BRPI0708970A2

BRPI0708970A2 - método para o tratamento de um sujeito com uma doença ou transtorno caracterizado por depósito amilóide de a-beta; método de inibição ou redução da acumulação de depósito amilóide de a-beta em um sujeito; método de inibição ou redução da neurodegeneração em um sujeito; e método de inibição ou redução do declìnio cognitivo, ou de melhora da cognição, em um sujeito

Info

Publication number: BRPI0708970A2
Application number: BRPI0708970-8A
Authority: BR
Inventors: Jack Steven Jacobsen; Xiang-Yang Tan; Lioudmila Tchistiakova; Sreekumar Raman Kodangattil; Angela Widom
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2006-03-21
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2011-06-21
Also published as: NO20084039L; MX2008012023A; EP2004694A2; CA2646643A1; RU2008134135A; CR10298A; WO2007109749A3; KR20080113236A; EP2001907A2; US20070253950A1; AU2007226863A1; WO2007109747A2; AU2007226861A1; NO20083720L; RU2008137764A; CA2638755A1; MX2008011933A; WO2007109747A3; BRPI0708998A2; KR20080110833A

Abstract

MéTODO PARA O TRATAMENTO DE UM SUJEITO COM UMA DOENçA OU TRANSTORNO CARACTERIZADO POR DEPóSITO AMILóIDE DE A-BETA; MéTODO DE INIBIçAO OU REDUçAO DA ACUMULAçAO DE DEPóSITO AMILóIDE DE A-BETA EM UM SUJEITO; MéTODO DE INIBIçãO OU REDUçãO DA NEURODEGENERAçAO EM UM SUJEITO; E MéTODO DE INIBIçAO OU REDUçAO DO DECLìNIO COGNITIVO, OU DE MELHORA DA COGNIçAO, EM UM SUJEITO Método para tratamento de uma doença ou transtorno caracterizado por depósito amilóide de A- beta, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se ligue especificamente a RAGE e iniba a ligação de um parceiro de ligação a RAGE.

Description

"MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UM SUJEITO COMUMA DOENÇA OU TRANSTORNO CARACTERIZADO POR DEPÓSITOAMILÓIDE DE A-BETA; MÉTODO DE INIBIÇÃO OU REDUÇÃO DAACUMULAÇÃO DE DEPÓSITO AMILÓIDE DE A-BETA EM UMSUJEITO; MÉTODO DE INIBIÇÃO OU REDUÇÃO DANEURODEGENERAÇÃO EM UM SUJEITO; E MÉTODO DE INIBIÇÃO OUREDUÇÃO DO DECLÍNIO COGNITIVO, OU DE MELHORA DACOGNIÇÃO, EM UM SUJEITO"

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

Reivindica-se a prioridade, de acordo com 35U.S.C. §119(e), do Pedido de Patente Norte-americanaProvisória n° 60/895.303, depositado em 16 de março de2007, e Pedido de Patente Norte-americana Provisória n°60/784.575, depositado em 21 de março de 2006, cujosconteúdos são aqui incorporados por referência em suainteireza.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere genericamente aanticorpos e seus fragmentos que se ligamespecificamente a produtos finais da glicação avançada(RAGE), a métodos em que esses anticorpos e seusfragmentos sejam administrados a pacientes humanos emamíferos não humanos para tratar ou prevenir doenças etranstornos relacionados a RAGE.FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A doença de Alzheimer (AD) é um transtornoneurodegenerativo progressivo, por fim fatal, que afetaprincipalmente os idosos. É a forma mais comum dedemência e está tipicamente associada à perda gradualde cognição (memória, raciocínio, orientação ejulgamento) e à progressão de inúmeros transtornoscomportamentais. A doença tende a se dividir em duascategorias: início tardio, que ocorre em idade avançada(65+ anos), e início precoce, que se desenvolve bemantes do período senil, isto é, entre 35 e 60 anos. Emambos os tipos da doença, a patologia é a mesma, mas asanormalidades tendem a ser mais graves e disseminadasem casos que começam em uma idade mais precoce. Adoença se caracteriza por pelo menos dois tipos delesões no cérebro: entrelaçamentos neurofibrilares eplacas senis. Entrelaçamentos neurofibrilares sãodepósitos intracelulares de proteína tau associada amicrotúbulos consistindo em dois filamentos torcidosentre si em pares. Placas senis (isto é, placasamilóides) são áreas de filamentos de neuropiladesorganizados de até 150 μιτι de diâmetro, com depósitosamilóides extracelulares no centro, que são visíveispor análise microscópica de seções de tecido cerebral.O acúmulo de placas amilóides no cérebro também estáassociado à síndrome de Down e outros transtornoscognitivos, como amiloidose de amilóide A sérica (SAA)e encefalopatias espongiformes.

Um peptidio chamado de peptidio β-amilóide ouΑβ é o principal constituinte das placas amilóides, ese acredita que desempenho um papel fundamental napatogênese de AD. Αβ é um fragmento interno hidrofóbicode 4-kDa de 39-43 resíduos de aminoácidos de umaglicoproteína transmembrana maior chamada de proteínaprecursora de amilóide (APP). Como resultado doprocessamento proteolítico de APP por β-secretase e γ-secretase, Αβ é principalmente encontrado tanto em umaforma curta, 40 aminoácidos de comprimento, quanto emuma forma longa, variando de 42-43 aminoácidos decomprimento. 0 acúmulo de placas amilóides no cérebroleva, por fim, à morte de células neuronais. Acredita-se que os déficits e sintomas físicos característicosda doença de Alzheimer (AD) resultem, pelo menos emparte, da deterioração neural causada pelos efeitosneurotóxicos de Αβ. A redução dos níveis de Αβ pelainibição da produção de Αβ ou aumento da depuração deΑβ é uma estratégia de modificação de doença amplamentereconhecida para a doença de Alzheimer.Várias mutações na proteína APP foramcorrelacionadas à presença de doença de Alzheimer.Exemplos dessas mutações incluem valina717 porisoleucina, glicine ou fenilalanina, e uma duplamutação que troca lisina595-metionina596 porasparagina595-leucina596 . Acredita-se que essas mutaçõescausem doença de Alzheimer por um processamentoaumentado ou alterado de APP em Αβ, particularmente oprocessamento de APP em quantidades aumentadas da formalonga de Αβ (isto é, Αβ1-42 e Αβ1-43). Acredita-se quemutações em outros genes, como os genes de presenilina,PSl e PS2, afetem indiretamente o processamento de APP,gerando quantidades aumentadas da forma longa de Αβ.

Modelos em camundongos foram usados comsucesso para determinar o significado de placasamilóides na doença de Alzheimer (Games et al. , 1995,Nature, 373:523; Johnson-Wood et al., 1997, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 94:1550). Em particular, quandocamundongos transgênicos PDAPP, que expressam uma formamutante de APP humana e desenvolvem doença de Alzheimerem idade jovem, são injetados com a forma longa de Αβ,apresentam tanto uma diminuição na progressão da doençade Alzheimer, quanto um aumento nos títulos deanticorpos para o peptídio Αβ (Schenk et al. , 1999,Nature, 400:173). As observações acima discutidasindicam que Αβ, particularmente em sua forma longa, é oelemento causador da doença de Alzheimer.

O peptidio Αβ pode existir em solução e pode ser detectado no SNC (por exemplo, FCE) e plasma. Sobcertas condições Αβ solúvel é transformado em formas defolha β fibrilares tóxicas em nas placas neuriticas evasos sangüíneos cerebrais de pacientes com AD.Tratamentos envolvendo a imunização com anticorposmonoclonais contra Αβ foram investigados. Tanto aimunização ativa, quanto a passiva foram testadas emmodelos em camundongos de AD. A imunização ativaresultou em alguma redução na carga de placas nocérebro, mas apenas quando administrada por via nasal.

A imunização passiva de camundongos transgênicos PDAPPtambém foi investigada (Bard, et al. , 2000, NatureMed., 6:916-19). Dois mecanismos são propostos para umadepuração eficaz, isto é, degradação central edegradação periférica. O mecanismo de degradaçãocentral se baseia em anticorpos capazes de cruzar abarreira hematoencefálica, ligarem-se às placas eindureza a depuração de placas pré-existentes.Demonstrou-se que a depuração é promovida porfagocitose mediada por receptor Fc (Bard, et al.,supra). O mecanismo de degradação periférica dadepuração de Αβ se baseia na ruptura do equilíbriodinâmico de Αβ entre o cérebro, FCE e plasma com aadministração do anticorpo, levando ao transporte de Αβde um compartimento par aoutro. Αβ derivadocentralmente é transportado para o FCE e plasma, onde édegradado. Estudos recentes sugeriram que Αβ solúvel enão ligado estão envolvidos na perda de memóriaassociada à AD, mesmo sem redução nos depósitosamilóides no cérebro. (Dodel, et al., 2003, The Lancet,2:215).

O receptor para produtos finais da glicaçãoavançada (RAGE) é um membro de superfície celular demultiligantes da superfamília de imunoglobulinas. RAGEconsiste em um domínio extracelular, um único domínioatravés da membrana e uma cauda citosólica. O domínioextracelular do receptor consiste em um domínio deimunoglobulina do tipo V seguido por dois domínios deimunoglobulina do tipo C. RAGE também existe em umaforma solúvel (sRAGE). RAGE é expressado por muitostipos de células, por exemplo, células endoteliais e demúsculo liso. macrófagos e linfócitos, em muitostecidos diferentes, incluindo pulmão, coração, rim,músculo esquelético e cérebro. A expressão estáaumentada em estados inflamatórios crônicos, comoartrite reumatóide e nefropatia diabética. Embora suafunção fisiológica não seja clara, está envolvido naresposta inflamatória e pode ter um papel em diversosprocessos de desenvolvimento, incluindo diferenciaçãomioblástica e desenvolvimento neural.

RAGE é um receptor de reconhecimento depadrão incoraum, que se liga a várias classes diferentesde moléculas endógenas, levando a várias respostascelulares, incluindo secreção de citocina, estresseoxidativo celular aumentado, crescimento de neuritos emigração celular. Demonstrou-se que RAGE tem um papelpatogênico ativo em uma ampla gama de doenças etranstornos amiloidogênicos.

Há necessidade de novas terapias e reagentespara o tratamento de doença de Alzheimer e outrasdoenças amilodogênicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção apresenta métodos detratamento de um sujeito com uma doença ou transtornocaracterizado por depósito amilóide de Αβ, poradministração de uma quantidade terapeuticamente eficazde um anticorpo que se ligue especificamente a RAGE(isto é, anticorpos anti-RAGE) e inibe a ligação de umparceiro de ligação a RAGE. As doenças ou transtornostratáveis As doenças ou transtornos tratáveis pelosmétodos expostos podem ser caracterizados por depósitoamilóide de Αβ no cérebro, como o que ocorre na doençade Alzheimer. Anticorpos anti-RAGE conforme aquidescritos também podem ser usados para inibir oureduzir o acúmulo de depósito amilóide de Αβ em umsujeito, para inibir ou reduzir a neurodegeneração emum sujeito, para inibir oú reduzir o declínio cognitivoem um sujeito e/ou para melhorar a cognição em umsujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As FIGS. 1A-1C mostram seqüências deaminoácidos alinhadas de RAGE de camundongo, rato,coelho (2 isoformas), babuíno, macaco cinomolgo e serhumano (SEQ ID NOs: 3, 14, 11, 13, 7, 9, 1).

A FIG. 2 é um gráfico de dados de ELISA deligação direta que demonstram a ligação de XT-H2 ahRAGE com EC50 de 90 pM e a ligação de XT-M4 a hRAGE-Fccom EC50 de 300 pM.

A FIG. 3 é um gráfico de dados de análiseELISA de ligação direta que demonstram a ligação deanticorpos XT-M4 e XT-H2 ao domínio Fc de hRAGE V comEC50 de 100 pM.A FIG. 4 é um gráfico de dados de ensaios deligação ELISA de competição de ligantes, mostrando acapacidade de XT-H2 e XT-M4 de bloquearem a ligação deHMGl a hRAGE-Fc.

A FIG. 5 é um gráfico de dados de ensaios deligação ELISA de competição de anticorpos, mostrandoque XT-H2 e XT-M4 compartilham um epitopo similar e seligam a sitios superpostos em RAGE humano.

A FIG. 6 mostra seqüências de aminoácidosalinhadas de regiões variáveis de cadeia pesada deanticorpos murideos anti-RAGE XT-Hlf XT-H2, XT-H3, XT-H5 e XT-H7 e de anticorpo anti-RAGE de rato XT-M4 (SEQID NOs: 18, 21, 24, 20, 26, 16).

A FIG. 7 mostra seqüências de aminoácidosalinhadas de regiões variáveis de cadeia leve deanticorpos murideos anti-RAGE XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5 e XT-H7 e de anticorpo anti-RAGE de rato XT-M4 (SEQID NOs: 19, 22, 25, 23, 27, 17) .

A FIG. 8 mostra a seqüência de nucleotideosdo cDNA que codifica RAGE de babuino (SEQ ID NO: 6).

A FIG. 9 mostra a seqüência de nucleotideosdo cDNA que codifica RAGE de macaco cinomolgo (SEQ IDNO: 8).A FIG. 10 mostra a seqüência de nucleotídeosdo c DNA que codifica a isoforma 1 de RAGE de coelho(SEQ ID NO:10).

A FIG. 11 mostra a seqüência de nucleotideosdo cDNA que codifica a isoforma 2 de RAGE de coelho(SEQ ID NO: 12).

As FIGS. 12A-12E mostram a seqüência denucleotideos de DNA genômico de babuino clonado quecodifica RAGE de babuino (clone 18.2) (SEQ ID NO: 15).

A FIG. 13 apresenta quatro gráficos mostrandoas capacidades de anticorpo XT-M4 quimérico e anticorpoXT-M4 de rato de bloquearem a ligação de ligantes deRAGE HMGBl, peptídio 1-42 de amilóide β, S100-A e S100-B a hRAGE-Fc, conforme determinado por ensaio deligação ELISA de competição.

A FIG. 14 apresenta gráficos mostrando acapacidade de XT-M4 quimérico de competir pela ligaçãoa hRAGE-Fc com anticorpos XT-M4 e XT-H2, conformedeterminado por ensaio de ligação ELISA de competiçãode anticorpos.

A FIG. 15 representa a coloração com IHC detecidos pulmonares de macaco cinomolgo, coelho ebabuino, mostrando que o XT-M4 se liga a RAGE desuperfície celular endógeno nesses tecidos. As amostrasde controle são células CHO que expressam hRAGEcontatadas por XT-M4, células NGBCHO que não expressamRAGE e células CHO que expressam hRAGE contatadas porum anticorpo IgG de controle.

A FIG. 16 mostra que o anticorpo XT-M4 derato se liga a RAGE em pulmão humano normal e pulmão deum ser humano com doença pulmonar obstrutiva crônica(DPOC) .

A FIG. 17 mostra seqüências de aminoácidos de10 região HV de XT-H2 murideo humanizado.

A FIG. 18 mostra seqüências de aminoácidos deregião HL de XT-H2 murideo humanizado.

A FIG. 19 mostra seqüências de aminoácidos deregião HV de XT-M4 de rato humanizado.

As FIGS. 20A-20B mostram seqüências deaminoácidos de região HL de XT-H2 de rato humanizado.

A FIG. 21 representa vetores de expressãousados para produzir polipeptidios de cadeias leve epesada humanizadas.

A FIG. 22 mostra os valores ED50 para aligação de anticorpos XT-H2 humanizados a RAGE humano-Fc conforme determinado por ELISA de competição.

A FIG. 23 mostra constantes de taxa cinética(ka e kd) e constantes de associação e dissociação (Ka eKd) para ligação de XT-M4 e anticorpos humanizados XT-M4-V10, XT-M4-Vl1 e XT-M4-V14 a hRAGE-SA, conformedeterminado pelo ensaio de ligação BIAÇORE™.

A FIG. 24 mostra constantes de taxa cinética(ka e kd) e constantes de associação e dissociação (Ka eKd) para ligação de XT-M4 e anticorpos humanizados XT-M4-V10, XT-M4-V11 e XT-M4-V14 a mRAGE-SA, conformedeterminado pelo ensaio de ligação BIACORE™.

A FIG. 25 mostra a seqüência de nucleotideosde um construto ScFv de XT-H2 VL-VH murideo (SEQ IDNO:51).

A FIG. 26 mostra a seqüência de nucleotideosde um construto ScFv de XT-H2 VH-VL murideo (SEQ ID NO: 52).

A FIG. 27 mostra a seqüência de nucleotideosde um construto ScFv de XT-M4 VL-VH de rato (SEQ ID NO: 54).

A FIG. 28 mostra a seqüência de nucleotideosde um construto ScFv de XT-M4 VH-VL de rato (SEQ ID NO: 53).

A FIG. 29 é um gráfico de dados de ELISAmostrando a ligação a RAGE humano-Fc por construtosScFv dos anticorpos XT-H2 e XT-M4 anti-RAGE naconfiguração VL/VH ou VH/VL.A FIG. 30 é um gráfico de dados de ELISAmostrando a ligação a RAGE humano-Fc e BSA porconstrutos ScFv dos anticorpos XT-H2 e XT-M4 anti-RAGEna configuração VL/VH ou VH/VL expressos como proteínasolúvel em Escherichia coli. ActRIIb é uma proteína denão ligação expressa pelo mesmo vetor como um controlenegativo.

A FIG. 31 representa esquematicamente o usode PCR para introduzir mutações pontuais em uma CDR deXT-M4.

A FIG. 32 mostra a seqüência de nucleotídeosda extremidade C terminal do construto ScFv de XT-M4VL-VH (SEQ ID NO: 56). VH-CDR3 está sublinhado. Tambémsão mostrados dois oligonucleotídeos de introduçãopontual (SEQ ID NOs: 57-58) com um número em cada sítiode mutação que identifica a razão de introdução pontualusada para mutação nesse sítio. As composições denucleotídeos das razões de introdução pontualcorrespondentes aos números também são identificadas.

A FIG. 33 representa esquematicamente o vetorde exposição em ribossomo pWRIL-3. "T7" designapromotor T7, "RBS" é o sítio de ligação a ribossomo,"espaçador polipeptídico" é um espaçador polipeptídicoconectando a proteína dobrada ao ribossomo, "etiquetaFlag" é a etiqueta de epítopo Flag para deteção daproteína.

A FIG. 34 representa esquematicamente o vetorde exposição em fago pWRIL-1.

A FIG. 35 representa esquematicamente amontagem combinatória de bibliotecas de introduçãopontual em VL e VH usando o vetor de exposição em FabpWRIL-6.

A FIG. 36 é um gráfico de dados de ELISA decompetição de anticorpos mostrando a afinidadeaumentada do anticorpo XT-M4 por hRAGE após" uma mutaçãoque remove o sítio de glicosilação na posição 52.

A FIG. 37 é um gráfico mostrando aconcentração sérica de XT-M4 quimérico após uma únicaadministração i.v. um camundongos.

A FIG. 38 é um gráfico mostrando os efeitosde XT-M4 quimérico sobre déficits de memória no modelode camundongo Tg2576.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Anticorpos anti-RAGE

A presente invenção apresenta anticorpos quese ligam especificamente a RAGE, incluindo RAGE solúvele RAGE secretória endógena, conforme aqui descrito.Anticorpos anti-RAGE representativos podem compreenderpelo menos uma das seqüências de aminoácidos de regiãovariável de anticorpo mostradas nas SEQ ID NOs: 16-49.

Os anticorpos anti-RAGE da invenção incluemanticorpos que se ligam especificamente a RAGE e têmuma seqüência de aminoácidos que é idêntica ousubstancialmente idêntica a qualquer uma das SEQ IDNOs: 16-4 9. Uma seqüência de aminoácidos de umanticorpo anti-RAGE que seja substancialmente idênticaé uma que tenha pelo menos 85%, 85%, 87%, 88%, 89%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%ou 99,9% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs:16-49.

Inclui-se nos anticorpos anti-RAGE dainvenção um anticorpo que se liga especificamente aRAGE e (a) compreende uma região variável de cadeialeve selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:19, 22, 25, 23, 27 e 17 ou (b) compreende uma regiãovariável de cadeia leve com uma seqüência deaminoácidos que seja pelo menos 90% idêntica a qualqueruma das SEQ ID NOs: 19, 22, 25, 23, 27 e 17 ou seja umfragmento de ligação a RAGE de um anticorpo de acordocom (a) ou (b).

Também se inclui nos anticorpos anti-RAGE dainvenção um anticorpo que se liga especificamente aRAGE e (a) compreende uma região variável de cadeiapesada selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:18, 21, 24, 20, 26 e 16 ou (b) compreende uma regiãovariável de cadeia pesada com uma seqüência deaminoácidos que seja pelo menos 90% idêntica a qualqueruma das SEQ ID NOs: 18, 21, 24, 20, 26 e 16 ou seja umfragmento de ligação a RAGE de um anticorpo de acordocom (a) ou (b) .

Inclui-se na invenção um anticorpo anti-RAGEque se liga especificamente a RAGE e:

(a) compete pela ligação a RAGE com umanticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-Hl,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;

(b) se liga a um epitopo de RAGE que é ligadopor um anticorpo selecionado do grupo que consiste em

XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M'4;

(c) compreende uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeialeve ou cadeia pesada de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7e XT-M4; ou

(d) é um fragmento de ligação a RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).A invenção inclui anticorpos anti-RAGE que seligam especificamente a células que expressam RAGE invitro e in vivo e anticorpos que se ligam a RAGE humanocom uma constante de dissociação (Kd) na faixa de pelomenos cerca de ΙχΙΟ"7 M a cerca de IxlO"10 M. Tambémestão incluídos anticorpos anti-RAGE da invenção que seligam especificamente ao domínio V de RAGE humano eanticorpos anti-RAGE que bloqueiam a ligação de RAGE aum parceiro de ligação a RAGE (RAGE-BP).

Também está incluído na invenção um anticorpoque se liga especificamente a RAGE e bloqueia a ligaçãode RAGE a um parceiro de ligação a RAGE, por exemplo, aligantes como HMGBl, AGE, Αβ, SAA, S100, anfoterina,S100P, S100A (incluindo S100A8 e S100A9), S100A4, CRP,p2-integrina, Mac-I e pl50,95 e tem CDRs com 4 ou maisdas seguintes características (a numeração de posição écom relação às posições de aminoácidos conformemostradas para as seqüências de VH e VL nas FIGS. 6 e 7):

1. Seqüência de aminoácidos Y-X-M (Y32; X33;M34) em VH CDR1, em que X é, de preferência, W ou N;

2. Seqüência de aminoácidos I-N-X-S (151;N52; X53 e S54) em VH CDR2, em que X é P ou N;3. O aminoácido na posição 58 na CDR2 de VH étreonina;

4. O aminoácido na posição 60 na CDR2 de VH étirosina;

5. O aminoácido na posição 103 na CDR3 de VHé treonina;

6. Um ou mais resíduos tirosina na CDR3 deVH;

7. Resíduo positivamente carregado (Arg ouLys) na posição 24 na CDRl de VL;

8. Resíduo hidrofílico (Thr ou Ser) naposição 26 na CDRl de VL;

9. Pequeno resíduo Ser ou Ala na posição 25na CDRl de VL;

10. Resíduo negativamente carregado (Asp ouGlu) na posição 33 na CDRl de VL;

11. Resíduo aromático (Phe ou Tyr ou Trp) naposição 37 na CDRl de VL;

12. Resíduo hidrofílico (Ser ou Thr) naposição 57 na CDR2 de VL;

13. Seqüência P-X-T na extremidade de CDR3 deVL, que X poderia ser um resíduo hidrofóbico Leu ouTrp.Anticorpos anti-RAGE da invenção incluemanticorpos que se ligam especificamente ao domínio V deRAGE humano e bloqueiam a ligação de RAGE a seusligantes e têm CDRs com 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 outodas as 13 características.

Os anticorpos anti-RAGE da invenção incluemum anticorpo anti-RAGE conforme acima descrito ou umfragmento de ligação a RAGE que é selecionado do grupoque consiste em um anticorpo quimérico, um anticorpohumanizado, um anticorpo de cadeia única, um anticorpotetramérico, um anticorpo tetravalente, um anticorpomultiespecífico, um anticorpo específico para domínio,um anticorpo de domínio deletado, uma proteína defusão, um fragmento Fab, um fragmento Fab', umfragmento F(ab')2/ um fragmento Fv, um fragmento ScFv,um fragmento Fd, um anticorpo de domínio único, umfragmento dAb e uma proteína de fusão Fc (isto é, umdomínio de ligação a antígeno fusionado a uma regiãoconstante de imunoglobulina). Esses anticorpos podemser acoplados a um agente citotóxico, um agenteradioterápico ou um marcador detectável.

Por exemplo, um anticorpo ScFv (SEQ ID NO:63) compreendendo os domínio VH e VL do anticorpo XT-M4de rato foi preparado, e se demonstrou por análise deELISA baseada em células que tem afinidades de ligaçãopor RAGE de babuino, camundongo, coelho e seres humanoscomparáveis às dos anticorpos XT-M4 quiméricos e detipo selvagem.

Anticorpos da presente invenção tambémpretendem incluir moléculas heteroconjugadas,biespecificas, de cadeia única e quiméricas ehumanizadas com afinidade por um dos presentespolipeptídios, conferida por pelo menos uma região CDRdo anticorpo.

Anticorpos da invenção que se ligamespecificamente a RAGE também incluem variantes dequalquer um dos anticorpos aqui descritos, que podemser prontamente preparados usando-se técnicas debiologia molecular e de clonagem conhecidas. Veja, porexemplo, Pedidos de Patentes Norte-americanasPublicados N0 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445,2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/018 6216,2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534e 2005/0238646 e membros de sua família de patentesrelacionados, todos aqui incorporados por referência emsuas inteirezas. Por exemplo, um anticorpo variante dainvenção também pode compreender uma proteína de fusãodomínio de ligação-imunoglobulina que inclui umpolipeptídio de domínio de ligação (por exemplo, scFv)que está fusionado ou de outra forma conectado a umpolipeptídio de região de articulação ou de açãoarticudora de imunoglobulina, que, por sua vez, estáfusionado ou de outra forma conectado a uma regiãocompreendendo uma ou mais regiões constantes nativas oumanipuladas de uma cadeia pesada de imunoglobulina,diferente de CHI, por exemplo, as regiões CH2 e CH3 deIgG e IgA ou as regiões CH3 ou CH4 de IgE (veja, porexemplo, U.S. 2005/0136049 de Ledbetter, J. et al., queé incorporada por referência, para uma descrição maiscompleta) . A proteína de fusão domínio de ligação-imunoglobulina também pode incluir uma região queinclui um polipeptídio de região constante CH2 decadeia pesada de imunoglobulina nativo ou manipulado(ou CH3 no caso de um construto derivado total ouparcialmente de IgE) que está fusionado ou de outraforma conectado ao polipeptídio de região dearticulação e um polipeptídio de região constante CH3de cadeia pesada de imunoglobulina nativo ou manipulado(ou CH4 no caso de um construto derivado total ouparcialmente de IgE) que está fusionado ou de outraforma conectado ao polipeptídio de região constante CH2(ou CH3 no caso de um construto derivado total ouparcialmente de IgE) . Tipicamente, essas proteínas defusão domínio de ligação-imunoglobulina são capazes depelo menos uma atividade imunológica, por exemplo,ligação específica a RAGE, inhibição da interação entreRAGE e um parceiro de ligação a RAGE, indução decitotoxicidade mediada por células dependente deanticorpo, indução de fixação de complemento e outras.

Anticorpos da invenção também podemcompreender um marcador ligado a eles e capaz de serdetectado, (por exemplo, o marcador pode ser umradioisótopo, composto fluorescente, enzima ou co-fatorde enzima).

Polipeptídios RAGE

A invenção também apresenta proteínas RAGEisoladas de babuíno, macaco cinomolgo e coelho, com asseqüências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 7,9, 11 ou 13 e também inclui proteínas RAGE com umaseqüência de aminoácidos que seja substancialmenteidêntica a uma das seqüências de aminoácidos mostradasnas SEQ ID NOs: 7, 9, 11 ou 13, pelo fato de ser pelomenos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,99,5% ou 99,9% idêntica à seqüência de aminoácidos dequalquer uma das SEQ ID NOs: 7, 9, 11 ou 13.Também estão incluídos na invenção métodospara aprodução dos anticorpos anti-RAGE e seusfragmentos de ligação a RAGE da invenção por qualquermeio conhecido na técnica.

Também está incluída na invenção umapreparação purificada de anticorpo monoclonal que seliga especificamente a um ou mais epítopos da seqüênciade aminoácidos de RAGE conforme apresentada em qualqueruma das SEQ ID NOs:1, 3, 7, 9, 11 ou 13.

DEFINIÇÕES

Por razões de conveniência, certos termosempregados no relatório, exemplos e reivindicaçõesanexas são aqui apresentados. A menos que definido deoutra forma, todos os termos técnicos e científicosaqui usados têm o mesmo significado que o comumenteentendido por aqueles versados na técnica a que estainvenção pertence.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados parase referirem a um ou mais de um (isto é, a pelo menosum) do objeto gramatical do artigo. A título deexemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais deum elemento.O termo "ou" é aqui usado para significar e éusado de maneira intercambiável com o termo "e/ou", amenos que o contexto indique claramente de outra forma.

Um polipeptidio ou proteína "isolada" ou"purificada", por exemplo, um "anticorpo isolado" estápurificado em um estado além do qual existe nanatureza. Por exemplo, o polipeptidio ou proteína"isolada" ou "purificada", por exemplo, um "anticorpoisolado" pode ser substancialmente livre de materialcelular ou outras proteínas contaminantes da fontecelular ou tissular da qual a proteína é derivada, ousubstancialmente livre de precursores químicos ououtras substâncias químicas, quando quimicamentesintetizada. A preparação de proteína de anticorpo commenos de cerca de 50% de proteína não anticorpo (tambémchamada aqui de "proteína contarainante") ou deprecursores químicos é considerada como"substancialmente livre". 40%, 30%, 20%, 10% e, maispreferivelmente, 5% (com base no peso seco) de proteínanão anticorpo ou de precursores químicos sãoconsiderados como substancialmente livre. Quando aproteína de anticorpo ou sua porção biologicamenteativa é produzida de maneira recomibnante, também é, depreferência, substancialmente livre de meio de cultura,isto é, o meio de cultura representa menos de cerca de30%, de preferência menos de cerca de 20%, maispref erivelmente menos de cerca de 10% e, o maispreferivelmente, menos de cerca de 5% do volume ou massa da preparação de proteína. Proteínas oupolipeptídios aqui chamados de "recombinante" sãoproteínas ou polipeptídios produzidos pela expressão deácidos nucléicos recombinantes.

O termo "anticorpo" é aqui usado de maneiraintercambiável com o termo "imunoglobulina" e incluianticorpos intactos, fragmentos de anticorpos, porexemplo, fragmentos Fab, F(ab')2, e anticorpos intactose fragmentos que tenham sofrido mutação em sua regiãoconstante e/ou variável (por exemplo, mutações paraproduzir anticorpos quiméricos, parcialmentehumanizados ou completamente humanizados, assim comopara produzir anticorpos com um traço desejado, porexemplo, ligação aumentada a IL 13 e/ou ligaçãoreduzida a FcR) . 0 termo "fragmento" se refere a umaparte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpocompreendendo menos resíduos de aminoácidos do que umanticorpo ou cadeia de anticorpo intacta ou completa.Fragmentos podem ser obtidos por tratamento químico ouenzimático de um anticorpo ou cadeia de anticorpointactada ou completa. Fragmentos também podem serobtidos por meios recombinantes. Fragmentosexemplificativos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2,Fabc, Fd, dAb e scFv e/ou Fv. 0 termo "fragmento deligação a antígeno" se refere a um fragmentopolipeptidico de uma imunoglobulina ou anticorpo que seliga ao antigeno ou compete com anticorpo intacto (istoé, com o anticorpo intacto do qual foram derivados)pela ligação a antigeno (isto é, ligação especifica).

Assim, esses anticorpos ou seus fragmentos estãoincluídos no âmbito da invenção, contanto que oanticorpo ou fragmento se ligue especificamente a RAGEe neutralize ou iniba uma ou mais atividades associadasa RAGE (por exemplo, iniba a ligação de parceiros deligação a RAGE (RAGE-BPs) a RAGE).

O anticorpo inclui uma estrutura molecularcomposta por quatro cadeias polipeptidicas, duascadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L)interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeiapesada é composta por uma região variável de cadeiapesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma regiãoconstante de cadeia pesada. A região constante decadeia pesada é composta por três domínios, CHI, CH2 eCH3. Cada cadeia leve é composta por uma regiãovariável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ouVL) e uma região constante de cadeia leve. A regiãoconstante de cadeia leve é composta por um domínio, CL.

As regiões VH e VL podem ser adicionalmentesubdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadasde regiões determinantes de complementaridade (CDRs),intercaladas com regiões que são mais conservadas,chamadas de regiões de armação (FR) . Cada VH e VL écomposta por três CDRs e quatro FRs, dispostas daterminação amino para a terminação carbóxi na seguinteordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 .

Pretende-se que o termo "anticorpo" englobequalquer classe de Ig ou qualquer subclasse de Ig (porexemplo, as subclasses IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4 de IgG)obtida de qualquer fonte (por exemplo, seres humanos eprimatas não humanos e em roedores, lagomorfos,carpinos, bovinos, eqüinos, ovinos e outros).

O termo "classe de Ig" ou "classe deimunoglobulina", conforme aqui usado, refere-se àscinco classes de imunoglobulinas que foramidentificadas em seres humanos e mamíferos superiores,IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. O termo "subclasse de Ig" serefere às duas subclasses de IgM (H e L) , trêssubclasses de IgA (IgAl, IgA2 e IgA secretória) equatro subclasses de IgG (IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4) queforam identificadas em seres humanos e mamíferossuperiores. Os anticorpos podem existir em formamonomérica ou polimérica; por exemplo, anticorpos IgM existem em forma pentamérica, e anticorpos IgA existemem forma monomérica, dimérica ou multimérica.

o termo "subclasse de IgG" se refere àsquatro subclasses da classe de imunoglobulina IgG-IgGi,IgG2, IgG3 e IgG4 que foram identificadas em sereshumanos e mamíferos superiores pelas cadeias pesadas γdas imunoglobulinas, γι~γ4, respectivamente.

O termo "imunoglobulina de cadeia única" ou"anticorpo de cadeia única" (aqui usados de maneiraintercambiável) se refere a uma proteína com umaestrutura de duas cadeias polipeptídicas consistindo emuma cadeia pesada e uma leve, as ditas cadeias sendoestabilizadas, por exemplo, por elos peptídicosintercadeias, que tem a capacidade de se ligarespecificamente ao antígeno. 0 termo "domínio" serefere a uma região globular de um polipeptídio decadeia pesada ou leve compreendendo alças peptídicas(por exemplo, compreendendo 3 a 4 alças peptídicas)estabilizadas, por exemplo, por folha pregueada β e/ouligação dissulffeto intracadeia. Os domínios também sãoaqui chamados de "constantes" ou "variáveis", com basena falta relativa de variação de seqüência dentro dosdomínios de vários membros da classe no caso de umdomínio "constante" ou na variação significativa dentrodos domínios de vários membros da classe no caso de umdomínio "variável". "Domínios" de anticorpo oupolipeptídio são freqüentemente chamados de maneiraintercambiável na técnica de "regiões" de anticorpo oupolipeptídio. Os domínios "constantes" de uma cadeialeve de anticorpo são chamados de maneiraintercambiável de "regiões constantes de cadeia leve","domínios constantes de cadeia leve", regiões "CL" oudomínios "CL". Os domínios "constantes" de uma cadeiapesada de anticorpo são chamados de maneiraintercambiável de "regiões constantes de cadeiapesada", "domínios constantes de cadeia pesada",regiões "CH" ou domínios "CH". Os domínios "variáveis"de uma cadeia leve de anticorpo são chamados de maneiraintercambiável de "regiões variáveis de cadeia leve","domínios variáveis de cadeia leve", regiões "VL" oudomínios "VL". Os domínios "variáveis" de uma cadeiapesada de anticorpo são chamados de maneiraintercambiável de "regiões constantes de cadeiapesada", "domínios constantes de cadeia pesada",regiões "VH" ou domínios nVH".

