MX2008011933A - Metodos y composiciones para antagonismo de rage. - Google Patents

Abstract

Se describen anticuerpos que se unen específicamente al receptor para los productos finales de glucación avanzada (RAGE) y fragmentos que se unen a RAGE de éstos. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos anti-RAGE y fragmentos de anticuerpo que se unen a RAGE de éstos, y su uso para el tratamiento de enfermedades relacionadas con RAGE.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA ANTAGONISMO DE RAGE REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS Se reivindica prioridad bajo la 35 U.S.C. §119(e) de la Solicitud de Patente Provisional No. 60/895,303, presentada en Marzo 16, 2007, y la Solicitud de Patente Provisional No. 60/784,575, presentada en Marzo 21 , 2006, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona de manera general con anticuerpos y fragmentos de estos que se unen específicamente a un receptor para los productos finales de glucación avanzada (RAGE), con métodos en los cuales tales anticuerpos y fragmentos de estos se administran a pacientes humanos y mamíferos no humanos para tratar o evitar enfermedades y trastornos relacionados con RAGE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor para los productos finales de glucación avanzada (RAGE) es un miembro de la superficie celular multi-ligando de la superfamilia de la inmunoglobulina. El RAGE consiste de un dominio extracelular, un dominio único que abarca la membrana, y una cola citosólica. El dominio extracelular del receptor consiste de un dominio de inmunoglobulina tipo V seguido por dos dominios de inmunoglobulina tipo C. El RAGE también existe en una forma soluble (sRAGE). El RAGE se expresa por muchos tipos de célula, por ejemplo, células de músculo endotelial y liso, macrófagos y linfocitos, en muchos tejidos diferentes, que incluyen pulmón, corazón, riñon, músculos del esqueleto y cerebro. La expresión se incrementa en estados inflamatorios crónicos tales como artritis reumatoide y neuropatía diabética. Aunque su función fisiológica no es clara, éste está involucrado en la respuesta inflamatoria y puede tener un papel en diversos procesos de desarrollo, que incluyen la diferenciación del mioblasto y el desarrollo neural.

El RAGE es un receptor de reconocimiento de patrón inusual que une varias diferentes clases de moléculas endógenas que conducen a varias respuestas celulares, que incluyen la secreción de citocina, la tensión oxidante celular incrementada, excrecencia de neurita y migración celular. Los ligandos del RAGE incluyen los productos finales de glucación avanzada (AGE), que forman estados hiperglucémicos prolongados. Sin embargo, los AGE pueden ser solo ligandos incidentales, patogénicos. Además de los AGE, los ligandos conocidos de RAGE incluyen proteínas que tienen fibrilas de lamina ß que son características de los depósitos amiloides y los mediadores pro-inflamatorios, que incluyen S100/calgranulins (por ejemplo, S100A12, A100B, S100A8-A9), proteína amiloide de suero (SAA) (forma fibrilar), proteína beta-amiloide (?ß), y la proteína 1 cromosómica de la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1 , también conocido como anfoterina). El HMGB-1 se ha mostrado como el mediador tardío de mortalidad en dos modelos de sepsis de murino, y la interacción entre el RAGE y los ligandos tales como el HMGB1 se cree que juega un papel importante en la patogenia de la sepsis y otras enfermedades inflamatorias.

Un número de trastornos humanos significativos se asocian con una producción crecientes de ligandos para RAGE o con una producción creciente del RAGE mismo. Terapéuticas consistentemente efectivas no están disponibles para muchos de estos trastornos. Estos trastornos incluyen, por ejemplo, muchas enfermedades inflamatorias crónicas, que incluyen artritis reumatoide y soriásica y enfermedad intestinal, cánceres, diabetes y nefropatía diabética, amiloidosis, enfermedades cardiovasculares sepsis. Sería benéfico tener tratamientos seguros y efectivos para tales trastornos relacionados con RAGE.

La sepsis es una respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) a la infección, y permanece como un resultado profundo en pacientes aún previamente normales. La sepsis se define por la presencia de por lo menos 2 de 4 signos clínicos: hipo o hipertermia, taquicardia, taquipnea, hiperventilacion, o leucograma anormal. La sepsis con una disfunción/falla de órgano se define como sepsis severa, y la sepsis severa con hipotensión incorregible es el choque séptico. Los tipos adicionales de sepsis incluyen septicemia y sepsis neonatal. Más de 2 millones de casos de sepsis ocurren cada año en los Estados Unidos, Europa, y Japón, con costos estimados anuales de $17.000 millones y tasas de mortalidad que varían desde 20-50%. En pacientes que sobreviven a la sepsis, la permanencia en la unidad de cuidado intensivo (ICU) se extiende en promedio al 65% comparado con los pacientes ICU que no experimentan sepsis.

A pesar de las recientes entradas en el mercado y los continuamente mejorados cuidados hospitalarios, la sepsis permanece como una significativa necesidad médica no solucionada. El tratamiento de los pacientes sépticos es intensivo en tiempo y recursos. Los agentes más nuevos, que incluye la introducción de XIGRIS®, tienen efectos modestos sobre los resultados. El síndrome continúa exhibiendo una tasa de mortalidad del 20-50%.

Agentes terapéuticos seguros y bien tolerados que podrían reducir la progresión de la sepsis temprana a sepsis severa o choque séptico, y mejorar de esta manera la supervivencia, podrían suministrar un gran avance en la terapia de la sepsis.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra nuevos reactivos inmunológicos, en particular, reactivos terapéuticos de anticuerpo que se unen al RAGE, para la prevención y tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con RAGE, por ejemplo, sepsis, diabetes y patologías asociadas a la diabetes, y enfermedades cardiovasculares y cáncer.

Los anticuerpos representativos de la invención incluyen anticuerpos que se unen específicamente a RAGE (es decir, anticuerpos anti-RAGE), que compiten por unirse al RAGE con un anticuerpo XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, o XT-M4, o que se unen a un epítopo de RAGE unido por un anticuerpo XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, o XT-M4. Los anticuerpos anti-RAGE representativos adicionales de la invención pueden comprender una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4. Adicionalmente se suministran aún fragmentos que se unen a RAGE de los anticuerpos anteriores. Los anticuerpos anti-RAGE de la invención pueden bloquear la unión de un compañero de cuerpo RAGE.

Por ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE de la invención puede comprender (a) una región variable de cadena liviana de XT-H1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO: 22), XT-H3_VL (SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO: 27), o XT-M4_VL (SEQ ID NO: 17); (b) una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica con una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, o SEQ ID NO: 17; o (c) un fragmento que se une a RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a) o (b). Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE de la invención puede comprender (a) una región variable de cadena pesada del IXT-H1_VH (SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21 ), XT-H3_VH (SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26), o XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16); (b) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica con la secuencia de un aminoácido de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, o SEQ ID NO: 16 o (c) un fragmento que se une a RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a) o (b).

La presente invención suministra además anticuerpos anti-RAGE que tienen una cualquiera de las regiones variables de cadena liviana anteriormente anotados y una cualquiera de las regiones variables de cadena pesada anteriormente anotadas. Por ejemplo un anticuerpo anti-RAGE de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, o un fragmento que se une a RAGE de éste, que tiene una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana que es por lo menos 90% idéntico a la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT-M4 (SEQ ID NO: 17), una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada que es por lo menos 90% idéntica con la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), y las regiones constantes derivadas de las regiones constantes humanas, tales como un anticuerpo que tiene una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT-M4 (SEQ ID NO: 17), una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), una región constante de cadena liviana kappa humana, y una región constante de cadena pesada lgG1 humana.

Los anticuerpos anti-RAGE representativos adicionales de la invención incluyen anticuerpos humanizados, por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable de cadena liviana humanizada que es por lo menos 90% idéntico con una secuencia de aminoácido XT-H2_hVL_V2.0 (SEQ ID NO: 32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQ ID NO: 33), XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4.1 (SEQ ID NO: 35), XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO: 39), XT-M4_hVL_V2.5 (SEQ ID NO: 40), XT-M4_hVL_V2.6 (SEQ ID NO: 41 ), XT-M4_hVL_V2.7 (SEQ ID NO: 42), XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2.9 (SEQ ID NO: 44), XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2.1 1 (SEQ ID NO: 46), XT-M4_hVL_V2.12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2.13 (SEQ ID NO: 48), o XT-M4_hVL_V2.14 (SEQ ID NO: 49). Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-RAGE humanizado puede comprender una región variable de cadena pesada humanizada que es por lo menos 90% idéntico con una secuencia de aminoácido de XT-H2_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31 ), XT-M4_hVH_V1.0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_V1.1 (SEQ ID NO: 37), o XT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38). Loa anticuerpos humanizados pueden ser semihumanos (es decir, en donde solamente una de las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada es humanizado), o completamente humanizado (es decir, que tanto las regiones variables de cadena liviana como de cadena pesada son humanizadas). Anticuerpos anti-RAGE humanizados representativos adicionales descritos aquí incluyen un anticuerpo XT-M4 humanizado y un anticuerpo XT-H2 humanizado.

Los suministrados aún adicionalmente son anticuerpos anti-RAGE que tienen los CDR con por lo menos 8 de las siguientes características: (a) la secuencia de aminoácido Y-X-M (Y32; X33; M34) en VH CDR1 , en donde X es preferencialmente W o N; (b) la secuencia de aminoácido l-N-X-S (151 ; N52; X53 y S54) en VH CDR2, en donde X es P o N; (c) el aminoácido en la posición 58 en CDR2 de VH es Treonina; (d) el aminoácido en la posición 60 en CDR2 de VH es Tirosina; (e) el aminoácido en la posición 103 en CDR3 de VH es Treonina; (f) uno o más residuos de Tirosina en CDR3 de VH; (g) el residuo positivamente cargado (Arg o Lys) en la posición 24 en CDR1 de VL; (h) el residuo hidrofilito (Thr o Ser) en la posición 26 en CDR1 de VL, (i) el residuo pequeño Ser o Ala en la posición 25 en CDR1 de VL; (j) el residuo negativamente cargado (Asp o Glu) en la posición 33 en CDR1 de VL; (k) el residuo aromático (Phe o Tyr o Trp) en la posición 37 en CDR1 de VL; (I) el residuo hidrofilito (Ser o Thr) en la posición 57 en CDR2 de VL; (m) la secuencia P-X-T en el extremo del CDR3 de VL donde X puede ser un residuo hidrófobo Leu o Trp; en donde la posición del aminoácido es como se muestra en las secuencias del aminoácido de la cadena liviana y pesada en la SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:16 respectivamente.

También se suministran ácidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los anticuerpos anti-RAGE descritos o las regiones variables de anticuerpo, y los ácidos nucleicos aislados que se hibridan específicamente a un acido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que es el complemento de la secuencia de nucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-RAGE descritos o las regiones variables de anticuerpo bajo condiciones de hibridación estrictas.

Los ácidos nucleicos aislados de la invención incluyen además (a) ácidos nucleicos que codifican una proteína RAGE de babuino, mono o conejo que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , y SEQ ID NO: 13; los ácidos nucleicos que se hibridan específicamente al complemento de (a); y (c) los ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótido que es 95% idéntica con una secuencia de nucleótido que codifica el RAGE de babuino , mono o conejo seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:12, cuando el cubrimiento de la consulta es del 100%.

La invención también incluye métodos para evitar o tratar la enfermedad o trastorno relacionado con RAGE de un sujeto que tiene tal enfermedad o trastorno, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RAGE o de un fragmento de unión RAGE de éste de la invención.

La invención incluye un método para evitar o tratar una enfermedad o trastorno relacionado con RAGE que se selecciona del grupo que consiste de sepsis, choque séptico, que incluye condiciones tales como neumonía adquirida en comunidad, que resulta en sepsis o choque séptico, listeriosis, enfermedades inflamatorias, cánceres, artritis enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias agudas crónicas, enfermedades cardiovasculares, disfunción eréctil, diabetes, complicaciones de diabetes, vasculitis, neuropatías, retinopatías y neuropatías. Tal método de la invención puede comprender administrar una composición que comprende un anticuerpo anti-RAGE o un fragmento de unión RAGE de éste de la invención en combinación con uno o más agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad o trastorno relacionado con RAGE que va a ser tratado. Tales agentes de la invención incluyen antibióticos agentes anti inflamatorios, anti oxidantes, ß bloqueadores, agentes anti-plaqueta, inhibidores ACE, agentes que disminuyen los lípidos, agentes anti angiogénicos y quimioterapéuticos.

La invención suministra un método para tratar la sepsis, el choque séptico, o la listeriosis (por ejemplo, listeriosis sistémica) en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RAGE quimérico o un fragmento de unión RAGE de éste que comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT-M4 (SEQ ID NO: 17), una región variable de cadena pesada que tiene la decencia de aminoácido de la secuencia de región variable de cadena pesada ) XT-M (SEQ ID NO: 16), una región constante de cadena liviana capa humana, y una región constante de cadena pesada lgG1 humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1C muestran secuencias de aminoácido alineadas de RAGE de ratón, rata conejo (2 isoformas), babuino, mono cinomólogo, y humano (SEQ ID Nos; 3, 14, 11 , 13, 7, 9, 1).

La figura 2 es una gráfica de datos de ELISA que se une directo que demuestra la unión del XT-H2 al hRAGE con EC50 de 90 pM y la unión del XT-M4 al hRAGE-Fc con EC50 de 300 pM.

La figura 3 es una gráfica de los datos del análisis ELISA que se une directa que demuestra la unión de anticuerpos XT-M4 y Xt-H2 al hRAGE V-dominio-Fc del EC50 de 100 pM.

La figura 4 es una gráfica de datos de los ensayos de unión ELISA de competencia de ligando que muestra la capacidad del XT-H2 y XT-M4 a bloquear la unión del HMG1 al hRAGE-Fc.

La figura 5 es una gráfica de datos de los ensayos de unión ELISA de competencia de anticuerpo demuestra que el XT-H2 y el XT-M4 comparten un epítopo similar y se une a sitios de traslapo sobre el RAGE humano. La figura 6 muestra las secuencias de aminoácido alineadas de las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos anti-RAGE de murino XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, y XT-H7, y del anticuerpo anti-RAGE de rata XT-M4 (SEQ ID Nos: 18, 21 , 24, 20, 26, 16).

La figura 7 muestra las secuencias de aminoácido alineadas de las regiones variables de cadena liviana de los anticuerpos anti-RAGE de murino XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, y XT-H7, y del anticuerpo anti-RAGE de rata XT-M4 (SEQ ID Nos: 19, 22, 25, 23, 27, 17).

La figura 8 muestra la secuencia del nucleótido del cADN que codifica el RAGE de babuino (SEQ ID NO: 6).

La figura 9 muestra la secuencia del nucleótido del cADN que codifica el RAGE del mono cinomólogo (SEQ ID NO: 8) La figura 10 muestra la secuencia de nucleótido del cADN que codifica la isoforma 1 del RAGE de conejo (SEQ ID NO: 10).

La figura 1 1 muestra la secuencia del nucleótido de la isoforma 2 del RAGE de conejo que codifica el cADN (SEQ ID NO: 12).

La figura 12A-12E muestran la secuencia del nucleótido del RAGE de babuino que codifica el ADN genómico de babuino clonado (clon 18.2) (SEQ ID NO: 15) La figura 13 presenta 4 gráficas que muestran las capacidades del anticuerpo XT-M4 quimérico y el anticuerpo XT-M4 de rata para bloquear la unión de los ligandos RAGE HMGB1 , los péptidos 1 -42 del ß amiloide, S100-A, y S100-B al hRAGE-Fc, determinado mediante el ensayo de unión de ELISA de competencia.

La figura 14 presenta gráficas que muestran la capacidad del XT-M4 quimérico a competir por la unión al hRAGE-Fc con los anticuerpos XT-M4 y XT-H2, determinado por el ensayo de unión ELISA de competencia de anticuerpo.

La figura 15 describe el teñido IHC de tejidos de pulmón de mono cinomólogo, conejo, y babuino, que muestra el XT-M4 que se une al RAGE de la superficie celular endógena en estos tejidos. Las muestras de control son células CHO que expresan hRAGE contactado por el XT-M4, las células NGBCHO que no expresan el RAGE, y las células CHO que expresan el hRAGE contactado por el anticuerpo IgG de control.

La figura 16 muestra que el anticuerpo de rata XT-M4 se une al RAGE en un pulmón humano normal y el pulmón de un humano con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD).

La figura 17 muestra la secuencia de aminoácido de la región XT-H2 HV de murino humanizado.

La figura 18 muestra la secuencia de aminoácido de la región XT-H2 HL de murino humanizado.

La figura 9 muestra la secuencia de aminoácido de la región XT-M4 HV de rata humanizada.

Las figuras 20A-20B muestran la secuencia de aminoácido de la región XT-H2 HL de rata humanizada.

La figura 21 describe los vectores de expresión utilizados para producir los polipéptidos de cadena liviana y pesada humanizados.

La figura 22 muestra los valores ED50 para la unión de los anticuerpos XT-H2 humanizados al RAG-Fc humano determinado por ELISA de competencia.

La figura 23 muestra las constantes de tasa cinética (ka y kd) y las constantes de asociación y disociación (ka y kd) para la unión del XT- 4 y de los anticuerpos humanizados XT-M4-V10, XT-M4-V1 1 , XT-M4-V14 al hRAGE-SA, determinado por el ensayo de unión BIACORE™.

La figura 24 muestra las constantes de tasa cinética (ka y kd) y las constantes de asociación y disociación (ka y kd) para la unión del XT-M4 y de los anticuerpos humanizados XT-M4-V10, XT-M4-V11 , y XT-M4-V14 al mRAGE-SA, determinado por el ensayo de unión BIACORE™.

La figura 25 muestra la secuencia del nucleótido de una construcción XT-H2 VL-VH ScFv de murino (SEQ ID NO: 51).

La figura 26 muestra la secuencia del nucleótido de una construcción XT-H2 VH-VL ScFv de murino (SEQ ID NO: 52).

La figura 27 muestra la secuencia del nucleótido de una construcción XT-M4 VL-VH ScFv de rata (SEQ ID NO: 54).

La figura 28 muestra la secuencia del nucleótido de una construcción XT-M4 VH-VL ScFv de rata (SEQ ID NO: 53).

La figura 29 es una gráfica de los datos ELISA que muestra la unión a un RAGE-Fc humano mediante las construcciones ScFv de los anticuerpos anti-RAGE XT-H2 y el XT-M4 en cualquiera de las configuraciones de VLA H o VH/VL La figura 30 es una gráfica de los datos ELISA que muestra la unión al RAGE-Fc humano y el BSA por las construcciones ScFv de los anticuerpos anti-RAGE XT-H2 y XT-M4 en la configuración VL/VH o VH/VL expresadas como proteína soluble en Escherichia coli. El ActRllb es una proteína de no unión expresada del mismo vector como el control negativo.

La figura 31 representa esquemáticamente el uso del PCR a las mutaciones puntuales introducidas en un CDR de XT-M4.

La figura 32 muestra la secuencia del nucleótido del extremo Terminal C de la construcción XT-M4 VL-VH ScFv (SEQ ID NO: 56). VH-CDR3 es subrayado. También se muestran los oligonucleótidos puntuales (SEQ ID Nos: 7-58) con un numero en cada sitio de mutación que identifica la proporción puntual utilizada para la mutación en ese sitio.

Las composiciones del nucleótido de las proporciones puntuales que corresponden a los números también se identifican.

La figura 33 representa esquemáticamente el vector de despliegue de ribosoma pWRIL-3. "T7" denota el promotor T7, "RBS" es el sitio de unión de ribosoma, "polipéptido espaciador" es un polipéptido espaciador que conecta la proteína doblada al ribosoma, "Flag-Etiqueta" es una etiqueta del epitopo Flag para la detección de proteína.

La figura 34 representa esquemáticamente el vector de despliegue de fago pWRIL-1 .

La figura 35 representa esquemáticamente el montaje combinatorial de las colecciones puntuales VL y VH que utilizan el vector de despegue Fab pWRIL-6.

La figura 36 es una gráfica de los datos ELISA de competencia de anticuerpo que muestran afinidad creciente del anticuerpo XT-M4 para el hRAGE luego de la mutación que remueve el sitio de glucosilación en la posición 52.

La figura 37 es una gráfica de supervivencia que muestra una ventaja de supervivencia que sigue el CLP para los ratones transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos, y para ratones dados el anticuerpo anti-RAGE comparado con los animales de control tipo silvestre.

La figura 38 es una gráfica que muestra los conteos de colonia de tejido para bacterias entéricas que siguen el CLP.

La figura 39 es una gráfica de supervivencia que muestra los efectos de dos diferentes dosis de anticuerpos anti-RAGE sobre la supervivencia de los ratones luego de CLP.

La figura 40 es una gráfica de supervivencia que muestra los efectos del retraso de la dosis única del anticuerpo anti-RAGE durante hasta 36 horas luego de CLP.

La figura 41 muestra los niveles de L. monocitogenes aislado del hígado y Bazo de ratones transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos infectados y ratones infectados dado el anti-RAGE mAb comparado con los animales de control tipo silvestre.

La figura 42 es una gráfica que muestra los niveles de suero de interferón ? de los ratones transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos infectados y de los ratones infectados dado el anticuerpo anti-RAGE comparado con los animales de control tipo silvestre.

La figura 43 es una gráfica de supervivencia que muestra una ventaja de supervivencia que sigue al CLP para los ratones transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos comparados con los animales de control tipo silvestre.

La figura 44 es una gráfica de supervivencia que muestra una ventaja de supervivencia luego del CLP para los ratones dada una inyección única del anticuerpo anti-RAGE comparado con los animales de control tipo silvestre.

La figura 45 es una gráfica de supervivencia que muestra los efectos del retraso de una dosis única del anticuerpo anti-RAGE durante 6 a 12 horas luego de CLP.

La figura 46 es una gráfica que muestra que los ratones dado el anticuerpo anti-RAGE tienen calificaciones de patologías mejoradas comparadas con los animales de control.

La figura 47 es una gráfica de supervivencia que muestra la supervivencia luego de CLP de los ratones dado el anticuerpo anti-RAGE en combinación con un antibiótico.

La figura 48 es una gráfica de supervivencia que muestra la supervivencia luego de CLP de los ratones dados los antibióticos solos.

La figura 50 es una gráfica que muestra L. monocitogenes en el hígado y bazo de los ratones transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos infectados y de los ratones dado el anticuerpo anti-RAGE.

La figura 51 es una gráfica que muestra la concentración de suero del XT-M4 quimérico luego de la administración ¡v única a los ratones.

La figura 52 muestra que el anticuerpo XT-M4 quimérico es protector en un modelo CLP.

La figura 53 muestra que el anticuerpo XT-M4 quimérico es protector en un modelo CLP de hasta 24 horas post cirugía.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Anticuerpos anti-RAGE La presente invención suministra anticuerpos que se unen específicamente a RAGE, que incluyen RAGE soluble y RAGE secretor endógeno, como se describió aquí. Los anticuerpos anti-RAGE representativos pueden comprender por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de la región variable de anticuerpo mostrada en la SEQ ID Nos: 16-49.

Los anticuerpos anti-RAGE de la invención incluyen anticuerpos que se unen específicamente a RAGE y tienen una secuencia de aminoácido que es idéntica o sustancialmente idéntica a una cualquiera de las SEQ ID Nos: 16-49. la secuencia de aminoácido de un anticuerpo anti-RAGE que es sustancialmente idéntica es una que es por lo menos 85% , 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% idéntica con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 16-49.

Incluida en los anticuerpos anti-RAGE de la invención está el anticuerpo que se une específicamente a RAGE y (a) comprende una región variable de cadena liviana seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID Nos: 19, 22, 25, 23, 27 y 17 o (b) comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica con una cualquiera de la SEQ ID Nos: 19 22, 25, 23, 27 y 17, o es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo a (a) o (b).

También incluido entre los anticuerpos anti-RAGE de la invención es un anticuerpo que se une específicamente a RAGE, y (a) comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID Nos: 18, 21 , 24, 20, 26, y 16, o (b) comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 18, 21 , 24, 20, 26, y 16, o es un fragmento que se une a RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a) o (b).

Incluida en la invención está un anticuerpo anti-RAGE que se une específicamente a RAGE y: (a) compite por la unión a RAGE con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT_H1 , XT_H2, XT_H3, XT_H5, XT_H7, y XT_M4; (b) se une a un epítopo de RAGE que está unido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT_H1 , XT_H2, XT_H3, XT_H5, XT_H7, y XT_M4; (c) comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una cadena liviana o cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT_H1 , XT_H2, XT_H3, XT_H5, XT_H7, y XT_M4; (d) es un fragmento que se une a RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a), (b) o (c).

La invención incluye anticuerpos anti-RAGE que se unen específicamente a las células que expresan RAGE in vitro e in vivo, y a los anticuerpos que unen al RAGE humano con una constante de disociación (kd) en el rango de por lo menos aproximadamente 1 x 10"7 M a aproximadamente 1 x 10"10 M. también se incluyen anticuerpos anti-RAGE de la invención que se unen específicamente al dominio V del RAGE humano, y a los anticuerpos anti-RAGE que bloquean la unión del RAGE a un compañero de unión RAGE (RAGE-BP).

También se incluyen en la invención un anticuerpo que se une específicamente al RAGE y que bloquea la unión del RAGE al compañero de unión RAGE, por ejemplo los ligados tales como el HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A (que incluye S100A8 y S100A9). S100A4, CRP, 2-¡ntegrin, Mac-1 , y p150,95, y tiene los CDR que tienen 4 o más de las siguientes características (numeración de la posición con respecto a las posiciones de aminoácido como se muestra en las secuencias VH y VL en las figuras 6 y 7): 1. La secuencia aminoácido Y-X-M (Y32; X33; M34) en VH CDR1 , en donde X es preferencialmente W o N; 2. La secuencia aminoácido l-N-X-S (151 , N52, X53, y S54) en VH CDR2, en donde X es P o N; 3. El aminoácido de la posición 58 en CDR2 de VH es Treonina; 4. El aminoácido de la posición 60 en CDR2 de VH es Tirosina; 5. El aminoácido de la posición 103 en CDR3 de VH es Treonina; 6. Uno o más residuos de Tirosina en CDR3 de VH; 7. El residuo positivamente cargado (Arg o Lys) en la posición 24 en CDR1 de VL; 8. El residuo hidrófilo (Thr o Ser) en la posición 26 en CDR1 de VL; 9. El residuo pequeño Ser o Ala en la posición 25 en CDR1 de VL; 10. Un residuo negativamente cargado (Asp o Glu) en la posición 33 en CDR1 de VL; 1 1. El residuo aromático (Phe o Tyr o Trp) en la posición 37 en CDR1 de VL; 12. El residuo hidrofilito (Ser p Thr) en la posición 57 en CDR2 de VL; 13. La secuencia P-X-T en el extremo del CDR3 de VL donde X puede ser un residuo hidrófobo Leu p Trp.

Los anticuerpos anti-RAGE de la invención incluyen anticuerpos que se unen específicamente al dominio del RAGE humano y bloquean la unión del RAGE a sus ligandos, y tienen los CDR que tienen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, o todas las 13 características.

Loa anticuerpos anti-RAGE de la invención incluyen un anticuerpo anti-RAGE como se describió anteriormente, o un fragmento donde un RAGE que se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo tetramérico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo especifico de dominio, un anticuerpo suprimido de dominio, una proteína de fusión, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab') 2, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento Fd, un anticuerpo de dominio único, un fragmento dAb, y una proteína de fusión Fe (es decir, un dominio de unión de antígeno fusionado a una región constante de inmunoglobulina). Estos anticuerpos se pueden acoplar con un agente citotóxico, un agente radioterapéutico, o un marcador detectable.

Por ejemplo, un anticuerpo ScFv (SEQ ID NO: 63) que comprende los dominios VH y VL del anticuerpo XT-M4 de rata se ha preparado se muestra mediante el análisis ELISA basado en célula por tener afinidades de unión para RAGE de babuino, ratón, conejo y humano, comparable con aquellos de los anticuerpos XT-M4 quimérico y tipo silvestre.

Los anticuerpos de la presente invención pretenden adicionalmente incluir moléculas heteroconjugadas, biespecíficas, de cadena única, y quiméricas y humanizadas que tengan afinidad por uno de los polipéptidos objeto, conferido mediante por lo menos una región CDR del anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención que se unen específicamente al RAGE también incluyen variantes de cualquiera de los anticuerpos descritos aquí, que pueden ser fácilmente preparados utilizando técnicas de biología y clonación molecular conocidas. Ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Publicada U.S. Nos. 2003/01 18592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534, y 2005/0238646, y los miembros de la familia de patentes relacionadas de estos, todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Por ejemplo, un anticuerpo variante de la invención también puede comprender una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que incluye un polipéptido de dominio de unión (por ejemplo, ScFv) que se fusiona o se conecta de otra manera a un polipéptido de una región de pivote de inmunoglobulina, o que acciona el pivote, que a su vez se fusiona o se conecta de otra manera a una región que comprende una o más regiones constantes nativas o trabajadas por ingeniería de una cadena pesada de inmunoglobulina, diferentes de CH1 , por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 del IgG y del IgA, o las regiones CH3 y CH4 del IgE (ver por ejemplo, U.S. 2005/0136049 por Ledbetter, J. et al., que se incorpora como referencia, para una descripción más completa). La proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión puede además incluir una región que incluye un polipéptido de región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina nativo o trabajada por ingeniería (o CH3 en el caso de una construcción derivada en todo o en parte del IgE) que se fusiona o se conecta de otra forma al polipéptido de la región pivote y al polipéptido de la región constante CH3 de cadena pesada inmunoglobulina nativo o trabajado por ingeniería (o CH4 en el caso de una construcción derivada en todo o en parte del IgE) que se fusiona o se conecta de otra forma al polipéptido región constante CH2 (o CH3 en el caso de una construcción derivada en todo o en parte del IgE). Típicamente, tales proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión son capaces de por lo menos una actividad inmunológica, por ejemplo, la unión especifica al RAGE, la inhibición de interacción entre el RAGE y un compañero de unión RAGE, la inducción de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo, la inducción de la fijación de complemento, etc.

Los anticuerpos de la invención también pueden comprender un marcador unido a este y capaz de ser detectado (por ejemplo, un marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, enzima o un cofactor de enzima).

Polipéptidos RAGE La invención también suministra proteínas RAGE aisladas de babuino, mono y conejo cinomólogo, que tiene la secuencia de aminoácido mostradas en la SEQ ID Nos: 7, 9, 11 , o 13, y que incluye además proteínas RAGE que tienen una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácido mostradas en la SEQ ID Nos: 7, 9, 11 , o 13, y que es por lo menos 90%, 91 %, 92%, 03%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% idéntica en la secuencia de aminoácido a una cualquiera de la SEQ ID Nos: 7, 9, 11 , o 13.

También se incluyen en la invención métodos para producir los anticuerpos anti-RAGE y los fragmentos de unión RAGE de estos de la invención por cualquier medio conocido en la técnica.

También se incluye en la invención una preparación purificada del anticuerpo monoclonal que se une específicamente a uno o más epítopos de la secuencia de aminoácido RAGE como se estableció en cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 , 3, 7, 9, 1 1 o 13.

Definiciones Por conveniencia, ciertos términos empleados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones principales se recolectan aquí. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde la invención.

Los artículos "un" y "una" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. Por vía de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "o" como se utiliza aquí, se utiliza intercambiablemente con, el término "y/o", a menos que el contexto claramente indique otra cosa.

Un polipéptido o proteína "aislado" o "purificado", por ejemplo, un "anticuerpo aislado", se purifica a un estado más allá del que éste existe en la naturaleza. Por ejemplo, el polipéptido o proteína "aislado" o "purificado", por ejemplo, un "anticuerpo aislado", puede estar sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de célula o tejido de la cual se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. La preparación de la proteína del anticuerpo que tiene menos de aproximadamente 50% de la proteína de no anticuerpo (también denominada aquí como "proteína contaminante"), o de los precursores químicos, se considera como "sustancialmente libre". Se considera 40%, 30%, 20%, 10% y más preferiblemente 5% (por peso seco), de proteína no anticuerpo, o de los precursores químicos como sustancialmente libre. Cuando la proteína del anticuerpo o la porción biológicamente activa de ésta se produce recombinantemente, también está preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, preferiblemente menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y el más preferible menos de aproximadamente 5% del volumen o masa de la preparación de la proteína. Las proteínas o polipéptidos denominados aquí como "recombinante" son proteínas o polipéptidos producidos mediante la expresión de ácidos nucleicos recombinantes.

El término "anticuerpo" se utiliza intercambiablemente con el término "inmunoglobulina" aquí, e incluye anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')2, y anticuerpos y fragmentos intactos que han sido mutados en su región constante y/o variable (por ejemplo, mutaciones para producir anticuerpos quiméricos, parcialmente humanizados, o completamente humanizados, así como también para producir anticuerpos con un rasgo deseado, por ejemplo, IL 13 mejorado que se une y/o reduce la unión FcR). El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende más pocos residuos de aminoácido que un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos se pueden obtener por vía de tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos también se pueden obtener por medios recombinantes. Los fragmentos de ejemplo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fd, dAb, y scFv y/o Fv. El término "fragmento de unión de antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del cual ellos se derivaron) para la unión de antígeno (es decir, la unión específica). Como tal estos anticuerpos o fragmentos de éstos están incluidos en el alcance de la invención, dado que el anticuerpo o fragmento se una específicamente al RAGE, y neutralice o inhiba una o más de las actividades asociadas a RAGE (por ejemplo, inhiba la unión de los compañeros de unión RAGE (RAGE-BPs) a RAGE).

