BG63682B1 - Фармацевтичен състав за имуномодулация на основата на пептиди и адюванти - Google Patents

Abstract

Съставът намира приложение като ваксина, напримерантитуморна. Той съдържа най-малко един протеин, съответно протеин (фрагмент) с имуномодулиращо действие с адювант. Пептидът произлиза от патогенен причинител на заболяване или от туморен антиген. Адювантът повишава свързването на пептида с клеткитена пациента и подобрява навлизането му в тях, като усилва имуномодулиращото действие на пептида. Подходящи адюванти са основни полиаминокиселини катополиаргинин или полилизин. В даден случай те са конюгирани с клетъчна лиганда, например въглехидратили трансферин.

Description

Изобретението се отнася до имуномодулация.

Изобретението е по-нататъшно развитие на терапевтична ваксина на основата на туморни клетки, която се основава по същество на следните предпоставки: съществуват качествени или количествени разлики между туморните клетки и нормалните клетки; имунната система има по принцип способността да разпознава тези разлики; имунната система може, чрез активно специфично имунизиране с ваксини, да бъде стимулирана да разпознава туморните клетки въз основа на тези разлики и да предизвика тяхното отхвърляне.

За да се предизвика антитуморен отговор, трябва да са изпълнени най-малко две предпоставки: първо, туморните клетки трябва да експресират антигени, които не се срещат при нормалните клетки или се намират ограничено по такъв начин, че е възможно количествено различаване между нормална и туморна тъкан посредством имунната система. Второ, имунната система трябва да бъде съответно активирана, за да реагира на тези антигени. Съществена пречка при имунната терапия на туморите е тяхната минимална имуногенност, преди всичко у хора.

Предшестващо състояние на техниката

Открити са тумор-асоциирани и тумор-специфични антигени, които представляват такива нео-епитопи и с това потенциални цели за атака от имунната система. Тъй като на имунната система все пак не се удава да елиминира туморите, които тези нео-епитопи експресират, очевидно не би трябвало да се предполага липса на нео-епитопи, а това че тези неоантигени не са достатъчни.

За имунотерапията на рака на клетъчна основа, са развити две общи стратегии: от една страна адоптивна '**' имунотерапия, която ползва in vitro експанзия на туморреактивни Т-лимфоцити и тяхното повторно вкарване в ' пациента; от друга страна-активна имунотерапия, която φ¹· ΐизползва туморни клетки, като се очаква това да предизвика или нови или засилени имунни отговори срещу туморните антигени, които водят до системен туморен отговор. Туморни ваксини на основата на активна имунотерапия са произведени в различни видове; един пример за това са облъчени туморни клетки, които са смесени с имуностимулиращи адюванти като Corynebacterium parvum или Bacillus Calmette Guerin (BCG), за да се предизвика имунна реакция срещу туморните антигени. (Oettgen und Old, 1991).

В последните години се използват преди всичко генетично модифицирани туморни клетки за активна имунотерапия срещу рака. Обзор върху тези различни предложения, при които туморни клетки с оглед на засилена имуногенност се отчуждават чрез въвеждане на различни гени, е даден от Zatloukal et al., 1993. Една от досега въведените стратегии използва туморни клетки, които са модифицирани генетично да продуцират цитокини.

Идентифицирането и изолирането на туморни антигени и тумор-асоциирани антигени (TAs) съответно на произлезли от тях пептиди (напр. описани от Wolfel et al., 1994 а) и 1994 b); Carrel et al., 1993, Lehmann et al., 1989, Tibbets et al., 1993 или в публикуваните международни заявки WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159) e предпоставка за друга стратегия, при която туморните антигени се използват като имуногени за туморни ваксини и именно както под формата на протеини ,така и като пептиди. От трудовете на Boon et al., 1992; Boon et al., 1994; Boon et al., 1995; van Peel et al., 1995; Van der Eynde, 1995; e известно, че пептиди_;произлезли от туморни антигени на злокачествени меланоми,се представят в MHC-l-контекст. С туморна ваксина под формата на туморни антигени като такива, досега обаче не е постигната задоволителна имуногенност, за да се предизвика клетъчен имунен отговор, какъвто се изисква за елиминиране на туморни клетки носещи туморни антигени (Marchand et al., 1995). За да се постигне антиген представящите клетки (’’Antigenpresenting cells”, ”APCs”) да представят на повърхността си дефинирани пептидни антигени, е предложено да се ’’изтласкат” пептидите, което обаче води до неефективно натоварване на клетките с пептиди (Tykocinski et al., 1996); показано е също, че едновременото приложение на адюванти само условно засилва имунния отговор (Oettgen und Old, 1991).

Трета стратегия на активна имунотерапия за повишаване на ефикасността на туморни ваксини се основава на ксеногенизирани (отчуждени) автологови туморни клетки. В основата на тази концепция е приемането, че имунната система реагира на туморни клетки, които експресират чужд протеин, и че в хода на тази реакция се предизвиква също имунен отговор срещу онези туморни антигени, които са представени от туморните клетки на ваксините.

Централна роля при регулирането на специфичния имунен отговор играе един тримолекулен комплекс, състоящ се от компонентите Т-клетка-антигенрецептор, МНС (’’Major Histocompatibility Сотр1ех”)-молекулаи и техни лиганди, който е пептиден фрагмент_;произлязъл от протеин.

МНС-молекули (съответстващите човешки молекули, ^г HLAs) са пептидни рецептори, които при строга специфичност позволяват свързването на многобройни различни лиганди. Предпоставка за това представляват алел-специфичните пептидни мотиви, които показват следните критерии за специфичност: пептидите имат в зависимост от МНСхаплотипа, определена дължина, при МНС-1 хаплотип по правило осем до десет аминокиселинни остатъци. Обикновено две аминокиселинни позиции представляват т.н. ’’котва”, които могат да бъдат заемани само от една единствена аминокиселина или от аминокиселинни остатъци с тясно родствени странични вериги. Точното положение на котвените аминокиселини в пептида и изискванията за техните свойства варират с МНС-хаплотиповете. С-края на пептидните лиганди често е алифатен или зареден остатък. Такива МНС-1-пептидлигандни мотиви са известни между другото за H-2K^d, K^b, К^к,

K^km1, D^b, HLA-A*0201, A*0205 и B*2705 хаплотиповете.

В рамките на кръговрата на протеините вътре в клетката правилни, с променен вид и чужди генни продукти напр. вирусни протеини или туморни антигени се разпадат до малки пептиди; някои от тях представляват потенциални лиганди за МНС-молекулите. С това е дадена предпоставката за тяхното представяне чрез МНС-молекули и като следствие от това предизвикване на клетъчен имунен отговор, при което още не е подробно изяснено как пептидите се продуцират като МНС-лиганди в клетката.

Чужди или отчуждени протеини и техните фрагменти могат да се разпознават, свързват и отстраняват също чрез имуноглобулини, които представляват хуморален имунен отговор. Това се отнася също за цялостните туморни антигени: например с тумор-асоциирани антигени MUC1, СЕА и HER2/hob е доказано, че имуноглобулините, които показват специфичност за тези протеини, могат да разпознават и убиват носещите протеина клетки. За да се предизвика туморантиген-специфичен хуморален имунен отговор, за това са изпробвани различни форми на MUC1 и СЕА като имуногени (напр. в рекомбинантни поксвектори; Bronte et al., J.Immunol. 154:5282 1995) на модели c животни и клинични предварителни опити.

В рамките на настоящото изобретение се имат предвид още съображения, които са установени при развитието на клетъчна туморна ваксина: докато незлокачествените нормални клетки на тялото се понасят от имунната система, тялото реагира на нормална клетка с имунна защита, ако тя,напр. поради вирусна инфекция, синтезира чужди на тялото протеини. Причината за това е, че МНС-молекулите представят чужди пептиди, които произлизат от чужди на тялото протеини. Като следствие от това, имунната система регистрира, че с тези клетки се е случило нещо необичайно, чуждо. APCs (към тях се причисляват макрофаги, дендритни клетки, Лангерхансови клетки, Вклетки, както и възможно откритите напоследък бифенотипни клетки, които показват както свойства на В-клетки, така и на макрофаги; Tykocinski et al., 1996) се активират, поражда се нов, специфичен имунитет и клетката се елиминира.

Туморните клетки съдържат именно съответните туморспецифични туморни антигени, обаче като такива са недостатъчни за ваксини, тъй като въз основа на тяхната минимална имуногенност се игнорират от имунната система. Ако се натовари една туморна клетка не с чужд протеин, а с чужд пептид, като допълнение към чуждите пептиди, свойствените туморни антигени на тази клетки също се приемат като чужди. Чрез отчуждаването с пептид може да се постигне предизвиканият чрез чужд пептид клетъчен имунен отговор да се насочи към туморните антигени.

