Em uma modalidade adicional do método de acordo com a invenção, o uso de códon dos ditos segundo e terceiro ácidos nuclei- cos é otimizado para a expressão nas células CHO. Isto permite um uso mais eficiente dos RNAs transportadores, presentes na célula CHO recombinante. Em uma outra modalidade, os ditos segundo e/ou terceiro ácidos nucléicos compreendem uma sequência de ácidos nu- cleicos intrônica, em uma outra modalidade o ácido nucléico intrônico é um intron híbrido de camundongo/ser humano. No genoma de células eucarióticas, as sequências de DNA genômico contêm sequências de ácidos nucléicos codificadoras (exônicas) e não-codificadoras (in- trônicas). Após a transcrição do DNA para pré-mRNA, o pré-mRNA também contém estas sequências de ácidos nucléicos intrônicas e exônicas. Antes da tradução, as sequências de ácidos nucléicos intrônicas não-codificadoras são removidas durante o processamento do mRNA, removendo-as do transcrito de mRNA primário para gerar o mRNA maduro. A remoção do mRNA primário é controlada por um sítio de remoção doador em combinação com um sitio de remoção receptor adequadamente separado. O sítio de remoção doador está localizado na extremidade 5' e o sítio de remoção receptor está localizado na extremidade 3' de uma sequência intrônica e ambos são somente parcialmente removidos durante a remoção do pré-mRNA.

[0063] Para produzir um polipeptídeo secretado, o(s) ácido(s) nu- cleico(s) codificando as cadeias da imunoglobulina heteróloga in- clui(em) um segmento de DNA que codifica uma sequência si- nal/peptídeo líder. A sequência sinal orienta o polipeptídeo recente- mente sintetizado para a, e através da, membrana do retículo endo- plasmático (ER), em que o polipeptídeo pode ser encaminhado para a secreção. A sequência sinal é clivada por uma peptidase de sinal durante a travessia da membrana do ER. Com relação à função da sequência sinal, é essencial o reconhecimento pelo mecanismo de secreção da célula hospedeira. Portanto, a sequência sinal usada tem de ser reconhecida pelas proteínas da célula hospedeira e enzimas do mecanismo de secreção.

[0064] Em uma modalidade, o método de acordo com a invenção compreende uma terceira etapa de transfecção na etapa c): (v) transfectar a dita célula CHO selecionada em (iv) com o dito vetor compreendendo uma quarta sequência de ácidos nucléicos diferente daquela no vetor de transfecção usado em (i) e (iii) conferindo resistência a um terceiro agente de seleção eucariótico, que é diferente do dito primeiro e do dito segundo agentes de seleção eucarióticos, (vi) selecionar uma célula CHO transfectada em (v) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro e o dito segundo e o dito terceiro agentes de seleção eucarióticos.

[0065] Nesta modalidade, o meio de cultivo empregado para o cultivo da dita célula CHO transfectada na etapa d) adicionalmente compreende um terceiro agente de seleção eucariótico.

[0066] Um segundo aspecto da presente invenção é uma célula CHO expressando uma imunoglobulina heteróloga secretada, obtenível com o seguinte método: a) fornecer uma célula CHO, a qual está - adaptada ao crescimento em cultura em suspensão, - adaptada ao crescimento em meio sem soro, - sem micoplasma, b) fornecer um ácido nucléico compreendendo - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, e/ou uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve da dita imu-noglobulina heteróloga, pelo que um primeiro vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um primeiro agente de seleção eucariótico, pelo que um segundo vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional, diferente do quarto ácido nu- cleico no dito primeiro vetor de transfecção, conferindo resistência a um segundo agente de seleção eucariótico, pelo que o dito segundo agente de seleção eucariótico é diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico, c) transfectar e selecionar a dita célula CHO, em que as ditas transfecção e seleção compreendem as etapas a seguir, na seguinte ordem: (i) transfectar a dita célula CHO com o dito primeiro vetor de transfecção, (ii) selecionar uma célula CHO transfectada em (i) por cres-cimento selecionado em um meio de cultivo contendo um primeiro agente de seleção eucariótico ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, (iii) transfectar a dita célula CHO selecionada em (ii) com o dito segundo vetor de transfecção, (iv) selecionar uma célula CHO transfectada em (iii) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, e o dito segundo agente de seleção eucariótico, ao qual o segundo vetor de transfecção confere resistência,

[0067] O termo "sem vírus", que é usado neste pedido, significa que a célula CHO não contém nenhum ácido nucléico viral, o qual resultaria se expresso durante o cultivo em produtos não separáveis de operações de processamento a jusante, prejudiciais, para seres humanos.

[0068] Os exemplos e as figuras a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo escopo real é descrito nas reivindicações em anexo. Entende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados, sem sair do espírito da invenção.

Descrição das Figuras

[0069] Figura 1 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p5128.

[0070] Figura 2 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p5137.

[0071] Figura 3 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p5151.

[0072] Figura 4 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p5057.

[0073] Figura 5 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p5069.

[0074] Figura 6 (A) Títulos de anticorpos de clones obtidos após subclonagem com diluição limitada e de clones obtidos com o método de acordo com a invenção; eixo X: (1) G24, (2) diluição limitada, (3) método de acordo com a invenção; eixo Y: concentração de imunoglobulina [juig/mL], (8) Taxas de produções específicas de clones obtidos após subclona- gem com diluição limitada e de clones obtidos com o método de acordo com a invenção; eixo X: (1) G24, (2) diluição limitada, (3) método de acordo com a invenção; eixo Y: taxa de produção específica [pg/d*célula],

[0075] Figura 7 SDS-PAGE após purificação do anticorpo por HPLC com proteína A. Para as quatro amostras 35-45, 37-65, 39-4 e 43-16, duas bandas estão visíveis, a superior sendo a cadeia pesada, a inferior sendo a cadeia leve. A amostra 25g7 é um anticorpo de controle com produtos laterais relacionados ao anticorpo (acima da cadeia pesada e entre as cadeias longa e curta). Amostras: (1) Marcador de peso molecular, (2) 35-45, (3) 37-65, (4) 39-4, (5) 43-16, (6) 25g7, (7) Anticorpo de referência, (8) Meio 25x.

[0076] Figura 8 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p6311.

[0077] Figura 9 Mapa de plasmídeo com notas do plasmídeo p5321.

Exemplos Materiais e Métodos

[0078] As informações gerais em relação às sequências de nu- cleotídeos das cadeias curta e longa das imunoglobulinas humanas são dadas em: Kabat, E.A., e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Amino acids of antibody chains are numbered according to Ell numbering (Edelman, G.M., e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

Técnicas de DNA recombinante:

[0079] Foram usados métodos-padrão para manipular o DNA, conforme descrito em Sambrook, J., e outros, Molecular cloning: A labora- tory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante.

Síntese do gene:

[0080] Os segmentos de genes desejados foram preparados a partir de oligonucleotídeos feitos por síntese química. Os segmentos de genes de 100 - 600 pb de comprimento, os quais foram flanqueados por sítios de clivagem com endonuclease de restrição singulares, foram formados por anelamento e ligação dos oligonucleotídeos, incluindo a amplificação por PCR, e subsequentemente clonados no vetor de clonagem pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., EUA) via as saliências A ou o vetor de clonagem pPCR-Script Amp SK(+) (Stratagene Corp., EUA). A sequência de DNA dos fragmentos de genes subclo- nados foi confirmada por sequenciamento de DNA.

Determinação da proteína:

[0081] A concentração de proteína foi determinada determinando- se a densidade óptica (OD) a 280 nm, usando o coeficiente de extinção molar calculado de acordo com a sequência de aminoácidos.

Determinação do título de anticorpo:

[0082] Os títulos de anticorpo foram determinados por ELISA de Fc anti-humano ou por cromatografia com Proteína A usando o anticorpo purificado autólogo como uma referência.

