JP2859679B2 - 新規細胞株 - Google Patents
新規細胞株Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は無血清無蛋白培地で培養できる新規チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞）のセルライン、
無血清無蛋白培地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタ
ミン非要求性を有する新規CHO細胞に関する。
ーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞）のセルライン、
無血清無蛋白培地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタ
ミン非要求性を有する新規CHO細胞に関する。
本発明で得られる細胞は有用蛋白質をコードする遺伝
子を導入する宿主細胞として利用できる。
子を導入する宿主細胞として利用できる。
従来の技術 動物細胞の大量培養はウィルス、ワクチンの製造さら
には白血球やハイブリドーマからインターフェロンやモ
ノクローナル抗体を生産するために利用されている。ま
た、近年では遺伝子組換え技術の進展に伴い、生体中に
存在する生理活性物質の天然型として蛋白質を生産でき
ることから、動物細胞を宿主とした有用蛋白質の生産が
注目され、大量培養技術の重要性が再認識されてきてい
る。
には白血球やハイブリドーマからインターフェロンやモ
ノクローナル抗体を生産するために利用されている。ま
た、近年では遺伝子組換え技術の進展に伴い、生体中に
存在する生理活性物質の天然型として蛋白質を生産でき
ることから、動物細胞を宿主とした有用蛋白質の生産が
注目され、大量培養技術の重要性が再認識されてきてい
る。
動物細胞の大量培養による有用物質生産の問題点の一
つとして、動物細胞の生育には基礎培地に血清を添加し
なければならないことがあげられる。血清は高価である
ばかりか、多種多様な蛋白質を含むため、目的蛋白質の
精製を複雑にする。またロット毎に品質が異なり、細胞
増殖への影響も大きい。そこで無血清培地さらには無蛋
白培地において増殖可能な細胞の開発が望まれている。
つとして、動物細胞の生育には基礎培地に血清を添加し
なければならないことがあげられる。血清は高価である
ばかりか、多種多様な蛋白質を含むため、目的蛋白質の
精製を複雑にする。またロット毎に品質が異なり、細胞
増殖への影響も大きい。そこで無血清培地さらには無蛋
白培地において増殖可能な細胞の開発が望まれている。
無血清培地を用いる方法としては、インスリン、トラ
ンスフェリン、セレンを含有する無血清培地でCHO細胞
を培養する方法〔イン ビトロ セルラー アンド デ
ベロップメンタルバイオロジー（in vitro Cellular ＆
Developmental Biology）、21巻、10号、588頁、1985
年〕、インスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェ
リン、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子を含有す
る無血清培地でHela栽培を培養する方法〔プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）U.S.A.、75巻、２号、9
01頁、1978年〕、インスリン、トランスフェリン、線維
芽細胞成長因子、フィブロネクチン、オレイン酸を含有
する無血清培地でBHK細胞を培養する方法〔ジャーナル
オブ セルラー フィジオロジー（Journal of Cellu
lar Physiology）114巻、215頁、1983年〕が知られてい
る。また無血清培地で生育可能な細胞としては、モノク
ローナル抗体生産マウスハイブリドーマ（特開昭58−63
385号）、インターフェロン生産ヒトバーキット腫瘍由
来ナマルバ細胞の馴化細胞（特開昭60−6190）、蛋白成
長因子としてインスリンのみを添加した培地で生育する
CHO細胞の馴化細胞（特開昭63−192381）などが知られ
ている。
ンスフェリン、セレンを含有する無血清培地でCHO細胞
を培養する方法〔イン ビトロ セルラー アンド デ
ベロップメンタルバイオロジー（in vitro Cellular ＆
Developmental Biology）、21巻、10号、588頁、1985
年〕、インスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェ
リン、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子を含有す