Причината за много малката имуногенност на туморните клетки може да бъде не само качествен, но и количествен проблем. За един произлязъл от туморни антигени пептид това може да означава, че той се представя именно от МНС-молекулите, обаче в концентрация, която е твърде малка, за да предизвика клетъчен тумор-специфичен имунен отговор. Повишението на броя на туморспецифичните пептиди върху туморните клетки също трябва да причини отчуждаване на туморните клетки, което води до предизвикване на клетъчен имунен отговор. Предложено е туморните антигени, съотв. произлезлиягот тях пептид поради това, да се представя на клетъчната повърхност, който пептид се трансфицира с една за съответен протеин, съотв. пептид кодираща ДНК, както е описано в международните публикации WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 и WO 95/00159.

В немска патентна публикация Р 195 43 649.0 е описана клетъчна ваксина, която съдържа като активен компонент туморни клетки, които са натоварени с един или повече пептиди по такъв начин, че туморните клетки в контекст с пептидите се разпознават от имунната система на пациента като чужди и предизвикват клетъчен имунен отговор. Съществен признак на пептидите е, че те са лиганди за МНСхаплотипа на пациента. Поради това, пептидите се разпознават от имунната система на пациента като чужди, докато те от една страна могат да бъдат ’’чужди пептиди” или ’’ксенопептиди”, т.е. те са различни от пептидите, които са произлезли от протеини, експресирани от туморните клетки на пациента. Една друга категория пептиди произлиза от туморните антигени, които се експресират от клетки на пациента. Те причиняват повишаване на имуногенността поради това, че се намират в концентрация върху туморните клетки от ваксината, която е по-висока от концентрацията на същия пептид върху туморните клетки на пациента.

В основата на настоящото изобретение е задачата да се приготви нов, с имуномодулиращо дейстие фармацевтичен състав, по-специално ваксина.

Техническа същност на изобретението

В по-нататъшно развитие на концепцията за клетъчна ваксина_;разкрита в немско патентно описание Р 195 43 649, в рамките на настоящото изобретение е създаден фармацевтичен състав, който съдържа пептид с имуномодулиращо действие, не в контекст с клетките, а заедно с адювант, за да се предизвика клетъчен и/или хуморален, за предпочитане системен имунен отговор срещу патогенен причинител на заболяване, съотв.противотуморен отговор, съотв. да усили или да предизвика толерантност срещу автоимунно действащите протеини.

По изненадващ начин е намерено, че определени адюванти,напр. поликатиони, за които за пръв път още в 1965 г е показано, че могат да причиняват увеличаване на преноса на протеини в клетките (Ryser et al., 1965; Ryser et al., 1978; Shen et al.,1981), повишават имуногенността на пептидите .

Изобретението се отнася до фармацевтичен състав, съдържащ един или повече пептиди, протеини или фрагменти от протеини с имуномодулиращо действие, заедно с адювант. ^; Съставът се характеризира с това, че адювантът показва способност да повишава свързването на пептида, съотв. на протеина или протеиновите фрагменти към клетките на лекувания индивид, или който ще се лекува, съотв. навлизане в клетките и да причинява засилване на имуномодулиращото действие на пептида, съотв. на протеина или протеиновите фрагменти.

В текста по-нататък за простота, представители на споменатите пептиди, протеини или протеинови фрагменти с имуномодулиращо действие ще се означават като ’’пептиди”. Понятието ’’пептид”, ако не се отнася изключително за лигандите, е заместващо също за по-големи протеинови фрагменти или протеини, от които е произлязъл пептидът, съотв. представлява продукт от разграждане на клетката.

Под ’’имуномодулиращо действие” се разбира от една страна предизвикването или усилването на клетъчна и/или хуморална, за предпочитане системна имунна реакция. В тази форма на изпълнение фармацевтичният състав съгласно изобретението действа като ваксина.

В предпочитана форма на изпълнение, пептидите са лиганди за най-малко една МНС-молекула, която се експресира от индивида, който ще се лекува.

Човешките NLHC-молекули се означават съобразно международната практика, по-нататък също и като ”HLA” (Human Leucocyte Antigen).

Под клетъчен имунен отговор” трябва да се разбира преди всичко цитотоксичният Т-клетъчен имунитет, който като следствие от генерирането на цитотоксични CD8позитивни Т-клетки и С04-позитивни хелперни Т-клетки причинява разрушаване на туморните клетки или на клетки, атакувани от патогенен причинител на заболяване.

Под хуморален имунен отговор” трябва да се разбира продуцирането на имуноглобулини, които селективно разпознават туморни клетки или структури,произлезли от патогенен причинител на заболяване_;и след това заедно с други системи, като напр. комплемент, ADCC (Antibody dependent Cytotoxicity) или фагоцитоза, предизвикват разрушаване на тези туморни клетки, съотв.на патогенния причинител на заболяването или на атакуваните от него клетки.

Съдържащият се във ваксината пептид произлиза от антиген, съотв. в случая на протеин представлява антиген, срещу който трябва да бъде предизвикан клетъчен и/или хуморален имунен отговор. С това се предизвиква Т-клетките ₇ съответно други цитотоксични ефекторни клетки да разпознават причинителя на заболяването, съотв. туморните клетки, показващи антигена и/или да генерират антитела.

За имунизиране срещу причинителя на заболяването като бактерии, вируси, паразити, се използват протеини, съотв. пептиди, които представляват протеин от съотв. причинител на заболяване, съотв. са произлезли от него. Подходящи за това са преди всичко протеини, които остават незасегнати от високата обща степен на мутация на причинителя на заболяването. Публикувани примери са HPV 16/17 (Human papilloma virus; Feltkamp et al.,1995), Hepatitis B. Virus Core Antigen ( Vitiello et al., 1995), Plasmodium Bergheii . (Widmann et al., 1992), нуклеопротеин от вируса на инфлуенцата, вируса на хепатит С.

В една форма на изпълнение на изобретението, протеинът, с оглед предизвикване на противотуморен отговор, произлиза от туморен антиген, съотв. от пептида на туморен антиген, при което фармацевтичният състав се използва като туморна ваксина.

Тези туморни антигени са например такива, които се експресират от пациента в концентрация, която е твърде малка, така че туморните клетки не се разпознават като чужди.

Туморните антигени на пациента могат да бъдат определени със стандартни методи в хода на установяването на диагнозата и план за лечение .Туморните антигени могат да се докажат по прост начин, имунохистохимично с помоща на антитела. Ако туморните антигени са ензими₇напр. тирозинази, могат да се докажат чрез ензимен анализ. При туморни антигени с позната последователност могат да бъдат използвани RT-PCR - методи (Boon, Т. et al., Coulie, P.G. et al.,1994; Weynants P. et al.,,1994). Други методи за доказване са анализ на основата на CTLs със специфичност за туморния антиген, който ще се определя. Такива анализи са описани между другото от Herin et al.,1987; Coulie et al., 1993; Cox et al., 1994; Rivoltini et al.,1995; Kawakami et al.,1995; както и в WO 94/14459; от тези литературни източници могат да се вземат също различни туморни антигени, съотв. произлезли от тях пептидни епитопи, които са подходящи в рамките на настоящото изобретение. Примери за подходящи туморни антигени са дадени освен това в излезлите напоследък обзорни статии на Rosenberg, 1996, и Henderson und Finn, 1996. Относно приложимите туморни антигени настоящото изобретение не поставя никакво ограничение; няколко примера за известни, приложими в рамките на изобретението туморни антигени_?съотв.произлезли от тях пептиди_?са дадени в таблицата.

Туморна ваксина, която съдържа туморен антиген, съответно произлезли от туморен антиген пептиди, може да се прилага освен терапевтично, също и профилактично. При профилактично приложение целесъобразно се включва смес от пептиди, които са произлезли от представители на често срещани туморни антигени. При терапевтично приложение на туморната ваксина съгласно изобретението, се използват един или повече пептиди, от които се очаква, че се съдържат в туморния(те) антиген(и) на пациента.

Туморната ваксина съгласно изобретението има предимството пред клетъчна ваксина на основата на автологови туморни клетки, че тя е терапевтично полезна за пациенти в относително ранен стадий (стадий I и II) на заболяването, у които няма на разположение достатъчно туморни клетки за получаване на клетъчна ваксина.

