BRPI9816290B1

BRPI9816290B1 - variante de uma alfa-amilase originária, uso de uma variante de alfa-amilase, aditivo detergente, composição detergente, e, composição para lavagem de roupas manual ou automática

Info

Publication number: BRPI9816290B1
Application number: BRPI9816290A
Authority: BR
Inventors: Allan Svendsen; Bjarne Ronfeldt Nielsen; Carsten Andersen; Soren Kjaerulff; Torben Lauesgaard Nissen; Torben Vedel Borchert
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1997-10-30
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2016-10-11
Also published as: AU9737398A; ATE490311T1; CA2308119A1; EP2386569B1; EP2386568A1; US20010039253A1; US20160222365A1; JP2001521739A; ES2515218T3; CA2845178A1; CN100593034C; US6204232B1; US6673589B2; CN1550549A; EP1027428A1; DE69842027D1; WO1999023211A1; EP2386569A1; CN1163597C; BRPI9813328B1

Abstract

a invenção refere-se a uma variante de uma <144>-amilase semelhante a termamyl originária que demonstra uma alteração em pelo menos uma das seguintes propriedades com relação à referida <144>-amilase originária: i) melhorada estabilidade de ph a um ph de 8 a 10,5; e/ou iii) melhorada estabilidade em ca^2+^ a ph 8 a 10,5, e/ou iii) aumentada atividade específica em temperaturas de 10 a 60<198>c.

Description

"VARIANTE DE UMA ALFA-AMILASE ORIGINÁRIA, USO DE UMA VARIANTE DE ALFA-AMILASE, ADITIVO DETERGENTE, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, E, COMPOSIÇÃO PARA LAVAGEM DE ROUPAS MANUAL OU AUTOMÁTICA" Dividido do PI 9813328-4, depositado em 30/I0/199S CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a variantes (mutantes) de a-amilases semelhantes a Termamyl originária com atividade maior em temperaturas médias e/ou pH alto, FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO a-amilases (α-1,4-gIucan-4-gIucano-hidrolases, EC 3.2.1,1) constituem um grupo de enzimas que catalisam hidrólise de amido e outros polissacarídeos e 1,4-glucosídico oligo-Imeares ou ramificados.

Existe um conjunto extenso de literatura de patente e científica relativo a esta classe industrial mente muito importante de enzimas. Um número de α-amílases como variantes de otamilases semelhantes a Termamyl é conhecido, por exemplo, de WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 e WO 96/23874.

Dentre as descrições mais recentes relativas a α-amilases, WO 96/23874 provê dados estruturais de cristais de raios-X tridimensionais para uma α-amilase semelhante a Termamyl que consiste de 300 resíduos de aminoácidos N-terminais da α-amilase de B. amyloliguefaciens (BAN™) e aminoácidos 301-483 da extremidade C-terminal da α-amilase de B. iichenifonms compreendendo a sequência de aminoácidos (a última estando comercialmente disponível sob o nome comercial Termamyl™), e que está, assim, intimamente relacionada às α-amilases de BaciUus industrialmente importantes (que, no presente contexto, são englobadas dentro do significado do termo “α-amilases semelhantes a TermamyF’, e que incluem, inter afia, as α-amilases de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens (BAN™) e B. stearothermophilus. WO 96/23874 descreve ainda metodologia para designar, na base de uma análise da estrutura de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária, variantes da α-amilase semelhante a Termamyl originária que demonstra propriedades alteradas relativas à origem.

BREVE DESCRICÂO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas variantes a-amilolíticas (mutantes) de uma α-amilase semelhante a Termamyl que demonstram desempenho de lavagem melhorado (com relação à α-amilase originária) em pH alto e em uma temperatura média. O termo “temperatura média” significa, no contexto da invenção, uma temperatura de 10°C a 60°C, preferivelmente 20°C a 50°C, especialmente 30-40°C. O termo “pH alto” significa o pH alcalino que é atualmente usado para lavagem, mais especificamente de cerca de pH 8 a 10,5.

No contexto da invenção, uma “α-amilase de temperatura baixa” significa uma α-amilase que tem uma atividade ótima relativa na faixa de temperatura de 0-30°C.

No contexto da invenção, uma “α-amilase de temperatura média” significa uma α-amilase que tem uma atividade ótima na faixa de temperatura de 30-60°C. Por exemplo, α-amilases SP690 e SP722, respectivamente, são “α-amilase de temperatura média”.

No contexto da invenção, uma “α-amilase de alta temperatura” é uma α-amilase tendo uma atividade ótima na faixa de temperatura de 60-110°C. Por exemplo, Termamyl é uma α-amilase de alta temperatura.

Alterações nas propriedades que podem ser obtidas em variantes (mutantes) da invenção são alterações em: Na estabilidade da α-amilase semelhante a Termamyl em um pH de 8 a 10,5, e/ou a estabilidade de Ca2+ em pH 8 a 10,5, e/ou a atividade específica em temperaturas de 10 a 60°C, preferivelmente 20-50°C, especialmente 30-40°C.

Deve ser notado que a temperatura ótima relativa depende frequentemente do pH específico usado. Em outras palavras, a temperatura ótima relativa determinada, por exemplo, em pH 8, pode ser substancialmente diferente da temperatura ótima relativa determinada, por exemplo, e, pH 10. A influência da temperatura na atividade enzimática A dinâmica no sítio ativo e circundante depende da temperatura e da composição de aminoácidos e é de grande importância para a temperatura ótima relativa de uma enzima. Comparando a dinâmica de a-amilases de temperatura média e alta, regiões de importância para a função de α-amilases em alta temperatura em temperaturas médias podem ser determinadas. Os perfis de atividade de temperatura da α-amilase SP722 (SEQ ID NO: 2) e da α-amilase de B. licheniformis (disponível de Novo Nordisk semelhante a Termamyl® (SEQ ID NO: 4) são mostrados na figura 2. A temperatura ótima relativa de SP722 em atividades absolutas mostra ser mais alta em temperaturas na faixa média (30-60°C) do que a α-amilase de B. licheniformis homóloga, que tem uma atividade ótima em cerca de 60-100°C. Os perfis são principalmente dependentes da estabilidade de temperatura e da dinâmica dos resíduos do sítio ativo e seus circundantes. Além disso, os perfis de atividade dependem do pH usado e do pKa dos resíduos do sítio ativo.

No primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma variante de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária, cuja variante tem atividade de α-amilase, referida variante compreende uma ou mais mutações correspondentes às seguintes mutações na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2: Τ141, Kl42, F143, D144, F145, P146, G147, R148, G149, Q174, R181, G182, D183, G184, K185, A186, W189, S193, N195, H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, S170, R171, Q172, F173, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275, K311, E346, K385, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463. T141 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S, W, Y, V; K142 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T, W, Y, V; F143A,D,R5N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V; D144A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,WjY,V; F145A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V; P146A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,-K,M,F,S,T,W,Y,V; G147A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; R148A,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G149A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; R181*,A,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G182*,A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D183*,A,R,N,C,F,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G184* ,A,R,D,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W,Y,V;

Kl 85 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; A186D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; W189A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T, Y,V; S193 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,T,W,Y,V; N195 A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W, Y, V; H107A,D,R,N,C,E,Q,G,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K108A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; G109A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D166A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; W167A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,Y,V; D168A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; Q169A,D,R,N,C,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; S170A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,T,W,Y,V; R17IA,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; Q172A,D,R,N,C,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; F173 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T, W, Y, V; Q174*,A,D,R,N,C,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; F267A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V; W268A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,Y,V; K269A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; N270A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D271A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; L272A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G273A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; A274D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; L275A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K311 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; E346A, D,R,N,C,Q,G,H,I,K,L,M,F,PS,T,W,Y,V; K385A,D,R,N,C,EQ,H,I,L,MF,P,ST,W,Y,V; G456A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; N457A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K458A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; P459A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V; G460A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; T461A,D,R,N,C,E,Q,G,H,1,L,K,M,F,P,S,W,Y,Y; V462A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y; T463A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,W,Y,V.

Preferem-se variantes que tenham uma ou mais das seguintes substituições ou deleções: K142R; S193P; N195F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R; Ρ459Τ; Τ461Ρ; Q174*; R181Q, N, S; G182T, S, N; D183*; G184*; Kl 85A, R, D, C, E, Q, G, Η, I, L, Μ, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V, R; 189T, S, N, Q.

Especialmente preferidas são variantes possuindo uma deleção nas posições Dl83 e G184 e, além disso, uma ou mais das seguintes substituições ou deleções: K142R; S193P; N195F; K269R, Q; N270Y, R, D; K311R; E346Q; K385R; K458R; P459T; T461P; Q174*; R181Q, N, S; G182T, S, N;

Kl85A, R, D, C, E, Q, G, Η, I, L, Μ, N, F, P, S, T, W, Y, V; A186T, S, N, I, V, R; W189T, S, N, Q.

As variantes da invenção acima mencionadas demonstram uma alteração em pelo menos uma das seguintes propriedades relativas à a-amilase originária: i) estabilidade de pH melhorada em um pH de 8 a 10,5; e/ou ii) estabilidade de Ca em pH 8 a 10,5; e/ou iii) atividade específica aumentada em temperaturas de 10 a 60°C, preferivelmente 20-50°C, especialmente 30-40°C. Além disso, detalhes serão descritos abaixo. A invenção refere-se ainda a construções de DNA codificando variantes da invenção; a processos para preparar variantes da invenção; e ao uso de variantes da invenção, sozinhos ou em combinação com outras enzimas, em vários produtos industriais ou processos, por exemplo, em detergentes ou para liquefação de amido.

Em um aspecto final, a invenção refere-se a um processo para prover α-amilases com pH ótimo alterado, e/ou temperatura ótima alterada, e/ou estabilidade melhorada.

Nomenclatura Na presente descrição e reivindicações, os códigos de uma letra ou de três letras convencionais para resíduos de aminoácidos são usados. Para facilidade de referência, variantes de α-amilase da invenção são descritas pelo uso da seguinte nomenclatura: Aminoácido(s) original(ais): posição(ões): aminoácido(s) substituído(s).

De acordo com esta nomenclatura, por exemplo a substituição de alanina por asparagina na posição 30 é mostrada como: Ala30Asn ou A30N uma deleção de alanina na mesma posição é mostrada como: Ala30* ou A30* e inserção de um resíduo de aminoácidos adicional, como lisina, é mostrada como: Ala30AlaLys ou A30Ak Uma deleção de um pedaço consecutivo de resíduos de aminoácidos, como resíduos de aminoácidos 30-33, é indicado como (30-33)* ou Δ (A30-N33).

Onde uma α-amilase específica contém uma “deleção” em comparação com outras α-amilases e uma inserção é feita em uma posição, isto é indicado como: *36Asp ou *36D para inserção de um ácido aspártico na posição 36.

Mutações múltiplas são separadas por sinais de mais, isto é: Ala30Asp + Glu34Ser ou A30N+E34S representando mutações nas posições 30 e 34 substituindo alanina e ácido glutâmico por asparagina e serina, respectivamente.

Quando um ou mais resíduos de aminoácidos alternativos podem ser inseridos em uma dada posição, é indicado como A30N, E ou A30N ou A30E

Além do mais, quando uma posição apropriada para modificação é identificada aqui sem qualquer modificação específica sendo sugerida, deve ser compreendido que qualquer resíduo de aminoácidos pode ser substituído pelo resíduo de aminoácidos presente na posição. Assim, por exemplo, quando uma modificação de uma alanina na posição 30 é mencionada, mas não especificada, deve ser compreendido que a alanina pode ser deletada ou substituída por qualquer outro aminoácido, isto é, qualquer um de: R, N, D, A, C, Q, E, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

BREVE DESCRICÂO DOS DESENHOS A figura 1 é um alinhamento de sequências de aminoácidos de seis α-amilases semelhantes a Termamyl originária. Os números na extrema esquerda designam as sequências de aminoácidos respectivas como a seguir: 1: SEQ ID NO: 2 2: Kaoamyl 3. SEQ ID NO: 1 4: SEQ ID NO: 5 5: SEQ ID NO: 4 6: SEQ ID NO: 3. A figura 2 mostra os perfis de atividade de temperatura de SP722 (SEQ ID NO: 2) (em pH 9) e a-amilase de B. licheniformis (SEQ ID NO: 4) (em pH 7,3). A figura 3 mostra o perfil de temperatura para SP690 (SEQ ID NO: 1), SP722 (SEQ ID NO: 2), α-amilase de B. licheniformis (SEQ ID NO: 4) empH 10. A figura 4 é um alinhamento das sequências de aminoácidos de cinco α-amilases. Os números na extrema esquerda designam as sequências de aminoácidos respectivas como a seguir: 1: amyp_camundongo 2: amyp_rato 3: amyp_suíno alfa-amilase pancreática de suínos (PPA) 4: amyp_humana 5: amyp altha alfa-amilase de A. haloplanctis (AHA) DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A g-amilase semelhante a Termamvl Sabe-se bem que um número de α-amilases produzidas por Bacillus spp. é altamente homólogo no nível de aminoácidos. Por exemplo, verificou-se que a α-amilase de B. licheniformis compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 (disponível comercialmente semelhante a Termamyl™) é cerca de 89% homóloga com α-amilase de B. amyloliquefaciens compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 5 e cerca de 79% homóloga com α-amilase de B. stearothermophilus compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3. Outras α-amilases homólogas incluem uma a-amilase derivada de uma cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 ou DSM 9375, todas as quais são descritas em detalhe em WO 95/26397, e a α-amilase descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications. 151 (1988), pp. 25-31 (ver SEQ ID NO: 6).