る無血清培地でHela栽培を培養する方法〔プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）U.S.A.、75巻、２号、9
01頁、1978年〕、インスリン、トランスフェリン、線維
芽細胞成長因子、フィブロネクチン、オレイン酸を含有
する無血清培地でBHK細胞を培養する方法〔ジャーナル
オブ セルラー フィジオロジー（Journal of Cellu
lar Physiology）114巻、215頁、1983年〕が知られてい
る。また無血清培地で生育可能な細胞としては、モノク
ローナル抗体生産マウスハイブリドーマ（特開昭58−63
385号）、インターフェロン生産ヒトバーキット腫瘍由
来ナマルバ細胞の馴化細胞（特開昭60−6190）、蛋白成
長因子としてインスリンのみを添加した培地で生育する
CHO細胞の馴化細胞（特開昭63−192381）などが知られ
ている。
成長因子の組合せにより種々の細胞の無血清培養が可
能となってきたが、成長因子の中には高価なものもあ
る。また大量培養による医薬品製造の観点から、成長因
子の中に微量でも異種蛋白が混入していることは好まし
くなく、使用する成長因子は非常に高純度であることが
要求される。
能となってきたが、成長因子の中には高価なものもあ
る。また大量培養による医薬品製造の観点から、成長因
子の中に微量でも異種蛋白が混入していることは好まし
くなく、使用する成長因子は非常に高純度であることが
要求される。
そこで無血清培地で増殖できかつ、無蛋白培地で増殖
可能な細胞が求められている。既に報告されている無血
清馴化細胞を無蛋白培地で培養することは困難で、細胞
の増殖が停止したり細胞生存率が著しく低下したりする
ため、物質の生産効率が良くない。
可能な細胞が求められている。既に報告されている無血
清馴化細胞を無蛋白培地で培養することは困難で、細胞
の増殖が停止したり細胞生存率が著しく低下したりする
ため、物質の生産効率が良くない。
無蛋白培地で増殖する細胞株としては勝田らによって
馴化された種々のP3株〔メソッズ イン セル バイオ
ロジー（Methods in Cell Biology）、６巻、1973年〕
がある。しかしいずれもCHO細胞ではなく、しかもグル
タミン要求性株である。
馴化された種々のP3株〔メソッズ イン セル バイオ
ロジー（Methods in Cell Biology）、６巻、1973年〕
がある。しかしいずれもCHO細胞ではなく、しかもグル
タミン要求性株である。
さらに、これらの細胞を培養する際には、培地成分の
少なくとも一つの成分の滅菌にフィルターを用いてお
り、微生物やウィルスなどの混入を厳密には否定しきれ
ない。これらの微生物やウィルスなどの混入を防ぐため
には、滅菌手段として加熱蒸煮滅菌を用いることが必要
であるが、蛋白性成分あるいは栄養源のグルタミンなど
が含まれていると加熱蒸煮滅菌によって熱変性や分解を
おこしてしまうので加熱蒸煮処理を施すことはできな
い。グルタミン非要求性細胞としては、無蛋白かつグル
タミン不含培地中で増殖する正常ラット肝細胞由来細胞
〔ドッキョー・ジャーナル・メディカル・サイエンス
（Dokkyo J.Med.Sci）、９巻、97−105頁、1982年〕、
蛋白質としてインスリン、トランスフェリンを必要とす
るがグルタミン不含培地で増殖するナマルバ細胞〔サイ
トテクノロジー（Cytotechnology）、１巻、151−158
頁、1988年〕、血清存在下でグルタミン非要求性にした
BHK21細胞アフリカミドリザルの細胞〔モーデン・アプ
ローチス・トゥー・アニマル・セル・テクノロジー（Mo
dern Approaches to Animal cell technology）〕、完
全蒸煮滅菌培地（無蛋白、無グルタミン培地）中で生育
するK562K1細胞〔第５回次世代産業基盤技術シンポジウ
ム予稿集、129−141頁、1987年〕が知られている。
少なくとも一つの成分の滅菌にフィルターを用いてお
り、微生物やウィルスなどの混入を厳密には否定しきれ
ない。これらの微生物やウィルスなどの混入を防ぐため
には、滅菌手段として加熱蒸煮滅菌を用いることが必要
であるが、蛋白性成分あるいは栄養源のグルタミンなど
が含まれていると加熱蒸煮滅菌によって熱変性や分解を
おこしてしまうので加熱蒸煮処理を施すことはできな
い。グルタミン非要求性細胞としては、無蛋白かつグル
タミン不含培地中で増殖する正常ラット肝細胞由来細胞
〔ドッキョー・ジャーナル・メディカル・サイエンス
（Dokkyo J.Med.Sci）、９巻、97−105頁、1982年〕、
蛋白質としてインスリン、トランスフェリンを必要とす
るがグルタミン不含培地で増殖するナマルバ細胞〔サイ