В една предпочитана форма на изпълнение на изобретението, пептидът, с оглед предизвикване на клетъчен имунен отговор, се съгласува с МНС-1- или МНС-П-подтипа на индивида, който ще се ваксинира; пептидът показва също последователност, съотв. съдържа последователност, която « осигурява нейното свързване с МНС-молекула.

В друга форма на изпълнение, фармацевтичният състав съдържа във формата за приложение като туморна ваксина, освен това полипептид с имуностимулиращо действие, по-специално цитокин. В предпочитана форма на изпълнение на изобретението, като цитокин се използва интерлевкин 2 (IL-2) или GM-CSF, например в доза от около 1000 единици; други примери за цитокини са IL-4, IL-12, IFNос, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω, TNF-α, както и комбинации от тях, напр. IL-2 + IFN-γ, IL-2 + IL-4, IL-2+TNF-a или TNF-a+ IFN-γ.

В една форма на изпълнение на изобретението, фармацевтичният състав служи за това, да доведе до толерантност спрямо протеини, съотв. техни фрагменти, които предизвикват автоимунно индуцирани заболявания, също за терапия на автоимунни заболявания. Пептидите,използвани в тази форма на изпълнение на изобретението, произлизат от протеини, които причиняват автоимунни заболявания.

В противоположност на приложението на изобретението като туморна ваксина или като ваксина срещу патогенен причинител на заболяване, при която пептидите със сегмент от първоначалния протеин (туморен антиген, съотв. протеин на антигена) по същество се съгласуват по такъв начин, че пептидът се разпознава като ’’оригинален антиген”, се използват при прилагане на изобретението за лечение на автоимунни заболявания_хмежду другото пептиди, които за аминнокиселинната последователност на първоначалния протеин показват критични разлики. Тези пептиди се свързват с МНС-молекулата именно въз основа на тяхното котвено положение, показват обаче мутации в тяхната последователност, които карат тези пептиди да функционират като антагонисти, които отново изключват активираните специфични Т-клетки (Kersh und Allen, 1996).

Като пептид-антагонисти са подходящи както природни” антагонисти, които се откриват във вируси (Bertoletti et al., 1994),така и антагонисти, които са намерени чрез системно изследване, напр. чрез скрининг на пептидните банки. Пример за пептидни антагонисти са пептиди, които могат да изключват Т-клетки, които са специфични за миелин базов протеин, те са изпробвани в опити с животни за активност. (Brocke et al.,1996).

Пептид, който може да предизвика клетъчен имунен отговор, трябва да може да се свързва с МНС-молекула. С това се предизвиква имунниятотговор у пациента и индивидът, който ще се лекува,трябва да показва отговаряща HLA14 молекула. Определянето на HLA-подтипа на пациента по този начин представлява, с оглед предизвикване на клетъчен имунен отговор, съществена предпоставка за ефективно приложение на един пептид към този пациент.

HLA-подтипът на пациента може да се определи със стандартни методи, като микротест за лимфотоксичност (Practical Immunology, 1989). Този тест се основава на принципа да се смесват лимфоцити,изолирани от кръвта на пациента,най-напред с антисерум или моноклонални антитела срещу определена HLA-молекула, в присъствие на заешки комплемент (С). Позитивните клетки се лизират и поемат индикаторно багрило, докато незасегнатите клетки остават неоцветени.

За определяне на HLA-I- или HLA-II- хаплотипа на един пациент може също да се използва RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) (Curr. Prot. Mol. Biol, глава 2 и 15). За целта от пациента се взема кръв и се изолира от нея РНК. Тази РНК най-напред се подлага на обратна транскрипция, при което се получава кДНК на пациента. Тази кДНК служи като матрица за реакция в полимеразната верига с първични двойки, които действат специфично за амплификацията на ДНК-фрагмента, което означава определен HLA-хаплотип. Ако след електрофореза на агароза се появи ДНК-ивица, това означава, пациентът експресира съответната HLA-молекула. Ако ивицата не се появи, значи пациентът е отрицателен.

Дефинирането на прилаган съгласно изобретението пептид чрез HLA-молекула определя същата по отношение на нейните котвени аминокиселини и нейната дължина;

дефинираните котвени положения и дължината осигуряват пептид, в който пептидсвързващата бразда отговаря на съответната HLA-молекула на пациента. Това има за последица стимулиране на имунната система и възбуждане на клетъчна имунна реакция, която в случай на прилагане на пептид^произлязъл от туморен антиген,се насочва срещу туморните клетки на пациента.

Пептидите, които са подходящи за приложение в рамките на настоящото изобретение, са на разположение в широк обхват. Тяхната последователност може да произлиза от природно разпространени имуногенни протеини, съотв. техни клетъчни разпадни продукти, напр. от вирусни или бактериални пептиди, от туморни антигени или могат да бъдат антагонисти на пептиди, които могат да са произлезли от протеини индуциращи автоимунни заболявания.

Подходящи пептиди могат напр. да бъдат избрани въз основа на познати от литературата пептидни последователности.

С оглед на предизвикване на клетъчен имунен отговор, пептидите могат да бъдат дефинирани с помощта на описаните от Rammensee et al., 1993, Rammensee et al., 1995, Falk et al., 1991 за различни HLA-мотиви пептиди, произлезли от имуногенни протеини с различен произход, които пасват в мястото на свързване на молекулата на съответния HLAподтип.

За пептиди, които показват частична последователност на протеин с имуногенно действие, може с помощта на вече познати или в даден случай още предстоящи за определяне полипептидни последователности, чрез изравняване на последователностите като се вземат предвид HLA-специфичните изисквания, да бъде потвърдено кои пептиди са подходящи. Примери за подходящи пептиди се намират например при Rammensee et al.,1993, Falk et al.,1991, и Rammensee, 1995, както в WO 91/09869 (HIV-пептиди); изведени от туморни антигени пептиди са описани между другото в публикувани международни патентни заявки WO 95/00159, WO 94/05304. Въз основа на тази литература и цитираните там статии могат да се имат предвид. Към предпочитаните пептид се причисляват тези, чиято имуногенност вече е показана, също пептиди, които са произлезли от познати имуногени например вирусни или бактериални протеини.

Вместо да се прилагат оригиналните пептиди, които ’ пасват в мястото на свързване на MHC-I- или MHC-II- ^w молекулите, могат да се имат предвид също пептиди, които произлизат от природни протеини без промяна, въз основа на оригиналната пептидна последователност, дадените минимални изисквания относно вариантите на котвените положения и дължина, доколкото чрез тези варианти — ефективната имуногенност на пептида, която представлява неговия афинитет на свързване към МНС-молекулата и неговата способност да стимулира Т-клетките, не само не се уврежда, но предимно се усилва. В този случай се прилагат също съгласно изобретението синтетични пептиди, които са съставени в съответствие с изискванията за способност за свързване с МНС-молекула. Те могат_?напр. като се излиза от H²-K^d-nnraHfln Leu Phe Glu Ala lie Glu Gly Phe lie (LFEAIEGFI) аминокиселини, които не представляват котвени аминокиселини да бъдат променени, за да се получи пептид с последователност Phe Phe lie Gly Ala Leu Glu Glu lie (FFIGALEEI); освен това може котвената аминокиселина Не в положение 9 да бъде заменена с Leu. Определянето на епитопите на МНС-1- съотв. МНС-П-лигандите, съответно на техните варианти₇може да, се направи напр. съгласно описания от Rammensee et al., 1995 принцип. Дължината на пептида отговаря, в случая на неговото съгласуване с МНСмолекулата, предимно на минимална последователност от 8 до 10 аминокиселини с изискваните котвени аминокиселини. Мотивът на MHC-ll-свързване, който се удължава чрез нови аминокиселини, показва по-висока степен на дегенерация в котвените позиции. Напоследък са развити методи, като се излиза от ренгеноструктурен анализ на МНС-молекулите, които позволяват точен анализ на MHC-ll-мотива на свързване и като се излиза от него, вариациите на пептидната последователност (Rammensee et al., 1995 и цитираната там оригинална литература).

В даден случай пептидът може да се удължи в Си/или N-края, доколкото това удължаване не уврежда способността за свързване към МНС-молекулата, съотв. удължения пептид при най-малката последователност може да бъде клетъчно преработван.

В една форма на изпълнение на изобретението пептидът е зареден отрицателно. В тази форма на изпълнение пептидът може да се удължава с отрицателно заредени аминокиселини, или е възможно отрицателно заредени аминокиселини да бъдат включени в пептида предимно в позициите, които не се изискват за разпознаване чрез специфични CTLs или като котвени аминокиселини, за да се постигне електростатично свързване на пептида с поликатионен адювант като полилизин.