Ainda outras α-amilases homólogas incluem a a-amilase produzida pela cepa de B. licheniformis descrita em EP 0252666 (ATCC 27811) e as α-amilases identificadas em WO 91/00353 e WO 94/18314. Outras α-amilases de B. licheniformis semelhante a Termamyl estão compreendidas nos produtos Optitherm™ e Takatherm™ (disponíveis de Solvay), Maxamyl™ (disponível de Gist-brocades/Genecor), Spezym AA™ e Spezyme Δ12 AA™ (disponíveis de Genecor), e Keistase™ (disponível de Daiwa).

Devido à homologia substancial encontrada entre estas a- amilases, elas são consideradas pertencer à mesma classe de α-amilases, a saber, a classe de “α-amilases semelhantes a Termamyl”.

Consequentemente, no presente contexto, o termo “a-amilases semelhantes a Termamyl” pretende indicar uma α-amilase que, ao nível de aminoácidos, demonstra uma homologia substancial com Termamyl™, isto é, a α-amilase B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 aqui. Em outras palavras, as seguintes α-amilases que tem as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aqui, ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 de WO 92/26397 (igual à sequência de aminoácidos mostrada como na SEQ ID NO: 7 aqui) ou na SEQ ID NO: 2 de WO 95/26397 (igual à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 8 aqui) ou em Tsukamoto et al., 1988 (cuja sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 6 aqui) são consideradas ser “α-amilase semelhante a Termamyl”. Outras a-amilases semelhantes a Termamyl são α-amilases 1) que exibe pelo menos 60%, como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de homologia com pelo menos uma de referidas sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOS: 1-8 e/ou ii) exibe reatividade cruzada imunológica com um anticorpo aumentado contra pelo menos uma de referidas α-amilases, e/ou iii) é codificada por uma sequência de DNA que hibridiza na sequência de DNA codificando α-amilases especificadas acima que são evidentes das SEQ ID NOS: 9, 10, 11 ou 12 do presente pedido (cujas sequências de codificação codificam as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 e 5 aqui, respectivamente), de SEQ ID NO: 4 de WO 95/26397 (cuja sequência de DNA, junto com o codon de parada TAA, é mostrada na SEQ ID NO: 13 aqui e codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 8 aqui) e da SEQ ID NO: 5 de WO 95/26397 (mostrado na SEQ ID NO: 14 aqui), respectivamente.

Em conexão com a propriedade 1), a “homologia” pode ser determinada pelo uso de qualquer algoritmo convencional, preferivelmente pelo uso do programa GAP do pacote GCG versão 7.3 (junho de 1993) usando valores de "default" para penalidades GAP, que é uma penalidade de criação GAP de 3.0 e penalidade de extensão GAP de 0.1 (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, versão 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

Um alinhamento estrutural entre Termamyl (SEQ ID NO: 4) e uma α-amilase semelhante a Termamyl pode ser usada para identificar posições equivalentes/correspondentes em outras α-amilases semelhantes a Termamyl. Um processo para obter referido alinhamento estrutural é usar o programa Pile Up do pacote GCG usando valores de "default" de penalidades gap, isto é, uma penalidade de criação gap de 3.0 e uma penalidade de extensão gap de 0.1. Outros processos de alinhamento estrutural incluem a análise de agrupamentos hidrófobos (Gaboriaud et al. (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) e enroscamento reverso (Huber, T.; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE vol. 7, na 1, pp. 142-149 (1998).

Propriedade ii) de α-amilase, isto é, a reatividade cruzada imunológica, pode ser testada usando um anticorpo aumentado contra, ou reatividade com, pelo menos um epítopo de aamilase semelhante a Termamyl relevante. O anticorpo, que pode tanto ser monoclonal como policlonal, pode ser produzido por processos conhecidos na arte, por exemplo, como descrito por Hudson et al., Practical Immunology, terceira edição (1989), Blackwell Scientific Publications. A reatividade cruzada imunológica pode ser determinada usando testes conhecidos na arte, exemplos dos quais são Western Blotting ou teste de imunodifusão radial, por exemplo, como descrito por Hudson et al., 1989. A este respeito, verifica-se reatividade cruzada imunológica entre as α-amilases tendo as sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, respectivamente. A sonda de oligonucleotídeos usada na caracterização da a-amilase semelhante a Termamyl, de acordo com a propriedade iii) acima, pode ser preparada apropriadamente na base do nucleotídeo parcial ou completo ou sequência de aminoácidos da α-amilase em questão.

Condições apropriadas para testar hibridização envolve pré-embebimento em 5xSSC e pré-hibridização durante 1 h a ~40°C em uma solução de 20% de formamida, 5x solução de Denhardt, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8 e DNA do timo de bezerro tratado com som desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução suplementada com ATP 100 mM durante 18 h a ~40°C, seguido por três lavagens do filtro em 2xSSC, 0,2% de SDS a 40°C durante 30 minutos (estringência baixa), preferida a 50°C (estringência média), mais preferivelmente a 65°C (estringência alta), ainda mais preferivelmente a ~75°C (estringência muito alta). Mais detalhes sobre o processo de hibridização podem ser encontrados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2~ ed., Cold Spring Harbor, 1989.

No presente contexto, “derivado de” pretende não somente indicar uma α-amilase produzida ou produtível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma α-amilase codificada por uma sequência de DNA isolada desta cepa e produzida em um organismo hospedeiro transformado com referida sequência de DNA. Finalmente, o termo presente indicar uma α-amilase que é codificada por uma sequência de DNA originária sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da α-amilase em questão. O termo também pretende indicar que uma a α-amilase originária pode ser uma variante de uma α-amilase de ocorrência natural, isto é, uma variante que é o resultado de uma modificação (inserção, substituição, deleção) de um ou mais resíduos de aminoácidos da α -amilase de ocorrência natural. q-Amilases híbridas originárias A α-amilase originária (isto é, α-amilase da estrutura dorsal) pode ser uma α-amilase híbrida, isto é, uma α-amilase que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos pancriais derivadas de pelo menos duas a-amilases. A α-amilase híbrida originária pode ser uma que, na base de homologia com aminoácidos e/ou reatividade cruzada imunológica e/ou hibridização de DNA (como acima definido), pode ser determinada pertencer à família de α-amilases semelhantes a Termamyl. Neste caso, a a-amilase híbrida é composta tipicamente de pelo menos uma parte de uma a-amilase semelhante a Termamyl e parte(s) de uma ou mais outras a-amilases selecionadas de α-amilases semelhantes a Termamyl ou α-amilases não semelhantes a Termamyl originárias microbianas (bacterianas ou füngicas) e/ou de mamíferos.

Assim, a α-amilase híbrida originária pode compreender uma combinação de sequências de aminoácidos parciais derivando de pelo menos duas alfa-amilases semelhantes a Termamyl, ou de pelo menos uma alfa-amilase bacteriana não semelhante a Termamyl e pelo menos uma semelhante a Termamyl, ou de pelo menos uma semelhante a Termamyl e pelo menos uma α-amilase fungica. A α-amilase semelhante a Termamyl da qual deriva uma sequência de aminoácidos parcial pode, por exemplo, ser qualquer uma das α-amilases semelhantes a Termamyl aqui referidas.

Por exemplo, a α-amilase originária pode compreender uma parte C-terminal de uma α-amilase derivada de uma cepa de B. licheniformis, e uma parte N-terminal de uma α-amilase derivada de uma cepa de B. amyloliquefaciens ou de uma cepa de B. stearothermophilus. Por exemplo, a α-amilase originária pode compreender pelo menos 430 resíduos de aminoácidos da parte C-terminal da α-amilase de B. licheniformis, e pode, por exemplo, compreender a) um segmento de aminoácido correspondente a 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da α-amilase de B. amyloliquefaciens tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 5 e um segmento de aminoácidos correspondente aos 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQID NO: 4, ou uma α-amilase semelhante a Termamyl sendo idêntica à sequência de Termamyl, isto é, a α-amilase de Bacillus licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4, exceto que os 35 resíduos de aminoácidos N-terminais (da proteína madura) são substituídos pelos 33 resíduos N-terminais de BAN (proteína madura), isto é, a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 5; ou b) um segmento de aminoácidos correspondente aos 68 resíduos de aminoácidos N-terminais da α-amilase de B. stearothermophilus tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3 e um segmento de aminoácidos correspondente aos 415 resíduos de aminoácidos C-terminais da α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos em SEQ ID NO: 4.

Outra α-amilase híbrida originária apropriada é a descrita anteriormente em WO 96/23874 (de Novo Nordisk) constituindo o N-término de BAN, de α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (1-300 aminoácidos da proteína madura) e o C-término de Termamyl (301-483 aminoácidos da proteína madura). Atividade aumentada foi aumentada substituindo uma ou mais das seguintes posições da α-amilase híbrida acima (BAN: 1- 300/Termamyl: 301-483): Q360, F290 e NI02. Substituições particularmente interessantes são uma ou mais das seguintes substituições: Q360E, D; F290A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, O, Q, R, S, T; N102D, E;

As posições correspondentes na α-amilase SP722 mostrada em SEQ ID NOS 2 são uma ou mais de: S365m Y295, NI 06. Substituições correspondentes de interesse particular em referida α-amilase mostrada em SEQ ID NO: 2 são uma ou mais de: S365D, E; Y295A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T; e N106D, E.

As posições correspondentes na α-amilase SP690 mostrada em SEQ ID NO: 1 são uma ou mais de: S365, Y295, N106. As substituições correspondentes de interesse particular são uma ou mais de: S365D, E; Y295 A, C, D, E, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, S, T; N106D, E. A α-amilase não semelhante a Termamyl mencionada acima pode, por exemplo, ser uma α-amilase fungica, uma α-amilase de mamífero ou de planta ou uma α-amilase bacteriana (diferente de uma a-amilases semelhantes a Termamyl). Exemplos específicos destas α-amilases incluem a α-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, a α-amilase de ácido de A. niger, a α-amilase de Bacillus subtilis, a α-amilase pancreática de suíno e uma a-amilase de cevada. Todas estas α-amilases têm estruturas elucidadas que são marcadamente diferentes da estrutura de uma α-amilase semelhante a Termamyl típica como aqui referido.

As α-amilases fungicas acima mencionadas, isto é, derivadas de A. niger e A. oryzae, são altamente homólogas no nível de aminoácidos e, em geral, consideradas pertencer à mesma família das α-amilases. A a-amilase fungica de Aspergillus oryzae está disponível comercialmente sob o nome comercial Fungamyl™.

Além do mais, quando uma variante particular de uma a-amilase semelhante a Termamyl (variante da invenção) é referida a -de um modo convencional -por referência a modificação (por exemplo, deleção ou substituição) de resíduos de aminoácidos específicos na sequência de aminoácidos de uma α-amilase semelhante a Termamyl, deve ser compreendido que variantes de outras α-amilases semelhantes a Termamyl modificadas na(s) posição(ões) equivalentes (como determinado ser o alinhamento de sequência de aminoácidos melhor possível entre as sequências de aminoácidos respectivas) são desse modo englobadas.

Em uma forma de realização preferida da invenção, a estrutura de α-amilases é derivada de B. licheniformis (como a α-amilase semelhante a Termamyl originária), por exemplo, uma das acima referidas, como a-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4.

Propriedades alteradas das variantes da invenção A seguir discute-se a relação entre mutações que estão presentes nas variantes da invenção, e alterações desejáveis nas propriedades (relativas às de α-amilase semelhante a Termamyl) que podem resultar das mesmas.

Estabilidade melhorada em pH 8-10,5 No contexto da presente invenção, mutações (incluindo substituições de aminoácidos) de importância com relação à obtenção de estabilidade melhorada em pH alto (isto é, pH 8 -10,5) incluem mutações correspondendo às mutações em uma ou mais das seguintes posições em a-amilase SP722 (tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2): T141, K142, F143, D144, F145, P146, G147, R148, G149, R181, A186, SI93, NI95, K269, N270, K311, K458, P459, T461. A variante da invenção tem uma ou mais das seguintes substituições (usando a numeração de SEQ ID NO: 2): T141A, D,R, N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,W,Y,V; K142A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,WY,V; F143A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y.,V; D144 A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W,Y,V; F145A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V; P146A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F, S,T, W, Y, V; G147A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; R148A,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G149A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W, Y, V; K181 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S ,T, W, Y, V; A186D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,P,K,M,F,S,T,W,Y,V; S193 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,T, W, Y, V; N195A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K269A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; N270A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K311 A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; K458A,D,R,N,C,EjQjG,H,1,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; P459A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V; T4 61 A,D,R,N,C,E,Q,G,H, 1 ,L,K,M,F,P,S,W,Y,V.