El anticuerpo incluye una estructura molecular comprendida de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena liviana está comprendida de una región variable de cadena liviana (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena liviana. La región constante de cadena liviana está comprendida de un dominio CL. Las regiones VH y VL se pueden además subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesto de tres CDR y cuatro FR, expuestos de amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Se pretende que el término "anticuerpo" comprenda cualquier clase Ig o cualquier subclase Ig (por ejemplo, las subclases del IgG lgG1 : lgG2, lgG3, e lgG4) obtenido de cualquier fuente (por ejemplo, primates humanos y no humanos, y en roedores, lagomorfos, caprinos, bovinos, equinos, ovinos, etc.).

El término "clase Ig" o "clase de inmunoglobulina", como se utiliza aquí, se refiere a las cinco clases de inmunoglobulina que se han identificado en humanos y mamíferos superiores, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. El término "subclase Ig" se refiere a dos de las subclases del IgM (H y L), tres subclases del IgA (lgA1 , lgA2, e IgA secretorio), y cuatro subclases del IgG (IgG!, lgG2, lgG3, e lgG ) que se han identificado en humanos y mamíferos superiores. Los anticuerpos pueden existir en forma monomérica o polimérica; por ejemplo, los anticuerpos IgM existen en forma pentamérica, y los anticuerpos IgA existen en forma monomérica, dimérica o multimérica.

El término "subclase IgG" se refiere a las cuatro subclases de la clase de inmunoglobulina IgG - IgGi, lgG2, lgG3, e lgG4 que se han identificado en humanos y mamíferos superiores mediante las cadenas pesadas ? de las inmunoglobulinas ?? - ?4, respectivamente.

El término "inmunoglobulina de cadena única" o "anticuerpo de cadena única" (utilizado aquí intercambiablemente) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consiste de una cadena pesada y una ligera, dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, mediante ligadores de péptido intercadena, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende aros de péptido (por ejemplo, que comprende 3 a 4 aros de péptido) estabilizados, por ejemplo, mediante lámina plegada beta y/o unión disulfuro intracadena. Los dominios se refieren además aquí como "constantes" o "variables", con base en la falta relativa de la variación de secuencia dentro de los dominios de los miembros de varias clases en el caso de un dominio "constante", o la variación significativa dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de anticuerpo o polipéptido se denominan a menudo intercambiablemente en la técnica como "regiones" de anticuerpo o polipéptido. Los dominios "constantes" de una cadena liviana de anticuerpo se denominan intercambiablemente como "regiones constantes de cadena liviana", "dominios constantes de cadena liviana", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de una cadena pesada de anticuerpo se denominan intercambiablemente como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH"). Los dominios "variables" de una cadena liviana de anticuerpo se denominan intercambiablemente como "regiones variables de cadena liviana", "dominios variables de cadena liviana", regiones "VL" o dominios "VL"). Los dominios "variables" de una cadena pesada de anticuerpo se denominan intercambiablemente como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH").

El término "región" también se puede referir a una parte o porción de una cadena de anticuerpo o el dominio de cadena de anticuerpo (por ejemplo, una parte o porción de una cadena pesada o ligera o una parte o porción de un dominio constante o variable, como se define aquí), así como también partes o porciones más discretas de dichas cadenas o dominios. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada o los dominios variables de cadena liviana y pesada incluyen "regiones determinantes de complementariedad" o los "CDR" intercalados entre "regiones de estructura" o los "FR", como se define aquí.

El término "conformación" se refiere a la estructura terciaria de una proteína o un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo, una cadena de anticuerpo, dominio o región de ésta. Por ejemplo, la frase "conformación de cadena liviana (o pesada)" se refiere a una estructura terciaria de una región variable de cadena liviana (o pesada), y la frase "conformación de anticuerpo" o "conformación de fragmento de anticuerpo" se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o fragmento de éste.

"Unión específica" de un anticuerpo significa que el anticuerpo exhibe afinidad apreciable por un antígeno o epítopo particular y, en general, no exhibe reactividad cruzada significativa. El término "anticuerpo anti-RAGE" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un RAGE. El anticuerpo puede no exhibir reactividad cruzada (por ejemplo, no reacciona cruzadamente con los péptidos no RAGE o con epítopos remotos sobre RAGE. La unión "apreciable" incluye la unión con una afinidad de por lo menos 106, 107, 108, 109 M"1, o 1010 M"1. Los anticuerpos con afinidades mayores de 107 M"1 o 108 M"1 se unen típicamente con la especificidad correspondientemente mayor. Los valores intermedios de aquellos establecidos aquí también pretenden estar dentro del alcance de la presente invención y los anticuerpos de la invención que se unen a RAGE con un rango de afinidades, por ejemplo, 106 a 1010 M" \ o 107 a 1010 M"\ o 108 a 1010 M~ . Un anticuerpo que "no exhibe reactividad cruzada significativa" es aquel que no se unirá apreciablemente a una entidad diferente de su objetivo (por ejemplo, un epítopo diferente o una molécula diferente). Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a RAGE se unirá apreciablemente a RAGE pero no reaccionará significativamente con proteínas o péptidos no RAGE. Un anticuerpo específico para un epítopo particular, por ejemplo, no reaccionará de forma cruzada de manera significativa con epítopos remotos sobre la misma proteína o péptido. La unión específica se puede determinar de acuerdo con cualquiera de los medios reconocidos en la técnica para determinar tal unión. Preferiblemente, la unión específica se determina de acuerdo con un análisis Scatchard y/o ensayos de unión competitivos.

Como se utiliza aquí, el término "afinidad" se refiere a la resistencia de la unión de un sitio único que combina antígeno con un determinante antigénico. La afinidad depende de la cercanía del ajuste estereoquímico entre los sitios que combinan anticuerpo y los determinantes de antígeno, sobre el tamaño del área de contacto entre ellos, sobre la distribución de los grupos cargados e hidrófobos, etc. La afinidad de anticuerpo se puede medir mediante diálisis de equilibrio o mediante un método BIACORE cinético. El método BIACORE™ se basa en el fenómeno de la resonancia de plasmón de superficie (SPR), que ocurre cuando las ondas de plasmón de superficie se excitan en una interfaz metal/liquido. La luz está dirigida a, y se refleja de, el lado de la superficie que no está en contacto con la muestra, y el SPR origina una reducción en la intensidad de la luz reflejada a una combinación específica de ángulo y longitud de onda. Los eventos de unión bimoleculares originan cambios en el índice de refracción en la capa de superficie, que se detectan como cambios en la señal SPR.

La constante de disociación, Kd, y la constante de asociación, Ka, son medidas cuantitativas de afinidad. En equilibrio, el antígeno libre (Ag) y el anticuerpo libre (Ab) están en equilibrio con el complejo antígeno-anticuerpo (Ag-Ab), y las constantes de tasa, ka y kd, cuantifican las tasas de las reacciones individuales: ka kd Ab + Ag Ab - Ag y Ab - Ag P£> + Ag En equilibrio, Ka [Ab][Ag]=kd [Ag-Ab]. La constante de disociación, Kd, se da por: Kd = kd/ka = [Ag][Ab] / [Ag-Ab]. Kd tiene unidades de concentración, más típicamente M, mM, µ?, nM, pM, etc. Cuando se comparan las afinidades de anticuerpo expresadas como Kd, que tienen afinidad mayor para RAGE se indica mediante un valor menor. La constante de asociación, Ka, se da por: Ka = ka/kd = [Ag-Ab] / [Ag][Ab]. Ka tiene unidades de concentración inversa, más típicamente M~ , mM"1, µ?"1, nM"1, pM"1, etc. Como se utiliza aquí, el término "avidez" se refiere a la resistencia de la unión de antigeno-anticuerpo después de la formación de complejos reversibles. Los anticuerpos anti-RAGE se pueden caracterizar en términos de Kd por su unión a una proteína RAGE, como unión "con una constante de disociación (Kd) en el rango de desde aproximadamente (el valor Kd inferior) a aproximadamente (el valor Kd superior)". En este contexto, el término "aproximadamente" pretende significar el valor Kd indicado ± 20%, es decir, Kd de aproximadamente 1 = Kd en el rango de 0.8 a 1.2.

Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de una población clonal de células que producen anticuerpo (por ejemplo, linfocitos B o células B) que es homogénea en estructura y de especificidad de antígeno.

El término "anticuerpo policlonal" se refiere a una pluralidad de anticuerpos originados de diferentes poblaciones clónales de células que producen anticuerpo que son heterogéneas en su estructura y especificidad de epítopo pero que reconocen un antígeno común. Los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden existir dentro de los fluidos corporales, como preparaciones crudas, o se pueden purificar, como se describe aquí.

El término "porción de unión" de un anticuerpo (o "porción de anticuerpo") incluye uno o más dominios completos, por ejemplo, un par de dominios completos, así como también fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente al RAGE. Se ha mostrado que la función de unión de un anticuerpo se puede desarrollar por medio de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinantes, o mediante división enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fd, dAb, Fv, cadenas únicas, anticuerpos de cadena única, por ejemplo, scFv, y anticuerpos de dominio único (Muyldermans et al., 2001 , 26:230-5), y una región determinante de complementariedad aislada (CDR). El fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1. El fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados mediante un puente disulfuro a la región pivote. El fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1 , y el fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo. Un fragmento dAb consiste de un dominio VH (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, ellos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que les posibilita ser hechos como una cadena de proteína única en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocida como Fv de cadena única (scFv) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Tales anticuerpos de cadena única también pretenden estar comprendidos dentro del término "porción de unión" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como los diacuerpos también están comprendidas. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan sobre una cadena de polipéptido única, pero que utiliza un ligador que es demasiado corto para permitir el pareado entre los dos dominios sobre la misma cadena, forzando de esta manera los dominios al aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno (ver por ejemplo, Holliger, et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Un anticuerpo o porción de unión de éste también puede ser parte de moléculas de inmunoadhesión mayores formadas mediante la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de las proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región núcleo de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas scFv bivalentes o biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058). Los fragmentos de unión tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar de anticuerpos completos que utilizan técnicas convencionales, tales como la digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de los anticuerpos completos. Más aún, los anticuerpos, las porciones de anticuerpo y las moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, como se describen aquí y como se conocen en la técnica. Los anticuerpos diferentes de "biespecíficos" o "bifuncionales", un anticuerpo se entiende por tener cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un "biespecifico" o "anticuerpo bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Un anticuerpo biespecifico también puede incluir dos regiones de unión de antígeno con una región constante de intervención. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o enlace de los fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 , 1990.: Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148, 1547-1553.

El término "retro mutación" se refiere a un proceso en el cual algunos o todos los aminoácidos somáticamente mutados de un anticuerpo humano se reemplazan con los residuos de línea germinal correspondiente de una secuencia de anticuerpo de linea germinal homologa. Las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo humano de la invención se alinean separadamente con las secuencias de línea germinal en la base de datos VBASE para identificar las secuencias con la homología más alta. Las diferencias en el anticuerpo humano de la invención se regresan a la secuencia de línea germinal al mutar posiciones de nucleótido definidas que codifican tales diferentes aminoácidos. El papel de cada aminoácido identificado así como candidato para la retro mutación se debe investigar para un papel directo o indirecto en la unión de antígeno y cualquier aminoácido encontrado después de la mutación para afectar cualquier característica deseable del anticuerpo humano no se debe incluir en el anticuerpo humano final; como un ejemplo, los aminoácidos que mejoran la actividad identificados mediante la aproximación de la mutagenia selectiva no estará sometidos a retro mutación. Para minimizar el número de aminoácidos sometidos a retro mutación aquellas posiciones de aminoácido encontradas como diferentes en la secuencia de línea germinal más cercana pero idénticos al aminoácido correspondiente en una segunda secuencia de la línea germinal pueden permanecer, siempre y cuando la segunda secuencia de la línea germinal sea idéntica y colineal a la secuencia del anticuerpo humano de la invención durante para por lo menos 10, preferiblemente 12 aminoácidos, a ambos lados del aminoácido en cuestión. La retro mutación puede ocurrir en cualquier etapa de optimización del anticuerpo; preferiblemente, la retro mutación ocurre directamente antes o después de la aproximación de la mutagenia selectiva. Más preferiblemente, la retro mutación ocurre directamente antes de la aproximación de la mutagenia selectiva.

Los anticuerpos intactos, también conocidos como inmunoglobulinas, son típicamente proteínas glicosiladas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. Dos tipos de cadena liviana, denominados lambda y kappa, se encuentran en los anticuerpos. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales: A, D, E, G y M, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , e lgA2. Cada cadena liviana está compuesta de un dominio (VL) de variable terminal N (V) y un dominio (CL) constante (C). Cada cadena pesada está compuesta de un dominio V terminal N (VH), tres o cuatro dominios C (CH), y una región pivote. El dominio CH más próximo al VH se designa como CH1. Los dominios VH y VL consisten de cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas denominadas regiones de estructura (FR1 , FR2, FR3 y FR4), las cuales forman un andamio para las tres regiones de secuencias hipervariables (regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables por las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDR se denominan como CDR1 , CDR2, y CDR3. De acuerdo con esto, los constituyentes CDR sobre la cadena pesada se denominan como H1 , H2, y H3, mientras que los constituyentes CDR sobre la cadena liviana se denominan como L1 , L2 y L3. El CDR3 es la fuente mayor de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. El H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácido o mayores de 26 aminoácidos. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, ver Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et. al., 1988. Un experto en la técnica reconocerá que cada estructura subunitaria, por ejemplo, una estructura CH, VH, CL, VL, CDR, FR, comprende fragmentos activos, por ejemplo, la porción de la subunidad VH, VL o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión, o, por ejemplo, la porción de la subunidad CH que se une y/o activa, por ejemplo, un receptor Fe y/o complemento.

La diversidad del anticuerpo se crea mediante el uso de genes de línea germinal múltiples que codifican las regiones variables y una variedad de eventos somáticos. Los eventos somáticos incluyen la recombinación de los segmentos de gen variable con segmentos de gen de diversidad (D) y de unión (J) para hacer una región VH completa, y la recombinación de los segmentos de gen variable y de unión para hacer una región VL completa. El proceso de recombinación mismo es impreciso, dando como resultado en la pérdida o adición de los aminoácidos en las uniones V(D)J. Estos mecanismos de diversidad ocurren en el desarrollo de la célula B antes a la exposición del antígeno. Después de la estimulación antigénica, los genes de anticuerpo expresados en las células B sufren mutación somática. Con base en el número estimado de segmentos de gen de línea germinal, la recombinación aleatoria de estos segmentos, y el pareado VH-VL aleatorio, hasta de 1.6 x 107 diferentes anticuerpos se podrían producir (Fundamental Immunology, 3rd ed. (1993), ed. Paul, Raven Press, New York, NY). Cuando otros procesos que contribuyen a la diversidad del anticuerpo (tal como la mutación somática) se tienen en cuenta, se cree que más de 1x1010 diferentes anticuerpos se podrían generar (Immunoglobulin Genes, 2nd ed. (1995), eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA). En razón a que muchos de los procesos involucrados en generar diversidad de anticuerpo, es improbable que los anticuerpos monoclonales independientemente derivados con la misma especificidad de antígeno tengan unas secuencias de aminoácido idénticas.

El término "polipéptido dimerizante" o "dominio dimerizante" incluye cualquier polipéptido que forma un dímero (o complejo de orden mayor, tal como trímero, tetrámero, etc.) con otro polipéptido. Opcionalmente, el polipéptido dimerizante se asocia con otros polipéptidos dimerizantes idénticos, formando de esta manera homomultímeros. Un elemento IgG Fe es un ejemplo de un dominio dimerizante que tiende a formar homomultímeros. Opcionalmente, los asociados de polipéptido dimerizante con otros diferentes polipéptidos dimerizantes, forman de esta manera heteromultímeros. El dominio de cremallera de leucina Jun forma un dímero con el dominio de cremallera de leucina Fos, y es por lo tanto un ejemplo de un dominio dimerizante que tiende a formar heteromultímeros. Los dominios dimerizantes pueden formar 25 de los hetero y homomultímeros.

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variable y constante que corresponden a las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana como se describe por Kabat et al. (Ver, Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por la mutagenia aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en los CDR y en particular CDR3. Las mutaciones preferiblemente se introducen utilizando la "aproximación de mutagenia selectiva" descrita aquí. El anticuerpo humano puede tener por lo menos una posición reemplazada con un residuo de aminoácido, por ejemplo, una actividad que mejora el residuo de aminoácido, que no está codificada por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. El anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones reemplazadas con los residuos de aminoácido que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, se reemplazan hasta diez, hasta cinco, hasta tres o hasta dos posiciones. Estor reemplazos pueden caer dentro de las regiones CDR como se describe en detalle adelante. Sin embargo, el término "anticuerpo humano" como se utiliza aquí, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado sobre las secuencias de estructura humana.

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrita adicionalmente en la Sección II, adelante), anticuerpos aislados de una colección de anticuerpo humano recombinante, combinatoria (descrito adicionalmente en la Sección III, adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295) o los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucra empalme de las secuencias del gen de inmunoglobulina humano a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombiantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (Ver Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagenia in vitro (o, cuando se utiliza un transgénico animal para las secuencias Ig humanas, mutagenia somática in vivo) y así las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se deriven y se relacionan con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos recombinantes pueden ser el resultado de la aproximación de la mutagenia selectiva o la retro mutación o ambas.

Un "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tiene diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente RAGE está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a RAGE diferente de hRAGE). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a RAGE puede unir moléculas RAGE de otras especies. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. Un "anticuerpo neutralizante" (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad RAGE") incluye un anticuerpo que se une a los resultados hRAGE en modulación de la actividad biológica del hRAGE. Esta modulación de la actividad biológica del hRAGE se puede evaluar al medir uno o más indicadores de la actividad biológica hRAGE, tal como la inhibición de la unión del receptor en un ensayo de unión de receptor RAGE (ver, por ejemplo, Ejemplos 6 y 7). Estos indicadores de la actividad biológica hRAGE se pueden evaluar mediante uno o más de varios ensayos estándar in vitro o in vivo conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ejemplos 6 y 7).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en cuyos residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar además el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios de variable, en el cual todo o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente que de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRAGE que se une a RAGE y/o la potencia neutralizante de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRAGE cuya unión al hRAGE inhibe la actividad biológica del RAGE, por ejemplo, la inhibición de la unión del receptor en un ensayo de unión de receptor RAGE humano.

Una "construcción de expresión" es cualquier ácido nucleico recombinante que incluye un ácido nucleico expresable y los elementos regulatorios suficientes para mediar la expresión de la proteína o polipéptido de ácido nucleico expresable en una célula huésped adecuada.

Los términos "proteína de fusión" y "proteína quimérica" son intercambiables y se refieren a una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene porciones que corresponden a las secuencias de aminoácido de dos o más proteínas. Las secuencias de dos o más proteínas pueden ser completas o parciales (es decir, fragmentos) de proteínas. Las proteínas de fusión también pueden tener regiones de enlace de aminoácidos entre las porciones que corresponden a aquellas de las proteínas. Tales proteínas de fusión se pueden preparar mediante métodos recombinantes, en donde los ácidos nucleicos correspondientes se unen a través del tratamiento con nucleasas y ligasas y se incorporan a un vector de expresión. La preparación de las proteínas de fusión se entiende generalmente por aquellos que tienen experticio en la materia.

El término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando es apropiado, ácido ribonucleico (ARN). El término también se puede entender por incluir, como equivalentes, análogos de su ARN o ADN hecho de análogos de nucleótido, y, como sea aplicable a las modalidades que se describen, polinucleótidos de cadena simple o doble (codificante o anticodificante).

El término "idéntico porcentual" o "identidad porcentual" se refiere a la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácido o entre dos secuencias de nucleótido. La identidad porcentual se puede determinar al comparar una posición en cada secuencia que se puede alinear para propósitos de comparación. La expresión como un porcentaje de la identidad se refiere a una función del número de aminoácidos o ácidos nucleicos idénticos en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Se pueden utilizar varios algoritmos y/o programas de alineamiento, incluyendo FASTA, BLAST, o ENTREZ. FASTA y BLAST están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se puede utilizar con, por ejemplo, configuraciones por defecto. ENTREZ está disponible a través del National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. La identidad porcentual de dos secuencias se puede determinar mediante el programa GCG con un peso de espacio de 1 , por ejemplo, cada espacio de aminoácido se pesa como si éste fuera un aminoácido único o existiera una falta de coincidencia de nucleótido entre las dos secuencias.

Otras técnicas para el alineamiento se describen en Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a división of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. Preferiblemente, un programa de alineamiento que permite espacios en la secuencia se utiliza para alinear las secuencias. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite espacios en los alineamientos de secuencia. Ver Meth. Mol. Viols. 70: 173-187 (1997). También, el programa GAP I que utiliza el método de alineamiento Needlenan y Wunsch se puede utilizar para alinear las secuencias. Una estrategia de búsqueda alternativa utiliza el software MPSRCH, que corre sobre una computadora MASPAR. El MPSRCH utiliza un algoritmo Smith-Waterman para calificar las secuencias 5 sobre una computadora masivamente paralela. Esta aproximación mejora la capacidad de recoger coincidencias distantemente relacionadas, y es especialmente tolerante de espacios pequeños y errores de secuencia de nucleótido. Las secuencias del aminoácido codificadas por el ácido nucleico se pueden utilizar para investigar ambas proteínas: y las bases de datos de ADN.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente aquí.

Una proteína "RAGE" es un "Receptor para los Productos Finales de Glucación Avanzada", como se conocen en la técnica. Las proteínas RAGE representativas se establecen en las Figuras 1A-1 C. Las proteínas RAGE incluyen RAGE soluble (sRAGE) y RAGE secretorio endógeno (esRAGE). El RAGE secretorio endógeno es una variante de empalme RAGE que se relaciona por fuera de las células, donde ésta es capaz de unirse a ligandos AGE y neutralizar las acciones AGE. Ver, por ejemplo, Koyama et al., ATVE, 2005; 25:2587-2593. La asociación inversa se ha observado entre el plasma humano esRAGE y varios componentes del síndrome metabólico (BMI, resistencia a insulina, BP, hipertrigliceridemia e IGT). Los niveles de plasma esRAGE también se han asociado inversamente con la ateroesclerosis carótida y femoral (cuantificada mediante ultrasonido) en sujetos con o sin diabetes. Más aún, los niveles del esRAGE del plasma son significativamente inferiores en pacientes no diabéticos con enfermedad de arteria coronaria angiográficamente probada que en controles saludables de edad coincidente.

Un "Receptor para el Elemento de Unión de Ligando de los Productos Finales de Glucación Avanzada" o "RAGE-LBE" (también denominado aquí como "RAGE-Fc" y "RAGE-estrep") incluye cualquier porción extracelular de un polipéptido RAGE de transmembrana y fragmentos de esto que retienen la capacidad de unirse al ligando RAGE. Este término también comprende polipéptidos que tienen por lo menos 85% de identidad, preferiblemente por lo menos 90% de identidad o más preferiblemente por lo menos 95% de identidad con un polipéptido RAGE, por ejemplo, el polipéptido humano o de murino al cual se unirá el ligando RAGE o el RAGE-BP.

Un "Receptor para el Compañero de Unión de los Productos Finales de Glucación Avanzada" o "RAGE-BP" incluye cualquier sustancia (por ejemplo, polipéptido, molécula pequeña, estructura de carbohidrato, etc.) que se une en una configuración fisiológica a una porción extracelular de una proteína RAGE (un polipéptido receptor tal como, por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE).

Los "trastornos relacionados con RAGE" o "trastornos asociados con RAGE" incluyen cualquier trastorno en el cual una célula o tejido afectado exhibe un incremento o disminución en la expresión y/o actividad de RAGE o uno o más ligandos RAGE. Los trastornos relacionados con RAGE también incluyen cualquier trastorno que sea tratable (es decir, uno o más síntomas se pueden eliminar o mejorar) mediante una disminución en la función RAGE (que incluye, por ejemplo, la administración de un agente que afecta las interacciones RAGE:RAGE-BP).

El "dominio V de RAGE" se refiere al dominio variable similar a inmunoglobulina como se muestra en la FIG. 5 de Beeper, et al, "Cloning and expression of RAGE: a cell surface receptor for advanced glycosylation end producís of proteins", J. Biol. Chem. 267: 14998-15004 (1992), cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia. El dominio V incluye los aminoácidos desde la posición 1 a la posición 120 como se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO:3.

El cADN humano del RAGE es de 1406 pares de base y codifica una proteína madura de 404 aminoácidos. Ver la FIG. 3 de Beeper et al. 1992.

El término "ácido nucleico recombinante" incluye cualquier ácido nucleico que comprende por lo menos dos secuencias que no están presentes juntas en la naturaleza. Se puede generar un ácido nucleico recombinante in vitro, por ejemplo al utilizar los métodos de biología molecular, o in vivo, por ejemplo mediante la inserción de un ácido nucleico a un sitio cromosómico novedoso mediante una recombinación homologa o no homologa.

El término "tratar" con respecto al sujeto, se refiere a mejorar por lo menos un síntoma de la enfermedad o trastorno del sujeto. El tratamiento puede curar la enfermedad o la condición o mejorarla.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual éste se ha ligado. Un tipo de vector es un epitoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicacion extra-cromosomal. Otro tipo de vector es un vector integrador que se designa para recombinar con el material genético de una célula huésped. Los vectores pueden ser ambos autónomamente replicantes e integrantes, y las propiedades de un vector pueden diferir dependiendo del contexto celular (es decir, un vector puede ser autónomamente replicante en un tipo de célula huésped y puramente integrante en otro tipo de célula huésped). Los vectores capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos expresables a los cuales ellos están operativamente ligados se denominan aquí como "vectores de expresión".

"Específicamente ¡nmunoreactivos" se refiere a la unión preferencial de los compuestos [un anticuerpo] a una secuencia de péptido particular, cuando el anticuerpo interactúa con una secuencia de péptido específica.

La frase "cantidad efectiva" como se utiliza aquí significa que la cantidad de uno o más agentes, materiales, o composiciones que comprenden uno o más agentes de la presente invención que es efectiva para producir algún efecto deseado en un animal. Se reconoce que cuando el agente se utiliza para lograr un efecto terapéutico, la dosis actual que comprende la "cantidad efectiva" variará dependiendo de un número de condiciones que incluyen la condición particular que se va a tratar, la severidad de la enfermedad, el tamaño y la salud del paciente, la ruta de administración, etc. Un practicante médico experto puede determinar fácilmente la dosis apropiada utilizando los métodos bien conocidos en las ciencias médicas.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que están, dentro del alcance del juicio médico sensato, adecuado para uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable beneficio/riesgo.

La frase "portador farmacéuticamente aceptable" como se utiliza aquí significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante líquido o sólido, involucrado en llevar o transportar los agentes objeto desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1 ) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa, y sus derivados, tal como carboximetil celulosa sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) mata; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya; (10) glicoles, tal como propilenglicol; (1 1 ) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como etil oleato y etil laurato; (13) agar; (14) agentes amortiguantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógeno; (17) solución salina isotónica, (18) solución de Ringer, (19) etil alcohol; (20) soluciones amortiguadoras de fosfato; y (21 ) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Preparación de anticuerpos monoclonales Un mamífero, tal como un ratón, o rata, un hámster o conejo se pueden inmunizar con una proteína de longitud completa o fragmentos de ésta, o el cADN que codifica la proteína de longitud completa o fragmento de ésta una forma inmunogénica del péptido.

Las técnicas para conferir inmunogenicidad sobre una proteína o péptido incluyen la conjugación a portadores u otras técnicas bien conocidas en el arte. Una porción inmunogénica de un polipéptido se puede administrar en la presencia del adyuvante. El progreso de la inmunización se puede monitorear mediante la detección de los títulos de anticuerpo en el plasma o suero. El ELISA estándar u otros inmuno-ensayos se pueden utilizar con el inmunógeno como el antígeno para evaluar los niveles de los anticuerpos.

Luego de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de los polipéptidos objeto, se puede obtener un antisuero, y si se desea, anticuerpos policlonales aislados del suero. Para producir los anticuerpos monoclonales, las células que producen anticuerpo (línfocitos) se pueden cosechar de un animal inmunizado y fusionar mediante procedimientos de fusión de célula somática estándar con células inmortalizantes tales como células de mieloma para producir las células de hibridoma. Tales técnicas se conocen bien en el arte, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma (originalmente desarrollada por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Las células de hibridoma se pueden seleccionar inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un epítopo del polipéptido RAGE y los anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que comprende tales células de hibridoma.

Humanización Los anticuerpos quiméricos comprenden secuencias de por lo menos dos especies diferentes. Como un ejemplo, las técnicas de clonación recombinantes se pueden utilizar para incluir regiones variables, que contienen los sitios de unión de antígeno, de un anticuerpo no humano (es decir, un anticuerpo preparado en una especie no humana inmunizada con el antígeno) y las regiones constantes derivadas de una inmunoglobulina humana.

Los anticuerpos humanizados son un tipo de anticuerpo quimérico en donde los residuos de la región variable responsable por la unión de antígeno (es decir, los residuos de una región determinante de complementariedad, una región determinante de complementariedad abreviada, o cualquier otros residuos que participen en la unión de antígeno) se derivan de una especie no humana, aunque el resto de los residuos de región variable (es decir, los residuos en las regiones de estructura) y las regiones constantes se derivan, por lo menos en parte, de las secuencias de anticuerpo humano. Un subconjunto de los residuos de región de estructura y los residuos de región constante de un anticuerpo humanizado se pueden derivar de fuentes no humanas. Las regiones variables del anticuerpo humanizado también se describen como humanizados (es decir, una región variable de cadena liviana o de cadena pesada humanizada). La especie no humana es típicamente aquella utilizada para la inmunización con antigeno, tal como especies de ratón, rata, conejo, primate no humano, u otros mamíferos no humanos. Los anticuerpos humanizados son típicamente menos inmunogénicos que los anticuerpos quiméricos tradicionales y muestran estabilidad mejorada luego de la administración a humanos. Ver, por ejemplo, Benicosa et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos et al. (1994) Eur. J. Cáncer 30A: 1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr. Infecí Dis. J. 17: 1 10-5.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son residuos de regiones variables de anticuerpo que participan en la unión del antígeno. Varios sistemas de numeración para identificar los CDR son de uso común. La definición Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia, y la definición de Chothia se basa en la localización de las regiones de aro estructural. La definición AbM es un compromiso entre las aproximaciones Kabat y Chothia. Los CDR de la región variable de cadena liviana están unidos mediante los residuos en las posiciones 24 y 34 (CDR1-L), 50 y 56 (CDR2-L), y 89 y 97 (CDR3-L) de acuerdo al Kabat, Chothia, o algoritmo AbM. De acuerdo con la definición Kabat, los CDR de la región variable de cadena pesada están unidos por los residuos en las posiciones 31 y 35B (CDR1 -H), 50 y 65 (CDR2-H), y 95 y 102 (CDR3-H) (numeración de acuerdo a Kabat). De acuerdo a la definición Chothia, los CDR de la región variable de cadena pesada se unen a los residuos en las posiciones 26 y 32 (CDR1-H), 52 y 56 (CDR2-H), y 95 y 102 (CDR3-H) (numeración de acuerdo a Chothia). De acuerdo con la definición del AbM, los CDR de la región variable de cadena pesada se unen mediante los residuos en las posiciones 26 y 35B (CDR1 -H), 50 y 58 (CDR2-H), y 95 y 102 (CDR3-H) (numeración de acuerdo a Kabat). Ver Martin et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 121- 153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1 : 126; y Rees et al. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp. 141-172.

Como se utiliza aquí, el término "CDR" se refiere a los CDR como se definen por Kabat o por Chothia; más aún, una variable de anticuerpo humanizado de la invención se puede construir para comprender uno o más CDR definidos por Kabat, y también para comprender uno o más CDR definidos por Chothia.

Las regiones determinantes de especificidad (SDR) son residuos dentro de los CDR que interactúan directamente con el antígeno. Los SDR corresponden a residuos hipervariables. Ver (Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139).

Los residuos de estructura son aquellos residuos de las regiones variables de anticuerpo diferentes de los residuos hipervariables o CDR. Los residuos de estructura se pueden derivar de un anticuerpo humano de ocurrencia natural, tal como una estructura humana que es sustancialmente similar a una región de estructura de un anticuerpo anti-RAGE de la invención. También se puede utilizar secuencias de estructura artificial que representan un consenso entre las secuencias individuales. Cuando se selecciona una región de estructura para la humanización, las secuencias que se representan ampliamente en humanos se pueden preferir sobre secuencias menos populares. Las mutaciones adicionales de las secuencias aceptadoras de estructura humana se pueden hacer para restablecer los residuos de murino que se cree que están involucrados en contactos de antígeno y/o residuos involucrados en la integridad estructural del sitio de unión de antígeno, o para mejorar la expresión del anticuerpo. Una predicción de la estructura del péptido se puede utilizar para analizar las secuencias de la región pesada y ligera variable humanizada para identificar y evitar los sitios de modificación de proteína post-trasnduccional introducidos por el diseño de humanización.