SDS-PAGE

[0083] Tampão de amostra de LDS, concentrado em quatro vezes (4x): 4 g de glicerol, 0,682 g de TRIS-Base, 0,666 g de TRIS-cloridrato, 0,8 g de LDS (dodecil sulfato de lítio), 0,006 g de EDTA (ácido etileno- diaminotetra-acético), 0,75 ml de uma solução a 1% em peso (p/p) de Serva Blue G250 em água, 0,75 ml de uma solução a 1% em peso (p/p) de fenol vermelho, adicionar água para ter um volume total de 10 ml.

[0084] O caldo de cultura contendo o anticorpo secretado foi centrifugado para remover as células e os fragmentos de células. Uma alíquota do sobrenadante purificado foi misturada com 1/4 de volume (v/v) do tampão de amostra de 4xLDS e 1/10 de volume (v/v) de 1,4- ditiotreitol (DTT) a 0,5 M. Então, as amostras foram incubadas por 10 min a 70°C e a proteína separada por SDS-PAGE. O sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen Corp.) foi usado de acordo com a instrução do fabricante. Em particular, utilizaram-se os géis NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast a 10% (pH 6,4) e um tampão de corrida NuPAGE® MOPS.

Western blot

[0085] Tampão de transferência: glicina a 39 mM, TRIS-cloridrato a 48 mM, 0,04% em peso (p/p) de SDS, e 20% em volume de metanol (v/v).

[0086] Após a SDS-PAGE, as cadeias de anticorpos separadas foram transferidas de modo eletroforético para uma membrana de filtro de nitrocelulose (tamanho de poro: 0,45 juim), de acordo com o "Método de Transferência Semisseca" de Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).

Exemplo 1 Vetor de expressão para expressar um anticorpo anti-Aβ

[0087] Um anticorpo (preferivelmente monoclonal) de exemplo, para o qual pode ser obtida uma linhagem celular para a expressão de acordo com a presente invenção, é um anticorpo contra o peptídeo amiloide β-A4 (anticorpo anti-Aβ). Tal anticorpo e as sequências de ácidos nucléicos correspondentes são, por exemplo, descritos na WO 2003/070760 ou na US 2005/0169925 ou nas SEQ ID NO: 1 a 12.

[0088] A linhagem celular do ovário do hamster chinês (CHO) que expressa o anticorpo anti-Aβ foi gerada por três transfecções e corridas de seleção completas sucessivas.

[0089] O segmento de gene da região constante da cadeia leve K humana genômico (C-capa, CL) foi adicionado à região variável da cadeia leve do anticorpo anti-Aβ, enquanto que um segmento de gene da região constante da cadeia pesada y1 humana (CHi-Articulação-CH2- CHS) foi adicionado à região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-Aβ. Os genes dos anticorpos das cadeias curta K e longa y1 completos foram então unidos com um promotor de citomegalovírus humano (HCMV) na extremidade 5' e uma sequência sinal de poliadeni- lação de imunoglobulina humana na extremidade 3'.

a) Cassete de expressão da cadeia pesada

[0090] A unidade de transcrição da cadeia pesada do anticorpo anti-Aβ é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome-galovírus humano, - uma região não-traduzida em 5' derivada de um gene da linha germinativa do anticorpo humano, - o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo anti-Aβ incluindo uma sequência sinal derivada de um gene da linha germinativa do anticorpo humano, - um íntron híbrido da cadeia pesada de ser huma- no/camundongo 2 incluindo o elemento intensificador da cadeia pesada da lg de camundongo (ver, por exemplo, Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), - a região constante do gene da cadeia pesada y1 humana genômico, - a sequência sinal de poliadenilação ("poli A") da cadeia pesada y1 da imunoglobulina humana, - os sítios de restrição únicos Ascl e SgrAI na extremidade 5' e na 3', respectivamente.

b) cassete de expressão da cadeia leve

[0091] A unidade de transcrição da cadeia leve do anticorpo anti- Aβ é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome- galovírus humano (HCMV), - uma região não-traduzida em 5' derivada de um gene da linha germinativa do anticorpo humano, - a região variável da cadeia leve do anticorpo anti-Aβ incluindo uma sequência sinal derivada de um gene da linha germinativa do anticorpo humano, - um íntron híbrido do gene da cadeia leve K de ser huma- no/camundongo 2 incluindo o elemento intensificador da cadeia leve % da lg de camundongo (Picard e Schaffner, A lymphocyte-specific enhancer in the mouse immunoglobulin kappa gene. Nature 307(1984) 80-82), - a região constante do gene da cadeia leve K humana, - a sequência sinal de poliadenilação ("poli A") K da imuno-globulina humana, - os sítios de restrição únicos Sse8387 e Fsel na extremidade 5' e na 3', respectivamente.

c) Plasmídeos de expressão 5128, 5137, e 5151

[0092] Para a expressão e a produção do anticorpo anti-Aβ, os cassetes de expressão das cadeias curta e longa foram colocados sobre um único vetor de expressão (cadeia pesada a montante da cadeia leve, na orientação do sentido horário). Três vetores de expressão idênticos foram gerados, diferindo somente no gene de marcador sele- cionável incluído, em particular, no gene que confere resistência ao agente de seleção neomicina, higromicina, ou puromicina. Os vetores também incluem um gene da DHFR de camundongo que não foi usado para a seleção ou a amplificação.

[0093] Os vetores de expressão contêm, além do cassete de expressão das cadeias longa e curta, os seguintes elementos: - um marcador selecionável (um gene de resistência à ne- omicina, higromicina ou puromicina), - uma origem de replicação que permite a replicação do plasmídeo em E. coli, - um gene de beta-lactamase que confere resistência à am- picilina em E. coli, - um gene da DHFR derivado de camundongo.

[0094] O mapa de plasmídeo do vetor de expressão 5128 contendo um gene de marcador selecionável para higromicina é mostrado na figura 1. O mapa de plasmídeo do vetor de expressão 5137 contendo um gene de marcador selecionável para neomicina é mostrado na figura 2. O mapa de plasmídeo do vetor de expressão 5151 contendo um gene de marcador selecionável para puromicina é mostrado na figura 3.

Exemplo 2 Transfecção e seleção de uma célula CHO expressando um anticorpo anti-Aβ

[0095] As células CHO-K1 de origem, pré-adaptadas ao crescimento em cultura em suspensão sem soro no meio ProCHO4 sem componentes de animais sintéticos (Cambrex Corp.) contendo suplemento de glutamina a 8 mM e 1x HT (Gibco/lnvitrogen), foram usadas como linhagem celular hospedeira. Este meio ProCHO4 suplementado é designado a seguir como meio ProCHO4-completo. A linhagem celular de origem CHO-K1 aderente, que cresce, foi recebida de ATTC como ATCC CCL-61.

[0096] As células hospedeiras de origem, pré-adaptadas, foram propagadas em suspensão em meio ProCHO4-completo sem componentes de animais, sintético, sob condições-padrão umidificadas (95%, 37°C, e 5% de CO2). Em intervalos regulares, dependendo da densidade da célula, as células foram divididas para meio novo. As células foram coletadas por centrifugação na fase de crescimento exponencial, lavadas uma vez em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), estéril, e suspensas novamente em PBS estéril.

[0097] Antes da transfecção, os plasmídeos que expressam 0 anticorpo anti-Aβ foram linearizados dentro do gene de β-lactamase (gene de marcador de resistência à ampicilina em E. coli) usando a enzima endonuclease de restrição Pvul ou Avill. O DNA clivado foi precipitado com etanol, secado sob vácuo e dissolvido em PBS estéril.

[0098] Em geral, para a transfecção, as células CHO (de origem ou já transfectadas) foram eletroporadas com 20-50 juig de DNA de plasmídeo linearizado por aproximadamente 107 células, em PBS, na temperatura ambiente. As eletroporações foram efetuadas com um dispositivo de eletroporação Gene Pulser XCell (Bio-Rad Laboratories) em uma cubeta com abertura de 2 mm, usando um protocolo de onda quadrada com um único pulso de 180 V. Após a transfecção, as células foram preparadas em meio ProCHO4-completo em placas de cultura de 96 poços. Após 24 h de crescimento, uma solução contendo um ou mais agentes de seleção foi adicionada (meio de seleção Pro- CHO4-completo; G418: 400 juig/mL; higromicina: 600 ]mg/mL; puromici- na: 8 juig/mL). Uma vez por semana, 0 meio de seleção ProCHO4- completo era substituído. A concentração de anticorpo do anticorpo anti-Aβ foi analisada com um ensaio ELISA específico para a lgG1 humana nos sobrenadantes da cultura.