トテクノロジー（Cytotechnology）、１巻、151−158
頁、1988年〕、血清存在下でグルタミン非要求性にした
BHK21細胞アフリカミドリザルの細胞〔モーデン・アプ
ローチス・トゥー・アニマル・セル・テクノロジー（Mo
dern Approaches to Animal cell technology）〕、完
全蒸煮滅菌培地（無蛋白、無グルタミン培地）中で生育
するK562K1細胞〔第５回次世代産業基盤技術シンポジウ
ム予稿集、129−141頁、1987年〕が知られている。
しかし、CHO細胞の亜株で、無血清無蛋白培地に生育
し、さらにグルタミン不含培地でも生育できるという報
告は知られていない。
し、さらにグルタミン不含培地でも生育できるという報
告は知られていない。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、無血清無蛋白培地で２ヶ月以上増殖
継代できる新規CHO細胞のセルライン、無血清無蛋白培
地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタミン非要求性を
有する新規CHO細胞を提供することにある。
継代できる新規CHO細胞のセルライン、無血清無蛋白培
地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタミン非要求性を
有する新規CHO細胞を提供することにある。
課題を解決するための手段 本発明によれば、無血清無蛋白培地で２ヶ月以上増殖
継代できる新規CHO細胞のセルライン、無血清無蛋白培
地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタミン非要求性を
有する新規CHO細胞を提供することができる。
継代できる新規CHO細胞のセルライン、無血清無蛋白培
地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタミン非要求性を
有する新規CHO細胞を提供することができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
１）馴化の方法 馴化するための親株としては、チャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞（Chinese hamster ovary cell:CHO細胞）
由来の細胞で無血清培地に増殖継代困難な細胞であれ
ば、いずれの細胞でも用いることができる。好適な例と
しては、CHO−K1株（ATCC CCL61）の亜株であるCHO細胞
由来のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株CHO細胞d-DXB11株
〔プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、77
巻、4216−4220頁、1980年、ディー・エヌ・エー（DN
A）３巻、297−308頁、1984年〕があげられる。
ター卵巣細胞（Chinese hamster ovary cell:CHO細胞）
由来の細胞で無血清培地に増殖継代困難な細胞であれ
ば、いずれの細胞でも用いることができる。好適な例と
しては、CHO−K1株（ATCC CCL61）の亜株であるCHO細胞
由来のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株CHO細胞d-DXB11株
〔プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、77
巻、4216−4220頁、1980年、ディー・エヌ・エー（DN
A）３巻、297−308頁、1984年〕があげられる。
CHO細胞は本来付着性細胞であるが、馴化させるには
浮遊培養法を利用するのが好ましい。
浮遊培養法を利用するのが好ましい。
浮遊培養において、細胞播種濃度は0.5〜８×105個/m
l程度が好ましく、培養中この濃度を維持することが好
ましい。また培地のpHが6.5以下にならないように、培
地中の栄養源が枯渇しないように、定期的に培地を交換
する必要がある。培地を交換する時点で細胞数が著しく
低下している場合は、遠心分離や上清除去により濃縮
し、逆に細胞数が向上している場合は希釈して細胞数を
調整する。とくに馴化開始初期は細胞数の著しい低下を
伴う場合がある。馴化期間は２ヶ月以上を要する。
l程度が好ましく、培養中この濃度を維持することが好
ましい。また培地のpHが6.5以下にならないように、培
地中の栄養源が枯渇しないように、定期的に培地を交換
する必要がある。培地を交換する時点で細胞数が著しく
低下している場合は、遠心分離や上清除去により濃縮
し、逆に細胞数が向上している場合は希釈して細胞数を