Los anticuerpos humanizados se pueden preparar utilizando una cualquiera de una variedad de métodos que incluyen revestido, injerto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), injerto de los CDR abreviados, injerto de las regiones determinantes de especificidad (SDR), y el montaje Frankenstein, como se describe adelante. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos superhumanizados, en los cuales se ha introducido uno o más cambios en los CDR. Por ejemplo, los residuos humanos se pueden sustituir por residuos no humanos en los CDR. Estas aproximaciones generales se pueden combinar con técnicas de mutagenia y síntesis estándar para producir un anticuerpo anti-RAGE de cualquier secuencia deseada.

El revestimiento está basado en el concepto de reducir secuencias de aminoácido potencialmente inmunogénicas en un roedor o en otro anticuerpo no humano al hacer salir a la superficie el disolvente exterior accesible del anticuerpo con las secuencias de aminoácido humana. Así, los anticuerpos de revestimiento parecen menos extraños a las células humanas que el anticuerpo no humano no modificado. Ver Pedían (1991 ) Mol. Immunol. 28:489-98. Un anticuerpo no humano es revestido al identificar los residuos de región de estructura exterior expuestos en el anticuerpo no humano, que son diferentes de aquellos en las mismas posiciones en las regiones de estructura de un anticuerpo humano, y el reemplazo de los residuos identificados con los aminoácidos que ocupan típicamente estas mismas posiciones en los anticuerpos humanos.

El injerto de los CDR se desarrolla al reemplazar uno o nás de los CDR de un anticuerpo aceptador (por ejemplo, un anticuerpo humano u otro anticuerpo que comprende los residuos de estructura deseada) con los CDR de un anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo no humano). Los anticuerpos aceptadores se pueden seleccionar con base en la similitud de los residuos de estructura entre un anticuerpo aceptador candidato y un anticuerpo donador. Por ejemplo, de acuerdo con la aproximación Frankenstein, las regiones de estructura humana se identifican por tener homología de secuencia sustancial con cada región de estructura del anticuerpo no humano relevante, y los CDR del anticuerpo no humano se injertan sobre el compuesto de las regiones de estructura humanas diferentes. Un método relacionado también útil para la preparación de anticuerpos de la invención se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 2003/0040606.

El injerto de los CDR abreviados es una aproximación relacionada. Los CDR abreviados incluyen los residuos determinantes de especificidad y los aminoácidos adyacentes, que incluyen aquellos en las posiciones 27d-34, 50-55 y 89-96 en la cadena liviana, y en las posiciones 31 -35b, 50-58 y 95-101 en la cadena pesada (numeración convencional de (Kabat et al. (1987)). Ver (Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9). El injerto de los residuos determinantes de especificidad (SDR) es la premisa bajo el entendimiento de que la especificidad de unión y la afinidad de un sitio que combina anticuerpo se determina por los residuos más altamente variables dentro de cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). El análisis de las estructura tridimensionales de los complejos de anticuerpo-antígeno, combinados con el análisis de los datos de secuencia de aminoácido disponibles se pueden utilizar para modelar la variabilidad de secuencia con base en la no similitud estructural de los residuos de aminoácido que ocurren en cada posición dentro del CDR. Los SDR se identifican como las secuencias de polipéptido mínimamente inmunogénicas que consisten de los residuos de contacto. Ver Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139.

Las estructuras aceptadoras para injertar los CDR o los CDR abreviados se pueden modificar además para introducir los residuos deseados. Por ejemplo, las estructuras aceptadoras pueden comprender una región variable de cadena pesada de una secuencia de consenso del subgrupo I humano, opcionalmente con residuos donadores no humanos en una o más de las posiciones, 1 , 28, 48, 67, 69, 71 , y 93. Como otro ejemplo, una estructura aceptadora humana puede comprender una región variable de cadena liviana de una secuencia de consenso del subgrupo I humano, opcionalmente con residuos donadores no humanos en una o más de las posiciones 2, 3, 4, 37, 38, 45 y 60. Luego del injerto, se pueden hacer cambios adicionales en las secuencias donadora y/o aceptadora para optimizar la unión y la funcionalidad del anticuerpo. Ver, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT No. WO 91/09967.

Las estructuras humanas de la región variable de cadena pesada que se pueden utilizar para preparar los anticuerpos anti-RAGE humanizados incluyen los residuos de estructura del DP-75, DP54, DP-54, FW VH 3 JH4, DP-54 VH3 3-07, DP-8(VH1 -2), DP-25, Vl-2b y VI-3 (VH1-03), DP-15 y V1 -8 (VH1-08), DP-14 y VI-18 (VH1-18), DP-5 y V1 -24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1 -46), DP-10, DA-6 y YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1 -e), DP-3, y DA-8 (VH1 -f).

Las estructuras humanas de la región variable de cadena liviana que se puede utilizar para preparar los anticuerpos anti-RAGE humanizados incluyen los residuos de estructura del clon de la línea germinal humana DPK24, DPK-12, DPK-9 Vk1 , DPK-9 Jk4, DPK9 Vk1 02, y los subgrupos del clon de línea germinal VKI I I y V I. Las siguientes mutaciones de una línea germinal DPK24 puede incrementar la expresión del anticuerpo: F10S, T45K, I63S, Y67S, F73L, y T77S.

Los anticuerpos anti-RAGE humanizados representativos de la invención incluyen anticuerpos que tienen uno o más CDR de una secuencia de aminoácido de región variable seleccionada de las SEQ ID Nos:16-27. Por ejemplo, los anticuerpos anti-RAGE humanizados pueden comprender dos o más CDR seleccionados de los CDR de la región variable de cadena pesada de una cualquiera de las SEQ ID NOS:16, 18, 21 , 24, 20, y 26, o una región variable de cadena liviana de una cualquiera de las SEQ ID NOS.17, 19, 22, 25, 23, y 27. Los anticuerpos anti-RAGE humanizados también pueden comprender una cadena pesada que comprende una región variable que tiene dos o tres CDR de una cualquiera de las SEQ ID NOS:16, 18, 21 , 24, 20, y 26, y una cadena liviana que comprende una región variable que tiene dos o tres CDR de una cualquiera de las SEQ ID NOS:17, 19, 22, 25, 23, y 27.

Los anticuerpos anti-RAGE humanizados de la invención se pueden construir en donde la región variable de una primera cadena (es decir, la región variable de cadena liviana o la región variable de cadena pesada) se humaniza, y en donde la región variable de la segunda cadena no se humaniza (es decir, una región variable de un anticuerpo producido en una especie no humana). Estos anticuerpos son un tipo de anticuerpo humanizado denominado como anticuerpos semi-humanizados.

Las regiones constantes de anticuerpos anti-RAGE humanizado se pueden derivar de regiones constantes de una cualquiera del IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, y cualquiera de los isotipos de éste (por ejemplo, los isotipos de IgG, lgG1 , lgG2, lgG3, o lgG4). Las secuencias de aminoácido de muchas de las regiones constantes se conocen. La elección de un isotipo humano y la modificación de los aminoácidos particulares en el isotipo pueden mejorar o eliminar la activación de los mecanismos de defensa del huésped y alterar la biodistribución del anticuerpo. Ver (Reff et al. (2002) Cáncer Control 9: 152-66). Para la clonación de las secuencias que codifican las regiones constantes de inmunoglobulina, se pueden suprimir las secuencias intrónicas.

Los anticuerpos anti-RAGE quiméricos y humanizados se pueden construir utilizando técnicas estándar conocidas en el arte. Por ejemplo, las regiones variables se pueden preparar mediante la hibridación junto con los oligonucleótidos traslapantes que codifican las regiones variables y ligarlas en un vector de expresión que contiene una región constante de anticuerpo humano. Ver, por ejemplo, Harlow & Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York y las Patentes U.S. Nos. 4,196,265; 4,946,778; 5,091 ,513; 5,132,405; 5,260,203; 5,677,427; 5,892,019; 5,985,279; 6,054,561. Los anticuerpos tetravalentes (H4L4) comprenden dos anticuerpos tetraméricos intactos, incluyen homodímeros y heterodímeros, se pueden preparar, por ejemplo, como se describe en la Publicación Internacional PCT No. WO 02/096948. Los dímeros de anticuerpo también se pueden preparar por vía de la introducción del o los residuos de cisteína en la región constante del anticuerpo, que promueve la formación del enlace disulfuro intercadena, mediante el uso de reticuladores heterobifuncionales (Wolff et al. (1993) Cáncer Res. 53: 2560-5), o mediante producción recombinante para incluir una región constante doble (Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30). Los fragmentos de unión de antígeno de los anticuerpos de la invención se pueden preparar, por ejemplo, mediante la expresión de secuencias de anticuerpo truncadas, o mediante la digestión post-transducción de los anticuerpos de longitud completa.

Las variantes de los anticuerpos anti-RAGE de la invención se pueden preparar fácilmente para incluir varios cambios, sustituciones, inserciones, y supresiones. Por ejemplo, las secuencias de anticuerpo se pueden optimizar para el uso del codón en el tipo de célula utilizado para la expresión del anticuerpo. Para incrementar la vida media del suero del anticuerpo, un epítopo que se une al receptor salvaje se puede incorporar, si no está presente ya, en la secuencia de cadena pesada del anticuerpo. Ver la Patente U.S. No. 5,739,277. Las modificaciones adicionales para mejorar la estabilidad del anticuerpo incluyen la modificación del lgG4 para reemplazar la serina en el residuo 241 con prolina. Ver Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108. Otros cambios útiles incluyen sustituciones como se requieran para optimizar la eficiencia en conjugar el anticuerpo con un fármaco. Por ejemplo, se puede modificar un anticuerpo en su terminal carboxilo para incluir los aminoácidos para la anexión del fármaco, por ejemplo se pueden agregar uno o más residuos de cisteína. Las regiones constantes se pueden modificar para introducir sitios para la unión de los carbohidratos u otros grupos funcionales.

Las variantes de anticuerpo adicional incluyen las isoformas de glucosilación que dan como resultado propiedades funcionales mejoradas. Por ejemplo, la modificación de la glucosilación Fe puede dar como resultado funciones efectoras alteradas, por ejemplo, la unión incrementada de los receptores gama Fe y el ADCC mejorado y/o podría disminuir la unión de C1 q y CDC (por ejemplo, el cambio de los oligosacáridos Fe de la forma compleja a la mañosa o tipo híbrido alto puede disminuir la unión C1q y CDC (ver, por ejemplo, Kanda et al., Glycobiology, 2007: 17: 104-1 18)). La modificación se puede hacer mediante bacterias, levaduras, células de plantas, células de insectos, y células de mamífero de bioingeniería; esto también se puede hacer al manipular la proteína o las sendas de glucosilación del producto natural en organismos trabajados por ingeniería genética. La glucosilación también se puede alterar al explotar la liberalidad con la cual las enzimas que se unen al azúcar (glicosiltransferasa) toleran un amplio rango de diferentes sustratos. Finalmente, un experto en la técnica puede glicosilar proteínas y productos naturales a través de una variedad de aproximaciones químicas; con moléculas pequeñas, enzimas, ligación de proteína, bioingeniería metabólica, o síntesis total. Los ejemplos de los inhibidores de molécula pequeña adecuados del procesamiento de N-glican incluyen, Castanospermina (CS), Kifunensina (KF), Desoximannojirimicina (DMJ), Swainsonina (Sw), Monensina (Mn).

Las variantes de los anticuerpos anti-RAGE de la invención se pueden producir utilizando técnicas recombinantes estándar, que incluyen mutagenia dirigida de sitio, o clonación de recombinación. Un repertorio diversificado de anticuerpos anti-RAGE se puede preparar por vía de la disposición del gen y los métodos de conversión del gen en animales no humanos transgénicos (Publicación de la Patente U.S. No. 2003/0017534), que se prueban para actividades relevantes utilizando ensayos funcionales. En particular las modalidades de la invención, se obtienen variantes utilizando un protocolo de maduración de afinidad para mutar los CDR (Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403), remoción de cadena (Marks et al. (1992) Biotechnology (NY) 10: 779-783), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368), remoción de ADN (Patten et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724-733), despliegue de fago (Thompson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 77-88), y PCR sexual (Crameri et al. (1988) Nature 391 : 288-291). Para aplicaciones de inmunoterapia, los ensayos funcionales relevantes incluyen la unión específica al antígeno RAGE humano, la internalización del anticuerpo, y el apuntamiento al o los sitios de tumor cuando se administra a un animal que lleva un tumor, como se describe aquí adelante.

La presente invención suministra además células y líneas celulares que expresan anticuerpos anti- AGE de la invención. Las células huésped representativas incluyen células de mamífero y humanas, tales como células CHO, células HEK-293, células HeLa, células CV-1 , y células COS. Los métodos para generar una línea celular estable luego de la transformación de una construcción heterologa en una célula huésped se conocen en la técnica. Las células huéspedes no mamíferas representativas incluyen células de insecto (Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-1 12). Los anticuerpos también se pueden producir en animales transgénicos (Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) y plantas transgénicas (Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45).

Como se discutió anteriormente, los anticuerpos monoclonales, quiméricos y humanizados, que se han modificado mediante, por ejemplo, la supresión, adición, o sustitución de otras porciones del anticuerpo, por ejemplo, la región constante, también están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo se puede modificar como sigue: (i) al suprimir la región constante; (ii) al reemplazar la región constante con otra región constante, por ejemplo, una región constante significa incrementar la vida media, la estabilidad o afinidad del anticuerpo, o una región constante de otras especies o clase de anticuerpo; o (iií) al modificar uno o más aminoácidos en la región constante para alterar, por ejemplo, el número de sitios de glucosilación, función de célula efectora, unión de receptor Fe (FcR), fijación de complemento, entre otros.

Los métodos para alterar una región constante de anticuerpo se conocen en la técnica. Los anticuerpos con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada para un ligando efector, tal como FcR sobre una célula, o el componente C1 del complemento se pueden producir al reemplazar por lo menos un residuo de aminoácido en la porción constate del anticuerpo con un residuo diferente (ver por ejemplo, EP 388, 151 A1 , US 5,624,821 y US 5,648,260, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia). El tipo similar de alteraciones se podría describir el cual si se aplica al murino, u otras especies de inmunoglobulina reducirían o eliminarían estas funciones.

Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de la región Fe de un anticuerpo (por ejemplo, un IgG, tal como un IgG humano) para un FcR (por ejemplo, FcyR1), o para la unión C1q al reemplazar el o los residuos especificados con uno o unos residuos que tengan una funcionalidad apropiada sobre su cadena lateral, o al introducir un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato o quizás un residuo no polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triftófano, o alanina (ver por ejemplo, US 5,624,821).

El anticuerpo o fragmento de unión de éste se puede conjugar con una citotoxina, un agente terapéutico, o un ión de metal radioactivo. En una modalidad, la proteína que se conjuga es un anticuerpo o fragmento de ésta. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Ejemplos no limitantes incluyen, caliqueamicina, taxol, citochalasin B, gramicidin D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, puromicina, y análogos, u homólogos de éstos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, y 5-fluoracil decarbazina), agentes alquilatanes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, camustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina, belomicina, mitramicina, y antramicina), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Las técnicas para conjugar tales grupos funcionales a proteínas son bien conocidas en la técnica.

Alternativamente, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, luego de inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homogénea del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JM) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpo. La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos luego de la exposición a antígeno. Ver, por ejemplo, Jackobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jackobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immune, 7:33 (1983); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Los anticuerpos humanos también se pueden derivar de las colecciones que despliegan fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención se pueden administrar en combinación con otros agentes como parte de una terapia de combinación. Por ejemplo, en el caso de condiciones inflamatorias, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes útiles en el tratamiento de enfermedades o condiciones inflamatorias. En el caso de condiciones de enfermedad cardiovascular, y particularmente aquellas que surgen de placas ateroescleróticas, que se cree que tienen un componente inflamatorio sustancial, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En el caso de cáncer, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más factores anti-angiogénicos, quimioterapéuticos, o como un adyuvante de radioterapia. Se prevé además que la administración de los anticuerpos objeto servirá como parte de un régimen de tratamiento de cáncer que puede combinar muchos diferentes agentes terapéuticos de cáncer. En el caso de IBD, los anticuerpos objeto se pueden administrar con uno o más agentes anti-inflamatorios, y pueden combinarse adicionalmente con un régimen de dieta modificado.

Métodos para Inhibir una Interacción entre un RAGE-LBE y un RAGE-BP La invención incluye métodos para inhibir la interacción entre RAGE y RAGE-BP, o modular la actividad RAGE. Preferiblemente tales métodos se utilizan para tratar trastornos asociados con RAGE.

Tales métodos pueden comprender administrar un anticuerpo elevado a RAGE como se describe aquí. Tales métodos comprenden administrar un anticuerpo que se une específicamente a uno o más epítopos de una proteína RAGE que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , o SEQ ID NO:13. En aún otra modalidad, tales métodos comprenden administrar un compuesto que inhibe ia unión del RAGE a uno o más de los RAGE-BP. Los métodos de ejemplo para identificar tales compuestos se discuten adelante.

En ciertas modalidades, la interacción se inhibe in vitro, tal como en una mezcla de reacción que comprende proteínas purificadas, células, muestras biológicas, tejidos, tejidos artificiales, etc. En ciertas modalidades, la interacción se inhibe in vivo, por ejemplo, al administrar un anticuerpo que se une a RAGE o a un fragmento que se une a RAGE de éste. El anticuerpo o fragmento de éste se une a RAGE e inhibe la unión de un RAGE-BP.

La invención incluye métodos para evitar o tratar un trastorno relacionado con RAGE al inhibir la interacción entre RAGE y RAGE-BP, o modular la actividad RAGE. Tales métodos incluyen administrar un anticuerpo a RAGE en una cantidad efectiva para inhibir la interacción y durante un tiempo suficiente para evitar o tratar dicho trastorno. Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de éstos en forma de cadena única, cadena doble, o triplexada. A menos que se limiten específicamente, los ácidos nucleicos pueden contener análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades similares como el ácido nucleico natural de referencia. Los ácidos nucleicos incluyen genes, cADN, mARN, y cARN. Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar, o se pueden derivar de cualquier fuente biológica, que incluye cualquier organismo.

Los ácidos nucleicos representativos de la invención comprenden una secuencia de nucleótido que codifica el RAGE mostrado en una cualquiera de las SEQ IDN NOs: 6, 8, 10, 12, que corresponden a los cADN que codifican el RAGE de babuino, mono cinomólogo, y conejo, o el mostrado en la SEQ ID NO: 15, que corresponde a una secuencia de ADN genómico que codifica el RAGE de babuino. Los ácidos nucleicos de la invención también comprenden una secuencia de nucleótido que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácido de la región variable del anticuerpo mostrado en las SEQ ID Nos: 16-49.

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden comprender una secuencia de nucleotido que sea sustancialmente idéntica a una cualquiera de las SEQ ID Nos: 6, 8, 10, 12, y 15, que incluyen las secuencias de nucleótidos que son por lo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% idénticas con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 6, 8, 10, 12, y 15.

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden comprender una secuencia de nucleotido que codifica una proteína RAGE que tiene una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica con cualquiera de las secuencias de aminoácido mostradas en las SEQ ID Nos: 7, 9, 11 , y 13, que incluyen las secuencias de nucleotido que son por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% idénticas con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 7, 9, 1 1 , y 13.

Los ácidos nucleicos de la invención también pueden comprender una secuencia de nucleotido que codifica una región variable de anticuerpo anti-RAGE que tiene una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica con cualquiera de las secuencias de aminoácido mostradas en las SEQ ID Nos: 16-49, que incluye una secuencia de nucleotido que codifica una secuencia de aminoácido que es por lo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.9% idéntica con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 16-49.

Las secuencias se comparan para correspondencia máxima utilizando un algoritmo de comparación de secuencia que utiliza una secuencia que codifica la región variable de longitud completa de cualquiera de las SEQ ID Nos: 16-49, una secuencia de nucleotido que codifica una región variable de longitud que tiene una cualquiera de las secuencias mostradas en las SEQ ID Nos: 16-49 como la secuencia de consulta, como se describe aquí adelante, o mediante inspección visual.

Las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una población. Una diferencia alélica puede ser tan pequeña como un par base. Las secuencias sustancialmente idénticas también pueden comprender secuencias mutagenizadas, que incluyen secuencias que comprenden mutaciones silentes. Una mutación puede comprender uno o más cambios de residuo, una supresión de uno o más residuos, o una inserción de uno o más residuos adicionales.

Los ácidos nucleicos sustancialmente idénticos también se identifican como ácidos nucleicos que hibridan específicamente a o hibridan sustancialmente a la longitud completa de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 6, 8, 10, 12, o 15, o a la longitud completa de cualquier secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido RAGE mostrada en las SEQ ID Nos: 7, 9, 1 1 , y 13, o que codifica a la secuencia de aminoácido de la región variable de anticuerpo mostrada en las SEQ ID Nos: 16-49, bajo condiciones estrictas. En el contexto de la hibridación del ácido nucleico, las dos secuencias de ácido nucleico que se comparan se pueden designar como una sonda y un objetivo. Una sonda es una molécula de ácido nucleico de referencia, y un objetivo es una molécula de ácido nucleico de prueba, a menudo encontrado dentro de la población heterogénea de las moléculas de ácido nucleico. Una secuencia objetivo es sinónima con una secuencia de prueba.

Para estudios de hibridación, las sondas útiles son complementarias a o semejan por lo menos aproximadamente 14 a 40 nucleótidos secuencia de una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Preferiblemente, las sondas comprenden 14 a 20 nucleótidos, o aún mayores donde se desea, tal como 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300, o 500 nucleótidos o hasta la longitud completa de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 6, 8, 10, 12, o 15, o a la longitud completa de una secuencia de nucleótido cualquiera que codifica una secuencia de aminoácido RAGE mostrada en las SEQ ID Nos: 7, 9, 1 1 , y 13, o que codifica una secuencia de aminoácido de la región variable de anticuerpo mostrada en las SEQ ID Nos: 16-49. Tales fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, mediante síntesis química del fragmento, mediante la aplicación de tecnología de amplificación de ácido nucleico, o al introducir secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante.

La hibridación específica se refiere a la unión, duplexación, o hibridación de una molécula solamente a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones estrictas cuando esa secuencia está presente en una mezcla de ácido nucleico de complejo (por ejemplo, ADN o ARN celular total). La hibridación específica puede acomodar faltas de coincidencia entre la sonda y la secuencia objetivo dependiendo de la exigencia de las condiciones de hibridación.

Las condiciones de hibridación exigentes y las condiciones de lavado de hibridación exigentes en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tal como los análisis Southern y Northern blot son ambas dependientes de secuencia y del ambiente. Las mayores secuencias hibridan específicamente a mayores temperaturas. Una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I capítulo 2, Elsevier, New York, New York. En general, la hibridación y las condiciones de lavado altamente estrictas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración y pH iónicos definidos. Típicamente, bajo condiciones estrictas una sonda se hibridará específicamente a su subsecuencia objetivo, pero no a otras secuencias.

La Tm es la temperatura (bajo concentración y pH iónico definido) en la cual el 50% de la secuencia objetivo híbrida a una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy estrictas para ser iguales al Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas para el análisis Southern o Northern Blot de los ácidos nucleicos complementarios que tienen más de aproximadamente 100 residuos complementarios es la hibridación durante la noche en 50% de formamida con 1 mg de heparina a 42°C. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente estrictas es 15 minutos en 0.1X SSC a 65°C. Un ejemplo de condiciones de lavado estrictas es 15 minutos en 0.2X amortiguador SSC a 65°C. Ver, Sambrook et al., eds (1989) Molecular Cloninq. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, para una descripción del amortiguador SSC. A menudo, se precede un lavado se alta exigencia por un lavado de baja exigencia para remover la señal de sonda de trasfondo. Un ejemplo del medio de las condiciones de lavado de exigencia para un dúplex de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es 15 minutos en 1X SSC a 45°C. Un ejemplo de lavado de baja exigencia para un dúplex de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es 15 minutos en 4X por 6X SSC a 40°C. Para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones estrictas involucran típicamente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1 M del ión Na+, típicamente aproximadamente 0.01 a 1M de concentración de ión Na+ (u otras sales) a pH 7.0-8.3, y la temperatura es típicamente por lo menos aproximadamente de 30°C. Las condiciones estrictas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una señal a proporción de ruido de 2 veces (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.

Los siguientes son ejemplos de hibridación y condiciones de lavado que se pueden utilizar para identificar las secuencias de nucleótido que son sustancialmente idénticas con las secuencias de nucleótido de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótido sonda preferiblemente híbrida una secuencia de nucleótido objetivo en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), 0.5M de NaP04, 1 mM de EDTA a 50°C seguido por lavado en 2X SSC, 0.1% SDS a 50°C; más preferiblemente, una sonda y una secuencia objetivo hibridan en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5M de NaP04, 1 mM de EDTA a 50°C seguido por lavado en 1X SSC, 0.1 % SDS a 50°C; más preferiblemente, una sonda y una secuencia objetivo hibridan en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5M de NaP04, 1 mM de EDTA a 50°C seguido por lavado en 0.5X SSC, 0.1 % SDS a 50°C; más preferiblemente, una sonda y una secuencia objetivo hibridan en 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5M de NaP04, 1 mM de EDTA a 50°C seguido por lavado en 0.1X SSC, 0.1% SDS a 50°C; más preferiblemente, una sonda y una secuencia objetivo hibridan en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), 0.5M de NaP0 , 1 mM de EDTA a 50°C seguido por lavado en 0.1 X SSC, 0.1% SDS a 65°C.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las proteínas codificadas por los ácidos nucleicos sean sustancialmente idénticas, compartan una estructura tridimensional total, o sean equivalentes biológicamente funcionales. Estos términos se definen adicionalmente aquí adelante. Las moléculas de ácido nucleico que no hibridan una a la otra bajo condiciones estrictas son aún sustancialmente idénticas si las proteínas correspondientes son sustancialmente idénticas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando dos secuencias de nucleótido comprenden variantes conservadoramente sustituidas como se permite por el código genético.

Las variantes conservadoramente sustituidas son secuencias de ácido nucleico que tienen sustituciones de codón degeneradas en donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituyen con residuos de base mezclados y/o desoxinosina. Ver Batzer et al. (1991 ) Nucleic Acids Res. 19:5081 ; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; y Rossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91 -98.

Los ácidos nucleicos de la invención también comprenden ácidos nucleicos complementarios a una cualquiera de las SEQ ID Nos: 6, 8, 10, 12, o 15, o las secuencias de nucleótido que codifican una secuencia de aminoácido RAGE mostrada en las SEQ ID Nos: 7, 9, 1 1 , y 13, o una secuencia de aminoácido de región variable de anticuerpo mostrada en las SEQ ID Nos: 16-49, y secuencias complementarias de éstas. Las secuencias complementarias son dos secuencias de nucleótido que comprenden secuencias de nucleótido antiparalelas capaces de parearse una con la otra luego de la formación de los enlaces de hidrógeno entre los pares base. Como se utiliza aquí, el término secuencias complementarias significa secuencias de nucleótido que son sustancialmente complementarias, como se puede evaluar por los mismos métodos de comparación de nucleótido establecidos adelante, o se define como ser capaces de hibridar al segmento de ácido nucleico en cuestión bajo condiciones relativamente estrictas tales como aquellas descritas aquí. Un ejemplo particular de un segmento de ácido nucleico complementario es un oligonucléotido anticodificante.

Una subsecuencia es una secuencia de ácidos nucleicos que comprenden una parte de una secuencia de ácido nucleico mayor. Una subsecuencia de ejemplo es una sonda, descrita aquí anteriormente, o un iniciador. El término iniciador como se utiliza aquí se refiere a una secuencia contigua que comprende aproximadamente 8 o más desoxiribunocleótidos o ribunocleótidos, preferiblemente 10-20 nucleótidos, y más preferiblemente 20-30 nucleótidos de una molécula de ácido nucleico seleccionada. Los iniciadores de la invención comprenden oligonucleótidos de suficiente longitud y secuencia apropiada con el fin de suministrar la iniciación de la polimerización sobre una molécula de ácido nucleico de la presente invención.

Una secuencia alargada comprende nucleótidos adicionales (u otras moléculas análogas) incorporadas en el ácido nucleico. Por ejemplo, una polimerasa (por ejemplo, una polimerasa de ADN) puede agregar secuencias en el terminal 3' de la molécula de ácido nucleico. Además, la secuencia de nucleótido se puede combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, regiones promotoras, mejoradores, señales de poliadenilación, secuencias intrónicas, sitios de enzima de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, y otros segmentos de codificantes. Así, la invención también suministra vectores que comprenden los ácidos nucleicos descritos, que incluyen vectores para la expresión recombinante, en donde un ácido nucleico de la invención está operativamente ligado a un promotor funcional. Cuando se liga operativamente a un ácido nucleico, un promotor es una combinación funcional con el ácido nucleico de tal forma que la trascripción del ácido nucleico se controla y se regula por la región promotora. Los vectores se refieren a ácidos nucleicos capaces de replicación en una célula huésped, tal como plásmidos, cósmicos, y vectores virales.

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden clonar, sintetizar, alterar, mutagenizar, o combinaciones de éstos. El ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular utilizados para aislar los ácidos nucleicos se conocen en la técnica. La mutagenia específica de sitio para crear los cambios de par base, las supresiones, o las inserciones pequeñas también se conoce en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New YorK; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.)(1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New York.

Métodos de Tratamiento La invención se relaciona con e incluye métodos para tratar trastornos relacionados con RAGE o asociados con RAGE. Los trastornos relacionados con RAGE se pueden caracterizar en general por incluir cualquier trastorno en el cual una célula afectada exhiba la expresión elevada de RAGE o uno o más ligandos RAGE. Los trastornos relacionados con RAGE también se pueden caracterizar como cualquier trastorno que es tratable (es decir, se pueden eliminar o mejorar uno o más síntomas) mediante la disminución en la función RAGE. Por ejemplo, la función RAGE se puede disminuir mediante la administración de un agente que afecta la interacción entre RAGE y un RAGE-BP, tal como un anticuerpo a RAGE.

La expresión creciente de RAGE se asocia con varios estados patológicos, tales como vasculopatía diabética, nefropatía, retinopatía, neuropatía, y otros trastornos, que incluyen reacciones inmunes/inflamatorias de las paredes de los vasos sanguíneos e sepsis. Los ligandos RAGE se producen en tejido afectado con muchos trastornos inflamatorios, que incluyen artritis (tal como artritis reumatoide). En tejidos diabéticos, se cree que la producción de RAGE se origina por la sobre producción de productos finales de glucación avanzada. Esto da como resultado tensión oxidativa y disfunción de célula endotelial que conduce a enfermedad vascular en diabéticos.

La invención incluye un método para tratar inflamación y enfermedades o condiciones caracterizadas por la activación de la cascada de citocina inflamatoria en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo antí-RAGE o un fragmento de unión RAGE de éstos y/o una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende un anticuerpo anti-RAGE o un fragmento de unión RAGE de éstos. Por ejemplo, las S100/calgranulinas han mostrado comprender una familia de polipéptidos de unión de calcio cercanamente relacionados caracterizados por dos regiones EF-hand ligadas por un péptido de conexión (por ejemplo, ver Schafer et al., 1996, TIBS, 21 : 134-140; Zimmer et al., 1995, Brain Res. Bull. , 37:417-429; Rammes et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:9496-9502; Lugering et al., 1995, Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664). Aunque a ellos les faltan péptidos de señal, se ha conocido durante largo tiempo que las S100/calgranulinas ganan acceso al espacio extracelular, especialmente en sitios de respuestas inmunes/inflamatorias crónicas, como en fibrosis quística y artritis reumatoide. El RAGE es un receptor para muchos miembros de la familia S100/calgranulina, que media sus efectos proinflamatorios sobre células tales como linfocitos y fagocitos mononucleares. También, los estudios sobre respuesta a la hipersensibilidad tipo retrasado, colitis en ratones nulos IL-10, artritis inducida por colágeno, y modelos de encefalitis auto-inmune experimental sugieren que la interacción RAGE-ligando (presumiblemente con S100/calgranulinas) tiene un papel próximo en la cascada inflamatoria. Una condición inflamatoria que sea adecuada para los métodos de tratamiento descritos aquí puede ser una en la cual se active la cascada de citocina inflamatoria.

La cascada de citocina inflamatoria puede causar una reacción sistémica, como ocurre con el choque séptico. Los anticuerpos anti-RAGE y los fragmentos de unión RAGE de éstos de la invención se pueden utilizar para tratar la sepsis, el choque séptico, y la listeriosis sistémica. La sepsis es una respuesta inflamatoria sistémica a la sepsis, y se asocia con la disfunción de órgano, la hipoperfusión, o la hipotensión. En el choque séptico, una forma severa de sepsis, la hipotensión se induce a pesar de la resucitación de fluido adecuada. La listeriosis es una sepsis seria causada al comer alimentos contaminados con la bacteria Listeria monocitogenes. El RAGE ha mostrado que media los efectos letales del choque séptico (Liliensek et al., 2004, 1 13:11641-50). La sepsis tiene una fisiología compleja, definida por la inflamación sistémica y la disfunción del órgano, que incluye anormalidades en la temperatura del cuerpo; parámetros cardiovasculares y conteo de leucocitos; enzimas de hígado elevadas y la función cerebral alterada La respuesta en la sepsis es a una sepsis o estímulo que se amplifique y se desregule. El modelo de sepsis CLP de murino da como resultado una sepsis polimicrobiana, con absceso abdominal y bacteremia, y recrea las fases hemodinámica y metabólica observada en enfermedad humana. Los resultados experimentales obtenidos con el modelo de sepsis CLP de murino descritos aquí muestran que el RAGE juega un papel importante en la patogenia de la sepsis. Los datos también demuestran que la administración de un anticuerpo anti-RAGE que se une específicamente a RAGE al momento de la cirugía, así como también hasta 36 horas después de la cirugía, suministran una protección terapéutica significativa a los ratones, como se evidencia mediante la supervivencia creciente y las calificaciones de patología mejorada. Los anticuerpos utilizados para el tratamiento de sepsis, listeriosis, y otras enfermedades relacionadas con RAGE pueden ser anticuerpos que se unen en el dominio V de RAGE para evitar que un ligando RAGE o un compañero de unión se unan a la proteína RAGE.