В една форма на изпълнение на изобретението антигенът се използва не във формата на пептид, а като протеин или протеинов фрагмент, съотв. като смес от протеини или протеинови фрагменти.В рамките на настоящото изобретение са подходящи по-големи протеинови фрагменти, съотв. цели протеини, за които е сигурно, че те след прилагането им ще се преработят от APCs на пациента до пептиди, които пасват на МНС-молекулата.

Протеинът представлява антиген, съотв. туморен антиген, от който са произлезли получените след преработката фрагменти. В тази форма на изпълнение адювантът служи за това да направи възможно или да засили зареждането (Transloading”) на клетките, по-специално APCs като дендритните клетки или макрофагите с туморни антигени, съответно фрагменти. Така приетите протеини, съотв. протеинови фрагментите преработват от клетките и след това те могат да се представят в МНС-контекст на имуноефекторните клетки и с това да предизвикат имунен отговор, съотв. да го засилят (Braciale und Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski und Rock. 1995; York und Rock, 1996).

Формата на изпълнение на изобретението, в която протеините, съотв. по-големите протеинови фрагменти са използвани като антигени,има предимството, че представлява минимална зависимост от HLA-типа на пациента, докато протеинът се преработва в няколко фрагменти и с това е налице ло-голяма изменчивост по отношение на подходящата форма на пептида.

В случай на използване на протеини или протеинови фрагменти, идентичността на преработените крайни продукти може да се докаже посредством химичен анализ (разграждане по Edmann или масспектрометрия на преработените фрагменти; виж обзорната статия на Rammensee et al., 1995, както и цитираната там оригинална литература) или биологичен анализ (способност на APCs за стимулиране на Тклетките, които са специфични за преработените фрагменти).

Изборът на пептиди, които са подходящи да предизвикат клетъчен имунен отговор, се осъществява по принцип в няколко етапа: най-общо възможните пептиди се изпитват целесъобразно в серийни опити, най напред в пептид-свързващ тест за способността им да се свързват с МНС-молекула.

Подходящ за това метод за изследване се основава на способността на пептидите да стабилизират свободни МНС-молекули, както е описано напр. от Stuber et al.,1994 и McIntyre et al., 1996. При това пептидът се довежда върху клетки, които са в състояние да експресират съответната МНС-молекула, обаче поради генетичен дефект не свързват ендогенни пептиди в МНС-контекст. Подходящи клетъчни линии от този тип са RMA-S (миши) и Т 2 (човешки) съотв. техните транфуцирани варианти. След това се доказват само стабилизираните от съответния пептид МНС-молекули, за предпочитане посредством основаващия се на цитометрия в поток ЕАС5-анализ(Е1ом Cytometry, 1989; FACS Vantage ТМ Users Guide 1994; Cell Quest TM Users Guide, 1994). Стабилни МНС-молекули се доказвате подходящи анти-МНС-антитела и с маркирано с флуоресцентно багрило напр. FITC (Fluoresceinisothiocyanat) второ (напр. поликлонално) антитяло. В потока след това се възбуждат отделни клетки с лазер с определени дължини на вълните; измерва се емитираната флуоресценция, тя е зависима от количеството пептид_?свързано с клетката.

Друг метод за определяне на свързани количества пептид е Scatchard-Plot_?onncaH от Sette et al.,1994. За целта се използва пептидът, който е маркиран с напр. I’²⁵ и.се инкубира една нощ с изолирани или рекомбинантно получени МНС-молекули при 4°С с различни дефинирани концентрации на пептид. За определяне на неспецифичното взаимодействие на пептида, към някои проби се прибавя излишък от немаркиран пептид, който свързва неспецифичното взаимодействие на маркирания пептид. След това се отстранява неспецифично свързания пептид например чрез гелхроматография. Количеството на свързания пептид тогава се измерва в сцинтилационен брояч въз основа на измерената радиоактивност. Оценката на така получените данни се осъществява по стандартни методи.

Обзор върху методите за характеризиране на МНС/пептидното взаимодействие, на анализа на МНСлигандите и анализа на пептидното свързване, които се прилагат в рамките на настоящото изобретение₇е даден от Rammensee et al., 1995.

В следващ етап възможните пептиди с добри качества на свързване се изследват за имуногенност.

Предизвикването на клетъчен имунен отговор може да бъде потвърдено чрез доказване на пептид-специфични

CTLs например посредством метода описан в Current Protocols in Immunology, глава 3 или от Blomberg et al., 1993. Друго доказателство за наличието на клетъчен имунен отговор се дава, когато в отсъствие на Т-клетки в опитно животно (което се постига като животното се обработи с антитела, които деплетират CD4- или С08-клетки) не настъпва имунен отговор (Current Protocols in Immunology, глава 3).

Клетъчен имунен отговор може да бъде показан също чрез доказване на ’’delayed type hypersensitivity” (DTH)реакция в имунизирани животни. За целта пептидите могат да се инжектират в стъпалото на мишки, след което се измерва набъбването на инжектираното място (Grohman et al., 1995; Pucceti et al.,1994).

Възбуждането на хуморален имунен отговор чрез пептиди, които са чужди за организма антигени, съотв. които се експресират от лекувания организъм в минимална концентрация, може да се определи чрез доказване на специфични антитела в серума. Подходящ метод за определяне титъра на антителата в серума е ензимно свързания имуноанализ (ELISA). При него се доказват специфичните антитела след свързване с приложения за имунизиране пептид с помощта на цветна реакция.

Алтернативен метод е т.н. Western блот. При него специфични серумни антитела се свързват с пептид_?имобилизиран върху мембрана. Свързаните антитела след това се доказват отново с цветна реакция (Литература за двата метода: Current Protocols in Immunology. Editors: Coligan et al., 1991).

След ваксиниране c чужди антигени, напр. от вирусен произход, преди всичко трябва да се очаква образуването на антитела. Не е изключено обаче да се образуват също специфични антитела срещу мутирали или свръхекспресирани пептиди, които са произлезли от клетъчни туморни антигени. Разрушаване на тумора от такива антитела би могло да се осъществи след свързване на антителата с туморните клетки чрез други компоненти на имунната система, като напр. комплемент, зависима от антителата цитотоксичност (ADCC) или фагоцитоза чрез макрофаги. (Roitt I.M., Brostoff J., Male D.K. Immunology, Churchill Livingstone).

Предизвикването на клетъчен имунен отговор чрез пептиди, които произлизат от протеини, на които имуногенното действие не е познато, може да бъде изледвано,както описват Rivoltini et al., 1995, или Kawakami et al., 1994a. За целта се използват Т-клетки, които могат да разпознават желания пептид, ако той е представен от МНСмолекули. В случай на пептиди, които произлизат от туморни клетки, съответните Т-клетки се получават от туморинфилтриращи лимфоцити (TILs), както описват Kawakami et al., 1994b; в случай на чужди пептиди такива Т-клетки се получават аналогично от периферната кръв. Т-клетките се смесват с клетъчни линии като Т 2 (Alexander et al., 1989) или RMA-S (Karre et al.,1986) със съответния пептид, инкубират се и се лизират, в случай че се касае за имуногенен пептид.

Друга възможност за изпитване на МНС-свързващи възможни пептиди за тяхната имуногенност се състои в това, да се изследва свързването на пептиди с Т2 -клетки. Един такъв тест се основава на характерната особеност на Т2клетките (Alexander et al., 1989) или RMA-S-клетките (Karre et al., 1986), да са дефект в ТАР-пептид-транспортния механизъм и едва тогава да представят стабилна МНС-молекула, ако върху нея се доставят пептиди, които са представени в МНСконтекст. За теста се използват Т2-клетки или RMA-S-клетки, които се трансфицират стабилно с HLA-ген напр. с HLA-A1и/или Н1_А-А2-гени. Ако клетките се смесят с пептиди, които са добри HLA-лиганди, при което те в HLA-контекст така са представени, че могат да бъдат разпознати от имунната система като чужди, такива пептиди стават причина HLAмолекулите в значителни количества да се появяват на повърхността на клетката. Доказването на HLAs на повърхността на клетките,напр. посредством моноклонални антитела, позволява идентифицирането на подходящия пептид (Malnati et al.,1995; Sykulev et al.,1994). Тук също е целесъобразно да се използва стандартен пептид с позната, добра способност за свързване на HLA.