調整する。とくに馴化開始初期は細胞数の著しい低下を
伴う場合がある。馴化期間は２ヶ月以上を要する。
CHO細胞d-DXB11株を例に、具体的な馴化方法を示す。
１−１）無血清培地への馴化方法 CHO細胞d-DXB11株を種細胞とし、付着状態ではほぼ接
触阻止の起こる細胞数（４×105個/ml）を、血清の代わ
りに血清代替物を添加した基礎培地（40ml）に播種す
る。これを37℃で２〜４日間培養する。その後浮遊状態
で生育している細胞を1500rpmで５分間遠心分離し、新
鮮基礎培地（40ml）に再懸濁する。
触阻止の起こる細胞数（４×105個/ml）を、血清の代わ
りに血清代替物を添加した基礎培地（40ml）に播種す
る。これを37℃で２〜４日間培養する。その後浮遊状態
で生育している細胞を1500rpmで５分間遠心分離し、新
鮮基礎培地（40ml）に再懸濁する。
このような操作を繰返すことにより、馴化株の生育が
安定し生存率が向上する。馴化株の生存率が、親株を通
常生育可能な培地で培養したときの生存率に近づくまで
この馴化操作を２ヶ月以上繰返し続ける。
安定し生存率が向上する。馴化株の生存率が、親株を通
常生育可能な培地で培養したときの生存率に近づくまで
この馴化操作を２ヶ月以上繰返し続ける。
基礎培地としては、動物細胞培養に用いられる一般的
な培地を使用することができる。たとえばRPMI−1640、
MEM、ダルベッコMEM、ハムF12、ハムF10、DM160、DM170
（極東製薬社製）、ダルベッコMEMおよびハムF12の1:1
混合培地、RPMI−1640、ダルベッコMEMおよびハムF12の
2:1:1混合培地などをあげることができる。
な培地を使用することができる。たとえばRPMI−1640、
MEM、ダルベッコMEM、ハムF12、ハムF10、DM160、DM170
（極東製薬社製）、ダルベッコMEMおよびハムF12の1:1
混合培地、RPMI−1640、ダルベッコMEMおよびハムF12の
2:1:1混合培地などをあげることができる。
血清代替物として、トランスフェリン0.1〜100μg/m
l、好ましくは１〜10μg/ml、インスリン0.1〜100μg/m
l、好ましくは１〜10μg/ml、葉酸0.1〜100μg/ml、好
ましくは１〜10μg/ml、亜セレン酸0.1〜100×10-8M、
好ましくは１〜10×10-8M、ペポールＢ−188（東邦千葉
化学工業社製）0.001〜10％、好ましくは0.01〜１％、
ジメチル−αまたはβ−シクロデキストリン（東進ケミ
カル社製）１μｇ〜10mg/ml、好ましくは10〜100μg/m
l、ポリエチレングリコール20000 0.01〜10％、好まし
くは0.01〜0.1％を組み合わせて用いる。
l、好ましくは１〜10μg/ml、インスリン0.1〜100μg/m
l、好ましくは１〜10μg/ml、葉酸0.1〜100μg/ml、好
ましくは１〜10μg/ml、亜セレン酸0.1〜100×10-8M、
好ましくは１〜10×10-8M、ペポールＢ−188（東邦千葉
化学工業社製）0.001〜10％、好ましくは0.01〜１％、
ジメチル−αまたはβ−シクロデキストリン（東進ケミ
カル社製）１μｇ〜10mg/ml、好ましくは10〜100μg/m
l、ポリエチレングリコール20000 0.01〜10％、好まし
くは0.01〜0.1％を組み合わせて用いる。
さらに添加物として、ヘペス緩衝液１〜300mM、好ま
しくは５〜25mM、グルタミン0.5〜10mM、好ましくは１
〜5mM、硫酸第一鉄0.1〜100μＭ、好ましくは５〜50μ
Ｍ、MEM用非必須アミノ酸混合液0.1〜25ml/100ml、好ま
しくは１〜10ml/100mlを組み合わせて用いる。
しくは５〜25mM、グルタミン0.5〜10mM、好ましくは１
〜5mM、硫酸第一鉄0.1〜100μＭ、好ましくは５〜50μ
Ｍ、MEM用非必須アミノ酸混合液0.1〜25ml/100ml、好ま
しくは１〜10ml/100mlを組み合わせて用いる。
このようにして無血清培地で生育可能なCHO細胞を得
ることができる。得られた細胞をCHO細胞KJM−１株と命
名する。
ることができる。得られた細胞をCHO細胞KJM−１株と命
名する。
CHO細胞KJM−１株は接着非依存性を有し、無血清培地
に浮遊状態で生育可能である。
に浮遊状態で生育可能である。
１−２）無血清無蛋白培地への馴化方法 先に得られた無血清馴化CHO細胞KJM−１株を種細胞と
し、４×105個/ml程度の細胞密度で、１−１）で使用し
た無血清培地からトランスフェリンおよびインスリンを
除いた組成からなる無血清無蛋白培地（40ml）に播種す
る。これを37℃で２〜４日間培養する。その後浮遊状態
で生育している細胞を1500rpmで５分間遠心分離し、上