La condición inflamatoria que se trata o se evita por los anticuerpos y los métodos de la invención se puede mediar mediante una cascada de citocina inflamatoria localizada, como en la artritis reumatoide. Ejemplos no limitantes de condiciones inflamatorias que pueden ser útilmente tratadas utilizando anticuerpos anti-RAGE y fragmentos de unión RAGE de éstos y/o las composiciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, enfermedades que involucran los tejidos del tracto gastrointestinal y asociados (tal como el íleo, apendicitis, , úlcera péptica, gástrica y duodenal, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerativa, pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, enfermedad coeliaca, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis, y enfermedad de Whipple); enfermedades y condiciones inflamatorios sistémico y local (tales como asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad de complejo inmune, isquemia de órgano, daño por reperfusión, necrosis de órgano, fiebre de heno, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granulomatosis, y sarcoidosis); enfermedades que involucran el sistema urogenital y tejidos asociados (tal como aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis, y uretritis); enfermedades que involucran el sistema respiratorio y tejidos asociados (tal como, bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis cística, neumonitis, síndrome de tensión respiratoria de adulto, neumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis, alvealitis, bronquiolitis, faringitis, pleurisia, y sinusitis); enfermedades que surgen de infección por varios virus (tal como influenza, virus sincital respiratorio, VIH, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y herpes), bacterias (tal como bacteremia diseminada, fiebre de Dengue), hongos (tal como candidiasis) y parásitos protozóicos y multicelulares (tal como malaria, filariasis, amebiasis, y quistes hidatidicos); enfermedades dermatológicas y condiciones de la piel (tal como quemaduras, dermatitis, dermatomiositis, quemaduras de sol, verrugas de urticaria, y ronchas); enfermedades que involucran el sistema cardiovascular y tejidos asociados (tal como estenosis, reestenosis, vasculitis, angiitis, endocarditis, arteritis, ateroesclerosis, tromboflebitis, pericarditis, falla cardiaca congestiva, miocarditis, isquemia del miocardio, periarteritis nodosa, y fiebre reumática); enfermedades que involucran el sistema nervioso central o periférico y tejidos asociados (tal como meningitis, encefalitis, esclerosis múltiple, infarto cerebral, embolismo cerebral, síndrome de Guillame-Barre, neuritis, neuralgia, daño de la columna vertebral, parálisis, y uveitis); enfermedades de los huesos, articulaciones, músculos y tejidos conectivos (tal como varias artritis y artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, y sinovitis); otros trastornos autoinmunes e inflamatorios (tal como miastenia gravis, trioiditis, lupus sistémico eritematoso, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcets, rechazo de haloinjerto, enfermedad de injerto versus huésped, diabetes tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, y síndrome de Retier); así como también varios cánceres, tumores y trastornos prolíferatívos (tales como enfermedad de Hodgkins); y, en cualquier caso la respuesta inflamatoria o inmune de huésped a cualquier enfermedad primaria.

Los anticuerpos anti-RAGE y los fragmentos de unión RAGE de éstos de la invención se pueden utilizar para tratar cáncer. Las células tumorosas evidencian una expresión creciente de un ligando RAGE, particularmente anfoterina, una proteína de unión de ADN cromosómica no histona del grupo I de alta movilidad (Rauvala et al., J. Biol. Chem., 262: 16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem., 268: 19726-19738 (1993)) que ha mostrado que interactúa con RAGE. La anfoterita promueve un producto de neurita, así como también sirve como una superficie para el montaje de complejos de proteasa en el sistema fibrinolítico (también conocido por contribuir a la movilidad de la célula) indicando que los cánceres también son un trastorno relacionado con RAGE. Los efectos oxidativos y otros aspectos de la inflamación crónica también tienen un efecto contribuyente a la génesis de ciertos tumores. Por ejemplo, además, un efecto inhibitorio de crecimiento de tumor local del bloqueo RAGE se ha observado en un modelo de tumor primario (glioma C6), el modelo de metástasis de pulmón Lewis (Taguchi et al., 2000, Nature 405:354-360), y los papilomas de surgimiento espontáneo en ratones que expresan el transgen v-Ha-ras (Leder et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci., 87:9178-9182).

Los anticuerpos o fragmentos de unión de éstos de la invención se pueden utilizar para tratar o evitar la diabetes, complicaciones de la diabetes, y condiciones patológicas asociadas con la diabetes. Se ha mostrado que la glicoxidación no enzimática de macromoléculas resultan finalmente en la formación de productos finales de glucación avanzada (AGE) que se mejora en sitios de inflamación, en falla renal, en la presencia de hiperglicemia y en otras condiciones asociadas con tensión oxidante sistémica o local (Dyer et al., J. Clin. Invest., 91 :2463-2469 (1993); Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem. 266:1 1654-1 1660 (1991 ); Degenhardt et al., Cell Mol. Biol. 44:1 139-1 145 (1998)). La acumulación de los AGE en la vasculatura puede ocurrir focalmente, como en la unión amiloide compuesta de AGE-32-microglobulina encontrada en pacientes con amiloidosis relacionada con diálisis (Miyata et al., J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest., 98: 1088-1094 (1996)), o en general, como se ejemplifica mediante la vasculatura y los tejidos de pacientes con diabetes (Schmidt et al., Nature Med. , 1 : 1002-1004 (1995)). La acumulación progresiva de los AGE durante el tiempo en pacientes con diabetes sugiere que los mecanismos de limpieza endógena no son capaces de funcionar efectivamente en sitios de deposición AGE. Tales AGE acumulados tienen la capacidad de alterar las propiedades celulares por un número de mecanismos. Aunque el RAGE se expresa a bajos niveles en tejidos y vasculatura normal, en un ambiente donde los ligandos del receptor se acumulan, se ha mostrado que el RAGE se regula hacia arriba (Li et al., J. Biol. Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al., J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790(2000)). La expresión RAGE se incrementa en el endotelio, las células musculares lisas e infiltra los fagocitos mononucleares en vasculatura diabética. También, los estudios en cultivo celular han demostrado que la interacción AGE-RAGE origina cambios en las propiedades celulares importantes en la homeostasis vascular.

Los anticuerpos anti-RAGE o fragmentos de unión de éstos también se pueden utilizar para tratar disfunción eréctil. La activación RAGE produce oxidantes por vía de una enzima similar a NADH oxidasa, suprimiendo por lo tanto la circulación del óxido nítrico, que es el principal estimulador de la relajación muscular lisa cavernosa que resulta en la erección del pene. Al inhibir la activación de las sendas de señalización RAGE, se atenúa la generación de oxidantes.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión de éstos de la invención se pueden utilizar para tratar o evitar la ateroesclerosis. Se ha mostrado que la enfermedad cardiaca isquémica es particularmente alta en pacientes con diabetes (Robertson, et al., Lab Invest, 18:538-551 (1968); Kannel et al., J. Am. Med. Assoc, 241 :2035-2038 (1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)). Además, estudios han mostrado que la ateroesclerosis en pacientes con diabetes es más acelerada y extensiva que en pacientes que no sufren de diabetes (ver, por ejemplo, Waller et al., Am. J. Med. 69:498-506 (1980); Crall et al., Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et. Al., Chest. 2:251-257 (1976); y Pyorala et al., Diaib. Metab. Rev., 3:463-524 (1987)). Aunque las razones para la ateroesclerosis acelerada en la configuración de la diabetes son muchas, se ha mostrado que la reducción de los AGE puede reducir la formación de placa.

De acuerdo con esto, la lista de los trastornos relacionados con RAGE que se pueden tratar o evitar con una composición de la invención incluyen: enfermedad inflamatoria aguda (tal como sepsis), choque (por ejemplo, choque séptico, choque hemorrágico), enfermedad inflamatoria crónica (tal como artritis reumatoide y soriásica, osteoartritis, colitis ulcerativa, enfermedad del intestino irritable, esclerosis múltiple, soriasis, lupus, nefritis de lupus sistémico, y nefritis de lupus inflamatorio, y otras enfermedades autoinmunes), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, ateroesclerosis, ataques, trastorno de placa frágil, angina y reestenosis), diabetes (y particularmente enfermedades cardiovasculares en diabéticos), complicaciones de la diabetes, disfunción eréctil, cánceres (por ejemplo, cáncer de pulmón, carcinoma de célula escamosa, cáncer de próstata, cáncer pancreático humano, melanoma de carcinoma celular renal), vasculitis y otros síndromes de vasculitis tal como vasculitis necrotizante, nefropatías, retinopatías, y neuropatías.

La invención suministra la administración de anticuerpos anti-RAGE y fragmentos de unión RAGE in vivo. Los anticuerpos objeto se pueden administrar como composiciones farmacéuticas, y también se pueden administrar con uno o más agentes adicionales. La administración de los anticuerpos objeto pueden ser parte de un régimen terapéutico para tratar una condición particular. Las condiciones que se pueden tratar mediante la administración de los anticuerpos solos, o por la administración de los anticuerpos objeto en combinación con otros agentes, incluyen trastornos asociados con RAGE. Por vía de ejemplo, los trastornos asociados con RAGE incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, ateroesclerosis, vasculitis y otros síndromes de vasculitis tales como vasculitis necrotizante. La enfermedad de Alzheimer, cáncer, complicaciones de la diabetes tal como retinopatia diabética, enfermedades auto-inmunes tales como soriasis y lupus. Los trastornos asociados con RAGE incluyen además enfermedades inflamatorias agudas (por ejemplo, sepsis), enfermedades inflamatorias crónicas, y otras condiciones que se agravan por la inflamación (es decir, cuyos síntomas se pueden mejorar al disminuir la inflamación).

Los métodos de administración del anticuerpo basado en composiciones puede ser cualquiera de un número de métodos bien conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen la administración local o sistémica y además incluyen rutas de administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, e intranasal, incluyendo el uso de un nebulizador e inhalación. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier ruta adecuada, incluyendo inyección intraventricular o intratecal. La inyección intraventricular se puede facilitar por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un reservorio, tal como un reservorio Ommaya. Los métodos de introducción también se pueden suministrar por dispositivos recargables o biodegradables, por ejemplo, depósitos. Adicionalmente, se contempla que la administración puede ocurrir al recubrir un dispositivo, implante, stent, o prótesis.

Por ejemplo, cartílago severamente dañado por condiciones de las articulaciones tales como artritis reumatoide y osteoartritis se pueden reemplazar, en todo o en parte, por varias prótesis. Existe una variedad de materiales trasplantares adecuados que incluyen aquellas basadas en moldes de colágeno - glicosaminoglican (Stone et al. (1990) Clin. Orthop. Relat. Red. 252: 129), condrocitos aislados (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7: 208; y Taligawa et al. (1987) Bone Miner 2: 449), y condrocitos unidos a polímeros naturales o sintéticos (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71 B: 74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88: 753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27: 11 ; y la Vacanti et al. Patente U.S. No. 5,041 ,138). Por ejemplo, los condrocitos pueden crecer en cultivo sobre andamios altamente porosos biocompatibles, biodegradables formados de polímeros tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, gel de agarosa, u otros polímeros que se degradan durante el tiempo como una función de la hidrólisis de la estructura del polímero en monómeros inocuos. Las matrices se diseñan para permitir los nutrientes adecuados y el intercambio de gas a las células hasta que ocurra el injerto. Las células se pueden cultivar in vitro hasta que un volumen y densidad de célula adecuada se haya desarrollado para las células que se van a implantar. Una ventaja de las matrices es que ellas se pueden fundir o moldear en una forma deseada sobre una base individual, de tal forma que el producto final se semeja cercanamente a la oreja o nariz propia del paciente (por vía de ejemplo), o se pueden utilizar matrices flexibles que permitan la manipulación al momento del implante, como en una articulación.

Estos y otros implantes y prótesis se pueden tratar con y utilizar para administrar los anticuerpos objeto o los fragmentos de unión de éstos. Por ejemplo, una composición que incluya el anticuerpo o el fragmento de unión se puede aplicar a o recubrir sobre el implante o prótesis. De esta manera, los anticuerpos o fragmentos de éstos se pueden administrar directamente al tejido afectado específico (por ejemplo, a la articulación dañada).

Los anticuerpos objeto se pueden administrar como parte de una terapia de combinación con otros agentes. La terapia de combinación se refiere a cualquier forma de administración en combinación con dos o más diferentes compuestos terapéuticos de tal forma que el segundo compuesto se administra aunque el compuesto terapéutico previamente administrado es aún efectivo en el cuerpo (por ejemplo, los dos compuestos son simultáneamente efectivos en el paciente, lo cual puede incluir efectos sinérgicos de los dos compuestos). Por ejemplo, los diferentes compuestos terapéuticos se pueden administrar en la misma formulación o en una formulación separada, concomitante o secuencialmente. Así, un individuo que recibe tal tratamiento puede tener un efecto combinado (conjunto) de diferentes compuestos terapéuticos.

Por ejemplo, en el caso de condiciones inflamatorias, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes útiles en el tratamiento de enfermedades o condiciones inflamatorias. Los agentes útiles en el tratamiento de las enfermedades o condiciones inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, agentes antiinflamatorios, o antiflogísticos. Los antiflogísticos incluyen, por ejemplo, glucocorticoides, tales como cortisona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, fluorcortolona, triamcinolona, metilprednisolona, prednilideno, parametasona, dexametasona, betametasona, beclometasona, fluprednilideno, desoximetasona, fluocinolona, flunetasona, diflucortolona, clocortolona, clobetasol y fluocortin butil éster; agentes inmunosupresores tales como los agentes anti-TNF (por ejemplo, etanercept, infliximab) y los inhibidores IL-1 ; penicilamina; fármacos anti-inflamatorios no esteroides ((NSAID) que comprenden anti-inflamatorios, analgésicos, y fármacos antipiréticos tales como ácido salicílico, celecoxib, difunisal y de sales de ácido fenilacético sustituidas o sales de ácido 2-fenilpropiónico, tales como alclofenac, ibutenac, ibuprofeno, clindanac, fenclorac, cetoprofeno, fenoprofeno, indoprofeno, fenclofenac, diclofenac, flurbiprofeno, piprofeno, naproxeno, benoxaprofeno, carprofeno y cicloprofeno; derivados de oxican, tal como piroxican; derivados de ácido antranílico, tal como ácido mefenamico, ácido flufenamico, ácido tolfenamico y ácido meclofenamico, derivados de ácido nicotínico sustituidos con anilino, tal como ácido miflumico fenamatos, clonixin y flunixin; ácido heteroarilacéticos en donde el heteroarilo es un grupo 2-indol-3-il o pirrol-2-il, tal como indometacina, oxmetacina, intrazol, acemetazina, cinmetacina, zomepirac, tolmetina, colpirac y ácido tiaprofenico; ácido idenilacético del tipo sulindac; ácidos heteroariloxiacéticos analgésicamente activos, tales como benzadac; fenilbutazona; etodolac; nabunetona; y fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad (DMARD) tales como metotrexato, sales de oro, hidroxicloroquina, sulfasalazina, ciclosporina, azatioprina, y leflunomida.

Otros terapéuticos útiles en el tratamiento de enfermedades o condiciones inflamatorias incluyen antioxidantes. Los antioxidantes pueden ser naturales o sintéticos. Los antioxidantes son, por ejemplo, dismutasa superóxido (SOD), 21-aminoesteroides/aminocromanos, vitamina C o E, etc. Muchos otros antioxidantes se conocen bien por aquellos expertos en la técnica.

Los anticuerpos objeto pueden servir como parte de un régimen de tratamiento para una condición inflamatoria, que puede combinar muchos diferentes agentes antiinflamatorios. Por ejemplo, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más de los NSAID, DMARD, o inmunosupresores. En una modalidad de la solicitud, los anticuerpos o fragmentos objeto de éstos se pueden administrar en combinación con metotrexato. En otra modalidad, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con un inhibidor de TNF-a.

En el caso de condiciones de enfermedad cardiovascular, y particularmente aquellas que surgen de placas ateroescleróticas, que se cree que tienen un componente inflamatorio sustancial, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Los agentes útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, ß-bloqueadores tales como carvedilol, metoprolol, bucindolol, bisoprolol, atenolol, propanolol, nadolol, timolol, pindolol, y labetalol; agentes antiplaqueta tal como aspirina y ticlopidina; inhibidores de la enzima convertidota de angiotensina (ACE) tal como captopril, enalapril, lisinopril, benazopril, fosinopril, quinapril, ramipril, espirapril, y moexipril; y agentes disminuidotes de los lípidos tal como mevastatina, lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, y rosuvastatina.

En el caso de cáncer, los anticuerpos objeto se pueden administrar en combinación con uno o más factores anti-angiogénicos, quimioterapéuticos, o como un adyuvante a la radioterapia. Se prevé además que la administración de los anticuerpos objeto servirá como parte de un régimen de tratamiento de cáncer, que puede combinar muchos diferentes agentes terapéuticos de cáncer. Los anticuerpos o los fragmentos de unión de éstos se pueden ligar o acoplar a una citotoxina o a radioterapéuticos para matar las células cancerígenas que expresan RAGE. Tales anticuerpos o fragmentos de éstos se pueden administrar a un paciente de tal forma que el anticuerpo se unirá a las células de cáncer que expresan RAGE. En el caso de IBD, los anticuerpos objeto se pueden administrar con uno o más agentes anti-inflamatorios, y se pueden combinar adicionalmente con un régimen de dieta modificado.

Para el tratamiento de la sepsis y los trastornos o condiciones relacionadas con la sepsis tales como choque séptico, así como también para el tratamiento de listeriosis sistémica, los anticuerpos anti-RAGE de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes y regímenes terapéuticos para tratar la sepsis y los trastornos o condiciones relacionadas con la sepsis, o para tratar la listeriosis sistémica. Por ejemplo, la sepsis o la listeriosis se pueden tratar al administrar los anticuerpos objeto en combinación con antibióticos y/o otras composiciones farmacéuticas que son el estándar del cuidado de los síntomas particulares y el estado del paciente.

En un aspecto, la presente invención también suministra un método para inhibir la interacción de un AGE con RAGE en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto identificado por los métodos de la invención. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que es capaz de evitar la interacción del AGE/RAGE en un sujeto. De acuerdo con esto, la cantidad variará con el sujeto que se vaya a tratar. La administración del compuesto puede ser por hora, día, semana, mes, año o un evento único. Por ejemplo, la cantidad efectiva del compuesto puede comprender desde aproximadamente 1 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En una modalidad, la cantidad efectiva del compuesto comprende desde aproximadamente 1 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En una modalidad adicional, la cantidad efectiva de los compuestos comprende desde aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. La cantidad efectiva actual se establecerá mediante ensayos de dosis/respuesta utilizando métodos estándar en la técnica (Johnson et al., Diabetes. 42: 1 179, (1993)). Así, como se conoce por aquellos expertos en la técnica, la cantidad efectiva dependerá de la biodisponibilidad, bioactividad y biodegradabilidad del compuesto.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-RAGE y las composiciones de la invención se administran a un paciente necesitado de ellas en una cantidad suficiente para inhibir la liberación de citocina proinflamatoria de una célula y/o para tratar una condición inflamatoria. La invención incluye inhibir la liberación de citocina proinflamatoria por al menos 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, o 95%, como se evaluó utilizando los métodos descritos aquí u otros métodos conocidos en la técnica.

En una modalidad, el sujeto es un animal. En una modalidad, el sujeto es un humano. En una modalidad, el sujeto sufre de una enfermedad relacionada con AGE tal como diabetes, amiloidosis, falla renal, envejecimiento, o inflamación. En otra modalidad, el sujeto comprende un individuo con enfermedad de Alzheimer. En una modalidad alternativa, el sujeto comprende un individuo con cáncer. En aún otra modalidad, el sujeto comprende un individuo con lupus sistémico eritematoso, o nefritis de lupus inflamatorio.

Los anticuerpos objeto o los fragmentos de unión de éstos se pueden administrar en una dosis de desde aproximadamente 1 Mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En una modalidad, la cantidad efectiva del compuesto comprende desde aproximadamente 1 g/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. La longitud de la frecuencia del tratamiento dependerá entre otros del estado particular de la enfermedad así como también el estado del paciente.

Biomarcadores Los biomarcadores que miden la actividad de la enfermedad de la sepsis, tal como el CRP, IL-6, pro-calcitonina, pro-adrenomedulina, y los parámetros de coagulación (D-dímero, niveles de PAI-1 , proteína C, fibrinógeno) se pueden monitorear para caracterizar sujetos con relación al estado de la enfermedad y a la respuesta potencial y actual al tratamiento con los anticuerpos anti-RAGE de la invención.

Además, el RAGE soluble (sRAGE) se encuentra en el plasma como una forma secretada o una forma clivada de la membrana celular. Se ha desarrollado un ensayo para medir los niveles de plasma del sRAGE y también se puede utilizar para caracterizar los sujetos. En razón a que los anticuerpos de la invención se unen al sRAGE, la presencia del sRAGE en el plasma del paciente puede influenciar las farmacodinámicas del tratamiento con los anticuerpos de la invención, si el sRAGE está presente en concentraciones cercanas a las concentraciones del anticuerpo.

Ensayos de Selección de Fármaco En ciertas modalidades, la presente invención suministra ensayos para identificar anticuerpos de prueba que inhiban la unión de un RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, ß2-ingegrina, Mac-1 y p150,95) a un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE, como se describió anteriormente). En ciertas modalidades, los ensayos detectan anticuerpos de prueba que modulan las actividades de señalización del receptor RAGE inducido por un RAGE-BP seleccionado del grupo que consiste de HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-ingegrina, Mac-1 y p150,95. Tales actividades de señalización incluyen, pero no se limitan a, unirse a otros componentes celulares, enzimas activantes tales como quinasas de proteína activadas por mitógeno (MAPK), activar la actividad transcripcional NF-??, y similares.

Las proteínas de unión RAGE anteriormente anotadas son relevantes para señalizar las sendas involucradas en el crecimiento y la proliferación celular, incluyendo crecimiento celular canceroso. Por ejemplo, el S100P es un miembro de la familia S100 de las proteínas que se unen al calcio (> 20 miembros) y es una proteína de 95 aminoácidos aislada primero de la placenta. El S100P se expresa y se secreta mediante >90% de todos los tumores pancreáticos y la expresión se incrementa con la progresión del cáncer pancreático. El S100P también se expresa en el cáncer de pulmón, mama, próstata y colon, la expresión en las líneas celulares de colon está correlacionada con la resistencia a la quimioterapia y en el cáncer de pulmón, la alta expresión del S100P indica pobre prognosis. La transferencia de gen o la adición extracelular de S100P incrementa la proliferación celular tumoral, la motilidad, la invasión y la supervivencia de las células in vitro y el crecimiento tumoral y la metástasis in vivo, aunque silenciar la expresión del S100P da como resultado una disminución de la proliferación y la metástasis. El único receptor conocido para S100P es RAGE, cuya expresión se ha correlacionado con la invasión y la metástasis de carcinoma gástrico y glioma. Los inhibidores de RAGE abrogan los efectos de la interacción del S100P-RAGE sobre la señalización de la célula, la proliferación y la supervivencia y una proteína inhibitoria derivada de la anfoterina actúa como un antagonista para la interacción del S100P RAGE. Los anticuerpos anti-RAGE y la expresión del RAGE negativo dominante inhiben los efectos del S100P.

Una variedad de formatos de ensayo será suficiente y, a la luz de la presente descripción, aquellos no expresamente descritos aquí sin embargo serán comprendidos por un experto en la técnica. Los formatos de ensayo que se aproximan a tales condiciones como la formación de complejos de proteína, la actividad enzimática, se pueden generar en muchas formas diferentes, e incluyen ensayos basados en sistemas libres de célula, por ejemplo, proteínas purificadas o lisados de célula, así como también ensayos basados en célula que utilizan células intactas. Los ensayos de unión simple se pueden utilizar para detectar compuestos que inhiben la interacción entre un RAGE BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-integrina, Mac-1 y p150,95) y un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LB). Los compuestos a ser probados se pueden producir, por ejemplo, por bacterias, levaduras u otros organismos (por ejemplo, productos naturales), químicamente producidos (por ejemplo, moléculas pequeñas, que incluyen peptidomiméticos), o recombinantemente producidos.

En muchas modalidades, una célula se manipula después de incubación con un compuesto candidato y se ensaya para actividades de señalización del receptor RAGE inducido por un RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-ingegrina, Mac-1 y p150,95). En ciertas modalidades, los bioensayos para tales actividades incluyen los ensayos de actividad NF-?? (por ejemplo, NF-?? luciferasa o los ensayos de gen indicador GFP).

Los ejemplos de NF-?? luciferasa o los ensayos del gen indicador GFP se pueden llevar a cabo como se describe por Shona et al. (2002) FEBS Letters. 515: 1 19-126. En resumen, las células que expresan el receptor RAGE o una variante de éste se transfectan con con un gen indicador de NF-KB-luciferasa. Las células transfectadas se incuban entonces con un compuesto candidato. Posteriormente, la actividad de la luciferasa estimulada por NF-?? se mide en células tratadas con el compuesto o sin el compuesto. De manera alternativa, las células se pueden transfectar con un gen indicador NF-KB-GFP (Stratagene). Las células transfectadas se incuban entonces con un compuesto candidato. Posteriormente, la actividad del gen estimulado con NF-?? se monitorea al medir la expresión GFP con un microscopio de luz fluorescente/visible configurado o mediante análisis FACS.

En ciertas modalidades, la presente invención suministra proteína reconstituida de tal manera que las preparaciones incluyen un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE), y uno o más RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-ingegrina, Mac-1 y p150,95). Los ensayos de la presente invención incluyen ensayos de unión de proteína-proteína marcada in vitro, ¡nmunoensayos para unión de proteína, y similares. La proteína purificada también se puede utilizar para la determinación de la estructura tridimensional del cristal, que se puede utilizar para modelar las interacciones intermoleculares. El anticuerpo purificado también se puede utilizar para la determinación de la estructura tridimensional del cristal, que se puede utilizar para modelar las interacciones intermoleculares.

En ciertas modalidades de los ensayos presentes, un polipéptido RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-ingegrina, Mac-1 y p 150, 95) o un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE) puede ser endógeno a la célula seleccionada para soportar los ensayos. De manera alternativa, un polipéptido RAGE-BP o un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE) se pueden derivar de fuentes exógenas. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden introducir en la célula mediante técnicas recombinantes (tal como a través del uso de un vector de expresión), así como también microinyección del polipéptido mismo o del mARN que codifica el polipéptido.

En modalidades adicionales de los ensayos, un complejo entre un RAGE-BP y un polipéptido receptor se puede generar en células completas, que toman ventaja de las técnicas de cultivo celular para sostener los ensayos objeto. Por ejemplo, como se describe adelante, se puede constituir un complejo en un sistema de cultivo de célula eucariótica, incluyendo células de mamíferos y levaduras. Las ventajas para generar los ensayos objeto en una célula intacta incluyen la capacidad de detectar compuestos que son funcionales en un ambiente más cercanamente análogo a aquel del uso terapéutico de los compuestos. Adicionalmente, ciertas de las modalidades del ensayo in vivo, tal como los ejemplos dados adelante, están sujetos a análisis de alto rendimiento de los compuestos candidatos.

En ciertas modalidades in vitro del presente ensayo, un complejo reconstituido comprende una mezcla reconstituida de por lo menos proteínas semi-purificadas. Por semi-purificado, se significa que las proteínas utilizadas en la mezcla reconstituida se han separado previamente de otras proteínas celulares. Por ejemplo, en contraste con los lísados de célula, las proteínas involucradas en la formación del complejo están presentes en la mezcla con por lo menos 50% de pureza con relación a todas las otras proteínas en la mezcla, en una modalidad están presentes en 90-95% de pureza, en una modalidad adicional están presentes en 95-99% de pureza. En ciertas modalidades del método objeto, la mezcla de proteína reconstituida se deriva al mezclar proteínas altamente purificadas de tal forma que a la mezcla reconstituida le falta sustancialmente otras proteínas (tal como de origen celular) que podrían interferir con o alterar de otra manera la capacidad de medir el montaje y/o desmontaje del complejo.

En ciertas modalidades, el ensayo en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede lograr en cualquier vaso adecuado para contener los reactivos. Ejemplos incluyen placas microtítulo, tubos de ensayo y tubos micro-centrífugos.

En ciertas modalidades, los ensayos de selección de fármaco se pueden generar los cuales detectan los anticuerpos de prueba sobre la base de su capacidad para interferir con el montaje, estabilidad o función de un complejo entre un RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-ingegrina, Mac-1 y p150,95) y un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE). En un ensayo de unión de ejemplo, el compuesto de interés se pone en contacto con una mezcla que comprende un polipéptido RAGE-LBE y un RAGE-BP tal como HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-¡ngegrina, Mac-1 y p150,95. La detección y cuantificación del complejo suministra un medio para determinar la eficacia del compuesto e inhibir la interacción entre los dos componentes del complejo. La eficacia del compuesto se puede valorar al generar las curvas de respuesta de dosis de los datos obtenidos utilizando varias concentraciones del anticuerpo de prueba. Más aún, se puede desarrollar un ensayo de control para suministrar una línea base para comparación. En el ensayo de control, la formación de los complejos está cuantificada en la ausencia del anticuerpo de prueba. En ciertas modalidades, la asociación entre los dos polipéptidos en un complejo (por ejemplo, un RAGE-BP y un polipéptido receptor), se pueden detectar por una variedad de técnicas, muchas de las cuales se describen efectivamente anteriormente. Por ejemplo, la modulación en la formación de complejos se puede cuantificar utilizando, por ejemplo, proteínas detectablemente marcadas (por ejemplo, radiomarcadas, marcadas fluorescentemente, o marcadas enzimáticamente), mediante el inmunoensayo, por un ensayo de dos híbridos, o por una detección cromatográfica. Los sistemas de resonancia del plasmón de superficie, tal como aquellos disponibles de Biacore International AB (Uppsala, Suecia), también se pueden utilizar para detectar la interacción proteína-proteína.

En ciertas modalidades, un polipéptido en un complejo que comprende un RAGE BP y un polipéptido receptor, se puede inmovilizar para facilitar la separación del complejo de formas no complejadas del otro polipéptido, así como también para acomodar la automatización del ensayo. En una modalidad ilustrativa, se puede suministrar un anticuerpo que agrega un dominio que le permite al anticuerpo unirse a una matriz insoluble. Por ejemplo, un anticuerpo se puede absorber sobre microesferas de glutationa cefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas microtítulo derivadas de glutationa, o unidas directa o indirectamente a microesferas magnéticas, que se combinan entonces con una proteína de interacción potencial (por ejemplo, un polipéptido S100 marcado con 35S, u otro marcado con RAGE-BP), y el anticuerpo de prueba se incuba bajo condiciones que conducen a la formación de complejo. Luego de la incubación, las microesferas se lavan para remover cualquier anticuerpo interactuante no unido, y la matriz de radiomarcador unido a microesfera determinada directamente (por ejemplo, microesferas colocadas en destello), o en el sobrenadante después de que se disocian los complejos, por ejemplo, cuando se utiliza una placa microtítulo.

Alternativamente, después de lavar el anticuerpo no unido, los complejos se pueden disociar de la matriz, separados mediante gel SDS-PAGE, y el nivel del polipéptido interactuante encontrado en la fracción unida a matriz cuantificada del gel que utiliza técnicas electroforéticas estándar.

En otra modalidad, se puede utilizar un ensayo de dos híbridos (también denominado como un ensayo de trampa de interacción) para detectar la interacción de dos polipéptidos en el complejo de RAGE-LBE y RAGE-BP (ver también, la Patente U.S. No: 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223,232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696), y para detectar posteriormente anticuerpos de prueba que inhiben la unión entre un polipéptido RAGE-LBE y RAGE-BP. Este ensayo incluye suministrar una célula huésped, por ejemplo, una célula de levadura (preferida), una célula de mamífero o una célula tipo bacteriano. La célula huésped contiene un gen indicador que tiene un sitio de unión para el dominio de unión de ADN de un activador transcripcional utilizado en la proteína cebo, de tal forma que el gen indicador expresa un producto de gen detectable cuando el gen se activa transcripcionalmente. Un primer gen quimérico se suministra el cual es capaz de expresarse en la célula huésped, y codifica un polipéptido "cebo". Un segundo gen quimérico también se suministra el cual es capaz de expresarse en la célula huésped, y codifica el polipéptido "pez". En una modalidad, tanto el primero como el segundo gen quimérico se introducen en la célula huésped en la forma de plásmidos. Preferiblemente, sin embargo, el primer gen quimérico está presente en un cromosoma de la célula huésped y el segundo gen quimérico se introduce en la célula huésped como parte de un plásmido.