Variantes de estabilidade em pH alto preferidas incluem uma ou mais das seguintes substituições na α-amilase SP722 (tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2): K142R, E181S, S193P, N195F, K269R, N270Y, K31 IR, K458R, P459T e T461P.

Nas formas de realização específicas, a α-amilase da cepa de NCIB 12512 de Bacillus tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, ou a α-amilase de B. sterothermophilus tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 3 ou a α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4, ou a α-amilase de B. amyloliquefaciens tendo a SEQ ID NO: 5 é usada como a estrutura dorsal, isto é, α-amilase semelhante a Termamyl originária, para estas mutações.

Como pode ser visto do alinhamento na figura 1, a a-amilase de B. stearothermophilus já tem uma tirosina na posição correspondente a N270 em SP722. Além disso, a α-amilase da cepa NCIB 12512 de Bacillus, a α-amilase de B. stearothermophilus, a α-amilase de B. licheniformis e a a-amilase de B. amyloliquefaciens já têm arginina na posição correspondente a K458 em SP722. Além do mais, α-amilase de B. licheniformis já tem uma prolina na posição correspondente a T461 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilases, estas substituições não são relevantes.

Variantes de α-amilases com estabilidade melhorada em pH alto podem ser construídas fazendo substituições nas regiões encontradas usando simulação de dinâmica molecular mencionadas no exemplo 2. A simulação descreve a(s) região (ões) que tem uma mobilidade ou flexibilidade mais altas em pH alto (isto é, pH 8 -10,5) quando comparada a pH médio.

Usando a estrutura de qualquer alfa-amilase bacteriana com homologia (como abaixo definido) na α-amilase semelhante a Termamyl (BA2), da qual a estrutura 3D é descrita no Apêndice 1 de WO 96/23874 (de Novo Nordisk), é possível modelar a estrutura desta alfa-amilase e submeter a mesma a simulações de dinâmica molecular. A homologia de referida a-amilase bacteriana pode ser pelo menos 60%, preferivelmente mais do que 70%, mais preferivelmente não mais do que 80%, preferivelmente mais do que 90% homóloga à α-amilase semelhante a Termamyl (BA2) mencionada acima, medida usando um programa GAP UWGCG do pacote GCG versão 7.3 (junho de 1993) usando valores de "default" para penalidades GAP [Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, versão 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711]. Substituição do resíduo desfavorável por outro pode ser aplicável.

Λ I

Estabilidade de Ca melhorada em pH 8-10.5 Λ I

Estabilidade de Ca melhorada significa que a estabilidade da enzima sob depleção de Ca2+ melhorou. No contexto da presente invenção, mutações (incluindo substituições de aminoácidos) de importância com respeito à obtenção de estabilidade de Ca2+ em pH alto incluem mutação ou deleção em uma ou mais posições correspondentes às seguintes posições na α -amilase de SP722 tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2: R181, G182, D183, G184, K185, A186, W189, N195, N270, E346, K385, K458, P459.

Uma variante da invenção tem uma ou mais das seguintes substituições ou deleções: R181*,A,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G182*,A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D183 *, AOIR,N,C,E,Q,G,FI,I,L,K,M,F,P,S,T, W, Y, V; G184*,A,R,D,N,C,E,Q,FI,I,L;K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K185A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V;

Al 86 ϋ^,Ν,ε,Ε^,Ο,Η,Ι,Ε,Κ,Μ,Ρ,Ρ^,Τ,W,Y,V; mS9AX>,R^,C>B,Q,G,HXUKM,F,^,S,T,Yy; N195A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; N270A,R,D,N,C,E,Q,H ,I,L,K,M,F,P, S ,T, W, Y, V; Ε346Α^,Ο,Ν,€,ρ,0,Η,Ι,Ε,Κ,Μ,Ε,Ρ,8,Τ^,Υ,ν; K385A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; K458A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; P459A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,S;T,W,Y,V.

Preferem-se variantes tendo uma ou mais das seguintes substituições ou deleções: R181Q, N; G182T, S, N; D183*; G184*; Kl 85A, E, D, E, Q, G, Η, I, L, Μ, N, F, P, S, T, W, Y, V; A86T, S, N, I, V; W189T, S, N, Q; N195F, N270R, D; E346Q; K385R; K458R; P459T.

Nas formas de realização específicas, a α-amilase da cepa NCIB 12512 de Bacillus tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, ou a α-amilasé de B. amyloliquefaciens tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 5, ou a α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 são usadas como a estrutura dorsal para estas mutações.

Como pode ser visto do alinhamento na figura 1, a a-amilase de B. licheniformis não tem as posições correspondentes a D183 e G184 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilases estas deleções não são relevantes.

Em uma forma de realização preferida, a variante é a a-amilase da cepa NCIB 12512 de Bacillus com deleções em D183 e G184 e ainda uma das seguintes substituições: R181Q, N e/ou G182T, S, N e/ou D183*; G184* e/ou K185A, R, D, C, E, Q, G, Η, I, L, Μ, N, F, P, S, T, W, Y, V e/ou A86T, S, N, I, V e/ou W189T, S, N, Q e/ou N195F e/ou N270R, D e/ou E346Q e/ou K385R e/ou K458R e/ou P459T.

Atividade específica aumentada em temperatura média Em um outro aspecto da presente invenção, mutações importantes com respeito à obtenção de variantes demonstrando atividade específica aumentada em temperaturas de 10-60°C, preferivelmente 20-50°C, especialmente 30-40°C, incluem mutações correspondentes a uma ou mais das seguintes posições na α-amilase de SP722 tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2: H107, K108, G109, D166, W167, D168, Q169, SI70, R171, Q172, F173, Q174, D183, G184, N195, F267, W268, K269, N270, D271, L272, G273, A274, L275, G456, N457, K458, P459, G460, T461, V462, T463. A variante da invenção tem uma ou mais das seguintes substituições: H107A,D,R,N,C,E,Q,G,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K108A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; G109A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D166A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; W167A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,Y,V; D168A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; Q169A,D,R,N,C,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; S170A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,T, W, Y, V; R17LA,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; Q172A,D,R,N,C,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W, Y, V; F173A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V; Q174*,A,D,R,N,C,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D183 * ,A,D,R,N,C,F„Q,G,H,I,L,K,M,F ,P,S, W ,Υ, V; G184*, A,R,N,C,F„Q,G,H,I,L,K,M,F ,P,S,T, W ,Υ, V; N195 A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W,Y,V; F267A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V; W268A,D,R,N,C,E,Q,G,FI)I,L,K,M,F,P,S,T,Y,V; K269A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; N270A,D,R,C,E,Q,G,FI,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; D271A,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; L272A,D,R,N,C,E,Q,G,FI,I,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G273A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; A274D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; L275A,D,R,N,C,E,Q,G,FI,I,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; G456A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; N457A,D,R,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; K458A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,M,F,P,S,T,W,Y,V; P459A,D,R,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V; G460A,D,R,N,C,E,Q,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V; T461 A,D,R,N,C,E,Q,G,H, 1 ,L,K,M,F,P,S, W, Y,V; ν462Α,Β?^Ν,€,Ε,Ρ,0,Η,ΐΧ,Κ5Μ,Ρ,Ρ,8,Τ,Ψ,Υ; T4 63A,D,R,N,C,E,Q5G,H,I,LsK,M,F,P5S,W,Y,V.

Variantes preferidas tem uma ou mais das seguintes substituições ou deleções: Q174*, D183*, G184*, K269S.

Em uma forma de realização específica, a α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 é usada como a estrutura dorsal para estas mutações.

Mutações gerais nas variantes da invenção: atividade específica aumentada em temperaturas médias As substituições de aminoácidos particularmente interessante são as que aumentam a mobilidade em tomo do sítio ativo da enzima. Isto é realizado por mudanças que rompem a interação de estabilização nas proximidades do sítio ativo, isto é, em preferivelmente 1OÂ ou 8À ou 6Â ou 4 Ã de quaisquer dos resíduos que constituem o sítio ativo.

Exemplos são mutações que reduzem o tamanho das cadeias laterais, como: Ala a Gly, Vai a Ala ou Gly, Ile ou Leu a Vala, Ala, ou Gly, Thr a Ser Espera-se que estas mutações causem flexibilidade aumentada na região do sítio ativo tanto pela introdução de cavidades como pelos rearranjos estruturais que enchem o espaço deixado pela mutação.

Pode-se preferir que uma variante da invenção compreenda uma ou mais modificações além das acima descritas. Assim, pode ser vantajoso que um ou mais resíduos de prolina presente na parte da variante de α-amilase que modificada com um resíduo não prolina é/sejam substituídos com um resíduo não prolina que pode ser quaisquer dos resíduos não prolina de ocorrência natural possíveis, e que, preferivelmente, é um alanina, glicina, serina, treonina, valina ou leucina.

Analogamente, pode-se preferir que um ou mais resíduos de cisteína presentes entre os resíduos de aminoácidos com os quais a a-amilase originária é modificada é/sejam substituídos com um resíduo não cisteína como serina, alanina, treonina, glicina, valina ou leucina.

Além do mais, uma variante da invenção pode -tanto como uma única modificação como em combinação com quaisquer das modificações descritas acima -ser modificada de modo que um ou mais Asp e/ou Glu presentes em um fragmento de aminoácidos correspondendo ao fragmento de aminoácidos 185-209 da SEQ ID NO: 4 seja substituído por um Asn e/ou Gin, respectivamente. Também de interesse é a substituição, na a-amilase semelhante a Termamyl, de um ou mais resíduos de Lys presente em um fragmento de aminoácidos correspondendo ao fragmento de aminoácidos 185-209 de SEQ ID NO: 4 por um Arg.

Será compreendido que a presente invenção engloba variantes incorporando duas ou mais das modificações descritas acima.

Além disso, pode ser vantajoso introduzir mutações de ponto em quaisquer das variantes aqui descritas.

Variantes de g-amilase tendo mobilidade aumentada em tomo do sítio ativo A mobilidade das variantes de α-amilase da invenção pode ser aumentada substituindo um ou mais resíduos de aminoácidos em uma ou mais posições próximas ao sítio do substrato. Estas posições são (usando a numeração de α-amilase de SP722 (SEQ ID NO: 2): V56, K108, D168, Q169, Q172, L201, K269, L272, L275, K446, P459.

Consequentemente, um aspecto da invenção refere-se a variantes que sofreram mutação em uma ou mais das seguintes posições.

Substituições preferidas são uma ou mais das seguintes: V56A,G,S,T,;

K108A,D,E,Q,G,H,I,L,M,N,S,T,V D168A,G,I,V,N,S,T; Q169A,D,G,H,I,L,M,N,S,T,V Q172A,D,G,H,I,L,M,N,S,T,V; L201A,G,I,V,S,T; K269A,D,E,Q,G,H,I,L,M,N,S,T,V; L272A,G,I,V,S,T; L275A,G,I,V,S,T; Y295A,D,E,Q,G,H,I,L,M,N,F,S,T,V; K446A,D,E,Q,G,H,I,L,M,N,S,T,V; P459A,G,I,L,S,T,V.

Nas formas de realização específicas da invenção, a a-amilase da Cepa NCIB 12512 de α-amilase de Bacillus tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 ou a α-amilase de B. stearothermophilus tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 3, ou a α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 4, ou a α-amilase de B. amyloliquefaciens tendo a sequência mostradas em SEQ ID NO: 5 são usadas como a estrutura dorsal destas mutações.

Como pode se ver do alinhamento na figura 1, as α-amilase de B. licheniformis e a α-amilase de B. amyloliquefaciens tem uma glutamina na posição correspondente a K269 em SP722. Além disso, a α-amilase de B. stearothermophilus tem uma serina na posição correspondendo a K269 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilase estas substituições não são relevantes.

Além do mais, como pode se ver do alinhamento na figura 1, a α-amilase de B. amyloliquefaciens tem uma alanina na posição correspondendo a L272 em SP722, e uma α-amilase de B. stearothermophilus tem uma isoleucina na posição correspondendo a L272 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilases estas substituições não são relevantes.

Como pode se ver do alinhamento na figura 1, a α-amilase da cepa 12512 de Bacillus tem uma isoleucina na posição correspondendo a L275 em SP722. Consequentemente, para referida α-amilase esta substituição não é relevante.

Como pode se ver do alinhamento na figura 1, a α-amilase de B. amyloliquefaciens tem uma fenilalanina na posição correspondendo a Y295 em SP722. Além disso, a α-amilase de B. stearothermophilus tem uma asparagina na posição correspondendo a Y295 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilases estas substituições não são relevantes.

Como se pode ver do alinhamento na figura 1, a α-amilase de B. licheniformis e a α-amilase de B. amyloliquefaciens têm uma asparagina na posição correspondendo a K446 em SP722. Além disso, a α-amilase de B. stearothermophilus tem uma histidina na posição correspondendo a K446 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilases estas substituições não são relevantes.