С оглед на една възможно широка приложимост на фармацевтичния състав съгласно изобретението, целесъобразно се използва смес от няколко пептидц, всеки от които може да се свързва с различна МНС-молекула, за предпочитане с един от два или три от най-често срещаните МНС-подтипове. С ваксина на основата на смес от пептиди, които могат да се свързват с тези хаплотипове, може да бъде обхваната широка популация от пациентите.

В една форма на изпълнение на изобретението ваксината може да има няколко пептидни последователности. В този случай използваните пептиди могат от една страна да се различават по това, че се свързват с различни HLAподтипове. С това може да се обхванат няколко, съотв. всички HLA-подтипове на един пациент или на по-голяма група пациенти.

Друга, в даден случай допълнителна възможност за промяна с оглед прилаганите пептидщможе да се състои в това, че пептиди, които се свързват с определен HLA-подтип, не се различават по отношение на меродавната за HLAсвързването последователност, тъй като те са получени напр. от различните протеини на същия патогенен причинител на заболяване или от различни причинители. От такава промяна може да се постигне засилване на стимулирането на имунния отговор, съотв. имунизиране срещу различни причинители на заболяване.

Количеството на активния пептид в състава съгласно изобретението може да се изменя в широка област. Количеството на пептида зависи между другото от начина на приложение и от съответната лекарствена форма. Прилаганото количество на пептида може да е около 1,0 цд до около 5000 цд за доза, най-общо 1,0 цд до около 1000 цд, поспециално около 10 цд до около 500 цд. Приемането може да се осъществи на един или няколко пъти, при многократно приемане целесъобразно най-малко три пъти. Специално при терапевтично приложение може да се осъществи прилагане в интервали (напр. от 1 х на седмица до 1 х на месец) през време на произволно дълъг период от време, който е обусловен от специфичния имунен статус на пациента, съотв. от протичането на болестта.

Фармацевтичният състав съгласно изобретението може също да се прилага ex vivo: принципът на възможно ех vivo приложение се състои в това, че APCs напр. дендритни клетки се култивират ex vivo, клетъчната култура се инкубира със състава съгласно изобретението и APCs, които представят пептида в МНС-контекст, се приемат от лекувания индивид.

За тази възможност за приложение могат да се използват познати от литературата методи, като например описаните от

Porgador und Gilboa, 1995; Young und Inabe, 1996.

Съдържащият се в състава съгласно изобретението адювант има свойството да улеснява навлизането на пептида в клетките, съотв. свързването на пептида с клетките на пациента и да засилва имуногенността на петида. Адювантът може да направи напр. мембраните на целевите клетки, в които пептидът трябва да достигне, поне за кратък срок проницаеми, за да пренесе по този начин пептида в клетката. 3актова е от полза, без обаче да се изисква безусловно, пептидът да бъде свързан с адюванта напр. чрез електростатично взаимодействие между електроотрицателния пептид и поликатионния адювант. Навлизане на пептида в клетката може да се предизвика също с това, че пептидът въз основа на неговата пространствена близост с клетъчната мембрана може да премине през нея веднага след като адювантът е предизвикал нейната проницаемост. Действието на адюванта може да се основава също на това, че той повишава върху повърхността на клетката критичната за поемане от клетката концентрация, или че той организира фагоцитозата или течния транспорт (пиноцитоза) на пептида в клетката.

По изненадващ начин присъствието на адюванта усилва не само поемането на пептида в клетката, но води също до засилване на имуномодулиращото действие на пептида, което се обяснява с правилно представяне на пептида от МНС-молекулите.

В една форма на изпълнение адюванти могат да бъдат между другото по принцип всички онези вещества, които правят проницаема мембраната, които се прилагат за пренасяне на нуклеинови киселини в клетката; в тази връзка може да се спомене WO 93/19768, където са назовани такива вещества.

В предпочитана форма на изпълнение на изобретението адювантът е основна полиаминокиселина или смес от основни полиаминокиселини.

Степента на полимеризация на полиаминокиселините може да варира в широка област. Тя възлиза на около 5 до около 1000, по-специално на около 15 до около 500.

За предпочитане, в рамките на настоящото изобретение като адювант се използва полиаргинин.

Друг предпочитан адювант в рамките на настоящото изобретение е полилизин.

Примери за други подходящи, по-специално поликатионни, органични съединения (основни полиаминокиселини) са полиорнитин, хистони, протамини, полиетиленимини или смеси от тях.

Адювантът в даден случай е конюгиран с клетъчна лиганда,напр. с трансферни, др120, LDL (Low Density Lipoprotein), α-фетулин, EGF (Epidermal Grouwth Factor)пептиди или c представител на други клетъчни лиганди за пренос на ДНК посредством ендоцитоза с посредник рецептор, които са описани в WO 93/07283, въглехидратни остатъци като маноза или фукоза (лиганди за макрофаги) или антитела (фрагменти) срещу протеини от повърхността на клетката.

В даден случай поликатионните адюванти като полиаргинин или полилизин, които в даден случай са конюгирани с клетъчна лиганда, са съставна част на комплекс с ДНК, напр. под формата на плазмид-ДНК.

ДНК може да не съдържа последователности, които кодират за функционални протеини, в такъв случай ДНК е празен плазмид.

В една форма на изпълнение на изобретението ДНК съдържа последователности, които кодират за имуномодулиращи протеини, по-специално цитокини като IL-2, интерферони, GM-CSF.

За да се изследва механизма на пептидния пренос посредством основни полиаминокиселини, в рамките на настоящото изобретение е измерено освобождаването на лактатдехидрогеназа (LDH). Докато в обработените с полиаргинин проби концентрациите на освободена LDH на практика не се доказват, след инкубация с полилизин, в клетъчните остатъци се доказват високи концентрации LDH. Тези резултати дават основание за извода, че действието на полилизина би могло да се обясни с пермеабилизиране на клетъчната мембрана.

Без теоретично потвърждение, действието на фармацевтичния състав сагласно изобретението може да се състои в това, че пептидът с помощта на адюванта прониква в целевите клетки или се свързва с клетките, които се намират в ендодермалната област на кожата. Целевите клетки са между другото антиген-представящи клетки, от които се представя пептида, в даден случай след преработка от Ви/или Т-клетки. Примери за целеви клетки са макрофаги, фибробласти, кератиноцити, Лангерхансови клетки, дендритни клетки или В-клетки.

В рамките на настоящото изобретение е изследвано дали малки пептиди в присъствието на основни полиаминокиселини или гликозилирани форми на поликатиони в засилена степен се приемат антеген-представящи клетки (APCs) от типа на макрофагите. От използваните захарни остатъци е известно, че те се приемат от макрофаги чрез ендоцитоза с посредничеството на рецептор. (За APCs се приема, че те представляват in vivo клетъчен тип, който приема пептидите и ги представя на други имунни клетки. Резултатите от in vitro опити, които показват,че APCs в присъствието на изпитвания адювант ендоцитира повишени количества пептидни антигени, са указание за това, че тези адюванти са подходящи също in vivo да засилват представянето на пептида спрямо цитотоксичните ефекторни клетки, както и неговото активиране, което като цяло води до усилен имунен отговор срещу съдържащата се във ваксината цел).

Като адюванти могат да се прилагат също компоненти под формата на частици, в даден случай в допълнение към гореспоменатите адюванти. За частици са подходящи по принцип материали, които се използват за получаване материал за колона за пептидна синтеза, напр. кизелгел или изкуствена смола, доколкото те са физиологично приемливи и от които могат да се получат частици, които са достатъчно малки да проникнат в клетката. С помощта на адюванти във формата на частици могат да се достигнат високи локални концентрации от пептид, което улеснява неговото приемане в клетките.

Видътна използвания адювант, целесъобразността на неговата модификация с клетъчни лиганди, съотв. добавянето на ДНК както и изискваното количество адювант в съотношение към пептида могат в частност да бъдат определени емпирично, напр. може избраното в отделен случай съотношение пептид към адювант, което по принцип може да се колебае в широк обхват, да се определи чрез титриране.

Изпитването на адювантите може да се осъществи по принцип по същите методи_}както изпитването на пептида, в даден случай в няколко етапа.

Способността на един адювант да повишава свързването и/или навлизането на пептида в APCs, може да се измери напр. в първи етап, при който се инкубират APCs със флуоресцентно маркиран пептид и адювант. Предизвикано от адюванта повишено приемане, съотв. свързване може да се определи чрез цитометрия в поток при сравнение с клетки, които са смесени само с пептид.

Във втори етап изпитваните адюванти могат да се изследват in vitro дали и в каква степен тяхното присъствие води до представяне на пептид върху APCs, при което по описания по-горе метод за изпитване на пептида се измерва МНС-концентрацията върху клетките.