En ciertas modalidades, la invención suministra un ensayo de dos híbridos para identificar los anticuerpos de prueba que inhiben la unión de un polipéptido RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, p2-ingegrina, Mac-1 y p150,95) y un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE). Para ilustrar, un polipéptido "cebo" que comprende un polipéptido receptor y un polipéptido "pez" que comprende un polipéptido RAGE-BP (tal como HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, 2-ingegrina, Mac-1 y p150,95), se introducen en la célula huésped. En una modalidad, el cebo comprende el dominio V del RAGE de humano o murino, o una secuencia con 80 a 99% de identidad con el dominio V del RAGE de humano o murino que se pueden aún unir al RAGE-BP. Las células se someten a condiciones bajo las cuales los polipéptidos cebo y pez se expresan en cantidad suficiente para que se active el gen reportero.

La interacción de los dos polipéptidos de fusión da como resultado una señal detectable producida mediante la expresión del gen reportero. De acuerdo con esto, el nivel de interacción entre los dos polipéptidos en la presencia del anticuerpo de prueba y en la ausencia del anticuerpo de prueba se puede evaluar al detectar el nivel de expresión del gen indicador en cada caso. Se pueden utilizar varias construcciones reporteras de acuerdo con los métodos de la invención e incluye, por ejemplo, genes reporteros que producen tales señales detectables como seleccionado frente al grupo que consiste de una señal enzimática, una señal fluorescente, una señal fosforescente y resistencia a fármaco.

En muchos programas de selección de fármaco que prueban colecciones de los compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos supervisados en un período de tiempo dado. Los ensayos de la presente invención que se desarrollan en sistemas libres de célula, tal como se pueden desarrollar con proteínas purificadas o semi-purificadas o con lisados, se prefieren a menudo como selecciones "primarias" porque ellas se pueden generar para permitir el desarrollo rápido y la detección relativamente fácil de una alteración en un objetivo molecular que es mediado por un anticuerpo de prueba. Más aún, los efectos de la toxicidad celular y/o la biodisponibilidad del anticuerpo de ensayo se puede ignorar generalmente en el sistema in vitro, el ensayo en lugar de estar enfocado principalmente en el efecto del fármaco sobre el objetivo molecular como puede ser manifiesta en una alteración de la afinidad de unión con otras proteínas o cambios en las propiedades enzimáticas del objetivo molecular.

En ciertas modalidades, una formación del complejo entre el RAGE-BP y un receptor se pueden evaluar mediante inmunoprecipitación y análisis de proteínas co-inmunoprecipitadas o purificación de afinidad y análisis de proteínas co-purificadas. Los ensayos basados en Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente (FRET) también se pueden utilizar para determinar tal formación del complejo. Las moléculas fluorescentes que tienen los espectros de emisión y excitación propias se lleva a proximidad cercana uno con el otro para poder exhibir FRET. Las moléculas fluorescentes se escogen de tal forma que el espectro de emisión de una de las moléculas (la molécula donadora) traslapa con el espectro de excitación de la otra molécula (la molécula aceptadora). La molécula donadora se excita por la luz de intensidad apropiada dentro del espectro de excitación del donador. El donador emite entonces la energía absorbida como luz fluorescente. La energía fluorescente que ésta produce se apaga mediante la molécula aceptadora. El FRET se puede manifestar como una reducción en la intensidad de la señal fluorescente del donador, la reducción en el tiempo de vida del su estado excitado, y/o la reemisión de la luz fluorescente a longitudes de onda mayores (energías menores) características del aceptador. Cuando las proteínas fluorescentes se separan físicamente, los efectos FRET se disminuyen o eliminan (ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 5,981 ,200).

La ocurrencia del FRET también hace que el tiempo de vida de fluorescencia del grupo funcional fluorescente donador disminuya. Este cambio en el tiempo de vida de la fluorescencia se puede medir utilizando una técnica denominada tecnología de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM)(Verveer et al. (2000) Science 290: 1567-1570, Squire et al. (1999) J: Microsc. 193: 36; Verveer et al. (2000) Biophys. J. 78: 2127). Se han desarrollado técnicas de análisis global para analizar los datos FLIM. Estos algoritmos usan el entendimiento de que el grupo funcional de fluorescencia donadora existe en solamente un número limitado de estados cada uno con un tiempo de vida de fluorescencia distinto. Los mapas cuantitativos de cada estado se pueden generar sobre una base píxel por píxel.

Para desarrollar unos ensayos basados en FRET, un polipéptido RAGE-BP (por ejemplo, HMGB1 , AGE, ?ß, SAA, S100, anfoterina, S100P, S100A, S100A4, A100A8, S100A9, CRP, 2-ingegrina, Mac-1 y p150,95) y un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE) se marcan ambos fluorescentemente. Las marcas fluorescentes adecuadas se conocen bien en la técnica. Los ejemplos se suministran adelante, pero las marcas fluorescentes adecuadas no específicamente discutidos también están disponibles para aquellos expertos en la técnica y se pueden utilizar. La marcación fluorescente se puede lograr al expresar un polipéptido como un polipéptido con una proteína fluorescente, por ejemplo las proteínas fluorescentes aisladas de medusas, corales y otros celentéreos. Las proteínas fluorescentes de ejemplo incluyen las muchas variantes de la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequoria victoria. Las variantes pueden ser más brillantes, dímeros, o tener diferente excitación y/o espectro de emisión. Ciertas variantes se alteran de tal forma que ellas ya no parecen verdes, y pueden parecer azules, cian, amarillo o rojo (denominadas BFP, CFP, YFP, y REP, respectivamente). Las proteínas fluorescentes se pueden unir establemente, a los polipéptidos a través de una variedad de enlaces covalentes y no covalentes, que incluyen, por ejemplo, enlaces de péptido (por ejemplo, expresión como una proteína de fusión), reticulación química y acoplamiento de biotina-estreptavidina. Para ejemplos de las proteínas fluorescentes, ver las Patentes U.S. Nos: 5,625,048, 5,777,079, 6,066,476, y 6, 124,128, Prasher et al. (1992) Gene, 1 1 1 : 229-233; Reign et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91 : 12501 -04; Ward et al. (1982) Photochem. Photobiol., 35: 803-808; Levine et al. (1982) Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77-g5; Tersikh et al. (2000) Science 290: 1585-88.

Los ensayos basados en FRET se pueden utilizar en ensayos basados en célula y en ensayos libres de célula. Los ensayos basados en FRET son adecuados para métodos de selección de alto rendimiento que incluyen Selección de Célula Activada por Fluorescencia y exploración fluorescente de arreglos mircotítulo.

En general, donde un ensayo de selección es un ensayo de unión (sea una unión proteína-proteína, una unión compuesto-proteína, etc.), una o más de las moléculas se puede acoplar o ligar a un marcador, donde el marcador puede suministrar directa o indirectamente una señal detectable. Varias marcadores incluyen radioisótopos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, moléculas de unión específica, partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, y similares. Las moléculas de unión específica incluyen pares, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específica, el miembro complementario se marcaría normalmente con una molécula que suministra la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos.

Una variedad de otros reactivos se puede incluir en el ensayo de selección. Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc., que se utilizan para facilitar la unión proteína-proteína óptima y/o reducir las interacciones no específicas o de campo de batalla. Los reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, tal como los inhibidores de proteasa, los inhibidores de nucleasa, los compuestos anti-microbianos, etc. se pueden utilizar. La mezcla de los componentes se agrega en cualquier orden que suministre la unión requisito. Las incubaciones se desarrollan a cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4°C y 40°C. Los períodos de incubación se seleccionan para actividad óptima, pero también se pueden optimizar para facilitar la rápida selección de alto rendimiento.

En ciertas modalidades, la invención suministra ensayos independientes de complejo. Tales ensayos comprenden identificar un anticuerpo de prueba que sea un candidato inhibidor de la unión de un RAGE-BP a un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE).

En una modalidad de ejemplo, un compuesto que se une a un polipéptido receptor se puede identificar al utilizar un polipéptido RAGE-LBE receptor. En una modalidad ilustrativa, se puede suministrar el RAGE-LBE el cual agrega un dominio adicional que permite que la proteína se una a una matriz insoluble. Por ejemplo, un RAGE-LBE fusionado con una proteína GST se puede adsorber sobre microesferas de sefarosa glutation (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o las placas microtítulo derivadas de glutation, que se combinan entonces con un compuesto de unión marcado potencial e incubado bajo condiciones que conducen a la unión. Luego de la incubación, las microesferas se lavan para remover cualquier compuesto no unido, y un marcador unido a microesfera de matriz determinado directamente, o en el sobrenadante después de que el compuesto unido se disocia.

En ciertas modalidades, el marcador puede suministrar directa o indirectamente una señal detectable. Varios marcadores comprenden radioisótpos, fluorescentes, químioluminiscentes, enzimas, moléculas de unión específica, partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, y similares. Las moléculas de unión específica incluyen pares, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específica, el miembro complementario se marcaría normalmente con una molécula que suministra la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos. En ciertas modalidades tales métodos comprenden formar la mezcla in vitro. En ciertas modalidades, tales métodos comprenden ensayos basados en célula al formar la mezcla in vivo. En ciertas modalidades, los métodos comprenden poner en contacto una célula que expresa un polipéptido receptor (por ejemplo, RAGE o RAGE-LBE) o una variante de éste con el anticuerpo de prueba.

En ciertas modalidades, los ensayos se basan en sistemas libres de célula, por ejemplo, proteínas purificadas o lisados de célula, asi como también ensayos basados en célula que utilizan células intactas. Los ensayos de unión simple se pueden utilizar para detectar compuestos que interactúan con el polipéptido receptor. Los compuestos que se van a probar se pueden producir, por ejemplo, mediante bacterias, levaduras u otros organismos (por ejemplo, productos naturales), químicamente producidos (por ejemplo, moléculas pequeñas, que incluyen peptidomiméticos), o recombinantemente producidos.

Opcionalmente, los anticuerpos de prueba identificados de estos ensayos se pueden utilizar para tratar trastornos asociados con RAGE.

Preparaciones Farmacéuticas Las proteínas o los ácidos nucleicos objeto de la presente invención son más preferiblemente administrados en la forma de composiciones apropiadas. Como composiciones apropiadas se pueden citar todas las composiciones usualmente empleadas para fármacos administradas sistémica o localmente. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser sustancialmente inerte, con el fin de no actuar con el componente activo. Los portadores inertes adecuados incluyen agua, alcohol, polietilenglicol, aceite mineral o gel de petróleo, propilenglicol, solución salina amortiguada de fosfato (PBS), agua bacterioestática para inyección (BWFI), agua estéril para inyección (SWFI), y similares. Dichas preparaciones farmacéuticas (incluyen los anticuerpos objeto o los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos objeto) se pueden formular para la administración de cualquier manera conveniente para uso en medicina humana o veterinaria.

Así, otro aspecto de la presente invención suministra unas composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad efectiva de un anticuerpo, formuladas junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptable (aditivos) y/o diluyentes. Como se describe en detalle adelante, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular específicamente para la administración en forma sólida o líquida, que incluye aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, empapados (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), tabletas, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, solución o suspensión estéril; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o pulverizado aplicado a la piel; o (4) intravaginalmente o intrarectalmente, por ejemplo, como un supositorio, crema o espuma. Sin embargo, en ciertas modalidades los agentes objetos se pueden disolver o suspender simplemente en agua estéril. En ciertas modalidades, la preparación farmacéutica es no pirogénica, es decir, no eleva la temperatura corporal de un paciente. La administración parenteral, en particular inyección subcutánea e intravenosa, es la ruta de administración preferida.

En ciertas modalidades, uno o más agentes pueden contener un grupo funcional básico, tal como amino o alquilamino, y son, por lo tanto, capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" a este respecto, se refiere a las sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos relativamente no tóxicos de los compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación final de los compuestos de la invención, o al hacer reaccionar separadamente un compuesto purificado de la invención en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislar la sal así formada. Las sales representativas incluyen sales de bromohidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19).

Las sales farmacéuticamente aceptables de los agentes incluyen sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico, y similares; y las sales preparadas de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico, isotiónico, y similares.

En otros casos, uno o más agentes pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y, así, ser capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. Estas sales se pueden preparar de manera similar in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos, o al reaccionar separadamente del compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión de metal farmacéuticamente aceptable, con amonio, o con una amina primaria, secundaria o terciaria orgánica farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalino terreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, y aluminio y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilamina, dietilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al., supra).

Los agentes humectantes, emulsificantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como también agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes endulzantes, saborizantes y de perfume, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.

Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares, (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, y similares, y (3) agentes quelantes de metal, tal como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Las formulaciones de la presente invención incluye aquellas adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal, y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. La cantidad del ingrediente activo se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis única que variará dependiendo del huésped que se va a tratar, el modo particular de administración, etc. La cantidad del ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis única será generalmente aquella cantidad del compuesto que produzca un efecto terapéutico. En general, del ciento por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, preferiblemente desde aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente desde aproximadamente 10 por ciento a aproximadamente 30 por ciento.

Los métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un agente con un portador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan al llevar uniforme y íntimamente en asocio un agente de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos divididos en el tiempo, o ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto.

Las formulaciones de la invención adecuadas para la administración oral pueden estar en la forma de cápsulas, obleas, pildoras, tabletas, pastillas (usando una base de sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos, o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como enjuagues de boca y similares, que contienen cada uno una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como ingrediente activo. Un compuesto de la presente invención también se puede administrar como un bolo, electuario o pasta.

En formas de dosis sólidas de la invención para la administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, grajeas, polvos, gránulos y similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: (1) rellenos o entendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; (2) ligadores, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa tapioca, ácido alginico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio; (5) agentes de retardo de solución, tal como parafina; (6) aceleradores de absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tal como por ejemplo, cetil alcohol y monostearato de glicerol; (8) absorbentes, tal como kaolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenoglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de éstos; y (10) agentes colorantes. En el caso de las capsulas, los comprimidos y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes amortiguantes. En el caso de las capsulas, comprimidos y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes amortiguantes. Las composiciones solidad de un tipo similar también se pueden emplear como rellenos en cláusulas de gelatina duras y blandas que utilizan tales excipientes como lactosa o azúcar en leche, asi como también polietilenoglicoles de alto peso molecular y similares.

Un comprimido se puede hacer por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar utilizando ligados (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil celulosa), lubricantes, diluyentes inertes, conservantes, desintegrantes (por ejemplo, glicolato de almidón de sodio o carboximetil celulosa de sodio reticulada), agentes dispersantes o de superficie activa. Los comprimidos moldeados se pueden hacer al moldear en una maquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humectado con un diluyente liquido inerte.

Los comprimidos, y las otras formas de dosificación sólida de las composiciones farmacéutica de la presente invención, tal como grageas, capsulas, pildoras y gránulos, se pueden clasificar o preparar opcionalmente con recubrimientos y cortezas, tal como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Ellos también se pueden formular con el fin de proporcional liberación lenta o controlada del ingrediente activo allí utilizando, por ejemplo, hidroípropilmetil celulosa en varias proporciones para suministrar el perfil de liberación deseado, otras matrices polimérica, liposomas y/o microesferas. Ellos se pueden esterizar por, por ejemplo, filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en aguas estéril, o algunos otros medios inyectables inmediatamente antes de uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición que ellos liberen los ingredientes activos solo, o preferencialmente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, en una forma retarda. Ejemplos de composición en bebidas que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede ser de forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.

Las formas de dosificación liquida para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptable, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires. En adición al ingrediente activo, las formas de dosificación liquida pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsificantes, tal como etil alcohol, alcohol isopropilico, etil carbonato, etil acetato, alcohol benzilico, bencil benzoato, propilenglicol, 1 ,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón; cacahuate, maíz, germen, oliva, resino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurilo polietilenglicoles y esteres de ácido graso de sorbitán, y mezclas de éstos.

A pesar de los diluyentes inertes, las composiciones orales también incluyen adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, endulzantes, saborizantes, colorantes, agentes perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, en adición a los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isotearilo etoxilados, esteres de sorbitán y sorbitol de polioxietileno, celulosa macrocristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar y tragacanto, y mezclas de éstos.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención para administración vaginal o rectal se pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar al mezclar uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes no irritantes adecuados o portadores que comprende, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, un cera de supositorio o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero liquido a temperatura corporal y, por lo tanto se fundirá en el recto o la cavidad vaginal y libera los agentes.

Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal también incluyen óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o formulaciones en aerosol que contiene tales portadores como se conocen en la técnica por ser apropiados.

Las formas de dosificación para la administración transdérmica de un compuesto de esta invención incluye polvo, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, amortiguante, o propulsor que se pueda requerir.

Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, en adición a un compuesto activo de esta invención, excipientes, tal como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafina, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y oxido de zinc, o mezclas de estos.

Los polvos y aerosoles pueden contener, en adicción a un compuesto de esta invención, excipientes tal como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener adicionalmente propulsores habituales, tal como clorofluorohidrocabonos e hidrocarburos no sustituidos volátiles, tal como butano y propano.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja agregada de proporcionar suministro controlado de un compuesto de la presente invención al cuerpo. Tales formas de dosificación se pueden hacer al disolver o dispersar los agentes en el medio apropiado. Los mejoradores de absorción también se pueden utilizar para incrementar el flujo de los agentes a través del "slain". La velocidad de tal flujo se puede controlar al suministrar una membrana de control de velocidad o dispersión del compuesto en una matriz de polímero o gel.

Las formulaciones oftálmicas, lo ungüentos para ojos, polvos, soluciones y similares, también se contemplan por estar dentro del alcance de esta invención.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para administración parenteral comprende uno o más compuestos de la invención en combinación con uno o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que se pueden reconstituir en soluciones inyectables estéreles o dispersiones justo antes de uso, que puede contener antioxidantes, amortiguantes, bacteriostatos, solutos que dan la formulación isotónica con la sangre del receptor destinado o agentes espesantes o de suspensión.

Ejemplo de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles(tal como glicerol, propilenglicol. polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de éstos. Aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectable, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y por el uso de tensoactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tal como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar por la inclusión de varios agentes antifúngico, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tal como azucares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. En adicción, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede llevar a cabo por la inclusión de agentes que retardan la absorción tal como monostearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un agente, es deseable retardar la absorción del agente a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede logar mediante el uso de una suspensión liquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en el agua. La velocidad de absorción del agente depende luego de su velocidad de disolución, que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un agente administrado parenteralmente se logra al disolver o suspender el agente en un vehículo aceitoso.

Las formas de depósito inyectables se hacen al formar matrices de micro capsulado de los compuestos objeto en polímeros biodegradables tal como polilacturo-poliglicoluro. Dependiendo de la velocidad del agente al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, la velocidad de liberación de agente se puede controlar. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluye poli (ortoésteres) y poli (anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósitos también se preparan al entrapar el agente en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran como farmacéuticos, a humanos y animales, ellos se pueden dar per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.1 a 99.5% (más preferiblemente, 0.5 a 90%) de ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Aparte de las composiciones descritas anteriormente, se puede hacer uso de recubrimientos, por ejemplo, en plastos, vendas, vendajes, almohadillas de gasas y similares, que contienen una cantidad apropiada de un terapéutico. Como se describió en detalle anteriormente, las composiciones terapéuticas se pueden administrar/suministrar en dispositivos, prótesis, e implantes.

La muestra de tejido para análisis es típicamente sangre, plasmo, suero, fluido de mucosa o fluido cerebroespinal del paciente. La muestra se analiza, por ejemplo, para niveles o perfiles de anticuerpos para péptido RAGE, por ejemplo, niveles o perfiles de anticuerpos humanizados. Los métodos ELISA para detectar anticuerpos específicos para RAGE se describen en los ejemplos.

El siguiente perfil de anticuerpo de inmunización pasiva muestra típicamente un pico inmediato en la concentración de anticuerpo seguido por un deterioro exponencial. Sin una dosificación adicional, los niveles de pre-tratamiento cercano al deterioro dentro de un periodo de días a meses dependen de la vida media del anticuerpo administrado.

En algunos métodos, una medición de línea base de anticuerpo para RAGE en los pacientes se hace antes de administración, una segunda medición se hace pronto después de determinar el nivel de anticuerpo pico, y se hace en una o más mediciones adicionales en intervalos para monitorear el deterioro de los niveles de anticuerpo.

Cuando el nivel de anticuerpo a declinado a la línea base o un porcentaje predeterminado de las líneas bases menos el pico (por ejemplo. 50%, 25% o 10%), la administración de una dosificación adicional de anticuerpo se suministra. En algunos métodos, el pico o los niveles medidos posteriormente menos el fondo se comparan con los niveles de referencia antes de determinar de constituir un régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico benéfico en otros pacientes. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que un nivel de referencia (por ejemplo, menor que la media menos una desviación estándar del valor de referencia en la población de pacientes que se benefician del tratamiento) la administración de una dosificación adicional de anticuerpo se indica.

EJEMPLOS La invención que se describe ahora generalmente, será más fácilmente entendida por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen únicamente para propósitos de ilustración de ciertos aspectos y modalidades de la presente invención, y no están destinados a limitar la invención.

Ejemplo 1 Preparación de construcciones RAGE Las secuencias de aminoácido de RAGE DE murino (mRAGE, no. acceso Genbank NP_031451 ; SEQ ID NO: 3) y RAGE humano (hRAGE, no. de acceso Genbank. NP_00127.1 ; SEQ IDNO:1) se muestran en la Figuras 1A-1 O el mRAGE que codifica el cADN de longitud completa (no. de acceso NM_007425.1 ; SEQ ID NO: 4) y hRAGE (no. de acceso. NM_001136; SEQ ID NO: 2) se insertan en el vector de expresión Adoh1-2, que comprende un promotor citomegalovirus (CMV) que conduce a la expresión de las secuencias de cADN, y contiene elementos adenovirus para la generación de virus. Una proteína de fusión RAGE-Fc humana formada al adherir los aminoácidos 1-344 del RAGE humano al dominio Fe de IgG humano se prepara al expresar una construcción de ADN que codifica la proteína de fusión en células cultivadas utilizando el vector de expresión Adori. Una proteína de fusión Fe de región RAGE V humana formada al agregar los aminoácidos 1-118 de RAGE al dominio Fe del IgG humano se prepara de forma similar. Las proteínas de fusión de etiqueta RAGE strep de murino y de humano formadas al agregar una estreptavidina (strep) secuencia tag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 5) a los aminoácidos 1 -344 del RAGE de murino o humano, respectivamente, se preparan al expresar construcciones de ADN que codifican las proteínas de fusión de etiqueta RAGE-estrep, también utilizando vectores de expresión Adori. Todas las construcciones se verifican por análisis de gestión de restricción extensiva y mediante análisis de secuencia de insertos de cADN dentro de los plásmidos.

Los adenovirus recombinantes (Ad5 E1 a/E3 eliminados) que expresan el RAGE de longitud completa, hRAGE-Fc, y Fe de dominio hRAGE V se generan por precombinación homologa en una línea celular de riñon humano embriónica 293 (HEK293) (ATCC, Rockland MD). El virus del adenovirus recombinarte se aisla amplifica posteriormente en célula HEK293. El virus se libera de las células HEK293 infectadas mediante tres ciclos de congelamiento descongelamiento. El virus se purifica adicionalmente por dos gradientes de centrifugación de cloruro de cesio y dializado contra solución salina amortiguada con fosfato (PBS) pH 7.2 at 4°C. Luego de diálisis, se agrega glicerol a una concentración de 10% y el virus se almacena a -80° C hasta uso. Las construcciones virales se caracterizan por infectividad (unidades formadoras de placas en 293 células), el análisis de PCR del virus, los análisis de secuencia de la región de codificación, expresión del transgen, y mediciones de endotoxina.

El ADN que contiene vectores de expresión Adori que codifica el RAGE-Fc, de región RAGE-V humana, y proteínas de fusión de etiqueta strep-RAGE de murino y humano se transfectan establemente dentro de células de ovario de Hámster Chino (CHO) utilizando lipofectina (invitrogen). Los transfectantes estables se seleccionan en 20 nM y 50nM de metritrexato. El medio condicionado se cosecha a partir de clones individuales y se analiza con el uso de eletroforesis de gel de poliacrilamida-sulfato dodecil sodio (SDS-PAGE) e inmunotranferencia Western para confirmar la expresión RAGE. (Kaufman, R.J., 1990, Methods in Enzymology, 185:537- 66; Kaufman, R.J., 1990, Methods in Enzymology, 185:487-511 ; Pittman, D. D. et al., 1993, Methods in Enzymology, 222: 236-237).

La proteínas de fusión RAGE solubles que expresan células HEK 293 translúcidas o CHO se cultivan para cosechar medio condicionado para purificación den proteína. Las proteínas se purifican con el uso de métodos indicados de etiqueta de afinidad. La proteína purificada se somete para reducir y no reducir el SDS-PAGE, visualización por teñido con azul Coomassie (Current Protocols in Protein Sciences, Wiley Interscience), y mostrado por ser los pesos moleculares esperados.

Ejemplo 2 Generación de Anticuerpos Monoclonales Anti-RAGE de murino Ratones BALB/c hembras de 6-8 semanas de edad (Charles River, Andover, MA) se inmunizan subcutáneamente con el uso de un dispositivo GeneGun (BioRad, Hercules, CA). El cADN que contiene el vector de expresión pAdori que codifica el RAGE humano de longitud completa se absorbe sobre las partículas de oro coloidal (BioRad, Hercules, CA) antes de administración subcutánea. Los ratones se inmunizan con 3 ug de vector dos veces por semana, durante dos semanas. Se hacen sangrar los ratones una vez por semana después de la última inmunización y se evalúan los títulos de anticuerpo. El ratón con mayor titulo de anticuerpo RAGE recibe una inyección adicional de 10 g de proteína TAGE-estrep humana recombinante tres días antes de la fusión celular.

Los esplenocitos se fusionan con células de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) en una proporción de 4:1 utilizando 50% de polietilenglicol (PM 150) (Roche Diagnostics Corp, Mannheim, Germany). Después de fusión, las células se siembran y cultivan en placas de 96 pozos de 1 x 105 células/pozos en el medio de selección RPMI1640, que contiene 20% de FVS, 5% de Origen (IGEN International Inc. Gaithersburg, MD), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 g/ml estreptomicina, 10 mM HEPES y 1 x hipoxantina- aminopterina-timidina (Sigma, St. Louis, MO). Ejemplo 3 Generación de Anticuerpos Monoclonales Anti-RAGE Se inmunizan ratas LOU (Harían, Harían, MA) subcutáneamente con el uso de un GeneGun (BioRad, Hercules, CA). El cADN que contiene el vector de expresión pAdori que codifica el RAGE de murino de longitud completa se pre-absorbe sobre partículas de oro coloidal (BioRad, Hercules, CA) antes de la administración subcutánea. Las ratas se inmunizan con 3 ug de vector una vez cada dos semanas durante cuatro veces. Las ratas se les toman muestra de sangre una vez a la semana después de la última inmunización y se evalúan los títulos de anticuerpo. La rata con el titulo de anticuerpo RAGE más alto recibe una inyección adicional de 10 µg de proteína RAGE-estrep de murino recombinante tres días antes de la fusión celular.

Se fusionan los esplenocitos con células de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) a una proporción de 4:1 utilizando el 50% polietileno glicol (PM 1500) (Roche Diagnostics Corp, Mannheim, Germany). Después de fusión, las células se cultivan y se cosechan en placas de 96 pozos en 1 x 105 células/pozo en el medio de selección RPMI 1640, que contiene 20% de FBS, 5% Origen (IGEN International Inc. Gaithersburg MD), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina 100 µg/ml estreptomicina 10 mM HEPES y 1x hipoxantina- aminopten-timidina (Sigma, St. Louis, MO). Ejemplo 4 Selección de Hibridoma Se generan paneles de mAbs RAGE anti humano de murino y RAGE anti-murino de rata por inmunización de cADN utilizando el GeneGun, y los plásmidos de expresión Adori que expresan la región de codificación de longitud completa de RAGE humano o de murino. Los supernadantes de hibridoma se seleccionan para unión a RAGE-Fc humano o de murino recombinante por ELISA u por análisis FACS en células de riñon embriónicas humanas (HEK-293) que expresan RAGE transitoriamente. Los supernadantes positivos se prueban adicionalmente por su capacidad de neutralizar la unión RAGE al ligando HMGB1. Siete anticuerpos monoclonales de rata (series XT-M) y siete anticuerpos monoclonales de ratón (series XT-H) se identifican. Se subclonan hibridomas seleccionados cuatro veces por dilución en serie y una vez por clasificación FACS. El medio condicionado se cosecha a partir de cultivos de hibridomas estables y las inmunoglobulinas se purifican utilizando columnas de purificación de anticuerpo de proteína (Millipore Billerica, MA). La clase Ig de cada mAb se determina con un kit de isotipo mAb de ratón o kit de isotipo mAb rata como se indica (IsoStrip; Boehringer Mannheim Corp.). Los isótopos de rata seleccionado y de los anticuerpos monoclonales de ratón se establecen en la Tabla 1 (adelante).

Tabla 1 Anti-cuerpos anti-muRAGE Anti-cuerpos anti-huRAGE monoclonales de rata monoclonales de Murino Clones Mabs Isotipos Clones Mabs Isotipos Ig Hibridona ig Hibridona I mRAGEP XT-M1 Rat I hRAGEP XT-H1 lgG1 de 3/1* lgG2a,k 3/6* Ratón, K I mRAGEP XT-M2 Rat I hRAGEP XT-H2 lgG1 de 3/7 lgG2b,k 3/16* Ratón, K I mRAGEP XT-M3 Rat I hRAGEP XT-H3 lgG1 de 3/8 lgG2a,k 3/18 Ratón, K I mRAGEP XT-M4 Rat I hRAGEP XT-H4 lgG1 de 3/10* lgG2b,k 3/48 Ratón, I mRAGEP XT-M5 Rat I hRAGEP XT-H5 lgG1 de 3/15 lgG2a,k 3/55* Ratón, K ImRAGEP XT-M6 Rat IhRAGEP XT-H6 lgG1 de 3/16 lgG2b,k 3/65 Ratón, K I mRAGEP XT-M7 Rat I hRAGEP XT-H7 lgG1 de 3/18* lgG2b,k 3/66 Ratón.K Ejemplo 5 Análisis FACS Se infectan células 293 humanas con el adenovirus RAGE de murino y humano. Se suspende las células infectadas en PBS que contiene 1 % BSA en una densidad de 4 x 104 células/ml. Las células se encuban con 100 ul de la muestra (suero inmune diluido, supernadantes de hibridoma o anti cuerpos purificados) durante 30 min a 4°C. Después de lavar, las células se incuban con F(ab')2 y IgG, anti ratón, de cabra etiquetado PE (DAKO Corporation GlostrupDenmark) durante 30 min a 4°C en la oscuridad. Las señales de florescencia asociadas a células se miden por un citofluorometro de flujo FACScan (Becton Dickinson) utilizando 5000 células por tratamiento. Se utiliza yoduro de propidio para identificar las células muertas, que se excluyen del análisis. Los siete anticuerpos monoclonales de murino XT-H1 a XT-H7 y los siete anticuerpos monoclonales de rata XT-M1 a XT-M7 se muestran por análisis FACS para unirse a la superficie celular hRAGE (Tabla 2).

Ejemplo 6 Ensayo de Unión ELISA.

Se purifican anticuerpos a partir de supernadantes de hibridoma utilizando procedimientos estándar. Los anticuerpos purificados se evalúan para unión a forma solubles de RAGE con el uso de ELISA. Se cubren placas de noventa seis pozos (Corning, Corning, NY) con 100 ul de RAGE-Fc humano recombinante o Fc-región RAGE V humano recombinante (1 pg/ml) y se incuban durante la noche a 4°C. Después de lavar y bloquear con PBS que contiene 1 % BSA y 0.05% tween-20, 100 ul de muestra (las muestras están en varias formas: suero inmune diluido, supernadantes de hibridoma, o anticuerpos purificados, según se indique) se agregan e incuban durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan con PBS, pH 7.2 y se une a anticuerpos anti-RAGE que se detectan con el uso de IgG anti-ratón (H+L) (IgG) (Pierce, Rockford, IL) de cabra conjugado con peroxidasa seguido por incubación con el sustrato TMB (BioFX Laboratories Owings Mills, MD Laboratories). Los valores de absorbencia se determinan a 450 nm en un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos monoclonales se determinan con el uso de IgG (FCY) (Pierce Rockford, IL) anti ratón de cabra etiquetado con peroxidasa y se genera una cuerva estándar mediante un IgG de ratón pareado con isotipo purificado. Los resultados Elisa para la capacidad de los siete anticuerpos de murino XT-H1 a XT-H7 y los siete anticuerpos de rata XT-M1 a XT-M7 para unirse a hRAGE-Fc, Fc-región hRAGE V, mRAGE-Fc y mRAGE-estrep, se resumen en la tabla 2. Como se muestra en las figuras 2 y 3 el anticuerpo XT-M4 y el anticuerpo de murino XT-H2 se unen al RAGE-Fc humano y al dominio V del hRAGE. Los valores EC50 para unión del XT-M4 al RAGE humano y al dominio RAGE V son de 300 pM y 100 pM, respectivamente. Los valores EC50 para unión del XT- H2 al RAGE y al demonio RAGE V humano son 90 pM y 100 pM, respectivamente.