O termo "região" também pode se referir a umaparte ou porção de um cadeia de anticorpo ou domínio decadeia de anticorpo (por exemplo, uma parte ou porçãode uma cadeia pesada ou leve ou uma parte ou porção deum domínio constante ou variável, conforme aquidefinido), assim como a partes ou porções maisdistintas das ditas cadeias ou domínios. Por exemplo,cadeias leves e pesadas ou domínios variáveis de cadeialeve e pesada incluem "regiões determinantes decomplementaridade" ou "CDRs" intercaladas entre"regiões de armação" ou "FRs", conforme aqui definido.

O termo "conformação" se refere à estruturaterciária de uma proteína ou polipeptídio (por exemplo,an anticorpo, cadeia de anticorpo, seu domínio ouregião) . Por exemplo, a expressão "conformação decadeia leve (ou pesada)" se refere à estruturaterciária de uma região variável de cadeia leve (oupesada), e a expressão "conformação do anticorpo" ou"conformação do fragmento de anticorpo" se refere àestrutura terciária de um anticorpo ou seu fragmento.

"Ligação específica" de um anticorposignifica que o anticorpo exibe afinidade apreciávelpor um antígeno ou epitopo particular e, em geral, nãoexibe reatividade cruzada significativa. 0 termo"anticorpo anti-RAGE" conforme aqui usado, refere a umanticorpo que se liga especificamente a RAGE. 0anticorpo pode não exibir nenhuma reatividade cruzada(por exemplo, não reage de maneira cruzada compeptidios não RAGE ou com epitopos remotos em RAGE).Ligação "apreciável" inclui a ligação com uma afinidadede pelo menos IO6, IO7, IO8, IO9 M-1 ou IO10 M"1.

Anticorpos com afinidades maiores que IO7 M-1 ou IO8 M-1tipicamente se ligam com especificidadecorrespondentemente maior. Valores intermediários aaosaqui expostos também devem ficar dentro do âmbito dapresente invenção, e anticorpos da invenção se ligam aRAGE com uma faixa de afinidades, por exemplo, IO6 aIO10 M-1 ou IO7 a IO10 M"1 ou IO8 a IO10 M"1. Um anticorpoque "não exiba reatividade cruzada significativa" é umque não se ligue apreciavelmente a uma entidadediferente de seu alvo (por exemplo, um epitopodiferente ou uma molécula diferente). Por exemplo, umanticorpo que se liga especificamente a RAGE se ligaráapreciavelmente a RAGE, mas não reagirásignificativamente com proteínas ou peptidios não RAGE.

Um anticorpo específico para um epitopo particular, porexemplo, não reagirá significativamente de maneiracruzada com epitopos remotos na mesma proteína oupeptídio. A ligação específica pode ser determinada deacordo com qualquer um dos meios reconhecidos natécnica para a determinação dessa ligação. Depreferência, a ligação específica é determinada deacordo com a análise Scatchard e/ou ensaios de ligaçãocompetitiva.

Conforme aqui usado, o termo "afinidade" serefere à força da ligação de um único sítio decombinação com antígeno com um determinante antigênico.A afinidade depende da proximidade do encaixeestereoquímico entre os sítios de combinação doanticorpo e determinantes antigênicos, do tamanho da área de contato entre eles, da distribuição de gurposcarregados e hidrofóbicos e outros. A afinidade doanticorpo pode ser medida por diálise de equilíbrio oupelo método BIAÇORE™ cinético. O método BIACORE™ sebaseia no fenômeno de ressoância de plásmon desuperfície (SPR) , que ocorre quando as ondas de plásmonde superfície são excitadas em uma interfacemetal/líquido. A luz é direcionada para e refletidapelo lado da superfície não em contato com a amostra ,e a SPR causa uma redução na intensidade da luzrefletida a uma combinação especifica de ângulo ecomprimento de onda. Eventos de ligação bimolecularescausam alterações no índice de retração na camadasuperficial, que são detectados como alterações nosinal de SPR.

A constante de dissociação, Kd, e a constantede associação, Ka, são medidas quantitativas deafinidade. Em equilíbrio, antígeno livre (Ag) eanticorpo livre (Ab) estão em equilíbrio com o complexoantígeno-anticorpo (Ag-Ab), e as constantes de taxa, kae kd, quantificam as taxas das reações individuais:

<formula>formula see original document page 34</formula>

Em equilíbrio, ka [Ab] [Ag] = kd [Ag-Ab]. Aconstante de dissociação, Kd, é dada por: Kd = kd/ka =[Ag][Ab]/[Ag-Ab]. Kd tem unidades de concentração, maistipicamente M, mM, pM, nM, pM e outras. Quando secomparam afinidades de anticorpos expressadas como Kd,uma maior afinidade por RAGE é indicada por um menorvalor. A constante de associação, Ka, é dada por: Ka =ka/kd = [Ag-Ab] / [Ag] [Ab] . Ka tem unidades deconcentração inversa, mais tipicamente M-1, mM-1, μΜ-1,nM-1, pM"1 e outras. Conforme aqui usado, o termo"avidez" se refere à forna da ligação antígeno-anticorpo após a formação de complexos reversíveis.

Anticorpos anti-RAGE podem ser caracterizados em termosda Kd para sua ligação a uma proteína RAGE, comoligação "com uma constante de dissociação (Kd) na faixade cerca de (valor inferior de Kd) a cerca de (valorsuperior de Kd)". Nesse contexto, o termo "cerca de"pretende significar o valor Kd indicado ± 20%; isto é,Kd de cerca de 1 = Kd na faixa de 0,8 a 1,2.

Conforme aqui usado, o termo "anticorpomonoclonal" se refere a um anticorpo derivado de umapopulação clonal de células produtoras de anticorpo(por exemplo, linfócitos B ou células B) que seja deestrutura e especificidade de antígeno homogêneas. Otermo "anticorpo policlonal" se refere a umapluralidade de anticorpos originados de diferentespopulações clonais de células produtoras de anticorposque são heterogêneas em sua estrutura e especificidadede epítopo, mas que reconhecem um antígeno cora ura.

Anticorpos monoclonais e policlonais podem existirdentro de fluidos corporais, como preparações brutas,ou podem ser purificados, conforme aqui descrito.

0 termo "parte de ligação" de um anticorpo(ou "parte de anticorpo") inclui um ou mais domínioscompletos, por exemplo, um par de domínios completos,assim como fragmentos de um anticorpo que retenham acapacidade de se ligarem especificamente a RAGE.

Demonstrou-se que a função de ligação de um anticorpopode ser realizada por fragmentos de um anticorpo decomprimento total. Fragmentos de ligação são produzidospor técnicas de DNA recombinante ou por clivagemenzimática ou química de imunoglobulinas intactas.Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fabc,Fd, dAb, Fv, cadeias únicas, anticorpos de cadeiaúnica, por exemplo, scFv, e anticorpos de domínio único(Muyldermans et al., 2001, 26:230-5) e uma regiãodeterminante de complementaridade isolada (CDR). Ofragmento Fab é um fragmento monovalente consistindonos domínios VL, VH, CL e CHI. O fragmento F(ab')2 é umfragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fabligados por uma ponte dissulfeto na região dearticulação. 0 fragmento Fd consiste nos domínios VH eCHI, e o fragmento Fv consiste nos domínios VL e VH deum único braço de um anticorpo. Um fragmento dAbconsiste em um domínio VH (Ward et al., (1989) Nature341:544-546). Embora os dois domínios do fragmento Fv,VL e VH, sejam codificados por genes separados, podemser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um elosintético que permite que sejam preparados como umaúnica cadeia de proteína, em que as regiões VL e VHficam pareadas para formar moléculas monovalentes(conhecidas como Fv de cadeia única (scFv) (Bird etal., 1988, Science 242:423-426). Esses anticorpos decadeia única também devem ser englobados dentro dotermo "parte de ligação" de um anticorpo. Outras formasde anticorpos de cadeia única, como diacorpos, tambémestão englobados. Diacorpos são anticorpos bivalentes ebiespecif icos, em que os domínios VH e VL sãoexpressados em uma única cadeia polipeptídica, masusando um elo que seja curto demais para permitir opareamento entre os dois domínios na mesma cadeia,forçando, dessa maneira, que os domínios fique pareadoscom domínios de complementaridade de outra cadeia ecriando dois sítios de ligação a antígeno (veja, porexemplo, Holliger, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 90:6444-6448).

Um anticorpo ou sua porção deligação também pode ser parte de moléculas deimunoadesão maiores formadas por associação covalenteou não covalente do anticorpo ou porção do anticorpocom uma ou mais outras proteínas ou peptídios. Exemplosdessas moléculas de imunoadesão incluem o uso da regiãode núcleo de estreptavidina, para formar uma moléculascFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), e o uso deum resíduo de cisteina, um peptídio marcador e umaetiqueta poli-histidina C terminal para formarmoléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov,S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058).Fragmentos de ligação, como fragmentos Fab e F(ab')2,podem ser preparados a partir de anticorpos inteirosusando-se técnicas convencionais, como digestão compapaína ou pepsina, respectivamente, de anticorposinteiros. Além disso, anticorpos, partes de anticorpose moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando-setécnicas padronizadas de DNA recombinante, conformeaqui descritas e conforme conhecidas na técnica. Alémde anticorpos "biespecificos" ou "bifuncionais",entende-se que um anticorpo tenha cada um de seussítios de ligação idênticos. Um "anticorpo bifuncional"ou "biespecifico" é um anticorpo híbrido artificial comdois pares de cadeis pesadas/leves diferentes e deissítios de ligação diferentes. Um anticorpo biespecíficotambém pode incluir duas regiões de ligação a antígenocom uma região constante intermediária. Anticorposbiespecificos podem ser produzidos por vários métodos,incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentosFab'. Veja, por exemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp.Immunol. 79:315-321, 1990; Kostelny et al., 1992, J.Immunol. 148, 1547-1553.

O termo "mutação retrógrada" se refere a umprocesso em que alguns ou todos os aminoácidos quesofreram mutação somática de um anticorpo humano sãosubstituídos pelos resíduos de linhagem germinativacorrespondentes de uma seqüência de anticorpo delinhagem germinativa homóloga. As seqüências de cadeiapesada e leve do anticorpo humano da invenção sãoalinhadas separadamente com as seqüências de linhagemgerminativa na base de dados VBASE para identificar asseqüências com a maior homologia. Diferenças noanticorpo humano da invenção retornam à seqüência delinhagem germinativa por mutação de posições denucleotídeos definidas que codificam esse aminoácidodiferente. O papel de cada aminoácido assimidentificado como candidato para mutação retrógradadeve ser investigado quanto a um papel direto ouindireto na ligação a antígeno, e nenhum aminoácidoencontrado após a mutação que afete qualquercaracterística desejável do anticorpo humano não deveser incluído no anticorpo humano final; como umexemplo, aminoácidos intensificadores de atividadeidentificados pela abordagem de mutagênese seletiva nãoestarão sujeitos a mutação retrógrada. Para minimizar onúmero de aminoácidos sujeitos a mutação retrógrada,aquelas posições de aminoácidos encontradas cmodiferentes da seqüência de linhagem germinativa maispróxima, mas idênticas ao aminoácido correspondente emuma segunda seqüência de linhagem germinativa podempermanecer, contanto que a segunda seqüência delinhagem germinativa seja idêntica e colinear com aseqüência do anticorpo humano da invenção em pelo menos10, de preferência 12, aminoácidos, de ambos os ladosdo aminoácido em questão. A mutação retrógrada podeocorrer em qualquer estágio da otimização do anticorpo;de preferência, a mutação retrógrada ocorre diretamenteantes ou após a abordagem de mutagênese seletiva. Maispreferivelmente, a mutação retrógrada ocorrediretamente antes da abordagem de mutagênese seletiva.

Anticorpos intactos, também conhecidos comoimunoglobulinas, são tipicamente proteínas glicosiladastetraméticas compostas por duas cadeias leves (L) deaproximadamente 25 kDa cada e duas cadeias pesadas (H)de aproximadamente 50 kDa cada. Dois tipos de cadeiasleves, chamadas de lambda e kapa, são encontradas emanticorpos. Dependendo da seqüência de aminoácidos dodomínio constante de cadeias pesadas, asimunoglobulinas podem ser classificadas em cincoclasses maiores: A, D, E, G e M. e várias dessas podemser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos),por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Cada cadeia leve é composta por dominio variável (V) Nterminal (VL) e um dominio constante (C) (CL) . Cadacadeia pesada é composta por um dominio V N terminal(VH) , três ou quatro domínios C (CHs) e uma região dearticulação. 0 domínio CH mais proximal a VH édesignado como CHI. Os domínios VH e VL consistem emquatro regiões de seqüências relativamente conservadas,chamadas de regiões de armação (FR1, FR2, FR3 e FR4) ,que formam uma estrutura de sustentação para as trêsregiões de seqüências hipervariáveis (regiões determinantes de complementaridade, CDRs). As CDRscontêm a maioria dos resíduos responsáveis porinterações específicas do anticorpo com o antígeno.CDRs são chamados de CDRl, CDR2 e CDR3. Portanto, osconstituintes de CDR na cadeia pesada são chamados de Hl, H2 e H3, ao passo que os constituintes de CDR nacadeia leve são chamados de Ll , L2 e L3. CDR3 é amaior fonte de diversidade molecular no sítio deligação do anticorpo. H3, por exemplo, pode ser tãocurta quanto dois resíduos de aminoácidos ou maior que26 aminoácidos. As estruturas de subunidades e asconfigurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas na técnica. Para umarevisão da estrutura de anticorpos, veja Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds.Harlow et al. , 1988. Aqueles versados na técnicareconhecerão que cada estrutura de subunidade, porexemplo, uma estrutura CH, VH, CL, VL, CDR, FR,compreende fragmentos ativos, por exemplo, a porção dasubunidade VH, VL ou CDR que se liga ao antigeno, istoé, o fragmento de ligação, or, por exemplo, a porção dasubunidade CH que se liga a e/ou ativa, por exemplo, umreceptor de Fc e/ou o complemento.

A diversidade de anticorpos é criada pelo usode múltiplos genes de linhagem germinativa quecodificam regiões regiões variáveis e uma variedade deeventos somáticos. Os eventos somáticos incluemrecombinação de segmentos de gene variável comsegmentos de gene de diversidade (D) e de união (J),para preparar uma região VH completa, e a recombinaçãode segmentos de gene variável e de união, para prepararuma região VL completa. O próprio processo derecombinação é impreciso, resultando na perda ou adiçãode aminoácidos nas funções V(D)J. Esses mecanismos dediversidade ocorrem na célula B em desenvolvimentoantes da exposição ao antigeno. Depois da estimulaçãoantigênica, os genes de anticorpo expressado nascélulas B sofrem mutação somática. Com base no númeroestimado de segmentos de gene de linhagem germinativa,na recombinação aleatória desses segmentos e nopareamento aleatório de VH-VL, até 1,6 χ IO7 diferentesanticorpos poderiam ser produzidos (FundamentalImmunology, 3a ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, NewYork, N.Y.)· Quando outros processos que contribuempara a diversidade de anticorpos (como mutaçãosomática) são levados em consideração, acredita-se quemais de 1 χ IO10 diferentes anticorpos possam sergerados (Immunoglobulin Genes, 2a ed. (1995), eds.Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif.). Porcausa dos muitos processos envolvidos na geração dadiversidade de anticorpos, é improvável que anticorposmonoclonais independentemente derivados, com a mesmaespecificidade de antigeno, tenham seqüências deaminoácido idênticas.

0 termo "polipeptídio de dimerização" ou"domínio de dimerização" inclui qualquer polipeptídioque forme um dímero (ou complexo de ordem superior,como um trímero, tetrâmero e outros) com outropolipeptídio. Opcionalmente, o polipeptídio dedimerização se associa com outros polipeptidios dedimerização idênticos, formando, dessa maneira,homomultimeros. Um elemento Fc de IgG é um exemplo deum domínio de dimerização que tende a formarhomomultimeros. Opcionalmente, o polipeptídio dedimerização se associa a outros polipeptidios dedimerização diferentes, formando, dessa maneira,heteromultímeros. 0 domínio de zíper de leucina Junforma um dímero com o domínio de zíper de leucina Fos eé, conseqüentemente, um exemplo de um domínio dedimerização que tende a formar heteromultímeros.Domínios de dimerização podem formar 25 hetero- ehomomultimeros.

o termo "anticorpo humano" inclui anticorposcom regiões variáveis e constantes correspondentes aseqüências de imunoglobulinas de linhagem germinativahumana conforme descrito por Kabat et al. (veja Kabat,et al. (1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Quinta Edição, Departamento Norte-americanode Saúde e Serviços Humanos, Publicação NIH No. 91-3242) . Os anticorpos humanos da invenção podem incluirresíduos de aminoácidos não codificados por seqüênciasde imunoglobulinas de linhagem germinativa humana (porexemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatóriaou especifica para sitio in vitro ou por mutaçãosomática in vivo), por exemplo nas CDRs e em particularCDR3. As mutações são introduzidas, de preferência,usando-se a "abordagem de mutagênese seletiva" aquidescrita. O anticorpo humano pode ter pelo menos umaposição substituída por um resíduo de aminoácido, porexemplo, um resíduo de aminoácido de intensificação deatividade, que não seja codificado pela seqüência deimunoglobulina de linhagem germinativa humana. Oanticorpo humano pode ter até vinte posiçõessubstituídas por resíduos de aminoácidos que não sejamparte da seqüência de imunoglobulina de linhagemgerminativa humana. Além disso, até dez, até cinco, atétrês ou até duas posições são substituídas. Essassubstituições podem se encontrar dentro das regiões deCDR conforme descrito em detalhes abaixo. Entretanto, otermo "anticorpo humano", conforme aqui usado, nãopretende incluir anticorpos em que as seqüências de CDRderivadas da linhagem germinativa de outra espécie demamífero, como um camundongo, tenham sido enxertadas emseqüências de armação humanas.

A expressão "anticorpo humano recombinante"inclui anticorpos humanos que são preparados,expressados, criados ou isolados por meiosrecombinantes, como anticorpos expressandos usando-seum vetor de expressão recombinante transfectado em umacélula hospedeira (adicionalmente descritos na SeçãoII, abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca deanticorpos humanos combinatórios recombinantes(adicionalmente descritos na Seção III, abaixo),anticorpos isolados de um animal (por exemplo, umcamundongo) que seja transgênico para genes deimunoglobulina humana (veja, por exemplo, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ouanticorpos preparados, expressados, criados ou isoladospor quaisquer outros meios que envolvam a junção deseqüências de genes de imunoglobulinas humanas a outrasseqüências de DNA. Esses anticorpos humanosrecombinantes têm regiões variáveis e constantesderivadas de seqüências de imunoglobulinas de linhagemgerminativa humana (veja Kabat, Ε. A., et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, QuintaEdição, Departamento Norte-americano de Saúde eServiços Humanos, Publicação NIH No. 91-3242).

Entretanto, esses anticorpos humanos recombinantespodem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quandose usa um animal transgênico para seqüências de Ighumana, mutagênese somática in vivo), e, portanto, asseqüências de aminoácidos das regiões VH e VL dosanticorpos recombinantes são seqüências que, emboraderivadas de e relacionadas a seqüências de VH e VL delinhagem germinativa humana, podem não existirnaturalmente no repertório de linhagem germinativa deanticorpos humanos in vivo. Em certas modalidades,entretanto, esses anticorpos recombinantes podem ser oresultado da abordagem de mutagênese seletiva ou mutação retrógrada ou ambas.

Um "anticorpo isolado" inclui um anticorpoque seja substancialmente livre de outros anticorposcom diferentes especificidades antigênicas (porexemplo, um anticorpo isolado que se ligueespecificamente a RAGE é substancialmente livre deanticorpos que se liguemm especificamente a RAGEdiferente de hRAGE). Um anticorpo isolado que se ligueespecificamente a RAGE pode se ligar a moléculas deRAGE de outras espécies. Além disso, um anticorpoisolado pode ser substancialmente livre de outrosmateriais celulares e/ou substâncias químicas.

Um "anticorpo neutralizador" (ou um"anticorpo que neutraliza a atividade de RAGE ") incluium anticorpo cuja ligação a hRAGE resulta em modulaçãoda atividade biológica de hRAGE. Essa modulação daatividade biológica de hRAGE pode ser avaliada pormedição de um ou mais indicadores de atividadebiológica de hRAGE, como inhibição da ligação areceptor em um ensaio de ligação a receptor de RAGEhumano (veja, por exemplo, Exemplos 6 e 7). Essesindicadores de atividade biológica de hRAGE podem seravaliados por um ou mais de vários ensaios padronizadosin vitro ou in vivo conhecidos na técnica (veja, porexemplo, Exemplos 6 e 7).

Formas "humanizadas" de anticorpos nãohumanos (por exemplo, murideos) são anticorposquiméricos que contêm seqüências mínimas derivadas deimunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorporeceptor) nas quais resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídas por resíduosde uma região hipervariável de uma espécie não humana(anticorpo doador) como camundongo, rato, coelho ouprimata não humano com a especificidade, afinidade ecapacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos FR daimunoglobulina humana são substituídos pelos resíduosnão humanos correspondentes. Além disso, anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor ou no anticorpodoador. Essas modificações são feitas para refinarainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, oanticorpo humanizado compreenderá substancialmentetodos de pelo menos um e tipicamente dois domíniosvariáveis, em que todas ou substancialmente todas asregiões hipervariáveis correspondem às de umaimunoglobulina não humana, e todas ou substancialmentetodas as regiões FR são de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizadoopcionalmente também compreenderá pelo menos uma porçãode uma região constante de imunoglobulina (Fc) ,tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Paradetalhes adicionais, veja Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); e Presta, Curr. 0p. Struct. Biol. 2:593-596(1992).

o termo "atividade" inclui atividades como aespecificidade/afinidade de ligação de um anticorpo porum antígeno, por exemplo, um anticorpo anti-hRAGE quese liga a RAGE e/ou a potência neutralizadora de umanticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-hRAGE cujaligação a hRAGE iniba a atividade biológica de RAGE,por exemplo, inhibição da ligação a receptor em umensaio de ligação a receptor de RAGE humano.

Um "construto de expressão" é qualquer ácidonucléico recombinante que inclua um ácido nucléicoexpressável e elementos reguladores suficientes paramediar a expressão da proteína ou polipeptídio do ácidonucléico expressão em uma célula hospedeira adequada.

Os termos "proteína de fusão" e "proteínaquimérica" são intercambiáveis e se referem a umaproteína ou polipeptídio que tenha uma seqüência deaminoácidos com porções correspondentes às seqüênciasde aminoácidos de duas ou mais proteínas. As seqüênciasde duas ou mais proteínas podem ser totais ou parciais(isto é, fragmentos) das proteínas. Proteínas de fusãotambém podem ter regiões de ligação de aminoácidosentre as porções correspondentes às das proteínas.

Essas proteínas de fusão podem ser preparadas pormétodos recombinantes, em que os ácidos nucléicoscorrespondentes são unidos mediante tratamento comnucleases e ligases e incorporados em um vetor deexpressão. A preparação de proteínas de fusão égenericamente entendida por aqueles versados natécnica.O termo "ácido nucléico" se refere apolinucleotídeos como o ácido desoxirribonucléico(DNA), e, quando apropriado, ácido ribonucléico (RNA).

O termo também deve ser entendido como incluindo, comoequivalentes, análogos de RNA ou DNA preparados apartir de análogos nucleotidicos e, quando aplicável àmodalidade que está sendo descrita, polinucleotídeos defilamento simples (em sentido ou anti-sentido) e duplo.

O termo "por cento idêntico" ou "porcentagemde identidade" se refere à identidade de seqüênciaentre duas seqüências de aminoácidos ou entre duasseqüências de nucleotideos. A porcentagem de identidadepode ser determinada por comparação da posição em cadaseqüência que pode ser alinhada para fins decomparação. A expressão como uma porcentagem deidentidade se refere a uma função do número deaminoácidos ou ácidos nucléicos idênticos em posiçõescompartilhadas pelas seqüências comparadas. Váriosalgoritmos e/ou programas de alinhamento podem serusados, incluindo FASTA, BLAST ou ENTREZ. FASTA e BLASTestão disponíveis como parte do pacote de análise deseqüência GCG (Universidade de Wisconsin, Madison,Wis.) e podem ser usados com, por exemplo, ajustes dedefault. ENTREZ está disponível no Centro Nacional deInformações Biotecnológicas, Biblioteca Nacional deMedicina, Instituso Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. Aporcentagem de identidade de duas seqüências pode serdeterminada pelo programa GCG com uma ponderação delacuna de 1, por exemplo, cada lacuna de aminoácido éponderada como se fosse uma única falta decorrespondência de aminoácido ou nucleotideo entre asduas seqüências.

Outras técnicas para alinhamento são descritas em Methods in Enzymology, vol. 266: ComputerMethods for Macromolecular Sequence Analysis (1996),ed. Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão daHarcourt Brace & Co., San Diego, Calif., EUA. Depreferência, utiliza-se um programa de alinhamento quepermita lacunas na seqüência para alinhar asseqüências. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo quepermite lacunas em alinhamentos de seqüência. VejaMeth. Mol. Viols. 70: 173-187 (1997) . Da mesma forma, oprograma GAP I, que usa o método de alinhamento deNeedlenan e Wunsch, pode ser utilizado para lainharseqüências. Uma estratégia de pesquisa alternativa usao software MPSRCH, que roda em um computador MASPAR.MPSRCH usa um algoritmo Smith-Waterman para classificaras seqüências como 5 em um computador maciçamenteparalelo. Essa abordagem melhora a capacidade deencontrar correspondências distantemente relacionadas eé particularmente tolerante a pequenas lacunas e errosde seqüências de nucleotideos. Seqüências deaminoácidos codificadas por ácidos nucléicos podem serusadas para pesquisar tanto bases de dados deproteínas, quanto de DNA.

Os termos "polipeptídio" e "proteína" sãoaqui usados de maneira intercambiável.

Uma proteína "RAGE" é um "Receptor paraProdutos Finais de Glicação Avançada", conformeconhecido na técnica. Proteínas RAGE representativassão apresentadas nas FIGS. 1A-1C. Proteínas' RAGEincluem RAGE solúvel (sRAGE) e RAGE secretória endógena(esRAGE). RAGE secretória endógena é uma variante dejunção de RAGE que é liberada para for a das células,onde é capaz de se ligar a ligantes de AGE eneutralizar ações de AGE. Veja, por exemplo, Koyama etal., ATVE, 2005; 25:2587-2593. Uma associação inversafoi observada entre esRAGE plasmática humana e várioscomponentes da síndrome metabólica (IMC, resistência àinsulina, PC, hipertrigliceridemia e IGT). Os níveisplasmáticos de esRAGE também foram inversamenteassociados a aterosclerose carótida e femoral(quantificada por ultra-sonografia) em indivíduos comou sem diabetes. Além disso, os níveis plasmáticos deesRAGE estão significativamente menores em pacientesnão diabéticos com doença da artéria coronarianaangiograficamente comprovada do que controles saudáveisde idade correspondente.

Um "Elemento de Ligação a Ligante de Receptorpara Produtos Finais de Glicação Avançada" ou "RAGE-LBE" (aqui também chamado de "RAGE-Fe" e "RAGE-strep")inclui qualquer porção extracelular de um polipeptídioRAGE transmembrana e seus fragmentos que retenham acapacidade de se ligarem a um lingante de RAGE. Essetermo também engloba polipeptídios com pelo menos 85%de identidade, de preferência pelo menos 90% deidentidade ou, mais preferivelmente, pelo menos 95% deidentidade com um polipeptídio RAGE, por exemplo, opolipeptídio humano ou murídeo ao qual um ligante deRAGE ou RAGE-BP se ligará.

Um "Parceiro de Ligação a Receptor paraProdutos de Glicação Avançada" ou "RAGE-BP" incluiqualquer substância (por exemplo, polipeptídio,molécula pequena, estrutura de carboidrato e outras)que se ligue em um ambiente fisiológica a uma porçãoextracelular de uma proteína RAGE (um polipeptídioreceptor como, por exemplo, RAGE ou RAGE-LBE).

"Transtornos relacionados a RAGE" ou"transtornos associados a RAGE" incluem qualquertranstorno em que uma célula ou tecido afetado exiba umaumento ou diminuição na expressão e/ou atividade deRAGE ou um ou mais ligantes de RAGE. Transtornosrelacionados a RAGE também incluem qualquer transtornoque seja tratável (isto é, um ou mais sintomas podemser eliminados ou melhorados) por uma diminuição nafunção de RAGE (incluindo, por exemplo, administraçãode um agente que rompa interações RAGE:RAGE-BP).

"Domínio V de RAGE" se refere ao domíniovariável do tipo imunoglobulina conforme mostrado naFIG. 5 de Neeper, et al, "Cloning and expression ofRAGE: a cell surface receptor for advancedglycosylation end products of proteins," J. Biol. Chem.267:14998-15004 (1992), cujo conteúdo é aquiincorporado por referência. 0 domínio V incluiaminoácidos da posição 1 à posição 120 conformemostrado na SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3.

O c DNA humano de RAGE tem 1.406 pares debases e codifica uma proteína madura de 404aminoácidos. Veja a FIG. 3 de Neeper et al. 1992.O termo "ácido nucléico recombinante" incluiqualquer ácido nucléico compreendendo pelo menos duasseqüências que não estejam presentes juntas nanatureza. Um ácido nucléico recombinante pode sergerado in vitro, por exemplo, usando-se os métodos debiologia molecular, ou in vivo, por exemplo, porinserção de um ácido nucléico em uma nova localizaçãocromossômica por recombinação homóloga ou não homóloga.

o termo "tratar", com relação a um sujeito,refere-se a melhorar pelo menos um sintoma da doença outranstorno do sujeito. Tratar pode ser curar a doençaou condição ou melhorá-la.

O termo "vetor" se refere a uma molécula deácido nucléico capaz de transportar outro ácidonucléico ao qual tenha sido ligado. Um tipo de vetor éum epissomo, isto é, um ácido nucléico capaz dereplicação extra-cromossômica. Outro tipo de vetor é umvetor integrativo, que é projetado para se recombinarcom o material genético de uma célula hospedeira. Osvetores podem ser tanto de replicação autônoma, quantointegrativos, e as propriedades de um vetor podemdiferir, dependendo do contexto celular (isto é, umvetor pode ser de replicação autônoma em um tipo decélula hospedeira e puramente integrativa em outro tipode célula hospedeira). Vetores capazes de dirigir aexpressão de ácidos nucléicos expressáveis aos quaisestejam operacionalmente ligados são aqui chamados de"vetores de expressão".

"Especificamente imunorreativo" se refere àligação preferencial de compostos [um anticorpo] a umaseqüência peptidica particular, quando um anticorpointerage com uma seqüência peptidica especifica.

A expressão "quantidade eficaz", conformeaqui usada, significa a quantidade de um ou maisagentes, materiais ou composições compreendendo um oumais agentes da presente invenção que é eficaz paraproduzir algum efeito desejado em um animal. Reconhece-se que, quando um agente está sendo usado para seconseguir um efeito terapêutico, a dose real quecompreende a "quantidade eficaz" variará dependendo deinúmeras condições, incluindo a condição particular queestá sendo tratada, a gravidade da doença, o tamanho esaúde do paciente, a via de amdinistração e outras.

Aqueles versados na prática médica podem determinarprontamente a dose apropriada usando métodos bemconhecidos nas técnicas médicas.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" éaqui empregada para se referir àqueles compostos,materiais, composições e/ou formas de dosagem que são,dentro do âmbito de um julgamento médico seguro,adequados para uso em contato com tecidos de sereshumanos e animais, sem toxicidade excessiva, irritação,resposta alérgica ou outros problemas e complicações,proporcionais a uma razão de risco/beneficio razoável.

A expressão "veiculo farmaceuticamenteaceitável", conforme aqui usado, significa um material,composição ou veiculo farmaceuticamente aceitável, comouma carga liquida ou sólida, diluente, excipiente,solvente ou material de encapsulação, envolvido nocarreamento ou transporte dos presentes agentes de umórgão ou parte do corpo para outro órgão ou parte docorpo. Cada veiculo tem de ser "aceitável" no sentidode ser compatível com outros ingredientes daformulação. Alguns exemplos de materiais que podemservir de veículos farmaceuticamente aceitáveisincluem: (1) açúcares, como lactose, glicose esacarose; (2) amidos, como amido de milho e amido debatata; (3) celulose e seus derivados, comocarboximetil celulose sódica, etil celulose e acetatode celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6)gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como manteiga decacau e ceras para supositórios; (9) óleos, como óleode amendoim, óleo de semente de algodão, óleo deaçafroa, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo demilho e óleo de soja; (10) glicóis, como propilenoglicol; (11) polióis, como glicerina, sorbitol, manitole polietileno glicol; (12) ésteres, como oleato deetila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes detamponamento, como hidróxido de magnésio e hidróxido dealumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre depirógenos; (17) salina isotônica, (18) solução deRinger, (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadascom fosfato; e (21) outras substâncias não tóxicascompatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.

Preparação de Anticorpos Monoclonais

Um mamífero, como um camundongo, um rato, umhamster ou coelho pode ser imunicado com a proteína decomprimento total ou seus fragmentos ou o cDNA quecodifica a proteína de comprimento total ou seufragmento, uma forma imunogênica do peptídio. Técnicaspara conferir imunogenicidade a uma proteína oupeptídio incluem a conjugação a veículos ou outrastécnicas bem conhecidas. Uma porção imunogênica de umpolipeptídio pode ser administrada na presença de umadjuvante. O progresso da imunização pode sermonitorizado por detecção de títulos de anticorpo noplasma ou sero. ELISA padrão ou outros imunoensaiospodem ser usados com o imunógeno como antigeno paraavaliar os níveis de anticorpos.

Após a imunização de um animal com umapreparação antigênica dos presentes polipeptídios,podem-se obter anti-seros e, caso desejado, anticorpospoliclonais isolados do soro. Para produzir anticorposmonoclonais, células produtoras de anticorpos(linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizadoe fusionadas por procedimentos padronizados de fusão decélulas somáticas a células de imortalização, comocélulas de mieloma para fornecer células de hibridoma.Essas técnicas são bem conhecidas e incluem, porexemplo, a técnica de hibridoma (originalmentedesenvolvida por Kohler e Milstein, (1975) Nature, 256:495-497), a técnica de hibridoma de células B humanas(Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4: 72) e atécnica de EBV-hibridoma para produzir anticorposhumanos monoclonais (Cole et al., (1985) MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96). Células de hibridoma podem serimunoquimicamente tríadas quanto à produção deanticorpos especificamente reativos com um epítopo dopolipeptidio RAGE, e anticorpos monoclonais isolados deuma cultura compreendendo essas células de hibridoma.

Humanização

Anticorpos quiméricos compreendem seqüênciasde pelo menos duas espécies diferentes. Como umexemplo, podem-se usar técnicas de clonagemrecombinante para incluir regiões variáveis, quecontenham os sitios de ligação a antigeno, de umanticorpo não humano (isto é, um anticorpo preparado emuma espécie não humana imunizada com o antigeno) eregiões constantes derivadas de uma imunoglobulinahumana.