Como pode se ver do alinhamento na figura 1, a α-amilase de B. licheniformis, a α-amilase de B. amyloliquefaciens e a α-amilase de B. stearothermophilus têm uma serina na posição correspondendo a P459 em SP722. Além disso, a α-amilase da cepa 12512 de Bacillus tem uma treonina na posição correspondendo a P459 em SP722. Consequentemente, para referidas α-amilases estas substituições não são relevantes.

Estabilização de enzimas tendo atividade alta em temperaturas médias Em uma outra forma de realização, a invenção refere-se a melhorar a estabilidade de α-amilases em temperatura baixa (por exemplo, Alteromonas haloplanctis (Feller et al. (1994), Eur. J. Biochem 222: 441-447), e α-amilases em temperatura média (por exemplo, SP722 e SP690) possuindo atividade em temperatura média, isto é, comumente conhecidas como enzimas psicrofílicas e enzimas mesofílicas. A estabilidade pode, para esta classe particular de enzima, ser compreendida tanto como termoestabilidade como a estabilidade em condições de depleção de cálcio.

Tipicamente, enzimas exibindo a atividade alta em temperaturas médias exibem também sérios problemas em condições que estressam a enzima, como temperatura ou depleção de cálcio.

Consequentemente, o objetivo é prover enzimas que ao mesmo exibem a atividade alta desejada em temperaturas médias sem perderem sua atividade em condições levemente estressadas. A atividade da variante estabilizada medida em temperaturas médias deve, preferivelmente, estar entre 100% ou mais e 50%, e mais preferivelmente entre 100% ou mais e 70%, e mais preferivelmente entre 100% ou mais e 85% da atividade original em que a temperatura específica antes da estabilização da enzima e a enzima resultante podem suportar incubação mais longa em condições estressadas do que a enzima do tipo selvagem.

Enzimas contempladas incluem α-amilases, por exemplo, originária bacteriana ou fungica.

Um exemplo desta α-amilase em temperatura baixa é a isolada de Alteromonas haloplanctis (Feller et al. (1994), Eur. J. Biochem. 222: 441-447). A estrutura de cristal desta alfa-amilase foi solucionada (Aghajari et al. (1998), Protein Science 7: 564-572). A alfa-amilase de A. haloplanctis (5 no alinhamento mostrado na figura 4) tem uma homologia de aproximadamente 66% com alfa-amilase de suínos (PPA) no alinhamento mostrado na figura 4). A estrutura 3D de PPA é conhecida e pode ser obtida da base de dados Brookhaven sob o nome ÍOSE ou 1DHK. Com base na homologia com outras alfa-amilases mais estáveis, estabilização de “enzima altamente ativa em temperatura baixa” de alfa-amilase de Alteromonas haloplanctis pode ser obtida e ao mesmo tempo retendo a atividade alta desejada em temperaturas médias. A figura 4 mostra alinhamentos de sequência múltiplos de cinco α-amilases, incluindo AHA e a α-amilase de PPA. Mutações específicas dando estabilidade aumentada na alfa-amilase de Alteromonas haloplanctis: T66P, Q69P, R155P, Q177R, A205P, A232P, L243R, V295P, S315R.

Processos para preparar variantes de q-amilases Conhecem-se vários processos para introduzir mutações em genes. Após uma breve discussão da clonagem de sequências de DNA codificando α-amilases, processos para gerar mutações em sítios específicos na sequência codificando α-amilases serão discutidos.

Clonagem de uma sequência de DNA codificando uma ot-amilase A sequência de DNA codificando uma α-amilase originária pode ser isolada de qualquer célula ou microrganismo produzindo a a-amilase em questão, usando vários processos conhecidos na arte. Primeiro, um DNA genômico e/ou biblioteca de cDNA deve ser construído usando DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a a-amilase a ser estudada. Então, se a sequência de aminoácidos da α-amilase é conhecida, sondas de oligonucleotídeo rotuladas, homólogas podem ser sintetizadas e usadas para identificar clones codificando α-amilase de uma biblioteca genômica preparada do organismo em questão. Altemativamente, uma sonda de oligonucleotídeo rotulada contendo sequências homólogas a um gene de α-amilase conhecido pode ser usada como uma sonda para identificar clones codificando α-amilase, usando condições de hibridização e de lavagem de estringência mais baixa.

Ainda outro processo para identificar clones codificando a-amilase pode envolver inserir fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, como um plasmídeo, transformando bactérias negativas de a-amilase com a biblioteca de DNA genômico resultante, e então depositando em placas as bactérias transformadas em agar contendo um substrato para a-amilase, permitindo assim aos clones expressarem a α-amilase a ser identificada.

Altemativamente, a sequência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por processos padrão estabelecidos, por exemplo, o processo de fosforoamidito descrito por S.L. Beaucage e M.H. Caruthers (1981) ou o processo descrito por Matthes et al. (1984). No processo de fosforoamidito, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, recombinados, ligados e clonados em vetores apropriados.

Finalmente, a sequência de DNA pode ser originária genômica e sintética misturada, originária em cDNA e sintética ou originária em cDNA e genômica misturada, preparada ligando fragmentos originários sintéticos, genômica ou em cDNA (como apropriado, os fragmentos correspondentes a várias partes da sequência de DNA total), de acordo com técnicas padrão. A sequência de DNA também pode ser preparada por reação de cadeia de polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo como descrito em US 4.683.202 ou R.K. Saiki et al. (1988).

Expressão de variantes de a-amilase De acordo com a invenção, a sequência de DNA codificando a variante produzida pelos processos acima descritos, ou por quaisquer processos alternativos conhecidos na arte, pode ser expressada, na forma de enzima, usando um vetor de expressão que inclui, tipicamente, sequências de controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de início de translação e, opcionalmente, um gene repressor de vários genes ativadores. O vetor de expressão recombinante conduzindo a sequência de DNA codificando uma variante de α-amilase na invenção pode ser qualquer vetor que pode, convenientemente, ser submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira em que ele deve ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor replicando automaticamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento extracromossômico, minicromossoma ou um cromossoma artificial. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) em que foi integrado.

No vetor, a sequência de DNA deve ser conetado operavelmente em uma sequência de promotor apropriada. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostra atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteínas tanto homólogos como heterólogos na célula hospedeira. Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição da sequência de DNA codificando a variante da α-amilase da invenção, sequência que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivada de genes codificando proteínas tanto homólogos como heterólogos na célula hospedeira. Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição da sequência de DNA codificando uma variante da α-amilase da invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do operon lac de E. coli, os promotores dagA do gene agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene (amyL)áe α-amilase de Bacillus licheniformis, os promotores do gene (amyM) de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus, os promotores de α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, etc. Para transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos de promotores utilizáveis são os derivados do gene codificando a amilase TAKA de A. oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, α-amilase neutra de A. niger, α-amilase estável em ácido de A. niger, glucoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, isomerase de fosfato triose de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans. O vetor de expressão da invenção também pode compreender um terminador de transcrição apropriado e, em eucariotos, sequências de poliadenilação conetadas operavelmente na sequência de DNA codificando a variante de α-amilase da invenção. Sequências de terminação e de poliadenilação podem, apropriadamente, ser derivadas das mesmas fontes do promotor. O vetor ainda pode compreender uma sequência de DNA possibilitando o vetor replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos destas sequências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBl 10, pE194, pAMBl e pIJ702. O vetor também pode compreender um marcador selecionável, por exemplo, um gene, o produto do qual complementa um defeito na célula hospedeira, como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um que confere resistência a antibiótico como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Além do mais, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus como amdS, argB, niaD e sC, um marcador dando aumento à resistência a higromicina, ou a seleção pode ser realizada por co-transformação, por exemplo, como descrito em WO 91/17243.

Apesar de expressão intracelular poder ser vantajosa em alguns aspectos, por exemplo, quando usando certas bactérias como células hospedeiras, prefere-se geralmente que a expressão seja extracelular. Em geral, a α-amilase de Bacillus aqui mencionada compreende uma pré-região permitindo secreção da protease expressada no meio de cultura. Se desejável, esta pré-região pode ser substituída por uma pré-região diferente ou sequência de sinal, convenientemente realizada pela substituição das sequências de DNA codificando as pré-regiões respectivas.

Os procedimentos usados para ligar a construção de DNA da invenção codificando uma variante de α-amilase, o promotor, terminador e outros elementos, respectivamente, e para inserir os mesmos em vetores apropriados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos dos versados na arte (conforme, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2~ edição, Cold Spring Harbor, 1989). A célula da invenção compreendendo tanto uma construção de DNA como um vetor de expressão da invenção, como acima definido, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de α-amilase da invenção. A célula pode ser transformada com a construção de DNA da invenção codificando a variante, convenientemente integrando a construção de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem uma vez que a sequência de DNA deve ser mais provavelmente mantida estavelmente na célula. Integração das construções de DNA no cromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com processos convencionais, por exemplo, por recombinação homóloga ou heteróloga. Altemativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão, como acima descrito, em conexão com os diferentes tipos de células hospedeiras. A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior como um mamífero ou um inseto, mas é preferivelmente uma célula microbiana, por exemplo, uma célula bacteriana ou fungica (incluindo levedura).

Exemplos de bactérias apropriadas são bactérias gram positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacülus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulam, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram negativas como E. coli. A transformação das bactérias pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos ou usando células competentes de um modo conhecido per se. O organismo levedura pode, favoravelmente, ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. 0 fungo filamentoso pode pertencer, vantajosamente, a uma espécie de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Células íungicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos e transformação de protoplastos após regeneração da parede celular de um modo conhecido per se. Um procedimento apropriado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito em EP 238.023.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para produzir uma variante da α-amilase da invenção, cujo processo compreende cultivar uma célula hospedeira como acima descrito sob condições úteis na produção da variante e recuperando a variante das células e/ou meio de cultura. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional para cultivar uma célula hospedeira em questão e obter expressão da variante de α-amilase da invenção. Meios apropriados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, como descrito em catálogos do American Type Culture Collection). A variante da α-amilase secretada das células hospedeiras pode, convenientemente, ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separar as células do meio por centrifugação ou filtração, e precipitar componentes proteináceos do meio por meio de um sal como sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos como cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, ou outros.

Aplicações Industriais As variantes de α-amilase desta invenção possui propriedades valiosas permitindo uma variedade de aplicações industriais. Em particular, variantes enzimáticas da invenção são aplicáveis como um componente em composições detergentes para lavagem, lavagem de louça e limpeza de superfícies duras.

Numerosas variantes são particularmente utilizáveis na produção de adoçantes e etanol de amido, e/ou para descolamento têxtil. Condições para processos de conversão de amido, incluindo processos de sacarificação e/ou liqüefação de amido, são descritas, por exemplo, em US 3.912.590 e nas publicações de patente EP n°s 252.730 e 63.909.

Composições Detergentes Como acima mencionado, as variantes da invenção podem ser, apropriadamente, incorporadas em composições detergentes. Referência é feita, por exemplo, a WO 96/23874 e WO 97/07202 para outros detalhes referentes a ingredientes relevantes de composições detergentes (como detergentes para lavagem de roupa ou de louça), processos apropriados para formular as variantes nestas composições detergentes e para exemplos de tipos relevantes de composições detergentes.

Composições detergentes compreendendo uma variante da invenção podem, adicionalmente, compreender uma ou mais outras enzimas, como lipase, cutinase, protease, celulase, peroxidase ou lacase e/ou outra a-amilase.

Variantes de α-amilase da invenção podem ser incorporadas em detergentes nas concentrações convencionalmente empregadas. Atualmente contempla-se que uma variante da invenção pode ser incorporada em uma quantidade correspondente a 0,00001-1 mg (calculada como proteína de enzima ativa, pura) de α-amilase por litro de licor de lavagem/lavagem de louça usando níveis de dosagem convencionais de detergente. A invenção refere-se também a um processo para prover a-amilases com 1) pH ótimo alterado, e/ou 2) temperatura ótima alterada, e/ou 3) estabilidade melhorada, compreendendo as seguintes etapas: i) identificar (a) posição(ões) de marcação e/ou região(ões) de mutação da α-amilase comparando a dinâmica molecular de duas ou mais estruturas 3D de α-amilase tendo pH substancialmente diferente, perfis de temperatura e/ou estabilidade, (ii) substituindo, adicionando e/ou deletando um ou mais aminoácidos na(s) posição(ões) e/ou região(ões) identificadas.

Na forma de realização da invenção, uma α-amilase de temperatura média é comparada com uma α-amilase de alta temperatura. Em outra forma de realização, uma α-amilase de temperatura baixa é comparada com uma α-amilase tanto de temperatura média como alta.

As α-amilases comparadas devem, preferivelmente, ser pelo menos 70%, preferivelmente 80%, até 90%, como até 95%, especialmente 95% homólogas umas com as outras.

As α-amilases comparadas podem ser α-amilases semelhantes a Termamyl como acima definido. Na forma de realização específica, as a-amilases comparadas são as α-amilases mostradas em SEQ ID NOL 1 a SEQ ID NO: 8.