Ejemplo 7 Ensayos de unión ELISA de competencia de anticuerpo y ligando RAGE Para determinar si los anticuerpos monoclonales RAGE afectan la unión de un ligando RAGE lig (HMGB1 ; Sigma, St. Louis, MO) a RAGE, se desarrollan ensayos de unión ELISA de competencia. Se cubren noventa y seis placas con 1 pg/ml de HMGB1 durante la noche 4°C. Los pozos se lavan bien y se bloquean como se describió anteriormente y se exponen a 100 pl de mezclas pre-incubadas de RAGE-Fc c TrkB-Fc (un control Fe no especifico), a 0.1 pg/ml, más varias formas de la preparación de anticuerpo indicadas (diluciones de suero inmune, supernadantes de hibridoma o anticuerpos purificados) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan con PBS, pH 7.2 y se detecta RAGE-Fc humano recombinante unido-ligado con el uso de IgG (FCY) (Pierce, Rockford, IL), de cabra conjugado con peroxidasa, seguido por incubación por el substrato TMB (BioFX Laboratories Owings Mills, MD Laboratories Owings Mills, MD). La unión del RAGE-Fc humano recombinante al ligando sin ninguna anticuerpo o con suero pre-inmune diluido se utiliza como un control y se define como unión del 100%. La capacidad de siete anticuerpos de murino XT-H 1 a XT-H7y los siete anticuerpos de rata XT-M 1 a XT-M7 para bloquear la unión HMGB1 a hRAGE-Fc como se determina por el ensayo de unión ELISA de competencia se muestran en la Tabla 3. Tabla 3 también resume las capacidades de los anticuerpos XT-H1 , XT-H2, y XT-H5 de murino para bloquear la unión a RAGE de un ligando diferente de hRAGE, péptido -42 ß amiloido, y las capacidades de los anticuerpos XT-M1 a XT-M7 para bloquear la unión de HMGB1 a RAGE-Fc de murino, como se determina por ensayo de unión ELISA de competencia similares. Como se muestra en la Figure 4, el XT-M4 de anticuerpo de rata y XT-H2 de anticuerpo de murino bloquean la unión del HMGB1 al RAGE humano.

Tabla 3 Ensayos de unión ELISA de competencia Ensayos de unión del ligando RAGE ELISA de competencia de anticuerpo Mabs hRAGE- hRAGE-Fc hRAGE- ELISA hRAGE-V-Fc Fc +?ß 1-42 FC+HMGB1 (CM) +HMGB1 péptido XT- - + H1 XT- + +++ H2 XT- - H3 XT- +/- H4 XT- + +++ H5 XT- - H6 XT- +/- H7 XT- - - M1 XT- + + XT-H3 & XT-H7 M2 compite XT- - - M3 XT- ++ + XT-H2 & XT-H7 M4 compite XT- - - 5 XT- + + M6 XT- + + M7 Se utiliza un enfoque de competencia similar para determinar los epítopos de unión relativos entre pares de anticuerpos. Primero, 1 pg/ml de RAGE-Fc humano recombinante se cubre sobre placas de noventa y seis pozos durante la noche a 4°C. Después de lavar y bloqueara (ver anterior) los pozos se exponen a 100 µ? de mezclas pre-incubadas de anticuerpo objetivo biotinilados y diluciones de un anticuerpo de competencia durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo biotinilado unido se detecta utilizando estreptividina conjugada con peroxidasa (Pierce), se utiliza un enfoque de competencia similar para determinar los epítopos de unión relativa entre pares de anticuerpo. Primero, se cubre 1 Mg/ml de RAGE-Fc humano recombinante sobre placas de noventa y seis pozos durante la noche a 4°C. Después de lavar y bloquear (como se hizo anteriormente) los pozos se exponen a 100 µ? de mezclas pre-incubadas de anticuerpo objetivo biotinilado y diluciones de un anticuerpo de competencia durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo biotinilado unido se detecta utilizando estraptividina conjugada con peroxidasa. (Pierce, Rockford, IL), seguido por incubación con el TMB de substrato (BioFX Laboratories Owings Mills, MD Laboratories). La unión del anticuerpo biotinilada al RAGE-Fc humano recombinante sin ningún anticuerpo de competencia se utiliza como un control y se define como 100%. Los resultados de los ensayos de unión ELISA de competencia que analizan la competencia entre los anticuerpos de murino y rata para unión al hRAGE se muestran en la Tabla 3. la Figura 5 presenta una gráfica de datos para los ensayos de unión ELISA de competencia que analizan la competencia entre XT-M4 de rata y los anticuerpos XT-H1 , XT-H2, XT-H5, XT-M2, XT-M4, XT-M6, y XT-M7 para unión a hRAGE. Los datos de unión ELISA de competencia mostrados en la Figura 5 demuestran que el XT-M4 y XT-H2 se unen a sitios de traslapo en el RAGE humano.

Ejemplo 8 Ensayos de Unión BIACORE™ de Unión de Anticuerpos Anti-RAGE y de Murino a RAGE-Fc de Murino y Humano.

A. Unión a RAGE de Murino y Humano La unión de los anticuerpos anti-RAGE de rata y de murino seleccionados a humanos y RAGE de murino y a los dominios V de RAGE humano y de murino se analizan mediante el ensaya de unión directa BIACORE®. Los ensayos se desarrollan utilizando RAGE-Fc recubierto de murino. En un chip CM5 de alta densidad (2000 RU) utilizando acoplamiento de amina estándar. La solución de los anticuerpos anti-RAGE en dos concentraciones, 50 y 100 nm, se corren sobre las proteínas RAGE-Fc inmovilizadas por duplicado. La tecnología BIACORE™ utiliza cambios en el índice de refracción en la capa de superficie luego de la unión de los anticuerpos anti-RAGE al anfígeno RAGE inmovilizados. La unión se detecta por resonancia de plasmón de superficie (SPR) de un refractor de luz láser desde la superficie. Los resultados de los ensayos de unión directa BIACORE™ se resumen la tabla 4.

Las constantes de velocidad cinética (ka y kd) y las constantes de asociación y disociación (K3 y Kd) para la unión de anticuerpos anti-RAGE de murino y rata a humano y RAGE de murino se determinan por el ensayo de unión directa BIACORE™ . Los análisis de los datos cinéticos de señal para proporción directa e indirecta permiten la discriminación entre interacciones específicas y no especificas. Las constantes de velocidad cinética y la constantes de equilibrio determinadas por BIACORE™ dirigen el ensayo de unión para la unión del anticuerpo XT-H2 de murino y el anticuerpo XT-M4 de rata al huRAGE-Fc se muestran en la tabla 5.

Tabla 5 Constantes de velocidad cinética y constantes de equilibrio para la unión huRAGE-Fc Ka (1/Ms) Kd (1/S) Ka (1/M) Kd (M) R AX XT-H2 5.76X106 5.04X10" 1 .14X1010 8.76X10 11 55.7 2.68 4 XT-M4 1 .16X106 1.16X10" 1.00X109 9.95X10"10 89.9 14.3 3 B. Unión al Dominio RAGE-V humano.

Las constantes de velocidad cinética y las constantes de asociación y disociación para la unión de murino y los anticuerpos anti-RACE de rata al dominio RAGE de humano también se determinan por BIACORE®. El dominio Fe RAGE-V se captura por los anticuerpos Fe antihumanos cubiertos en un chip CM5 y los ensayos de unión directa BIACORE® de la unión de los anticuerpos anti-RAGE de rata y de murino al Fe de dominio hRAGE-V inmovilizados se determinan como se describió anteriormente para los ensayos de unión de RAGE-Fc de longitud completa.

Ejemplo 9 Secuencias de aminoácidos de Regiones Variables de Anticuerpo Anti-RAGE La secuencias de ADN que codifican las regiones variables de cadena liviana y pesada de anticuerpos anti-RACE de murino XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, y XT-H7, y de anticuerpo anti-RAGE XT-M4 se clonan y se secuencian, y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables se determina. Las secuencias de aminoácido alineadas de las regiones variables de cadena pesada de estas seis anticuerpos se muestran a la Figura 6, y las secuencias de aminoácidos alineadas de las regiones de cadena variable de cadena liviana se muestran en la Figura 7.

Ejemplo 10 Aislamiento de RAGE que Codifica las Secuencias de cADN de monos sin homólogos, babuinos y conejos El RAGE que codifica la secuencias de cADN se aisla y clona utilizando métodos de reacción de cadena de polimerasa-transcripción inversa estándar (RT-PCR). El ARN se extrae y purifica a partir de tejido de pulmón utilizando Trizol (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) por vía del protocolo del fabricante. El mARN se transcribe de forma inversa para generar cADN utilizando reactivo de transcripción inversa TaqMan (Roche Applied Science Indianapolis, IN) y el protocolo del fabricante amplifican las secuencias RAGE de mono cinomólogo (Macaca fascicularis) y el babuino (Papio cianocefalus) de cADN utilizando polimerasa de ADN Taq de invitrogen (Invitrogen, Carlsbad CA) y el protocolo y los oligonucleótidos (5'- GACCCTGGAAGGAAGCAGGATG (SEQ ID NO: 59) y 5'GGATCTGTCTGTGGGCCCCTCAAGGCC) (SEQ ID NO: 60) que agregan los sitios de restricción Spel y EcoRV. Los productos de amplificación PCR se digieren con Spel/EcoRV y se clonan en los sitios correspondientes en el plasmada pAdohl -3. El RAGE de conejo se clona utilizando RT-PCR como se describió anteriormente utilizando los oligonucleótidos: 5'- ACTAGACTAGTCGGACCATGGCAGCAGGGGCAGCGGCCGGA (SEQ ID NO: 61 ) y 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGGGCTCTCCTGTACCGCTCTC (SEQ ID NO: 62) que agregan los sitios Spel y Notl y se clonan en los sitios correspondientes en pAdori1 -3. Las secuencias de nucleotido de las secuencias de cADN clonadas que codifican babuinos, monos, y dos isoformas de RAGE en los plásmidos resultantes se determinan. Las secuencia de nucleótidos que codifica el RAGE de babuino se muestra en la Figura 8 (SEQ ID NO: 6), y la secuencia de nucleotido que codifica el RAGE de mono sin homologo se muestra en la Figura 9 (SEQ ID NO: 8). Las secuencias de nucleotido que codifican dos isoformas del RAGE de conejo se muestran en la Figura 10 (SEQ ID NO: 10 ) y Figura 1 1 (SEQ ID NO: 12).

Ejemplo 11 Aislamiento de un RAGE de Babuino que Codifica la Secuencia de ADN Genómica Un RAGE que codifica la secuencia de ADN genómica de babuino se aisla utilizando técnicas de clonación genomitas estándar (por ejemplo, ver Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Una colección genómica lambda de babuino (Papio cianocephalus) (Stratagene, La Jolla, C) en el vector Lambda DASH II se selecciona utilizando cADN RAGE humano cebado aleatorio 32P. Las placas de fago positivas se aislan y someten a dos rondas adicionales de selección para obtener aislados sencillos. El ADN Lambda se prepara, se digiere con Notl, y se fracciona para separar el ADN inserto de los brazos genómicos Lambda, utilizando procedimiento común. Los fragmentos Notl se ligan en el pBlueschpt SK+, digerido con Notl, y el inserto se secuencia utilizando cebadores especifícaos RAGE. El clon que se obtiene es el clon designado 18.2. Las secuencias de nucleótido del RAGE de babuino que codifica ADN genómico de babuino clonado se muestra en las in Figuras 12A- 12-E (SEQ ID NO: 15).

Ejemplo 12 Anticuerpo XT-M4 Quimérico Se genera un XT-M4 quimérico al fusionar las regiones variables de cadena liviana y pesada de XT-M4 de anticuerpo RAGE anti murino de rata con regiones constantes de cadena liviana kappa humana y regiones constantes de cadena pesada IgGI, respectivamente. Para producir la actividad efectora potencial mediada por Fe, las mutaciones quimérica L234A y G237A se introducen en el XT-M4 la región Fe IgGI humana. El anticuerpo quimérico se da número de molécula XT-M4-A-1. El anticuerpo XT-M4 quimérico contiene 93.83% de secuencia de aminoácido humana, y 6.18% se secuencia de aminoácido de rata.

Ejemplo 13 Evaluación de la Unión del XT-M4 Quimérico a RAGE La capacidad del anticuerpo quimérico XT-M4 y los anticuerpos anti-RAGE de murino y de rata seleccionados para unirse al RAGE humano y el RAGE de otras especies, y bloquear la unión de los ligandos RAGE se mide por los ensayos de unión ELISA y BIACORE™ .

A. Unión a RAGE humano soluble medido por ensayo de unión BIACORE™.

La unión del anticuerpo quimérica XT-M4,el anticuerpo XT-M4 de rata parental, y los anticuerpos XT-H2 y XT-H5 de murino para RAGE humano soluble(hRAGE-SA) se mide por el ensayo de unión de captura BIACORE™. Los ensayos se desarrollan al cubrir anticuerpos sobre un chip CM5 BIA con 5000-7000 RU. Las soluciones de un RAGE etiquetado por estreptavidina humano soluble purificada (hRAGE-SA) en concentraciones de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.12 nM, 1 .56 nM y O nM se hacen fluir sobre los anticuerpos inmovilizados por triplicado, y las constantes de velocidad cinética (ka y kd) y las constantes de asociación y disociación (K3 y Kd) para la unión al hRAGE-SA se determina. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

El anticuerpo quimérico XT-M4 y el anticuerpo XT-M4 se unen al RAGE humana soluble monomérico con cinética similares. La afinidad del c XT-M4 quimérico para el RAGE monomérico soluble humano es aproximadamente y 5.5 nM.

B. ensayo de unión ELISA de competencia del ligando RAGE La capacidad del anticuerpo XT-M4 de anticuerpo quimérico y el anticuerpo XT-M4 de rata para bloquear la unión de los ligando HMGB1 RAGE, péptido ß1 -42 amiloide, S100-A, y S100-B para el hRAGE -Fe se determinan por ensayo de unión ELISA de competencia de ligando como se describe en el ejemplo 7. Como se muestra en la Figura 13, el anticuerpo XT-M4 quimérico y el XT-M4 son casi idénticos en su capacidad para bloquear la unión del HMGB1 , el péptido ß1 -42 amiloide, S100-A, y S100-B al RAGE humano.

C. ensayo de unión ELISA de competencia de anticuerpo.

La capacidad del anticuerpo XT-M4 de anticuerpo quimérico para completar con XT- M4 de anticuerpo de rata y XT-H2 de murino en unión al hRAGE-Fc se determina por el ensayo de unión ELISA de competencia de anticuerpo, utilizando los anticuerpos XT-M4 y XT-H2 ligados a biotina., en la forma descrita en el ejemplo 7. Como se muestra en la Figura 14, el anticuerpo XT-M4 quimérico compite con el anticuerpo XT-M4 de rata y con el anticuerpo XT-H2 de murino en la unión al hRAGE-Fc.

Ejemplo 14 Unión de Anticuerpo al RAGE de diferentes especies se mide por ELISA basado en células.

Transfección celular Células embriónicas de riñon 293 humanas (American Tissue Type Culture, Manassas, VA) se colocan placas a 5 x 106 células por 10 cm2 de placa de cultivo de tejido y se cultiva durante la noche a 37°C. Al siguiente día las células de transfectan con plásmidos de expresión RAGE (RAGE de conejo, mono sin homologo, babuino, humano, ratón que codifica el vector pAdoril -3) utilizando el reactivo LF2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) en una proporción 4:1 de reactivo par ADN de plásmido utilizando el protocolo del fabricante. Las células se cosechan a 48 horas post-transfección utilizando tripsina, se lavan una vez con solución salina amortiguada con fosfato (PBS), luego se suspenden en medio de crecimiento sin suero en una concentración de 2 x 106 células/ml.

ELISA basado en células Se diluyen seriamente anticuerpos primarios en 1 pg/ml a 1 :2 o 1 :3 en PBS que confine 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) en una placa 96 pozos. Celular 293 transfectadas por RAGE o células 293 parentales de control (50 µ?) en 2 x 106 células/ml en medio de crecimiento libre de suero se agregan a una placa de 96 pozos de fondo U para una concentración final de 1 x 105 células/pozo. Las células se centrifugan a 1600 rpm durante 2 minutos. Los supernadantes se desechan gentilmente con la mano con un paño en una sola pasada y la placa se agita gentilmente para liberar el glóbulo de células. Los anticuerpos anti-RAGE primarios diluidos o los anticuerpos de control de apareamiento de isotipo (100 µ?) en PBS frió contiene 10% de suero de becerro fetal (FCS) se agregan a las células y se incuban en hielo durante 1 hora. Las células se tiñen con 100 µ? de conjugados HRP de anticuerpo anti IgG segundario (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) en hielo durante 1 hora. Luego de cada etapa de incubación de anticuerpo primario y anticuerpo segundario, las células se lavan 3 veces con PBS enfriado con hielo. 100 µ? de componente TMV1 de substrato (BIO FX, TMBW -0100-01) se agrega a la placa e incuban durante 5-30 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo del color se detiene al agregar 100 µ? de 0.18M H2S04. Las células se centrifugan y los supernadantes se transfieren a una placa fresca y se leen a 450 nm (Soft MAX pro 4.0, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA).97 Las capacidades de los anticuerpo XT-M4 y XT-M4 quiméricos para unirse al RAGE de babuino y humano como se determina por ELISA pasado en células se muestra en la figura 14. Los valores EC50 para la unión del anticuerpo XT-M4 y XT-M4 quimérico al RAGE de conejo, ratón, mono, babuino y humano de superficie celular expresado por células 293, como se determina por ELISA basado en célula, se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 Valores EC50 para unir a RAGE determinado por ELISA basa en célula XT-M4 quimérico XT-M4 de rata RAGE 293 de murino ~1.5nM ~2.2nM RAGE 293 de humano ~0.8nM ~0.84nM RAGE 293 de mono si ~1.66nM ~2.33nM homologo RAGE 293 de babuino ~1.25nM ~1 .33nM Ejemplo 15 Unión a RAGE de Especies Diferentes - Determinado por Teñido Inmunohistoquímico La capacidad del anticuerpo XT-M4 quimérico, el anticuerpo XT-M4 de rata, y los anticuerpos XT-H1 , XT-H2, y XT-H5 de murino para unirse RAGE de superficie celular endógena en tejido de pulmón de humano, mono sin homologo, babuino, y conejo se determinan por teñido inmunohistoquímico (IHC)se secciones de tejido de pulmón.

Se construyen con ingeniería células de ovario de Hámster Chino (CHO) transfectadas establemente para expresar proteínas de longitud completa RAGE humanas y de murino. El cADN RAGE humano y de murino se clona dentro del vector de expresión de mamífero, se lineariza y transfecta en células CHO utilizando métodos de lipofectina (Kaufman, R.J., 1990, Methods in Enzymology 185:537-66; Kaufman, R.J., 1990, ethods in Enzymology 185:487-51 1 ; Pittman, D. D. et al., 1993, Methods in Enzymology 222; 236). las células se seleccionan adicionalmente en 20 nM metotrexato y los extractos celulares se cosechan de clones individuales y se analiza mediante electroforesis (SDS-PAGE)de gel de sulfato-poliacrilamida dodecil sodio SDS y inmunotransferecia Western para confirmar la expresión.

La inmunohistoquímica para los tejidos de pulmón RAGE aislados de RAGE humano que sobre expresa células de ovarios de Hámster chino o de conejo, mono sin homologo o babuino o células de control CHO se desarrolla utilizando técnicas estándar. Los anticuerpos RAGE y el control de isotipo lgG2b de rata o control de isotipo de ratón se utilizan a 1 -15 mg. El XT-M4 quimérico, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10, XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.1 1 , XT-M4-hVH-V2.0- 2m/hVL-V2.14 se biotinilizan y se utiliza anticuerpo de control biotinalido IgGI sigma a 0.2, 1 , 5 y 10 µg/ml luego de la detección con HRP y Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 488 o anti-biotina conjugada con FITC, también se tiñen secciones con 4'-6- Diamidino-2-fenilindol (DAPI).

La Figura 15 muestra que el anticuerpo XT-M4 quimérico se une al RAGE en tejido de pulmón de mono sin homologo, conejo, y babuino. Los patrones de teñido IHC positivos son visibles en las muestras en las que las células que producen RAGE entran en contacto con XT-M4 quimérico, pero no en las muestras en las que el RAGE o un anticuerpo de unión RAGE están ausentes. La Figura 16 muestra que el anticuerpo de rata XT-M4 se une al RAGE en pulmón humano normal y pulmón de un humano con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). La unión del anticuerpo XT-M4 de rata y los anticuerpos XT-H1 , XT-H2, y XT-H5 de murino con RAGE de superficie celular endógena en pulmón séptico de babuino y pulmón de mono sin homologo normal, como se determina por el teñido IHC de secciones de tejido de pulmón, se resumen en la tabla 8. Las células CHO estable transfectadas con un vector de expresión que expresa ADN que codifica a hRAGE de utiliza como un control positivo Tabla 8 Unión a RAGE en pulmón de primate no humano-ensayado por IHC Pulmón de babuino (séptico) Pulmón de mono hRAGE CHO (normal) CHO pg/ml 1 5 10 15 5 10 15 1 1 XT-M4 +++ +++ ++++ ++++ + ++ +++ - XT-H1 ++++ +++ ++++ ++++ +++ +++ +++ - XT-H2 - - + ++ - - +++ - XT-H5 ++++ ++++ ++++ ++++ - - +++ - control mRA109 control rSFR Ejemplo 16 Modelamiento Molecular para humanizar anticuerpo XT-H2 RAGE antihumano de murino Modelamiento molecular del dominio HV de anticuerpo XT-H2 RAGE antihumano de murino.

Las plantillas de estructura de anticuerpos para modelamiento de cadena pesada XT-H2 de murino se seleccionan basados en la búsquedas BLASTP contra la base de datos de la secuencias del banco de datos de proteínas (PDB). El modelo molecular de XT-H2 de murino se construye basados en 6 estructuras de plantilla, 1 SY6 (anticuerpo anti-CD3), 1 MRF (anticuerpo anti-ARN), Y 1 RIH (anticuerpo anti-tumor) utilizando el modulo de homología de Insightll (Accelrys, San Diego). Las regiones conservadas estructuralmente (SCR) de las plantilla se determina basado en la matriz de distancias Ca para cada molécula y las estructuras de plantilla se superponen basado en la desviación RMS mínima de átomos correspondientes en SCR. La secuencia del VH del XT-H2 de rata de proteína objetivo se alinea con las secuencias de las proteínas de plantilla superpuestas y las coordenadas atómicas del SCR se asigna al los residuos correspondientes de la proteína objetivo. Basado en el grado de similitud de secuencia entre el objetivo y las plantillas en cada uno de los SCR, se utilizan las coordenadas de diferentes plantillas utilizadas para diferentes SCR. Las coordenadas para las regiones variables y los bucles no incluidos en el SCR se generan por los métodos de Search Loop o Genérate Loop como se implementa en el modulo Homology.

En resume, el método de Search Loop explora las estructuras de proteínas que pudieran imitar la región entre 2 SCR al comparar la matriz de distancia Ca de los residuos SCR de flanco con una matriz precalculada derivada de estructuras de proteínas que tienen el mismo número de residuos de flanco y un segmento de péptido interviniente de una longitud dada. La salida del método Search Loop se evalúa al encontrar primero una coincidencia que tiene mínimas desviaciones RMS y máxima identidad de secuencia en los residuos SCR flanco. Luego una evaluación de la similitud de secuencias entre las coincidencias potenciales y la secuencia del bucle objetivo se toma. El método Genérate Loop genera coordenadas de átomo de novo que se utiliza en aquellos casos en donde el Search Loops no encuentra coincidencias óptimas. La confirmación de los sitios de las cadenas laterales de aminoácido se mantiene igual como aquella en la plantilla si el residuo de aminoácido es idéntico en la plantilla y el objetivo. Sin embargo, se desarrolla una búsqueda conformacional de rotámeros y la conformación energética más favorable se retiene para aquellos residuos que no son idénticos en la plantilla y el objetivo. Para optimizar las partículas de empalme entre dos SCR adyacentes, cuyas coordenadas se adaptan de diferentes plantillas, y aquellas entre los SCR y los bucles, se utiliza la función de Splice Repair del modulo de Homology. El Splice Repair establece una simulación mecánica molecular para derivar longitudes de unión óptimas y ángulos de unión en articulación entre 2 SCR o entre SCR y una región variable. Finalmente el modelo se somete a minimización de energía utilizando el algoritmo Steepest Descents hasta una derivada máxima de 5 kcal/ (mol A) o 500 ciclos y el algoritmo Conjúgate Gradients hasta una derivada máxima de 5 kcal/(mol A) o 2000 ciclos. La calidad del modelo se evalúa utilizando la utilidad ProStat/Struct_Check del modulo Homology.

Modelamiento molecular del dominio HV XT-H2 anti-RAGE humanizado Un modelo molecular de la cadena pesada del XT-H2 de anticuerpo anti-RAGE humanizado (CDR injertado) se construye con Insight II siguiendo el mismo procedimiento como se describe para el modelamiento de la cadena pesada de anticuerpo XT H2 de ratón, excepto que las plantillas utilizadas son diferentes. Las plantillas de estructura utilizadas en este caso son 1 L7I (anticuerpo B2 anti-Erb), 1 FGV (anticuerpo anti-CD18), UPS (anticuerpo de factor anti tejido) y 1 N8Z (anticuerpo anti-Her2).

Análisis de modelo y predicción de humanización-retro mutaciones de trabaio de estructura.

El modelo de anticuerpo de ratón pariente se compara con el modelo de la versión humanizada CDR-injertado con respecto a la similitudes y diferencias en una o más de las siguiente característica: contactos CDR-estructura, uniones potenciales de hidrógeno que influencia la conformación CDR, y desviaciones RMS en varias regiones tal como estructura 1 , estructura 2, estructura 3, estructura 4 y los 3 CDR.

Las siguientes retro mutaciones solas y en combinaciones se predicen por ser importantes para la humanización exitosa por injerto CDR: E46Y, R72A, N77S, N74K, R67K, K76S, A23K, F68A, R38K, A40R.

Ejemplo 17 Modelamiento molecular para anticuerpo XT-M4 anti-RAGE de rata Modelamiento molecular del dominio HV de anticuerpo XT-M4 RAGE anti-murino de rata Las plantillas de estructura de anticuerpo para modelar cadenas pesadas XT-M4 de rata se seleccionan basado en la búsqueda BLASTP contra la base de datos de secuencia Protein Data Bank (PDB). Los modelos moleculares de XT-M4 de rata se construyen basado en 6 estructuras de plantilla, 1 QKZ (anticuerpo anti-peptido), 1 IGT (anticuerpo monoclonal linfoma anti-canino), 8FAB (anticuerpo arsonato anti-p-azofenilo), 1 MQK (anticuerpo oxidasa anti-citocromo C), 1 HOD (anticuerpo anti-angiogenina), y 1 MHP (anticuerpo anti-alphal betal ) utilizando el Homology del Insightll (Accelrys, San Diego). Las regiones estructuralmente conservadas (SCR) de las plantillas se determinan basado en la matriz de distancia Ca para cada molécula y las estructuras de plantillas se superponen basado en la desviación RMS mínima de los átomos correspondientes en SCR. Las secuencias de VH de XT-M4 de rata de proteína objetivo se alinea con las secuencias de las proteínas de plantilla superpuestas y las coordenadas atómicas del SCR se asignan a los residuos correspondientes de la proteína objetivo. Basado en el grado se similitud de secuencia entre el objetivo y las plantillas en cada uno de los SCR, se utilizan coordenadas de diferentes plantillas para diferentes SCR. Las coordenadas para las regiones variables y de bucle no incluidas es el SCR se generan por el método Search Loop o Genérate Loop según simplemente en el modulo Homology.

En resumen, las estructuras de proteína de exploración del método Search Loop que pueden imitar la región entre 2 SCR al comparar la matriz de distancia Ca de los residuos SCR de flanco con una matriz pre-calculada derivada de estructuras de proteína que tienen el mismo número de residuos de flanco y un segmento de péptido interviniente de una longitud dada. El rendimiento del método Search Loop se evalúa para encontrar prometo una coincidencia que tiene desviaciones RMS mínimas y máxima identidad de secuencia en los residuos SCR de flanco. Luego se hace una evaluación de la similitud de secuencia entre las coincidencias potenciales y la secuencia del bucle objetivo. El método Genérate Loop genera coordenadas de átomo de novo que se utiliza en aquellos casos en donde Search Loops no encuentra coincidencias óptimas. La conformación de las cadenas laterales de aminoácidos se mantiene igual como aquella en la plantilla si el residuo de aminoácido es idéntico en la plantilla y el objetivo. Sin embargo una búsqueda conformacional de rótamelos se desarrolla y la conformación energéticamente más favorable se retiene para aquellos residuos que no son idénticos en la plantilla y objetivo. Para optimizar las articulaciones de empalme entre dos SCR adyacentes, cuyas coordenadas se adaptan de diferentes plantillas, y aquella entre los SCR y los bucles, se utiliza función Splice Repair del modulo Homology. El Splice Repair establece una simulación de mecánica molecular para derivar longitudes de unión óptimas y ángulos de unión en articulaciones entre 2 SCR o entre SCR y una región variable. Finalmente el modelo se somete a imitación de energía utilizando el algoritmo Steepest Descents hasta un derivado máximo de 5 kcal/(mol A) o 500 ciclos y el algoritmo Conjúgate Gradients hasta una derivada máxima 5 kcal/(mol A) o 2000 ciclos. Se evalúa la calidad del modelo utilizando la utilidad ProStat/Struct_Check utility del modulo Homology.

Dominio variable de cadena liviana XT-M4 Los módulos estructurales para los dominios variables de cadena liviana XT M4 se generan con el modeler 8v2 utilizando un 1 K6Q (anticuerpo de factor anti-tejido), 1WTL, 1 D5B (anticuerpo AZ-28) y 1 BOG (anticuerpo anti-p24) como las plantillas. Para cada objetivo, afuera de los 100 modelos iniciales, un modelo con las violaciones menos restrictivas, como se define por la función de densidad de probabilidad molecular, se selecciona para optimización adicional. Para el modelo de optimización una cascada de minimización de energía que consiste de los métodos Steepest Descent, Conjúgate Gradient y Adopted Basis Newton Raphson se desarrolla hasta un gradientes RMS de 0.01 que se satisface utilizando el campo de fuerza Charmm 27 (Accelrys Software Inc.) y la solvatación implícita de Generalized Born como se implementa en el Discovery Studio 1.6 (Accelrys Software Inc.). Durante la minimización de energía, el movimiento de los átomos de la estructura se restringe utilizando una restricción armónica de fuerza de 10 masas.

Modelamiento molecular de dominio VH XT-M4 anti-RAGE humanizado Un modelo molecular de la cadena pesada de anticuerpo XT M4 anti-RAGE (CDR injertado) humanizado se construye con Insight II siguiendo el mismo procedimiento como se describe para modelamiento de la cadena pesada de anticuerpo XT M4 de rata, excepto que las plantillas utilizadas son diferentes. Las plantilla de estructuras utilizadas en este caso son 1 MHP (anticuerpo anti-alphal betal), 1 IGT (anticuerpo monoclonal de limfoma anti-canino), 8FAB (anticuerpo anti-p-azofenil arsonato), 1 MQK (anticuerpo oxidasa anti-citocromo C) y 1 H0D (anticuerpo anti- angiogenina).

Dominio variable de cadena liviana XT-M4 humanizado.

Un modelo molecular del la cadena liviana de anticuerpo XT M4 anti-RAGE (injertado CDR) humanizado se construye utilizando el Modeler 8v2 siguiendo el mismo procedimiento como se describe para el modelamiento de la cadena liviana de anticuerpo XT M4 de rata, excepto que las plantillas utilizadas son diferentes. Las plantillas de estructura utilizadas en este caso son 1 B6D.1 FGV (anticuerpo anti-CD18), 1 UJ3 (anticuerpo de factor anti-tejido) y 1WTL como en las plantillas.

Análisis de modelo y predicción de la humanización-retro mutación de estructura.

Se compara el modelo anticuerpo rata pariente con el modelo de la versión CDR-injertada humana con respecto a la similitudes y diferencias en una o más de las siguientes características: contactos de estructura CDR, uniones potenciales de hidrógeno que influencia la conformación CDR, desviaciones RMS en varias regiones tal como estructura 1 , estructura 2, estructura 3, estructura 4 y los 3 CDR, y las energías calculadas de interacciones residuo-residuo. Las retro mutaciones potenciales identificadas se incorporan, solas o en combinaciones, en otra ronda de construcción de modelos utilizando el Insight II o Modeler 8v2 y los modelos de los mutantes se comparan con el modelo de anticuerpo de rata pariente para evaluar la solubilidad de los mutantes in silico.

Las siguientes retro mutaciones solas o en combinación se predicen que son importantes para la humanización exitosa por injerto CDR: Cadena pesada: L114M, T113V y A88S; Cadena liviana: K45R, L46R, L47M, D70I, G66R, T85D, Y87H, T69S, Y36F, F71Y.

Ejemplo 18 Regiones variables humanizadas con los CDR de los anticuerpos XT-M4 de rata XT-H2 de murino Se preparan regiones variables de cadena pesada humanizadas al injertar los CDR de los anticuerpos XT-M4 de rata y XT-H2 de murino en las secuencias de estructura de línea germinal humana mostradas en la Tabla 9, y que introducen retromutaciones seleccionadas.