記の新鮮培地（40ml）に再懸濁する。
し、４×105個/ml程度の細胞密度で、１−１）で使用し
た無血清培地からトランスフェリンおよびインスリンを
除いた組成からなる無血清無蛋白培地（40ml）に播種す
る。これを37℃で２〜４日間培養する。その後浮遊状態
で生育している細胞を1500rpmで５分間遠心分離し、上
記の新鮮培地（40ml）に再懸濁する。
このような操作を繰返すことにより、馴化株の生育が
安定し生存率が向上する。馴化株の生存率が親株を通常
生育可能な培地で培養したときの生存率に近づくまでこ
の馴化操作を２ヶ月以上繰返し続ける。
安定し生存率が向上する。馴化株の生存率が親株を通常
生育可能な培地で培養したときの生存率に近づくまでこ
の馴化操作を２ヶ月以上繰返し続ける。
基礎培地、血清代替物およびその他の添加物はトラン
スフェリンおよびインスリンを除き、前記したものと同
じものを用いることができる。
スフェリンおよびインスリンを除き、前記したものと同
じものを用いることができる。
このようにして無血清無蛋白培地で２ヶ月以上生育可
能なCHO細胞を得ることができる。得られた細胞をCHO細
胞KJM−1PF株と命名する。
能なCHO細胞を得ることができる。得られた細胞をCHO細
胞KJM−1PF株と命名する。
２）グルタミン非要求性の付与 得られた無血清無蛋白馴化CHO細胞KJM−1PF株を、１
−２）で使用した無血清無蛋白培地組成のグルタミンの
代わりに過剰のグルタミン酸を添加した培地で培養する
ことにより、CHO細胞KJM−1PF株にグルタミン非要求性
を付与することができる。
−２）で使用した無血清無蛋白培地組成のグルタミンの
代わりに過剰のグルタミン酸を添加した培地で培養する
ことにより、CHO細胞KJM−1PF株にグルタミン非要求性
を付与することができる。
過剰のグルタミン酸とは、一般的な培地に含有されて
いるグルタミン酸含量の10〜30倍程度であり、とくに20
倍程度を培地に含有させるのが好ましい。
いるグルタミン酸含量の10〜30倍程度であり、とくに20
倍程度を培地に含有させるのが好ましい。
実施例３においては、グルタミンの代わりにグルタミ
ンと同当量のグルタミン酸（一般的に培地に含有されて
いるグルタミン酸の20倍）を含有させた。
ンと同当量のグルタミン酸（一般的に培地に含有されて
いるグルタミン酸の20倍）を含有させた。
このようにして無血清無蛋白培地で２ヶ月以上生育可
能でかつグルタミン非要求性を有するCHO細胞を得るこ
とができる。得られた細胞をCHO細胞KJT−１株と命名す
る。
能でかつグルタミン非要求性を有するCHO細胞を得るこ
とができる。得られた細胞をCHO細胞KJT−１株と命名す
る。
CHO細胞KJT−１株は、ブダペスト条約に基づき平成２
年２月27日付で工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第2776号（FERM BP−2776）として寄託されてい
る。
年２月27日付で工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第2776号（FERM BP−2776）として寄託されてい
る。
CHO細胞KJT−１株の完全蒸煮滅菌培地での生育及びグ
ルタミン非要求性の確認については、直線的な証明方法
として培養液中のグルタミンをアミノ酸自動分析機JLC
−200A（日本電子社製）によって分析する方法がある。
あらかじめ含まれていない成分であるグルタミンを培養
上清中に検出することもあるが、CHO細胞KJT−１株を培
養して得られた培養液を分析した結果、グルタミンの含
有は確認されなかった。間接的な証明方法としては、CH
O細胞KJT−１株の増殖曲線とグルタミン合成酵素の誘導
によって証明する方法がある。
ルタミン非要求性の確認については、直線的な証明方法
として培養液中のグルタミンをアミノ酸自動分析機JLC
−200A（日本電子社製）によって分析する方法がある。
あらかじめ含まれていない成分であるグルタミンを培養
上清中に検出することもあるが、CHO細胞KJT−１株を培
養して得られた培養液を分析した結果、グルタミンの含
有は確認されなかった。間接的な証明方法としては、CH
O細胞KJT−１株の増殖曲線とグルタミン合成酵素の誘導
によって証明する方法がある。
これらの結果により、蒸煮滅菌した培地にはグルタミ
ンがまったく含有されず、CHO細胞KJT−１株がグルタミ
ンをまったく含有しない培地でも生育可能であることが
証明される。
ンがまったく含有されず、CHO細胞KJT−１株がグルタミ
ンをまったく含有しない培地でも生育可能であることが
証明される。
以下に本発明の実施例および参考例を示す。
実施例１ 無血清培地馴化株の育成 ハムF12を基礎培地として、トランスフェリン10μg/m