Друга възможност за изпитване на ефективността на един адювант е използването на in vitro моделна система. За целта се инкубират APCs заедно с адювант и пептид и се измерва относителното активиране на Т-клетъчен клон, който специфично разпознава използвания пептид. (Coligan et al.,1991; Lopez et al., 1993)

Ефикасността на лекарствената форма може да бъде показана също чрез клетъчен имунен отговор чрез доказване на ”delayed-type hypersensitivity” (ОТН)-реакция в имунизирани животни.

Накрая имуномодулиращото действие на формата се измерва в опити с животни. За целта могат да се използват установени туморни модели, при които разпознаваните от имунните клетки пептидни последователности са известни. Ваксината,съдържаща пептид и адювант, се прилага във вариращи съотношения относно пептид към адювант и в цялостно количество. Защитата от туморен растеж е мярка за ефикасността на туморната ваксина.

Фармацевтичният състав може да се прилага парентерално, топично, орално или локално. За предпочитане той се прилага парентерално, напр. подкожно, интрадермално или мускулно, за предпочитане подкожно или интрадермално, за да се достигнат преди всичко кожните клетки (кератиноцити, фибробласти), дендритни клетки, Лангерхансови клетки или макрофаги като целеви клетки. В рамките на терапия на тумори, туморната ваксина може също да се прилага вътретуморно.

Съставът съгласно изобретението за парентерално приложение се приготвя като разтвор или суспензия от пептида и адюванта във фармацевтично приемлив носител, за предпочитане воден носител. Като водни носители могат да се използват напр. вода, буферирана вода, разтвор на натриев хлорид (0,4 %), глицинов разтвор (0,3%), хиалуронова киселина и подобни познати носители. Освен водните носители, могат да се използват още разтворители като диметилсулфоксид, пропиленгликол, диметилформамид и смеси от същите. Съставът освен това може да съдържа фармацевтично приемливи помощни вещества, като буферни вещества, както и неорганични соли, за да се постигне нормално осмотично налягане и/или ефективно лиофилизиране. Примери за такива добавки са натриеви и калиеви соли_?напр. хлориди и фосфати, захароза, глюкоза, протеинови хидролизати, декстран, поливинилпиролидон или полиетиленгликол. Съставите могат да се стерилизират посредством обичайни техники,напр. чрез стерилна филтрация. Съставът може непосредствено да се напълва в такава форма или също да се лиофилизира и преди употреба да се смеси със стерилен разтвор.

В една форма на изпълнение фармацевтичният състав съгласно изобретението се приготвя като топична форма напр. за дермално, съотв. трансдермално приложение. Фармацевтичният състав може да бъде приготвен₇напр. като хидрогел на база полиакрилова киселина или полиакриламид (като напр. Dolobene^R, Merckle), като мази напр. с полиетиленгликол (PEG) като вехикулум, като стандартна маз DAB 8 (50% PEG 300, 50% PEG 1500) или като емулсия, преди всичко като микроемулсия на основа вода-в-масло или масловъв-вода, в даден случай с прибавка на липозоми. Като ускорители на пенетрацията (влекачи”) са подходящи между другото сулфоксидни производни като диметилсулфоксид (DMSO) или децилметилсулфоксид (Decyl-MSO)_>както и транскутол (диетиленгликолмоноетилетер) или циклодекстрини, освен това пиролидони^напр. 2-пиролидон, 1Ч-метил-2-пиролидон, 2-пиролидон-5-карбоксилна киселина или биологично разграждащите се М-(2-хидроксиетил)-2пиролидон и техни естери с мастни киселини, карбамидни производни като додецилурея, 1,3-ди-додецилурея и 1,3дифенилурея, терпени, напр. D-лимонен, ментон, а-терпинол, карвол, лимоненоксид или 1,8-цинеол.

Други форми на приложение са аерозоли_?напр. за прилагане като спрей за носа или за инхалиране.

Съставът съгласно изобретението може да се прилага също посредством липозоми, които могат да се намират под формата на емулсии, пени, мицели, неразтворими монослоеве, фосфолипидни дисперсии, ламеларни слоеве и подобни. Те служат като носители да пренасят пептидите целенасочено до определена тъкан_?напр. лимфоидна тъкан или туморна тъкан, съотв. да удължат времето на полуживот на пептида.

В случай на приготвяне на състава съгласно изобретението като топична форма тя може още да съдържа UV-абсорбиращо средство, за да действа напр. при профилактично приложение срещу меланома едновременно като средство за защита от слънцето.

Специалистът може да намери подходящи помощни вещества и лекарствени форми в стандартни трудове като ’’Remington's Pharmaceutical Sciences ” 1990.

Описание на фигурите

Фиг. 1 Ваксиниране на DBA/2 мишки срещу мастоцитом Р 815 с пептида KYQAVTTTL

Фиг. 2 Ваксинираме на DBA/2-мишки срещу мастоцитом Р 815 с пептид SYFPEITHI

Фиг. 3 Ваксиниране на 0ВА2-мишки срещу мастоцитом Р 815 с пептид SYFPEITHI

Фиг. 4 Ваксиниране на DBA/2-мишки срещу меланом М-З със смес от пептиди

Фиг. 5 Ваксиниране на 0ВА2-мишки срещу меланом М-З посредством топично приложение

Фиг. 6 Ваксиниране на 0ВА2-мишки срещу меланом М-З-метастази

Фиг. 7 Излекуване на мишки^носещи М-З микрометастази след ваксиниране с пептидна смес

Фиг. 8 Зареждане на клетки с тирозиназа с посредничеството на полилизин.

Фиг. 9 Активиране на Т-клетка след ваксиниране в терапевтичен модел (освобождаване на IFN-γ от клетки от далака на ваксинирани животни като реакция на М-З-клетки).

Фиг. 10 Възбуждане на противовирусен имунитет посредством инфлуенцануклеокапсид-пептид ASNENMETM и фукозилиран полилизин като адювант (CTL-активиране)

Фиг. 11 Усилване на свързването на пептиди с

APCs чрез основни полиаминокиселини

Фиг. 12 Увеличаване пропускливостта на клетъчната мембрана чрез основни полиаминокиселини (освобождаване на LDH след обработка на клетките с полилизин или полиаргинин)

Фиг. 13 Навлизане на пептида чрез полиаргинин

Фиг. 14 Пренос на пептиди в антиген-представящи клетки от костен мозък

Фиг. 15 Увеличаване на преноса на пептиди в антиген-представящи клетки посредством поликатионни полиаминокиселини и хистони

Фиг. 16 Ефективност на преноса в зависимост от степента на полимеризация на основните аминокиселини.

Фиг. 17 Пренос на пептиди с полиаргинини с ниско молекулно тегло

Фиг. 18 Повлияване на ефективността на преноса в зависимост от заряда на пептида

В следващите примери се използват следните материали и методи, освен ако не е казано друго:

А) Клетки

a) Клетъчни линии

Клетъчна линия миша меланома Cloudman S91 (Klon

М-З; АТСС № CCL 53.1), мастоцитомна клетъчна линия Р 815 (АТСС № TIB 64) и клетъчна линия моноцити-макрофаги P388D1 (АТСС TIB 63) се получават от АТСС. Клетките се култивират в DMEM-среда с високо съдържание на глюкоза (’’High Glucose DMEM, Life Technologies), допълнена c 10% FCS, 2 ml L-глутамин и 20 цд/т! гентамицин. Клетките се изпитват по рутинен начин за липса на микоплазмена контаминация (PCR-Mycoplasma Detection Kit, Stratagene).

Мишата клетъчна линия RMA/S (миши лимфом) е описана от Karre et al., 1986 и от Ljunggren et al., 1990.

b) Антиген-представящи клетки от костен мозък Най-напред от бедрото на DBA/2-мишки се промива костен мозък. Клетките от костния мозък се култивират в DMEM-среда с високо съдържание на глюкоза, съдържаща 10% FCS, 5% конски серум, 2 тМ L-глутамин и 20 цд/т!

гентамицин в присъствие на 200, единици/ml миши-GM-CSF (Li et al., 1989; Genzyme, Cambridge, MA,USA). През време на първите пет дни, на всеки 24 часа се сменя две трети от средата, за да се отстранят неадхерентни гранулоцити и Вклетки (Inaba et al., 1992). Както слепените,така и свободно закрепените клетки се събират между днитег 8 и 10 чрез инкубация с PBS/5 mM EDTA и при плътност на клетките от 3 х 10⁴ клетки на ямка се посяват на 8-ямкови микроскопски предметни стъкла (Nunc, Roskilde,Danemark). Повече от 90% от клетките показват положителна реакция с антитела F4/80 (Endogen, Cambridge, МА, USA).