Anticorpos humanizados são um tipo deanticorpo quimérico em que resíduos de região variávelresponsáveis pela ligação a antigeno (isto é, resíduosde uma região determinante de complementaridade,abreviado como região determinante de complementaridadeou quaisquer outros resíduos que participem na ligaçãoa antigeno) são derivados de uma espécie não humana, aopasso que os resíduos restantes da região variável(isto é, resíduos das regiões de armação) e regiõesconstantes são derivados, pelo menos em parte, deseqüências de anticorpos humanos. Um subconjunto deresíduos de região de armação e resíduos de regiãoconstante de um anticorpo humanizado pode ser derivadode fontes não humanas. Regiões variáveis de umanticorpo humanizado também são descritas comohumanizadas (isto é, uma região variável de cadeia leveou pesada humanizada). A espécie não humana étipicamente a usada para imunização com um antigeno,como camundongo, rato, coelho, primata não humano ououtras espécies de mamíferos não humanos. Anticorposhumanizados são tipicamente menos imunigênicos queanticorpos quiméricos tradicionais e mostram melhorestabilidade após a administração a seres humanos.Veja, por exemplo, Benincosa et al. (2000) J.Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos et al.(1994) Eur. J. Câncer 30A:1842-50; Subramanian et al.(1998) Pediatr. Infect. Dis. J. 17:110-5.

Regiões determinantes de complementaridade(CDRs) são resíduos de regiões variáveis de anticorpoque participam na ligação a antigeno. Vários sistemasde numeração para identificar CDRs são comumenteusados. A definição Kabat se base na variabilidade daseqüência, e a definição Chothia se baseia nalocalização das regiões de alça estrutural. A definiçãoAbM é um compromisso entre as abordagens de Kabat eChothia . As CDRs da região variável de cadeia leveestão ligadas pelos resíduos nas posições 24 e 34(CDRl-L), 50 e 56 (CDR2-L) e 89 e 97 (CDR3-L) , deacordo com o algoritmo de Kabat, Chothia ou AbM. Deacordo com a definição Kabat, as CDRs da regiãovariável de cadeia pesada estão ligadas pelos resíduosnas posições 31 e 35B (CDRl-H), 50 e 65 (CDR2-H) e 95 e102 (CDR3-H) (numeração de acordo com Kabat). De acordocom a definição Chothia, as CDRs da região variável decadeia pesada estão ligadas pelos resíduos nas posições26 e 32 (CDRl-H), 52 e 56 (CDR2-H) e 95 e 102 (CDR3-H)(numeração de acordo com Chothia). De acordo com adefinição AbM, as CDRs da região variável de cadeiapesada estão ligadas pelos resíduos nas posições 26 e35B (CDRl-H), 50 e 58 (CDR2-H) e 95 e 102 (CDR3-H)(numeração de acordo com Kabat). Veja Martin et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 9268-9272; Martinet al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersenet al. (1992) Immunomethods 1: 126; e Rees et al.(1996) em Sternberg M. J. E. (ed.), Protein StructurePrediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172.

Conforme aqui usado, o termo "CDR" se referea CDRs conforme definidas por Kabat ou Chothia; alémdisso, pode-se construir um anticorpo humanizadovariável da invenção para compreender uma ou mais CDRsconforme definidas por Kabat e também compreender umaou mais CDRs conforme definidas por Chothia.

Regiões determinantes de especificidade(SDRs) são resíduos dentro de CDRs que interagemdiretamente com o antígeno. As SDRs correspondem aresíduos hipervariáveis. Veja (Padlan et al. (1995)FASEB J. 9: 133-139).

Resíduos de armação são os resíduos deregiões variáveis de anticorpo diferentes de resíduoshipervariáveis ou de CDR. Resíduos de armação podem serderivados de um anticorpo humano de ocorrência natural,como uma armação humana que seja substancialmentesimilar a uma região de armação de um anticorpo anti-RAGE da invenção. Seqüências de armação artificiais querepresentam um consenso entre seqüências individuaistambém podem ser usadas. Quando se seleciona uma regiãode armação para humanização, seqüências que sejamamplamente representadas em seres humanos podem serpreferíveis com relação a seqüências menos comuns.

Podem-se fazer mutações adicionais das seqüências dereceptor de armação humano para restaurar resíduosmurídeos que se acredite que estejam envolvidos emcontantos com o antígeno e/ou resíduos envolvidos naintegridade estrutural do sitio de ligação a antigenoou para melhorar a expressão de anticorpo. Pode-se usaruma predição de estrutura de peptidio para analisar asseqüências de regiões pesadas e leves variáveishumanizadas, para identificar e evitar sitios demodificação de proteína pós-tradução introduzidos peloprojeto de humanização.

Anticorpos humanizados podem ser preparadosusando-se qualquer um de vários métodos, incluindofolheamento, enxerto de regiões determinantes decomplementaridade (CDRs), enxerto de CDRs abreviadas,enxerto de regiões determinantes de especificidade(SDRs) e montagem Frankenstein, conforme descritoabaixo. Anticorpos humanizados também incluemanticorpos super-humanizados, em que uma ou maisalterações foram introduzidas nas CDRs. Por exemplo,resíduos humanos podem substituir resíduos não humanosnas CDRs. Essas abordagens genéricas podem sercombinadas com mutagênese padronizadas e técnicas desíntese para produzir um anticorpo anti-RAGE dequalquer seqüência desejada.

O folheamento se baseia no conceito dereduzir seqüências de aminoácidos potencialmenteimunogênicas em um anticorpo de roedor ou outro nãohumano por recobrimento do exterior acessível asolvente do anticorpo com seqüências de aminoácidoshumanas. Assim, anticorpos folheados parecem menosestranhos a células humanas do que o anticorpo nãohumano não modificado. Veja Padlan (1991) Mol. Immunol.28:489-98. Um anticorpo não humano é folheado poridentificação de resíduos de região de armação externaexpostos no anticorpo não humano que sejam diferentesdaqueles nas mesmas posições em regiões de armação de um anticorpo humano e substituição dos resíduosidentificados por aminoácidos que tipicamente ocupemessas mesmas posições em anticorpos humanos.

O enxerto de CDRs é realizado porsubstituição de uma ou mais CDRs de um anticorpo receptor (por exemplo, a anticorpo humano ou outroanticorpo compreendendo resíduos de armação desejados)por CDRs de um anticorpo doador (por exemplo, umanticorpo não humano). Podem-se selecionar anticorposreceptores com base na similaridade de resíduos de armação entre um candidato a anticorpo receptor e umanticorpo doador. Por exemplo, de acordo com umaabordagem Frankenstein, regiões de armação humanas sãoidentificadas como possuindo homologia de seqüênciasubstancial com cada região de armação do anticorpo nãohumano relevante, e CDRs do anticorpo não humano sãoenxertadas no compósito das diferentes regiões dearmação humanas. Um método relacionado tambémutilizável para a preparação de anticorpos da invençãoé descrito na Publicação de Pedido de Patente Norte-americana n° 2003/0040606.

O enxerto de CDRs abreviadas é uma abordagemrelacionada. CDRs abreviadas incluem os resíduosdeterminantes de especificidade e aminoácidosadjacentes, incluindo aqueles nas posições 27d-34, 50-55 e 89-96 na cadeia leve e nas posições 31-35b, 50-58e 95-101 na cadeia pesada (convenção de numeração de(Kabat et al. (1987)). Veja (Padlan et al. (1995) FASEBJ. 9: 133-9) . O enxerto de resíduos determinantes deespecificidade (SDRs) se baseia no entendimento de quea especificade e a afinidade de ligação de um sítio decombinação a anticorpo são determinadas pelos resíduosmais altamente variáveis em cada uma das regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs). A análisedas estruturas tridimensionais de complexos anticorpo-antígeno, combinada com a análise dos dados deseqüência de aminoácidos disponíveis pode ser usadapara modelar a variabilidade de seqüência com base nadissimilaridade estrutural de resíduos de aminoácidosque ocorram em cada posição na CDR. SDRs sãoidentificadas como seqüências polipeptidicasminimamente imunogênicas consistindo em residuos decontato. Veja Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139.

Armações de receptor para enxoerto de CDRs ouCDRs abreviadas também podem ser modificadas paraintroduzir residuos desejados. Por exemplo, armaçõesreceptoras podem compreender uma região variável decadeia pesada de uma seqüência de consenso do subgrupoI humano, opcionalmente com residuos doadores nãohumanos em uma ou mais das posições 1, 28, 48, 67, 69,71 e 93. Como outro exemplo, uma armação receptorahumana pode compreender uma região variável de cadeialeve de uma seqüência de consenso do subgrupo I humano,opcionalmente com residuos doadores não humanos em umaou mais das posições 2, 3, 4, 37, 38, 45 e 60. Após oenxerto, podem-se fazer alterações adicionais nasseqüências doadores e/ou receptoras para otimizar aligação e funcionalidade do anticorpo. Veja, porexemplo, Publicação Internaiconal PCT n° WO 91/09967.

Armações humanas de uma região variável decadeia pesada que podem ser usadas para prepararanticorpos humanizados anti-RAGE incluem os residuos dearmação de DP-75, DP54, DP-54 FW VH 3 JH4, DP-54 VH3 3-07, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-2b e VI-3 (VH1-03), DP-15 eVl-8 (VH1-08), DP-14 e Vl-18 (VH1-18), DP-5 e V1-24P(VH1-24), DP-4 (VHl-45) , DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 eYAC-7 (VHl-69), DP-88 (VHl-e), DP-3 e DA-8 (VHl-f).

Armações humanas de uma região variável decadeia leve que podem ser usadas para prepararanticorpos humanizados anti-RAGE incluem resíduos dearmação de clones de linhagem germinativa humana DPK24,DPK-12, DPK-9 Vkl, DPK-9 Jk4, DPK9 Vkl 02 e clones delinhagem germinantiva dos subgrupos VkIII e VkI. Asseguintes mutações de uma linhagem germinativa DPK24podem aumentar a expressão de anticorpo: FIOS, T45K,I63S, Y67S, F7 3L e T77S.

Anticorpos humanizados anti-RAGErepresentativos da invenção incluem anticorpos com umaou mais CDRs de uma seqüência de aminoácidos de regiãovariável selecionada de SEQ ID NOs:16-27. Por exemplo,anticorpos humanizados anti-RAGE podem compreender duasou mais CDRs selecionadas de CDRs de uma regiãovariável de cadeia pesada de qualquer uma das SEQ IDN0s:16, 18, 21, 24, 20 e 26 ou uma região variável decadeia leve de qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 19, 22,25, 23 e 27. Anticorpos humanizados anti-RAGE tambémpodem compreender uma cadeia pesada compreendendo umaregião variável com duas ou três CDRs de qualquer umadas SEQ ID N0s:16, 18, 21, 24, 20 e 26 e uma cadeialeve compreendendo uma região variável com duas ou trêsCDRs de qualquer uma das SEQ ID NOs: 17, 19, 22, 25, 23 e 27 .

Podem-se construir anticorpos humanizadosanti-RAGE da invenção em que a região variável de umaprimeira cadeia (isto é, a região variável de cadeialeve ou a região variável de cadeia pesada) é humanizada, e em que a região variável da segundacadeia não é humanizada (isto é, uma região variável deum anticorpo produzida em uma espécie não humana).Esses anticorpos são um tipo de anticorpo humanizadochamado de anticorpos semi-humanizados.

As regiões constantes de anticorpos anti-RAGEquiméricos e humanizados podem ser derivadas de regiõesconstantes de qualquer uma das IgA, IgD, IgE, IgG, IgMe qualquer de seus isotipos (por exemplo, os isotiposIgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 de IgG) . As seqüências deaminoácidos de muitas regiões constantes de anticorpossão conhecidas. A escolha de um isotipo humano e amodificação aminoácidos particulares no isotipo podemintensificar ou eliminar a ativação de mecanismos dedefesa do hospedeiro e alterar a biodistribuição doanticorpo. Veja (Reff et al. (2002) Câncer Control 9:152-66). Para a clonagem de seqüências que codifiquemregiões constantes de imunoglobulinas, podem-se deletarseqüências intrônicas.

Anticorpos anti-RAGE quiméricos e humanizadospodem ser construídos usando-se técnicas padronizadasjá conhecidas. Por exemplo, podem-se preparar regiõesvariáveis por anelamento de oligonucleotídeossuperpostos que codifiquem as regiões variáveis eligação em um vetor de expressão contendo uma regiãoconstante de anticorpo humano. Veja, por exemplo,Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., e Patentes Norte-americanas n° 4.196.265,4.946.778, 5.091.513, 5.132.405, 5.260.203, 5.677.427,5.892.019, 5.985.279, 6.054.561. Anticorpostetravalentes (H4L4) compreendendo dois anticorpostetraméricos intactos, incluindo homodímeros eheterodimeros, podem ser preparados, por exemplo,conforme descrito na Publicação Internacional PCT n° WO02/096948. Dimeros de anticorpos também podem serpreparados mediante introdução de resíduos cisteína naregião constante de anticorpo, o que promove a formação de ligações dissulfeto intercadeias, com o usode reticuladores heterobifuncionais (Wolff et al.(1993) Câncer Res. 53: 2560-5) ou por produçãorecombinante para incluir uma região constante dupla(Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30). O fragmento de ligação a antigenoos de anticorposda invenção pode ser preparado, por exemplo, porexpressão de seqüências de anticorpo truncadas ou pordigestão pós-tradução de anticorpos de comprimentototal.

Variantes de anticorpos anti-RAGE da invençãopodem ser prontamente preparadas para incluir váriasalterações, substituições, inserções e deleções. Porexemplo, seqüências de anticorpos podem ser otimizadaspara uso de códon no tipo de célula para expressão deanticorpo. Para aumentar a meia-vida sérica doanticorpo, um epitopo de ligação a receptor desalvamento pode ser incorporado, se já não estiverpresente, na seqüência de cadeia pesada do anticorpo.Veja a Patente Norte-americana n° 5.739.277.

Modificações adicionais para aumentar a estabilidade doanticorpo incluem a modificação de IgG4 para substituira serina no resíduo 241 por prolina. Veja Angal et al.(1993) Mol. Immunol. 30: 105-108. Outras alteraçõesutilizáveis incluem substituições conforme requeridaspara otimizar a eficiência na conjugação do anticorpo aum fármaco. Por exemplo, um anticorpo pode sermodificado em sua terminação carboxila para incluiraminoácidos para fixação de um fármaco, por exemplo, umou mais resíduos cisteína podem ser adicionados. Asregiões constantes podem ser modificadas paraintroduzir sítios para ligação de carboidratos ou outras frações.

Variantes de anticorpos adicionais incluemisoformas de glicosilação que resultem em propriedadesfuncionais aperfeiçoadas. Por exemplo, a modificação daglicosilação de Fc pode resultar em funções efetorasalteradas, por exemplo, ligação aumentada a receptoresgama de Fc e melhor ADCC e/ou poderia diminuir aligação a Clq e CDC (por exemplo, alteração deoligossacarídeos de Fc da forma complexa para um tipode alta manose ou híbrido pode diminuir a ligação a Clqe CDC (veja, por exemplo, Kanda et al., Glycobiology,2007:17:104-118)). A modificação pode ser feita porbioengenharia de bactérias, leveduras, célulasvegetais, células de insetos e células de mamíferos;também pode ser feita por manipulação das vias deglicosilação de proteína ou produto natural emorganismos geneticamente manipulados. A glicosilaçãotambém pode ser alterada explorando-se a liberalidadecom que enzimas de fixação a açúcar(glicosiltransferases) toleram uma ampla gama dediferentes substratos. Finalmente, aqueles versados natécnica podem glicosilar proteínas e produtos naturaismediante várias abordagens químicas: com pequenasmoléculas, enzimas, ligação de proteína, bioengenhariametabólica ou síntese total. Exemplos de inibidores depequena molécula adequados do processamento de Ν-glicano incluem Castanospermina (CS), Cifunensina (KF) ,

Desoximanojirimicina (DMJ), Swainsonina (Sw), Monensina(Mn).

Variantes de anticorpos anti-RAGE da invençãopodem ser produzidas usando-se técnicas recombinantespadronizadas, incluindo mutagênese direcionada a sítioou clonagem de recombinação. Um repertóriodiversificado de anticorpos anti-RAGE pode serpreparado mediante métodos de arranjo de genes econversão de genes em animais transgênicos não humanos(Publicação de Patente Norte-americana n°2003/0017534), que são, então, testados quanto aatividades relevantes usando ensaios funcionais. Emmodalidades particulares da invenção, obtêm-sevariantes usando um protocolo de maturação porafinidade para mutação de CDRs (Yang et al. (1995) J.Mol. Biol. 254: 392-403), embaralhamento de cadeia(Marks et al. (1992) Biotechnology ( NY ) 10: 779-783),uso de cepas causadoras de mutação de E. coli (Low etal. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368), embaralhamentode DNA (Patten et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:724-733), exposição em fago (Thompson et al. (1996) J.Mol. Biol. 256: 77-88) e PCR sexual (Crameri et al.(1998) Nature 391: 288-291). Para aplicações em1imunoterapia, ensaios funcionais relevantes incluem aligação especifica a um antigeno RAGE humano,internalização de anticorpo e direcionamento a um sitiode tumor, quando administrado a um animal portador deum tumor, conforme aqui descrito abaixo.

A presente invenção também apresenta célulase linhagens cleulares que expressam anticorpos anti-RAGE da invenção. Células hospedeiras representativasincluem células de mamíferos e humanas, como célulasCHO, células HEK-293, células HeLa, céluilas CV-I ecélulas COS. Conhecem-se na técnica métodos para ageração de uma linhagem celular estável após atransformação de um construto heterólogo em uma célulahospedeira. Células hospedeiras não mamíferasrepresentativas incluem células de insetos (Potter etal. (1993) Int. Rev. Immunol. 10 (2-3) : 103-112) . Osanticorpos também podem ser produzidos em animaistransgênicos (Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol.13 (6) : 625-629) e plantas transgênicas (Schillberg etal. (2003) Cell Mol. Life Sei. 60(3) :433-45) .

Conforme acima discutido, anticorposmonoclonais, quiméricos e humanizados, que tenham sidomodificados, por exemplo, por deleção, adição ousubstituição de outras porções do anticorpo, porexemplo, a região constante, também estão dentro doâmbito da invenção. Por exemplo, um anticorpo pode sermodificado da seguinte maneira: (i) por deleção daregião constante; (ii) por substituição da regiãoconstante por outra região constante, por exemplo, umaregião constante destinada a aumentar a meia-vida,estabilidade ou afinidade do anticorpo ou uma regiãoconstante de outra espécie ou classe de anticorpo; ou(iii) por modificação de um ou mais aminoácidos naregião constante para alterar, por exemplo, o número desítios de glicosilação, a função de célula efetora, aligação a receptor de Fc (FcR), a fixação decomplemento, entra outras.

Métodos para alterar uma região constante deanticorpo são conhecidos na técnica. Anticorpos comfunção alterada, por exemplo, afinidade alterada por umligante efetor, como FcR em uma célula ou o componenteCl do complemento, podem ser produzidos porsubstituição de pelo menos um resíduo de aminoácido naporção constante do anticorpo por um resíduo diferente(veja, por exemplo, EP 388.151 Al, Patente Norte-americana n° 5.624.821 e Patente Norte-americana n°5.648.260, cujos conteúdos são aqui incorporados porreferência). Poderiam ser descritos tipos similares dealterações que, caso aplicados a imunoglobulina demurídeos ou outras espécies, reduziriam ou eliminariamessas funções.

Por exemplo, é possível alterar a afinidadede uma região Fc de um anticorpo (por exemplo, um IgG,como um IgG humano) para uma ligação a FcR (porexemplo, FcyRI) ou a Clq por substituição do(s)resíduo(s) específicado(s) por um resíduo(s) com umafuncionalidade apropriada em sua cadeia colateral oupor introdução de um grupo funcional carregado, comoglutamato ou aspartato, ou talvez um resíduo não polararomático, como fenilalanina, tirosina, triptofano oualanina (veja, por exemplo, Patente Norte-americana n°5,624,821).O anticorpo ou seu fragmento de ligação podeser conjugado a uma citotoxina, um agente terapêuticoou um ion metálico radioativo. Em uma modalidade, aproteína que é conjugada é um anticorpo ou seufragmento. Uma citotoxina ou agente citotóxico incluiqualquer agente que seja prejudicial para células.Exemplos não limitativos incluem caliqueamicina, taxol,citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio,emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida,vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina,daunorubicina, diidróxi antracin diona, mitoxantrona,mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona,glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaina,propranolol, puromicina e seus análogos ou homólogos.Agentes terap-euticos incluem, mas não se limitam a,antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina e 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (porexemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan,carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida,busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicinaC e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP), cisplatina),antraciclinas (por exemplo, daunorubicina edoxorubicina), antibióticos (por exemplo,dactinomicina, bleomicina, mitramicina e antramicina) eagentes antimitóticos (por exemplo, vincristina evinblastina). Técnicas para a conjugação dessas fraçõesa proteínas são bem conhecidas na técnica.

Alternativamente, agora é possível produziranimais transgênicos (por exemplo, camundongos) quesejam capazes de, por imunização, produzir umrepertório completo de anticorpos humanos na ausênciada produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo,descreveu-se que a deleção homogênea do gene de regiãode junção de cadeia pesada do a anticorpo (JM) emcamundongos mutantes quiméricos e de linhagemgerminativa resulta em inhibição completa da produçãode anticorpo endógeno. A transferência do arranjo degene de imunoglobulina de linhagem germinativa humananesses camundongos mutantes de linhagem germinativaresultará na produção de anticorpos humanos com odesafio com antígeno. Veja, por exemplo, Jackobovits etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993);Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993);Bruggermann et al. , Year em Immune, 7:33 (1983); eDuchosal et al. Nature 355:258 (1992). Anticorposhumanos também podem ser derivados de bibliotecas deexposição em fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol.227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309(1996)).

Em certas modalidades, os anticorpos dapresente invenção podem ser administrados em combinaçãocom outros agentes como parte de uma terapia decombinação. Por exemplo, no caso de condiçõesinflamatórias, os presentes anticorpos podem seradministrados em combinação com um ou mais outrosagentes utilizáveis no tratamento de doenças oucondições inflamatórias. No caso de condiçõespatológicas cardiovasculares e particularmente aquelasque surgem de placas ateroscleróticas, que se acreditaque tenham um componente inflamatório substancial, ospresentes anticorpos podem ser administrados emcombinação com um ou mais outros agentes utilizáveis notratamento de doenças cardiovasculares. No caso decâncer, os presentes anticorpos podem ser administradosem combinação com um ou mais fagores antiangiogênicos,quimioterápicos ou como um adjuvante de radioterapia.

Também se considera que a administração dos presentesanticorpos sirva como parte de um regime de tratamentode câncer que pode ocmbinar muitos agentes terapêuticosde câncer diferentes. No caso de IBD, os presentesanticorpos podem ser administrados com um ou maisagentes antiinflamatórios e também podem ser combinadoscom um regime de dieta modificada.

Métodos Para Inibição da Interação Entre umRAGE-LBE e um RAGE-BP

A invenção inclui métodos para inibir ainteração entre RAGE e um RAGE-BP ou modular aatividade de RAGE. De preferência, esses métodos sãousados para o tratamento de transtornos associados aRAGE.

Esses métodos podem compreender aadministração de um anticorpo gerado contra RAGEconforme aqui exposto. Esses métodos compreendem aadministração de um anticorpo que se liga especificamente a um ou mais epitopos de uma proteínaRAGE com uma seqüência de aminoácidos conformeapresentada na SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13. Em aindaoutra modalidade, esses métodos compreendem a administração de um composto que iniba a ligação deRAGE a um ou mais RAGE-BPs. Métodos exemplificativos deidentificação desses compostos são discutidos abaixo.

Em certas modalidades, a interação é inibidain vitro, como em uma mistura de reação compreendendoproteínas purificadas, células, amostras biológicas,tecidos, tecidos artificiais e outros. Em certasmodalidades, a interação é inibida in vivo, porexemplo, por administração de um anticorpo que se ligaa RAGE ou seu fragmento de ligação a RAGE. O anticorpoou seu fragmento se liga a RAGE e inibe a ligação de umRAGE-BP.

A invenção inclui métodos para a prevenção outratamento de um transtorno relacionado a RAGE porinibição da interação entre RAGE e um RAGE-BP oumodulação da atividade de RAGE. Esses métodos incluem aadministração de um anticorpo contra RAGE em umaquantidade eficaz para inibir a interação e durante umtempo suficiente para prevenir ou tratar o ditotranstorno.

Ácidos nucléicos

Ácidos nucléicos são desoxirribonucleotídeosou ribonucleotídeos e seus polímeros forma de filamentosimples, filamento duplo ou tríplex. A menos queespecificamente limitado, ácidos nucléicos podem conteranálogos conhecidos de nucleotídeos naturais que tenhampropriedades similares às do ácido nucléico natural dereferência. Ácidos nucléicos incluem genes, cDNAs,mRNAs e cRNAs. Ácidos nucléicos podem ser sintetizadosou podem ser derivados de qualquer fonte biológica,incluindo qualquer organismo.

Ácidos nucléicos representativos da invençãocompreendem uma seqüência de nucleotideos que codificaRAGE mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 8, 10,12, correspondendo aos cDNAs expostos que codificamRAGE de babuino, macaco cinomolgo e coelho ou mostradana SEQ ID NO: 15, correspondendo a uma seqüência de DNAgenômico que codifica RAGE de babuino. Ácidos nucléicosda invenção também compreendem uma seqüência denucleotideos que codifica qualquer uma das seqüênciasde aminoácidos de região variável de anticorpomostradas nas SEQ ID NOs: 16-49.

Ácidos nucléicos da invenção também podemcompreender uma seqüência de nucleotideos que sejasubstancialmente idêntica a qualquer uma das SEQ IDNOs: 6, 8, 10, 12 e 15, incluindo seqüências denucleotideos que sejam pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idênticasa qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12 e 15.

Ácidos nucléicos da invenção também podemcompreender uma seqüência de nucleotideos que codificauma proteína RAGE com uma seqüência de aminoácidos queseja substancialmente idêntica a qualquer uma dasseqüências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NOs: 7,9, 11 e 13, incluindo seqüências de nucleotídeos quesejam pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idênticas a qualquer umadas SEQ ID NOs: 7, 9, 11 e 13.

Ácidos nucléicos da invenção também podemcompreender uma seqüência de nucleotídeos que codificauma região variável de anticorpo anti-RAGE com umaseqüência de aminoácidos que seja substancialmenteidêntica a qualquer uma das seqüências de aminoácidosmostradas na SEQ ID NOs: 16-49, incluindo uma seqüênciade nucleotídeos que codifica uma seqüência deaminoácidos que seja pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,99, 5% ou 99,9% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-49.

As seqüências são comparadas quanto acorrespondência máxima com um algoritmo de comparaçãode seqüências usando-se a seqüência codificadora deregião variável de comprimento total de qualquer umadas SEQ ID NOs: 16-49, uma seqüência de nucleotídeosque codifica uma região variável de comprimento totalcom qualquer uma das seqüências mostradas nas SEQ IDNO: 16-4 9 como a seqüência de pergunta, conforme aquidescrito abaixo, ou por inspeção visual.

Seqüências substancialmente idênticas podemser seqüências polimórficas, isto é, seqüênciasalternativas ou alelos em uma população. Uma diferençaalélica pode ser tão pequena quanto um par de bases.Seqüências substancialmente idênticas também podemcompreender seqüências que sofreram mutagênese,incluindo seqüências compreendendo mutaçõessilenciosas. A mutação pode compreender uma ou maisalterações de resíduos, uma deleção de um ou maisresíduos ou uma inserção de um ou mais resíduosadicionais.

Ácidos nucléicos substancialmente idênticos também são identificados como ácidos nucléicos que sehibridizam especificamente ou se hibridizamsubstancialmente ao comprimento total de qualquer umadas SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12 ou 15 ou ao comprimentototal de qualquer seqüência de nucleotídeos que codifique uma seqüência de aminoácidos de RAGE mostradanas SEQ ID NOs: 7, 9, 11 e 13 ou codifique umaseqüência de aminoácidos de região variável deanticorpo mostrada nas SEQ ID NOs: 16-49, sob condiçõesrigorosas. No contexto da hibridização de ácidosnucléicos, duas seqüências de ácidos nucléicos queestejam sendo comparadas podem ser designadas como umasonda e um alvo. A sonda é uma molécula de ácidonucléico de referência, e o alvo é uma molécula deácido nucléico de teste, freqüentemente encontradadentro de uma população heterogênea de moléculas deácido nucléico. Seqüência de alvo é sinônimo deseqüência de teste.

Para estudos de hibridização, sondasutilizáveis são complementares a ou imitam pelo menoscerca de 14 a 40 seqüências de nucleotideos de umamolécula de ácido nucléico da presente invenção. Depreferência, as sondas compreende de 14 a 20nucleotideos ou mesmo mais, quando desejado, como 30,40, 50, 60, 100, 200, 300 ou 500 nucleotideos ou até ocomprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 8,10, 12 ou 15 ou o comprimento total de qualquerseqüência de nucleotideos que codifique uma seqüênciade aminoácidos de RAGE mostrada nas SEQ ID NOs: 7, 9,11 e 13 ou que codifique uma seqüência de aminoácidosde região variável de anticorpo mostrada nas SEQ IDNOs: 16-4 9. Esses fragmentos podem ser prontamentepreparados, por exemplo, por síntese química dofragmento, por aplicação de tecnologia de amplificaçãode ácidos nucléicos ou por introdução de seqüênciasselecionadas em vetores recombinantes para produçãorecombinante.

Hibridização especifica se refere à ligação,formação de dúplex ou hibridização de uma moléculaapenas a uma seqüência de nucleotideos particular sobcondições rigorosas, quando essa seqüência estápresente em uma mistura de ácidos nucléicos complexos(por exemplo, DNA ou RNA celular total) . A hibridizaçãoespecifica pode acomodar faltas de correspondênciaentre a seqüência de sonda e a de alvo, dependendo dorigos das condições de hibridização.

Condições de hibridização rigorosa econdições de lavagem de hibridização rigorosas, nocontexo de experimentos de hibridização de ácidosnucléicos, como análises de Southern e Northern blot,dependem tanto da seqüência, quanto do ambiente.Seqüências mais longas se hibridiam especificamente atemperaturas mais elevadas. Um guia abrangente dahibridização de ácidos nucléicos é encontrado emTijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology - Hybridiztion with Nucleic AcidProbesr parte I capitulo 2, Elsevier, New York, N.Y.Genericamente, condições de hibridização e de lavagemaltamente rigorosas são selecionadas como sendo cercade 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) de umaseqüência especifica a uma força iônica e pH definidos.Tipicamente, sob condições rigorosas, uma sonda sehibridizará especificamente com sua seqüência alvo, masnão com outras seqüências.

A Tm é a temperatura (sob uma força iônica epH definidos) em que 50% da seqüência alvo sehibridizam a uma sonda perfeitamente correspondente. Condições muito rigorosas são selecionadas como sendoiguais à Tm para uma sonda particular. Um exemplo decondições rigorosas de hibridização para análises deSouthern ou Northern Blot de ácidos nucléicoscomplementares com mais do que cerca de 100 resíduos complementares é uma hibridização durante um anoite emformamida a 50% com 1 mg de heparina a 42°C. Um exemplode condições de lavagem altamente rigorosas são 15minutos em 0,IxSSC a 65°C. Um exemplo de condições delavagem rigorosas são 15 minutos em 0,2><tampão SSC a 65°C. Veja Sambrook et al. , eds (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., para umadescrição do tampão SSC. Freqüentemente, uma lavagemaltamente rigorosa é precedida por uma lavagem de baixorigor, para remover sinal de sonda de fundo. Um exemplode condições de lavagem de rigor médio para um dúplexde mais de cerca de 100 nucleotideos são 15 minutos emIxSSC a 45°C. Um exemplo de lavagem de baixo rigor paraum dúplex de mais de cerca de 100 nucleotideos são 15minutos em 4χ a 6*SSC a 40°C. Para sondas mais curtas(por exemplo, de cerca de 10 a 50 nucleotideos),condições rigorosas tipicamente envolvem concentraçõesde sal de menos de cerca de IM de ions Na+, tipicamentede cerca de 0,01 a IM de concentração de ions Na+ (ououtros sais), a pH 7,0-8,3, e a temperatura étipicamente de pelo menos cerca de 30°C. Condiçõesrigorosas também podem ser conseguidas com a adição deagentes desestabilizadores como formamida. Em geral,uma razão de sinal para ruido de 2 vezes (ou mais) aobservada para uma sonda não relacionada no ensaio dehibridização particular indica a detecção de umahibridização especifica.

Os seguintes são exemplos de condições dehibridização e lavagem que podem ser usadas paraidentificar seqüências de nucleotideos que sejamsubstancialmente idênticas a seqüências de nucleotideosde referência da presente invenção: uma seqüência denucleotideos de sonda se hibridiza, de preferência, auma seqüência de nucleotideos de alvo em dodecilsulfato de sódio a 7% (SDS) , 0,5M de NaPO4, 1 mM deEDTA a 50°C, seguido por lavagem em 2*SSC, 0,1% de SDSa 50°C; mais preferivelmente, uma seqüência de sonda ealvo se hibridizam em dodecil sulfato de sódio a 7%(SDS) , 0, 5M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C, seguido porlavagem em lxSSC, 0,1% de SDS a 50°C; maispreferivelmente, uma seqüência de sonda e alvo sehibridizam em dodecil sulfato de sódio a 7% (SDS), 0,5Mde NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C, seguido por lavagem em0, 5*SSC, 0,1% de SDS a 50°C; mais preferivelmente, umaseqüência de sonda e alvo se hibridizam em dodecilsulfato de sódio a 7% (SDS) , 0,5M de NaPO4, 1 mM deEDTA a 50°C seguido por lavagem em 0,1*SSC, 0,1% de SDSa 50°C; mais preferivelmente, uma seqüência de sonda ealvo se hibridizam em dodecil sulfato de sódio a 7%(SDS) , 0, 5M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C seguido porlavagem em 0,1><SSC, 0,1% SDS a 65°C.

Uma indicação adicional de que duasseqüências de ácidos nucléicos são substancialmenteidênticas que que as proteínas codificadas pelos ácidosnucléicos são substancialmente idênticas, compartilhamuma estrutural tridimensional global ou sãoequivalentes biologicamente funcionais. Esses termossão adicionalmente definidos mais abaixo. Moléculas deácido nucléico que não se hibridizam entre si sobcondições rigorosas ainda são substancialmenteidênticas, se as proteínas correspondentes foremsubstancialmente idênticas. Isso pode ocorrer, porexemplo, quando duas seqüências de nucleotídeoscompreendem variantes substituídas de maneiraconservadora, conforme permitido pelo código genético.

Variantes substituídas de maneiraconservadora são seqüências de ácidos nucléicos comsubstituições de códons degeneradas, em que a terceiraposição de um ou mais códons selecionados (ou todos) ésubstituída por resíduos de base mista e/oudesoxiinosina. Veja Batzer et al. (1991) Nucleic AcidsRes. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem.260:2605-2608; e Rossolini et al. (1994) Mol. CellProbes 8:91-98.

Ácidos nucléicos da invenção tambémcompreendem ácidos nucléicos complementares a qualqueruma das SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12 ou 15 ou seqüências denucleotídeos que codifiquem uma seqüência deaminoácidos de RAGE mostrada nas SEQ ID NOs: 7, 9, 11 e13 ou codifiquem uma seqüência de aminoácidos de regiãovariável de anticorpo mostrada nas SEQ ID NOs: 16-4 9 esuas seqüências complementares. Seqüênciascomplementares são duas seqüências de nucleotideos quecompreendam seqüências de nucleotideos antiparalelascapazes de pareamento entre si com a formação deligações de hidrogênio entre pares de bases. Conformeaqui usado, o termo seqüências complementares significaseqüências de nucleotideos que sejam substancialmentecomplementares, conforme pode ser avaliado pelos mesmosmétodos de comparação de nucleotideos apresentadosabaixo ou é definido como capazes de hibridização aosegmento de ácido nucléico em questão sob condiçõesrelativamente rigorosas, como aquelas aqui descritas.