l、インスリン10μg/ml、葉酸10μg/ml、亜セレン酸1.2
5×10-8M、ペポールＢ−188 0.1％、ヘペス緩衝液7.5m
M、グルタミン2mM、硫酸第一鉄10μＭ、MEM用非必須ア
ミノ酸混合液10ml/100mlおよび重曹0.15％を加えた無血
清培地（以下、培地ａという。）40mlを75cm2の培養フ
ラスコへ入れ、そこへCHO細胞d-DXB11株（血清依存性）
を４×105個/ml程度の細胞密度で播種した。
l、インスリン10μg/ml、葉酸10μg/ml、亜セレン酸1.2
5×10-8M、ペポールＢ−188 0.1％、ヘペス緩衝液7.5m
M、グルタミン2mM、硫酸第一鉄10μＭ、MEM用非必須ア
ミノ酸混合液10ml/100mlおよび重曹0.15％を加えた無血
清培地（以下、培地ａという。）40mlを75cm2の培養フ
ラスコへ入れ、そこへCHO細胞d-DXB11株（血清依存性）
を４×105個/ml程度の細胞密度で播種した。
37℃で３日間静置培養した後、浮遊状態で生育してく
る細胞を1500rpmで５分間遠心分離して集め、前記と同
じ組成からなる新鮮無血清培地40mlに再懸濁した。
る細胞を1500rpmで５分間遠心分離して集め、前記と同
じ組成からなる新鮮無血清培地40mlに再懸濁した。
細胞は継代するにしたがって生存率が低下した。培養
を開始してから７日目には生存率は７％まで低下した
が、そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の生存
率が向上した。培養を開始してから２ヶ月後には生存率
80％以上に回復し、細胞数も１×106個/ml程度まで増殖
可能となった。以後、培養を開始してから17ヶ月以上安
定した増殖を示している。
を開始してから７日目には生存率は７％まで低下した
が、そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の生存
率が向上した。培養を開始してから２ヶ月後には生存率
80％以上に回復し、細胞数も１×106個/ml程度まで増殖
可能となった。以後、培養を開始してから17ヶ月以上安
定した増殖を示している。
このようにして無血清培地馴化株であるCHO細胞KJM−
１株が得られた。
１株が得られた。
実施例２ 無血清無蛋白培地馴化株の育成 ハムF12を基礎培地とし、亜セレン酸1.25×10-8M、ペ
ポールＢ−188 0.1％、ヘペス緩衝液7.5mM、グルタミ
ン2mM、硫酸第一鉄10μＭ、MEM用非必須アミノ酸混合液
10ml/100mlおよび重曹0.15％を添加した無血清無蛋白培
地（以下、培地ｂという。）40mlを75cm2の培養フラス
コへ入れ、そこへCHO細胞KJM−１株を４×105個/ml程度
の細胞密度で播種した。37℃で３日間静置培養した後、
浮遊状態で生育している細胞を1500rpmで５分間遠心分
離して集め、前記と同じ組成からなる新鮮無血清無蛋白
培地40mlに再懸濁した。
ポールＢ−188 0.1％、ヘペス緩衝液7.5mM、グルタミ
ン2mM、硫酸第一鉄10μＭ、MEM用非必須アミノ酸混合液
10ml/100mlおよび重曹0.15％を添加した無血清無蛋白培
地（以下、培地ｂという。）40mlを75cm2の培養フラス
コへ入れ、そこへCHO細胞KJM−１株を４×105個/ml程度
の細胞密度で播種した。37℃で３日間静置培養した後、
浮遊状態で生育している細胞を1500rpmで５分間遠心分
離して集め、前記と同じ組成からなる新鮮無血清無蛋白
培地40mlに再懸濁した。
細胞は継代するにしたがって生存率が低下した。培養
を開始してから７日目には生存率は20％まで低下した
が、そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の生存
率が向上した。培養を開始してから２ヶ月後には、生存
率80％以上に回復し、細胞数も１×106個/ml程度まで増
殖可能となった。
を開始してから７日目には生存率は20％まで低下した
が、そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の生存
率が向上した。培養を開始してから２ヶ月後には、生存
率80％以上に回復し、細胞数も１×106個/ml程度まで増
殖可能となった。
このようにして無血清無蛋白培地馴化株であるCHO細
胞KJM−1PF株が得られた。
胞KJM−1PF株が得られた。
実施例３ グルタミン非要求性の付与 実施例２で用いた無血清無蛋白培地組成のグルタミン
2mMの代わりにグルタミン酸4mMを加えた培地（40ml）
に、実施例２で得られたCHO細胞KJM−1PF株を播種し、3
7℃で３日間培養した。
2mMの代わりにグルタミン酸4mMを加えた培地（40ml）