[0099] Para a seleção das linhagens celulares de produção de anticorpo anti-Aβ de alto rendimento, a produtividade foi testada no meio de seleção ProCHO4-completo após propagação em placas de cultura de 6 poços, frascos em T e/ou frascos de agitação Erlenmeyer, usando um ELISA para IgG 1 anti-humana e/ou HPLC com Proteína A analí- tica.

[00100] Os subclones foram obtidos por dois métodos, Diluição Li- mitante (LD) e Separação de Célula Ativada por Fluorescência (FACS).

Diluição limitante:

[00101] Para a diluição limitante, as células foram preparadas em meio ProCHO4-condicionado (consistindo em 50% (v/v) de meio de seleção ProCHO4-completo novo e 50% (v/v) de meio de seleção ProCHO4-completo condicionado, derivado das células a serem propagadas) em uma densidade de célula de 0,5 - 2 células por 0,1 ml de meio por poço de uma placa de cultura de 96 poços. Uma vez por semana, o meio era substituído por meio de seleção ProCHO4-completo. A concentração de anticorpo do anticorpo anti-Aβ foi analisada por um ensaio ELISA específico para a lgG1 humana nos sobrenadantes da cultura.

Deposição de célula única por citometria de fluxo incluindo a identificação e o isolamento de clones:

[00102] A identificação e o isolamento de clones estavelmente transfectados foram efetuados com o auxílio de uma técnica de marcação da superfície celular usando a Proteína A fluorescentemente marcada que se liga aos anticorpos secretados, porém ainda unidos à membrana. A intensidade da fluorescência das células coloridas foi usada como critério para a seleção da célula.

[00103] No caso da separação de célula ativada por fluorescência, a população eletroporada de células foi diretamente semeada em frascos em T, em meio ProCHO4-completo. O agente ou os agentes de seleção apropriados (G418, higromicina, e/ou puromicina) foram adicionados à cultura um dia depois da transfecção e a reunião de transfec- tantes foi expandida.

[00104] As células da reunião de transfectantes expandida foram primeiramente tratadas com Accumax (PAA Laboratories) por 15 minutos, a 37°C, e então passadas através de uma malha de náilon de 40 JLLM para remover os agregados de células grandes restantes. As células foram coletadas por centrifugação, suspensas novamente em PBS contendo 5% de FCS (Gibco/lnvitrogen), em uma densidade de célula de 106 a 107 células/mL, e incubadas por 20 minutos sobre gelo. Após isso, as células foram coloridas com 10 ng/mL de Proteína A Alexa Fluor 488 (Molecular Probes Inc.) em um volume de 8 ml de FCS-PBS, por 30 minutos, sobre gelo, no escuro. Posteriormente, as células foram lavadas uma vez com 5% de FCS-PBS, e uma vez com meio ProCHO4 contendo UltraGlutamina a 8 mM (Cambrex Corp.), 1x HT suplementado com 5% de FCS. Finalmente, as células foram suspensas novamente no meio ProCHO suplementado, usado para a lavagem, em uma densidade de célula de 106 a 107 células/mL, e transferidas para um separador de célula BD FACSAria (BD Biosciences).

[00105] As células individuais foram separadas por citometria de fluxo e depositadas em poços de placas de cultura com 96 poços contendo o meio ProCHO4-condicionado. As células selecionadas e depositadas incluíram as células com o máximo 10%, 7% ou 4% de intensidade de fluorescência das células vivas com acesso. Após 48 horas, o meio de seleção ProCHO4 completo contendo o agente de seleção apropriado em concentração de 2 vezes foi adicionado a cada poço. Uma vez por semana, o meio era substituído por meio de seleção ProCHO4-completo. A concentração de anticorpo do anticorpo anti-Aβ foi analisada com um ensaio ELISA específico para a lgG1 humana nos sobrenadantes da cultura.

Etapas de Transfecção e Seleção:

[00106] Para a primeira etapa de transfecção e seleção, utilizou-se o plasmídeo 5137. O plasmídeo 5137 foi transfectado com eletropora- ção para a linhagem celular de origem adaptada ao crescimento em meio ProCHO4-completo. As células transfectadas foram cultivadas em meio ProCHO4-completo, suplementado com até 700 juig/mL de G418, em placas com 96 poços. A concentração de anticorpo dos so- brenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti- humana. Aproximadamente 1000 clones foram testados e os selecionados deles foram adicionalmente cultivados em placas com 24 poços, placas com 6 poços e subsequentemente em frascos agitadores. O crescimento e a produtividade de aproximadamente 20 clones foram avaliados em culturas estáticas e em suspensão por ELISA para lgG1 anti-humana e/ou HPLC com proteína A analítica. O melhor clone (o melhor clone não significa o clone mais produtivo, significa o clone com as melhores propriedades para as etapas adicionais) foi subclo- nado por diluição limitada em meio ProCHO4-condicionado, suplementado com 700 (Lig/mL de G418. O clone selecionado foi chamado 8C8.

[00107] Para a segunda etapa de transfecção e seleção, utilizou-se o plasmídeo 5128. O plasmídeo 5128 foi transfectado com eletropora- ção para o clone da linhagem celular 8C8 cultivado em meio Pro- CHO4-completo, suplementado com 700 |Lig/mL de G418. As células transfectadas foram expandidas por cerca de duas a três semanas em meio ProCHO4-condicionado, suplementado com 200 |Lig/mL de G418 e 300 fig/mL de higromicina (meio de seleção ProCHO4-duplo). As células individuais de secreção de anticorpo foram identificadas e depositadas de acordo com a intensidade de fluorescência após coloração com um conjugado de Proteína A Alexa Fluor através de análise por FACS. As células depositadas foram cultivadas em meio de seleção ProCHO4-duplo em placas com 96 poços. A concentração de anticorpo nos sobrenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti-humana. Aproximadamente 500 clones foram testados e os selecionados deles foram adicionalmente cultivados em placas com 24 poços, placas com 6 poços e subsequentemente em frascos agitado- res. O crescimento e a produtividade de aproximadamente 14 clones foram avaliados em culturas estáticas e em suspensão por ELISA para lgG1 anti-humana e/ou HPLC com proteína A analítica. O clone selecionado foi chamado 4F5.

[00108] Para a terceira etapa de transfecção e seleção, utilizou-se o plasmídeo 5151. O plasmídeo 5151 foi transfectado com eletroporação para o clone da linhagem celular 4F5 cultivado em meio de seleção ProCHO4-duplo. As células transfectadas foram expandidas por cerca de duas a três semanas em meio de seleção ProCHO4-triplo (meio ProCHO4-condicionado, suplementado com 200 juig/mL de G418 e 300 juig/mL de higromicina e 4 p.g/mL de puromicina). As células individuais de secreção de anticorpo foram identificadas e depositadas de acordo com a intensidade de fluorescência após coloração com um conjugado de Proteína A Alexa Fluor através de análise por FACS. As células depositadas foram cultivadas em meio de seleção ProCHO4-triplo em placas com 96 poços. A concentração de anticorpo nos sobrenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti-humana. Aproximadamente 500 clones foram testados e os selecionados deles foram adicionalmente cultivados em placas com 24 poços, placas com 6 poços e subsequentemente em frascos agitadores. O crescimento e a produtividade de aproximadamente 10 clones foram avaliados em culturas estáticas e em suspensão por ELISA para lgG1 anti-humana e/ou HPLC com proteína A analítica. O clone selecionado foi chamado 20F2.