Um exemplo particular de um segmento de ácido nucléicocomplementar é um oligonucleotideo anti-sentido,

Uma subseqüência é uma seqüência de ácidonucléico que compreende uma parte de uma seqüência deácido nucléico mais longa. Uma subseqüênciaexemplificativa é uma sonda, acima descrita, ou umprimer. O termo primer, conforme aqui usado, refere-sea uma seqüência contígua compreendendo cerca de 8 oumais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotideos, depreferência 10-20 nucleotideos e, mais preferivelmente,20-30 nucleotideos de uma molécula de ácido nucléicoselecionada. Os primers da invenção englobamoligonucleotídeos de comprimento suficiente e seqüênciaapropriada para fornecer a iniciação de polimerizaçãoem uma molécula de ácido nucléico da presente invenção.

Uma seqüência alongada compreendenucleotideos adicionais (ou outras moléculas análogas)incorporados no ácido nucléico. Por exemplo, umapolimerase (por exemplo, uma DNA polimerase) podeadicionar seqüências na terminação 3' da molécula deácido nucléico. Além disso, a seqüência de nucleotideospode ser combinada com outras seqüências de DNA, comopromotores, regiões promotoras, intensificadores,sinais de poliadenilação, seqüências intrônicas, sitiosde enzima de restrição adicionais, múltiplos sitios declonagem e outros segmentos de codificação. Assim, ainvenção também apresenta vetores compreendendo osácidos nucléicos apresentados, incluindo vetores paraexpressão recombinante, em que um ácido nucléico dainvenção está operacionalmente ligado a um promotorfuncional. Quando operacionalmente ligado a um ácidonucléico, o promotor está em combinação funcional com oácido nucléico, de modo que a transcrição do ácidonucléico é controlada e regulada pela região promotora.

Vetores se referem a ácidos nucléicos capazes dereplicação em uma célula hospedeira, como plasmidios,cosmidios e vetores virais.

Ácidos nucléicos da presente invenção podemser clonados, sintetizados, alterados, submetidos amutagênese ou suas combinações. Técnicas padronizadasde DNA recombinante e clonagem molecular usadas paraisolar ácidos nucléicos são conhecidas. A mutagêneseespecifica para sitio para criar alterações, deleçõesou pequenas inserções de pares de bases também éconhecida na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook etal. (eds.) (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.; Silhavy et al. (1984) Experimentewith Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.; Glover & Hames (1995) DNACloning: A Practical Approache 2a ed. IRL Press naOxford University Press, Oxford/N.Y.; Ausubel (ed.)(1995) Short Protocols in Molecular Biologye 3a ed.Wiley, N.Y.

Métodos Profiláticos e Terapêuticos

A presente invenção apresenta um método parao tratamento de um sujeito com uma doença ou transtornocaracterizado por depósito amilóide de Αβ, como doençade Alzheimer, que compreende a administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo quese ligue especificamente a RAGE e iniba a ligação de umparceiro de ligação a RAGE a um sujeito.

A invenção também apresenta um método deinibição ou redução do acúmulo de depósito amilóide deΑβ em um sujeito, compreendendo a administração aosujeito de uma quantidade eficaz de um anticorpo que seligue especificamente a RAGE e iniba a ligação de umparceiro de ligação a RAGE. Também está incluído nainvenção um método de inibição ou redução daneurodegeneração em um sujeito, compreendendo aadministração ao sujeito de uma quantidade eficaz de umanticorpo que se ligue especificamente a RAGE e iniba aligação de um parceiro de ligação a RAGE. A invençãotambém inclui um método de inibição ou redução dodeclínio cognitivo ou de melhora da cognição, em umsujeito, compreendendo a administração ao sujeito deuma quantidade eficaz de um anticorpo que se ligueespecificamente a RAGE e iniba a ligação de um parceirode ligação a RAGE. A invenção também apresenta ummétodo para o tratamento de um sujeito com uma doençaou transtorno amiloidogênico caracterizado por depósitoamilóide, que compreende a administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo quese ligue especificamente a RAGE e iniba a ligação de umparceiro de ligação a RAGE.

A presente invenção apresenta um método parao tratamento de um sujeito com uma doença ou transtornocaracterizado por depósito amilóide de Αβ, como doençade Alzheimer, gue compreende a administração de umaguantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo quese ligue especificamente a RAGE e iniba a ligação de umparceiro de ligação a RAGE a um sujeito, sob condiçõesque gerem uma resposta terapêutica benéfica no sujeito(por exemplo, redução da carga de placas, inhibição daformação de placas, redução da distrofia neuritica emelhora da função cognitiva, por exemplo, melhorandorapidamente a cognição e/ou revertendo, tratando ouprevenindo o declínio cognitivo) no paciente.

Doenças associadas a depósitos amilóides deΑβ no cérebro incluem doença de Alzheimer, síndrome deDown e prejuízo cognitivo. Este último pode ocorrer comou sem outras características de uma doençaamiloidogênica.

Além de produtos finais de glicação avançada(AGE's), que se formam em estados hiperglicêmicosprolongados, os ligantes de RAGE incluem proteínas comestrutura fibrilar de folha β que são característicasde depósitos amilóides e mediadores pró-inflamatórios,incluindo proteína beta-amilóide (Αβ), amilóide sérico(SAA) (forma fibrilar), SlOO/calgranulinas (porexemplo, S100A12, S100B, S100A8-A9) e proteína 1cromossômica de caixa-1 do grupo de alta mobilidade(HMGB1, também conhecida como anfoterina). Há umapercepção crescente do papel de RAGE na progressãopatológica de doenças amiloidogênicas. Além de suacontribuição à patogênese da doença de Alzheimer,demonstrou-se que RAGE está intimamente relacionada aoestresse celular e à deposição de amilóide sérico A(SAA) no baço (Yan et al., 2000, Nature Med., 6:643-51). RAGE está associada ao acúmulo de amilóido nosrins e à destruição tissular que leva à insuficiênciarenal em indivíduos com polineuropatia amiloidóticafamiliar (FAP) (Matsunaga et al. , 2005, Scand. J. Clin.Lab. Invest.). O ligante de RAGE anfoterina (HMGBl)também contém um peptídio-1 amiloidogênico que éaltamente homólogo ao peptídio Αβ de Alzheimer e formapeptídios do tipo amilóide quando lilberado da proteínanativa (Kallijarvi et al, 2001, Biochem., 40:10032-7).

A interação de Αβ com células portadoras deRAGE nas paredes de vasos sangüíneos resulta notransporte de Αβ através da barreira hematoencefálica(BHE) e na expressão de citocinas pró-inflamatórias eendotelina-1 (ET-I) , esta última mediando avasoconstrição induzida por Δβ. Assim, a presenteinvenção também apresenta métodos para reduzir avasoconstrição induzida por Αβ.

Demonstrou-se que a inibição da interaçãoRAGE-Iigante suprime o acúmulo de Αβ no parênquimacerebral em um modelo de camundongo transgênico paradoença do tipo Alzheimer (Deane et al., 2003, NatureMedicine 9:907-913). O papel patogênico ativo de RAGEem uma ampla gama de doenças e transtornosamiloidogênicos torna possível proporcionar tratamentoterapêucio benéfico a pacientes com esses transtornosamiloidogênicos pelo método da presente invenção, queapresenta anticorpos que se ligam especificamente aRAGE e inibem a ligação de um parceiro de ligação aRAGE.

Os métodos da invenção podem ser usados tantoem pacientes assintomáticos, quanto naqueles mostrando atualmente sintomas de doença. Os anticorpos usadosnesses métodos podem ser anticorpos humanos,humanizados, quiméricos ou não humanos ou seusfragmentos (por exemplo, fragmentos de ligação a RAGE),conforme aqui descrito. Em ainda outro aspecto, ainvenção apresenta a administração de anticorpospreparados a partir de um ser humano imunizado com[considero que isso deva ser RAGE, embora talvez devaser simplemente deletado] peptidio Αβ, esse ser humanopodendo ser um paciente a ser tratado com anticorpo. Osmétodos terapêuticos da invenção podem ser realizadosusando-se um anticorpo que:

(a) compete pela ligação a RAGE com umanticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-H1,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;

(b) se liga a um epitopo de RAGE que é ligadopor um anticorpo selecionado do grupo que consiste emXT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;

(d) é um fragmento de ligação a RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

Por exemplo, os métodos da invenção podem serrealizados por administração ao sujeito de um anticorpoou fragmento de anticorpo de ligação a RAGE quecompreende uma região variável de cadeia levecompreendendo CDRs de uma região variável de cadeialeve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17), a região variável decadeia pesada compreendendo CDRs de uma seqüência deregião variável de cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO:16), uma região constante de cadeia leve kapa humana; euma região constante de cadeia pesada de IgGl humana.Os métodos da invenção também podem ser realizadosusando-se um anticorpo ou seu fragmento de ligação aRAGE compreendendo uma região variável de cadeia leve com uma seqüência de aminoácidos de uma região variávelde cadeia leve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17), uma regiãovariável de cadeia pesada com uma seqüência deaminoácidos de uma seqüência de região variável decadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16) , uma região constante de cadeia leve kapa humana; e uma regiãoconstante de cadeia pesada de IgGl humana. Descriçõesdesses e de muitos outros anticorpos que podem serusados com sucesso para o método da invenção são feitasaqui.

Agentes terapêuticos da invenção estãotipicamente em forma substancialmente pura decontaminantes indesejáveis. Isso significa que umagente é tipicamente pelo menos cerca de 50% p/p(peso/peso) puro, assim como substancialmente livre deproteínas e contaminantes de interferência. Às vezes,os agentes são pelo menos cerca de 80% p/p e, maispreferivelmente, pelo menos 90 ou cerca de 95% p/ppuros. Entretanto, usando-se técnicas de purificação deproteínas convencionais, podem-se obter peptídioshomogêneos pelo menos 99% p/p puros.

A invenção inclui a administração de umanticorpo com um veículo farmacêutico como umacomposição farmacêutica. Alternativamente, o anticorpopode ser administrado a um paciente por administraçãode um polinucleotídeo que codifique pelo menos umacadeia de anticorpo. O polinucleotídeo é expressadopara produzir a cadeia de anticorpo no paciente. Opolinucleotídeo pode codificar cadeias pesadas e levesdo anticorpo. 0 polinucleotídeo é expressado paraproduzir as cadeias pesadas e leves no paciente. Emmodalidades exemplificativas, o paciente é monitorizadoquanto ao nível de anticorpo administrado no sangue dopaciente.

A invenção, portanto, atende a umanecessidade antiga de regimes terapêuticos paraprevenir ou melhorar a neuropatologia e, em algunspacientes, o prejuízo cognitivo associado a doença deAlzheimer.Redução do Declínio Cognitivo e/ou Melhora daCognição

A presente invenção apresenta um método parainibir ou reduzir o declínio cognitivo e/ou melhorar acognição, em um paciente com ou com risco de sofrer deuma doença ou transtorno relacionada a Αβ ou doença outranstorno amiloidogênico (por exemplo, AD),compreendendo a administração ao sujeito de umaquantidade eficaz de um anticorpo que se ligueespecificamente a RAGE e iniba a ligação de um parceirode ligação a RAGE.

Os métodos apresentam a administração de umadose eficaz de um anticorpo da invenção de modo que odeclínio cognitivo seja reduzido e/ou se coniga umamelhora na cognição. Por exemplo, consegue-se a melhorade um ou mais déficits cognitivos do paciente (porexemplo, déficits de aprendizagem procedimental e/oumemória). 0 déficit cognitivo pode ser um prejuízo namemória explícita (também conhecido como memória"declarativa" ou "de trababalho"), que é definida comoa capacidade de armazenar e recuperar informaçõesespecíficas que estejam disponíveis à consciência e quepossam, portanto, ser expresar pela linguaguem (porexemplo, a capacidade de se lembrar de um fato ouevento especifico). Alternativamente, o déficitcognitivo pode ser um prejuízo na mamória procedimental(também conhecida como memória "implícita" ou"contextual"), que é definida como a capacidade deadquirir, reter e recuperar informações ouconhecimentos genéricos que não estejam disponíveispara a consciência e que requeiram o aprendizado dehabilidades, associações, hábitos ou reflexos complexospara serem expressados, por exemplo, a capacidade de selembrar como executar uma tarefa específica. Indivíduosque sofram de déficits de memória procedimental estãomuito mais prejudicados em sua capacidade de agirnormalmente. Assim, tratamentos que sejam eficazes paramelhorar os déficits da memória procedimental sãoaltamente desejáveis e vantajosos.

Pacientes Passíveis de Tratamento

Pacientes passíveis de tratamento pelainvenção incluem indivíduos com risco de uma doença outranstorno relacionado a Αβ ou doença ou transtornoamiloidogênico, mas não mostrando sintomas, assim comopatients mostrando atualmente sintomas. No caso dedoença de Alzheimer, virtualmente qualquer um tem riscode sofrer de doença de Alzheimer se ele ou ela viver osuficiente. Conseqüentemente, os presentes métodospodem ser administrados profilaticamente à população emgeral, sem a necessidade de qualquer avaliação do riscodo paciente em questão.

Os presentes métodos são particularmenteúteis para indivíduos que tenham risco de AD, porexemplo, aqueles que exibem fatores de risco de AD. 0principal fator de risco de AD é a idade avançada. Como envelhecimento da população, a freqüência de ADcontinua a aumentar. As atuais estimativas indicam que até 10% da população com mais de 65 anos e até 50% dapopulação com mais de 85 têm AD.

Embora raros, certos indivíduos podem seridentificados em uma idade precoce como sendogeneticamente predispostos ao desenvolvimento de AD.Indivíduos protadores da forma hereditária de AD,conhecida como "AD familiar" ou "AD de início precoce",podem ser identificados a partir de um históricofamiliar bem documentado de AD, da análise de um geneque se sabe que confere AD quando sofre mutação, por exemplo, o gene de APP ou presenilina. Mutações de APPbem caracterizadas incluem as mutações "Hardy" noscódons 716 e 717 de APP770 (por exemplo, valina717 emisoleucina (Goate et al., (1991), Nature 349:704);valina717 em glicina (Chartier et al. (1991) Nature353:844; Murrell et al. (1991), Science 254:97);valina717 em fenilalanina (Mullan et al. (1992), NatureGenet. 1:345-7)), as mutações "Swedish" nos códons 670e 671 de APP770 e a mutação "Flemish" no códon 692 deAPP770. Acredita-se que essas mutações causem doença deAlzheimer por um processamento aumentado ou alterado deAPP em Αβ, particularmente o processamento de APP emquantidades aumentadas da forma longa de Αβ (isto é,Αβ1-42 e Αβ1-4 3) . Acredita-se que mutações em outrosgenes, como os genes de presenilina, PS1 e PS2, afetemindiretamente o processamento de APP, gerandoquantidades aumentadas da forma longa de Αβ (vejaHardy, TINS 20: 154 (1997); Kowalska et al., (2004),Polish J. Pharmacol., 56: 171-8). Além de AD, mutaçõesno aminoácido 692 ou 693 da isoforma de 770 aminoácidosde APP foram implicadas no transtorno amiloidogênicocerebral chamado de Hemorragia Cerebral Hereditária comAmiloidose do Tipo Holandês' (HCHWA-D).

Mais comumente, AD não é herdada por umpaciente, mas se desenvolve devido à interação complexade vários fatores genéticos. Diz-se que essesindivíduos têm "AD esporádica" (também conhecida como"AD de início tardio") , uma forma que é muito maisdifícil de diagnosticar. Todavia, a população depaciente pode ser tríada quanto à presença de alelos outraços de.suscetibilidade que não causem AD, mas que sesaiba que segreguem com AD a uma freqüência maior doque na população em geral, por exemplo, os alelos ε2,ε3 e ε4 da apolipoproteína E (Corder et. al. (1993),Science, 261: 921-923). Em particular, pacientes sem oalelo ε4, de preferência além de algum outro marcadorpara AD, podem ser identificados como "com risco" deAD. Por exemplo, pacientes sem o alelo ε4 que tenhamparentes com AD ou que sofram de hipercolesterolemia ouaterosclerose podem ser identificados como "com risco"de AD. Outro biomarcador em potencial é a avaliaçãocombinada dos níveis de Αβ42 e tau no fluido cérebro-espinhal (FCE). Baixos níveis de Αβ42 e altos de tautêm um valor preditivo na identificação de pacientescom risco de AD.

Outros indicadores de pacientes com risco deAD incluem dados neuropatológicos dinâmicos in vivo,por exemplo, deteção in vivo de beta amilóide cerebral,padrões de ativação cerebral e outros. Esses dadospodem ser obtidos usando-se, por exemplo, imagem deressonância magnética tridimensional (MRI), varredurade tomografia de emissão de pósitron (PET) e tomografiacomputadorizada de emissão de fóton único (SPECT).Indicadores de pacientes com provável AD incluem, masnão se limitam a, parcientes (1) com demência, (2) deuma idade de 40-90 anos, (3) déficits cognitivos, porexemplo, em dois ou mais domínios cognitivos, (4)progressão dos déficits durante mais de seis meses, (5)consciência não perturbada e/ou (6) ausência d eoutrosdiagnósticos razoáveis.

Indivíduos que sofram de formas esporáticasou familiares de AD normalmente são, entretanto,diagnosticados após apresentarem um ou mais sintomascaracterísticos de AD. Sintomas comuns de AD incluemdéficits cognitivos que afetem o desempenho dehabilidades ou tarefas rotineiras, problemas com alinguagem, desorientação no tempo ou espaço, julgamentoruim ou diminuído, prejuízos no pensamento abstrato,perda de controle motor, alteração do humor oucomportamento, alteração de personalidade ou perda deiniciativa. o número de déficits ou o grau do déficitcognitivo apresentado pelo paciente normalmente reflete a extensão em que a doença progrediu. Por exemplo, opaciente pode exibir apenas um leve prejuízo cognitivo,de modo que o paciente exibe problemas de memória (porexemplo, memória contextual), mas, em outros aspectos,é capaz de funcionar bem.Os presentes métodos também são úteis paraindivíduos que tenham um déficit cognitivo relacionadoa Αβ, por exemplo, demência relacionada a Αβ. Emparticular, os presentes métodos são particularmenteúteis para indivíduos que tenham um déficit cognitivoou aberssão causada por ou atribuída à presença de Αβoligomérica solúvel no sistema nervoso central (SNC),por exemplo, no cérebro ou FCE. Déficits cognitivoscausados por ou associados a Αβ também incluem aquelescausados por ou associados a: (1) desenvolvimento deplacas β amilóides no cérebro ; (2) taxas anormais desíntese, processamento, degradação ou depuração de Αβ;(3) a formação ou atividade de espécies de Αβoligomérica solúvel (por exemplo, no cérebro); e/ou (4)a formação de formas anormais de Αβ. Não é necessárioque o elo causativo real sejam estabelecido entre umaanormalidade de Αβ e o déficit cognitivo em um pacienteparticular; entretanto, algum elo deve ser indicado,por exemplo, por um dos marcadores de AD acimamencionados para distinguir pacientes que sofram dedéficits cognitivos não relacionados a Αβ, que não seespera que se beneficiem do tratamento com um agenteimunoterápico para Αβ.Foram desenvolvidos vários testes paraavaliar habilidades ou o desempenho cognitivo emsujeitos humanos, por exemplo, sujeitos com risco de oucom sintomas ou patologia de transtornos de demência(por exemplo, AD). Déficits cognitivos podem seridentificados por um desempenho prejudicado nessestestes, e muitos tratamentos foram propostos com baseem sua capacidade de melhorar o desempenho nessestestes. Embora algumas tarefas tenham avaliadocomportamentos ou a função motora dos sujeitos, amaioria das tarefas foram projetadas para testar oaprendizado ou memória.

A cognição em seres humanos pode ser avaliadausando-se uma ampla variedade de testes, incluindo, masnão limitados a, os seguintes testes. O ADAS-Cog(Escala Cognitiva de Avaliação da Doença de Alzheimer)é um teste em 11 partes que leva 30 minutos paracompletar. 0 ADAS-Cog é um exame breve preferido para oestudo de habilidades de linguagem e memória. VejaRosen et al. (1984) Am J Psychiatry. 141(11):1356-64;Ihl et al. (2000) Neuropsychobiol. 41(2):102-7; e Weyeret al. (1997) Int Psychogeriatr. 9(2):123-38.

0 Teste Blessed é outro teste rápido (-10minutos) de cognição, que avalia atividades da vidadiária e a memória, concentração e orientação. VejaBlessed et al. (1968) Br J Psychiatry 114(512):797-811.

A Bateria Automatizada de TestesNeuropsicológicos de Cambridge (CANTAB) é usada paraavaliação de déficits cognitivos em seres humanos comdoenças neurodegenerativas ou lesão cerebral. Consisteem treze testes computadorizados inter-relacionados dememória, atenção e função executiva e é administradomediante uma tela sensível a toques de um computador pessoal. Os testes são livres de linguagem e quasetotalmente de aspectos culturais e se mostraramaltamente sensíveis na deteção precoce e triagem derotina de doença de Alzheimer. Veja Swainson et al.(2001) Dement Geriatr Cogn Disord.; 12:265-280; e Fraye Robbins (1996) Neurotoxicol Teratol. 18 (4) : 499-504.Robbins et al. (1994) Dementia 5 (5) :266-81.

Os Testes Clínicos e Neuropsicológicos doConsórcio Para Estabelecer um Registro de Doença deAlzheimer (CERAD) incluem um teste de fluência verbal, o Teste de Nomeação de Boston, 0 Mini Exame de EstadoMental (MMSE), lembrança de dez itens de palavras,práxis construtiva e lembrança retardada de itens depráxis. 0 teste tipicamente leva 20-30 minutos e éconveniente e eficaz para avaliar e acompanhar odeclínio cognitivo. Veja Morris et al. (1988)Psychopharmacol Buli. 24(4) :641-52; Morris et al.(1989) Neurology 39(9):1159-65; e Welsh et al. (1991)ArchNeurol. 48(3):278-81.

O Mini Exame de Estado Mental (MMSE),desenvolvido em 1975 por Folestein et al., é um testebreve do status mental e função cognitiva. Não medeoutros fenômenos mentais e não é, conseqüentemente, umsubstituto para um exame completo do status mental. Éútil na triagem de demência, e seu sistema de contagemé útil para acompanhar o progresso com o tempo. 0 MiniExame de Estado Mental MMSE é amplamente usado, comnormas ajustadas para idade e educação. Pode ser usadopara a triagem de prejuízo cognitivo, para estimar agravidade do prejuízo cognitivo em um dado momento,para acompnhar o curso de alterações cognitivas em umindivíduo com o tempo e para documentar a resposta deum indivíduo ao tratamento. A avaliação cognitiva desujeitos pode requerer testes neuropsicológicosformais, com testes de acompanhamento separados de novemeses ou mais (em seres humanos). Veja Folstein et al.(1975) J Psychiatr Res. 12:196-198; Cockrell e Folstein(1988) Psychopharm Buli. 24(4):689-692; e Crum et al.(1993) J. Am. Med. Assoeiation 18:238 6-2391.A Triagem de Sete Minutos é uma ferramenta detriagem para ajudar a identificar pacientes que tenhamsido avaliados quanto a doença de Alzheimer. Aferramenta de triagem é altamente sensível aos sinaisprecoces de AD, usando uma série de perguntas paraavaliar diferentes tipos de funcionalidade intelectual.

0 teste consiste em 4 conjuntos de perguntas quefocalizam a orientação, memória, habilidades visuaisespaciais e a linguagem expressiva. Pode distinguirentre alterações cognitivas devidas ao processo deenvelhecimento normal e déficits cognitivos devidos ademência. Veja Solomon e Pendlebury (1998) Fam Med.30(4)1265-71, Solomon et al. (1998) Arch Neurol.55 (3) :349-55.

Indivíduos atualmente sofrendo de doença deAlzheimer podem ser reconhecidos pela demênciacaracterística, assim como pela presença dos fatores derisco acima descritos. Além disso, há inúmeros testesdiagnósticos disponíveis par aidentificar indivíduosque tenham AD. Esses incluem a medição dos níveis detau e Αβ42 no FCE. Níveis elevados de tau e diminuídosde Αβ42 significam a presença de AD. Indivíduos quesofram de doença de Alzheimer também podem serdiagnosticados pelos critérios ADRDA.Terapia de Combinação

Os anticorpos anti-RAGE da presente invençãopodem ser usados em combinação com um ou mais agentesadicionais, que podem ser administrados a um sujeitoconcomitante ou seqüencialmente em qualquer odem. Asterapias de combinação apresentadas podem gerar umefeito terapêutico sinérgico, isto é, um efeito maiorque o efeito de qualquer agente isoladamente. Efeitosterapêuticos mensuráveis são descritos mais acima. Por exemplo, um efeito terapêutico sinérgico pode ser umefeito pelo menos cerca de duas vezes maior que oefeito terapêutico gerado por um único agente ou pelomenos cerca de cinco vezes maior, ou pelo menos cercade dez vezes maior, ou pelo menos cerca de vinte vezesmaior, ou pelo menos cerca de cinqüenta vezes maior, oupelo menos cerca de cem vezes maior.

Por exemplo, a invenção inclui aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficazde um anticorpo que se ligue especificamente a RAGE e iniba a ligação de um parceiro de ligação a RAGE emcombinação com outro anticorpo que se ligaespecificamente a Αβ. O anticorpo que se liga a Αβ podeser um anticorpo que se liga especificamente a peptidioΑβ sem ligação a proteína precursora de amilóide decomprimento total (ΔΡΡ). Alternativamente, o anticorpoda invenção pode ser administrado em combinação comanticorpos que se ligam a e/ou capturam Αβ solúvel ouque se ligam a um depósito amilóide no paciente einduzem uma resposta de depuração contra o depósitoamilóide. Essa resposta de depuração pode ser efetuadapor fagocitose mediada por receptor Fc. Essa respostade depuração pode ser introduzida em um anticorpo, porexemplo, por inclusão de um domínio de ligação areceptor Fc (por exemplo, uma região constante deIgG2a). O anticorpo da invenção também pode seradministrado a um paciente que tenha recebido ou estejarecebendo uma vacina para Αβ. No caso de doença deAlzheimer e síndrome de Down, em que depósitosamilóides ocorrem no cérebro, anticorpos da invençãotambém podem ser administrados em conjunto com outrosagentes que aumentam a passagem dos agentes da invençãoatravés da barreira hematoencefálica. Anticorpos dainvenção também podem ser administrados em combinaçãocom outros agentes que aumentem o acesso do agenteterapêutico a uma célula ou tecido alvo, por exemplo,lipossomos e outros. A co-administração desses agentespode diminuir a dosagem de um agente terapêutico (porexemplo, anticorpo ou cadeia de anticorpo terapêutico)necessária para se conseguir o efeito desejado.

Monitorização do Curso do Tratamento

A invenção apresenta métodos de monitorizaçãodo tratamento em um paciente que sofra de ou sejasuscetível a doença de Alzheimer, isto é, paramonitorizar um cursto de tratamento que esteja sendoadministrado a um paciente. Os métodos podem ser usadospara monitorizar tanto o tratamento terapêutico empacientes sintomáticos, quanto o tratamento profiláticoem pacientes assintomáticos. Em particular, os métodossão úteis para monitorizar a imunização passiva (porexemplo, medir o nível de anticorpo administrado).

Alguns métodos envolvem a determinação de umvalor basal, por exemplo, de um nível ou perfil deanticorpo em um paciente, antes de se administrar umadosagem do agente e comparar com um valor para o perfilou nível após o tratamento. Um aumento significativo(isto é, maior que a margem típica de erro experimentalem medições repetidas da mesma amostra, expressa comoum desvio padrão da média dessas medições) no valor donível ou perfil sinaliza um resultado de tratamentopositivo (isto é, a administração do agente conseguiu aresposta desejada). Se o valor de resposta imune não sealtera significativamente ou diminui, indica-se umresultado de tratamento negativo.

Em outros métodos, um valor de controle (istoé, uma média e desvio padrão) do nivel ou perfil édeterminado para uma população de controle.Tipicamente, os indivíduos na população de controle nãoreceberam tratamento prévio. Os valores medidos donível ou perfil em um paciente após a administração deum agente terapêutico são, então, comparados com o valor de controle. Um aumento significativo com relaçãoao valor de controle (por exemplo, mais de um desviopadrão da média) sinaliza um resultado de tratamentopositivo ou suficiente. Uma falta de aumentosignificativo ou uma diminuição sinaliza um resultadode tratamento negativo ou insuficiente. A administraçãodo agente em geral é continuada enquanto o nível estáaumentando com relação ao valor de controle. Comoantes, atingir um platô com relação a valores decontrole é um indicador de que a administração detratamento pode ser descontinuada ou a dosagem e/ou afreqüência reduzida.

Em outros métodos, um valor de controle donível ou perfil (por exemplo, uma média e desviopadrão) é determinado a partir de uma população deindivíduos de controle que tenham sofrido tratamentocom um agente terapêutico e cujos níveis ou perfistenham atingido um platô em resposta ao tratamento. Osvalores medidos de níveis ou perfis em um paciente sãocomparados com o valor de controle. Se o nível medidoem um paciente não for significativamente diferente(por exemplo, mais de um desvio padrão) do valor decontrole, o tratamento pode ser descontinuado. Se onível em um paciente estiver significativamente abaixodo valor de controle, justifica-se uma administraçãocontinuada do agente. Se o nível no paciente persisteabaixo do valor de controle, então, pode estar indicadauma alteração no tratamento.

Em outros métodos, um paciente que não estejaatualmente recebendo tratamento, mas que tenha sofridoum curso anterior de tratamento é monitorizado quandoaos níveis ou perfis de anticorpo para determinar se érequerido o reinicio do tratamento. 0 nível ou perfilmedido no paciente pode ser comparado com um valoranteriormente atingido no paciente após um cursoanterior de tratamento. Uma diminuição significativacom relação à medição anterior (isto é, maior do queuma margem de erro típica em medições repetidas damesma amostra) é uma indicação de que o tratamento podeser reiniciado. Alternativamente, o valor medido em umpaciente pode ser comparado com um valor de controle(média mais desvio padrão) determinado em uma populaçãode pacientes após sofrerem um curso de tratamento.

Alternativamente, o valor medido em um paciente podeser comparado com um valor de controle em populações depacientes profilaticamente tratados que permaneçamlivres de sintomas de doença ou populações de pacientesterapeuticamente tratados que mostrem melhora dascaracterísticas da doença. Em todos esses casos, umadiminuição significativa com relação ao nível decontrole (isto é, mais de um desvio padrão) é umindicador de que o tratamento deve ser reiniciado em umpaciente.

A amostra de tecido para análise étipicamente sangue, plasma, soro, fluido mucoso oufluido cérebro-espinhal do paciente. A amostra éanalisada, por exemplo, quanto aos níveis ou perfis deanticorpos para peptídio RAGE, por exemplo, níveis ouperfis de anticorpos humanizados. Métodos ELISA dedetecção de anticorpos específicos para RAGE sãodescritos nos Exemplos. Em alguns métodos, o nível ouperfil de um anticorpo administrado é determinadousando-se um ensaio de depuração, por exemplo, em umensaio de fagocitose in vitro, conforme aqui descrito.Nesses métodos, uma amostra de tecido de um pacienteque esteja sendo testado é contatada com depósitosamilóides (por exemplo, de um camundongo PDAPP) ecélulas fagociticas portadoras de receptores Fe. Adepuração subseqüente do depósito amilóide é, então,monitorizada. A existência e a extensão da resposta dedepuração fornece uma indicação da existência e donivel de anticorpos eficazes para depurar Αβ em umaamostra de tecido do paciente sendo testado.

O perfil de anticorpo após a imunizaçãopassiva tipicamente mostra um pico imediato naconcentração de anticorpo seguido por um decaimentoexponencial. Se uma dosagem adicional, o decaimento se aproxima de niveis pré-tratamento em um período de diasa meses, dependendo da meia-vida do anticorpoadministrado.

Em alguns métodos, faz-se uma medição basalde anticorpo contra RAGE no paciente antes daadministração, faz-se uma segunda medição logo depois,para determinar o nível de pico de anticorpo, e se fazuma ou mais medições em intervalos para monitorizar odecaimento dos níveis de anticorpo. Quando o nível deanticorpo tiver declinado ao basal ou a uma porcentagempredeterminada do pico menos o basal (por exemplo, 50%,25% ou 10%), faz-se a administração de uma dosagemadicional de anticorpo. Em alguns métodos, niveismedidos de pico ou subseqüentes menos o basal sãocomparados com niveis de referência previamentedeterminados para constituírem um regime de tratamentoprofilático ou terapêutico em outros pacientes. Se onivel de anticorpo medido for significativamente menorque um nivel de referência (por exemplo, menor que amédia menos um desvio padrão do valor de referência emuma população de pacientes que se beneficiem dotratamento) , está indicada a administração de umadosagem adicional de anticorpo.

índices mensuráveis para monitorizar o cursode tratamento e o status do paciente incluem amonitorização dos (redução nos) niveis de Αβ no cérebrodo paciente, monitorização da redução de amilóide emonitorização da melhora dos déficits induzidos por Αβna função neuronal. Outros índices mensuráveis incluema monitorização do status ou alterações na patologiaangiopatia amilóide congofílica vascular (CAA) nadoença de Alzheimer e monitorização de alterações nasinalização intracelular e inflamação mediada por Αβ.Esta última fornece informações relativas à regulaçãode RAGE por seus ligantes com múltiplas vias desinalização divergentes, por exemplo, a ativação dofator transcricional NF-kB ativa um promotor de RAGE, ea resposta neurotóxica é medida pela ativação dasinalização celular (cascata da MAP quinase (MAPKs),ERK1/2, Akt, JNK, p38), e MAbs anti-RAGE bloqueiam afosforilação de JNK, p38, NFkB. Medições úteis tambémincluem a monitorização da sinalização induzida por Αβe a plasticidade sináptica potencializada por RAGE einfluxo/efluxo cerebral diferencial de Αβ através dabarreira hetamoencefálica, mediada por RAGE e LRP,podem mediar o influxo/efluxo cerebral diferencial deΑβ através da barreira hetamoencefálica. A presenteinvenção apresenta, portanto, métodos para reduzir asinalização intracelular (por exemplo, reduzir acascata de MAPK) e a inflamação associada a Αβ.

Métodos adicionais incluem a monitorização,no curso do tratamento, qualquer sintoma fisiológicoreconhecido na técnica (por exemplo, sintoma físico oumental) rotineiramente usado por pesquisadores oumédicos para diagnosticar ou monitorizar doençasamiloidogênicas (por exemplo, doença de Alzheimer). Porexemplo, pode-se monitorizar o prejuízo cognitivo. Esteúltimo é um sintoma da doença de Alzheimer e dasíndrome de Down, mas também pode ocorrer sem outrascaracterísticas de qualquer uma dessas doenças. Porexemplo, o prejuízo cognitivo pode ser monitorizado pordeterminação da contagem do paciente no Mini Exame de Estado Mental de acordo com convenção em todo o cursodo tratamento.

Preparações Farmacêuticas

As proteínas ou ácidos nucléicos da presenteinvenção são, o mais preferivelmente, administrados na forma de composições apropriadas. Como composiçõesapropriadas, podem-se citar todas as composiçõesnormalmente empregadas para administração sistêmica oulocal de fármacos. O veículo farmaceuticamenteaceitável deve ser substancialmente inerte, para não agirem com o componente ativo. Veículos inertesadequados incluem água, álcool, polietileno glicol,óleo mineral ou gel de petróleo, propileno glicol,salina tamponada com fosfato (PBS), gua bacteriostáticapara injeção (BWFI), água estéril para injeção (SWFI) e outros. As ditas preparações farmacêuticas (incluindoos presentes anticorpos ou ácidos nucléicos quecodificam os presentes anticorpos) podem ser formuladaspara administração de qualquer maneira conveniente parauso em medicina humana ou veterinária.Assim, outro aspect da presente invençãoapresenta composições farmaceuticamente aceitáveiscompreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo,formulado juntamente com um ou mais veículosfarmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes.Conforme descrito em detalhes abaixo, as composiçõesfarmacêuticas da presente invenção podem serespecialmente formuladas para administração em formasólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para asseguintes: (1) administração oral, por exemplo,medicamentos líquidos (soluções ou suspensão aquosas ounão aquosas), comprimidos, bolus, pós, grânulos, pastaspara aplicação à língua; (2) administração parenteral,por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular ouintravenosa como, por exemplo, uma solução ou suspensãoestéril; (3) aplicação tópica, por exemplo, como umcreme, ungüento ou spray aplicado à pele; ou (4)intravaginal ou intraretal, por exemplo, como umpessário, creme ou espuma. Entretanto, em certasmodalidades, os presentes agentes podem sersimplesmente dissolvidos ou postos em suspensão em águaestéril. Em certas modalidades, a preparaçãofarmacêutica é não pirogênica, isto é, não eleva atemperatura corporal de um paciente. A administraçãoparenteral, em particular injeção subcutânea eintravenosa, é a via de administração preferida.