に、実施例２で得られたCHO細胞KJM−1PF株を播種し、3
7℃で３日間培養した。
このようにして無血清無蛋白培地に２ヶ月以上増殖継
代できかつグルタミン非要求性を有するCHO細胞KJT−１
株が得られた。
代できかつグルタミン非要求性を有するCHO細胞KJT−１
株が得られた。
参考例１ グルタミン非要求性の付与の確認 ハムF12を基礎培地とし、亜セレン酸1.25×10-8M、ペ
ポールＢ−188 0.1％、ヘペス緩衝液7.5mM、硫酸第一
鉄10μＭ、グルタミン酸4mM、MEM用非必須アミノ酸混合
液10ml/100mlを添加した無血清無蛋白培地40mlを蒸煮滅
菌し、さらに使用時に別途蒸煮滅菌した重曹を0.15％に
なるように添加した培地（以下培地ｃという。）で、CH
O細胞KJT−１株37℃で培養した。
ポールＢ−188 0.1％、ヘペス緩衝液7.5mM、硫酸第一
鉄10μＭ、グルタミン酸4mM、MEM用非必須アミノ酸混合
液10ml/100mlを添加した無血清無蛋白培地40mlを蒸煮滅
菌し、さらに使用時に別途蒸煮滅菌した重曹を0.15％に
なるように添加した培地（以下培地ｃという。）で、CH
O細胞KJT−１株37℃で培養した。
その結果を第３図に示す。
参考例２ 細胞内グルタミン合成酵素活性の比較 培地ｃでCHO細胞d-DXB11株およびCHO細胞KJT−１株を
それぞれ37℃で４日間培養した。
それぞれ37℃で４日間培養した。
培地ｂを過滅菌した培地でCHO細胞d-DXB11株および
CHO細胞KJM−1PF株をそれぞれ37℃で４日間培養した。
CHO細胞KJM−1PF株をそれぞれ37℃で４日間培養した。
培養後それぞれの細胞内のグルタミン合成酵素活性を
比較した。結果を第１表に示す。
比較した。結果を第１表に示す。
発明の効果 本発明によれば、無血清無蛋白培地で２ヶ月以上増殖
継代できる新規CHO細胞のセルラインおよび無血清無蛋
白培地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタミン非要求
性を有する新規CHO細胞を提供することができる。
継代できる新規CHO細胞のセルラインおよび無血清無蛋
白培地に２ヶ月以上増殖継代できかつグルタミン非要求
性を有する新規CHO細胞を提供することができる。
第１図は、CHO細胞KJM−１株を37℃下、培地ａで培養し
たときの細胞増殖曲線およびCHO細胞d-DXB11株を37℃
下、培地ａ組成中トランスフェリンおよびインスリンの
代わりに５％牛胎児血清を添加した培地で培養したとき
の増殖曲線を示す。図中、白丸実線はCHO細胞KJM−１
株、黒丸実線はCHO細胞d-DXB11株の増殖曲線である。 第２図は、CHO細胞KJM−1PF株を37℃下、培地ｂで培養
したときの増殖曲線を示す。 第３図は、CHO細胞KJT−１株を37℃下、培地ｃで培養し
たときの増殖曲線を示す。 いずれの図も縦軸は生細胞数（１×105cells/ml）、横
軸は培養日数を表わす。
たときの細胞増殖曲線およびCHO細胞d-DXB11株を37℃
下、培地ａ組成中トランスフェリンおよびインスリンの
代わりに５％牛胎児血清を添加した培地で培養したとき
の増殖曲線を示す。図中、白丸実線はCHO細胞KJM−１
株、黒丸実線はCHO細胞d-DXB11株の増殖曲線である。 第２図は、CHO細胞KJM−1PF株を37℃下、培地ｂで培養
したときの増殖曲線を示す。 第３図は、CHO細胞KJT−１株を37℃下、培地ｃで培養し
たときの増殖曲線を示す。 いずれの図も縦軸は生細胞数（１×105cells/ml）、横
軸は培養日数を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】血清および蛋白を含有しない培地（以下、
無血清無蛋白培地という。）で２ヶ月以上増殖継代でき
る新規チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞）
のセルライン。 - 【請求項２】無血清無蛋白培地に２ヶ月以上増殖継代で
きかつグルタミン非要求性を有する新規CHO細胞。 - 【請求項３】無血清無蛋白培地が完全蒸煮滅菌された培
地である請求項（２）記載の新規CHO細胞。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2050076A JP2859679B2 (ja) | 1990-03-01 | 1990-03-01 | 新規細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2050076A JP2859679B2 (ja) | 1990-03-01 | 1990-03-01 | 新規細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03254679A JPH03254679A (ja) | 1991-11-13 |