[00109] O clone 20F2 foi selecionado com base nas suas características de crescimento, produtividade, e qualidade do produto após crescimento em cultura em suspensão em batelada alimentada, em meio de seleção ProCHO4 triplo, isto é, na presença concomitante dos três agentes de seleção G418, higromicina e puromicina.

Características do Clone:

[00110] Conforme pode ser visto a partir da tabela a seguir, o tempo de duplicação e a densidade da célula após três dias de cultivo eram comparáveis quando a linhagem celular básica CHO-K1 (tipo selvagem) e os clones selecionados são comparados. Tabela 1: Características de crescimento

Exemplo 3 Estabilidade do clone 20F2 expressando um anticorpo anti-Aβ

[00111] A estabilidade do crescimento e da formação do produto foi avaliada em subculture sequencial de células por um período de tempo de 60 dias (cerca de 60 gerações), na presença e na ausência dos agentes de seleção (com e sem antibióticos). O cultivo foi efetuado conforme descrito acima. Tabela 2: Características do clone 20F2.

[00112] Após passagem extensiva (até a geração 60) não foi obtida nenhuma evidência indicando que o clone 20F2 produtor de anticorpo anti-Aβ era instável em relação ao crescimento celular e à formação de produto na presença ou na ausência dos três agentes de seleção, res- pectivamente.

Exemplo 4 Vetor de expressão para expressar um anticorpo antisselectina P

[00113] Um outro anticorpo (preferivelmente monoclonal) de exemplo, para o qual pode ser obtida a linhagem celular para a expressão de acordo com a presente invenção, é um anticorpo contra a glicopro- teína Selectina P humana (anticorpo antisselectina P). Tal anticorpo e as sequências de ácidos nucléicos correspondentes são, por exemplo, descritos em WO 2005/100402, ou US 2005/0226876 ou SEQ ID NO: 13a 18.

[00114] A linhagem celular do ovário do hamster chinês expressando o anticorpo antisselectina P foi gerada por duas transfecções e corridas de seleção de clone completas, sucessivas.

[00115] Um segmento de gene da região constante da cadeia leve capa humana genômico (C-capa) foi adicionado à região variável da cadeia leve do anticorpo antisselectina P, enquanto que um segmento de gene da região constante da cadeia pesada gama 4 humana (CHI- Articulação-CH2-CH3) foi adicionado à região variável da cadeia pesada do anticorpo antisselectina P. Os genes dos anticorpos das cadeias curta capa e longa gama 4 completos foram então unidos com um promotor e o intensificador iniciais imediatos de citomegalovírus humano (CMV IE) na extremidade 5' e a sequência sinal de poliadenila- ção inicial do Vírus Símio 40 (poli A inicial do SV 40) na extremidade 3'.

a) Cassete de expressão da cadeia pesada

[00116] A unidade de transcrição da cadeia pesada do anticorpo antisselectina P é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome-galovírus humano (CMV IE), - uma região não-traduzida em 5' (5' UTR), - a sequência codificadora para a cadeia pesada gama 4 do anticorpo antisselectina P incluindo um peptídeo de sinal em uma estrutura de gene de íntron-éxon, - a sequência sinal de poli A inicial do SV 40.

b) cassete de expressão da cadeia leve

[00117] A unidade de transcrição da cadeia leve do anticorpo antisselectina P é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome- galovírus humano (CMV IE), - uma região não-traduzida em 5' (5' UTR), - a sequência codificadora para a cadeia leve capa do an-tisselectina P em uma estrutura de gene de íntron-éxon, - a sequência sinal de poli A inicial do SV 40.

c) Plasmídeos de expressão 5057 e 5069

[00118] Para a expressão e a produção do anticorpo antisselectina P, os cassetes de expressão das cadeias curta e longa foram colocados sobre um único vetor de expressão (cadeia pesada a montante da cadeia leve). Dois vetores de expressão idênticos foram gerados, diferindo somente no gene de marcador selecionável incluído, em particular, o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR) de murino ou um gene de resistência à neomicina.

[00119] Os vetores de expressão contêm, além do cassete de expressão das cadeias curta e longa, os seguintes elementos: - um marcador selecionável, ou o gene da DHFR de murino ou um gene conferindo resistência ao agente de seleção neomicina, sob o controle do promotor inicial de SV40 e a origem - uma origem de replicação que permite a replicação do plasmídeo em E. coli, obtida do pUC19 (origem de pUC), - um gene de beta-lactamase que confere resistência à am- picilina em E. coli,

[00120] O mapa de plasmídeo do vetor de expressão 5057 contendo um gene de marcador da DHFR de murino é mostrado na figura 4. O mapa de plasmídeo do vetor de expressão 5069 contendo um gene de marcador selecionável para neomicina é mostrado na figura 5.

Exemplo 5 Transfecção e seleção de uma linhagem celular CHO expressando um anticorpo antisselectina P

[00121] As células CHO-K1, pré-adaptadas ao crescimento em cultura em suspensão sem soro no meio HyQ SFM4CHO sem proteína (Hyclone, N2 do Cat. SH30549), suplementado com componentes derivados de animais definidos (colesterol da lã ovina e óleo de fígado de bacalhau), foram usadas como a linhagem celular hospedeira. As células foram propagadas em frascos de agitação em meio HyQ SFM4CHO sem proteína, sob condições-padrão umidificadas (95%, 37°C, e 5% de CO2) e sob agitação constante a 150 rpm/min. Dependendo da densidade da célula, as células foram divididas para meio novo.

[00122] As linhagens celulares CHO-K1 aderentes foram obtidas da American Type Culture Collection como ATCC CCL-61.

Primeira Transfecção e Seleção

[00123] Antes da transfecção, 0 plasmídeo de expressão 5057 foi linearizado dentro do gene de beta-lactamase, usando a enzima de restrição Pvul. O DNA clivado foi purificado usando colunas de rotação QiaQuick (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante.

[00124] A transfecção foi efetuada por eletroporaçâo usando 0 Gene Pulser XCell (BIO-RAD) e cubetas de 0,2 cm (BIO-RAD, N2 do Cat. 165-2086). Para a transfecção, 106 a 107 células CHO-K1 foram coletadas por centrifugação, suspensas novamente em PBS, transferidas para a cubeta e misturadas com 20-50 p.g de DNA de plasmídeo linearizado. As células foram expostas a um único pulso de onda quadrada (160 V, 15 ms) e subsequentemente diluídas em meio HyQ SFM4CH0 até uma densidade de aproximadamente 4 x 105 células/mL e semeadas em um frasco de cultura de células T75. Após 48 horas de propagação sem a suplementação de um agente de seleção, as células foram diluídas em meio HyQ SFM4CHO, suplementado com MTX a 200 nM, até uma densidade de 104 a 105 células/mL e semeadas em placas com 96 poços com 3-7000 células por poço. Após aproximadamente duas semanas, adicionou-se meio novo por poço e, após duas semanas adicionais, o meio de cultura foi completamente substituído por meio novo. Quatro dias mais tarde, os sobrenadantes da cultura foram testados quanto à produção de anticorpo por ELISA para Fc anti-humano. No total, aproximadamente 600 clones foram examinados.

[00125] 45 clones com títulos de anticorpos de mais de 10 juig/mL foram coletados e transferidos para placas com 48 poços. Os clones foram expandidos para os frascos agitadores durante passagens adicionais e subsequentemente transferidos para meio de produção sem soro para a avaliação final da produtividade. Um frasco agitador de 125 ml foi inoculado com 105 a 106 células/mL em meio suplementado com MTX a 200 nM. A densidade de célula viável e a viabilidade foram monitoradas durante uma semana. Os títulos de anticorpos foram medidos por cromatografia com Proteína A no dia final. Com base nestes dados, o clone G24 foi selecionado para desenvolvimento adicional. O G24 atingiu uma densidade de célula viável máxima de 3,3 x 106 célu- las/mL. O título de anticorpo era 402 |ng/mL. A taxa de produção específica (SPR) média era 28 pg/(célula*d).