Em certas modalidades, um ou mais agentespodem conter um grupo funcional básico, como amino oualquilamino e são, conseqüentemente, capazes de formarsais farmaceuticamente aceitáveis com ácidosfarmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "saisfarmaceuticamente aceitáveis", com relação a isso,refere-se a sais de adição de ácido inorgânico eorgânico, relativamente não tóxicos, de compostos dapresente invenção. Esses sais podem ser preparados insitu durante o isolamento e purificação finais doscompostos da invenção ou por reação separada de umcomposto da invenção purificado em sua forma de baselivre com um ácido orgânico ou inorgânico e isolamentodo sal assim formado. Sais representativos incluem ossais bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato,fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato,estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato,tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato,tartarato, naftilato, mesilato, glucoeptonato,lactobionate e laurilsulfonato e outros. (Veja, porexemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts," J.Pharm. Sci. 66: 1-19).Os sais farmaceuticamente aceitáveis dosagentes incluem os sais não tóxicos convencionais ousais de amônio quaternário dos compostos, por exemplo,a partir de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Por exemplo, esses sais não tóxicosconvencionais incluem aqueles derivados de ácidosinorgânicos, como clorídrico, bromídrico, sulfúrico,sulfâmico, fosfórico, nítrico e outros; e os saispreparados a partir de ácidos orgânicos, como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, lático,málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico,maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutâmico,benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico,fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isotiônico e outros.

Em outros casos, o um ou mais agentes podemconter um ou mais grupos funcionais ácidos e, assim,são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveiscom bases farmaceuticamente aceitável. Esses sais também podem ser preparados in situ durante oisolamento e purificação finais dos compostos ou porreação separada do composto purificado em sua forma deácido livre com uma base adequada, como o hidróxido,carbonato ou bicarbonato de um cátion metálicofarmaceuticamente aceitável, com amônia ou com umaamina orgânica primária, secundária ou terciáriafarmaceuticamente aceitável. Sais de metais alcalinosou alcalino-terrosos representativos incluem os sais delitio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio eoutros. Aminas orgânicas representativas para uso naformação de sais de adição de base incluem etilamina,dietilamina, etilenodiamina, etanolamina,dietanolamina, piperazina e outras. (Veja, por exemplo,Berge et al., supra)

Agentes umectantes, emulsificadores elubrificantes, como lauril sulfato de sódio e estearatode magnésio, assim como agentes corantes, agentes deliberação, agentes de revestimento, adoçantes, agentesde sabor e perfume, preservativos e antioxidantestambém podem estar presentes nas composições.

Exemplos de antioxidantes farmaceuticamenteaceitável incluem: (1) antioxidantes solúveis em água,como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína,bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfitode sódio e outros, (2) antioxidantes solúveis em óleo,como palpitato de ascorbila, hidroxianisol butilado(BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiatode propila, alfa-tocoferol e outros; e (3) agentesquelantes de metais, como ácido citrico, ácidoetilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácidotartárico, ácido fosfórico e outros.

Formulações da presente invenção incluemaquelas adequadas para administração oral, nasal,topical (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginale/ou parenteral. As formulações podem serconvenientemente apresentadas em forma de dosagemunitária e podem ser preparadas por quaisquer métodosconhecidos na técnica de farmácia. A quantidade deingrediente ativo que pode ser combinada com ummaterial de veiculo para produzir uma forma de dosagemúnica variará dependendo do hospedeiro que é tratado,do modo particular de administração e outros. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinadacom um material de veiculo para produzir uma forma dedosagem única em geral será a quantidade de compostoque produz um efeito terapêutico. Genericamente, de cempor cento, essa quantidade variará de cerca de 1 porcento a cerca de noventa e nove por cento deingrediente ativo, de preferência de cerca de 5 porcento a cerca de 70 por cento, o mais preferivelmentede cerca de 10 por cento a cerca de 30 por cento.Métodos de preparação dessas formulações oucomposições incluem a etapa de colocar em associação umagente com o veiculo e, opcionalmente, um ou maisingredientes acessórios. Em geral, as formulações sãopreparadas por colocação em associação uniforme eintima de um agente da presente invenção com veículoslíquidos ou veículos sólidos finamente divididos ouambos e, então, caso necessário, modelagem do produto.

Formulações da invenção adequadas paraadministração oral podem estar na forma de cápsulas,cachês, pílulas, comprimidos, trociscos (usando umabase de sabor, normalmente sacarose e goma-arábica outragacanto) , pós, grânulos ou como uma solução ou umasuspensão em um líquido aquoso ou não aquoso ou comouma emulsão líquida de óleo-em-água ou água-em-óleo oucomo um elixir ou xarope ou como pastilhas (usando umabase inerte, como gelatina e glicerina ou sacarose egoma-arábica) e/ou como colutórios e outros, cada umcontendo uma quantidade predeterminada de um compostoda presente invenção como um ingrediente ativo. Umcomposto da presente invenção também pode seradministrado como um bolus, electuário ou pasta.

Em formas de dosagem sólidas da invenção paraadministração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas,drágeas, pós, grânulos e outras), o ingrediente ativo émisturado com um ou mais veículos farmaceuticamenteaceitáveis, como citrato de sódio ou fosfato dedicálcio e/ou qualquer um dos seguintes: (1) cargas ouexpansores, como amidos, lactose, sacarose, glicose,manitol e/ou ácido silícico; (2) aglutinantes como, porexemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina,polivinil pirrolidona, sacarose e/ou goma-arábica; (3)umectantes, como glicerol; (4) agentes desintegrantes,como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata outapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonatode sódio; (5) agentes retardadores de solução, comoparafina; (6) aceleradores da absorção, como compostosde amônio quaternário; (7) agentes para molhar como,por exemplo, álcool cetílico e monoestearato deglicerol; (8) absorventes, como caulim e argilabentonita; (9) lubrificantes, como talco, estearato decálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóissólidos, lauril sulfato de sódio e suas misturas; e(10) agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidose pílulas, as composições farmacêuticas também podemcompreender agentes de tamponamento. Composiçõessólidas de um tipo similar também podem ser empregadascomo cargas em cápsulas de gelatina mole ou dura,usando excipientes como lactose ou açúcares de leite,assim como polietileno glicóis de alto peso molecular eoutros.

Um comprimido pode ser preparado porcompressão ou moldagem, opcionalmente com um ou maisingredientes acessórios. Comprimidos por compressãopodem ser preparados usando-se aglutinante (porexemplo, gelatina ou hidroxipropilmetil celulose),lubrificante, diluente inerte, preservativo,desintegrante (por exemplo, amido glicolado de sódio oucarboximetil celulose sódica reticulada), agentestensoativos ou dispersantes. Comprimidos moldados podemser preparados por moldagem em uma máquina adequada deuma mistura de composto em pó umectado com um diluenteliquido inerte.

Os comprimidos e outras formas de dosagemsólida das composições farmacêuticas da presenteinvenção, como drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos,podem ser opcionalmente marcados ou preparados comrevestimentos e invólucros, como revestimentosentéricos e outros revestimentos bem conhecidos natécnica de formulações farmacêuticas. Também podem serformulados para proporcionar uma liberação lenta oucontrolada do ingrediente ativo usando-se, por exemplo,hidroxipropilmetil celulose em proporções variáveispara apresentar o perfil de liberação desejado, outrasmatrizes poliméricas, lipossomos e/ou microesferas.

Podem ser esterilizados, por exemplo, por filtraçãoatravés de um filtro de retenção de bactérias ou porincorporação de agentes esterilizantes na forma decomposições sólidas estéreis que possam ser dissolvidasem água estéril ou algum outro meio injetávle estérilimediatamente antes do uso. Essas composições tambémpodem opcionalmente conter agentes de opacificação epodem ser de uma composição que libere o(s)ingrediente(s) ativos(s) apenas ou preferencialmente emcerta parte do trato gastrointestinal, opcionalmente,de maneira retardada. Exemplos de composições deincrustação que podem ser usadas incluem substânciaspoliméricas e ceras. 0 ingrediente ativo também podeestar em forma microencapsulada, caso apropriado, comum ou mais dos excipientes acima descritos.

Formas de dosagem liquida para administraçãooral dos compostos da invenção incluem emulsões,microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixiresfarmaceuticamente aceitáveis. Além do ingredienteativo, as formas de dosagem líquidas podem conterdiluentes inertes comumente usados na técnica como, porexemplo, água ou outros solventes, agentes desolubilização e emulsificadores, como álcool etilico,álcool isopropilico, carbonato de etila, acetato deetila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilene glicol, óleos (em particular,óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe detrigo, azeite de oliva, ricino e gergelim), glicerol,álcool tetraidrofurilico, polietileno glicóis e ésteresde ácido graxo de sorbitano e suas misturas.

Além de diluentes inertes, as composiçõesorais também podem incluir adjuvantes como agentesumectantes, emulsificadores e agentes de suspensão,adoçantes, agentes de sabor, corantes, perfusmo eagentes preservativos.

Suspensões, além dos compostos ativos, podemconter agentes de suspensão como, por exemplo, álcooisisoestearilicos etoxilados, polioxietileno sorbitol eésteres de sorbitano, celulose microcristalina,metaidróxido de alumínio, bentonita, áagar e tragacantoe suas misturas.

Formulações das composições farmacêuticas dainvenção para administração retal ou vaginal podem serapresentadas como supositórios, que podem serpreparados por misturação de um ou mais compostos dainvenção com um ou mais excipientes ou veículos nãoirritantes adequados compreendendo, por exemplo,manteiga de cacau, polietileno glicol, uma cera desupositório ou um salicilato, e que seja sólido àtemperatura ambiente, mas líquido à temperaturacorporal e, conseqüentemente, derreta na cavidade doreto ou vaginal e libere os agentes.

Formulações da presente invenção que sãoadequadas para administração vaginal também incluempessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ouformulações em spray contendo veículos conformeconhecidos na técnica como apropriados.

Formas de dosagem para administração tópicaou transdérmica de um composto desta invenção incluempós, sprays, ungüentos, pastas, cremes, loções, géis,soluções, emplastros e inalantes. 0 composto ativo podeser misturado sob condições estéreis com um veículofarmaceuticamente aceitável e com quaisquerpreservativos, tampões ou propelentes que possam sernecessários.

Os ungüentos, pastas, cremes e géis podemconter, além de um composto ativo desta invenção,excipientes, como gorduras animais e vegetais, óleos,ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados decelulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas,ácido silicico, talco e óxido de zinco ou suasmisturas.

Pós e sprays podem conter, além de umcomposto desta invenção, excipientes como lactose,talco, ácido silicico, hidróxido de alumínio, silicatosde cálcio e pó de poliamide ou misturas dessassubstâncias. Os sprays também podem conter propelentescomuns, como clorofluoroidrocarbonetos ehidrocarbonetos não substituídos voláteis, como butanoe propano.

Emplastros transdérmicos têm a vantagemadicional de proporcionar uma liberação controlada deum composto da presente invenção ao corpo. Essas formasde dosagem podem ser preparadas por dissolução oudispersão dos agentes no meio apropriado.Intensificadores de absorção também podem ser usadospara aumentar o fluxo dos agentes através da pele. Ataxa desse fluxo pode ser controlada por instalação deuma membrana de controle de taxa ou dispersão docomposto em uma matriz polimérica ou gel.

Formulações oftálmicas, ungüentos, pós,soluções e outros para os olhos também são consideradoscomo estando dentro do âmbito desta invenção.Composições farmacêuticas desta invençãoadequadas para administração parenteral compreendem umou mais compostos da invenção em combinação com uma oumais soluções, dispersões, suspensões ou emulsõesaquosas ou não aquosas isotônicas estéreisfarmaceuticamente aceitáveis ou pós estéreis que possamser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveisestéreis pouco antes do uso, que podem conterantioxidantes, tampões, bacteriostáticos, solutos quetornem a formulação isotônica com o sangue do receptordesejado ou agentes de suspensão ou espessantes.

Exemplos de veículos aquosos e não aquososadequados que podem ser empregados nas composiçõesfarmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis(como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol eoutros) e suas misturas adequadas, óleos vegetais, comoazeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, comooleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida,por exemplo, com o uso de materiais de revestimento,como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícularequerido, no caso de dispersões, e com o uso desurfatantes.

Essas composições também podem conteradjuvantes como preservativos, agentes umectantes,agentes emulsificadores e agentes dispersantes. Aprevenção da ação de microorganismos pode serassegurada pela inclusão de vários agentesantibacterianos e antifúngicos, por exemplo, paraben,clorobutanol, ácido fenol sórbico e outros. Também podeser desejável incluir agentes isotônicos, como açúares,cloreto de sódio e outros nas composições. Além disso,a absorção prolongada da forma farmacêutica injetávelpode ser conseguida com a inclusão de · agentes queretardem a absorção, como monoestearato de alumínio egelatina.

Em alguns casos, para prolongar o efeito deum agente, é desejável retardar a absorção do agente dainjeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode serrealizado com o uso de uma suspensão líquida dematerial cristalino ou amorfo com baixa solubilidade emágua. A taxa de absorção do agente depende, então, desua taxa de dissolução, que, por sua vez, pode dependerdo tamanho do cristal e da forma cristalina.

Alternativamente, a absorção retardada de um agenteadministrado por via parenteral é realizada pordissolução ou suspensão do agente em um veículo oleoso.

Formas de depósito injetáveis são preparadaspor formação de matrizes de microencapsulação dospresentes compostos em polímeros biodegradáveis, comopolilactida-poliglicolida. Dependendo da razão deagente para polímero e da natureza do polímeroparticular empregado, a taxa de liberação do agentepode ser controlada. Exemplos de outros polímerosbiodegradáveis incluem poli(ortoésteres) epoli(anidridos). Formulações injetáveis de depósitotambém são preparadas por aprisionamento do agente emlipossomos ou microemulsões que sejam compatíveis comtecidos corporais.

Quando os compostos da presente invenção sãoadministrados como substâncias farmacêuticas a sereshumanos e animais, podem ser dados isoladamente ou comouma composição farmacêutica contendo, por exemplo, de0,1 a 99,5% (mais pref erivelmente, de 0,5 a 90%) deingrediente ativo em combinação com um veículofarmaceuticamente aceitável.

Além das composições acima descritas, pode-sefazer uso de coberturas, por exemplo, gessos,bandagens, curativos, gazes e outros contendo umaquantidade apropriada de uma substância terapêutica.Conforme descrito em detalhes acima, as composiçõesterapêuticas podem ser administradas/distribuídas emhastes, dispositivos, aparelhos protéticos e implantes.A amostra de tecido para análise étipicamente sangue, plasma, soro, fluido mucoso oufluido cérebro-espinhal do paciente. A amostra éanalisada, por exemplo, quanto aos níveis ou perfis deanticorpos para peptídio RAGE, por exemplo, níveis ouperfis de anticorpos humanizados. Métodos ELISA dedetecção de anticorpos específicos para RAGE sãodescritos nos Exemplos.

0 perfil de anticorpo após a imunizaçãopassiva tipicamente mostra um pico imediato naconcentração de anticorpo seguido por um decaimentoexponencial. Sem uma dosagem adicional, o decaimento seaproxima dos níveis pré-tratamento em um período dedias a meses, dependendo da meia-vida do anticorpoadministrado.

Em alguns métodos, faz-se uma medição basaldo anticorpo contra RAGE no paciente antes daadministração, faz-se uma segunda medição logo depois,para se determinar o nível de pico de anticorpo, e sefaz uma ou mais medições adicionais em intervalos, paramonitorizar o decaimento dos níveis de anticorpo.

Quando o nível de anticorpo tiver declinado até o basalou uma porcentagem predeterminada do pico menos o basal(por exemplo, 50%, 25% ou 10%), faz-se a administraçãode uma dosagem adicional de anticorpo. Em algunsmétodos, os níveis medidos de picos ou subseqüentesmenos o basal são comparados com níveis de referênciapreviamente determinados para constituírem um regime detratamento profilático ou terapêutico em outrospacientes. Se o nível de anticorpo medido forsignificativamente menor que um nível de referência(por exemplo, menor que a média menos um desvio padrãodo valor de referência na população de pacientes que sebeneficiam do tratamento), indica-se a administração deuma dosagem adicional de anticorpo.

EXEMPLOS

A invenção, tendo sido genericamentedescrita, será mais prontamente entendida comreferência aos seguintes exemplos, que são incluídosapenas para fins de ilustração de certos aspectos emodalidades da presente invenção e não pretendemlimitar a invenção.

Exemplo 1

Preparação de Construtos de RAGE

As seqüências de aminoácidos de RAGE murídeo(mRAGE, N0 de Acesso do Genbank NP - 031451; SEQ ID NO:3) e RAGE humano (hRAGE, N0 de Acesso do Genbank NP _00127.1; SEQ ID NO: 1) são mostradas na FIG. 1A-1C.cDNAs de comprimento total que codificam mRAGE (N° deAcesso NM - 007425.1; SEQ ID NO: 4) e hRAGE (N° deAcesso NM - 001136; SEQ ID NO: 2) foram inseridos novetor de expressão Adoril-2, que compreende um promotorde citomegalovirus (CMV) que dirige a expressão dasseqüências de cDNA e contém elementos de adenoviruspara a geração de virus. Uma proteína de fusão RAGEhumano-Fc formada por anexação dos aminoácidos 1-34 4 deRAGE humano ao domínio Fc de IgG humana foi preparadapor expressão de um construto de DNA que codifica aproteína de fusão em células em cultura usando o vetorde expressão Adori. Uma proteína de fusão RAGE humanoregião V-Fc formada por anexação dos aminoácidos 1-118de RAGE humano ao domínio Fc de IgG humana foipreparada da mesma forma. Proteínas de fusão RAGEhumano e murídeo-etiqueta strep formadas por anexaçãode uma seqüência de etiqueta estreptavidina (strep)(WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 5) aos aminoácidos 1-344 de RAGEhumano ou murídeo, respectivamente, foram preparadaspor expressão de construtos de DNA que codificamproteínas de RAGE-etiqueta strep, também usando vetoresde expressão Adori. Todos os construtos foramverificados por amplas análises de digestão porrestrição e por análises de seqüência dos enxertos decDNA nos plasmidios.

Adenovirus recombinantes (Ad5 Ela/E3deletados) que expressam RAGE de comprimento total,hRAGE-Fc e hRAGE domínio V-Fc foram gerados porrecombinação homóloga em uma linhagem celular de rimembrionário humano 293 (HEK293) (ATCC, Rockland Md.)·Vírus adenovírus recombinante foi isolado esubseqüentemente amplificado em células HEK2 93. 0 vírusfoi liberado por células HEK293 infectadas por trêsciclcos de congelamento-descongelamento. 0 vírus foiadicionalmente purificado por dois gradientes decentrifugação com cloreto de césio e dialisados contrasalina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2 a 4°C. Apósa diálise, adicionou-se glicerol a uma concentração de10%, e o vírus foi armazenados a -80°C até o uso. Osconstrutos virais foram caracterizados quanto ainfectividade (unidades formadoras de placa em células293) , análise de PCR do vírus, análise de seqüência daregião codificadora, expressão do transgene e mediçõesde endotoxina.

Vetores de expressão Adori contendo DNA quecodifica proteínas de fusão RAGE humano-Fc, RAGE humanoregião V-Fc e RAGE humano e murídeo-etiqueta strepforam transfectados de maneira estável em células deOvário de Hamster Chinês (CHO) usando lipofectina(Invitrogen). Transfectantes estáveis foramselecionados em 20 nM e 50 nM de metotrexato. Os meioscondicionados foram colhidos de clones individuais eanalisados com o uso de eletroforese em dodecil sulfatode sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) etransferência Western para confirmar a expressão deRAGE. (Kaufman, R. J., 1990, Methods in Enzymology,185:537-66; Kaufman, R. J., 1990, Methods inEnzymology, 185:487-511; Pittman, D. D. et al., 1993,Methods in Enzymology, 222: 236-237).

Células CHO ou HEK 293 transduzidas queexpressam proteínas de fusão com RAGE solúveis foramcultivadas para colher meio condicionado parapurificação de proteína. As proteínas foram purificadascom o uso dos métodos de etiqueta de afinidadeindicados. As proteínas purificadas foram submetidas aSDS-PAGE redutora e não redutora, visualizadas porcoloração com Azul de Coomassie (Current Protocols inProtein Sciences, Wiley Interscience), e se mostrou quesão dos pesos moleculare esperados.Exemplo 2

Geração de Anticorpos Monoclonais Anti-RAGEMurideos

camundongos BALB/c fêmeos de 6-8 semanas deidade (Charles River, Andover, Mass.) foram imunizadossubcutaneamente com o uso de um dispositivo GeneGun(BioRad, Hercules, Calif.). O vetor de expressão pAdoricontendo cDNA que codifica RAGE humano de comprimentototal foi pré-absorvido em partículas de ouro coloidal(BioRad, Hercules, Calif.) antes da administraçãosubcutânea. Os camundongos foram imunizados com 3 pg devetor duas vezes por semana, durante duas semanas. Oscamundongos foram sangrados uma semana após a últimaimunização, e os títulos de anticorpo foram avaliados.

Os camundongo com o título de anticorpo para RAGE maiselevado recebeu uma injeção adicional de 10 yg deproteína RAGE humano recombinante-strep três dias antesda fusão celular.

Esplenócitos foram fusionados a células demieloma de camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville,Md.) a uma razão de 4:1 usando-se polietileno glicol a50% (PM 1.500) (Roche Diagnostics Corp, Mannheim,Alemanha). Após a fusão, as células foram semeadas ecultivadas em placas de 96 poços a IxlO5 células/poçono meio de seleção RPMI1640, contendo 20% de FBS, 5% deOrigen (IGEN International Inc. Gaithersburg, Md.)/ 2mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL deestreptomicina, 10 mM de HEPES e 1 χ hipoxantina-aminopterina-timidina (Sigma, St. Louis, Mo.).

Exemplo 3

Geração de Anticorpos Monoclonais Anti-RAGEde Rato

Ratos LOU (Harlan, Harlan, Mass.) foramimunizados subcutaneamente com o uso de um GeneGun(BioRad, Hercules, Calif.). 0 vetor de expressão pAdoricontendo cDNA que codifica RAGE murideo de comprimentototal foi pré-absorvido em partículas de ouro coloidal(BioRad, Hercules, Calif.) antes da administração subcutânea. Os ratos foram imunizados com 3 pg de vetoruma vez a cada duas semanas por quatro vezes. Os ratosforam sangrados uma semana após a última imunização, eos títulos de anticorpo foram avaliados. 0 rato com otítulo de anticorpo para RAGE mais elevado recebeu umainjeção adicional de 10 pg de proteína RAGE murideorecombinante-strep três dias antes da fusão celular.

Esplenócitos foram fusionados a células demieloma de camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville,Md.) a uma razão de 4:1 usando-se polietileno glicol a50% (PM 1.500) (Roche Diagnostics Corp, Mannheim,Alemanha) . Após a fusão, as células foram semeadas ecultivadas em placas de 96 poços a IxlO5 células/poçono meio de seleção RPMI1640, contendo 20% de FBS, 5% deOrigen (IGEN International Inc. Gaithersburg Md.), 2 mMde L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 yg/mL deestreptomicina, 10 mM de HEPES e 1 χ hipoxantina-aminopterina-timidina (Sigma, St. Louis, Mo.).

Exemplo 4

Triagem de Hibridoma

Painéis de mAbs anti-RAGE murideo de rato eanti-RAGE humano murideo foram gerados por imunizaçãocom cDNA usando o GeneGun e os plasmidios de expressãoAdori que expressam a região codificadora decomprimento total de RAGE murideo ou humano. Ossobrenadantes de hibridoma foram triados quanto àligação a RAGE humano ou murideo recombinante-Fc porELISA e por análise FACS em células de rim embrionáriashumanas (HEK-293) que expressam transitoriamente RAGE.

Os sobrenadantes positivos foram adicionalmentetestados quanto a sua capacidade de neutralizar aligação de RAGE ao ligante HMGBl. Sete anticorposmonoclonais de rato (série XT-M series) e seteanticorpos monoclonais de camundongo (série XT-H) foramidentificados. Os hibridomas selecioandos foramsubclonados quatro vezes por por diluição seriada e umavez por classificação FACS. Os meios condicioandosforam colhidos das culturas de hibridoma estáveis, e asimunoglobulinas foram purificadas usando-se colunas depurificação de anticorpo para Proteína A (MilliporeBillerica, Mass.). A classe Ig de cada mAb foideterminada com um kit de isotipagem de mAb decamundongo mAb ou um kit de isotipagem de mAb de rato,conforme indicado (IsoStrip; Boehringer MannheimCorp.). Os isotipos dos anticorpos monoclonais de ratoe camundongo são apresentados na Tabela 1 (abaixo).

Tabela 1

<table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table>

Exemplo 5

Análise FACS

Células 293 humanas foram infectadas com oadenovirus de RAGE humano e murideo. As célulasinfectadas foram postas em suspensão em PBS contendo 1%de BSA a uma densidade de 4><104 células/mL. As célulasforam incubadas com 100 pL de amostra (soro imunesdiluídos, sobrenadantes de hibridoma ou anticorpospurificados) durante 30 min a 4°C. Após a lavagem, ascélulas foram incubadas com F(ab')2 anti-camundongo,IgG, de cabra, marcado com PE (DAKO CorporationGlostrup, Dinamarca) durante 30 min a 40C no escuro. Ossinais de fluorescência associados às células forammedidos por um citofluorômetro de fluxo FACScan (BectonDickinson) usando-se 5.000 células por tratamento.Usou-se iodeto de propidio para identificar célulasmortas, que foram excluídas da análise. Sete anticorposmonoclonais murídeos XT-Hl a XT-H7 e sete anticorposmonoclonais de rato XT-Ml a XT-M7 foram mostrados, poranálise FACS, que se liqam a hRAGE de superfíciecelular (Tabela 2).

Exemplo 6

Ensaio de Liqação ELISA

Os anticorpos foram purificados desobrenadantes de hibridoma usando-se procedimentospadronizados. Os anticorpos purificados foram avaliadosquanto à ligação a formas solúveis de RAGE com o uso deELISA. Placas de noventa e seis poços (Corning,Corning, N.Y.) foram revestidas com 100 pL de RAGEhumano recombinante-Fc ou RAGE humano recombinanteregião V-Fc (1 μg/mL) e incubadas durante uma noite a4 °C. Após a lavagem e bloqueio com PBS contendo 1% deBSA e 0,05% de Tween-20, 100 pL de amostra (as amostrasestava em várias formas: soro imune diluído,sobrenadantes de hibridoma ou anticorpos purificados,conforme indicado) foram adicionados e incubadosdurante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foramlavadas com PBS, pH 7,2, e os anticorpos anti-RAGEligados foram detectados com o uso de IgG anti-camundongo de cabra conjugada a peroxidase (H+L) (IgG)(Pierce, Rockford, 111.) seguido por incubação com osubstrato TMB (BioFX Laboratories Owings Mills, Md.Laboratories). Os valores de absorbância foramdeterminados a 450 nm em um espectrofotômetro. Asconcentrações de anticorpos monoclonais foramdeterminadas com o uso de IgG anti-camundongo de carbramarcada com peroxidase (Fcy) (Pierce Rockford, Ill.), euma curva padrão foi gerada por uma IgG de camundongode isotipo correspondente purificada. Os resultados deELISA para as capacidades dos sete anticorpos murideosXT-Hl a XT-H7 e dos sete anticorpos de rato XT-Ml a XT-M7 de se ligarem a hRAGE-Fc, hRAGE região V-Fc, mRAGE-Fc e mRAGE-strep estão resumidas na Tabela 2. Conforomemostrado nas FIGS. 2 e 3, o anticorpo XT-M4 de rato e oanticorpo XT-H2 murídeo se ligam ambos a RAGE humano-Fce ao domínio V de hRAGE. Os valores de EC50 para aligação de XT-M4 a RAGE humano e a RAGE humano domínioV foram de 300 pM e 100 pM, respectivamente. Os valoresde EC50 para a ligação de XT-H2 a RAGE humano e RAGEhumano domínio V foram de 90 pM e 100 pM,respectivamente.Tabela 2

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Exemplo 7

Ligante de RAGE e Ensaios de Ligação ELISA deCompetição de Anticorpos

Para determinar se anticorpos monoclonaispara RAGE afetam a ligação de um ligante de RAGE(HMGBl; Sigma, St. Louis, Mo.) a RAGE, realizaram-seensaios de ligação ELISA de competição. Placas denoventa e seis poços foram revestidas com 1 yg/mL deHMGB1 durante uma noite a 4°C. Os poços foram lavados ebloqueados, conforme acima descrito, e expostos a 100uL de misturas pré-incubadas de RAGE-Fc ou TrkB-Fc (umcontrole de Fc não especifico), a 0,1 yg/mL, maisvárias formas da preparação de anticorpo indicada(diluições de soros imunes, sobrenadantes de hibridomaou anticorpos purificados) durante 1 hora à temperaturaambiente. As placas foram lavadas com PBS, pH 7,2, eRAGE humano recombinante-Fc ligado a ligante foidetectado com o uso de IgG anti-humana de cabraconjugada a peroxidase (Fcy) (Pierce, Rockford, Ill.),seguido por incubação com o substrato TMB (BioFXLaboratories Owings Mills, Md. Laboratories OwingsMills, Md.). A ligação de RAGE humano recombinante-Fcao ligante sem nenhum anticorpo ou com soro pré-imunediluído foi usada como um controle e definida como 100%de ligação. As capacidades dos sete anticorpos murídeosXT-Hl a XT-H7 e os sete anticorpos de rato XT-Ml a XT-M7 de bloquearem a ligação de HMGBl a hRAGE-Fc,conforme determinado pelo ensaio de ligação ELISA decompetição, são mostradas na Tabela 3. A Tabela 3também resume as capacidades de anticorpos murídeos XT-Hl, XT-H2 e XT-H5 de bloquear a ligação a um RAGE de umligante diferente de hRAGE, peptidio 1-42 de amilóideβ, e as capacidades de anticorpos de rato XT-Ml a XT-M7de bloquearem a ligação de HMGBl a RAGE murideo-Fc,conforme determinado por ensaios de ligação ELISA decompetição similares. Conforme mostrado na FIG. 4, oanticorpo XT-M4 de rato e o anticorpo XT-H2 murideobloqueiam ambos a ligação de HMGBl a RAGE humano.

Tabela 3

<table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table>

Uma abordagem de competição similar foi usadapara determinar os epitopos de ligação relativos entrepares de anticorpos. Em primeiro lugar, 1 μg/mL de RAGEhumano recombinante-Fc foi revestido em placas denoventa e seis poços durante uma noite a 4 °C. Após alavagem e bloqueio (veja acima), os poços foramexpostos a 100 pL de misturas pré-incubadas deanticorpo alvo biotinilado e diluições de um anticorpocompetidor durante 1 hora à temperatura ambiente. Oanticorpo biotinilado ligado foi detectado usando-seestreptavidina conjugada a peroxidase (Pierce). Umaabordagem de competição similar foi usada paradeterminar os epitopos de ligação relativa entre paresde anticorpos. Em primeiro lugar, 1 pg/mL de RAGEhumano recombinante-Fc foi revestido em placas denoventa e seis poços durante uma noite a 4 °C. Após alavagem e bloqueio (veja acima), os poços foramexpostos a 100 pL de misturas pré-incubadas deanticorpo alvo biotinilado e diluições de um anticorpocompetidor durante 1 hora à temperatura ambiente. Oanticorpo biotinilado ligado foi detectado usando-seestreptavidina conjugada a peroxidase (Pierce,Rockford, Ill.), seguido por incubação com o substratoTMB (BioFX Laboratories Owings Mills, Md.Laboratories). A ligação de anticorpo biotinilado aRAGE humano recombinante-Fc sem nenhum anticorpocompetidor foi usada como um controle e definida como100%. Os resultados dos ensaios de ligação ELISA decompetição que analisam a competição entre anticorposde rato e murideos quanto à ligação a hRAGE sãomostradas na Tabela 3. A FIG. 5 apresenta um gráfico dedados dos ensaios de ligação ELISA de competição queanalisam a competição entre XT-M4 de rato e anticorposXT-H1, XT-H2, XT-H5, XT-M2, XT-M4, XT-M6 e XT-M7 quantoà ligação a hRAGE. Os dados de ligação de ELISA decompetição mostrados na FIG. 5 demonstram que XT-M4 eXT-H2 se ligam a sítios superpostos em RAGE humano.

Exemplo 8

Ensaios de Ligação BIAÇORE™ de Ligação deAnticorpos Murideos e de Rato Anti-RAGE a RAGE humano-Fc e MurídeoA. Ligação a RAGE humano e murideo

A ligação de anticorpos murideos e de ratoanti-RAGE selecionados a RAGE humano e murideo e aosdomínios V de RAGE humano e murideo foi analisada peloensaio de ligação direta BIAÇORE®. Os ensaios foramrealizados usando-se RAGE humano ou murídeo-Fcrevestido em um chip CM5 a alta densidade (2.000 RU),usando-se acoplamento de amina padrão. Soluções dosanticorpos anti-RAGE a duas concentrações, 50 e 100 nm,foram passadas sobre as proteínas RAGE-Fc imobilizadasem duplicata. A tecnologia BIAÇORE™ utiliza alteraçõesno índice de refração na camada superficial com aligação dos anticorpos anti-RAGE ao antígeno RAGEimobilizado. A ligação é detectada por ressonância deplásmon de superfície (SPR) de uma luz laser retratandoda superfície. Os resultados dos ensaios de ligaçãodireta BIAÇORE™ são resumidos Tabela 4.

Tabela 4

<table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table>

As constantes de taxa cinética (ka e kd) econstantes de associação e dissociação (Ka e Kd) para aligação de anticorpos murídeos e de rato anti-RAGE aRAGE humano e murideo foram determinadas pelo ensaio deligação direta BIACORE™. A análise dos dados cinéticosde sinal para na taxa e fora da taxa permite adiscriminação entre interação não especificas eespecificas. As constantes de taxa cinética econstantes de equilíbrio determinadas pelo ensaio deligação direta BIACORE™ para a ligação de anticorpo XT-H2 murideo e anticorpo XT-M4 de rato a h RAGE-Fc sãomostradas na Tabela 5.

Tabela 5

<table>table see original document page 156</column></row><table>Β. Ligação a Domínio V de RAGE Humano

As constantes de taxa cinética e constantesde associação e dissociação para a ligação deanticorpos murídeos e de rato anti-RAGE ao domínio V deRAGE humano também foram determinadas pelo ensaio deligação direta BIAÇORE™. RAGE humano domínio V-Fc foicapturado por anticorpos anti-Fc humano revestidos emum chip CM5, e ensaios de ligação direta BIAÇORE™ daligação de anticorpos murídeos e de rato anti-RAGE ahRAGE domínio V-Fc imobilizado foram realizadosconforme acima descrito para ensaios de ligação a RAGE-Fc de comprimento total.

Exemplo 9

Seqüências de Aminoácidos de RegiõesVariáveis de Anticorpo anti-RAGE

Seqüências de DNA que codificam as regiõesvariáveis de cadeia leve e pesada de anticorposmurídeos anti-RAGE XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5 e XT-H7 ede anticorpo anti-RAGE de rato XT-M4 foram clonadas eseqüenciadas, e as seqüências de aminoácidos dasregiões variáveis foram determinadas. As seqüências deaminoácidos alinhadas de regiões variáveis de cadeiapesada desses seis anticorpos são mostradas na FIG. 6,e as seqüências de aminoácidos alinhadas das regiõesvariáveis de cadeia leve são mostradas na FIG. 7.