| JP2859679B2 true JP2859679B2 (ja) | 1999-02-17 |
Family
ID=12848919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2050076A Expired - Fee Related JP2859679B2 (ja) | 1990-03-01 | 1990-03-01 | 新規細胞株 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2859679B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US8021881B2 (en) | 1999-09-28 | 2011-09-20 | Baxter Innovations Gmbh | Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells |
| US8080414B2 (en) | 1997-06-20 | 2011-12-20 | Baxter Innovations Gmbh | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| US8440408B2 (en) | 2004-10-29 | 2013-05-14 | Baxter International Inc. | Animal protein-free media for cultivation of cells |
| US9758568B2 (en) | 2006-01-04 | 2017-09-12 | Baxalta GmbH | Oligopeptide-free cell culture media |
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|---|---|---|---|---|
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| EP2592147A1 (en) * | 2007-10-12 | 2013-05-15 | F. Hoffmann-La Roche AG | Protein expression from multiple nucleic acids |
-
1990
- 1990-03-01 JP JP2050076A patent/JP2859679B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (21)
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| US8084252B2 (en) | 1997-06-20 | 2011-12-27 | Baxter Innovations Gmbh | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
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| USRE46897E1 (en) | 1997-06-20 | 2018-06-19 | Baxalta Incorporated | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
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| US9222075B2 (en) | 2004-10-29 | 2015-12-29 | Baxalta Incorporated | Animal protein-free media for cultivation of cells |
| US8440408B2 (en) | 2004-10-29 | 2013-05-14 | Baxter International Inc. | Animal protein-free media for cultivation of cells |
| US10138461B2 (en) | 2004-10-29 | 2018-11-27 | Baxalta GmbH | Animal protein-free media for cultivation of cells |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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