Segunda Transfecção e seleção:

[00126] O clone G24 foi submetido a uma segunda transfecção. Para a segunda transfecção utilizou-se o plasmídeo 5069. A linearização e a purificação do plasmídeo, bem como a eletroporação do G24 foram efetuadas conforme descrito para a primeira transfecção. Após 48 horas de propagação sem pressão de seleção, as células foram diluídas em meio HyQ SFM4CHO, suplementado com MTX a 200 nM e 400 juig/mL de G418 até uma densidade de 103 a 104 células/mL, e semeadas em placas de 96 poços com 500 células por poço. Após aprox. duas semanas, adicionou-se meio novo por poço e, após uma semana adicional, o meio de cultura foi completamente substituído por meio novo. Quatro dias mais tarde, os sobrenadantes da cultura foram testados quanto à produção de anticorpo por ELISA para Fc anti- humano. No total, aproximadamente 220 clones foram examinados.

[00127] Então, 13 clones com títulos de anticorpos de mais de 150 juig/mL foram coletados e transferidos para placas com 24 poços. Os clones foram expandidos para os frascos agitadores durante passagens adicionais e subsequentemente transferidos para meio de produção sem soro para a avaliação final da produtividade. Um frasco agitador foi inoculado com 105 a 106 células/mL em 50 ml de meio suplementado com MTX a 200 nM e 400 juig/mL de G418. A densidade de célula viável e a viabilidade foram monitoradas durante uma semana. Os títulos de anticorpos foram medidos por cromatografia com Proteína A no dia final. Com base nestes dados, o clone G24_x6 foi considerado o melhor clone. O G24_x6 atingiu uma densidade de célula viável máxima de 3,0 x 106 células/mL. O título de anticorpo era 685 juig/mL. A taxa de produção específica (SPR) média era 48 pg/(célula*d).

Diluição limitante:

[00128] Para comparar o método de acordo com a invenção com a simples subclonagem em relação ao seu efeito sobre a produtividade, o clone G24 foi submetido à diluição limitante ou à deposição de célula individual em placas com 96 poços.

[00129] Para a diluição limitante, as células foram semeadas em placas com 96 poços em meio HyQ SFM4CHO suplementado com 50% (v/v) de meio condicionado, 10% de FCS e MTX a 200 nM a 0,5 célula/poço. Alternativamente, 1 célula/poço foi depositada em placas com 96 poços por FACS. Após 10 dias, o meio HyQ SFM4CHO novo, MTX a 200 nM sem FDS, foi adicionado por poço e, após uma semana adicional, o meio de cultura foi completamente substituído por meio HyQ SFM4CHO, MTX a 200 nM. Quatro dias mais tarde, os sobrena- dantes da cultura foram testados quanto à produção de anticorpo por ELISA para Fc anti-humano. No total, aproximadamente 230 clones foram examinados.

[00130] Onze subclones com títulos de anticorpos de mais de 130 |ug/mL foram transferidos para placas com 24 poços. Após passagens em placas com 6 poços, os clones foram transferidos para os frascos agitadores e subsequentemente transferidos para meio de produção sem soro para a avaliação final da produtividade. Um frasco agitador foi inoculado com 105 a 106 células/mL em meio suplementado com MTX a 200 nM. A densidade de célula viável e a viabilidade foram monitoradas durante uma semana. Os títulos de anticorpos foram medidos por cromatografia com Proteína A no dia final. Com base nestes dados, o G24_13 foi considerado o melhor clone. O G24_13 atingiu uma densidade de célula viável máxima de 3,6 x 106 células/mL. O título de anticorpo era 472 juig/mL. A taxa de produção específica (SPR) média era 31 pg/(célula*d).

[00131] A Tabela 3 resume os dados de produtividade do subclone G24_13 que melhor desempenha e do subclone G24_x6 que melhor desempenha, obtidos com o método de acordo com a invenção, em comparação com o seu clone parental G24. Com o método de acordo com a invenção, pode ser obtido um clone com produtividades volumétrica e específica aumentadas em mais do que 50%, enquanto que, após a subclonagem, somente um pequeno aumento de ambos os parâmetros foi observado.

[00132] A figura 6 mostra uma visão geral das produtividades volu- métrica (A) e específica (B) de todos os subclones de G24 que foram investigados nos frascos de agitação. Conforme pode ser visto, as produtividades médias volumétrica e específica dos clones obtidos com o método de acordo com a invenção eram significativamente maiores do que após a subclonagem. Tabela 3: Produtividade dos melhores clones produtores em com paração com o clone parental G24.

Características do Clone:

[00133] Conforme pode ser visto a partir da tabela a seguir, o tempo de duplicação e a densidade da célula após três dias de cultivo eram comparáveis quando a linhagem celular transfectada uma vez G24 e os clones selecionados são comparados. Tabela 4: Características de crescimento

Exemplo 6 Transfecção e seleção de uma linhagem celular CHO expressando um anticorpo antisselectina P

[00134] As células CHO-DG44, adaptadas ao crescimento em cultura em suspensão sem soro, em meio HyQ SFM4CHO sem proteína (Hyclone, N- do Cat. SH30549), foram usadas como a linhagem celular hospedeira. A linhagem celular hospedeira foi cultivada em meio comercial HyQ SFM4CHO-utilidade (Hyclone, N- do Cat. SH30516) durante as etapas de transfecção, exame e subclonagem.

Primeira Transfecção e Seleção

[00135] Antes da transfecção, o plasmídeo de expressão 5057 (figura 4) foi linearizado dentro do gene de beta-lactamase, usando a enzima de restrição Pvul.

[00136] A transfecção da linhagem celular hospedeira foi efetuada por nucleotransfecção proporcionada por AMAXA (Kit T Nucleofector, N- do Cat. VCA-1002, Programa de transfecção U-17). As células foram cultivadas em meio suplementado com 10% de soro de bezerro fetal, por 48 h, após a transfecção.

[00137] As células transfectadas foram preparadas sobre placas com 96 poços, com 1000 células por poço, em meio suplementado com 10% de soro de bezerro fetal, na presença de metotrexato (MTX) a 40 nM como o agente de seleção e incubadas por aproximadamente três semanas.

[00138] A concentração de anticorpo foi determinada por ELISA no sobrenadante das placas com 96 poços. Cerca de 400 clones primários foram examinados. Vinte e quatro clones com a mais alta produtividade de anticorpos foram transferidos para placas com 24 poços e cultivados na presença do agente de seleção, sem suplementação com soro de bezerro fetal. A qualidade do produto foi analisada por Western blotting que detecta as cadeias curta e longa do anticorpo. Nove clones que mostraram a mais alta produtividade e que expressaram o anticorpo sem produtos laterais detectáveis derivados de anticorpos (Western blot) foram expandidos para frascos de agitação.

[00139] A produtividade foi analisada em frascos de agitação de batelada após 7 e 10 dias de incubação. A qualidade do produto foi avaliada por SDS-PAGE após purificação por HPLC com Proteína A (figura 7). A melhor concentração de produto foi atingida com o clone 43-16. A melhor produtividade específica por célula foi obtida com o clone 35-45. Ambos os clones não mostraram nenhum produto lateral detectável na SDS-PAGE. Ambos os clones foram selecionados para a subclonagem por diluição limitante.

[00140] Os clones parentais 35-45 e 43-16 foram subclonados por diluição limitante sobre placas com 96 poços, em meio HyQ comercial suplementado com 5% (v/v) de soro de bezerro fetal, na presença de MTX a 20 nM. Após 20 dias de incubação, a produção de anticorpo foi examinada por ELISA. Os melhores subclones em termos de produtividade foram expandidos para frascos de agitação e subsequentemente transferidos para o meio de produção sem soro para a avaliação final da produtividade. Os dois melhores subclones, 35-45-F2 e 43-16- A10, dos clones parentais 35-45 e 43-16 foram avaliados no ensaio- padrão do frasco de agitação de batelada. A produtividade era 270 |Lig/mL e 185 juig/mL após 7 dias e 337 |Lig/mL e 343 |Lig/mL após 10 dias, respectivamente.