Exemplo 10

Isolamento de Seqüências de cDNA de Coelho,Babuino e Macaco Cinomolgo que Codificam RAGEseqüências de cDNA que codificam RAGE formaisoladas e clonadas usando-se métodos de transcriçãoreversa-reação em cadeia de polimerase padronizados(RT-PCR). O RNA foi extraído e purificado de tecidopulmonar usando-se Trizol (Gibco Invitrogen, Carlsbad,Calif.) segundo o protocolo do fabricante. O mRNA foitranscrito de maneira reversa para gerar cDNA usando oReagente de Transcrição Reversa TaqMan (Roche AppliedScience Indianapolis, Ind.) e protocolo do fabricante.

Seqüências de RAGE de Macaco cinomolgo (Macacafascicularis) e babuíno (Papio cyanocephalus) foramamplificadas a partir de cDNA usando Taq DNA polimeraseda Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad Calif.) e oprotocolo, e os oligonucleotídeos (5' —GACCCTGGAAGGAAGCAGGATG (SEQ ID NO: 59) e (5r-GGATCTGTCTGTGGGCCCCTCAAGGCC) (SEQ ID NO: 60) queadicionam os sítios de restrição SpeI e EcoRV. Osprodutos de amplificação por PCR foram digeridos comSpel/EcoRV e clonados nos sítios correspondentes noplasmidios pAdoril-3. RAGE de coelho foi clonadousando-se RT-PCR conforme acima descrito usando osoligonucleotideos: 5'-

ACTAGACTAGTCGGACCATGGCAGCAGGGGCAGCGGCCGGA (SEQ ID NO:61) e 5'-

ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGGGCTCTCCTGTACCGCTCTC (SEQID NO: 62) que adicionam sítios SpeI e NotI, e clonadosnos sítios correspondentes em pAdoril-3. As seqüênciasde nucleotídeos das seqüências de cDNA clonadas quecodificam RAGE de babuíno, macaco e duas isoformas decoelho nos plasmidios resultantes foram determinadas. Aseqüência de nucleotídeos que codifica RAGE de babuínoé mostrada na FIG. 8 (SEQ ID NO: 6) , e a seqüência denucleotídeos que codifica RAGE de macaco cinomolgo émostrada na FIG. 9 (SEQ ID NO: 8) . As seqüências denucleotídeos que codificam duas isoformas de RAGE decoelho são mostradas na FIG. 10 (SEQ ID NO: 10) e FIG.11 (SEQ ID NO:12).

Exemplo 11

Isolamento de uma Seqüência de DNA Genômicoque Codifica RAGE de Babuíno

Uma seqüência de DNA genômico de babuíno quecodifica RAGE foi isolada usando-se técnicas declonagem genômica padronizadas (por exemplo, vejaSambrook, J. et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2a Ed., 1989, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.). Uma bibliotecagenômica de lambda de babuino (Papio cyanocephalus)(Stratagene, La Jolla, C) no vetor Lambda DASH II foitríada usando-se cDNA humano de RAGE marcado com 32P.Placas de fagos positivos foram isoladas e submetidas aduas rodadas adicionais de triagem para se obteremisolados únicos. DNA lambda foi preparado, digerido comNotI e fracionado por tamanho para separar DNA deenxerto dos braços genômicos lambda, usando-se umprocedimento comum. Os fragmentos NotI foram ligados empBluescript SK+ digerido com NotI, e o enxerto foiseqüenciado usando-se primers específicos para RAGE. Oclone que foi obtido foi designado como clone 18.2. Aseqüência de nucleotídeos do DNA genômico de babuinoclonado que codifica a RAGE de babuino é mostrada nasFIGS. 12A-12-E (SEQ ID NO: 15).

Exemplo 12

Anticorpo XT-M4 Quimérico

Um XT-M4 quimérico foi gerado por fusão dasregiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpoXT-M4 anti-RAGE murídeo de rato à cadeia leve kapahumana e regiões constantes de cadeia pesada de IgGl,respectivamente. Para reduzir a atividade efetoramediada por Fc do anticorpo em potencial, as mutaçõesquiméricas L234A e G237A foram introduzidas em XT-M4 naregião Fc de IgGl humana. O anticorpo quimérico recebeo número de molécula XT-M4-A-1. O anticorpo XT-M4quimérico contém 93,83% de seqüência de aminoácidoshumana e 6,18% de seqüência de aminoácidos de rato.

Exemplo 13

Avalição da Ligação de XT-M4 Quimérico a RAGE

As capacidades de anticorpo quimérico XT-M4 eanticorpos de rato e murideos anti-RAGE selecionados dese ligarem a RAGE humano e RAGE de outras espécies e debloquearem a ligação de ligantes de RAGE foi medida porensaios de ligação ELISA e BIAÇORE™.

A. Ligação a RAGE Humano Solúvel Medida por

Ensaio de Ligação BIAÇORE™

A ligação de anticorpo quimérico XT-M4, deanticorpo XT-M4 de rato de origem e de anticorposmurideos XT-H2 e XT-H5 a RAGE humano solúvel (hRAGE-SA)foi medida por ensaio dei igação de captura BIAÇORE™.

Os ensaios foram efetuados por revestimento deanticorpos em um chip CM5 BIA com 5.000-7.000 RU.Soluções de um RAGE humano etiquetado comestreptavidina solúvel (hRAGE-SA) a concentrações de100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, 3,12 nM, 1,56nM e 0 nM fluíram sobre os anticorpos imobilizados emtriplicata, e as constantes de taxa cinética (ka e kd) econstantes de associação e dissociação (Ka e Kd) paraligação a hRAGE-SA foram determinadas. Os resultadossão mostradas na Tabela 6.

Tabela 6

<table>table see original document page 162</column></row><table>

0 anticorpo XT-M4 e o anticorpo quimérico XT-M4 se ligam a RAGE humano solúvel monomérico comcinéticas similares. A afinidade do XT-M4 quiméricopara RAGE humano monomérico solúvel é deaproximadamente 5,5 nM.Β. Ensaio de Ligação ELISA de Competição deLigante de RAGE

As capacidades de anticorpo quimérico XT-M4 eanticorpo XT-M4 de rato de bloquearem a ligação dosligantes de RAGE HMGBl, peptidio 1-42 de amilóide β,S100-A e S100-B a hRAGE-Fc foram determinadas peloensaio de ligação ELISA de competição de liganteconforme descrito no Exemplo 7. Conforme mostrado naFIG. 13, anticorpo quimérico XT-M4 e XT-M4 são quaseidênticos em suas capacidades de bloquearem a ligaçãode HMGBl, peptidio 1-42 de amilóide β, S100-A e S100-Ba RAGE humano.

C. Ensaio de Ligação ELISA de Competição deAnticorpos

A capacidade do anticorpo quimérico XT-M4 decompetir com o anticorpo XT-M4 de rato e o anticorpomurideo XT-H2 na ligação a hRAGE-Fc foi determinada porensaio de ligação ELISA de competição de anticorpos,usando os anticorpos XT-M4 e XT-H2 ligados a biotina,da maneira descrita no Exemplo 7. Conforme mostrado naFIG. 14, o anticorpo quimérico XT-M4 compete com oanticorpo XT-M4 de rato e com o anticorpo XT-H2 murideona ligação a hRAGE-Fc.Exemplo 14

A Ligação de Anticorpo a RAGE de DiferentesEspécies Foi Medida por ELISA à Base de Células

Transfecção Celular

Células 293 de rim embrionárias humanas(Cultura Americana de Tipo de Tecido, Manassas, Va.)foram plaqueadas a 5x106 células por 10 cm2 de placa decultura de tecido e cultivadas durante uma noite a37°C. No dia seguinte, as células foram transfectadascom plasmidios de expressão de RAGE (vetor pAdoril-3que codifica RAGE de camundongo, humana, babuino,macaco cinomolgo ou coelho) usando o reagente LF2000(Invitrogen, Carlsbad Calif.) a uma razão de 4:1 dereagente para DNA plasmidico, sando o protocolo dosfabricantes. As células foram colhidas 48 h após atransfecção usando-se tripsina, lavadas uma vez comsalina tamponada com fosfato (PBS), então, postas emsuspensão em meio de crescimento sem soro, a umaconcentração de 2x106 células/mL.

ELISA à Base de Células

Anticorpos primários a 1 yg/mL foram diluídosserialmente a 1:2 ou 1:3 em PBS contendo 1% de albuminasérica bovina (BSA) em um aplaca de 96 poços. Células293 transfectadas com RAGE ou células 293 de origempara controle (50 μι) a 2><106 células/mL em meio decrescimento livre de soro foram adicionadas a uma placade 96 poços de fundo em U para uma concentração finalde IxlO5 células/poço. As células foram centrifugadas a1.600 rpm durante 2 minutos. Os sobrenadantes foramsuavemente descartados com a mão por uma únicaoscilação, e a placa foi suavemente batida para soltara pelota de células. Os anticorpos anti-RAGE primáriosdiluídos ou anticorpos de controle com correspondênciade isotipo (100 yL) em PBS frio contendo 10% de sorobovino fetal (FCS) foram adicionados às células eincubados em gelo durante 1 hora. As células foramtingidas com 100 μΐι de conjugados de anticorpo anti-IgGsecundário diluído e HRP (Pierce Biotechnology,Rockford, 111.) em gelo durante 1 hora. Após capa etapade incubações de anticorpo primário e anticorposecundário, as células foram lavadas 3 vezes com PBSgelado. 100 μl, de componente TMBl de substrato (BIO FX,TMBW-0100-01) foram adicionados à placa e incubadosdurante 5-30 minutos à temperatura ambiente. odesenvolvimento de cor foi interrompido pela adição de100 yL de H2SO4 a 0,18M. As células foramcentrifugadas, e os sobrenadantes foram transferidospara uma placa fresca e lidos a 450 nm (Soft MAX pro4.0, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Calif.).

As capacidades de anticorpos XT-M4 quiméricoe XT-M4 de se ligam a RAGE humano e de babuino conformedeterminado por ELISA à base de células são mostradasna FIG. 14. Os valores de EC50 para a ligação deanticorpo quimérico XT-M4 e XT-M4 a RAGE de superfíciecelular humano, de babuino, macaco, camundongo e coelhoexpressado por células 293, conforme determinado porELISA à base células, são mostradas na Tabela 7.

Tabela 7

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Exemplo 15

Ligação a RAGE de Diferentes Espécies

Determinada Por Coloração Imuno-histoquímica

As capacidades do anticorpo quimérico XT-M4,do anticorpo XT-M4 de rato e de anticorpos murídeos XT-H1, ΧΤ-Η2 e ΧΤ-Η5 de se ligarem a RAGE de superfíciecelular endógeno em tecido pulmonar de ser humano,macaco cinomolgo, babuino e coelho foram determinadaspor coloração imuno-histoquímica (IHC) de seções detecido pulmonar.

Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO)transfectadas de maneira estável foram manipuladas paraexpressar proteínas de comprimento total de RAGEmurídeo e humano. Os cDNAS de RAGE murídeo e humanoforam clonados no vetor de expressão em mamíferos,linearizados e transfectados em células CHO usandométodos de lipofectina (Kaufman, R. J., 1990, Methodsin Enzymology 185:537-66; Kaufman, R. J., 1990, Methodsin Enzymology 185:487-511;Pittman, D. D. et al. , 1993,Methods in Enzymology 222: 236). As células foramadicionalmente selecionadas em 20 nM de metotrexato, eos extratos celulares foram colhidos de clonesindividuais e analisados por eletrofores em dodecilsulfato de sódio (SDS)-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)e transferência Western para confirmar a expressão.

A imuno-histoquímica para RAGE de tecidospulmonares isolados de babuino, macaco cinomolgo,coelho ou células de Ovário de Hamster Chinês quesuperexpressam RAGE humano ou células CHO de controlefoi realizada usando-se técnicas padronizadas.

Anticorpos para RAGE e controle de isotipo IgG2b derato ou controle de isotipo de camundongo foram usadosa 1-15 mg. XT-M4 quimérico, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.11, XT-M4-hVH-V2.O-2m/hVL-V2.14 foram biotinilados, e seu usou anticorpode controle biotinilado IgGl da Sigma a 0,2, 1, 5 e 10pg/mL. Após a deteção com HRP e Alexa Fluor 594, AlexaFluor 488 ou anti-biotina conjugado com FITC, também setingiram seções 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

A FIG. 15 mostra que o anticorpo quiméricoXT-M4 se liga a RAGE em tecidos pulmonares de macacocinomolgo, coelho e babuino. Padrões de coloração comIHC positivos são visíveis nas amostras em que célulasprodutoras de RAGE são contatadas com XT-M4 quimérico,mas não em amostras em que RAGE ou um anticorpo deligação a RAGE esteja ausente. A FIG. 16 mostra que oanticorpo XT-M4 de rato se liga a RAGE em pulmão humanonormal e pulmão de um ser humano com doença pulmonarobstrutiva crônica (DPOC). A ligação de anticorpo XT-M4de rato e anticorpos murideos XT-H1, XT-H2 e XT-H5 aRAGE de superfície celular endógeno em pulmão sépticode babuino e pulmão normal de macaco cinomolgo,conforme determinado por coloração com IHC de seções detecido pulmonar, é resumida na Tabela 8. Células CHOtransfectadas de maneira estável com um vetor deexpressão que expressa DNA que codifica hRAGE sãousadas como um controle positivo.

Tabela 8

<table>table see original document page 169</column></row><table>

Exemplo 16

Modelagem Molecular Para Humanização deAnticorpo Anti-RAGE Humano Murideo XT-H2

A modelagem molecular de domínio HV deanticorpo anti-RAGE humano murídeo XT-H2

Moldes de estrutura de anticorpo paramodelagem da cadeia pesada de XT-H2 murídeo foramselecionados com base em uma busca BLASTP contra a basede dados de seqüências do Banco de Dados de Proteínas(PDB). 0 modelo molecular de XT-H2 murídeo foiconstruído com base em 6 estruturas de molde: 1SY6(anticorpo anti-CD3), IMRF (anticorpo anti-RNA) e IRIH(anticorpo anti-tumor) usando o módulo de Homologia doInsightII (Accelrys, San Diego). As regiõesestruturalmente conservadas (SCRs) dos moldes foramdeterminadas com base na matriz de distância Ca paracada molécula, e as estruturas de moldes foramsuperpostas com base no desvio mínimo de RMS dos átomoscorrespondentes em SCRs. A seqüência da proteína alvoVH de XT-H2 de rato foi alinhada às seqüências dasproteínas de molde superpostas, e as coordenadasatômicas das SCRs foram atribuídas aos resíduoscorrespondentes da proteína alvo. Com base no grau desimilaridade de seqüência entre os alvo e os moldes emcada SCRs, coordenadas de diferentes moldes foramusadas para diferentes SCRs. As coordenadas para alçase regiões variáveis não incluídas nas SCRs foramgeradas por métodos Busca de Alça o Geração de Alça,conforme implementados no módulo de Homologia.

Resumidamente, o método de Busca de Alçavarre estruturas de proteínas que imitariam a regiãoentre 2 SCRs por comparação da matriz de distância Cade resíduos SCR de flanco com uma matriz pré-calculadaderivada de estruturas de proteínas que tenham o mesmonúmero de resíduos de flanco e um segmento peptidicointerposto de um dado comprimento. A saída do métodoBusca de Alça foi avaliada para primeiro encontrar umacorrespondência com desvios mínimos de RMS e identidademáxima de seqüência nos resíduos SCR de flanco. Então,empreendeu-se uma avaliação de similaridade deseqüência entre as correspondências em potencial e umaseqüência da alça alvo. O método Geração de Alça quegera coordenadas atômicas de novo foi usado naquelescasos em que a Busca de Alças não encontroucorrespondências ótimas. A conformação das cadeiascolaterais de aminoácidos foi mantida a mesma do molde,se o resíduo de aminoácido fosse idêntico no molde e noalvo. Entretanto, uma busca conformacional de rotâmeros foi realizada, e a conformação energeticamente maisfavorável foi mantida para aqueles resíduos que nãofossem idênticos no molde e no alvo. Para otimizar asjunções de união entre duas SCRs adjacentes, cujascoordenadas fossem adaptadas de diferentes moldes, eaquelas entre SCRs e alçvas, usou-se a função Reparo deUnião do módulo de Homologia. 0 Reparo de União criauma simulação de mecânica molecular para derivarcomprimentos de ligação e ângulos de ligação ótimos nasjunções entre 2 SCRs ou entre a SCR e uma regiãovariável. Finalmente, o modelo foi submetido a umaminimização de energia com o algoritmo de Descidas MaisAcentuadas até que uma derivada máxima de 5 kcal/(molÃ) ou 500 ciclos e o algoritmo Gradientes de Conjugadoaté uma derivada máxima de 5 kcal/(mol Â) ou 2.000ciclos. A qualidade do modelo foi avaliada usando-se outilitário ProStat/Struct_Check do módulo Homologia.

Modelagem Molecular do Domino HV de XT-H2Anti-RAGE Humanizado

Um modelo molecular da cadeia pesada doanticorpo anti-RAGE XT-H2 humanizado (com enxerto deCDR) foi construído com Insight II seguindo-se o mesmoprocedimento descrito para a modelagem da cadeia pesadade anticorpo XT-H2 de camundongo, exceto que os moldesusados foram diferentes. Os moldes de estrutura usadosnesse caso foram 1L7I (anticorpo anti-Erb B2), IFGV(anticorpo anti-CD18), IJPS (anticorpo anti-fatortissular) e 1N8Z (anticorpo anti-Her2).

Análise de Modelo e Predição de MutaçõesRetrógradas de Estrutura Principal-Humanização

O modelo de anticorpo camundongo de origemfoi comparado ao modelo da versão humanizada comenxerto de CDR com relação a similaridades e diferençasem uma ou mais das seguintes características: contatosCDR-estrutura principal, ligações de hidrogênio empotencial que influenciam a conformação da CDR edesvios de RMS em várias regiões, como estruturaprincipal 1, estrutura principal 2, estrutura principal3, estrutura principal 4 e as 3 CDRs.

Asse guintes mutações retrógradas,isoladamente ou em combinações, foram previstas comoimportantes para uma humanização bem sucedida porenxoerto de CDR: E46Y, R72A, N77S, N74K, R67K, K76S,A23K, F68A, R38K, A40R.

Exemplo 17

Modelagem Molecular Para Humanização deAnticorpo anti-RAGE de Rato XT-M4

Modelagem Molecular de Domínio HV deAnticorpo XT-M4 anti-RAGE Murideo de Rato

Moldes de estrutura de anticorpo para amodelagem da cadeia pesada de XT-M4 de rato foramselecionados com base em uma busca BLASTP contra a basede dados de seqüências do Banco de Datos de Proteínas(PDB) . Os modelos moleculares de XT-M4 de rato foramconstruídos com base em 6 estruturas de molde: IQKZ(anticorpo anti-peptídio) , IIGT (anticorpo monoclonalanti-linfoma canino) , 8FAB (anticorpo anti-asronato dep-azofenila) , IMQK (anticorpo anti-citocromo Coxidase), 1 HOD (anticorpo anti-angiogenina) e IMHP(anticorpo anti-alfalbetal) usando-se o módulo deHomologia de InsightII (Accelrys, San Diego). Asregiões estruturalmente conservadas (SCRs) dos moldesforam determinadas com base na matriz de distância Capara cada molécula, e as estruturas de moldes foramsuperpostas com base no desvio mínimo de RMS de átomoscorrespondentes em SCRs. Δ seqüência da proteína alvoVH de XT-M4 de rato foi alinhada às seqüências dasproteínas de molde superpostas, e as coordenadasatômicas das SCRs foram atribuídas aos resíduoscorrespondentes da proteína alvo. Com base no grau desimilaridade de seqüência entre o alvo e os moldes emcada SCRs, foram usadas coordenadas de diferentesmoldes para diferentes SCRs. Coordenadas para alças eregiões variáveis não incluídas nas SCRs foram geradaspelos métodos Busca de Alça ou Geração de Alça,conforme implementados no módulo de Homologia.

Resumidamente, o método de Busca de alçavarre estruturas de proteínas que imitariam a regiãoentre 2 SCRs por comparação da matriz de distância Cade resíduos SCR de flanco com uma matriz pré-calculadaderivada de estruturas de proteínas que têm o mesmonúmero de resíduos de flanco e um segmento peptídicointerposto de um dado comprimento. A saída do método deBusca de Alça foi avaliado para primeiro encontrar umacorrespondência com desvios mínimos de RMS e identidademáxima de seqüência nos resíduos SCR de flanço. Então,empreendeu-se uma avaliação da similaridade deseqüência entre as correspondências em potencial e aseqüência da alça alvo. 0 método Geração de alça quegera coordenadas atômicas de novo foi usado naquelescasos em que a Busca de Alça não encontroucorrespondências ótimas. A conformação das cadeiascolaterais de aminoácido foi mantida a mesma que nomolde, se o resíduo de aminoácido fosse idêntico nomolde e no alvo.

Entretanto, realizou-se uma buscaconformacional de rotâmeros, e a conformaçãoenergeticamente mais favorável foi mantida para aquelesresíduos que não fossem idênticos no molde e no alvo.

Para otimizar as funções de união entre duas SCRsadjacentes, cujas coordenadas fossem adaptadas dediferentes moldes, e aquelas entre SCRs e alças, usou-se a função Reparo de União do módulo de Homologia. OReparo de União cria uma simulação de mecânicamolecular para derivar comprimentos de ligação eângulos de ligação ótimos nas junções entre 2 SCRs ouentre a SCR e uma região variável. Finalmente, o modelofoi submetido a uma minimização de energia com oalgoritmo de Descidas Mais Acentuadas até que umaderivada máxima de 5 kcal/ (mol Â) ou 500 ciclos e oalgoritmo Gradientes de Conjugado até uma derivadamáxima de 5 kcal/(mol Ã) ou 2.000 ciclos. A qualidadedo modelo foi avaliada usando-se o utilitárioProStat/Struct_Check do módulo Homologia.

Domínio Variável de Cadeia Leve de XT-M4

Modelos estruturais para domínio variável decadeia leve de XT M4 foram gerados com Modeler 8v2usando 1K6Q (anticorpo anti-fator tissular), 1WTL, 1D5B(anticorpo AZ-28) e IBOG (anticorpo anti-p24) como osmoldes. Para cada alvo, dos 100 modelos iniciais, ummodelo com as menores violações de restrição, conformedefinido pela função de densidade de probabilidademolecular, foi escolhido para otimização adicional.Para a otimização do modelo, uma cascata de minimizaçãode energia, consistindo nos métodos Descida MaisAcentuada, Gradiente Conjugado e Base Adotada de NewtonRaphson, foi realizada até que um gradiente de RMS de0,01 fosse satisfeito usando o campo de força Charmm 27(Accelrys Software Inc.) e a solvatação implítica BornGeneralizada, conforme implementada no Discovery Studio1.6 (Accelrys Software Inc.) . Durante a minimização deenergia, os movimento dos átomos de estrutura principalfoi restringido usando-se uma restrição harmônica de 10massas força.

Modelagem Molecular de Domínio VH de XT-M4

Anti-RAGE Humanizado

Um modelo molecular de cadeia pesada deanticorpo anti-RAGE humanizado XT M4 (com enxerto deCDR) foi construído com Insight II seguindo-se o mesmoprocedimento descrito para a modelagem da cadeia pesada de anticorpo XT M4 de rato, exceto que os moldes usadosforam diferetnes. Os moldes de estrutura usados nessecaso foram IMHP (anticorpo anti-alfalbetal), IIGT(anticorpo monoclonal anti-linfoma canino), 8FAB(anticorpo anti-arsonato de p-azofenila), IMQK(anticorpo anti-citocromo C oxidase) e IHOD (anticorpoanti-angiogenina) .

Domínio Variável de Cadeia Leve de XT-M4

Humanizado

Um modelo molecular de cadeia leve deanticorpo anti-RAGE humanizado XT M4 (com enxerto deCDR) foi construído usando-se Modeler 8v2 seguindo-se omesmo procedimento descrito para a modelagem de cadeialeve de anticorpo XT M4 de rato, exceto que os moldesusados foram diferentes. Os moldes de estrutura usadosnesse caso foram 1B6D, IFGV (anticorpo anti-CD18), 1UJ3(anticorpo anti-fator tissular) e IWTL como os moldes.

0 modelo de anticorpo de rato de origem foicomparado com o modelo da versão humanizada com enxertode CDR com relação a similaridades e diferenças em umaou mais das seguintes características: contatos de CDR-estrutura principal, ligações de hidrogênio empotencial que influenciam a conformação de CDR, desviosde RMS em várias regiões como estrutura principal 1,estrutura principal 2, estrutura principal 3, estruturaprincipal 4 e as 3 CDRs e energias calculadas deinterações resíduo-resíduo. A(s) mutação(ões)retrógrada(s) em potencial identificada(s) foi(ram)incorporada(s), isoladamente ou em combinações, emoutra rodada de modelos construídos usando-se InsightII ou Modeler 8v2, e os modelos dos mutantes foramcomparados com o modelo de anticorpo de rato de origempara avaliar a adequação dos mutantes in silico.

As seguintes mutações retrógradas,isoladamente ou em combinações, foram previstas comosendo importantes para uma humanização bem sucedida porenxerto de CDR:Cadeia pesada: L114M, T113V e A88S;

Cadeia leve: K45R, L46R, L47M, D70I, G66R,T85D, Y87H, T69S, Y36F, F71Y.

Exemplo 18

Regiões Variáveis Humanizadas com as CDRs dosAnticorpos XT-H2 murideo e XT-M4 de Rato

Regiões variáveis de cadeia pesadahumanizadasforam preparadas por enxerto das CDRs dosanticorpos XT-H2 murideo e XT-M4 de rato nas seqüênciasde estrutura principal de linhagem germinativa humanamostradas na Tabela 9 e introdução de mutaçõesretrógradas selecionadas.

Tabela 9

<table>table see original document page 179</column></row><table>

As seqüências de aminoácidos de regiõesvariáveis de cadeia pesada e leve de XT-H2 humanizadosão mostradas na FIG. 17 (SEQ ID NOs: 28-31) e FIG. 18(SEQ ID NOs: 32-35), respectivamente.As seqüências de aminoácidos de regiõesvariáveis de cadeia pesada e leve de XT-M4 de ratohumanizado são mostradas na FIG. 19 (SEQ ID NOs: 36-38)e FIGS. 20A-20B (SEQ ID NOs: 39-49), respectivamente.

Seqüências de linhagem germinativa das quaisas seqüências de estrutura principal foram derivadas emutações retrógradas especificas nas regiões variáveishumanizadas são identificadas na Tabela 10.

Seqüências de DNA que codificam regiões variáveis humanizadas foram subclonadas em vetores deexpressão contendo seqüências que codificam regiõesconstantes de imunoglobulina humana e seqüências de DNAque codificam cadeias leves e pesadas de comprimentototal foram expressadas em células COS, usando-se procedimentos padronizados. DNAs que codificam regiõesvariáveis de cadeia pesada foram subclonados em umvetor pSMED2hlgGlm_(L234, L237)cDNA, produzindo cadeiaspesadas de anticorpo IgGl humanizado. DNAs quecodificam regiões variáveis de cadeia leve foramsubclonados em um vetor pSMEN2 hkapa, produzindocadeias leves de anticorpo kapa humanizado. Veja FIG.21.

Tabela 10

<table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table>

Exemplo 19

Protocolo de ELISA de Competição

A ligação de anticorpos XT-H2 e XT-M4humanizados e de XT-M4 quimérico a FlAGE humano-Fc foicaracterizada por ensaio imunossorvente ligado a enzimade competição (ELISA). Para gerar um competidor, oanticorpo XT-M4 de rato de origem foi biotinilado. Asplacas de ELISA foram revestidas durante uma noite com1 μg/mL de RAGE humano-Fc. Concentrações variáveis deXT-M4 biotinilado foram adicionadas em duplicata apoços (0,11 - 250 ng/mL), incubadas, lavadas edetectadas com estreptavidina-HRP. A ED50 calculada deXT-M4 de rato de origem biotinilado foi de 5 ng/mL. AIC50 de anticorpo XT-M4 quimérico e cada um doshumanizados foi calculada quando competia com 12,5ng/mL de anticorpo XT-M4 de origem biotinilado.Resumidamente, as placas foram revestidas durante umanoite com 1 μg/mL de RAGE humano-Fc. Concentraçõesvariáveis de anticorpos quiméricos ou humanizadosmisturadas com 12,5 ng/mL de XT-M4 de rato de origembiotinilado foram adicionadas em duplicata a poços (nafaixa de 9 ng/mL a 20 μg/mL). Anticorpos XT-M4 de ratode origem biotinilados foram detectados comestreptavidina-HRP, e os valores de IC50 foramcalculados. Os valores de IC50 determinados para osanticorpos humanizados por análise de ELISA decompetição são mostrados na Tabela 11.Tabela 11

<table>table see original document page 183</column></row><table><table>table see original document page 184</column></row><table>

Os valores de ED50 para a ligação deanticorpos XT-H2 humanizados a RAGE humano-Fc tambémforam determinados por ELISA de competição e sãomostrados na FIG. 22.

Exemplo 20

Reatividade Cruzada de Anticorpo XT-M4Quimérico e Humanizado com Outros Receptores deSuperfície celular

Os anticorpos XT-M4 humanizados XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10 e XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.11 foramtestados juntamente com XT-M4 quimérico quanto areatividade cruzada com outros receptores do tipo RAGE.

Esses receptores foram escolhidos porque sãoexpressados na superfície celular, como RAGE, e suainteração com o ligante também é dependente da carga.

Os receptores testados foram rhVCAM-1, rhICAM-I-Fc,rhTLR4 (etiqueta His C terminal), rhNCAM-1, rhB7-Hl-FcmLoxl-Fc, hLoxl-Fc e hRAGE-Fc (como um controlepositivo). As placas de ELISA foram revestidas duranteuma noite com 1 yg/mL das proteínas receptorasrelacionadas. Concentrações variáveis dos anticorposΧΤ-Μ4 humanizados e quiméricos acima relacionados foramadicionadas em duplicata a poços (0,03 a 20 yg/mL),incubadas, lavadas e detectadas com HRP anti-IgGhumana. A Tabela 12 mostra os resultados da análiseELISA de ligação direta da ligação de anticorpos XT-M4quiméricos e humanizados e proteínas de superfíciecelular de camundongo. Os dados mostrados são osvalores de C>D450 para a ligação detectada entre oreceptor e o anticorpo a 20 μg/mL (a maior concentraçãotestada).

Tabela 12

<table>table see original document page 185</column></row><table>

Exemplo 21

Esanio de Ligação BIAÇORE™ da Ligação a RAGE Humano SolúvelA ligação de anticorpo quimérico XT-M4 e deanticorpos XT-M4 humanizados a RAGE humano solúvel(hRAGE-SA) e RAGE murideo solúvel (mRAGE-SA) foi medidapelo ensaio de ligação de captura BIAÇORE™. Os ensaios foram realizados por revestimento de anticorpos anti-Fchumano em um chip CM5 BIA com 5.000 RU (pH 5.0, 7 min)nas células de fluxo 1-4. Cada anticorpo foi capturadopor fluxo a 2,0 μg/mL sobre os anticorpos anti-Fc nascélulas de fluxo 2-4 (a célula de fluxo 1 foi usadacomo uma referência) . Soluções de um RAGE etiquetadocom estreptavidina humano solúvel purificado (hRAGE-SA)a concentrações de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25nM, 3,125 nM, 1,25 nM e 0 nM foram passadas sobre osanticorpos imobilizadas em duplicata, com dissociação durante 5 minutos, e se determinaram as constantes detaxa cinética (ka e kd) e constantes de associação edissociação (Ka e Kd) para a ligação a hRAGE-SA. Osresultados para ligação de XT-M4 quimérico e anticorposhumanizados XT-M4-V10, XT-M4-V11 e XT-M4-V14 quanto àligação a hRAGE-SA e mRAGE-SA são mostrados nas FIGS.23 e 24, respectivamente.

Exemplo 22

Otimização da Reatividade Cruzada EntreEspécies do Anticorpo XT-H2 LiderA reatividade cruzada entre espécies émanipulada por um processo de mutação aleatória doanticorpo XT-H2, gerando uma biblioteca de variantes deproteínas e enriquecendo seletivamente aquelasmoléculas que tenham adquirido mutações que resultem emreatividade cruzada de RAGE de camundongo-humano. Usam-se tecnologias de exposição em ribossomos (Hanes etal., 2000, Methods Enzymol., 328:404-30) e exposição emfagos (McAfferty et al., 1989, Nature, 348: 552-4).

Preparação de Anticorpos ScFv Baseados nosAnticorpos XT-H2 e HT-M4

A. Anticorpos ScFv Baseados em XT-H2

Dois construtos de ScFv compreendendo asregiões V de XT-H2 foram sintetizados no formato VH/VLou no formato VL/VH, conectados por meio de um eloflexível de DGGGSGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 50) . Asseqüências dos construtos de ScFv configuradas como VL-VH e VH-VL são mostradas na FIG. 25 (SEQ ID NO: 51) eFIG. 26 (SEQ ID NO:52), respectivamente.

B. Anticorpos ScFv Baseados em XT-M4

Dois construtos de ScFv compreendendo asregiões V de XT-M4 foram sintetizados no formato VH/VLou no formato VL/VH, conectados por meio de um eloflexível de DGGGSGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 50) . Asseqüências dos construtos de ScFv configuradas como VL-VH e VH-VL são mostradas na FIG. 27 (SEQ ID NO: 54) eFIG. 28 (SEQ ID NO: 53), respectivamente.

A FIG. 29 mostra dados de ELISA de construtosM4 e H2 transcritos e traduzidos in vitro. As placas deELISA foram revestidas com RAGE humano-Fc (5 μς/πΛ) ouBSA (200 μς/πΛ) em tampão bicarbonato durante uma noitea 4°C, lavadas com PBS+Tween a 0,05% e bloqueadasdurante 1 hora à temperatura ambiente com 2% de leiteem pó PBS. As placas foram incubadas com ScFv traduzidoin vitro durante 2 horas à temperatura ambiente. Asplacas foram bloqueadas, e a detecção foi com anticorpoanti-Flag (diluição de 1/1.000) seguido por HRP anti-camundongo de coelho (diluição de 1/1.000). Os dadosmostram que os construtos de ScFv das regiões variáveisdos anticorpos anti-RAGE XT-H2 e XT-M4 nasconfigurações VL/VH ou VH/VL podem produzir proteínadobrada funcional que se liga especificamente a RAGEhumano. Os valores para Kd do ScFv em ambos osformatos, conforme determinado por BIACORE™, foramusados para determinar as concentrações ótimas deantígeno para experimentos de seleção.C. Estratégia de Seleção e Triagem ParaRecuperar Variantes com Melhor Reatividade Cruzada deRAGE de Camundongo/Humano

Cria-se uma biblioteca de variantes por PCRpropensa a erros (Gram et al., 1992, PNAS 89:3576-80).Essa estratégia de mutagênese introduz mutaçõesaleatórias por todo o comprimento do gene de ScFv. Abiblioteca é, então, transcrita e traduzida in vitrousando-se procedimentos estabelecidos (por exemplo,Hanes et al. , 2000, Methods Enzymol., 328:404-30). Essabiblioteca é submetida à rodada 1 de seleção em RAGEhumano-Fc, os complexos ribossomais não ligados sãolavados, e os complexos ribossomais ligados a antigenosão eluidos. 0 RNA é recuperado, convertido em cDNA por RT-PCR e submetido à rodada 2 de seleção em RAGEcamundongo-Fc. Essa estatégia de seleção alternadaenriquece preferencialmente clones que se liguem tantoa RAGE humano, quanto de camundongo-Fc. A saida dessaseleção é, então, passada por uma segunda 2 de PCR propensa a erros. A biblioteca gerada é, então,submetida à rodada 3 e seleções de rodada em RAGEhumano-Fc e RAGE de camundongo-Fc, respectivamente.Esse processo é repetido conforme requerido. As saídasreunidas de RNA de cada etapa de seleção sãoconvertidas em cDNA e clonadas em um vetor de expressãode proteína pWRIL-1 para avaliar a reatividade cruzadade ScFvs variantes. Os materiais de diversidadereunidos também são seqüenciados para se avaliar adiversidade, para determinar se as seleções estão semovendo na direção de clones dominantes que tenhamreatividade cruzada entre espécies.