Em outra forma de realização, o perfil de estabilidade das a-amilases em questão comparadas é o perfil de dependência de Ca2+. MATERIAIS E MÉTODOS

Enzimas SP722: (SEQ ID NO: 2, disponível de Novo Nordisk) Termamyl™ (SEQ ID NO: 4, disponível de Novo Nordisk) SP690: (SEQ ID NO: 1, disponível de Novo Nordisk) SHA273 de Bacillus subtilis: ver WO 95/10603 Plasmídeos pJEl contém um gene codificando uma variante da a-amilase SP722 (SEQ ID NO: 2): a saber, deleção de 6 nucleotídeos correspondendo a aminoácidos D183-G184 na proteína madura. Transcrição do gene JE1 é dirigida do promotor amyL. O plasmídeo ainda mais contém a origem de replicação e gene cat conferindo resistência para canamicina obtido do plasmídeo pUBl 10 (Gryczan, TJ et al. (1978), J. bact. 134: 318-329). Métodos: Construção da biblioteca do vetor pDorKIOl O vetor de transporte pDorKIOl de E. coli/Bacillus (descrito abaixo) pode ser usado para introduzir mutações sem expressão de a-amilase em E. coli e, então, ser modificado de um modo que a α-amilase é ativa em Bacillus. O vetor foi construído como se segue: O gene codificando JE1 (SP722 com a deleção de D183-G184) foi inativado em pJEl por interrupção do gene no sítio PstI na região de codificação 5’ da SEQ ID NO: 2; SP722 por um fragmento de 1,2 kB contendo uma origem de replicação de E. coli. Este fragmento foi ampliado por PCR de pUC19 (Número de acesso GenBank: X02514) usando o iniciador dianteiro: 5’-gacctgcagtcaggcaacta-3’ e o iniciador reverso: 5’tagagtcgacctgcaggcat-3\ O amplicon de PCR e o vetor pJEl foram digeridos com PstI a 37°C durante 2 horas. O fragmento do vetor pJEl e o fragmento de PCR foram ligados em temperatura ambiente durante lhe transformados em E. coli por eletrotransformação. O vetor resultante é designado pDorKIOl.

Testes de triagem de filtro O teste pode ser usado para triagem de variantes de a-amilases semelhantes a Termamyl tendo uma estabilidade melhorada em pH alto comparada à enzima originária e variantes de α-amilases semelhantes a Termamyl tendo uma estabilidade melhorada em pH alto e temperaturas médias comparada à enzima originária dependendo da fixação da temperatura de triagem.

Teste de filtro em pH alto Bibliotecas de Bacillus são depositadas em placa em um sanduíche de acetato de celulose (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) -e filtros de nitrocelulose (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) em placas de agar TY com 10 pg/ml de canamicina a 37°C durante pelo menos 21 horas. A camada de acetato de celulose está localizada na placa de agar TY.

Cada sanduíche de filtro é especificamente marcado com uma agulha após deposição em placa, mas antes da incubação a fim de ser capaz de localizar variantes positivas no filtro e o filtro de celulose com variantes ligadas, é transferido para um recipiente com tampão de glicina-NaOH, pH 8,6 -10,6 e incubado em temperatura ambiente (pode ser alterada de 10o- 60°C) durante 15 min. Os filtros de acetato de celulose com colônias são armazenados nas placas TY em temperatura ambiente até serem usados. Após incubação, atividade residual é detectada em placas contendo 1% de agarose, 0,2% de amido em tampão de glicina-NaOH, pH 8,6 -10,6. As placas de teste com filtros de nitrocelulose são marcadas do mesmo modo como o sanduíche de filtro e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente. Após remoção dos filtros, as placas de teste são coloridas com solução de Lugol a 10%. Variantes de degradação de amido são detectadas como pontos brancos em fundo azul escuro e então identificadas nas placas de armazenagem. Variantes positivas são retriadas nas mesmas condições da primeira triagem. Teste de filtro de cálcio baixo As bibliotecas de Bacillus são depositadas em placas em um sanduíche de acetato de celulose (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) -e filtros de nitrocelulose (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) em placas de agar TY com um antibiótico relevante, por exemplo canamicina ou cloranfenicol, a 37°C durante pelo menos 21 horas. A camada de acetato de celulose está localizada na placa de agar TY.

Cada sanduíche de filtro é marcado especificamente com uma agulha após deposição em placa, mas antes da incubação a fim de ser capaz de localizar variantes positivas no filtro e o filtro de nitrocelulose com variantes ligadas é transferido para um recipiente com tampão de carbonato/bicarbonato em pH 8,5 -10 e com diferentes concentrações de EDTA (0,001 mM -100 mM). Os filtros são incubados em temperatura ambiente durante 1 h. Os filtros de acetato de celulose com colônias são armazenados em placas TY em temperatura ambiente até serem usados. Após incubação, a atividade residual é detectada nas placas contendo 1% de agarose, 0,2% de amido em tampão de carbonato/bicarbonato em pH 8,5 -10. As placas de teste com filtros de nitrocelulose são marcadas do mesmo modo como o sanduíche de filtro durante 2 h em temperatura ambiente. Após remoção dos filtros, as placas de teste são coloridas com 10% de solução de Lugol. Variantes de degradação de amido são detectada como pontos brancos em fundo azul escuro e então identificadas nas placas de armazenagem. Variantes positivas são retriadas duas vezes nas mesmas condições da primeira triagem.

Processo para obter as regiões de interesse Existem três estruturas 3D conhecidas de a-amilase bacterianas. Duas de α-amilase de B. licheniformis, base de dados Brookhaven 1BPL (Machius et al. (1955), J. Mol. Biol. 246, p. 545-559) e 1VJS (Song et al. (1996). Enzymes for Carbohydrate 163 Engineering (Prog. Biotechnol. V 12). Estas duas estruturas são desprovidas de uma peça importante da estrutura do assim denominado domínio B, na área em tomo de dois sítios de íons de cálcio e um de ligação de íons de sódio. Os requerentes, consequentemente, usaram uma estrutura 3D de uma α-amilase BA2 (WO 96/23874 que são um híbrido entre BAN™ (SEQ ID NO: 5) e α-amilase de B. licheniformis (SEQ ID NO: 4). Na base da estrutura, um modelo de alfa-amilase de B. licheniformis e a α-amilase SP722 é construído.

Fermentação e purificação de variantes de a-amilase Fermentação e purificação podem ser realizadas por processos bem conhecidos na arte.

Determinação de estabilidade Todas as experiências de estabilidade são feitas usando a mesma organização. O processo inclui: A enzima é incubada em condições relevantes (1-4). Amostras são tomadas em vários pontos de tempo, por exemplo, após 0, 5, 10, 15e30 minutos e diluídas 25 vezes (mesma diluição para todas as amostras tomadas) no tampão de teste (tampão Britton 50 mM 0,1 M em pH 7,3) e a atividade é medida usando o teste de Phadebas (Pharmacia) em condições padrão em pH 7,3, 37°C. A atividade medida antes da incubação (0 min) é usada como referência (100%). O declínio na porcentagem é calculado como uma função do tempo de incubação. A tabela mostra a atividade residual após, por exemplo, 30 minutos de incubação.

Determinação da atividade específica A atividade específica é determinada usando o teste de Phadebas (Pharmacia) como atividade/mg de enzima. As instruções do fabricante são seguidas (ver também., abaixo, sob “Assay for a-amylase activity”).

Testes para atividade de a-amilase 1. Teste de Phadebas Atividade de α-amilase é determinada por um processo empregando comprimidos de Phadebas® como substrato. Comprimidos Phadebas (Phadebas® Amylase Test, fornecido por Pharmacia Diagnostic) contêm um polímero de amido colorido de azul insolúvel de ligação cruzada que é misturado com albumina de soro bovino e uma substância tampão e prensado na forma de comprimido.

Para cada medição única, um comprimido é colocado em suspensão em um tubo contendo 5 ml de tampão Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, CaCb 0,1 mM, pH ajustado no valor de interesse com NaOH). O teste é realizado em um banho de água na temperatura de interesse. A α-amilase a ser testada é diluída em x ml de tampão Britton-Robinson 50 mM. Um ml desta solução de α-amilase é adicionado a 5 ml do tampão Britton-Robinson 50 mM. O amido é hidrolisado pela α-amilase, dando fragmentos azuis solúveis. A absorvência da solução azul resultante, medida espectrofotometricamente em 620 nm, é uma função da atividade de a-amilase. É importante que a absorvência medida em 620 nm após 10 ou 15 minutos de incubação (tempo de teste) esteja na faixa de 0,2 a 2,0 unidades de absorvência em 620 nm. Nesta faixa de absorvência existe linearidade entre atividade e absorvência (regra de Lambert-Beer). A diluição da enzima deve, consequentemente, ser ajustada para ajustar este critério. Em um conjunto especificado de condições (condições de temperatura, pH, tempo de reação, de tampão), 1 mg de uma dada α-amilase hidrolisará uma certa quantidade de substrato e uma cor azul será produzida. A intensidade da cor é medida em 620 nm. A absorvência medida é diretamente proporcional à atividade específica (atividade/mg de proteína de α-amilase pura) da a-amilase em questão em um dado conjunto de condições. 2. Processo alternativo Atividade de α-amilase é medida por um processo empregando o substrato PNP-G7. PNP-G7, que é uma abreviatura para p-nitrofenil-α, D-malto-heptaosídeo, é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase. Após a divagem, a α-glucosidase incluída no conjunto digere o substrato para liberar uma molécula de PNP livre que tem uma cor amarela e, assim, pode ser medida por espectrofotometria visível a λ=405. (400-420 nm). Conjuntos contendo substrato PNP-G7 e a-glucosidase são fabricados por Boehringer-Mannheim (catálogo ns 1054635).

Para preparar o substrato, um frasco de substrato (BM 1442309) é adicionado a 5 ml de tampão (BM 1442309). Para preparar a a-glucosidase, um frasco de α-glucosidase (BM 1462309) é adicionado a 45 ml de tampão (BM 1442309). A solução de trabalho é preparada misturando 5 ml de solução de α-glucosidase com 0,5 ml de substrato. O teste é realizado transformando 25 μΐ da solução de enzima em uma placa de mitrotítulo de 96 reservatórios e incubando a 25°C. 200 μΐ da solução de trabalho, 25°C, são adicionados. A solução é misturada e pré-incubada durante 1 min e absorção é medida a cada 15 s durante 3 minutos em OD 405 nm. O declínio da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade específica (atividade por mg de enzima) da α-amilase em questão no conjunto de condições dado.

Processos gerais de mutagênese randômica usando o programa A muragê POPE A mutagênese aleatória pode ser realizada seguindo as etapas: 1. Selecionar regiões de interesse para modificação na enzima originária. 2. Decidir sobre sítios de mutação e sítios não mutados na região selecionada. 3. Decidir sobre qual espécie de mutações deve ser realizada, por exemplo, com respeito à estabilidade e/ou desempenho desejado da variante a ser construída. 4. Selecionar mutações estruturalmente razoáveis. 5. Ajustar os resíduos selecionados pela etapa 3 com relação à etapa 4. 6. Analisar, usando um algoritmo dope apropriado, a distribuição de nucleotídeos. 7. Se necessário, ajustar os resíduos desejados para o realismo do código genético (por exemplo, levando em contra embaraços resultantes do código genético (por exemplo, a fim de impedir a introdução de codons de parada) (o versado na arte estará ciente de que algumas combinações de codons não podem ser usadas na prática e precisarão ser adaptadas). 8. Preparar iniciadores. 9. Realizar mutagênese randômica usando os iniciadores. 10. Selecionar variantes de α-amilase resultantes, triando as propriedades melhoradas desejadas.

Algoritmos dope apropriados para uso na etapa 6 serão bem conhecidos na arte. Um algoritmo é descrito por Tomandl, D. et al., Journal of Computer-Aided Molecular Design, 11 (1997), pp. 29-38). Outro algoritmo, DOPE, é descrito em: O programa dope O programa “DOPE” é um algoritmo de computador utilizável para otimizar a composição de nucleotídeos de um tripleto de codon de modo que ele codifique uma distribuição de aminoácidos que mais se assemelhe à distribuição de aminoácidos desejada. A fim de avaliar qual das possíveis distribuições é a mais similar à distribuição de aminoácidos desejada, uma função de classificação é necessária. No programa “Dope”, verificou-se que a seguinte função é apropriada: onde X;’s são as quantidades obtidas de aminoácidos e grupos de aminoácidos como calculado pelo programa, yfs são as quantidades desejadas de aminoácidos e grupos de aminoácidos como definido pelo usuário do programa (por exemplo, especificar quais dos 20 aminoácidos ou codons de parada são desejados para ser introduzidos, por exemplo, com uma certa porcentagem (por exemplo, 90% de Ala, 3% de Ile, 7% de Vai), e wfs são designados fatores de peso, como definido pelo usuário do programa (por exemplo, dependendo da importância de ter um resíduo de aminoácidos específico inserido na posição em questão). N é 21 mais o número de grupos de aminoácidos como definido pelo usuário do programa. Para fins desta função, 0o é definido como sendo 1.