Segunda Transfecção e Seleção:

[00141] O subclone 43-16-A10 foi transfectado com o vetor de expressão p5069 (Figura 5) usando o método de nucleofecção (Amaxa, Kit T Nucleofector, VCA-1002, Programa de transfecção U-17). A segunda transfecção foi também realizada em meio Hyclone: HyQ SFM4CHO-utilidade (N2do Cat. SH30516), suplementado com 10% de soro de bezerro fetal e MTX a 20 nM. Dois dias após a segunda transfecção, as células foram transferidas para placas com 96 poços, com 1000 células por poço. Como o segundo agente de seleção, adiciona- ram-se 250 juig/mL de G418.

[00142] Após cultivo por duas semanas, mais do que 2000 poços primários foram examinados por determinação do título de anticorpo por ELISA para Fc anti-humano. Cinquenta clones com a mais alta produtividade foram transferidos para placas com 24 poços e examinados uma segunda vez por ELISA para Fc anti-humano, três dias mais tarde. Todos os clones foram transferidos para placas com 6 poços e examinados por ELISA para Fc anti-humano, três dias mais tarde. Os seis clones com a melhor produtividade foram diretamente sub- clonados a partir do estágio de placa com 6 poços.

Diluição limitante:

[00143] Os melhores clones parentais da segunda rodada de transfecção e seleção43- 16A10_S1, 43-16A10_S13, 43-16A10_S14, 43- 16A10-S19, 43-16A10_S24, 43-16A10_S43 foram subclonados por diluição limitante. A qualidade de produto dos doze melhores subclo- nes foi avaliada em SDS-PAGE e Western Blotting a partir do estágio de 24 poços. Não foi detectado nenhum produto lateral relacionado ao anticorpo, indesejado.

[00144] Três subclones, 43-16-A10-S1-16, 43-16-A10-S24-11, e 43- 16-A10-S43-14, foram selecionados de acordo com a sua produtividade nas placas de 6 poços para a expansão em frascos de agitação. Eles foram transferidos para o meio de produção sem soro para a avaliação final da produtividade. A sua produtividade foi comparada ao subclone após a primeira transfecção, o clone 43-16-A10. A produtividade foi aumentada duas vezes para dois dos clones após a segunda transfecção e seleção, o 43-16-A10-S1-16 e o 43-16-A10-S24-11, de 221 juig/mL após 7 dias no frasco de agitação de batelada para 436 juig/mL e 407 juig/mL, respectivamente. Após 10 dias de incubação no frasco de agitação de batelada, a produtividade aumentou de 306 juig/mL para 683 juig/mL e 446 juig/mL, respectivamente.

[00145] A produtividade específica por célula aumentou também de 17 pg/célula/dia para o clone 43-16-A10, após a primeira transfecção, para 40 pg/célula/dia para o primeiro clone transfectado 43-16-A10-S1- 16 e para 33 pg/célula/dia para o segundo clone transfectado 43-16- A10-S24-11. O tempo de duplicação não foi afetado pela segunda transfecção. O tempo de duplicação para o clone 43-16-A10 após a primeira transfecção foi 33 h e ele foi 32 h para ambos os clones 43- 16-A10-S1 -16 e 43-16-A10-S24-11.

Exemplo 7 Vetor de expressão para expressar um anticorpo anti-IL-13Ra

[00146] Um outro anticorpo (preferivelmente monoclonal) do exemplo, para o qual pode ser obtida uma linhagem celular para a expressão de acordo com a presente invenção, é um anticorpo que se liga ao Receptor de IL-13 alfa 1 (anticorpo anti-IL-13Roc1 e anti-IL-13Ra). Tal anticorpo e as sequências de ácidos nucléicos correspondentes são, por exemplo, descritos em WO 2006/072564 ou SEQ ID NO: 19 a 28.

[00147] Um segmento de gene da região constante da cadeia leve capa humana genômico (C-capa) foi adicionado à região variável da cadeia leve do anticorpo anti-IL-13Roc, enquanto que um segmento de gene da região constante da cadeia pesada gama 1 humana (CHI- Articulação-CH2-CH3) foi adicionado á região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-IL-13Roc. O plasmídeo de expressão 5321 compreende um cassete de expressão para a cadeia pesada y1 do anticorpo anti-IL-13Roc, e a cadeia leve K do anticorpo anti-IL-13Roc, e um ácido nucléico codificando o gene da DHFR de murino. Um mapa de plasmídeo com notas é mostrado na figura 9.

a) Cassete de expressão da cadeia pesada

[00148] A unidade de transcrição da cadeia pesada do conjugado do anticorpo anti-IL-13Roc é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome- galovírus humano (CMV IE), - uma região não-traduzida em 5' (5' UTR), - a sequência codificadora para o conjugado da cadeia pesada gama 1 do anticorpo anti-IL-13Rcc incluindo um peptídeo de sinal em uma estrutura de gene de íntron-éxon, - a sequência sinal de poliadenilação de imunoglobulina gama 1 humana.

b) Cassete de expressão da cadeia leve

[00149] A unidade de transcrição da cadeia leve do anticorpo anti- IL-13Roc é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome- galovírus humano (CMV IE), - uma região não-traduzida em 5' (5' UTR), - a sequência codificadora para a cadeia leve capa do anti- IL-13Ra em uma estrutura de gene de íntron-éxon, - a sequência sinal de poliadenilação de imunoglobulina capa humana.

c) Plasmídeos de expressão

[00150] Para a expressão e a produção do conjugado de anticorpo anti-IL-13Roc, os cassetes de expressão das cadeias curta e longa foram colocados sobre um único vetor de expressão (cadeia leve a montante da cadeia pesada). Dois vetores de expressão idênticos foram gerados, diferindo somente no gene de marcador selecionável incluído, em particular, o gene da DHFR de murino e tanto o gene da DHFR de murino quanto um gene de resistência à higromicina.

[00151] Os vetores de expressão contêm, além do cassete de expressão das cadeias curta e longa, os seguintes elementos: - uma origem de replicação que permite a replicação do plasmídeo em E. coli (origem de pUC), - um gene de beta-lactamase que confere resistência à am- picilina em E. coli,

Exemplo 8 Transfecção e seleção de uma linhagem celular CHO expressando um anticorpo anti-IL-13Ra

[00152] Para a primeira etapa de transfecção e seleção, utilizou-se o plasmídeo 5321. O plasmídeo 5321 foi transfectado com eletropora- ção para a linhagem celular de origem adaptada ao crescimento em meio ProCHO4-completo. As células transfectadas foram cultivadas em meio HyQSFMCHO-completo (HyClone), suplementado com até 200 nM de metotrexato, em placas. A concentração de anticorpo nos sobrenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti- humana. Os clones foram testados e os selecionados deles foram adicionalmente cultivados em placas com 24 poços, placas com 6 poços e subsequentemente em frascos agitadores. O crescimento e a produtividade foram avaliados em culturas estáticas e em suspensão por ELISA para lgG1 anti-humana e/ou HPLC com proteína A analítica. O melhor clone (o melhor clone não significa o clone mais produtivo, significa o clone com as melhores propriedades para as etapas adicionais) foi selecionado. O clone selecionado foi chamado 200_019. A produtividade era 90 |Lig/mL, com uma taxa de produção específica média de 7 pg/célula*d após 7 dias de cultivo.

[00153] Para a segunda etapa de transfecção e seleção, utilizou-se um plasmídeo com um gene da DHFR e de resistência à higromicina. O plasmídeo foi transfectado com eletroporação para a linhagem celular selecionada, cultivada em meio HyQSFMCHO (HyClone), suplementado com até 200 nM de metotrexato. O meio de seleção duplo continha, além disso, 300 |Lig/mL de higromicina B. As células individuais de secreção de anticorpo foram identificadas e depositadas de acordo com a sua intensidade de fluorescência após coloração com um conjugado de Proteína A Alexa Fluor através de análise por FACS. O clone selecionado foi chamado 5_17_35. A produtividade era 150 |u,g/mL, com uma taxa de produção específica média de 10 pg/célula*d após 7 dias de cultivo.