Exemplo 23

Maturação de Afinidade de Anticorpo XT-M4Líder

Uma melhor afinidade se traduz em umbenefício em potencial de dose ou freqüência de dosereduzida e/ou maior potência. A afinidade por hRAGE émelhorada por maturação de afinidade usando um processocombinado de mutagênese direcionada ao VH-CDR3 acopladaa PCR propensa a erros aleatória (Gram et al., 1992,PNAS 89:3576-80). Isso gera uma biblioteca de variantesde anticorpos dos quais. se recuperam moléculas quetenham uma melhor afinidade por RAGE humano, mantendo,ao mesmo tempo, a reatividade cruzada entre espéciespara RAGE de camundongo-Fc. Usam-se a tecnologia deexposição em ribossomos (Hanes et al, 1997, supra) e atecnologia de exposição em fagos (McAfferty et al.,1989, supra).A FIG. 30 mostra dados de ligação ELISA deconstrutos ScFv de XT-M4 e XT-H2 em pWRIL-1 no formatoVL-VH, expressos como proteína solúvel em Escherichiacoli e testados quanto à ligação a RAGE humano-Fc eBSA. ActRIIb representa uma proteína de não ligaçãoexpressada pelo mesmo vetor como um controle negativo.As placas de ELISA foram revestidas com RAGE humano-Fc(5 μg/mL) ou BSA (200 μg/mL) em tampão bicarbonatodurante uma noite a 4°C, lavadas com PBS+Tween a 0,05%e bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com2% de leite em pó PBS. Preparações periplasmáticas de mL de culturas de E. coli foram realizadas usando-seprocedimentos padronizados. O volume final daspreparações periplasmáticas de anticorpos ScFv não purificados era de 1 mL, do qual 50 μL foram pré-incubados com anticorpo anti-His a uma diluição de1/1.000 durante 1 hora à temperatura ambiente, em umvolume total de 100 μί com 2% de leite em pó PBS. Aspreparações periplasmáticas foram adicoinadas à placa de ELISA e incubadas durante mais 2 horas à temperaturaambiente. As placas foram lavadas 2 vezes com PBS+0,05%de Tween e 2 vezes com PBS e incubadas com HRP anti-camundongo de coelho a uma diluição de 1/1.000 em 2% deleite em pó PBS. As placas foram lavadas como antes, ea ligação foi detectada usando-se reagentes TMBpadronizados. Os dados mostram que os construtos ScFvde anticorpos XT-M4 e XT-H2 na configuração VL/VH podemproduzir proteína solúvel dobrada funcional em E. colique se liga especificamente a RAGE humano. Os valoresde partida de Kd do ScFv em ambos os formatos, conformedeterminado por BIACORE™, são usados para determinar asconcentrações ótimas de antigeno para seleções deafinidade.

Exemplo 24

Estratégia de Seleção e Triagem ParaRecuperar Variantes com Melhor Afinidade por hRAGE-FcMantendo ao Mesmo Tempo Reatividade Cruzada EntreEspécies

Cria-se uma biblioteca de variantes pormutagênese pontual da VH-CDR3 de XT-M4 usando-se PCR. AFIG. 31 representa esquematicamente como a PCR é usadapara introduzir mutações pontuais em uma CDR de XT-M4.(1) Projeta-se um oligonucleotídeo de introduçãopontual portando uma região de diversidade pelocomprimento da alça de CDR e delimitado por regiões dehomologia com o gene V alvo na FR3 e FR4 . (2) Ooligonucleotídeo é usado em uma reação de PCR com umprimer específico que anela à extremidade 5' do gene Valvo e é homólogo à região FRl. A FIG. 32 mostra aseqüência de nucleotideos da extremidade C terminal doconstruto ScFv de XT-M4 VL-VH (SEQ ID NO: 56). VH-CDR3está sublinhada. Também são mostrados doisoligonucleotideos de introdução pontual (SEQ ID NOs:57-58) com um número em cada sitio de mutação queidentifica a razão de introdução pontual usada paramutação nesse sitio. As composições de nucleotideos dasrazões de introdução pontual correspondentes aosnúmeros também são identificadas.

O produto de PCR com introdução pontual deXT-M4-VHCDR3 é clonado no vetor de exposição emribossomo pWRIL-3 como um fragmento Sfil para gerar umabiblioteca. Essa biblioteca é submetida a seleção emRAGE humano biotinilado usando-se exposição emribossomo (Hanes e Pluckthun., 2000) . Usa-se antigenomarcado com biotina, pois isso permite uma seleçãobaseada em solução, o que permite mais controlecinético sobre o processo e aumenta a probabilidade deenriquecimento preferencial dos clones de maiorafinidade. As seleções são realizadas em um modo deequilíbrio a uma concentração de antigeno decrescentecom relação à afinidade de partida ou em um modocinético, em que uma melhor taxa é especificamenteselecionada usando-se competição com antigeno nãomarcado em um espaço de tempo empiricamentedeterminado. Os complexos ribossomais não ligados sãolavados, o complexos ribossomais ligados a antigeno sãoeluídos, o RNA é recuperado, convertido em cDNA por RT-PCR, e se realiza uma segunda rodada de seleção em RAGEde camundongo-Fc biotinilado para manter a reatividadecruzada entre espécies. A saida dessa etapa de seleçãocontendo variantes de ScFv com mutações na VH-CDR3 é,então, submetida a uma etapa de mutação de ciclo 2.

Essa etapa de mutagênese envolve a geração de mutaçõesaleatórias usando-se PCR propensa a erros. A bibliotecagerada é, então, submetida a seleções de rodada 3 emRAGE humano-Fc biotinilado a uma concentração deantigeno 10 vezes menos. Esse processo é repetidoconforme reguerido. As saídas de RNA reunidas de cadaetapa de seleção são convertidas em cDNA e clonadas emum vetor de expressão de proteína pWRIL-1 paraclassificar a afinidade e reatividade cruzada entreespécies de ScFv's variantes. Os materiais dediversidade reunidos também são seqüenciados paraavaliar a diverisdade, para determinar se as seleçõesestão movendo para clones dominantes.

Exemplo 2 5Matuação de Afinidade de XT-M4 UsandoExposição em Fagos

A bibliotaca com mutações pontuais de VH-CDR3é clonada no vetor de exposição em fago pWRIL-1mostrado na FIG. 34 para seleção em hRAGE biotinilado.Será usado um antigeno marcado com biotina, pois esseformato é mais compatível com seleções acionadas porafinidade sem olução. As seleções sãor ealizadas em ummodo de equilíbrio a uma concentração de antigenodescrescente com relação à afinidade de partida ou emum modo cinético, em que se seleciona especificamenteuma taxa melhor para uso de competição com antigeno nãomarcado durante um espaço de tempo empiricamentedeterminado. Usam-se procedimentos padronizados paraexposição em fagos.

ScFv pode dimerizar, o que complica osprocedimentos de seleção e triagem. ScFv dimerizadomostra potencialmente ligação baseada em avidez, e essaatividade de ligação aumentada pode dominar as seleções. Essas melhoras na capacidade de ScFv dedimerizar, em vez de qualquer melhora intrínseca naafinidade, têm pouca relevância no anticorpoterapêutico final, que em geral é uma IgG. Para evitarartefatos resultantes de alterações na capacidade dedimerizar, usam-se formatos de anticorpo Fab, pois emgeral não dimerizam. XT-M4 foi reformatado como umanticorpo Fab e clonado em um novo vetor de exposiçãoem fagos pWRIL-β. Esse vetor tem sítios de restriçãoque abrangem ambas as regiões VH e VL e não cortamfreqüentemente em genes V da linhagem germinativahumana. Esses sítios de restrição podem ser usados paraembaralhamento e montagem combinatória de repertóriosVL e VH. Em uma estratégia, bibliotecas de mutaçãopontual VH-CDR3 e VL-CDR3 são ambas montadascombinatoriamente no vetor de exposição de Fab,conforme mostrado na FIG. 34, e são selecionadas quantoà melhor afinidade.

Exemplo 26

Caracterização Física do Anticorpo QuiméricoXT-M4

A caracterização preliminar por cromatografialíquida de alto desempenho (HPLC)/espectrometria demassa (MS) para mapeamento de peptídio e análise desubunidade com deteção MS on Iine confirmou que aseqüência de aminoácidos é conforme prevista para aseqüência de DNA de XT-M4 quimérico. Esses dados de MStambém indicaram que o sítio de consenso de seqüênciade oligossacarídeo ligado a N esperado em Asn299 SerThrestá ocupado, e que as duas principais espécies sãoglicanos fucosilados de núcleo bianternar ligados a Ncomplexos que contêm zero ou um resíduo galactoseterminal, respectivamente. Além do oligossacarídeoligado a N esperado localizado na região Fc damolécula, um oligossacarídeo ligado a N foi observadoem um sítio de consenso de seqüência (Asn52AsnSer) naregião CDR2 da cadeia pesada de XT-M4 quimérico. 0oligossacarídeo ligado a N extra é encontradoprincipalmente em apenas uma das cadeias pesadas ecompreende aproximadamente 38% das moléculas, conformedeterminado por análise CEX-HPLC (pode haver outrasespécies ácidas que não possam ser diferenciadas pelaestrutura primária, que podem contribuir para aporcentagem total de espécies ácidas. A espéciepredominante é uma estrutura bianternar fucosilada comdois ácidos siálicos. A absortividade é usada paracalcular a concentração por medição de A280· Άabsortividade teórica de XT-M4 quimérico foi calculadacomo sendo de 1,35 mL mg-1 cm.

O peso molecular aparente de XT-H4 quimérico,conforme determinado por SDS-PAGE não redutora, é deaproximadamente 200 kDa. O anticorpo migra maislentamente do que o esperado a partir de sua seqüência.Esse fenômeno foi observado para todos os anticorposrecombinantes analisados até agora. Sob condiçõesredutoras, XT-M4 quimérico tem uma única banda decadeia pesada migrando a aproximadamente 50 kDa e uma única cadeia leve migrando a aproximadamente 25 kDa.Também há uma banda adicional que migra logo acima dabanda de cadeia pesada. Essa banda foi caracterizadapor degradação Edman automatizada, e se determinou quetem um NH2 terminal que corresponde à cadeia pesada deXT-M4 quimérico. Esses resultados, juntamente com oaumento no peso molecular observado por SDS-PAGE,indicam que a banda adicional é consistente com acadeia pesada que tem um oligossacarideo ligado a Nextra na região CDR2.

o ponto isoelétrico predito (pi) de XT-M4quimérico com base na seqüência de aminoácidos é de 7,2(sem Lys COOH terminal na cadeia pesada). IEF resolveuXT-M4 quimérico em aproximadamente dez bandas quemigram dentro de uma faixa de pi de aproximadamente7,4-8,3, com uma banda dominante que migra com um pi deaproximadamente 7,8. 0 pi determinado por focalizaçãoisoelétrica de eletroforese capilar era deaproximadamente 7,7.A análise do material de revelação porcromatografia liquida de alto desempenho com troca decátions (CEX-HPLC) proporciona uma resolução adicionalpara espécies de XT-M4 quimérico que diferem na cargamolecular. A maior parte da heterogeneidade de cargaobservada é mais provavelmente devida a contribuiçõesdos ácidos siálicos que são encontrados nooligossacarideo ligado a N adicional, localizado naregião CDR2 da cadeia pesada. Uma pequena parte daheterogeneidade de carga observada pode ser atribuída àheterogeneidade da lisina COOH terminal.

Exemplo 27

Remoção do Sítio de Glicosilação

A mutação que converte asparagina (N) emácido aspártico (D) na posição 52 (pela numeração deKabat) na região variável de cadeia pesada do anticorpoXT-M4 melhora a ligação do XT-M4 anticorpo a RAGEhumano, conforme determinado por análise ELISA deligação direta a hRAGE-Fc, conforme mostrado na FIG.36. A mutação N52D está na CDR2 da região variável decadeia pesada do anticorpo XT-M4.

Exemplo 28

Ensaio Pré-clínico In Vivo de Eficácia doAnticorpo Quimérico Anti-RAGEA. Farmacocinética (PK)

A concentração sérica do anticorpo quiméricoXT-M4 após uma única dose IV de 5 mg/kg a camundongosmachos BALB/c (n=3) foi avaliada para XT-M4 quimérico.

A concentração sérica do anticorpo com o tempo foimedida com um ELISA de IgG. A exposição sérica média doXT-M4 quimérico era de (23.235 g.h/mL), e a meia-vida éde aproximadamente uma semana (152 horas) . Veja FIG.37 .

Exemplo 2 9

Modelo CFC de Déficit de MemóriaO paradigma de condicionamento de medocontextual (CFC) foi utilizado para examinar o efeitoda administração de um anticorpo de rato quimérico, XT- M4, que se liga especificamente a RAGE e inibe aligação de um parceiro de ligação a RAGE, sobre odesempenho cognitivo em um modelo animal de funçãocognitiva reduzida devido a depósitos amilóides.

O camundongo modelo Tg257 6 desenvolve placaamilóide em 18 meses, e isso é precedido por déficitsLTP no CAl hipocampal e giro dentado, déficits dememória espacial em um labirinto de água modificado,plasticidade sináptica modificada e uma elevação deagregados e oligômeros de Αβ até 6 meses de idade. Αβinduz déficits de memória contextual em camundongosTg2576 jovens não portadores de placas. Ocondicionamento de medo contextual (CFC), um teste deaprendizagem e memória dependente do hipocampo, foirealizado no modelo de camundongo APP humanotransgênico Tg2576 de formação de Αβ e depósitosamilóides.

A aprendizagem contextual envolve aassociação de um estimulo de aversão (choque na pata)com um ambiente de gaiola especifico onde ocorre ochoque (contexto). A memória para o condicionamento éexpressa como congelamento dependente de contexto naausência do choque. Os camundongos são condicionados emcâmaras operantes por pareamento do contexto com umbreve choque na pata. 0 treinamento consiste em umasessão de 5 minutos na câmara operante durante a qual oanimal recebe dois choques leves na pata. 0 teste dememória ocorre aproximadamente 24 horas depois, quandoo animal é reintroduzido no ambiente em que haviarecebido anteriormente o choque. Os níveis de atividadesão registrados durante o teste de memória, e o tempogasto no estado "congelado", expresso como umaporcentagem da quantidade de tempo total, é analisadopor ANOVA entre os grupos de tratamento. Níveisdiminuídos de atividade indicam uma memória intactapara o evento de aversão. Em contraste com companheirosde ninhada não transgênicos, determinou-se que Tg2576desenvolve déficits de memória contextual entre asidades de 14 e 16 semanas, e que déficits completos sãoobservados até 20 semanas de idade.

Administração de Anticorpos

Anticorpos XT-M4 quiméricos específicos paraRAGE murídeo foram diluídos em PBS e administrados i.p.a Tg2576 de 20 semanas de idade e companheiros deninhada não transgênicos de idade correspondente (tiposelvagem) em doses únicas (10 mg/kg) nos dias 1, 4, 7 e10. Um anticorpo neutro (inativo) foi administrado comocontrole. O treinamento dos camundongos começou no dia11, 24 horas após a quarta dose de anticorpo ter sidoadministrada, e o teste ocorreu no dia 12.

As contagens de memória (congelamentoaumentado) foram examinadas durante a sessão de testeno dia 12. A eficácia foi determinada por demonstraçãoda reversão dos déficits de memória com relação aosanimais transgênicos tratados com PBS. A dose mínimaeficaz (MED) foi determinada por geração de curvas dedose-resposta com doses variando de 0,1 a 30 mg/kg. Aduração da eficácia após uma única imunização na MEDestabelecida foi determinada por análise do cursotemporal e avaliação da extensão dos intervalos detempo antes do treinamento sobre uma melhor cognição.

Anticorpos XT-M4 quiméricos (κ, IgGl)demonstraram uma reversão significativa dos déficits dememória contextual. Em contraste, camundongos quereceberam a administração de um anticorpo nãorelacionado e controles de PBS não apresentaram nenhumefeito sobre o CFC em camundongos Tg257 6 oucompanheiros de ninhada de tipo selvagem. Os dadosmostram que a administração com anticorpo monoclonalXT-M4 quimérico contra RAGE murideo é eficaz paramelhorar a cognição no modelo transgênico APP de doençade Alzheimer. (Veja FIG. 38)

Materiais e Métodos

Camundongos

Os camundongos usados no estudo foramcamundongos Tg257618 transgênicos machosheterozigóticos, que expressavam a proteína APP humana.O genótipo foi confirmado por PCR, e todos os animaishomozigóticos para mutação de Degeneração de Retina(Rd) foram excluídos. A cepa de fundo consistia em umcruzamento de C57BI6 e 129SJL. Os estudos decondicionamento de medo contextual foram realizados noscamundongos com 20 semanas de idade (n = 8 -12/genótipo/idade).

Aparelho de Teste

O condicionamento de medo contextual (CFC)foi realizado em seis câmaras operantes de 30 χ 24 χ 21cm (Med Associates, Inc., St. Albans, Vt.) construídascom paredes de alumínio e teto, porta e parede de trásde plexiglass. Cada câmara foi equipada com um pisoconsistindo em 36 barras de aço inoxidável, através dasquais se podia administrar um choque na pata. Alémdisso, cada câmara tinha 2 luzes de estímulo, uma luzinterna e um solenóide. A iluminação, o choque na pata(US) e o solenóide (CS) eram todos controlados por umsoftware MED-PC rodando em um PC. As câmaras estavamlocalizadas em uma sala à prova de som, na presença deluz vermelha.

Condicionamento de Medo Contextual

O treinamento dos camundongos Tg257 6 ou deseus companheiros de ninhada de tipo selvagem e idadecorrespondente começou no dia 11, um dia depois de oscamundongos receberem sua quarta dose do anticorpoanti-RAGE XT-M4 quimérico.

O treinamento consistiu na colocação doscamundongos nas câmaras operantes, iluminação tanto dasluzes de estímulo, quanto itnerna e permissão de queexplorassem durante 2 minutos. Ao término dos doisminutos, a indicação auditiva (clique de 2 Hz pelosolenóide; CS) foi apresentada durante 15 segundos. 0choque na pata (US; 1,5 mAmp) foi administrado duranteos 2 segundos finais do CS e co-terminados com aapresentação do CS. Esse procedimento foi repetido, e,30 segundos depois do segundo choque na pata, oscamundongos foram removidos das câmaras e devolvidos asuas gaiolas.

Vinte horas depois do treinamento, os animaisforam retornados às câmaras onde haviam sidopreviamente treinados. 0 comportamento de congelamento,no mesmo ambiente onde haviam recebido o choque(contexto), foi, então, registrado pelo experimentadorusando-se amostragem de tempo em intervalos de 10segundos durante 5 minutos (30 pontos de amostra). 0congelamento foi definido como a falta de movimento,exceto o requerido para respiração. Ao término dos 5minutos, os camundongos foram devolvidos a suasgaiolas.

Os dados de congelamento na condição de Novoe Indicação foram coletados depois que todos oscamundongos haviam sido testados no contexto(aproximadamente 60 minutos depois do teste de contextoinicial). O novo ambiente consistia em modificações dacâmara operante, incluindo um divisor de plexiglassopaco do canto direito traseiro até o esquerdo frontal, um piso de plexiglass, assim como iluminação diminuída(apenas luz interna) . Os camundongos foram colocados nocontexto novo, e se usou a amostragem de tempo paracoletar as contagens de congelamento durante 3 minutos(18 pontos de amostra) . Ao término dos 3 minutos, o clique auditivo (CS) foi apresentado durante 3 minutos,durante os quais o congelamento foi novamente contado(18 pontos de amostra) . As contagens de congelamentopara cada animal foram convertidas em porcentagem decongelamento para cada parte do teste. A memória para ocontexto (memória contextual) para cada animal foiobtida por subtração da porcentagem de congelamento nanova condição (uma medida da atividade basal) daobservada no contexto.

Tratamento com Anticorpo

Os anticorpos XT-M4 quiméricos foram diluídosem PBS (10 mg/kg) e administrados i.p. em camundongosTg2576 de 20 semanas de idade ou seus companheiros deninhada de tipo selvagem de idade correspondente, comodoses únicas nos dias 1, 4, 7 e 10, com treinamento no11 e teste no dia 12.

Análise dos Dados

A memória contextual foi analisada usando-seANOVA de duas vias e comparação pareada de Fischer posthoc, feita usando-se o software estatístico SAS (SASInstitute, Inc.). Todos os dados são apresentados comomédia ± EPM.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

SEQUENCE LISTING

<110> Clancy, Brianpaul sen, JanetPiche-Nicholas, NicolePittman, DebbieSreekumar, Kodangattil R.Sun1 YingTan, Xiang-YangTchistiakov1 LioudmilaWidom, Angel

<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANTAGONISM OF RAGE

<130> 040000-0360547

<150> US 60/784,575<151> 2006-03-21

<150> US 60/895,303<151> 2007-03-16

<160> 64

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 404

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Genbank Accession No. NP_001127<400> 1

Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30

Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser vai Ala Arg vai Leu Pro65 70 75 80

Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95

Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn

Page 1

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA ANTAGONISMO DE RAGE<223> N0 de Acesso do Genbank NP 001127Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt100 105 110

Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125

Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140

vai Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160

Gly Lys Pro Leu vai Pro Asn Glu Lys Gly vai Ser vai Lys Glu Gln165 170 175

Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu180 185 190

Met vai Thr Pro Ala Arg Glv Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys195 " 200 205

Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro210 215 220

Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu225 230 235 240

vai vai Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr245 250 255

Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met260 265 270

Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu275 280 285

Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys vai Ala Thr290 295 300

His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile ser lie305 310 315 320

Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser325 330 335

Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly340 345 350

Page 2Rage_A2_PCT_040000-0360547.txtThr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg355 360 365

Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380

Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400

Thr Gly Gly Pro

<210> 2

<211> 1414

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> Genbank Accession No. NM_001136

<400> 2

gccaggaccc tggaaggaag caggatggca gccggaacag cagttggagc ctgggtgctg 60gtcctcagtc tgtggggggc agtagtaggt gctcaaaaca tcacagcccg gattggcgag 120ccactggtgc tgaagtgtaa gggggccccc aagaaaccac cccagcggct ggaatggaaa 180ctgaacacag gccggacaga agcttggaag gtcctgtctc cccagggagg aggcccctgg 240gacagtgtgg ctcgtgtcct tcccaacggc tccctcttcc ttccggctgt cgggatccag 300gatgagggga ttttccggtg ccaggcaatg aacaggaatg gaaaggagac caagtccaac 360taccgagtcc gtgtctacca gattcctggg aagccagaaa ttgtagattc tgcctctgaa 420ctcacggctg gtgttcccaa taaggtgggg acatgtgtgt cagagggaag ctaccctgca 480gggactctta gctggcactt ggatgggaag cccctggtgc ctaatgagaa gggagtatct 540gtgaaggaac agaccaggag acaccctgag acagggctct tcacactgca gtcggagcta 600atggtgaccc cagcccgggg aggagatccc cgtcccacct tctcctgtag cttcagccca 660ggccttcccc gacaccgggc cttgcgcaca gcccccatcc agccccgtgt ctgggagcct 720gtgcctctgg aggaggtcca attggtggtg gagccagaag gtggagcagt agctcctggt 780ggaaccgtaa ccctgacctg tgaagtccct gcccagccct ctcctcaaat ccactggatg 840aaggatggtg tgcccttgcc ccttcccccc agccctgtgc tgatcctccc tgagataggg 900cctcaggacc agggaaccta cagctgtgtg gccacccatt ccagccacgg gccccaggaa 960agccgtgctg tcagcatcag catcatcgaa ccaggcgagg aggggccaac tgcaggctct 1020gtgggaggat cagggctggg aactctagcc ctggccctgg Page ggatcctggg 3 aggcctgggg 1080

<223> N0 de Acesso do Genbank NM 001136acagccgccc tgctcattgg Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt ggtcatcttg tggcaaaggc ggcaacgccg aggagaggag 1140aggaaggccc cagaaaacca ggaggaagag gaggagcgtg cagaactgaa tcagtcggag 1200gaacctgagg caggcgagag tagtactgga gggccttgag gggcccacag acagatccca 1260tccatcagct cccttttctt tttcccttga actgttctgg cctcagacca actctctcct 1320gtataatctc tctcctgtat aaccccacct tgccaagctt tcttctacaa ccagagcccc 1380ccacaatgat gattaaacac ctgacacatc ttga 1414

<210> 3<211> 403

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Genbank Accession No. ΝΡ_031451<400> 3

Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu15 10 15

Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30

Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Gln Ile Leu Pro Asn65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe85 90 95

Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr100 105 110

Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val130 135 140

Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly145 150 155 160

Page 4

<213> Murideo

<223> N0 de Acesso do Genbank NP 031451

ΛRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr165 170 175

Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr180 185 190

vai Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser195 200 205

Phe Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile210 215 220

Gln Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu225 230 235 240

Val Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu245 250 255

Thr Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys260 265 270

Asp Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro275 280 285

Glu vai Gly His Ala Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His290 295 300

Pro Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr305 310 315 320

Glu Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly325 330 335

Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Val340 345 350

Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Ile Leu Trp Arg Lys Arg Gln Pro Arg355 360 365

Arg Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Ser Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg370 375 380

Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Ala Glu Met Pro Glu Asn Gly Ala385 390 395 400

Gly Gly ProRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<210> 4

<211> 1348

<212> DNA

<213> Murine

<220>

<221> misc_feature

<223> Genbank Accession No. NM_007425.1

<400> 4

gcaccatgcc agcggggaca gcagctagag cctgggtgct ggttcttgct ctatggggag 60ctgtagctgg tggtcagaac atcacagccc ggattggaga gccacttgtg ctaagctgta 120agggggcccc taagaagccg ccccagcagc tagaatggaa actgaacaca ggaagaactg 180aagcttggaa ggtcctctct ccccagggag gcccctggga cagcgtggct caaatcctcc 240ccaatggttc cctcctcctt ccagccactg gaattgtcga tgaggggacg ttccggtgtc 300gggcaactaa caggcgaggg aaggaggtca agtccaacta ccgagtccga gtctaccaga 360ttcctgggaa gccagaaatt gtggatcctg cctctgaact cacagccagt gtccctaata 420aggtggggac atgtgtgtct gagggaagct accctgcagg gacccttagc tggcacttag 480atgggaaact tctgattccc gatggcaaag aaacactcgt gaaggaagag accaggagac 540accctgagac gggactcttt acactgcggt cagagctgac agtgatcccc acccaaggag 600gaaccaccca tcctaccttc tcctgcagtt tcagcctggg ccttccccgg cgcagacccc 660tgaacacagc ccctatccaa ctccgagtca gggagcctgg gcctccagag ggcattcagc 720tgttggttga gcctgaaggt ggaatagtcg ctcctggtgg gactgtgacc ttgacctgtg 780ccatctctgc ccagccccct cctcaggtcc actggataaa ggatggtgca cccttgcccc 840tggctcccag ccctgtgctg ctcctccctg aggtggggca cgcggatgag ggcacctata 900gctgcgtggc cacccaccct agccacggac ctcaggaaag ccctcctgtc agcatcaggg 960tcacagaaac cggcgatgag gggccagctg aaggctctgt gggtgagtct gggctgggta 1020cgctagccct ggccttgggg atcctgggag gcctgggagt agtagccctg ctcgtcgggg 1080ctatcctgtg gcgaaaacga caacccaggc gtgaggagag gaaggccccg gaaagccagg 1140aggatgagga ggaacgtgca gagctgaatc agtcagagga agcggagatg ccagagaatg 1200gtgccggggg accgtaagag cacccagatc gagcctgtgt gatggcccta gagcagctcc 1260cccacattcc atcccaattc ctccttgagg cacttccttc tccaaccaga gcccacatga 1320tccatgctga gtaaacattt gatacggc 1348

<210> S<211> 8

Page 6

<213> Murídeo

<223> N0 de Acesso do Genbank NM 007425.1Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Streptavidin tag sequence<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5

<210> 6

<211> 1250

<212> DNA

<213> Baboon

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(1231)

<400> 6

gaccctggaa ggaagcagg atg gca gcc gga gca gca gtt gga gcc tgg gtg 52

Met Ala Ala Gly Ala Ala Val Gly Ala Trp Val1 5 10

ctg gtc ctc agt ctg tgg ggg gca gta gta ggt gct caa aac ate aca 100

Leu Val Leu Ser Leu Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr15 20 25

gcc cgg ate ggt gag cca ctg gtg ctg aag tgt aag ggg gcc ccc aag 148

Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys30 35 40

aaa cca ccc cag cag ctg gaa tgg aaa ctg aat aca ggc cgg aca gaa 196

Lys Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu45 50 55

gct tgg aag gtc cta tet ccc cag gga ggc ccc tgg gat agt gtg gct 244

Ala Trp Lys vai Leu Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser vai Ala60 65 70 75

cgt gtc ctt ccc aac ggc tcc ctc ttc ctt ccg gct gtc ggg ate cag 292

Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala vai Gly Ile Gln80 85 90

gat gag ggg att ttc cgg tgc cag gca atg aac agg aat gga aag gag 340

Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu95 100 105

acc aag tcc aac tac cga gtc cgt gtc tac cag att cct ggg aag ccg 388

Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro110 115 120

gaa att ata gat tet gcc tet gaa ctc acg gct ggt gtt ccc aat aag 436

Glu Ile Ile Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys125 130 135

gtg ggg aca tgt gtg tca gag gga age tac cct gca ggg act ctt age 484

Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser140 145 150 155

Page 7

<223> Seqüência de etiqueta de estreptavidina<213> BabuinoRage_A2_PCT_040000-0360547.txttgg cac ttg gat ggg aag ccc ctg gtg cct aat gag aag gga gta tctTrp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser160 165 170

gag gtc caa ttg gtg gta gag cca gaa ggt gga gca gta gct cct ggtGlu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly240 245 250

gga ggc ctg ggg aca gcc gct ctg ctc att ggg gtc ate ttg tgg caaGly Gly Leu Gly Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln350 355 360

ggc gag agt ggt act gga ggg cct tga ggggcccaca gacagatccGly Glu Ser Gly Thr Gly Gly Pro400

532

gtg aag gaa gag acc agg aga cac cct gag acg ggg ctc ttc aca ctg 580

vai Lys Glu Glu Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu

175 180 185

cag tcg gag cta atg gtg acc cca gcc cgg gga gga aat ccc cat ccc 628

Gln Ser Glu Leu Met vai Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asn Pro His Pro

190 195 200

acc ttc tcc tgt age ttc age cca ggc ctt ccc cga cgc cgg gcc ttg 676

Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Leu

205 210 215

cac aca gcc cct ate cag ccc cgt gtc tgg gag cct gtg cct ctg gag 724

His Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu

220 225 230 235

772

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255 260 265

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285 290 295

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300 305 310 315

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Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser

320 325 330

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335 340 345

1108

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1250Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<210> 7<211> 403<212> PRT<213> Baboon

<400> 7

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Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe85 90 95

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Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Ile Asp Ser115 120 125

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Page 9

<213> BabuinoRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val225 230 235 240

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Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly325 330 335

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Gly Gly Pro

<210> 8

<211> 1250

<212> DNA

<213> Cynomologus Monkey

<220>

<221> CDS

<222> (20)..(1231)

<400> 8

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<213> Macaco cinomolgoRage_A2_PCT_040000-0360547.txt1 5 10

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30 35 40

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244

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772

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300 305 310 315

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<210> 9<211> 403<212> PRT

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Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Arg Cys Val Ala Thr His290 295 300

Pro Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile305 310 315 320

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Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly325 330 335

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Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Arg Arg Gln355 360 365

Gly Glu Glu Arg Lys Ala Ser Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu Arg370 375 380

Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Gly Thr385 390 395 400

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<210> 10

<211> 1220

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242

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Page 14

<213> CoelhoRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

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Lys Leu Leu Val Pro Asp Gly Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr165 170 175

<213> CoelhoRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Arg Arg His Pro Asp Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met180 185 190

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Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Ile210 215 220

Gln Pro Ser Val Trp Glu Pro Gly Pro Leu Glu Val Arg Leu Leu Val225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr245 250 255

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Glu Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu325 330 335

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<210> 12

<211> 1247

<212> DNA

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255 260 265

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<210> 13

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962

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Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly

335 340 345

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Glu Glu Arg Thr Glu Leu His Gln Ser Glu Ala Arg Glu Ala Met Glu380 385 390 395

1247

<213> CoelhoRage_A2_PCT_040000-0360547.txt35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Gly Ser Trp Asp Ser Val Ala His Val Leu Pro Asn65 70 75 80

Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala vai Gly Ile Gln Asp Glu Gly Thr Phe85 90 95

Arg Cys Arg Thr Thr Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr100 105 110

Arg vai Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Leu Asp Pro115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Ile Pro Ser Lys Val Glv Thr Cys Val130 135 140

Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Leu Gly Thr Leu Ser Trp His Met Asp Gly145 150 155 160

Lys Leu Leu Val Pro Asp Gly Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr165 170 175

Arg Arg His Pro Asp Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met180 185 190

Val Thr Pro Ala Gly Gly Gly Gly Pro Pro Pro Thr Phe Ser Cys Ser195 200 205

Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg Arg Arg Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Ile210 215 220

Gln Pro Ser Val Trp Glu Pro Gly Pro Leu Glu Val Arg Leu Leu vai225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Ala vai Ala Pro Gly Glu Thr vai Thr Leu Thr245 250 255

Cys Glu Ala Pro Ala Gln Pro Pro Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp260 265 270

Gly Met Ser Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu275 280 285

Page 20Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

VaT Gly Pro Gln Asp Glu Gly Tfir Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro

290 295 300

Asn Arg Gly Pro Gln Glu Ser Leu Pro Ile Ser Ile Ser Val Glu Thr

305 310 315 320

Gly Glu Asp Gly Pro Thr Ala Gly Ser Glu Gly Gly Ser Gly Leu Gly

325 330 335

Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Thr Ala Ala340 345 350

Leu Leu vai Gly vai Ile Leu Trp Arg Arg Arg Lys Arg Gln Gly Glu355 360 365

Gln Arq Lys Val Pro Glu Asn Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg Thr Glu

370 375 380

Leu His Gln Ser Glu Ala Arg Glu Ala Met Glu Ser Gly Thr Gly Glu

385 390 395 400

<210> 14

<211> 402

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Genbank No. NP_445788

<400> 14

Met Pro Thr Gly Thr vai Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu1 5 10 15

Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30

Pro Leu Met Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Thr Gln Lys35 40 45

Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60

Ser Pro Gln Gly Asp Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Ile Leu Pro Asn65 70 75 80

Page 21

<223> N0 de Acesso do Genbank NP 445788Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Ile Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe85 90 95

Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Leu Gly Lys Glu vai Lys Ser Asn Tyr100 105 110

Arg vai Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asn Pro115 120 125

Ala Ser Glu Leu Thr Ala Asn Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys ValIBO 135 140

Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly145 150 155 160.