Um algoritmo Monte-Carlo (um exemplo sendo o descrito por Valleau, J.P. & Whittington, S.G. (1977) A guide to Mont Cario for statistical mechanics: 1 Highways. Em “Statistical Mechanics, Part A” Equilibrium Techniques ed. B.J. Beme, New York: Plenum) é usado para encontrar o valor máximo desta função. Em cada iteração, as seguintes etapas são realizadas: 1. Uma composição de nucleotídeos randômica nova é selecionada para cada base, onde a diferença absoluta entre a composição atual e a nova é menor do que ou igual a d para cada um dos quatro nucleotídeos G, A, T, C em todas as três posições do codon (ver abaixo para definição de d). 2. As classificações da composição nova e da composição atual são comparadas pelo uso da função s como acima descrito. Se a nova classificação é superior ou igual à classificação da composição atual, a composição nova é mantida e a composição atual é mudada para a nova. Se a classificação é menor, a probabilidade de manter a composição nova é exp( 1000(nova_classificação_atual_classificação)).

Um ciclo consiste normalmente de 1000 iterações, como acima descrito, em que d está decrescendo linearmente de 1 a 0. Cem ou mais ciclos são realizados em um processo de otimização. A composição de nucleotídeos resultantes na classificação mais alta é finalmente apresentada. EXEMPLOS Exemplo 1 Exemplo na construção de homologia de Termamyl™ A homologia total da α-amilase de B. licheniformis (a seguir referida semelhante a Termamyl™) com outras α-amilases semelhantes a Termamyl é alta e a similaridade percentual é extremamente alta. A similaridade calculada para Termamyl™ em BSG (a α-amilase de B. stearothermophilus tendo a SEQ ID NO: 3), e BAN (a α-amilase de B. amyloliquefaciens tendo a SEQ ID NO: 5), usando o programa GCG da University of Wisconsin Genetics Computer Group’s, deu 89% e 78%, respectivamente. TERM tem uma deleção de 2 resíduos entre o resíduo G180 e Kl81 comparado a BAN™ e BSG. BSG tem uma deleção de 3 resíduos entre G371 e 1372 em comparação com BAN™ e Termamyl™. Além disso, BSG tem uma extensão C-terminal de mais do que 20 resíduos comparado a BAN™ e Termamyl™. BAN™ tem 2 resíduos a menos e Termamyl tem um resíduo a menos no N-término comparado a BSG. A estrutura de α-amilase de B. licheniformis (Termamyl™) e de B. amyloliquefaciens (BAN™), respectivamente, foi modelada na estrutura descrita no Apêndice 1 de WO 96/23974. A estrutura de outras a-amilases semelhantes a Termamyl (por exemplo, as aqui descritas) podem ser construídas analogamente.

Em comparação com a α-amilase usada para elucidar a presente estrutura, Termamyl™ difere, em que é desprovido de 2 resíduos em tomo de 178-182. A fim de compensar isto na estrutura modelo, o programa HOMOLOGY de BIOSYM foi usado para substituir os resíduos nas posições equivalentes na estrutura (não somente regiões estruturalmente conservadas), exceto para o ponto de deleção. Uma ligação de peptídeo foi estabelecida entre G179 (G177) e Kl 80 (Kl 80) em Termamyl™ (BAN™). A íntima relação estrutural entre a estrutura resolvida e a estrutura modelo (e assim a validade da última) é indicada pela presença de somente muito poucos átomos a serem também íntimos juntos com o modelo). A esta estrutura muito grosseira de Termamyl™ foram então adicionadas todas as águas (605) e íons (4 de cálcio e 1 de sódio) da estrutura resolvida (ver Apêndice 1 de WO 96/23874) nas mesmas coordenadas como para referida estrutura resolvida usando o programa INSIGHT. Isto pode ser feito somente com poucas sobreposições -em outras palavras, com um ajuste muito bom. Esta estrutura modelo foi então minimizada usando 200 etapas de rebaixamento Steepest e 600 etapas de gradiente Conjugated (ver Borrks et al., 1983, J. Computational Chemistry 4, p. 187-217). A estrutura minimizada foi então submetida a dinâmica molecular, 5ps aquecimento 5ps seguido por até 200ps de equilíbrio, mas mais do que 35ps. A dinâmica como realizada com o algoritmo Verlet e a temperatura de equilíbrio 300K foram mantidas usando a copulação de Behrendsen em um banho de água (Barendsen et al., 1984, J. Chemical Physics 81, p. 3684-3690). Rotações e translações foram removidas a cada picossegundo.

Exemplo 2 Processo para extrair regiões importantes para identificar variantes de a-amilase com estabilidade em pH melhorada e atividade de temperatura alterada A estrutura de raio-X e/ou a estrutura modelo da enzima de interesse, aqui SP722 e Termamyl™, são submetidas a simulações de dinâmica molecular. A simulação de dinâmica molecular são feitas usando o programa CHARM (de Molecular simulations (MSI)) ou outro programa apropriado como, por exemplo, DISCOVER (de MSI). A análise da dinâmica molecular é feita in vacuo, ou, mais preferido, incluindo águas de cristal, ou com a enzima embutida em água, por exemplo, uma esfera de água ou uma caixa de água. A simulação é realizada durante 300 picossegundos (ps) ou mais, por exemplo, 300-1200 ps. As flutuações isotrópicas são extraídas para os carbonos CA das estruturas e comparadas entre as estruturas. Onde a sequência tem deleções e/ou inserções, as flutuações isotrópicas da outra estrutura são inseridas dando, assim, 0 como a diferença na flutuação isotrópica. Para explicação de flutuações isotrópicas ver o manual CHARM (obtenível de MSI). A simulação de dinâmica molecular pode ser feita usando cargas padrão em aminoácidos carregáveis. Isto é, Asp e Glu são carregados negativamente e Lys e Arg são carregados positivamente. Esta condição assemelha-se a pH médio de apc 7. Para analisar um pH mais alto ou mais baixo, titulação da molécula pode ser feita para obter os pKa’s alterados de resíduos tituláveis padrão, normalmente em pH de 2-10; Lys, Arg, Asp, Glu, Tyr e His. Também Ser, Thr e Cys são tituláveis, mas não são levados em conta aqui. Aqui, as cargas alteradas devido ao pH são descritas como ambos Asp e Glu serem negativos em pH alto, e ambos Arg e Lys não serem carregados. Isto imita um pH de cerca de 10 a 11, onde a titulação de Lys e Arg inicia, como o pKa normal destes resíduos é de cerca de 9 a 11, onde a titulação de Lys e Arg inicia, como o pKa normal destes resíduos é cerca de 9 a 11. 1. A abordagem usada para extrair regiões importantes para identificar variantes de α-amilase com estabilidade em pH alto: As regiões importantes para construir variantes com estabilidade em pH melhorada são as regiões que, em pH extremo, exibem a mobilidade mais alta, isto é, regiões tendo as flutuações isotrópicas mais altas.

Estas regiões são identificadas realizando duas simulações de dinâmica molecular: i) um teste de pH alto em que os aminoácidos básicos, Lys e Arg, são vistos como neutros (isto é, não protonados) e os aminoácidos acídicos, Asp e Glu, tem a carga (-1) e ii) um teste de pH neutro com os aminoácidos básicos, Lys e Arg, tendo a carga simples de (+1) e os aminoácidos acídicos tendo a carga de (-1).

Os dois testes são comparados e regiões exibindo a mobilidade relativamente mais alta em pH alto comparado à análise de pH neutro foram identificadas.

Introdução de resíduos melhorando a estabilidade geral, por exemplo, ligação de hidrogênio, tomando a região mais rígida (por mutações como substituições de prolina ou substituição de resíduos de glicina), ou melhorando as cargas de sua interação, melhora a estabilidade em pH alto da enzima. 2. A abordagem usada para extrair regiões para identificar variantes de α-amilase com atividade aumentada em temperaturas médias: As regiões importantes para construir variantes com atividade aumentada em temperatura média foram verificadas como a diferença entre as flutuações isotrópicas em SP722 e Termamyl, isto é, flutuações isotrópicas de CA Termamyl menos SP722 com a mobilidade mais alta nas flutuações isotrópicas foram selecionadas. Esperou-se que estas regiões e os resíduos aumentassem a atividade em temperaturas médias. A atividade de uma alfa-amilase é expressada somente se a mobilidade correta de certos resíduos está presente. Se a mobilidade dos resíduos é muito baixa, a atividade é diminuída ou abandonada.

Exemplo 3 Construção dopada por mutagênese randômica, de variantes de q-amilase semelhante a Termamyl tendo uma estabilidade em Ca2+ melhorada em temperaturas médias comparado à enzima originária Para melhorar a estabilidade na concentração de cálcio baixa de α-amilases, mutagênese randômica na região pré-selecionada foi realizada. Região :Resíduo SAI:R181-W189 O software DOPE (ver Materiais e Processos) foi usado para determinar codons salpicados para cada mudança sugerida na região SAI minimizando a quantidade de codons de parada (ver tabela 1). A distribuição exata de nucleotídeos foi calculada nas três posições do codon para dar a população sugerida de mudanças de aminoácidos. As regiões dopadas foram dopadas especificamente nas posições indicadas para ter uma oportunidade alta de obter os resíduos desejados, mas ainda permitir outras possibilidades. TABELA 1 Distribuição de resíduos de aminoácidos para cada posição RI 81: 72% R, 2% N, 7% Q, 4% H, 4% K, 11 % S G182: 73% G, 13% A, 12% S, 2% T K185: 95% K, 5%R

Al86: 50% A, 4% N, 6% D, 1% E, 1% G, 1% K, 5% S, 31% T W187: 100% N

Dl 88: 100% D W189: 92% W, 8% S O filamento de oligonucleotídeos dopado resultante é mostrado na tabela 2 como filamento de sentido: com o nucleotídeo do tipo selvagem e sequência de aminoácidos e a distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. TABELA 2: Posiçãol81 182 185 186 187 188 189 Seq. de aminoácidosArg Gly Lys Ala Thr Asp Thr Seq. nuc. wt.cga ggt aaa gct tgg gat tgg Iniciador dianteiro (SEQ ID NO: 15): FSA:5’-caa aat cgt ate tac aaa ttc 123 456 a7g 8910 tgg Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada 1:35% A, 65% C

2: 83% G, 17% A

3: 63% G, 37% T

4: 86% G, 14% A

5: 85% G, 15% C

6: 50% T, 50% C

7: 95% A, 5% G

8: 58% G, 37% A, 5% T

9: 86% C, 13% A, 1% G

10: 83% T, 17% G

11: 92% G, 8% C

Iniciador reverso (SEQ ID NO: 16) RS A: 5’-gaa ttt gta gat acg att ttg-3’ Mutagênese randômica O oligonucleotídeo salpicado evidente da tabela 2 (que por um termo comum é designado FSA) e iniciadores reversos RSA para a região Sal e SEQ ID NO: 2 específica: iniciadores SP722 cobrindo os sítios SacII e DralII são usados para gerar fragmentos de biblioteca de PCR pelo processo de extensão em sobreposição (Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68) com uma sobreposição de 21 pares de bases. O plasmídeo pJEl é o gabarito para a reação de cadeia de polimerase. Os fragmentos de PCR são clonados no vetor de transporte pDorklOl de E. coli/Bacillus (ver Materiais e Processos) possibilitando mutagênese em E. coli e expressão imediata em Bacillus subtilis evitando acúmulo letal de amilases em E. coli. Após estabelecer os fragmentos de PCR clonados em E. coli, um fragmento de pUC19 é digerido do plasmídeo e o promotor e o gene de Termamyl mudado é fisicamente conectado e expressão pode se realizar em Bacillus.

Triagem A biblioteca pode ser triada nos testes de filtro de cálcio baixo descrito na seção “Materiais e Processos” acima.

Exemplo 4 Construção de variantes de SEP ID NO: 1 de amilase (SP690) O gene codificando a amilase de SEQ ID NO: 1 está localizado em um plasmídeo pTVB106 descrito em WO 96/23873. A amilase é expressada do promotor amyL nesta construção em Bacillus subtilis.

Uma variante da proteína é delta (T183-G184) + Y243F+Q391E+K444Q. A construção desta variante é descrita em WO 96/23873. A construção de delta (T183-G184) + N195F pelo processo de mega-iniciador, como descrito por Sarkar e Sommer (1990), BioTechniques 8; 404-407.

Iniciador BI específico do gene (SEQ ID NO: 17) e iniciador mutagênico 101458 (SEQ ID NO: 19) foram usados para ampliar por PCR um fragmento de DNA de aproximadamente 645 bp de um plasmídeo como pTVB106 (com as mutações delta (TI 83-G184) no gene codificando a amilase de SEQ ID NO: 1). O fragmento de 645 bp foi purificado de um gel agarose e usado como um mega-iniciador junto com iniciador Y2 (SEQ ID NO: 18) em um segundo PCR realizado no mesmo gabarito. O fragmento de aproximadamente 1080 bp resultante foi digerido com enzimas BstEII e AflIII de restrição e o fragmento de DNA de aproximadamente 510 bp foi purificado e ligado com o plasmídeo como pTVB106 (com as mutações delta (T183-G184) no gene codificando a amilase de SEQ ID NO: 1) digerido com as mesmas enzimas. Células SHA273 de Bacillus subtilis competentes (amilase e protease baixa) foram transformadas com a ligação e transformantes resistentes a cloranfenicol e checadas por sequenciação de DNA para verificar a presença de mutações corretas no plasmídeo.