Exemplo 9 Vetor de expressão para expressar um conjugado de anticorpo anti-CD4

[00154] Um outro anticorpo (monoclonal) de exemplo, para o qual pode ser obtida uma linhagem celular para a expressão de acordo com a presente invenção, é um anticorpo contra o receptor da superfície de CD4 humano (anticorpo anti-CD4), o qual está conjugado a dois a oito peptídeos antifusogênicos. Tal anticorpo e as sequências de ácidos nucléicos correspondentes são, por exemplo, descritos em PCT/EP2008/005894 ou SEQ ID NO: 29 a 40.

[00155] Um segmento de gene da região constante da cadeia leve capa humana genômico (C-capa) foi adicionado à região variável da cadeia leve do anticorpo anti-CD4 de SEQ D NO: 39, enquanto que um segmento de gene da região constante da cadeia pesada gama 1 humana (CHi-Articulação-CH2-CH3) foi adicionado à região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-CD4 de SEQ ID NO: 36. O plasmídeo de expressão 6311 compreende uma cadeia pesada y1 do anticorpo anti-CD4, que está unida no último aminoácido, porém C-terminal, isto é, o resíduo de lisina C-terminal da cadeia pesada está removido, com um ácido nucléico codificando um peptídeo antifusogênico de SEQ ID NO: 41, via o ligante peptídico de glicina-serina de SEQ ID NO: 41, e uma cadeia leve K do anticorpo anti-CD4, e um ácido nucléico conferindo resistência ao marcador selecionável neomicina. Um mapa de plasmídeo com notas é mostrado na figura 8.

a) Cassete de expressão da cadeia pesada

[00156] A unidade de transcrição da cadeia pesada do conjugado do anticorpo anti-CD4 é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome- galovírus humano (CMV IE), - uma região não-traduzida em 5' (5' UTR), - a sequência codificadora para o conjugado da cadeia pesada gama 1 do anticorpo anti-CD4 incluindo um peptídeo de sinal em uma estrutura de gene de íntron-éxon, - a sequência sinal de poli A inicial do SV 40.

b) Cassete de expressão da cadeia leve

[00157] A unidade de transcrição da cadeia leve do conjugado de anticorpo anti-IL-CD4 é composta dos seguintes elementos: - o intensificador e o promotor iniciais imediatos do citome- galovírus humano (CMV IE), - uma região não-traduzida em 5' (5' UTR), - a sequência codificadora para a cadeia leve capa do anti- IL-CD4 em uma estrutura de gene de íntron-éxon, - a sequência sinal de poli A inicial do SV 40.

c) Plasmídeos de expressão

[00158] Para a expressão e a produção do conjugado de anticorpo anti-CD4, os cassetes de expressão das cadeias curta e longa foram colocados sobre um único vetor de expressão (cadeia leve a montante da cadeia pesada). Três vetores de expressão idênticos foram gerados, diferindo somente no gene de marcador selecionável incluído, em particular, um gene de resistência à neomicina, um gene de resistência à puromicina, e um gene de resistência à higromicina.

[00159] Os vetores de expressão contêm, além do cassete de expressão das cadeias curta e longa, os seguintes elementos: - uma origem de replicação que permite a replicação do plasmídeo em E. coli, obtida do pUC18 (origem de pUC), - um gene de beta-lactamase que confere resistência à am- picilina em E. coli, Exemplo 10 Transfecção e seleção de uma linhagem celular CHO expressando um conjugado de anticorpo anti-CD4

[00160] Para a primeira etapa de transfecção e seleção, utilizou-se o plasmídeo 6311. O plasmídeo 6311 foi transfectado com eletropora- ção para a linhagem celular de origem adaptada ao crescimento em meio ProCHO4-completo. As células transfectadas foram cultivadas em meio ProCHO4-completo, suplementado com até 700 juig/mL de G418, em placas com 96 poços. A concentração de anticorpo nos so- brenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti- humana. Aproximadamente 5000 clones foram testados e os selecionados deles foram adicionalmente cultivados em placas com 24 poços, placas com 6 poços e subsequentemente em frascos agitadores. O crescimento e a produtividade de aproximadamente 15 clones foram avaliados em culturas estáticas e em suspensão por ELISA para lgG1 anti-humana e/ou HPLC com Proteína A analítica. O melhor clone (o melhor clone não significa o clone mais produtivo, significa o clone com as melhores propriedades para as etapas adicionais) foi subclo- nado por diluição limitada em meio ProCHO4-condicionado, suplementado com 700 juig/mL de G418.

[00161] Os subclones foram obtidos por dois métodos, Diluição Limitante (LD) e Separação de Célula Ativada por Fluorescência (FACS).

Diluição limitante:

[00162] Para a diluição limitante, as células foram preparadas em meio de seleção ProCHO4, em uma densidade de célula de 0,5 - 2 células por 0,1 ml de meio por poço de uma placa de cultura de 96 poços.

[00163] No caso da separação de célula ativada por fluorescência, a população eletroporada de células foi diretamente semeada em fras- cos em T, em meio ProCHO4-completo. O agente ou os agentes de seleção apropriados (G418, higromicina e/ou puromicina) foram adicionados à cultura um dia depois da transfecção e a reunião de transfec- tantes foi expandida. O crescimento e a produtividade de aproximadamente 112 clones foram avaliados, em culturas estáticas e em suspensão, por ELISA para lgG1 anti-humana e/ou HPLC com Proteína A analítica. O clone selecionado foi chamado 1-17.

[00164] Para a segunda etapa de transfecção e seleção, utilizou-se um plasmídeo com um gene de resistência à higromicina. O plasmídeo foi transfectado com eletroporação para o clone da linhagem celular 1- 17 cultivado em meio ProCHO4-completo, suplementado com 700 |Lig/mL de G418. As células transfectadas foram expandidas por cerca de duas a três semanas em meio ProCHO4-condicionado, suplementado com 200 juig/mL de G418 e 300 |Lig/mL de higromicina (meio de seleção ProCHO4-duplo). As células individuais de secreção de anticorpo foram identificadas e depositadas de acordo com a intensidade de fluorescência após coloração com um conjugado de Proteína A Alexa Fluor através de análise por FACS. As células depositadas foram cultivadas em meio de seleção ProCHO4-duplo em placas com 96 poços. A concentração de anticorpo nos sobrenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti-humana. O clone selecionado foi chamado 24_16.

[00165] Para a terceira etapa de transfecção e seleção, utilizou-se um plasmídeo com um gene de resistência à puromicina. O plasmídeo foi transfectado com eletroporação para o clone da linhagem celular 24_16 cultivado em meio de seleção ProCHO4-duplo. As células transfectadas foram expandidas por cerca de duas a três semanas em meio de seleção ProCHO4-triplo (meio ProCHO4-condicionado, suplementado com 200 juig/mL de G418 e 300 |Lig/mL de higromicina e 4 juig/mL de puromicina). As células individuais de secreção de anticorpo foram identificadas e depositadas de acordo com a intensidade de fluorescência após coloração com um conjugado de Proteína A Alexa Fluor através de análise por FACS. As células depositadas foram cultivadas em meio de seleção ProCHO4-triplo em placas com 96 poços. A concentração de anticorpo nos sobrenadantes da cultura foi avaliada por um ELISA para lgG1 anti-humana. O clone selecionado foi chamado 1-24.