Tabla 9 anticuerpos isotipo Línea germinal Identidad humana XT-H2_VH mG1/k DP-75 VH1 ; 1-46 77.50% XT-M4_VH rG2b/k DP-54 VH3; 3-07 77.50% XT-H2_VL mG1/k DPK-12 VK2; A2 80.00% XT-M4_VL rG2b/k DPK-9 VK1 ; 02 64.50% Las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena liviana y pesada XT-H2 de murino humanizadas se muestran en la Figura 17 (SEQ ID No.: 28-31 ) y Figura 18 (SEQ ID No.: 32-35), respectivamente.

Las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena liviana y pesada XT-M4 de rata humanizadas se muestran en la Figura 19 (SEQ ID No: 36-38) y Figuras 20A-20B (SEQ ID NO: 39-49), respectivamente.

Las secuencias de línea Germinal de las que se derivan la estructura y las retromutaciones específicas en las regiones variables humanizadas se identifican en la Tabla 10.

Las secuencias de ADN que codifican las regiones variables humanizadas se subclonan en los vectores de expresión que contienen las secuencias que codifican las regiones constantes de inmuno globulina humana, y las secuencias de ADN que codifican las cadenas liviana y pesada de longitud completa que se expresan en las células COS, utilizando procedimientos estándar. Las regiones variables de cadena pesada que codifican ADN se subclonan en un vector pSMED2hlgG1 m_(L234, L237)cDNA, que produce cadenas pesadas de anticuerpo IgGI humanizadas. Las regiones variables de cadena liviana que codifican ADN se subclonan en el vector hkappa pSMEN2, que produce cadenas livianas de anticuerpo kappa humanizadas. Ver Figura 21.

Tabla 10 Dominio V Línea germinal retromutaciones humanizado XT-H2_hVH_V2.0 DP-75 A40R, E46Y,M481 ,R71A, Y T73K XT-H2_hVH_V2.7 DP-75 XT-H2_hVH_V4.0 DP-54 FW, VH 3.JH4 XT-H2_hVH_V4.1 DP-54 FW, VH 3,JH4 XT-H2_hVL_V2.0 DPK-12 12V, M4L Y P48S XT-H2_hVL_V3.0 DPK-24 XT-H2_hVL_V4.0 DPK-9 Vk1 XT-H2_hVL_V4.1 DPK-9 Vk1 XT-M4_hVH_V1.0 DP-54, VH3; 3-07 XT-M4_hVH_V1.1 DP-54, VH3; 3-07 XT-M4_hVH_V1.0 DP-54, VH3; 3-07 XT-M4_hVL_V2.4 DPK-9 Vk1 ;02 G66R XT-M4_hVL_V2.5 DPK-9 Vk1 ;02 D701 XT-M4_hVL_V2.6 DPK-9 Vk1 ;02 T69S XT-M4_hVL_V2.7 DPK-9 Vk1 ;02 L46R XT-M4_hVL_V2.8 DPK-9 Vk1 ;02 XT-M4_hVL_V2.9 DPK-9 Vk1 ;02 F71Y XT- DPK-9 Vk1 ;02 M4_hVL_V2.10 XT- DPK-9 Vk1 ;02 M4_hVL_V2.1 1 XT- DPK-9 Vk1 ;02 M4_hVL_V2.12 XT- DPK-9 Vk1 ;02 M4_hVL_V2.13 XT- DPK-9 Vk1 ;02 M4_hVL_V2.14 Ejemplo 19 Protocolo ELISA de competencia La unión de los anticuerpos XT-H2 y XT- 4 humanizados y del XT-M4 quiméricos a un RAGE-Fc humano se caracteriza por el ensayo ¡nmunoabsorbente ligado a encimas (ELISA) de competencia. Para generar un competidor, se biotiniliza el anticuerpo XT-M4 de rata pariente. Las placas ELISA se cubren durante la noche con 1 ug/ml RAGE-Fc humano. Se agregan concentraciones variantes del XT-M4 biotinilado por duplicado a los pozos (0.1 1-250ng/ml), se incuba, se lava y se detectan con estreptavidina-HRP. El ED50 calculado del XT-M4 de rata pariente biotinilado es 5 ng/ml. El IC50 del anticuerpo quimérico y de cada anticuerpo XT-M4 humanizado se calcula cuando se compite con 12.5 ng/ml de anticuerpo XT-M4 pariente biotinilado. En resumen, se cubren placas durante la noche con 1 ug/ml de RAGE-Fc humano. Concentraciones variantes de anticuerpos humanizados o quiméricos mezclados con 12.5ng/ml de XT-M4 de rata pariente biotinilado se agregan por duplicado a los pozos (en el rango 9ng/ml a 20ug/ml). Los anticuerpos XT-M4 de rata pariente Biotinilado que se detectan con HRP-estreptavidina y se calcula los valores IC50. Los valores IC50 determinados para los anticuerpos humanizados mediante análisis ELISA de competencia se muestran en la Tabal 1 1.

Los valores ED50 para la unión de los anticuerpos XT-H2 humanizados a RAGE-Fc Humano se determinan de forma similar por ELISA de competencia, y se muestran en la Figura 22.

Ejemplo 20 Reactividad cruzada de anticuerpo XT-M4 humanizado y quimérico a otros receptores de superficie celular. Anticuerpos XT-M4 humanizados XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10 y XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.1 1 , se prueban junto con el XT-M4 quimérico para reactividad cruzada con otros receptores similares a RAGE. Estos receptores se seleccionan ya que ellos son superficies celulares expresadas, similares a RAGE, y su interacción con los ligandos es similarmente dependiente de la carga. Los receptores probados son rhVCAM-1 , rhlCAM-1 -Fc, rhTLR4 (etiqueta C-Terminal His), rhNCAM-1 , rhB7-H1 -Fc ml_ox1-Fc, hl_ox1-Fc y hRAGE-Fc (como un control positivo). Las placas ELISA se cubren durante la noche con 1 pg/ml de las proteínas de receptor listadas. Concentraciones variantes de los anteriores anticuerpos XT-M4 quiméricos y humanizados listados se agregan por duplicado a los pozos (0.03 a 20 pg/ml), se incuban, se lavan y detectan con HRP. IgG anti-humano. La Tabla 12 muestra los resultados del análisis ELISA de unión directa de la unión de los anticuerpos XT-M4 quiméricos y humanizados a proteínas de superficie celular de ratón y humanas. Los datos mostrados son valores OD450 para unión detectada entre el receptor y el anticuerpo a 20 pg/ml (concentración más alta ensayada).

Ejemplo 21 Ensayo de unión BIACORE™ de unión RAGE humano soluble La unión del anticuerpo quimérico XT-M4 y de los anticuerpos XT-M4 humanizados a RAGE humano soluble (hRAGE-SA) y RAGE (mRAGE-SA) se mide por el ensayo de unión de captura BIACORE™. Los ensayos se desarrollan al recubrir los anticuerpos Fe anti-humanos en un chip CM5 BIA con 5000 RU (pH 5.0, 7min.) en 1 -4 células de flujo.

Cada anticuerpo se captura al hacer fluir en 2.0 g/ml sobre los anticuerpos anti-Fc en 2-4 (célula de flujo 1 se utiliza como una referencia). la soluciones de un RAGE etiquetado con estraptavidina humana soluble purificada (hRAGE-SA) en concentraciones de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM, 1.25 nM y 0 nM se hacen fluir sobre los anticuerpos inmovilizados por duplicado, con disociación durante 5 minutos, y constantes de velocidad cinética (ka y kd) y se determinan las constantes de asociación y disociación (K3 y Kd) para unión a hRAGE-SA. Los resultados para la unión del XT-M4 quimérico y los anticuerpos humanizados XT-M4-V10, XT-M4-V1 1 , y XT-M4-V14 para unión al hRAGE- SA y el mRAGE-SA se muestran en las Figuras 23 y 24, respectivamente.

Ejemplo 22 Optimización de especies a través reactividad de anticuerpo XT-H2 Se construye con ingeniería especies por reactividad cruzada mediante un proceso de mutación aleatoria del anticuerpo XT-H2, generar una colección de variantes de proteína y enriquecer selectivamente aquellas moléculas que han adquirido mutaciones que resultan en reactividad cruzada RAGE humano-ratón. Se utilizan tecnologías de exhibición de ribosoma (Hanes et al, 2000, Methods Enzymol, 328:404-30) y exhibición de fago (McAfferty et al., 1989, Nature, 348: 552-4).

Preparar anticuerpos ScFv basados en anticuerpos XT-H2 y HT-M4 A. Anticuerpos ScFv basados en XT-H2 Se sintetizan dos construcciones ScFv que comprenden las regiones V del XT-H2 en formato VHA/L o el formato VLA/H conectado por medio de un ligador flexible de DGGGSGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 50). Las secuencias de las construcciones ScFv configuradas como VL-VH y VH-VL se muestran en la Figura 25 (SEQ ID NO:51 ) y Figura 26 (SEQ ID NO:52 ), respectivamente.

B. Anticuerpos ScFv basados en XT-M4 Se sintetizan dos construcciones ScFv que comprenden las regiones V de XT-M4 en formato VHA/L o el formato VLA/H conectado por medio de un ligador flexible de DGGGSGGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 50). Las secuencias de las construcciones ScFv configuradas como VL-VH y VH-VL se muestran en la Figura 27 (SEQ ID NO:54 ) y Figura 28 (SEQ ID NO: 53), respectivamente.

La Figura 29 muestra datos ELISA de construcciones 4 Y H2 traducidas y transcritas in Vitro. Las placas ELISA cubiertas con RAGE -Fe (5ug/ml) o BSA (200ug/ml) en amortiguador de bicarbonato durante la noche a 4°C, lavado con PBS+tween 0.05% y bloqueado durante 1 hora a temperatura ambiente con 2% de leche en polvo PBS. Las placas se incuban con ScFv traducido in vitro durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se bloquean y la detección es con el anticuerpo anti-flag (dilución 1/1000) seguido por HRP anti-conejo de ratón (dilución 1/1000). los dato muestran que las construcciones ScFv de las regiones variables de los anticuerpos anti-RAGE XT-H2 y XT-M4 en las configuraciones VLA/H o VHA/L pueden producir proteínas plegadas funcionales que se unan específicamente al RAGE humano. Los valores para Kd del ScFv en ambos formatos como se determina por BIACORE™ se utilizan para determinar las concentraciones óptimas de antígenos para experimentos de selección.

C. Estrategia de selección y detección sistemática para recuperar variantes con reactividad cruzada RAGE de ratón/humano mejorada.

Se crea una colección de variantes mediante PCR propenso a error (Gram et al., 1992, PNAS 89:3576-80). La estrategia de mutagenia introduce mutaciones aleatorias sobre la longitud completa del gen ScFv. La colección se transcribe luego y se traduce in Vitro utilizando procedimientos establecidos (por ejemplo, Hanes et al., 2000, Methods Enzymol., 328:404-30). esta colección se somete a la ronda 1 de selección en RAGE-Fc humano, los complejos ribosómicos no unidos se lavan, y los complejos ribosómicos unidos a antígeno se eluyen. El ARN se recupera, se convierte a cADN por RT-PCR y se someten a la ronda 2 de selección en RAGE-Fc de ratón. Esta estrategia de selección alterna enriquece preferencialmente los clones que se unen al RAGE-Fc humano y de ratón. El rendimiento de esta selección se pone luego a través de un segundo PCR 2 propenso a error. La colección generada se somete luego a la ronda 3 y a rondas de selección en RAGE-Fc humano y RAGE-Fc de ratón, respectivamente. Este proceso se repite según se requiera. Los grupos de rendimiento de ARN de cada etapa de selección se convierten a cADN y se clonan en un vector de expresión pWRIL-1 para evaluar las especies a través de reactividad cruzada de la vanante ScFv. Los grupos de diversidad también se secuencian para evaluar la diversidad para determinar si las selecciones se mueven hacia clones dominantes que tengan especies de reactividad cruzadas.

Ejemplo 23 Maduración por afinidad de anticuerpo XT-M4 La afinidad mejorada se traduce en un beneficio potencial de dosis reducida o frecuencia de dosis y/o potencia incrementada. La afinidad para el hRAGE se mejora por maduración de afinidad, utilizando un proceso combinado de mutagenia objetivada para el VH-CDR3 acoplado a mutagenia de PCR propensa a error aleatorio (Gram et al., 1992, PNAS 89:3576- 80). Esto genera una colección de variantes de anticuerpo de las que las moléculas son recuperadas que tienen una afinidad mejorada para el RAGE-humano mientras que mantienen reactividad cruzada de especies RAGE-Fc de ratón. Se utiliza a La tecnología de exhibición de Ribosoma (Hanes et al, 1997, supra) y tecnología de exhibición de fago (McAfferty et al., 1989, supra).

La Figura 30 muestra datos de unión ELISA de construcciones ScFv XT-H2 y XT-M4 en pWRIL-1 en el formato VL-VH, expresado como proteína soluble en Escherichia coli y probado para unión en RAGE-Fc humano y BSA. El ActRllb representa una proteína de no unión expresada desde el mismo vector como un control negativo. Las placas ELISA se recubren con un RAGE -Fe humano (5ug/ml) o BSA (200ug/ml) en amortiguador de bicarbonato durante la noche a 4oC, lavado con PBS+tween 0.05% y bloqueado durante 1 hora a temperatura ambiente con 2% de leche en polvo PBS. Las preparaciones Periplásmica de cultivos E. coli 20 mi se desarrollan utilizando procedimientos estándar. El volumen final de las preparaciones periplásmicas de anticuerpos ScFv no purificados es 1 mi del cual 50ul se pre-incuba con anticuerpo anti-His en dilución 1/1000 durante 1 hora a temperatura ambiente en un volumen total de 10Oul con 2% leche en polvo PBS. Las preparaciones periplásmicas ligadas cruzadas se agregan a la placa ELISA y se incuban durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente. Las placas se lavan 2 veces con PBS+0.05% tween y 2 veces con PBS y se incuban con HRP anti-ratón de conejo en dilución 1/1000 en 2% de leche en polvo PBS. Las placas se lavan como se hizo anteriormente y la se detecto la unión utilizando reactivos TMB estándar. Los datos muestran que las construcciones ScFv de los anticuerpos XT-M4 y XT-H2 en la configuración VL VH puede producir proteína soluble plegada funcional en E. coli que se une específicamente al RAGE humano. Los valores Kd de partida del ScFv en ambos formatos como se determina por el BIACORE™ se utilizan para determinar las concentraciones óptimas de antígeno para selecciones de afinidad.

Ejemplo 24 Estrategia de selección y detección sistemática para recuperar variantes con afinidad mejorada para el hRAGE-Fc mientras mantienen la reactividad cruzada de especies.

Se crea una colección de variantes por mutagenia agregada del VH-CDR3 del XT-M4 utilizando PCR. La Figura 31 representa esquemáticamente como se utiliza el PCR para introducir mutaciones agregadas en un CDR de XT-M4. (1 ) se diseña un oligonucleótido agregado que lleva una región de diversidad sobre la longitud del bucle CDR y paréntesis por regiones de homología con el gen V objetivo en el FR3 y FR4. (2) se utiliza el oligonucleótido en una reacción PCR con un cebador especifico que híbrida al extremo 5' del gen V objetivo y es homologo a la región FR1. Figura 32 muestra la secuencia de nucleótido del extremo Terminal C de la construcción ScFv VL-VH XT-M4 (SEQ ID NO: 56). VH-CDR3 se subraya. También se muestran dos oligonucleótidos agregados (SEQ ID Nos:57-58 ) con un miembro en cada sitio de mutación que identifica la proporción de agregado utilizada para la mutación en ese sitio. Las composiciones de nucleótidos en las proporciones de agregamiento que corresponden a los números también se identifican.

El producto PCR agregado XT-M4-VHCDR3 se clona en el vector de exhibición de ribosoma pWRIL-3 como un fragmento Sfil para generar una colección. Esta colección se somete a selección en RAGE biotinilado humano utilizando exhibición de ribosomas (Hanes and Pluckthun., 2000). Se utiliza antígeno etiquetado Biotina ya que este permite la solución basado en la selección que permite más control cinético sobre los procesos e incrementa la probabilidad de enriquece preferencialmente los clanes de mayor afinidad. Las selecciones se desarrollan en un modo de equilibrio en una concentración de antígeno relativa al inicio de la afinidad o en una forma cinética cuando se mejora la proporción que se selecciona específicamente para utilizar la competencia con antígeno no etiquetado sobre un tiempo determinado empíricamente. Los complejos ribosómicos no unidos se lavan, el antígeno unido a los complejos ribosómicos se eluye, se recupera el RNA se convierte a cADN por RT-PCR y se desarrolla una segunda ronda de selección en RAGE-Fc de ratón biotinilado para mantener la reactividad cruzada de las especies. El rendimiento de esta etapa de selección que contiene variantes ScFv con mutaciones en el VH-CDR3 se somete luego a un ciclo de mutagenia de 2 etapas. La etapa de mutagenia involucra la veneración de mutaciones aleatorias utilizada PCR propenso a error. La colección generada se somete luego a la ronda 3 de selecciones en RAGE-Fc humano biotinilado en una concentración de antígeno 10 veces menor. Este proceso se repite según se requiera. Los grupos de rendimiento de ARN de cada etapa de selección se convierten a cADN y se clonan en un vector de expresión de proteína pWRIL-1 para clasificar la afinidad y la reactividad cruzada de las especies de ScFv variante. Los grupos de diversidad también se secuencian para evaluar la diversidad para determinar si las selecciones se mueven hacia clones dominantes.

Ejemplo 25 Maduración de afinidad de XT-M4 usando exhibición de fago La colección agregada de VH-CDR3 se clona en el vector de exhibición de fago pWRIL-1 mostrado en la Figura 34 para selección en hRAGE Bitinilado. El antígeno etiquetado Biotina se utilizara ya que este formato es más compatible con las selecciones controladas por afinidad en solución. Las selecciones se desarrollan en una forma de equilibrio en una concentración de antígeno reducida relativo al inicio de la afinidad o en una forma cinética cuando la velocidad mejorada se selecciona específicamente para utilizar competencia con antígeno no etiquetado durante un tiempo determinado empíricamente. Se utiliza procedimientos estándar para exhibición de fago.

El ScFv puede dimerizar, lo que complica los procedimientos de detección sistemática y selección. El ScFv dimerizado muestra potencialmente unión basada en avidez y esto incrementa la actividad de unión que puede dominar selecciones. Tales mejoras en la capacidad del ScFv para dimerizar a diferencia de cualquier mejora intrínseca en la afinidad tienen poca relevancia en el anticuerpo terapéutico final, que es generalmente un IgG. Para evitar artefactos que resultan cambios en la capacidad para dimerizar, se utilizan formatos de anticuerpo Fab, ya que ellos generalmente no dimerizan. El XT-M4 se ha reformateado como un anticuerpo Fab y se ha clonado en un nuevo vector de exhibición de fago pWRIL-6. Este vector tiene sitios de restricción que atraviesan las regiones VH y VL y no cortan frecuentemente en genes de línea germinal V humanos.

Estos sitios de restricción se pueden utilizar para mezclar y ensamblar de forma combinatoria repertorios VL y VH. En una estrategia, las conexiones VH-CDR3 y VL-CDR3 agregadas se ensamblan de forma combinatoria en el vector de exhibición Fab como se muestra en la Figura 34, y se seleccionan para afinidad mejorada.

Ejemplo 26 Caracterización física de anticuerpo XT-M4 quimérico.

La caracterización preliminar por cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC)/cartografía de péptido por espectroscopia de masa (MS) y análisis de su unidad con detección MS en línea han confirmado que las secuencia de aminoácidos es como se predice a partir de la secuencia de ADN XT-M4 quimérica. Estos datos MS también indican que el sitio consesus de secuencia de oligosacárido ligada a N- esperada en Asn299SerThr se ocupa y las dos especies mayores son complejos de glicanos fucosilados de núcleos bicatenarios ligados a N- que contienen cero o ningún residuo de galactosa Terminal. En adición al oligosacárido esperado ligado N- ubicado en la región FC de la molécula, se observa un oligosacárido ligado N en un sitio de secuencia consesus, (Asn52AsnSer) en la región CDR2 de la cadena pesada del XT-M4 quimérico. El oligosacárido ligado a N- extra se encuentra principalmente solo en una de las cadenas pesadas y comprende aproximadamente 38% de las moléculas como se determina por análisis CEX-HPLC (pueden ser otras especies acidas que no se pueden diferenciar mediante la estructura primaria, que pueden contribuir al porcentaje total de especies acídicas). La especies predominante es una estructura bicatenaria fucosilada con dos ácidos siálicos. La absorptividad se utiliza para calcular la concentración al medir el A28o La absorptividad teórica XT-M4 se calcula por ser 1.35 ml_ mg"1 cm"1. El evidente pesos molecular del XT-M4 quimérico como se determina por SDS-PAGE de no reducción es aproximadamente 200 kDa. El anticuerpo migra más lentamente de los esperado de su secuencia. Este fenómeno se ha observado para todos los anticuerpos recombinantes analizados hasta la fecha. Bajo condiciones de reducción, el XT-M4 quimérico tiene una banda de cadena pesada sencilla que migra en aproximadamente 50 kDa y una cadena liviana sencilla que migra en aproximadamente 25 kDa. También hay una banda adicional que migra justo por encima de la banda de cadena pesada. Esta banda se caracteriza por degradación Edman automatizada y se determina por tener un Terminal NH2 que corresponde a la cadena pesada del XT-M4 quimérico. Estos resultados, junto con el incremento en el peso molecular observado por SDS-PAGE, indican que la banda adicional es consistente con una cadena pesada que tiene el oligosacárido ligado N- en la región CDR2.

El punto isoeléctrico (pi) predicho del XT- 4 quimérico basado en la secuencia de aminoácido se 7.2 (sin Lys Terminal COOH en la cadena pesada). IEF XT-M4 quimérico resuelto en aproximadamente diez bandas que migran dentro de un rango pl de aproximadamente 7.4-8.3 con una banda dominante que migra con un pl de aproximadamente 7.8. El pl determinado por electroforesis capilar isoeléctrica de enfoque es aproximadamente 7.7.

El análisis del material de desarrollo por cromatografía liquida de alto desempeño de intercambio de catión (CEX-HPLC) suministra resolución adicional para especies XT- 4 quiméricas que difieren en la carga molecular. La mayoría de la heterogeneidad de carga observada se debe más probablemente a las contribuciones de los ácidos siálicos que se encuentran en el oligosacárido ligado a N ubicado en la región CDR2 de la cadena pesada. Una menor porción de la heterogeneidad de la carga observada se puede atribuir a la heterogeneidad de la lisina de Terminal COOH.

Ejemplo 27 Remoción del sitio de qlucosilación La mutación que convierte la asparagina (N) a ácido aspártico (D) en la posición 52 (por numeración kabat) en la región variable de cadena pesada del anticuerpo XT-M4 mejora la unión del anticuerpo XT-M4 al RAGE humano como se determina por análisis ELISA de unión directa al hRAGE-Fc, como se muestra en la Figura 36. la mutación N52D está en CDR2 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo XT-M4.

Ejemplo 28 Tratamiento de sepsis v listeriosis Los anticuerpos Anti-RAGE se muestran por tener beneficio terapéutico significativo en un modelo de murino estándar de sepsis intra-abdominal, polimicrobiana. El resultado también muestra que la expresión RAGE es altamente prejudicial a los animales expuestos sistemáticamente con listeria monocitogenes como se evidencia por los marcados beneficios de supervivencia observados en transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos comparados con animales de tipo silvestre.

A. materiales y métodos Todos los reactivos y químicos se compran de sigma (St. Louis, MO) a menos que se indique otra cosa. El anticuerpo monoclonal de rata XT-M4 IgG, con una constante de afinidad de 0.3 nM para RAGE dimérico de murino, se describe adelante. El anticuerpo monoclonal TN3.1912 (TNF) alfa de factor de necrosis anti tumoral es un anticuerpo IgG neutralizante derivado de hámsteres con alta afinidad de unión a TNF de murino. La cepa de exposición de listeria monocitogenes se compra (ATCC # 19115, Manassas, VA). Todas las cepas de ratón utilizadas en estos experimentos son de 2-6 meses de edad y son animales libres de patógenos específicos mantenidos bajo condiciones de nivel 2 de bio seguridad. Ratones machos tipo silvestre BALB/c (Charles River Laboratories, Inc, Wilmington, MA), ratones macho homocigotos RAGE"'' 129SvEvBrd, ratones machos heterocigotos RAGE"'" 129SvEvBrd y ratones machos 129SvEvBrd tipo silvestre (criados en jaulas Wyeth). Los ratones transgénicos RAGE se designan en t Wyeth Research como un gen transgénico condicional objetivado en ratones 129SvEv-Brd en el que la recombinasa Cre corta los exones 2, 3 y 4 (Lexicón Genetics, Inc, The Woodlands.TX). La eliminación resultante resulta en una truncación de cambio de estructura de la proteína RAGE y la proteína no se produce. El RAGE no es esencial para la disponibilidad en ratones. Ratones nulos RAGE no tienen fenotipos obvios y se crían normalmente. Los ratones se evalúan para supervivencia hasta siete días después de CLP o exposición a L. monocitogenes.

La microbiología cuantitativa se desarrolla de muestras de órganos obtenidas en necropsias de ratones luego de experimentos en listeriosis y CLP. Se obtienen muestras de sangre de animales supervivientes al momento del sacrificio, y se recolecta el suero y se coloca inmediatamente en hielo para determinación del citocina. La citocina del suero miden mediante un ensayo múltiples de ensayo inmunoabsorbente ligado encima utilizando las placas hechas habitualmente y el protocolo proporcionado por Meso Scale Delivery (Gaithersburg, MD). Las citocinas ensayadas son MCP-1 , IL-1 beta, TNF alpha, Interferón ? e IL-6. Se recolectan muestran de tejidos de pulmón, hígado, y vaso. El fluido peritoneal se obtiene al lavar la cavidad peritoneal con 5 mi de solución salina estéril y retirar el fluido. Los tejidos de órgano se pesan y luego se pulverizan para generar una suspensión de tejido en TSB. Los especímenes se diluyen seriamente y se cultivan a 37C aeróbicamente en TSB (para bacterias de gran positivas y gran negativa) y agar MacConkey (para bacterias gran negativas) para obtener conteos bacterianos cuantitativos estandarizados por gramo de peso de órgano o fluido de lavado peritoneal CFU/ml.

También se analizan histológicamente los tejidos animales (pulmón, íleo distal) mediante un patólogo cegado a la asignación del tratamiento de cada animal y clasificado en una clasificación de patología definida graduada de 0 (normal) a 4 (necrosis extensiva y difusa de tejidos). El agua de pulmón toral como se mide de fluido de edema pulmonar se calcula de proporciones húmedo a seco de tejido de pulmón.

Análisis de datos y diseño estadístico. El punto final principal en cada experimento es la supervivencia. Los experimentos animales se desarrollan utilizando un sistema de código numérico que es cegado a los investigadores para el tratamiento de anticuerpo o genotipo animal (versus control de suero) hasta la terminación del estudio. Los datos numéricos se presenta como media (+/- SEM). Se analizan las diferencias en supervivencia mediante una gráfica de supervivencia Kaplan-Meier y la estadística log-rank. La estadística ANOVA de un vía no paramétrica Kruskal-Wallis (para grupos múltiples) o la prueba U Mann-Whitney (para dos grupos) se utiliza para analizar diferencias entre grupos. Se utilizan múltiples comparaciones post-prueba de Duna para confirmar diferencias cuando se analizan comparaciones que involucran múltiples grupos. Un valor P de dos colas de <.05 se considera significativo.

B. Ligación de apéndice vermicular y modelo de punción Se ha descrito el procedimiento CLP en detalle previamente [Echtenacher et al., 1990, J. Immunol., 145:3762-6], En resumen, lo animales se anestesian con una inyección intraperitoneal de 200 microlitros de una combinación de cetamina (Bedford Co. Bedford, OH) (9mg/ml) y xylazina (Phoenix, St. Josephs, MO) (I mg/ml). El cecum se exterioriza a través de una incisión de línea media abdominal de aproximadamente 1 cm de longitud. El cecum se liga luego con monofilamentos de 5.0 en un nivel justo distante de la articulación ileocecal (>90% del cecum ligado). el costado anti-mesentérico del cecum se punciona a través con una aguja de diámetro 23. Una cantidad de conteo luminar se expresa luego a través de sitios de punción para asegurar permeabilidad. El cecum se regresa a la cavidad abdominal, y se cierran las incisiones de la piel y fascia con grapas quirúrgicas y monofilamentos 6.0, respectivamente. Se aplica 1 % lidocaína y bacitracina al sitio quirúrgico pos operativamente. Todos los animales reciben una única inyección intramuscular de trovafloxacina (Pfizer, New York) en una dosis 20 mg/kg inmediatamente post-operación, y se administra fluido de resucitación estándar con 1.0 mi de inyección subcutánea de solución salina normal. Los animales se regresan luego a sus jaulas individuales y se vuelve a calentar utilizando lámparas de calor hasta que ellos obtienen movilidad y la postura normal.

El Anti-RAGE mAb XT-M4 en dosis de 7.5 mg/kg o 15 mg/kg (o control sueros) se da una vez intravenosamente a ratones tipo silvestre 30-60 minutos antes de CLP o en los siguientes intervalos de tiempo post-CLP: 6, 12, 24, o 36 horas. Como un control adicional, cinco animales experimentan cirugía de grupo quirúrgico de referencia (laparotomía con movilización y exteriorización del cecum pero sin ligación o punción) Resultados. A. Supervivencia de animales transgénicos RAGE homocigotos, heterocigotos RAGE v tipo silvestre después de CLP.

La Figura 37 muestra que hubo una ventaja significativa en la supervivencia para transgénicos RAGE homocigotos (n=15) y heterocigotos RAGE (n=23) comparado con animales de control tipo silvestre (n=15) (P < .001). Los heterocigotos RAGE se protegen de sepsis polimicrobiana letal casi también como los mutantes RAGE homocigotos (RAGE"A vs. RAGE+ ", P = ns). Como se espera de los animales de cirugía del grupos quirúrgico de referencia (n=5) todos sobrevive. Un grupo adicional de 15 animales 129SvEvBrd tipo silvestre se les da mAb anti-RAGE 30 minutos antes de CLP y tienen una ventaja de supervivencia similar como los RAGE transgénicos cuando se compara con animales de control tipo silvestre, tratados con suero.

La Figura 38 muestra conteos de colonias de tejidos para organismos bacterianos entéricos gran positivos y gran negativos aeróbicos luego de CLP. Las concentraciones de tejido en hígado y tejidos del bazo y fluido peritoneal son similares en todos los tres grupos (P = ns) pero son todos significativamente mayores que animales operados como grupo quirúrgico de referencia (P < .05). Los RAGE transgénicos homocigotos tienen la menor cantidad de agua en pulmón comparado con otros grupos, aunque esto no alcanza significancia (proporción húmedo a seco: 4.8±0.2-RAGE"'" vs. 5.0± 0.4-RAGE+ " vs. 5.3±0.3-wt; P = ns).

La Figura 39 muestra que hubo diferencia significativa en la supervivencia de animales BALB/c a los que se les da suero de control (n=15) y animales que se les da anticuerpo anti-RAGE (7.5 mg/kg grupo [n=15] o 15 mg/kg grupo [n=15]) 30-60 minutos antes de CLP. Los efectos protectores óptimos se logran en 15 mg/kg de mAb anti-RAGE (P < .05 vs. 7.5 mg/kg grupo; P < .001 vs. control de sueros). Los animales que se le dio anticuerpo anti-RAGE no tienen cargas bacterianas en órganos significativamente incrementadas comparadas con los animales de control, pero ambos grupos tienen unidades formadoras de colonia más significativas (CFU)/gm de tejido de bazo y hígado que los animales de control tratados con grupo quirúrgico de referencia (n=5). Ver Tabla 1. La histopatológica del tejido de pulmón y la mucosa del intestino delgado en examen de necropsia fue marcadamente anormal en el grupo de control de suero mientras que los hallazgos patológicos fueron significativamente reducidos en el grupo mAb anti-RAGE y el grupo quirúrgico de referencia (Tabla 13).

Tabla 13 HALLAZGOS PATOLÓGICOS Y MICROBIOLÓGICOS LUEGO DE TERAPIA mAb anti-RAGE en CLP Parámetro Grupo quirúrgico Control de suero mAb anti-RAGE de control (15 mg/kg) N 5 15 15 Bacteria gran 0.6±1.5* 5643±1281 4910±39515 negativa aeróbica(CFU/gm) Bacteria gran 601 ±548* 15.616±6800 1 1 , 22211873 positiva aeróbica(CFU/gm) Clasificación 0.6±0.5 3.0±0.9** 1 .8±1.1 patológica (pulmón, intestino delgado) Proporción 4.6±0.6 5.3±0.5 5.1 ±0.6 húmedo a seco (tejido de pulmón) *P<.05 grupo quirúrgico de referencia vs otros grupos **P<.005 control vs grupo quirúrgico de referencia o mAb anti-RAGE La Figura 40 muestra los efectos de la administración retardada de una dosis única de 15 mg/kg de anticuerpo anti-RAGE en intervalos de tiempo extendidos tanto como 36 horas después de CLP. El tratamiento de anticuerpo monoclonal retrasado suministra protección significativa contra mortalidad hasta 24 horas después CLP (P < .01 ). La administración del mAb retrasada hasta 36 horas después de CLP muestra una tendencia a las supervivencia favorable pero las diferencias no fueron significativamente mayores comparadas con el grupo de control tratado con suero (P = .12). Las concentraciones de tejido de bacterias gran positivas y gran negativas entéricas aeróbicas no difieren entre los grupos de tratamiento (P = ns). Los hallazgos de un beneficio de supervivencia después de la administración retrasada de anticuerpo anti-RAGE tienen implicaciones clínicas importantes debido a que una intervención tal como el tratamiento de anticuerpo anti-RAGE típicamente no se puede dar inmediatamente después de incitar el evento en pacientes sépticos. Estos datos proporcionan soporte para el uso de mAb anti-RAGE como una terapia salvaje para pacientes con sepsis severa establecida.