Iniciador BI: (SEQ IDNO: 17) 5’CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCC 3’ Iniciador Y2: (SEQ ID NO: 18) 5’CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3’ Iniciador 101458 (SEQ ID NO: 19): 5’GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C 3’ A construção da variante: delta (TI 83-G184) + K185R+A186T foi realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico 101638.

Iniciador 101638: (SEQ ID NO: 20) 5’CC CAG TCC CAC GTA CGT CCC CTG AAT TTA TAT ATT TTG 3’ Variantes: delta (T183-G184) + A186T, delta (T183-G184) + Al 861, delta (T183-G184) + A186S, delta (T183-G184) + A186N são construídas por um processo similar, exceto que plasmídeo como pTVB 106 (realizando variante delta (T183-G184) + K185R+A186T) é usado como gabarito e como o vetor para fins de clonagem. O oligonucleotídeo mutagênico (Oligo 1) é: 5’ CC CAG TCC CAG NTCTTT CCC CTG AAT TTA TAT ATT TTG 3’(SEQ IDNO: 21) N representa uma mistura das quatro bases: A, C, G e T usadas na síntese de mutagenicoli-gonucleotídeo. Sequenciação de transformantes identifica o codon correto para posição de aminoácidos 186 na amilase madura.

Variante: delta (T183-G184) + K185R+A186T+N195F é construída como a seguir: PCR é realizado com iniciador x2 (SEQ ID NO: 22) e iniciador 101458 (SEQ ID NO: 19) no plasmídeo como pTVB106 (com mutações delta (T183-G184) + K185R+A186T). O fragmento de DNA resultante é usado como um mega-iniciador junto com iniciador Y2 (SEQ ID NO: 18) em um PCR no plasmídeo como pTVB106 (com mutações delta (T183-G184) + NI95). O produto do segundo PCR é digerido com endonuclease de restrição Acc65I e AflIII e clonado no plasmídeo como pTVB106 (delta (T183-G184) + N195F) digerido com as mesmas enzimas. Iniciador x2: (SEQ ID NO: 22) 5’GCG TGG ACA AAG TTT GAT TTT CCT G 3’ Variante: delta (T183-G184) + K185R + A186T + N195F + Y243F + Q391E + K444Q é construída como a seguir: PCR é realizado com iniciador x2 e iniciador 101458 no plasmídeo como pTVB106 (com mutações delta (T183-G184) + K185R+A186T). O fragmento de DNA resultante é usado como um mega-iniciador junto com iniciador Y2 em um PCR no plasmídeo como pTVBlOó (com mutações delta (T183-G184) + Y243F + Q391E + K444Q). O produto do segundo PCR é digerido com endonuclease de restrição Acc65I e AflIII e clonado no plasmídeo como pTVBlOó (delta (T183-G184) + Y243F + Q391E + K444Q) digerido com as mesmas enzimas.

Exemplo 5 Construção de variantes de g-amilase dirigidas ao sítio na α-amilase SP722 originária (SEQID NO: 2) A construção de variantes de amilase SEQ ID NO: 2 (SP722) é realizada como abaixo descrito. O gene codificando a amilase da SEQ ID NO: 2 está localizado em um plasmídeo pTVBl 12 descrito em WO 96/23873. A amilase é expressada do promotor amyL nesta construção em Bacillus subtilis. A construção de delta (D183-G184) + V56I pelo processo de mega-iniciador, como descrito por Sarkar e Sommer, 1990 (BioTechniques 8: 404-407). O iniciador DA03 específico do gene e iniciador mutagênico Da07 são usados para ampliar por PCR um fragmento de DNA de aproximadamente 820 bp de um plasmídeo como pTVB112 (com as mutações delta (D183-G184) no gene codificando a α-amilase mostrada em SEQ ID NO: 2. O fragmento de 820 bp é purificado de um gel agarose e usado como um mega-iniciador junto com o iniciador DA01 em um segundo PCR realizado no mesmo gabarito. O fragmento de aproximadamente 920 bp resultante é digerido com enzimas de restrição NgoM I e Aat I e o fragmento de DNA de aproximadamente 170 bp resultante é purificado e ligado com o plasmídeo como pTVBl 12 (com as mutações delta (D183-G184) no gene codificando a amilase mostrada em SEQ ID NO: 2) digerido com as mesmas enzimas. Células SHA273 de Bacillus subtilis competentes (amilase e protease baixa) são transformadas com a ligação e transformantes resistentes a cloranfenicol são checadas por sequenciação de DNA para verificar a presença de mutações corretas no plasmídeo.

Iniciador DA01: (SEQ ID NO: 23) 5’CCTAATGATGGGAATCACTGG 3’ Iniciador DA03: (SEQID NO: 24) 5’GCATTGGATGCTTTTGAACAACCG 3’ Iniciador DA07 (SEQ ID NO: 25) 5’CGCAAAATGATATCGGGTATGGAGCC 3’ Variantes: delta (D183-G184) + K108L, delta (D183-G184) + K108Q, delta (D183-G184) + K108E, delta (D183-G184) + K108V, foram construídas pelo processo de mega-iniciador, como descrito por Sarkar e Sommer, 1990 (BioTechniques 8: 404-407): PCR é realizado com iniciador DA03 e iniciador de mutagênese DA20 no plasmídeo como pTVB112 (com mutações delta (D183-G184)). O fragmento de DNA resultante é usado como um mega-iniciador junto com o iniciador DA01 em um PCR no plasmídeo pTVBl 12 (com mutações delta (Dl83-G184)). O produto de aproximadamente 920 bp do segundo PCR é digerido com endonucleases de restrição Aat II e Mlu I e clonado no plasmídeo como pTVB112 (delta (Dl83-G184)) digerido com as mesmas enzimas.

Iniciador DA20 (SEQ ID NO: 26): 5 OTGATGAACCACSWAGGTGGAGCTGATGC 3 ’ S representa uma mistura das duas bases: C e G usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico e W representa uma mistura das duas bases: A e T usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico.

Sequenciação de transformantes identifica o codon correto para posição 108 de aminoácidos na amilase madura.

Construção das variantes: delta (D183-G184) + D168A, delta (D183-G184) + Dl681, delta (D183-G184) + D168V, delta (D183-G184) + D168T é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DAM.

Iniciador DAM (SEQ ID NO: 27): 5’GATGGTGTATGGRYCAATCACGACAATTCC 3’ R representa uma mistura das duas bases: A e G usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico e Y representa uma mistura das duas bases: C e T usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico.

Sequenciação de transformantes identifica o codon correto para posição 168 de aminoácidos na amilase madura.

Construção da variante: delta (D183-G184) + Q169N é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DAI 5.

Iniciador DA15 (SEQ ID NO: 28) 5 ’ GGTGTATGGGATAACTCACGACAATTCC 3’ Construção da variante: delta (Dl83-G184) + Q169L é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA 16.

Iniciador DA 16 (SEQ ID NO: 29): 5’GGTGTATGGGATCTCTCACGACAATTCC 3’ Construção da variante: delta (D183-G184) + Q172N é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DAI 7.

Iniciador DA17 (SEQ ID NO: 30) 5 OGGATCAATCACGAAATTTCCAAAATCGTATC 3 ’ Construção da variante: delta (D183-G184) + Q172L é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA 18.

Iniciador DAI 8 (SEQ ID NO: 31): 5 ’GGGATCAATCACGACTCTTCCAAAATCGTATC 3 ’ Construção da variante: delta (D 183-G184) + L201I é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA06.

Iniciador DA06 (SEQ ID NO: 32): 5 ’ GG AAATT AT G ATT AT ATC AT GT AT GC AGAT GT AG 3 ’ Construção da variante: delta (D183-G184) + K269S é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA06.

Iniciador DA09.

Iniciador DA09 (SEQ ID NO: 33) 5’GCTGAATTTTGGTCGAATGATTTAGGTGCC 3’ Construção da variante: delta (D183-G184) + K269K é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA011.

Iniciador DA06.

Iniciador DAI 1 (SEQ ID NO: 34): 5 OCTGAATTTTGGTCGAATGATTTAGGTGCC 3’ Construção da variante: delta (D183-G184) + N270Y é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA21.

Iniciador DA09.

Iniciador DA21 (SEQ ID NO: 35): 5 OAATTTTGGAAGTACGATTTAGGTCGG 3’ Construção das variantes: (D183-G184) + L272A, (D183-G184) + L272I, (D183-G184) + L272V, (D183-G184) + L272T é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DAI2. Iniciador DA12 (SEQ ID NO: 36): 5’GGAAAACGATRYCGGTGCCTTGGAGAAC 3’ R representa uma mistura das duas bases: A e G usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico e Y representa uma mistura das duas bases: C e T usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico.

Sequenciação de transformantes identifica o codon correto para posição 272 de aminoácidos na amilase madura.

Construção das variantes: delta (D183-G184) + L275A, delta (D183-G184) + L275I, delta (D183-G184) + L275V, delta (D183-G184) + L275T é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA 13.

Iniciador DA13 (SEQID NO: 37): 5’GATTTAGGTGCCTRYCAGAACTATTTA 3’ R representa uma mistura das duas bases: A e G usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico e Y representa uma mistura das duas bases: C e T usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico.

Sequenciação de transformantes identifica o codon correto para a posição 275 de aminoácidos na amilase madura.

Construção da variante: delta (D183-G184) + Y295E é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA08.

Iniciador DA08 (SEQ ID NO: 38): 5’CCCCCTTCATGAGAATCTTTATAACG 3’ Construção de delta (D183-G184) + K446Q pelo processo de mega-inciador, como descrito por Sarkar e Sommer, 1990 (BioTechniques 8: 404-407).

Iniciador DA04 específico do gene, recombinação a jusante de 214-231 bp relativa ao codon STOP e iniciador mutagênico DA10 foram usados para ampliar por PCR um fragmento de DNA de aproximadamente 350 bp de um plasmídeo como pTVB112 (com as mutações delta (Dl 83-G184) no gene codificando a amilase descrita em SEQ ID NO: 2). O fragmento de DNA resultante é usado como um mega-iniciador junto com o iniciador DA05 em um PCR no plasmídeo como pTVB112 (com mutações delta (D183-G184)). O produto de aproximadamente 460 bp do segundo PCR é digerido com endonucleases de restrição SnaB I e Not I e clonado no plasmídeo como pTVB112 (delta (Dl 83-G184)) digerido com a mesmas enzimas.

Inciador DA04 (SEQID NO: 39): 5’GAATCCGAACCTCATTACACATTCG 3’ Iniciador DA05 (SEQ ID NO: 40): 5’CGGATGGACTGAGAAGGAAATACCACG 3’ Iniciador DA 10 (SEQ ID NO: 41) 5’CGTAGGGCAAAATCAGGCCGGTCAAGTTTGG 3’ Construção das variantes: delta (D183-G184) + K458R é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA22.

Iniciador DA22 (SEQ ID NO: 42): 5’CATAACTGGAAATCGCCCGGGAACAGTTACG 3’ Construção das variantes: delta (D183-G184) + P495S e delta (D183-G184) + P459T é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DAI9.

Iniciador DAI9 (SEQ ID NO: 43): 5 ’ CTGGAAATAAA W CGGAAC AGTT ACG 3’ W representa uma mistura das duas bases: A e T usadas na síntese de oligonucleotídeo mutagênico.

Sequenciação de transformantes identifica o codon correto para posição 459 de aminoácidos na enzima madura.

Construção das variantes: delta (D183-G184) + T461P é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA23.

Iniciador DA23 (SEQ ID NO: 44): 5’GGAAATAAACCAGGACCCGTTACGATCAATGC 3’ Construção da variante: delta (Dl83-G184) + K142R é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA32.

Iniciador DA32 (SEQ ID NO: 45): 5’GAGGCTTGGACTAGGTTTGATTTTCCAG 3’ Construção da variante: delta (D183-G184) + K269R é realizada de um modo similar, exceto que se usou o iniciador mutagênico DA31.

Iniciador DA31 (SEQ ID NO: 46): 5’GCTGAATTTTGGCGCAATGATTTAGGTGCC 3’ Exemplo 6 Construção de variantes de α-amilase dirigidas ao sítio na q-amilase Termamvl originária (SEQ ID NO: 4) O gene amyL, codificando a α-amilase Termamyl está localizado no plasmídeo pDN1528 descrito em WO 95/10603 (Novo Nordisk). Variantes com substituições N265R e N265D, respectivamente, de referida α-amilase originária são construídas pelos processos descritos em WO 97/41213 ou pela abordagem do “mega-iniciador” acima descrito. Oligonucleotídeos mutagênicos são: Iniciador bl 1 para a substituição N265R: 5’PCC AGC GCG CCT AGG TCA CGC TGC CAA TAT TCA G (SEQ ID NO: 56).

Iniciador bl2 para a substituição N265D: 5’PCC AGC GCG CCT AGG TCA TCC TGC CAA TAT TCA G (SEQ ID NO: 57) P representa um grupo de fosfato.