Lys Pro Leu Ile Pro Asp Gly Lys Gly Thr Val Val Lys Glu Glu Thr165 170 175

Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leü Arg Ser Glu Leu Thr180 185 190

Val Thr Pro Ala Gln Gly Gly Thr Thr Pro Thr Tyr Ser Cys Ser Phe195 200 205

Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile Gln210 215 220

Pro Arg vai Arg Glu Pro Leu Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu Val225 230 235 240

Glu Pro Glu Gly Gly Thr Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr245 250 255

Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Ile His Trp Ile Lys Asp260 265 270

Gly Thr Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro Glu275 280 285

Val Gly His Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Pro290 295 300

Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Asn Ile Arg Val Thr Glu305 310 315 320

Thr Gly Asp Glu Gly Gln Ala Ala Gly Ser Val Asp Gly Ser Gly Leu325 330 335Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly Ile Ala340 345 350

Ala Leu Leu Ile Gly Ala Ile Leu Trp Arg Lys Arg Gln Pro Arg Leu355 360 365

Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Ser Gln Glu Asp Glu Glu Glu Arg Ala370 375 380

Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Ala Glu Met Pro Glu Asn Gly Ala Gly385 390 395 400

Gly Pro

<210> 15

<211> 5301

<212> DNA

<213> baboon

<400> 15

ttttttaaaa actactattt gaaaattgga gggggaagag tgggaaggga gttattgcca 60aatatgttaa atatgggttg gggtgcttgt atatgtatct tcctcaattt ccccagaaat 120gaggtatctt tttgtcacac caaaatcaag tggtagggag agggaggagg ttgcaaaaag 180ccaagtgtgg gggaaaagta aaatcaacac tgtcccatcc tcagccctaa accctaccat 240ctgatcccct cagacattct caggattttg caagactgtc agagtgggga acccctccca 300ttaaagatct gggcaggact ggggacaggt tggaagtgtg atgggtgggg gggtgggagg 360catgggctgg gggcagttct ctcctcactt gtaaacttgt gtagtttcac agaaaaaaaa 420caaaatgcag ttttaaataa agaagtttct ttttttcctg ggtttagttg agaatttttt 480tcaaaaaaca tgagaaaccc cagaaaaaaa aatatatatt ttctttcacg aagctccaaa 540caggtttctc tcctgtcccc cagccttgcc ttcacgatgc agtcccaatt gcacccttgc 600aaacaacagt ctggcctcaa cgctattgat gcaaccttgc ccagtcaaca tggggctcca 660gtgggtcacc aggcagccct gatggactga tggaataaat aggatagggg gctctgaggg 720aatgagaccc tagagggtac actccccatc ccccagggaa gtgactgtgt ccagaggctg 780gtagtgccca ggggtggggt gataattatt tctctagtac ctgaaggact cttgtcccaa 840aggcatgaat tcctagcatt ccctgtgaca agatgactga aagatggggg ctggagagag 900ggtacaggcc ccacctaggg cggaggccac agcgcggaga ggggcagaca gagctatgag 960cctggaagga agcaggatgg cagccggagc agcagttgga gcctgggtgc tggtcctcag 1020tctgtggggt gagccactcc ccccacccac tgacccttcc tacagaaagc acttgaaccc 1080

<213> BabuinoRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

cataccccaa ttgccctaga acttttccca gaacccaggg aactgctttt caaggtcccg 1140cacgcaccct gtccaaattt tgttagccct cattaccttc ctgcccctct accacgatgc 1200tgtctcccag gggcagtagt aggtgctcaa aacatcacag cccggatcgg tgagccactg 1260gtgctgaagt gtaagggggc ccccaagaaa ccaccccagc agctggaatg gaaactggta 1320agtggggatc ctgttgcagc ttcccaactt ccagggagac cagcaatgat tcggatcccc 1380atcactctgc ctcacagtac tttcccaaag gccttgcact gtttaggccc tgcttctctg 1440cttctagaat acaggccgga cagaagcttg gaaggtccta tctccccagg gaggcccctg 1500ggatagtgtg gctcgtgtcc ttcccaacgg ctccctcttc cttccggctg tcgggatcca 1560ggatgagggg attttccggt gccaggcaat gaacaggaat ggaaaggaga ccaagtccaa 1620ctaccgagtc cgtgtctacc gtaagaattc cagggccttc tccaaggccc cctctcttat 1680ctcagaaaaa gccttcaacc ctagccttgg cccatgaggg cctctgactt ccactggccc 1740catttccaca cacagagttt gagaaccttc acaattacag cctctgattg gatttttcct 1800tcttcagaga ttcctgggaa gccggaaatt atagattctg cctctgaact cacggctggt 1860gttcccaaca aggtagtgaa agaaaggaga agtagaaaat ggtcctgtga acaggaggcg 1920agtgtgtgtg ggtgtgtggc atctctcatt ttcaaaggat tctgaggtca ccactctttc 1980cccaggtggg gacatgtgtg tcagagggaa gctaccctgc agggactctt agctggcact 2040tggatgggaa gcccctggtg cctaatgaga agggtgagtc cgaaggtgcc cgccaagctg 2100CCttCtCCCt gatctcactc ccacacccac cctgggataa tttgtcttat cctcctacca 2160taggagtatc tgtgaaggaa gagaccagga gacaccctga gacggggctc ttcacactgc 2220agtcggagct aatggtgacc ccagcccggg gaggaaatcc ccatcccacc ttctcctgta 2280gcttcagccc aggccttccc cgacgccggg ccttgcacac agcccctatc cagccccgtg 2340tctggggtga gcagaggtgg ggagggctcc aagctcatgt gagtgcattc tggaagtcgg 2400acccttaggg aaagagggag tcaagcccat ggccactggg atcactcaca agtgtaactc 2460tccacctcat aacccttcca actcccagag cctgtgcctc tggaggaggt ccaattggtg 2520gtagagccag aaggtggagc agtagctcct ggtggaaccg taaccctgac ctgtgaagtc 2580cctgcccagc cctctcctca gatccactgg atgaaggatg tgagtgacct ggagagaggg 2640gctgggaggt agggtgaacc ataactagca acagggaggg cagagggcta acgagggaaa 2700ggcaggctag gagctgagga ggaagagagg gtatttgaag atgtggagac aaaaagataa 2760gagttttgaa atagtctcct CtCCCCttCC cccaccaggg tgtgccctta cccctttccc 2820ccagccctgt gctgatcctc cctgagatag ggcctcagga ccagggaacc tacaggtgtg 2880tggccaccca tcccagccac gggccccagg aaagccgtgc tgtcagcatc agcatcatcq 2940gtgagacctc tctccaagcc ctacagaccc tggggctagg gtgcaggata gcacaggctc 3000taatttcctg ccccattctg gccttacccc caagagccag cccacctctc cctccgtgca 3060cccacaccca aacctcccct gccccactca aattctgcca agagagcagc caagcctctc 3120CCttCttCCC tctgaactaa aaaaagggaa agacggctgg gcgcagtggc tcacgcctgt 3180aatcccaaca ctttgggagg ctgaggccgg tggatcacct gaggttggga gttcaagacc 3240agtctgacca acatggagga accccatttc tactaaaaat acaaaattag ccagttgtgg 3300tggcacgtgc ctgtaatccc agctacttgg gaggctgaga caggaaaatc acttgaaccc 3360gggaggcgta agttgcggtg agccaagatc ctgccattgc atgccagcct gggcaacaag 3420agcgaaactc catctcaaaa aaaaaaaaaa aagaaaggga aagactccac tggagctccc 3480actaaataac cctctctcaa cccgaagtct tcctttctga ctggatccaa ctttgtcttc 3540cagaaccagg cgaggagggg ccaactgcag gtgaggggtt cgagaaagtc agggaagcag 3600aagatagccc ccaacacatg tgactgcggg gatggtcaac aagaaaggaa tggtggccgg 3660gcgcggtggc tcaagcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgagatggg cggatcacga 3720ggtcaggaga tcgagaccat cctggctaac acagtaaaac cccatctcta ccaaaaaaaa 3780atacaaaaaa ctagccgggc gacgtggcgg gcgcctgtag tcccagctac tcgggaggct 3840gaggcaggag aatggtgtaa acccgggagg cggagcttgc agtgagctga gatccggcca 3900ctgcactcca gcctgggcaa cagagccaga ctccatctca aaaaaaaaaa aaaagaaaga 3960aaggaatggt gagtggtggg ggctgtgctc tcaattttcc ctgtctccct acaggctctg 4020tgggaggatc agggccagga actctagccc tggccctggg gatcctggga ggcctgggga 4080cagccgctct gctcattggg gtcatcttgt ggcaaaggcg gcgacgccaa cgagaggaga 4140ggtgagtgga gaaagccaga ctcctcagac ctagggcttc caggcagcaa gtgaagaggg 4200atggggggtg gaacgacaac gtgcagcatt ctccacaatc ttcctcctca ggaaggcctc 4260agaaaaccag gaggaagagg aggagcgtgc agagctgaat cagtcggagg aacctgaggc 4320aggcgagagt ggtactggag ggccttgagg ggcccacaga gagatcccat ccatcagctc 4380ccttttcttc ttcccttgaa ctgttctggc cccagaccaa ctctctcctg tataacccca 4440ccttgccaaa ctttcttcta caaccagagc cccccacaat gatgagtaaa cacctgacac 4500atcttgctct tgtgtgtctg tgtatatgtg tgtgagacac aacctcaccc ctacaccctt 4560gagggccctg aaggaaaggg actcaccccc acactgcacc aaacatctac tcaagttggg 4620gagaagatgc ttctgtcaag agagggaggg aggaaggtgg ggggcaaact tgggaagaga 4680tcccatcaat acatttcacc ttttttattg aatttgtatt aaaggaggta gtaaggggga 4740ggaagcactt aagagtcaga acccatatta gactctgggg agtgaaaaat taaattaaat 4800caataagatg ggagtggggg aagagtcaga gggagctttg cccccctttc aagatcaaat 4860Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

caagaaatca gggaaagcaa agacttagaa gagaagaaag acattctctc aatccatcct 4920

ccttccccag ggcagagaat tataatgtta ctgagtgagc ttctgagcag aaggctctcc 4980

catctatgca cagacttcac tcctcctccc caagctttcc tggagaatgt ccagggctgg 5040

ccttagccaa cagaaataga gaggtcaagg gggtccatga gtaaggaagg gtcagcaggg 5100

acccccaata ctgattctcc tctggctgga ggtgggcagg aaggagacat agctcaaata 5160

ctgagcagcc aaaaaaagaa gaagatggcg agaaacagga agagggaatc ctgccagctg 5220

gaggccgggt gaccctgtcc cagatccaca cctgtgggag agaggaaagc tgtggaagca 5280

tatgcttcta ggctgggagg g 5301

<210> 16

<211> 119

<212> PRT

<213> Rat

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> ΧΤ-Μ4 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Heavy Region

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr20 25 30

Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Ser Ile Asn Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys85 90 95

Thr Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Val Met Val Thr Val Ser Ser

<213><223>

Rato

Região Pesada Variável115

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Rat

<220>

<221> MISC_FEATURE<22 3> XT-M4 VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> variable Light Region

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser vai Ser Leu Gly15 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp vai Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Arg Met Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Ile Tvr Ser Leu Thr Tle Ser Ser Leu Glu Ssr65 70 ' 75 80

Glu Asp vai Ala Asp Tyr His Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly ser Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys100 105

<210> 18

<211> 119

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> XT-Hl VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> variable Heavy Region

<400> 18

<213> Rato

<223> Região Leve Variável<213> Murideo

<223> Região Pesada VariávelRage_A2_PCT_040000-0360547.txtGln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Ile Thr Ser Tyr20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45

Val vai Ile Trp Ser Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Ser Thr Leu Lys50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val85 90 95

Arg His Gly Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115

<210> 19

<211> 106

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-Hl VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Light Region

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Phe20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Thr Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Phe Ile35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

<213> Murídeo

<223> Região Leve VariávelAsn Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Met Tyr Thr85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 20

<211> 119

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-H5 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Heavy Region

<400> 20

Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asp Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Lys Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Thr Thr His Asp His Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115

<210> 21<211> 117

<213> Murídeo

<223> Região Pesada VariávelRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<212> PRT<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<22 3> XT-H2_VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Heavy Region

<400> 21

Glη Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Tyr Trp Ile35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 35

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-H2-VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Light Region

<400> 22

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly

Page 30

<213> Murideo

<223> Região Pesada Variável

<213> Murideo

<223> Região Leve VariávelAsp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val ser Asp Arg Phe ser Gly vai Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser85 90 95

Asn ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110

<210> 23

<211> 111

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-H5 VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Light Region

<400> 23

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala vai Ser Leu Gly15 10 15

Gln Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu ser vai Asp Asn Tyr20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Thr vai Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His65 70 75 80<213> Murideo

<223> Região Leve VariávelRage_A2_PCT_040000-0360547.txtPro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110

<210> 24<211> 116<212> PRT<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-H3 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> variable Heavy Region

<400> 24

Gln vai Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

G"ly Asn Leu Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe50 55 60

Lys ser Lys vai Thr Leu Thr Glu Asp Thr ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met His Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Thr Ser Leu Arg Arg Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110

Thr vai Ser Ala115

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> Murine

<220>

<213> Murídeo

<223> Região Pesada Variável<213> Murideo<221> MISC_FEATURE<223> XT-H3 VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> variable Light Region

<400> 25

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Tyr Met Ser Met Ser Phe Gly15 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr20 25 30

vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Thr Tyr Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 26<211> 116<212> PRT<213> Murine

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-H7 VH

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Heavy Region

<400> 26

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln15 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45

<223> Região Leve Variável<213> Murideo

<223> Região Pesada VAriávelRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Gly vai Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Met50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Tyr Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val100 105 110

Thr vai Ser Ser115

27

106

PRT

Muri ne

<210><211><212 ><213>

<220>

<221> MISC_FEATURE<223> XT-H7 VL

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Variable Light Region

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15

Gly Lys vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Lys Tyr20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Arg Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

<213> Murídeo

<223> Região Leve Variável<210> 28<211> 117<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVH_v2.0<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized heavy chain variable regions<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Tyr Trp Ile35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 29

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVH_v2.7<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized heavy chain variable regions

<223> XT-H2_hVH_2.0 Humanizado<223> Seqüências de aminoácidospesada humanizadas<223> XT-H2_hVH_2.7 Humanizado<223> Seqüências de aminoácidospesada humanizadas

de regiões variáveis de cadeia

de regiões variáveis de cadeiaRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

vai Thr vai Ser Ser115

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> XT-H2_hVH_V4.0<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized heavy chain variable regions<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Page 36

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeipesada humanizadasRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115

<210> 31

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVH_v4.1<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized heavy chain variable regions<400> 31

Glu vai Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30

Trp Met His Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Tyr Trp Val Ala Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn50 55 60

Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ala Lys Ser65 70 75 80

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Gly Tyr Thr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<223> XT-H2_hHV_V4.1 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeipesada humanizadas<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVL_v2.O

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequerce of humanized Iight chain variable regions<400> 32

Asp vai vai Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly15 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp vai Gly vai Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVL_v3.0

<220>

<221> MISC_FEATU RE

<223> Amino acid sequence of humanized light chain variable regions<400> 33

Asp Ile vai Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly15 10 15

<223> XT-H2_hVL_V2.0 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadei

leve humanizadas

<223> XT-H2_hVL_V3.0 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeileve humanizadasRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 34<211> 112<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVL_v4.0<220>

<221> MISC_FEAlüRE

<223> Amino acid sequence of humanized Iight chain variable regions<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser85 90 95

Page 39

<223> XT-H2_hVL_V4.0 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeileve humanizadasAsn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-H2_hVL_v4.1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequence of humanized light chain variable regions<400> 35

Asp Val Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30

Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser85 90 95

Asn Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys100 105 110

<210> 36

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVH_Vl.0

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized heavy chain variable regions<400> 36

<223> XT-H2_hVL_V4.1<223> Seqüências deleve humanizadas<223> XT-M4_hVH_Vl.0<223> Seqüências depesada humanizadas

Humanizadoaminoácidos

de regiões variáveis de cadeia

de regiões variáveis de cadeiaRage_A2_PCT_040000-0360547.txtIu Ser Gly

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr20 25 30

Trp Met Thr Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp vai35 40 45

Ala Ser Ile Asn Asn ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr pro Asp Ser Val50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115

<210> 37

<211> 119

<?X2> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVH_Vl.1<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized heavy chain variable regions<400> 37

Glu vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Ser Ile Asp Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60

<223> XT-M4_hVH_Vl.1 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeipesada humanizadasLvs Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 HO

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115

<210> 38

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVH_v2.0<220>

<221> MISC_FEATURE , , . . ,,

<223> Amino acid sequences of humamzed heavy chain variable regions

<400> 38

Glu vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Spr leu Arn Leu Ser rvs ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr""" " 20 " 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala ser Ile Asp Asn Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 HO

Thr Leu vai Thr vai Ser Ser115

<223> XT-M4_hVH_V2.0 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeipesada humanizadasRage_A2_PCT_040000-0360547. txt

<210> 39<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.4 \ (G66R)<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 40<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.5 \ (D70I)<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly15 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr

Page 43

<223> XT-M4_hVL_V2.4 Humanizado \ (G66R)

<223> Seqüências de aminoácidos de regiõesleve humanizadas

<223> XT-M4_hVL_V2.5 Humanizado \ (D70I)

<223> Seqüências de aminoácidos de regiõesleve humanizadas

variáveis de cadeia

variáveis de cadeiaVal Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ile Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 41<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.6 \ (T69S)<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

<223> XT-M4_hVL_V2.6 Humanizado \ (T69S)

100 105

<210> 42<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.7 \ Cl46R)<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized Iight chain variable regions<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 43<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.8<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized Iight chain variable regions<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

<223> XT-M4_hVL_V2.7 Humanizado \ (L4 6R)

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia

leve humanizadas

<223> XT-M4_hVL_V2.8 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeialeve humanizadasRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 44<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.9 \ (F71Y)<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized Iight chain variable regions<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Page 46

<223> XT-M4_hVL_V2.9 Humanizado \ (F71V)

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeileve humanizadasThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys100 105

<210> 45<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.10<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 46<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.11<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions

<400> 46

<223> XT-M4_hVL_V2.10 Humanizado<223> Seqüências de aminoácidosleve humanizadas

<223> XT-M4_hVL_V2.11 Humanizado<223> Seqüências de aminoácidosleve humanizadas

de regiões variáveis de cadeia

de regiões variáveis de cadeiaRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 47<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVi__V2.12

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

vai Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

<223> XT-M4_hVL_V2.12 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeileve humanizadasRage^A2_PCT_040000-0360547.txt

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys100 105

<210> 48<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.13<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Amino acid sequences of humanized light chain variable regions<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arq Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 49<211> 107<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Humanized XT-M4_hVL_v2.14<220>

<221> MISC_FEATURE

Page 49

<223> XT-M4_hVL_V2.13 Humanizado

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeileve humanizadas

<223> XT-M4 hVL V2.14 Humanizado<22B> Amino acid sequences of humanized Iight chain variable regions

<400> 49

Asp ITe Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp vai Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> ArtiFicial

<220>

<223> Linker<400> 50

Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser15 10 15

60120180240

<210> 51

<211> 783

<212> ONA

<213> Artificial

<220>

<223> XT.H2_VL-VH (direct) ScFv<400> 51

gtggcccagg cggccggcgc gcactccgactccgcctccg tgggcgaccg ggtgaccatctccgacggct tcacctacct ggactggtatctgatctacc tggtgtccga ccggttctcc

sequence

atccagatga cccagtcccc ctcctccctgacctgcaagt ccaccaagtc cctgctgaaccagcagaagc ctggcaaggc ccctaagctgggcgtgcctt cccggttcag cggctccggc

<223> Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeileve humanizadas<223> Elo

<223> Seqüência de ScFv de XT.H2_VL-VH (direto)Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc tccctccagc ctgaggactt cgccacctac 300tactgcttcc agtccaactc cctgcctctg acctttggcg gcggaacaaa ggtggaaatc 360aaagatggcg gtggatcggg cggtggtgga tctggaggag gtggaagctc tgaggtgcag 420ctcgtggagt ctggcggcgg actggtgcag cctggcggct ccctgcggct gtcctgcgcc 480gcctccggct acaccttcac cacctactgg atgcactggg tgcggcaggc ccctggcaag 540ggcctggagt gggtcgccta catcaaccct tccaccggct ataccgagta caaccagaag 600ttcaaggacc ggttcaccat ctcccgggac aacgccaaga actccctgta cctccagatg 660aactccctgc gggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccagatgggc tggctacacc 720atcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct catctgatca ggcctcaggg 780gcc 783

<210> 52

<211> 783

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> XT.H2_VH-VL (direct) ScFv sequence

<400> 52

gtggcccagg cggccggcgc gcactccgag gtgcagctcg tggagtctgg cggcggactg 60gtgcagcctg gcggctccct gcggctgtcc tgcgccgcct ccggctacac cttcaccacc 120tactggatgc actgggtgcg gcaggcccct ggcaagggcc tggagtgggt cgcctacatc 180aacccttcca ccggctatac cgagtacaac cagaagttca aggaccggtt caccatctcc 240cgggacaacg ccaagaactc cctgtacctc cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc 300gccgtgtact actgcgccag atgggctggc tacaccatcg actactgggg ccagggcacc 360ctggtgaccg tgtcctcaga tggcggtgga tcgggcggtg gtggatctgg aggaggtgga 420agctctgaca tccagatgac ccagtccccc tcctccctgt ccgcctccgt gggcgaccgg 480gtgaccatca cctgcaagtc caccaagtcc ctgctgaact ccgacggctt cacctacctg 540gactggtatc agcagaagcc tggcaaggcc cctaagctgc tgatctacct ggtgtccgac 600cggttctccg gcgtgccttc ccggttcagc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 660accatctcct ccctccagcc tgaggacttc gccacctact actgcttcca gtccaactcc 720ctgcctctga cctttggcgg cggaacaaag gtggaaatca aatctgatca ggcctcaggg 780gcc 783

<210> 53<211> 774<212> DNA<213> Artificial

Page 51

<223> Seqüência de ScFv de XT.H2_VH-VL (direto)Rage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<220>

<223> xt.M4_vh_vl Scfv sequence

<400> 53 gtggcccagg cggccggcgc gcactccgag gtgcagctgg tggagtctgg cggcggactg 60gtgcagcctg gcggctctct gagactgtct tgtgccgcct ccggcttcac cttcaacaac 120tactggatga cctgggtgag gcaggcccct ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc 180gacaactccg gcgacaacac ctactacccc gactccgtga aggaccggtt caccatctcc 240agggacaacg ccaagaactc cctgtacctc cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc 300gccgtgtact actgtgccag aggcggcgat atcaccaccg gcttcgacta ctggggccag 360ggcaccctgg tgaccgtgtc ctctgatggc ggtggatcgg gcggtggtgg atctggagga 420ggtggaagct ctgacatcca gatgacccag tccccctctt ctctgtctgc ctctgtgggc 480gacagagtga ccatcacctg tcgggcctct caggatgtgg gcatctacgt gaactggttt 540cagcagaagc ctggcaaggc tcccaggcgc ctgatctacc gggccaccaa cctggccgat 600ggcgtgcctt ccagattctc cggctctcgc tctggcaccg atttcaccct gaccatctcc 660tccctccagc ctgaggattt cgccacctac tactgcctgg agttcgacga gcaccctctg 720acctttggcg gcggaacaaa ggtggagatc aagtctgatc aggcctcagg ggcc 774<210> 54 <211> 774 <212> DNA <2X3> Artiificial <220> <223> XT.M4_VL_VH ScFv sequence <400> 54 gtggcccagg cggccggcgc gcactccgac atccagatga cccagtcccc ctcttctctg 60tctgcctctg tgggcgacag agtgaccatc acctgtcggg cctctcagga tgtgggcatc 120tacgtgaact ggtttcagca gaagcctggc aaggctccca ggcgcctgat ctaccgggcc 180accaacctgg ccgatggcgt gccttccaga ttctccggct ctcgctctgg caccgatttc 240accctgacca tctcctccct ccagcctgag gatttcgcca cctactactg cctggagttc 300gacgagcacc ctctgacctt tggcggcgga acaaaggtgg agatcaagga tggcggtgga 360tcgggcggtg gtggatctgg aggaggtgga agctctgagg tgcagctggt ggagtctggc 420ggcggactgg tgcagcctgg cggctctctg agactgtctt gtgccgcctc cggcttcacc 480ttcaacaact actggatgac ctgggtgagg caggcccctg gcaagggcct ggagtgggtg 540gcctccatcg acaactccgg cgacaacacc tactaccccg actccgtgaa ggaccggttc 600accatctcca gggacaacgc caagaactcc ctgtacctcc agatgaactc cctgagggcc 660

<223> Seqüência de ScFv de XT.M4_VH_VL<223> Seqüência de ScFv de XT.M4_VL_VHgaggataccg ccgtgtacta ctgtgccaga ggcggcgata tcaccaccgg cttcgactac 720

tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc tcttctgatc aggcctcagg ggcc 774

<210> 55

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> C terminal end of Μ4 ScFv - VL/VH format<400> 55

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp15 10 15

Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val20 25 30

Ser ser ser Asp Gln Ala Ser Gly Ala35 40

<210> 56

<211> 123

<212> ONA

<213> Artificial

<220>

<223> C terminal end of M4 Scfv vl/vh format

<4qq> cc

ctgagggccg aggataccgc cgtgtactac tgtgccagag gcggcgatat caccaccggc 60

ttcgactact ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct cttctgatca ggcctcaggg 120

gcc 123

<210> 57

<211> 86

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Spiking oligonucleotide for VH3-CDR3 mutagenesis of M4 VL/VH<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(70)

<223> N is A, T, C or G

<400> 57

caggttgtcg gcccctgagg cctgatcaga ggacacggtc accagggtgc cctggcccca 60nnnnnnnnnn tctggcacag tagtac 86

<223> Extremidade C terminal de ScFv de M4 - formato VL/VH<223> Extremidade C terminal de ScFv de M4 - formato VL/VH<223> Oligonucleotideo de mutação pontual para mutagênese com VH3-CDR3 de M4 VL/VH<223> N é A, T, C ou GRage_A2_PCT_040000-0360547.txt

<210> 58

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Spiking oligonucleotide for VH3-CDR3 mutagenesis of M4 VL/VH<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(37)

<223> N is A, T, C or G

<400> 58

caggttgtcc agggtgccct ggccccannn nnnnnnntct ggcacagtag tac 53

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 59

gaccctggaa ggaagcagga tg 22

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 60

ggatctgtct gtgggcccct caaggcc 27

<210> 61

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 61

actagactag tcggaccatg gcagcagggg cagcggccgg a 41

<210> 62<211> 48<212> DNA<213> Artificial<220> <223> Artificial<400> 62

Page 54

<223> Oligonucleotídeo de mutação pontual para mutagênese com VH3-

CDR3 de M4 VL/VH

<223> Seqüência Artificial

<223> Seqüência Artificialataagaatgc ggccgctaaa ctattcaggg ctctcctgta ccgctctc 48

<210> 63

<211> 476

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> anti-RAGE scfv-fc fusion protein<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> huXT-M4 V2.ll scFv-Fc with wt human IgGl Fc VL-Iinker-VH<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Tyr20 25 30

Val Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Ile35 40 45

Tyr Arg Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Arq Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 " 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Phe Asp Glu His Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser130 135 140

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Trp Met Thr Trp Val145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Asp Asn165 170 175

Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr

<223> Proteína de fusão scFv de anti-RAGE-Fc

<223> scFv de huXT-M4 v2.Il-Fc com wt IgGl humano Fc VL-elo-VHRage_A2_PCT_040000-0360547.txt180 185 190

Xle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp210 215 220

Ile Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu vai Thr Val225 230 235 240

Ser ser Asp Gln Glu Pro Lys ser ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro245 250 255

Pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val275 280 285

Thr Cys vai Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg370 375 380

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly385 390 395 400

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser420 425 430Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Tnr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His450 455 460

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470 475

<210> 64

<211> 1428

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Encodes anti-RAGE scFv-Fc fusion protein<220>

<221> misc_feature

<223> huXT-M4 VL V2.Il-VH V2.0 wt-Fc sequence

<400> 64

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60atcacctgtc gggcctctca ggatgtgggc atctacgtga actggtttca gcagaagcct 120ggcaaggctc ccaggcgcct gatctaccgg gccaccaacc tggccgatgg cgtgccttcc 180agattctccg gctctcgctc tggcaccgat ttcaccctga ccatctcctc cctccagcct 240gaggatttcg ccacctacta ctgcctqqaq ttcqacgaqc accctctgac ctttggcggc 300ggaacaaagg tggagatcaa ggatggcggt ggatcgggcg gtggtggatc tggaggaggt 360gggagctctg aggtgcagct ggtggagtct ggcggcggac tggtgcagcc tggcggctct 420ctgagactgt cttgtgccgc ctccggcttc accttcaaca actactggat gacctgggtg 480aggcaggccc ctggcaaggg cctggagtgg gtggcctcca tcgacaactc cggcgacaac 540acctactacc ccgactccgt gaaggaccgg ttcaccatct ccagggacaa cgccaagaac 600tccctgtacc tccagatgaa ctccctgagg gccgaggata ccgccgtgta ctactgtgcc 660agaggcggcg atatcaccac cggcttcgac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 720tcctctgatc aggagcccaa atcttctgac aaaactcaca catgtccacc gtgcccagca 780cctgaactcc tgggtggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140

<223><223>

Codifica proteína de fusão scFv de anti-RAGE-FcSeqüência de huXT-M4 VL V.211-VH V2.0 wt-Fccccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200ttctatccaa gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1320gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1428

Claims

1. Método para o tratamento de um sujeitocom uma doença ou transtorno caracterizado por depósitoamilóide de Α-beta, caracterizado pelo fato de quecompreende a administração ao sujeito de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo que se ligueespecificamente a RAGE e iniba a ligação de um parceirode ligação a RAGE.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o sujeito é um sujeitohumano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a doença ou transtornose caracteriza por depósito amilóide de Α-beta nocérebro.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a doença ou transtorno édoença de Alzheimer.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a doença ou transtorno édoença de Alzheimer pré-clinica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o anticorpo:(a) compete pela ligação a RAGE com umanticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-H1,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) liga-se a um epitopo de RAGE que sejaligado por um anticorpo selecionado do grupo queconsiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeialeve ou cadeia pesada de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação a RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmentode anticorpo de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia levecompreendendo CDRs de uma região variável de cadeialeve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesadacompreendendo CDRs de uma seqüência de região variávelde cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seufragmento de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia leve com aseqüência de aminoácidos de uma região variável decadeia leve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesada com aseqüência de aminoácidos de uma seqüência de regiãovariável de cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umanticorpo quimérico, humanizado ou humano.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o anticorpo quimérico ouhumanizado compreende regiões constante humanas ouregiões constantes derivadas delas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende aadministração do anticorpo ou seu fragmento de ligaçãoa RAGE em combinação com um ou mais agentes utilizáveispara o tratamento de doença de Alzheimer para, dessaforma, provocar um efeito terapêutico sinérgico.

12. Método de inibição ou redução daacumulação de depósito amilóide de Α-beta em umsujeito, caracterizado pelo fato de que compreende aadministração ao sujeito de uma quantidade eficaz de umanticorpo que se ligue especificamente a RAGE e iniba aligação de um parceiro de ligação a RAGE.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sujeito é umsujeito humano.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainibição ou redução da acumulação de depósito amilóidede Α-beta no cérebro.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a acumulação dedepósito amilóide de Α-beta no cérebro está associada adoença de Alzheimer.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a acumulação dedepósito amilóide de Α-beta no cérebro está associada adoença de Alzheimer pré-clinica.

17. Método, de acordo com a reivindicação-12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo:(a) compete pela ligação a RAGE com umanticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-Hl,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) liga-se a um epitopo de RAGE que sejaligado por um anticorpo selecionado do grupo queconsiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeialeve ou cadeia pesada de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em XT-Hl, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação a RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

18. Método, de acordo com a reivindicação-17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo oufragmento de anticorpo de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia levecompreendendo CDRs de uma região variável de cadeialeve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesadacompreendendo CDRs de uma seqüência de região variávelde cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

19. Método, de acordo com a reivindicação-18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seufragmento de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia leve com aseqüência de aminoácidos de uma região variável decadeia leve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesada com aseqüência de aminoácidos de uma seqüência de regiãovariável de cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

20. Método, de acordo com a reivindicação-12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umanticorpo quimérico, humanizado ou humano.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpoquimérico ou humanizado compreende regiões constanteshumanas ou regiões constantes derivadas delas.

22. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende aadministração do anticorpo ou seu fragmento de ligaçãoa RAGE em combinação com um ou mais agentes utilizáveispara inibir ou reduzir o depósito amilóide de A-betapara, dessa forma, provocar um efeito sinérgico.

23. Método de inibição ou redução daneurodegeneração em um sujeito, caracterizado pelo fatode que compreende a administração ao sujeito de umaquantidade eficaz de um anticorpo que se ligueespecificamente a RAGE e iniba a ligação de um parceirode ligação a RAGE.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o sujeito é umsujeito humano.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainibição ou redução da neurodegeneração no cérebro.

26. Método, de acordo com a reivindicação-25, caracterizado pelo fato de que a neurodegeneraçãoestá associada a doença de Alzheimer.

27. Método, de acordo com a reivindicação-25, caracterizado pelo fato de que a neurodegeneraçãoestá associada a doença de Alzheimer pré-clinica.

28. Método, de acordo com a reivindicação-23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo:(a) compete pela ligação a RAGE com umanticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-H1,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) liga-se a um epítopo de RAGE que sejaligado por um anticorpo selecionado do grupo queconsiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeialeve ou cadeia pesada de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação a RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

29. Método, de acordo com a reivindicação-28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo oufragmento de anticorpo de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia levecompreendendo CDRs de uma região variável de cadeialeve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesadacompreendendo CDRs de uma seqüência de região variávelde cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

30. Método, de acordo com a reivindicação-29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seufragmento de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia leve com aseqüência de aminoácidos de uma região variável decadeia leve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesada com aseqüência de aminoácidos de uma seqüência de regiãovariável de cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

31. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umanticorpo quimérico, humanizado ou humano.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpoquimérico ou humanizado compreende regiões constanteshumanas ou regiões constantes derivadas delas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende aadministração do anticorpo ou seu fragmento de ligaçãoa RAGE em combinação com um ou mais agentes utilizáveispara inibir ou reduzir a neurodegeneração para, dessaforma, provocar um efeito sinérgico.

34. Método de inibição ou redução dodeclínio cognitivo, ou de melhora da cognição, em umsujeito, caracterizado pelo fato de que compreende aadministração ao sujeito de uma quantidade eficaz de umanticorpo que se ligue especificamente a RAGE e iniba aligação de um parceiro de ligação a RAGE.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o sujeito é umsujeito humano.

36. Método, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que o declínio cognitivoestá associado a doença de Alzheimer.

37. Método, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que o declínio cognitivoestá associado a doença de Alzheimer pré-clínica.

38. Método, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo:(a) compete pela ligação a RAGE com umanticorpo selecionado do grupo que consiste em XT-H1,XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(b) liga-se a um epítopo de RAGE que sejaligado por um anticorpo selecionado do grupo queconsiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7 e XT-M4;(c) compreende uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeialeve ou cadeia pesada de um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em XT-H1, XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7e XT-M4; ou(d) é um fragmento de ligação a RAGE de umanticorpo de acordo com (a), (b) ou (c).

39. Método, de acordo com a reivindicação-38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo oufragmento de anticorpo de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia levecompreendendo CDRs de uma região variável de cadeialeve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesadacompreendendo CDRs de uma seqüência de região variávelde cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seufragmento de ligação a RAGE compreende:uma região variável de cadeia leve com aseqüência de aminoácidos de uma região variável decadeia leve de XT-M4 (SEQ ID NO: 17);uma região variável de cadeia pesada com aseqüência de aminoácidos de uma seqüência de regiãovariável de cadeia pesada de XT-M4 (SEQ ID NO: 16);uma região constante de cadeia leve kapahumana; euma região constante de cadeia pesada de IgGlhumana.

41. Método, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umanticorpo quimérico, humanizado ou humano.

42. Método, de acordo com a reivindicação-41, caracterizado pelo fato de que o anticorpoquimérico ou humanizado compreende reqiões constanteshumanas ou regiões constantes derivadas delas.

43. Método, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que compreende aadministração do anticorpo ou seu fragmento de ligaçãoa RAGE em combinação com um ou mais agentes utilizáveispara inibir ou reduzir o declínio cognitivo, oumelhorar a cognição, para, dessa forma, provocar umefeito sinérgico.