B. Modelo de exposición de listeriosis de Murino Ratones machos tipo silvestre BALB/c, machos tipo silvestre, machos RAGE+/ -129SvEvBrd heterocigotos, y machos RAGE"'"-129SvEvBrd homocigotos se utilizan en estos experimentos. Se prepara un inoculo estándar de L. monocitogenes de cultivos que crecen 18 horas a 37°C en caldo de cultivo de soya tripticasa (TSB) (BBL, Cockseyville, MD).las Bacterias se centrifugan a 10,00Og durante 15 min a 4C y se resuspenden en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Se ajustan las concentraciones bacterianas espectrofotométricamente y se revisan mediante conteos de placa dilucional cuantitativa en placas de agar con soya tripticasa con 5% de RBCs de oveja (BBL, Cockseyville, MD). Diluciones en series que varían de 103-106 unidades formadoras de colonia (CFU) L. monocitogenes se administran intravenosamente para determinar el LD50 para ratones tipo silvestre, RAGE"'" transgénicos homocigotos, heterocigotos RAGE+/", y ratones tipo silvestre que se les dio 15 mg/kg de mAb anti-RAGE iv y una hora antes de exposición bacteriana. Se siguieron los animales durante 7 días después de la administración de la exposición intravenosa con L monocitogenes y se sacrifican los sobrevivientes para análisis de tejido y estudio microbiológico.

Para las determinaciones de citocina y microbiología cuantitativa diferencial detallada, se da un inoculo estándar de 104 CFU intraperitonealmente una hora después de infusión intravenosa del mAb anti-RAGE (15 mg/kg), mAb anti-TNF (20mg/kg), o volumen igual de 1 % de suero de murino autólogo como un control. El RAGE RAGE+/" y tipo silvestre también se estudian durante 48 horas a partir de este inoculo estándar (n=5/group).se sacrifican los animales 48 horas después de exposición a L. monocitogenes y se realizan microbiología cuantitativa de los tejidos del hígado y del bazo al picar las muestras de tejido y realizar dilución en serie en sangre sobre placas agar.

Resultados Los LD50 para ratones tipo silvestre es (log10) 3.31 ±0.2 CFU, mientras que el LD50 para transgénicos RAGE heterocigoto es 5.98±0.39, y 5.10±0.47 para transgénicos RAGE homocigotos. Esta diferencia de más de dos órdenes de magnitud en LD50 de listeriosis sistémica es estadísticamente significativo (P < .01) para los heterocigotos RAGE y los homocigotos comparados con ratones tipo silvestre. La dosis única de anticuerpo anti-RAGE XY-M4 también proporciona protección significativa a ratones tipo silvestres de listeriosis sistémica letal con un LD50 de 4.69±0.55 (P < .05 vs. control tipo silvestre). el nivel de protección contra listeriosis suministrado por mAb anti-RAGE es similar aquel observado en animales RAGE"'", pero no fue tan grande el que da a los animales RAGE+/" (P < .05).

No hubo diferencia estadísticamente significativa en el nivel cuantitativo de L. monocitogenes aislado en tejidos de hígado y bazo luego de una exposición sistémica de estándar de 104 CFU entre grupos (n=10 /grupo) de animales de control tipo silvestre, animales que se les dio anticuerpos anti-RAGE, transgénicos RAGE homocigotos, o heterocigotos RAGE. Ver Figura 41. Sin embargo, hubo un incremento alta y estadísticamente significativo en concentraciones bacterianas en órganos en animales que se les dio el mismo inoculo de L. monocitogenes luego de la administración de un anticuerpo anti-TNF (P < .001).

Figura 42 muestra niveles de suero de interferon gama luego de tratamiento. Las determinaciones de citocina después de exposición de listeria mostraron un nivel significativamente inferior de interferon gama en transgénicos RAGE homocigotos comparados con animales BALB/c de control. Los animales BALB/c se les dio mAb anti-TNF y tienen un nivel significativamente mayor de interferon ? comparado con controles BALB/c, mientras que los animales que se les dio mAb anti-RAGE tienen niveles de interferon ? que no fueron estadísticamente diferente de aquellos de los animales de control. Se observan resultados similares con IL-6 (grupo mAb anti-TNF-459±121 pg/ml vs. grupo de control-38±14 pg/ml; P< 01 ) y CP-1 (mAb anti-TNF -1363±480 pg/ml vs. grupo de control 566±70 pg/ml; P<.05). No se encontró diferencia significativa en niveles IL-6 o MCP-1 en animales con RAGE deficiente o en el grupo tratado con anticuerpo anti-RAGE comparado con el grupo de control. Otras determinaciones de citocina no mostraron diferencias significativas.

La exposición de Listeria monocitogenes sistémica es un modelo de estudio clásico par la respuesta inmune innata y adquirida en ratones. Los experimentos de exposición a listeria muestran que los animales transgénicos RAGE homocigotos y heterocigotos toleran esta sepsis destacadamente mejor de lo que lo hacen los animales tipo silvestre, lo que indica que los efectos perjudiciales del RAGE se ven en estado inflamatorio a diferencia de la sepsis polimicrobial acompañante. A los animales tipo silvestre se les da mAb anti-RAGE y los animales transgénicos RAGE parecen claros a L. monocitogenes así como también los animales tipo silvestres. Esto es en contraste a los animales que se les da anticuerpo mAb anti-TNF en los cuales los conteos de colonia L. monocitogenes en muestras de tejido se incrementan marcadamente. De manera similar, los niveles de citocina se incrementan después de exposición a listeria en animales que se les da. anti-TNF mAb, Pero los niveles son similares de aquellos de control en animales que se les da mAb anti-RAGE.

Estos hallazgos demuestran que el RAGE juega un papel importante en la patogenia de las sepsis. En dos estudios CLP separados, una dosis única (7.5 mg/kg a 1 -6 hora post-CLP) de XT-M4 muestran protección significativa (65% de supervivencia) en el día siete cuando se compara con ratones inyectados con 1.0% de suero de ratón autólogo (20% supervivencia). Dos dosis de XT-M4 (7 mg/kg a 6 y 12 horas post-CLP) protegido a 85% de los ratones en el día siete, comparado con aproximadamente 25% de supervivencia entre ratones que reciben suero BALB/c diluido. La administración de una dosis única de XT-M4 anti-RAGE 24 horas post CLP también es protector comparado con animales de control. Los anteriores experimentos demuestra que el RAGE juega un papel importante en la patogenia de las sepsis y sugiere que los anticuerpos anti-RAGE pueden ser agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de las sepsis.

Ejemplo 29 Evaluación adicional de anticuerpos anti-RAGE en el modelo CLP de murino El modelo CLP murino de sepsis resulta en una sepsis polimicrobiana, con absceso abdominal y bacteremia, y recrea las fases metabólicas y hemodinámicas observadas en enfermedades humanas. En este modelo, el cecum se exterioriza a través de una incisión abdominal en la línea media de aproximadamente un centímetro de longitud, luego se liga, y el costado anti-mesentérico del cecum se punciona con una aguja de diámetro 23. El cecum se regresa a la cavidad abdominal, y las incisiones de la piel y fascia se cierran. Los animales reciben una inyección intramuscular de trovafloxacina (20 mg/kg) y fluido estándar de resucitación con 1.0 mi de solución salina normal subcutáneamente. Los animales se observan durante 7 días después de CLP, se registran las muertes cuando se notan en intervalos de revisión durante el día. Como un control adicional, los animales que experimentan cirugía de grupo quirúrgico de referencia que consiste de una laparotomía con movilización y exteriorización del cecum, pero sin ligación o punción. Los resultados de supervivencia se comparan con gráficas de supervivencia Kaplan-Meier y se analizan con una prueba ANOVA no paramétrica. La eficacia de los anticuerpos RAGE en dosificación profiláctica y terapéutica y ratones RAGE genéticamente modificados se evalúan en los modelos CLP de murino.

Ratones nulos RAGE Homocigotos (RAGE-/-) muestran un grado significativo de protección de los efectos letales de punción y ligación del apéndice vermicular, cuando se compara con ratones tipo silvestre, parientes, como se muestra en la Figura 43. A los ochos días post CLP, 80% de los ratones RAGE-/- sobreviven al CLP, comparado con el 35% de los ratones tipo silvestre. Los animales RAGE-/+ tiene similitud con los animales RAGE-/-. Como se ve en los análisis de tiempo de supervivencia, los anímales RAGE-/-tienen una ventaja de supervivencia significativa sobre los animales tipo silvestre luego de CLP. Estos hallazgos demuestran que el RAGE juega un papel importante en la patogenia de la sepsis. El RAGE no es esencial para la viabilidad en ratones. Ratones RAGE eliminados homocigotos no tienen fenotipo obvio. El RAGE-/-, RAGE+/- y RAGE+/+ están en la cepa de fondo 129SvEvBrd. El análisis farmacocinético de XT-M4 administrado intraperitonealmente (IP), radioetiquetado, (4 mg/kg) muestra un T1 2 de 73 h, y un Tmax de 6 h. El XT-M4 también exhibe farmacocinéticas favorables en varías cepas de ratón. La administración intravenosa de 5 mg/kg de XT-M4 para ratones BALB/c machos exhibe una depuración de suero muy baja y el JV2 de 4 ~ 5 días. La administración intraperitoneal de 5 mg/kg de XT-M4 a ratones machos db/db también muestra farmacocinéticas similares.

En los estudios CLP separados de ratones macho BALB/c, una dosis única (7.5 mg/kg en 0-6 horas post-CLP de XT-M4 muestra protección significativa (>50% supervivencia) de los efectos de CLP, cuando se compara con ratones inyectados con 1.0% de suero de ratón autólogo (15%-20% supervivencia), en el día 7. Ver las figuras 44 y 45. Dos dosis de XT-M4 (7.5 mg/kg en 6 y 12 horas post-CLP, dosis final de 15 mg/kg, (Figura 45) protegido 90% de los ratones en el día 7 post-CLP comparado con 15% de supervivencia en el grupo de control. Se observa protección óptima con 15 mg/kg de XT-M4.

La clasificación patológica de ratones con un CLP se reduce en animales tratados con anticuerpo anti-RAGE.

Todos los animales que sobreviven al día 8 se sacrifican y experimentan examen de necropsia para evidencia histológica de lesión de órganos, así como también clasificación patológica de pulmón e intestino delgado. Se aplica una clasificación patológica graduada de 0 (normal) a 4 (necrosis extensiva y difusa de tejido). La histopatología del tejido de pulmón y mucosa de intestino delgado en examen de necropsia fue marcadamente anormal en el grupo de control de suero mientras que los hallazgos patológicos fueron significativamente reducidos en el grupo tratado con XT-M4 anti-RAGE (15 mg/kg) y el grupo quirúrgico de referencia. Ver figura 46. La reducción en la histopatología es consistente con supervivencia incrementada.

Las concentraciones de tejido de bacterias gram positivas y gram negativas enteras aeróbicas no difieren entre los grupos de tratamiento. La microbiología cuantitativa se desarrolla de muestras de órganos obtenidas en necropsia de ratones que sobreviven luego de CLP. Se recolectan muestras de tejido de pulmón, hígado, y bazo. El fluido peritoneal se obtiene al lavar la cavidad peritoneal. Los conteos bacterianos cuantitativos se estandarizan por gramo de peso de órgano o unidades formadoras de colonia (CFU)/ml de fluido de lavado peritoneal. A los animales se les da Anticuerpo XT-M4 o RAGE-/- que no tienen cargas bacterianas de órganos significativamente incrementadas comparadas con animales de control (p=ns) pero ambos grupos tienen unidades formadoras de colonia más significativas (CFU)/gm de tejido bazo e hígado que los animales de control tratados con grupos quirúrgicos de referencia (n=5) (p<0.05).

Los anticuerpos Anti-RAGE son protectores en un modelo de murino CLP con Antibióticos.

La administración intravenosa de 30 mg/kg XT-M4 en la presencia o ausencia de antibióticos protege los animales de efectos letales de CLP. Ver figura 47. Los ratones se someten a CLP en 0 h. Los ratones reciben una inyección intravenosa de 30 mg/kg XT-M4 o un volumen igual de 1 % de suero de ratón autólogo. Todos los grupos reciben una dosis de trovafloxacin (20 mg/kg IM) en el tiempo 0. En adición, el trovafloxacin (20 mg/kg intramuscular) dado en los momentos de 24 y 48 h, o vancomicina (20 mg/kg IP) se administran en los momentos de 0, 12, 24, 36, y 24 h post-CLP. La inyección de vancomicina resulta en una reducción en supervivencia. Ver figura 48. No se observan efectos aditivos cuando se administran vancomicina o trovafloxacina.

Los anticuerpos Anti-RAGE son protectores en un modelo de murino CLP con una administración retardada.

Los análisis de supervivencia Kaplan-Meier luego de punción y ligación del apéndice vermicular en animales con tratamiento retardado con mAB anti-RAGE versus tratamiento de control de suero dado en varios intervalos de tiempo después de CLP (Figura 49). Una administración intravenosa retardada del XT-M4 a ratones BALB/c machos en una dosis de 15 mg/kg en 6, 12, o 24 horas post-CLP también resulta en supervivencia significativa de los animales (N=15, Control; n=14). El tratamiento de anticuerpo monoclonal retardado proporciona proporción significativa contra mortalidad hasta 24 horas después de CLP (p<0.01). La administración retardada hasta 36 horas después de CLP muestra una tendencia favorable a la supervivencia (9/15 animales que sobreviven), pero las diferencias no fueron significativamente mayores comparadas con el grupo de control tratado con suero (p=0.12). La concentración de tejido de bacterias gram positivas y gram negativas entéricas aeróbicas no difieren entre los grupos de tratamiento (p=ns).

Ejemplo 30 La modulación RAGE No excacerba la sepsis sistémica de Listeria monocitogenes La inhibición o eliminación de RAGE no interrumpe el mecanismo anfitrión o purificación de patógenos microbianos. La exposición a Listeria monocitogenes es un modelo bien conocido para el estudio de la respuesta inmune innata y adquirida en ratones. El LD50 para ratones tipo silvestre es (log 10) 3.31 ±0.2 CFU, mientras que el LD50 para RAGE+/- heterocigoto es 5.98±0.39, y 5.10±0.47 para RAGE-/- homocigoto. Esta diferencia de más de dos órdenes de magnitud en LD50 de listeriosis sistémica es estadísticamente significativa (p<0.01) para los heterocigotos RAGE y homocigotos comparados con ratones tipo silvestre. Los ratones se exponen con una administración sistémica de Listeria monocitogenes (104 unidades formadoras de colonia (CFU)) una hora después de administración del anticuerpo o suero de control. A los animales tipo silvestre se les da anti- XT-M4 RAGE y los animales RAGE-/- parecen limpios de L. monocitogenes así como también los animales tipo silvestre. Comparado con el grupo de control, el nivel cuantitativo (CFU/gm) de L. monocitogenes en tejido hepático y del bazo no se cambia por la administración del Anticuerpo XT-M4 (15 mg/kg) o en animales nulos RAGE y heterocigotos RAGE. En contraste, se incrementan los niveles con la administración de anticuerpo anti-TNF-a (anticuerpo monoclonal TN3.1912, 20 mg/kg). Ver figura 50. Como se espera, el anticuerpo monoclonal anti-TNF incrementa significativamente la susceptibilidad de los ratones a listeriosis. La eliminación o inhibición del RAGE no exacerba la sepsis en este modelo.

Ejemplo 31 Ensayo preclínico in vivo de eficacia de anticuerpo Anti-RAGE quimérico A. Farmacocinéticas (PK) La concentración en suero de anticuerpo XT-M4 quimérico luego de una dosis única IV de 5 mg/kg a ratones BALB/c machos (n=3) se evalúa para concentración en suero XT-M4 quimérica de anticuerpo durante el tiempo que se mide con ELISA IgG. La exposición promedio al suero de XT-M4 quimérico es (23,235 g*hr/ml_) y la vida media es de aproximadamente una semana (152 horas). Ver figura 51.

B. Evaluación del efecto protector de diferentes dosis de XT-M4 quimérico después de CLP Las capacidades del anticuerpo quimérico XT- 4 y el anticuerpo XT-M4 de rata pariente para prolongar la supervivencia de ratones BALB/c machos luego de CLP se determina siguiendo la dosificación en 3.5 mg/kg, 7.5 mg/kg y 30 mg/kg intravenosamente en el momento de la cirugía, en comparación con los animales de control con suero. La gráfica de supervivencia se muestra en la figura 52. Una dosis intravenosa única (7.5 mg/kg en 0 horas post-CLP) de XT-M4 quimérico protegido aproximadamente 90% de los ratones en el día 7 post-CLP, cuando se compara con ratones inyectados con 1.0% de suero de ratón autólogo (20% supervivencia), en el día 7 (p<0. 05). Las dosis de 3.5 mg/kg y 30 mg/kg de XT-M4 quimérico también proporciona protección significativa (aproximadamente 70 % comparado con el control, p<0.05) de los ratones en el día 7 post-CLP.

C. Evaluación de la protección suministrada por XT-M4 quimérico dado 24 horas después de CLP Las diferencias en la supervivencia se analizan mediante la gráfica de supervivencia Kaplan-Meier luego de punción y ligación del apéndice vermicular en animales con tratamiento retardado (p<0.01 para ambos grupos tratados con anticuerpo comparado con el grupo de control de suero). La comparación del quimérico con el XT-M4 anti-RAG de rata cuando se administra en una dosis de 15 mg/kg intravenosamente 24 horas después del modelo CLP se describe en la figura 53. El nivel de protección suministrado por el XT-M4 quimérico en el modelo CLP es similar a aquel suministrado por el anticuerpo XT-M4 de rata pariente cuando se administra terapéuticamente 24 horas post-CLP.

Resumen de resultados La ausencia de ratones protegidos con RAGE de los efectos letales de sepsis inducida por CLP. Una dosis única de XT-M4 protege los ratones de los efectos letales del CLP. Ninguna diferencia significativa en la concentración de tejido de listeria monocitogenes 48 horas post- exposición a Listeria sistémica en RAGE-/- o ratones tratados con anticuerpo, sugiere ninguna inmunosupresión en bruto. Los datos muestran que el reemplazo de las regiones constantes del XT-M4 del anticuerpo de rata con regiones constantes humanas no afecta la actividad de unión del anticuerpo. En adición, la eficacia del modelo CLP dosificada profilácticamente con el XT-M4 muestra que el 90% de los animales se protegen en una dosis de 7.5 mg/kg. El XT-M4 quimérico y el Anticuerpo XT-M4 pariente proporcionan niveles de protección similares en el modelo CLP cuando se administra terapéuticamente 24 horas post-CLP.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad como si cada publicación individual o patente se indicara específica e individualmente para ser incorporada como referencia. En caso de conflicto, la presente solicitud, que incluye cualquier definición, regirá.

Mientras las modalidades específicas de la invención objeto han sido descritas, la anterior especificación es ilustrativa y no restrictiva. Muchas variaciones de la invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica luego de la revisión de esa especificación y las reivindicaciones adelante. El alcance completo de la invención se debe determinar por referencia a las reivindicaciones, junto con su alcance completo de equivalentes, y la especificación, junto con tales variaciones.

Claims (43)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente al RAGE y: (a) compite para unirse al RAGE con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (b) se une a un epítopo del RAGE que se une mediante un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (c) comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; o (d) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a), (b) o (c).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende una región variable de cadena liviana que comprende por lo menos dos de los CDR de una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT- M4.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, que comprende una región variable de cadena liviana que comprende tres CDR de una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende una región variable de cadena pesada que comprende por lo menos dos de los CDR de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT- M4.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende una región variable de cadena liviana que comprende tres CDR de una región variable de cadena liviana de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT- H5, XT-H7, y XT-M4; y una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT- H5, XT-H7, y XT-M4.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende regiones variables de las cadenas liviana y pesada que comprenden tres CDR de una región variable de cadena liviana y tres CDR de una región variable de cadena pesada, respectivamente, de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4.

8. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se une al RAGE humano con una constante de disociación (Kd) en el rango de entre por lo menos aproximadamente 1 x 10"7 M a aproximadamente 1 x 10~10 M.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se une al dominio V del RAGE humano.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se une específicamente las células que expresan el RAGE in vitro.

1 1. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se une específicamente las células que expresan el RAGE in vivo.

12. El anticuerpo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se une a RAGE e inhibe la unión de un socio de unión RAGE (RAGE-BP) al RAGE.

13. Un anticuerpo que se une específicamente a RAGE, y (a) comprende una región variable de cadena liviana seleccionada del grupo que consiste de: XT-H1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO: 22), XT-H3_VL (SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO: 27), y XT-M4_VL (SEQ ID NO: 17), o (b) comprende una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, y SEQ ID NO: 17; o (c) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a) o (b).

14. Un anticuerpo que se une específicamente a RAGE y, (a) comprende una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: IXT-H1_VH (SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21 ), XT-H3_VH (SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26), y XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16), o (b) comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, y SEQ ID NO: 16; o (c) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a) o (b).

15. El anticuerpo de la reivindicación 13, que (a) comprende adicionalmente una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de: XT-H1_VH (SEQ ID NO. 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21), XT-H3_VH (SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26), y XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16), o (b) comprende adicionalmente una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, y SEQ ID NO: 16; o (c) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a) o (b).

16. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende regiones variables de las cadenas liviana y pesada que tienen secuencias de aminoácido de las regiones variables de las cadenas liviana y pesada, respectivamente, de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT- H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4.

17. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo tetramérico, un anticuerpo tetravalente, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico de dominio, un anticuerpo de dominio eliminado, una proteína de fusión, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento Fd, un anticuerpo de dominio único, y un fragmento dAb.

18. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende por lo menos una mutación de un aminoácido en una región variable de cadena liviana o pesada que remueve un sitio de glucosilación.

19. Un anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión RAGE de éste, que comprende una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT- M4 (SEQ ID NO: 17), y una secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), y que comprende adicionalmente regiones constantes derivadas de las regiones humanas constantes.

20. Un anticuerpo quimérico, o un fragmento de unión RAGE de éste, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT-M4 (SEQ ID NO: 17), una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la secuencia de región variable de cadena pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), una región constante de cadena liviana humana kappa y una región constante de cadena pesada humana lgG1.

21. Un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión RAGE de éste, que comprende por lo menos una región variable de cadena liviana humanizada que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena liviana humanizada seleccionada del grupo que consiste de: XT-H2_hVL_V2.0 (SEQ ID NO: 32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQ ID NO: 33), XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4.1 (SEQ ID NO: 35), XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO: 39 ), XT-M4_hVL_V2.5 (SEQ ID NO: 40), XT-M4_hVL_V2.6 (SEQ ID NO: 41 ), XT-M4_hVL_V2.7 (SEQ ID NO: 42), XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2.9 (SEQ ID NO: 44), XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2.1 1 (SEQ ID NO: 46), XT-M4_hVL_V2.12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2.13 (SEQ ID NO: 48), y XT-M4_hVL_V2.14 (SEQ ID NO: 49).

22. Un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión RAGE de éste, que comprende una región variable de cadena pesada humanizada que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena pesada humanizada seleccionada del grupo que consiste de: XT-H2_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31 ), XT-M4_hVH_V1 .0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_V1.1 (SEQ ID NO: 37), y XT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38).

23. El anticuerpo humanizado o fragmento de éste de la reivindicación 21 , que comprende adicionalmente una región variable de cadena pesada humanizada que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena pesada humanizada seleccionada del grupo que consiste de: XT-H2_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31 ), XT-M4_hVH_V1.0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_V1.1 (SEQ ID NO: 37), y XT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38).

24. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente al RAGE, o un fragmento de unión RAGE de éste, cuyo anticuerpo es un anticuerpo XT-M4 humanizado.

25. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente al RAGE, o un fragmento de unión RAGE de éste, cuyo anticuerpo es un anticuerpo XT-H2 humanizado.

26. Un anticuerpo que se une específicamente al RAGE y bloquea la unión de un socio de cuerpo RAGE, cuyo anticuerpo tiene los CDR que tienen por lo menos 8 de las siguientes características; a. Secuencia de aminoácido Y-X-M (Y32; X33; M34) en VH CDR1 , en donde X es preferencialmente W o N; b. secuencia de aminoácido l-N-X-S (151 ; N52; X53 y S54) en VH CDR2, en donde X es P o N; c. aminoácido en la posición 58 en CDR2 de VH es Treonina; d. aminoácido en la posición 60 en CDR2 de VH es Tirosina; e. aminoácido en la posición 103 en CDR3 de VH es Treonina; f. uno o más residuos Tirosina en CDR3 de VH; g. residuo cargado positivamente (Arg o Lys) en la posición 24 en CDR1 de VL; h. residuo hidrófilo (Thr o Ser) en la posición 26 en CDR1 de VL; i. residuo pequeño Ser o Ala en la posición 25 en CDR1 de VL; j. residuo cargado negativamente (Asp o Glu) en la posición 33 en CDR1 de VL; k. residuo aromático (Phe o Tyr o Trp) en la posición 37 en CDR1 de VL; I. residuo hidrófilo (Ser o Thr) en la posición 57 en CDR2 de VL; m. Secuencia P-X-T en el extremo de CDR3 de VL en donde X puede ser el residuo hidrófobo Leu o Trp; en donde la posición de aminoácido es como se muestra las secuencias de aminoácido de cadenas pesada y liviana en la SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO: 16, respectivamente.

27. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una región variable del anticuerpo anti-RAGE seleccionada del grupo que consiste de: XT-H1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO: 22), XT-H3_VL (SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO. 27), XT-M4_VL (SEQ ID NO. 17), XT-H 1_VH (SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21 ), XT-H3_VH (SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26), y XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16).

28. Un ácido nucleico aislado que híbrida específicamente al ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que es el complemento de una secuencia nucleótido que codifica una región variable del anticuerpo anti-RAGE seleccionada del grupo que consiste de: XT-H1_VL (SEQ ID NO: 19), XT-H2_VL (SEQ ID NO: 22), XT-H3_VL (SEQ ID NO: 25), XT-H5_VL (SEQ ID NO: 23), XT-H7_VL (SEQ ID NO: 27), XT-M4_VL (SEQ ID NO: 17), XT-H1_VH (SEQ ID NO: 18), XT-H2_VH (SEQ ID NO: 21 ), XT-H3_VH (SEQ ID NO: 24), XT-H5_VH (SEQ ID NO: 20), XT-H7_VH (SEQ ID NO: 26), y XT-M4_VH (SEQ ID NO: 16), bajo condiciones estrictas de hibridación.

29. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotido que codifica una región variable del anticuerpo anti-RAGE seleccionada del grupo que consiste de: XT-H2_hVL_V2.0 (SEQ ID NO: 32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQ ID NO: 33), XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4.1 (SEQ ID NO: 35), XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO: 39 ), XT-M4_hVL_V2.5 (SEQ ID NO: 40), XT-M4_hVL_ 2.6 (SEQ ID NO: 41 ), XT-M4_hVL_V2.7 (SEQ ID NO: 42), XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2.9 (SEQ ID NO: 44), XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2.11 (SEQ ID NO: 46), XT-M4_hVL_V2.12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2.13 (SEQ ID NO: 48), y XT-M4_hVL_V2.14 (SEQ ID NO: 49), XT-H2_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31 ), XT-M4_hVH_V1.0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_V1.1 (SEQ ID NO: 37), y XT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38).

30. Un ácido nucleico aislado que híbrida específicamente a un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleotido que es el complemento de una secuencia de nucleotido que codifica una región variable del anticuerpo anti-RAGE seleccionado del grupo que consiste de: XT-H2_hVL_V2.0 (SEQ ID NO: 32), XT-H2_hVL_V3.0 (SEQ ID NO: 33), XT-H2_hVL_V4.0 (SEQ ID NO: 34), XT-H2_hVL_V4.1 (SEQ ID NO: 35), XT-M4_hVL_V2.4 (SEQ ID NO: 39 ), XT-M4_hVL_V2.5 (SEQ ID NO: 40), XT- 4_hVL_V2.6 (SEQ ID NO: 41 ), XT-M4_hVL_V2.7 (SEQ ID NO: 42), XT-M4_hVL_V2.8 (SEQ ID NO: 43), XT-M4_hVL_V2.9 (SEQ ID NO: 44), XT-M4_hVL_V2.10 (SEQ ID NO: 45), XT-M4_hVL_V2.11 (SEQ ID NO: 46), XT-M4_hVL_V2.12 (SEQ ID NO: 47), XT-M4_hVL_V2.13 (SEQ ID NO: 48), y XT-M4_hVL_V2.14 (SEQ ID NO: 49), XT-H2_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 28), XT-H2_hVH_V2.7 (SEQ ID NO: 29), XT-H2_hVH_V4 (SEQ ID NO: 30), XT-H2_hVH_V4.1 (SEQ ID NO: 31), XT-M4_hVH_V1.0 (SEQ ID NO: 36), XT-M4_hVH_V1.1 (SEQ ID NO: 37), y XT-M4_hVH_V2.0 (SEQ ID NO: 38), bajo condiciones estrictas de hibridación.

31. Un ácido nucleico aislado que comprende (a) una secuencia de nucleótido que codifica el RAGE de babuino, mono o conejo que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , y SEQ ID NO: 13; (b) un ácido nucleico que híbrida específicamente al complemento de (a): o (c) una secuencia de nucleótido que es 95% idéntica a una secuencia de nucleótido que codifica RAGE de babuino, mono o conejo seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID NO: 12, cuando el cubrimiento del interrogante es del 100%;

32. Un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad relacionada con RAGE o trastorno que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo que: (a) compite para unirse al RAGE con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (b) se une a un epítopo del RAGE que se une a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (c) comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; o (d) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a), (b) o (c).

33. El método de la reivindicación 32, en donde la enfermedad o trastorno relacionado con RAGE se selecciona del grupo que consiste de sepsis, choque séptico, listeriosis, enfermedades inflamatorias, cánceres, artritis, enfermedad de Crohn, enfermedades inflamatorias agudas crónicas, enfermedades cardiovasculares, disfunción eréctil, diabetes, complicaciones de diabetes, vasculitis, nefropatías, retinopatías, y neuropatías.

34. El método de la reivindicación 32, que comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión RAGE de éste en combinación con uno o más agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad o trastorno relacionado con RAGE que se trata.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste de: agentes anti-inflamatorios, antioxidantes, bloqueadores ß, agentes antiplaquetarios, inhibidores ACE, agentes de reducción de lípidos, agentes anti-angiogénicos, y quimioterapéuticos

36. Un método para tratar sepsis o choque séptico en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RAGE quimérico o humanizado que comprende las regiones constantes derivadas de las regiones constantes humanas, y: (a) compite para unirse al RAGE con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (b) se une a un epítopo del RAGE que se une a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H 1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (c) comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; o (d) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a), (b) o (c).

37. Un método para tratar sepsis o choque séptico en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RAGE quimérico, o un fragmento de unión RAGE de éste que comprende: una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT-M4 (SEQ ID NO: 17), una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la secuencia de región variable de cadena pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), una región constante de cadena liviana kappa humana y una región constante de cadena pesada lgG1 humana.

38. Un método para tratar listeriosis sistémica en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RAGE quimérico o humanizado que comprende regiones constantes derivadas de las regiones constantes humanas, y: (a) compite para unirse al RAGE con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (b) se une a un epítopo del RAGE que se une a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H 1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (c) comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; o (d) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a), (b) o (c).

39. Un método para tratar listeriosis en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-RAGE quimérico, o un fragmento de unión RAGE de éste, que comprende una región variable de cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana XT-M4 (SEQ ID NO: 17), una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la secuencia de región variable de cadena pesada XT-M4 (SEQ ID NO: 16), una región constante de cadena liviana kappa humana y una región constante de cadena pesada lgG1 humana.

40. Un método para inhibir la unión de un socio de unión RAGE (RAGE-BP) al RAGE en un sujeto mamífero, administrar al sujeto una cantidad inhibidora de un anticuerpo anti-RAGE quimérico o humanizado que comprende regiones constantes derivadas de las regiones constantes humanas, y: (a) compite para unirse al RAGE con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (b) se une a un epítopo del RAGE que se une a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H 1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; (c) comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de XT-H1 , XT-H2, XT-H3, XT-H5, XT-H7, y XT-M4; o (d) es un fragmento de unión RAGE de un anticuerpo de acuerdo con (a), (b) o (c).

41. El anticuerpo de la reivindicación 1 , cuyo anticuerpo se une específicamente al RAGE soluble (sRAGE).

42. El anticuerpo de la reivindicación 41 , cuyo anticuerpo se une específicamente al sRAGE seleccionado del grupo que consiste de sRAGE murino y sRAGE humano.

43. El anticuerpo de la reivindicación 42 cuyo anticuerpo se une específicamente al sRAGE con una constante de disociación ( d) en el rango de aproximadamente 1 x 10"9 M a aproximadamente 5 x 10"9 M.