Exemplo 7 Determinação de estabilidade em pH em pH alcalino de variantes da oc-amilase originária tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 Nesta série de análises, foram usadas amostras de enzimas purificadas. As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão CAPS 100 mM ajustado em pH 10,5. As soluções foram incubadas a 75°C.

Após incubação durante 20 e 30 min, a atividade residual foi medida usando o teste PNP-G7 (descrito na seção “Materiais e Processos” acima). A atividade residual nas amostras foi medida usando tampão Britton Robinson em pH 7,3. O declínio na atividade residual foi medido com relação a uma solução de referência correspondente da mesma enzima em 0 minutos, que não é incubada em pH alto e 75°C. A porcentagem da atividade inicial como uma função é mostrada na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 2) e para as variantes em questão.

Em uma outra série de análise, sobrenadantes de cultura são usados. As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão CAPS 100 mM ajustado em pH 10,5. As soluções foram incubadas a 80°C.

Após incubação durante 30 minutos, a atividade residual foi medida usando o teste de Phadebas (descrito na seção “Materiais e Processos” acima. A atividade residual nas amostras foi medida usando tampão Britton Robinson em pH 7,3. O declínio na atividade residual foi medido com relação a uma solução de referência correspondente da mesma enzima em 0 minutos, que não é incubada em pH alto e 80°C. A porcentagem da atividade inicial como uma função é mostrada na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 2) e para as variantes em questão.

Exemplo 8 Determinação da estabilidade em cálcio em pH alcalino de variantes de g-amilase originária tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, SEP ID NO: 2 e SEP ID NO: 4 A: Estabilidade em cálcio de variantes da sequência em SEP ID NO: 1 As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão CAPS 100 mM ajustado em pH 105, às quais adicionou-se polifosfato (no tempo t=0) para dar uma concentração final de 2400 ppm. As soluções foram incubadas a 50°C. A porcentagem da atividade inicial como uma função é mostrada na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 1) e para as variantes em questão. n.d. = Não determinado B. Estabilidade em cálcio de variantes da sequência em SEQ ID NO: 2 Nesta série de análise, amostras purificadas de enzimas foram usadas. As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão CAPS 100 mM ajustado em pH 10,5, às quais adicionou-se polifosfato (no tempo t=0) para dar uma concentração final de 2400 ppm. As soluções foram incubadas a 50°C.

Após incubação durante 20 e 30 minutos, a atividade residual foi medida usando o teste PNP-G7 (acima descrito). A atividade residual nas amostras foi medida usando tampão Britton Robinson em pH 7,3. O declínio na atividade residual foi medido com relação a uma solução de referência correspondente da mesma enzima em 0 minutos, que não é incubada em pH alto e 50°C. A porcentagem da atividade inicial como uma função é mostrada na tabela abaixo para a enzima originária (SEQID NO: 2) e para as variantes em questão.

Nesta série de análises, sobrenadantes de cultura foram usados. As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão CAPS 100 mM ajustado em pH 10,5, às quais adicionou-se polifosfato (no tempo: t=0) para dar uma concentração final de 2400 ppm. As soluções foram incubadas a 50°C.

Após incubação durante 30 minutos, a atividade residual foi medida usando o teste de Phadebas como acima descrito. A atividade residual nas amostras foi medida usando tampão Britton Robinson em pH 7,3. o declínio na atividade residual foi medido com relação a uma solução de referência correspondente da mesma enzima em 0 minutos, que não é incubada em pH alto e 50°C. A porcentagem da atividade inicial como uma função é mostrada na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 2) e para as variantes em questão. C: Estabilidade em cálcio de variantes das sequências em SEP ID NO: 4 As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão CAPS 100 mM ajustado em pH 10,5, às quais adicionou-se polifosfato (no tempo t=0) para dar uma concentração final de 2400 ppm. As soluções foram incubadas a 60°C durante 20 minutos.

Após incubação durante 20 minutos, a atividade residual foi medida usando o teste PNP-G7 (acima descrito). A atividade residual nas amostras foi medida usando tampão Britton Robinson em pH 7,3. O declínio na atividade residual foi medido com relação a uma solução de referência correspondente da mesma enzima em 0 minutos, que não é incubada em pH alto e 60°C. A porcentagem da atividade inicial como uma função é mostrada na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 4) e para as variantes em questão.

Exemplo 9 Medição da atividade em temperatura média de α-amilases tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEP ID NO: 1 A: Atividade de α-amilase de variantes da sequência em SEP ID NO: 1 As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão Britton Robinson 50mM ajustado em pH 7,3 e usando o teste de Phadebas descrito acima. A atividade nas amostras foi medida a 37°C usando tampão Britton Robinson em pH 7,3 e a 25°C usando tampão CAPS 50 mM em pH 10,5. A atividade dependente de temperatura e a porcentagem da atividade a 25°C com relação à atividade a 37°C são mostradas na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ Π) NO: 1) e para as variantes em questão.

Outra medição foi feita usando soluções das variantes respectivas em tampão Britton Robinson 50 mM ajustado em pH 7,3 e usando o teste de Phadebas acima descrito. A atividade nas amostras foi medida a 37°C e 50°C usando tampão Britton Robinson 50 mM em pH 7.3. A atividade dependente de temperatura e a porcentagem da atividade a 37°C com relação à atividade a 50°C são mostradas na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 1) e para as variantes em questão. B: Atividade de α-amilase de variantes da sequência em SEQ ID NO: 2 As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão Britton Robinson 50mM ajustado em pH 7,3 e usando o teste de Phadebas descrito acima. A atividade nas amostras foi medida a 25°C e 37°C usando tampão Britton Robinson 50mM em pH 7,3 e a 25°C usando tampão CAPS 50 mM em pH 7,3. A atividade dependente de temperatura e a porcentagem da atividade a 25°C com relação à atividade a 37°C são mostradas na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 2) e para as variantes em questão. C: Atividade de a-amilase de variantes da sequência em SEP ID NO: 4 As medições foram feitas usando soluções das variantes respectivas em tampão Britton Robinson 50mM ajustado em pH 7,3 e usando o teste de Phadebas descrito acima. A atividade nas amostras foi medida em ambos 37°C usando tampão Britton Robinson 50 mM em pH 7,3 e a 60°C usando tampão CAPS 50 mM em pH 10,5. A atividade dependente de temperatura e a porcentagem da atividade a 37°C com relação à atividade a 60°C são mostradas na tabela abaixo para a enzima originária (SEQ ID NO: 4) e para as variantes em questão.

Exemplo 10 Construção de variantes da α-amilase BAN:1 -300/Termamvl: 301-483 híbrida originária Plasmídeo pTVB191 contém o gene codificando uma a-amilase BAN:l-300/Termamyl:301-483 bem como uma origem de replicação funcional em Bacillus subtilis e o gene cat conferindo resistência a cloranfenicol.

Variante BM4 (F290E) foi construída usando a abordagem de mega-iniciador (Sarkar e Sommer, 1990) com o plasmídeo pTVB191 como gabarito.

Iniciador PI (SEQ ID NO: 52) e oligonucleotídeo mutagênico bm4 (SEQ ID NO: 47) foram usados para ampliar um fragmento de 444 bp com reação de cadeia de polimerase (PCR) em condições padrão. Este fragmento foi purificado de um gel agarose e usado como “Meg-iniciador” em um segundo PCR com iniciador P2 (SEQ ID NO: 53) resultando em um fragmento de 531 bp. Este fragmento foi digerido com endonucleases de restrição HindIII e Tthllll. O fragmento de 389 bp produzido por este foi ligado no plasmídeo pTVB191 que foi clivado com as mesmas duas enzimas. O plasmídeo resultante foi transformado em SHA273 de B. subtilis. Clones resistentes a cloranfenicol foram selecionados cultivando os transformantes em placas contendo cloranfenicol bem como amido insolúvel. Clones expressando uma α-amilase ativa foram isolados selecionando clones que formaram halos após colorir as placas com vapor de iodo. A identidade das mutações introduzidas foi confirmada por sequenciação de DNA.

Variantes BM5 (F290K), BM6 (F290A), BM8 (Q360E) e BM11 (N102D) foram constmídas de um modo similar. Detalhes de sua construção são dados abaixo.

Variante: BM5 (F290K) Oligonucleotídeo mutagênico: bm5 (SEQ ID NO: 48) Iniciador (1° PCR): pl (SEQ ID NO: 52) Tamanho do fragmento resultante: 444 bp Iniciador (2~ PCR): p2 (SEQ ID NO: 53) Endonucleases de restrição: HindDIII, Tthl 111 Tamanho do fragmento clivado: 389 bp Variante: BM6 (F290K) Oligonucleotídeo mutagênico: bmó (SEQ ID NO: 49) Iniciador (lfi PCR): pl (SEQ ID NO: 52) Tamanho do fragmento resultante: 444 bp Iniciador (22 PCR): p2 (SEQ ID NO: 53) Endonucleases de restrição: HindDIII, Tthl 111 Tamanho do fragmento clivado: 389 bp Variante: BM8 (Q360E) Oligonucleotídeo mutagênico: bm8 (SEQ ID NO: 50) Iniciador (V- PCR): pl (SEQID NO: 52) Tamanho do fragmento resultante: 230 bp Iniciador (2S PCR): p2 (SEQ ID NO: 53) Endonucleases de restrição: HindDIII, Tthl 1II Tamanho do fragmento clivado: 389 bp Variante: BM11 (N102D) Oligonucleotídeo mutagênico: bml 1 (SEQ ID NO: 51) Iniciador {V- PCR): p3 (SEQ ID NO: 54) Tamanho do fragmento resultante: 577 Iniciador (2£ PCR): p4 (SEQ ID NO: 55) Endonucleases de restrição: HindDIII, Pvul Tamanho do fragmento clivado: 576 Oligonucleotídeos mutagênicos bn4 (SEQ ID NO: 47): F290E

iniciador 5 ’GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT GAG AAT TTA CAG G bm5 (SEQ ID NO: 48): F290K

iniciador 5 ’GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT AAG AAT TTA CAG G bm6 (SEQ ID NO: 49): F290A

iniciador 5’GTG TTT GAC GTC CCG CTT CAT GCC AAT TTA CAG G bm8 (SEQ ID NO: 50): Q360E

iniciador 5’AGG GAA TCC GGA TAC CCT GAG GTT TTC TAC G bml 1 (SEQ IDNO: 51): N102D iniciador 5’GAT GTG GTT TTG GAT CAT AAG GCC GGC GCT GAT G Outros iniciadores: pl: 5’ CTG TTA TTA ATG CCG CCA AAC C (SEQ ID NO: 52) p2: 5' G GAA AAG AAA TGT TTA CGG TTG CG (SEQ ID NO: 53) p3: 5' G AAA TGA AGC GGA ACA TCA AAC ACG (SEQ ID NO: 54) p4: 5' GTA TGA TTT AGG AGA ATT CC (SEQ ID NO: 55) Exemplo 11 Atividade de α-amilase em pH alcalino de variantes da α-amilase BAN:1- 300/Termamvl: 301-483 híbrida originária As medições foram feitas usando soluções para as enzimas respectivas e utilizando o teste Phadebas (acima descrito). A atividade foi medida após incubar durante 15 minutos a 30°C em tampão Britton Robinson 50 mM ajustado no pH indicado por NaOH.

Enzima NU/mg pH peso Q360E F290A F290K F290E N102D 8.0 5300 7800 8300 4200 6600 6200 9.0 1600 2700 3400 2100 1900 1900 REFERÊNCIAS CITADAS

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REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Variante de uma α-amilase originária que corresponde à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, compreendendo uma deleção na posição Dl83 + G184, em. que a numeração das posições correspondem às posições na sequência de aminoãcido mostrada na SEQ ID NO: 2, caracterizada pelo fato de que a variante tem atividade ct-amilase, demonstra com relação à ot-amilase originária uma atividade específica aumentada a temperaturas de 10 a ó()tíC, e adicional mente compreende a substituição Q264S na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:4.

2. Uso de uma variante de ot-amilase como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para lavagem e/ou lavagem de louça.

3. Aditivo detergente, caracterizado pelo fato de compreende uma variante de α-amiiase como definida na reivindicação I, opcionalmenie na forma de um granulado uão pulverulento, enzima protegida ou líquida estabilizada.

4. Aditivo detergente de acordo com a reivindicação 3. caracterizado pelo fato de conter 0,02 -200 mg de proteína de enzima /g de aditivo.

5. Aditivo detergente de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente outra enzima como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.

6. Composição detergente, caracterizada pelo fato de compreender uma variante de ot-amilase como definida na reivindicação 1.

7. Composição detergente de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender outra enzima como protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.

8. Composição detergente para lavagem de louça manual ou automática, caracterizada pelo fato de compreender uma variante de a-amilase como definida na reivindicação 1.

9. Composição detergente para lavagem de louça de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender outra enzima como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.

10. Composição para lavagem de roupas manual ou automática, caracterizada pelo fato de compreender uma variante de α-amilase como definida na reivindicação 1.

11. Composição para lavagem de roupas de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente outra enzima como protease, uma lipase, uma peroxidase, uma enzima amilolítica e/ou uma celulase.