В) Синтеза на пептида

Пептидите се синтезират на пептид-синтезатор (Modell 433 A с Feedbackmonitir, Applied Biosystems, Foster City, Kanada) при използване на TentaGel S PHB (Rapp, Tubingen) като твърда фаза съгласно метода Fmoc(HBTUактивиране, Fastmoc™; мащаб 0:25 mmol). Пептидите се разтварят в 1М ТЕАА, pH 7,3 и се пречистват посредством хроматография с обърнати фаза на колона Vydac С-1 В. Последователностите се потвърждават посредством масспектроскопия на MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Kanada).

C) Списък на използваните пептиди

Пептид Означение	Последователност	Съответен антиген	Аминокиселина Номериране в протеина	МНСхаплотип
крер 117	SYFPEITHI	Тирозинкиназа JAK1	355-363	H2-Kd
крер 11 8	KYQAVTTTL	Tum-P198	14-22	H2-Kd
крер 162	GPPHSNNFGY	Tum-P35B	4-13	H2-Dd
крер 163	ISTQNHRAL	Р91А	12-20	H2LL3
крер 164	LPYLGWLVF	Р815	35-43	H2-Ld
крер 143	RYAEDYEEL	trp-1		H2-Kd
крер 145	PYLEQASRI	тирозиназа		H2-Kd
крер 146	YYVSRDTLL	тирозиназа		hFk3
крер150	YYSVKKTFL	trp-1		H2-Kd
	ASNENMETM	инфлуенца нуклеокапсид пептид		H2-Kb .

Пептидни смеси:

Пептидна смес I за М-З меланомна ваксина:

крер 143, крер 145, крер 146, крер 150.

Пептидна смес III за Мастоцитом Р 815 ваксина: крер 117, крер 118, крер 162, крер 163, крер 164

D) Получаване на ваксините:

Di) Ваксини с един пептид

a) Контролни ваксини с единичен пептид без адювант се получават, като пептидът се смесва в концентрация 1 mg/ml с PBS. Времето за инкубация до инжектирането е 4h при стайна температура.

b) Ваксини с единичен пептид с полилизин (ако понататък не е казано друго, използва се полилизин с дължина на веригата 200) като адювант се получават,като пептидът и полилизинът се смесват в дадените количества в HBS. Времето на инкубация до инжекцията е 4h при стайна температура.

i) За да се получи ваксина със съдържание на активен пептид 16 цд, се смесват 11,8 цд полилизин с 160 цд пептид крер 117 в общ обем 1 ml HBS.

ii) За да се получи ваксина със съдържание 100 gg активен пептид, се смесват 74 gg полилизин с 1 mg пептид крер 117 в общ обем 1 ml HBS.

с) Контролни ваксини с единичен пептид с непълен адювант на Freund (IFA) се получават_?като пептидът и IFA в дадените количества се емулгират. Времето за инкубация до инжекцията е 30 min при стайна температура.

i) За контролна ваксина, съдържаща 16 gg активен пептид, се емулгират 192 gg пептид крер 117 в 600 μΙ HBS с 600 μΙ IFA.

ii) За контролна ваксина, съдържаща 100 gg активен пептид, се емулгират 1,2 mg пептид крер 117 в 600 μΙ HBS с 600 μΙ IFA.

D₂ ) Пептидни смеси като ваксини

a) Пептидна смес I като контролна ваксина без адювант съдържа 250 gg от всеки от пептидите крер 143, крер 145, крер 146, крер 150 в общ обем 1 ml PBS.

b) Пептидна смес III като контролна ваксина без адювант съдържа 250 gg от всеки от пептидите крер 117, крер 118, крер 162, крер163, крер 164 в общ обем от 1 ml PBS.

c) Пептидна смес I като ваксина с полилизин като адювант се получава_?като 1 mg пептидна смес I (съдържаща зв

250 цд от всеки пептид) се смесва с 74 цд полилизин в HBS.

Инкубационното време до инжекцията е 4 h при стайна температура.

d) Пептидна смес III като ваксина с полилизин като адювант се приготвя, като 1,25 mg пептидна смес III (съдържаща 250 цд от всеки пептид) се смесва с 93 цд полилизин в HBS. Инкубационното време до инжекцията е 4h при стайна температура.

e) Пептидна смес I като контролна ваксина с непълен адювант на Фройнд се получава, като 1,2 mg пептидна смес I в 600 μΙ HBS (съдържаща 300 μς от всеки пептид) се емулгира с 600 μΙ IFA. Инкубационното време до инжекцията е 30 min при стайна температура.

f) Пептидна смес III като контролна ваксина с непълен адювант на Фройнд се получава_;като 1,5 mg пептидна.. смес III в 600 μΙ HBS (съдържаща 300 цд от всеки пептид) се емулгира с 600 μΙ IFA. Инкубационното време до инжекцията е 30 min при стайна температура.

д) За топично прилагане с полилизин като адювант се инкубира 1 mg пептидна смес I (съдържаща 250 μρ от всеки пептид) с 74 цд полилизин в продължение на 4 h в общ обем от 400 μΙ HBS. Получената смес се разбърква в 1,6 g хидрогел DOLOBENE (Merckle).

h) За топично приложение на контролна ваксина без адювант, 1 mg пептидна смес I (съдържаща 250 μρ от всеки пептид) в общ обем от 200 μΙ HBS се разбърква в 1,8 g хидрогел DOLOBENE (Merckle).

i) Получаването на свързан с фукоза полилизин (дължина на веригата: 240 съотв. 200) се осъществява по метода_?описан от MacBroom et al.,1992, при което се постига заместване около 40 % (изходният материал β-Lфукопиранозилфенил-изотиоцианат и полилизин са получени от Sigma).

j) Когато се използват трансферин/полилизинконюгати (получени₇както е описано в WO 93/07283)? количеството се нагажда така, че абсолютното количество на полилизин да е 75 pg за mg пептид. Ако в комплекса се интегрира плазмид-ДНК (празен плазмид pSP65, несъдържащ -LPS, Boeringer Mannheim), съотношението е 37,5 pg ДНК/75 pg полилизин/ 1 mg пептид. В случай на използване на 160 pg вместо 1 mg пептид, количествата на другите компоненти се намаляват със същия фактор (6,25).

E) Инжектиране на ваксината

Преди подкожната инжекция мишките в групи от до осем животни се анестезират в изолирана въздушна камера. След 3,5 min третиране с халотан (4% в О₂, скорост на изтичане 4) мишките са упоени в продължение на около 1 min.; в това време се инжектира подкожно ваксината.

Интраперитонеална инжекция се извършва без предварително анестезиране. Инжектираният обем за всяка ваксина е 100 pl на животно, което отговаря на 100 pg единичен пептид или пептидна смес I на животно. В случай на пептидна смес III се използва 125 pg общо количество пептиди на мишка.

F) Топично приложение на ваксината

На мишка се втрива по 200 mg маз, съдържаща 100 pg пептид или пептидна смес I, съотв. пептидна смес I в кожата на обръснати животни и именно по целия гръб и в ушите. Точното количество се контролира с везна.

G) Приложение на ваксината срещу туморен растеж в миши модел.

Протоколът за изпитването на ефикасността на туморните ваксини в профилактичен или терапевтичен миши модел отговаря, ако не е казано друго, на описания във· W0 94/21808 принцип, при което като миши модел се използва DBA/2 модел.

Примери за изпълнение на изобретението ПРИМЕР 1

Ваксиниране на DBA/2 мишки срещу мастоцитом Р 815

160 цд от пептида с последователност KYQAVTTTL (крер 118) произлизащ от описания от Lethe et al., 1992, туморен антиген Р 815, лиганда от H2-K^d, се смесва с 11,8 цд полилизин 300 в 500 μ| HBS и се инкубира 4 h при стайна температура. След това се прибавят 500 μΙ EBSS (буфериран разтвор на натриев хлорид на Earl). По 100 μΙ от получената смес се прилагат на 8 мишки подкожно, в едноседмичен интервал. След това предварително имунизиране, след още една седмица се предизвикват тумори, като на всяка мишка се инжектират контралатерално 5 х 10⁴ клетки от мастоцитомна клетъчна линия Р 815 (АТСС № TIB 64; тези клетки експресират туморен антиген, от който произлиза пептидът Р 815) в 100 μΙ EBSS. Резултатът от този опит е представен на Фиг.1 (запълнените квадратчета).