Características do Clone:

[00166] Conforme pode ser visto a partir da tabela a seguir, o tempo de duplicação e a densidade da célula após três dias de cultivo eram comparáveis quando a linhagem celular básica CHO-K1 (tipo selvagem) e os clones selecionados são comparados. Tabela 5: Características de crescimento

Claims

1. Método para a produção recombinante de uma imunoglobulina heteróloga em uma célula do ovário do hamster chinês (CHO) que é secretada para o meio de cultivo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer uma célula do ovário do hamster chinês (CHO), a qual está - adaptada ao crescimento em cultura em suspensão, - adaptada ao crescimento em meio sem soro, - sem micoplasma, b) fornecer um ácido nucléico compreendendo - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, e uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve da dita imunoglobulina heteróloga, em que um primeiro vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um primeiro agente de seleção eucariótico, em que um segundo vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um segundo agente de seleção eucariótico, em que o dito segundo agente de seleção eucariótico é diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico, b1) fornecer um ácido nucléico compreendendo - uma origem de replicação procariótica, - uma primeira sequência de ácidos nucléicos conferindo resistência a um agente de seleção procariótico, - uma segunda sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, e/ou uma terceira sequência de ácidos nucléicos codificando a cadeia leve da dita imunoglobulina heteróloga, em que um terceiro vetor de transfecção é fornecido, o qual compreende o dito ácido nucléico fornecido, e uma quarta sequência de ácidos nucléicos adicional conferindo resistência a um terceiro agente de seleção eucariótico, em que o dito terceiro agente de seleção eucariótico é diferente do dito primeiro agente de seleção eucariótico e também é diferente do dito segundo agente de seleção eucariótico, c) transfectar a dita célula do ovário do hamster chinês (CHO), em que a dita transfecção compreende as etapas a seguir, na seguinte ordem: (i) transfectar a dita célula do ovário do hamster chinês (CHO) com o dito primeiro vetor de transfecção, (ii) selecionar uma célula do ovário do hamster chinês (CHO) transfectada em (i) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo um primeiro agente de seleção eucariótico ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, (iii) transfectar a dita célula do ovário do hamster chinês (CHO) selecionada em (ii) com o dito segundo vetor de transfecção, (iv) selecionar uma célula do ovário do hamster chinês (CHO) transfectada em (iii) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, e o dito segundo agente de seleção eucariótico, ao qual o segundo vetor de transfecção confere resistência, (v) transfectar a dita célula do ovário do hamster chinês (CHO) selecionada em (iv) com o dito terceiro vetor de transfecção, (vi) selecionar uma célula do ovário do hamster chinês (CHO) transfectada em (v) por crescimento selecionado em um meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção eucariótico, ao qual o primeiro vetor de transfecção confere resistência, e o dito segundo agente de seleção eucariótico, ao qual o segundo vetor de transfecção confere resistência e o dito terceiro agente de seleção eucariótico, ao qual o terceiro vetor de transfecção confere resistência, d) cultivar a dita célula do ovário do hamster chinês (CHO) transfectada em um meio na presença do dito primeiro e do dito segundo e do dito terceiro agentes de seleção eucarióticos, sob condições adequadas para a expressão dos ditos segundo e/ou terceiro ácidos nucléicos, e) recuperar a dita imunoglobulina heteróloga secretada do meio de cultivo e, com isso, produzindo uma imunoglobulina heteróloga em uma célula do ovário do hamster chinês (CHO), a qual é secretada para o meio de cultivo, em que o primeiro, segundo e terceiro vetores de transfecção cada um difere apenas no ácido nucléico que confere resistência ao dito primeiro, segundo e terceiro agentes de seleção eucariótico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita célula CHO é uma célula CHO K1, ou uma célula CHO DG44, ou uma célula CHO XL99, ou uma célula CHO DXB11, ou uma célula CHO DP12.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os ditos segundo e/ou terceiro ácidos nucléicos contêm sequência de ácidos nucléicos intrônica híbrida.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o promotor empregado para a transcrição do dito segundo e terceiro ácidos nucléicos difere do promotor empregado para a transcrição do dito quarto ácido nucléico.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o promotor empregado para a transcrição do dito segundo e terceiro ácidos nucléicos é o mesmo.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende selecionar uma célula CHO transfectada na etapa c) (i) e/ou (ii) por crescimento em meio de cultivo sem um agente de seleção por 12 a 72 horas, seguida por crescimento selecionado em meio de cultivo contendo o dito primeiro agente de seleção no caso de (ii) ou o dito primeiro e segundo agentes de seleção eucarióticos no caso de (iv).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o uso de códons do segundo e terceiro ácido nucléicos é otimizado para a tradução em células CHO.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa c) e a etapa d) são efetuadas no mesmo meio.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito meio é um meio sem soro, ou um meio sem soro suplementado com componentes derivados de animais definidos, ou um meio sem componentes derivados de animais, ou um meio sem proteína, um meio sem proteína suplementado com componentes derivados de animais definidos, ou um meio sem proteína definido, ou um meio quimicamente definido.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que na dita etapa d) o dito cultivo é na presença dos ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de menos do que 500 litros e que o dito cultivo é na ausência dos ditos agentes de seleção eucarióticos em um volume de 500 litros ou mais, e que a dita recuperação da dita imunoglobulina heteróloga secretada é a partir do meio de cultivo sem os ditos agentes de seleção eucarióticos.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: f) purificar a dita imunoglobulina heteróloga com uma ou mais etapas cromatográficas.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a dita célula CHO transfectada da etapa c) tem - um tempo de duplicação de 150 % ou menos do tempo de duplicação da célula CHO selecionada na subetapa (ii), - um rendimento volumétrico de 125 % comparado ao rendimento volumétrico da célula CHO selecionada em (ii).

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a dita imunoglobulina heteróloga é um anticorpo anti-Aβ compreendendo um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 e um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 10, 11 ou 12..

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a dita imunoglobulina heteróloga é um anticorpo anti-P selectina compreendendo um domínio variável da cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 13, 14 ou 15 e um domínio variável da cadeia leve com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 16, 17 ou 18.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a dita imunoglobulina é um anticorpo humano, ou um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico, ou anticorpo depletado para o antígeno de célula T.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a célula CHO é uma célula CHO K1 (ATCC CCL-61 ou DSM ACC 110) ou uma célula CHO DG44 (também conhecida como CHO-DHFR [-], DSM ACC 126) ou uma célula CHO XL99, uma CHO-T ou uma célula CHO-S ou uma célula Super-CHO.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada e a cadeia leve contêm uma extensão N-terminal, que é necessária para o transporte/secreção do polipeptídeo através da célula para o meio extracelular.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é adequado para a produção de uma imunoglobulina heteróloga secretada em larga escala.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado a um volume de 100 L.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado a um volume de 500 L.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado a um volume de 1.000 L.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o cultivo da dita célula CHO transfectada é realizado na presença do dito agente de seleção eucariótico no trem de amplificação de fermentações e o cultivo da referida célula CHO transfectada é realizado na ausência dos ditos agentes de seleção eucarióticos na fermentação principal e que a dita recuperação da dita imunoglobulina heteróloga secretada é do meio de cultivo sem os ditos agentes de seleção eucarióticos.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que os agentes de seleção eucarióticos são adicionados durante a fase de crescimento e omitidos durante a fase de produção da dita célula CHO.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina heteróloga é uma imunoglobulina heteróloga secretada completamente processada.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o meio usado no cultivo é um meio sem soro, ou um meio sem soro suplementado com componentes definidos derivados de mamíferos, ou um meio sem componente derivado de animal, ou um meio sem proteína, um meio sem proteína suplementado com componentes definidos derivados de animal, ou um meio quimicamente definido, ou um meio sem componente derivado de mamíferos, ou um meio definido sem proteína.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o meio é o mesmo meio em todas as etapas e é um meio adequado para produção em larga escala da imunoglobulina heteróloga secretada.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa final de purificar a dita imunoglobulina heteróloga com uma ou mais etapas cromatográficas.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que a transfecção é realizada em etapas sequenciais de transfecção e seleção.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o vetor com o qual a célula CHO é transfectada e que compreende um ácido nucléico que confere resistência à um agente de seleção eucariótico também compreende um ácido nucléico que codifica a cadeia leve da dita imunoglobulina heteróloga e um ácido nucléico que codifica a cadeia pesada da dita imunoglobulina heteróloga, ou se o vetor compreende apenas um ácido nucléico que codifica tanto a cadeia leve da dita imunoglobulina quanto a cadeia pesada da dita imunoglobulina, a dita célula CHO é também transfectada com outro vetor compreendendo um ácido nucléico que codifica a outra cadeia da dita imunoglobulina correspondente.