В паралелен опит 200 цд от пептида се смесват с

500 μΙ HBS и след това се емулгират с 500 μΙ адювант на

Фройнд. С по 100 μΙ от получената емулсия се имунизират предварително 8 мишки и след това се вкарват Р 815 туморни клетки, както е дадено по-горе (Фиг. 1 запълнени кръгчета).

За друг паралелен опит се получава клетъчна туморна ваксина₇както следва:

160 μ9 пептид крер 118 се смесва с 3 μ9 трансферин-полилизин (Tipi), 10 цд pl и 6 μ9 плазмид psp65 (несъдържащ LPS) в 500 μΙ HBS-буфер.След 30 min при стайна температура, горният разтвор се прибавя в Т 75 съд за клетъчни култури с 1,5 х 10⁶ клетки от алогенна фибробластна клетъчна линия NIH3T3 (АТСС № CRL 1658) в 20 mi DMEMсреда (10% CFS, 20 тМ глюкоза) и се инкубира при 37°С. След 3 h клетките се смесват с 15 ml прясна среда и се инкубират една нощ при 37~С и 5% СОг- 4h преди приложението клетките се облъчват с 20 Gy.По-нататъшната обработка на ваксината се извършва?както е описано във W0 94/21808. Предварителното имунизиране с тази ваксина се извършва в едноседмичен интервал, с 10⁵ клетки; след още още една седмица се провежда вкарването на тумора7както е описано по-горе. (Фиг.1 запълнени триъгълничета). Показано е, че ваксината, която съдържа пептида заедно с полилизин, най-добре защитава мишките от образуване на тумори.

ПРИМЕР 2

Ваксиниране нз DBA/2 миш ки срещу мастоцитом Р 815 с ваксина с един пептид

а) Три ваксини с по един петид, съдържащи или пептид крер 117 самостоятелно в PBS (Фиг. 2а), пептид крер 117, емулгиран в IFA (Фиг. 2Ь) или пептид 117 с полилизин (дължина на веригата: 240) като адювант (Фиг.2с), се изпитват за защитно действие срещу вкарване на тумор Р 815. Ваксините се получават,както е описано по-горе в раздел D. Инжекционният обем всеки път е 100 μ|; инжектирането се извършва подкожно (sc) или интраперитонеално (ip).

Нетретирани мишки служат за отрицателен контрол, ваксина от цели клетки₇състояща се от GM-CSF секретиращи Р 815 клетки като положителен контрол (Р 815-GM-CSF; 10⁵ клетки в 100 μΙ се инжектират подкожно на всяко животно). Всяка опитна група се състои от осем животни, извършват се три ваксинирания (sc) на интервали от седем дни. Една седмица след последното ваксиниране животните получават контралатерално туморно заразяване с 5 х 10⁴ Р 815-клетки. Животните се инспектират ежедневно, настъпването на тумори се контролира на интервали от една седмица.

Пептидът крер 117 с полилизин като адювант постига най-добро противотуморно действие, ако се инжектира подкожно 100 цд на животно (три от осем животни са защитени). Този ефект е приблизително толкова добър, както постигнатият с ваксина от цели клетки (четири от осем животни са защитени). 16 цд пептид заедно с полилизин на животно е по-малко ефективно (две защитени животни), обаче ясно по-добър от 100 цд пептид в PBS (Фиг. 2а, няма защитно действие). Също така, емулгиран в 1РА_?пептидът не постига действието, което упражнява заедно с полилизина (Фиг. 2с).

Ь) В друг експеримент в Р 815 мастоцитомен модел, два немодифицирани полилизина с различни дължини на веригата се сравняват помежду си, един по-къс само с 16 лизинови остатъци (р!_ 16) и един дълъг с 240 остатъка (р!_

240). На животните от контролните групи се инжектира 100 цд пептид крер 117 или разтворен в PBS_?win емулгиран в IFA. Две GM-CSF секретиращи клетъчни контролни ваксини се прилагат като позитивни контроли (виж а), при което едната ваксина е получена от стабилно трансфицирани Р 815-клетки, а втората посредством транзиентна трансфекция при използване на метода₇описан от Wagner et al., 1992 (AVET). Двете ваксини от цели клетки осигуряват на четири, съотв. пет от животните/защита. Ваксините на основата на пептиди, които се състоят само от пептид или емулгиран в IFA пептид, не показват защитно действие: всички животни, скоро след вкарването на тумор_;развиват тумори. Ако обаче пептидът се приложи заедно с полилизин, пептидната ваксина защитава животните срещу вкарания тумор: две от осем животни са защитени, когато се приложи дълъг полилизин (pL 240) и четири от осем животни в случая на къс полилизин. Тези резултати, които са представени на фиг. 3, показват, че един единичен пептид, когато е приложен заедно с полилизин като адювант,причинява ефективна противотуморна защита, която е сравнима с тази на най-ефективните цитокинсекретиращи ваксини от цели клетки, които са посочени в литературата като стандартно противотуморно ваксиниране (Dranoff et al.,1993; Schmidt et al., 1995).

ПРИМЕР 3

Ваксиниране на DBA'2 мишки срещу мастоцитом Р 815 с туморна ваксина,съдържаща Р 815 единични пептиди или смеси от Р 815-пептиди.

За получаването на ваксината се използват следните пептиди:

крер 118 (100 цд на инжекция)

Пептидна смес III (крер 117, крер 118, крер 162, крер 163, крер 164) тази пептидна смес съдържа всички досега известни Р 815-пептиди; използват се 25 цд от всеки пептид за една инжекция).

Прилагат се също положителни контроли, GM-CSF секретиращи Р 815 клетки.

В предварителните опити крер 117 се оказва пептидът с най-добро защитно действие срещу Р 815-туморно заразяване, ако се използват 100 ад пептид заедно с полилизин (7,5 цд полилизин/100 ug пептид^отговарящо на стандартно съотношение; полилизин: дължина на веригата = 200). Много по-малко количество (16 дд ) крер 117 е много по-малко активно. В този пример се инжектират по 100 дд крер 118 на животно, и именно веднъж с полилизин (група В), веднъж с трансферин-полилизин (група С) и веднъж с трансферин-полилизин/ДНК (група D). За контрола се използва крер 118 с IFA. В този експеримент крер 118 сам не показа защитно действие срещу туморно заразяване.

В проведения в пример 4 опит е показано, че ваксина ^съдържаща пептидна смес от меланомни пептиди, показва защитно действие срещу меланома. Поради това в този пример се изпитва, дали концепцията за пептидна смес е подходяща също за Р 815.

Пептидната смес III се прилага веднъж с полилизин (група Е), веднъж с трансферин-полилизин (група F) и веднъж с трансферин-полилизин/ДНК (група G). За контрола се използва пептидната смес III в IFA. Като отрицателна контрола се използват нетретирани мишки; като позитивна контрола—

GM-CSF-трансфицирани Р 815-клетки (10⁵ клетки на мишка).

Проведените в този пример опити се развиват в сравнение с другите опити по-скоро нетипично: в позитивната контролна група (GM-CSF секретиращи клетки) всички животни развиват тумори скоро след вкарването на тумори, при което повечето от тези тумори също така бързо изчезват,както бързо са се появили. Едно възможно обяснение за това е, че туморът известно време нараства преди да бъде разрушен. Друго възможно обяснение е, че диагностицираното като тумор подуване не е предизвикано от туморен растеж, а от силен инфилтрат на имунни клетки (гранулом). Тъй като животните не са сецирани, причината не можа да бъде потвърдена определено; всеки път вкараните тумори накрая се разрушават. Друг интересен резултат се получава в групата G, в която животните се обработват с комбинация от пептидна смес III и полилизин. Всички животни развиват тумори, в две от животните обаче големината на подуването от тумора (съотв. инфилтрата на имунни клетки) е относително Тези две животни не са убити, а се оставят под наблюдение. По изненадващ начин девет седмици след вкарването на тумора тумори вече не се доказват, резултат,ненаблюдаван досега. Две от осемте животни разрушават впоследствие туморитеРазрушаването на туморите би могло да се обясни със съдържанието на крер 117 в пептидната смес, където по аналогия с пример 2 две от осем животни с 16 цд крер 117 и три от осем животни с 100 μg крер 117 са защитени. Защитното действие би могло обаче да бъде предизвикано също от повече от един пептид от сместа.

ПРИМЕР 4

Защита на DBA/2 мишки срещу меланома М-З чрез предварително имунизиране с туморна ваксина, съдържаща смес от пептиди

Прилага се профилактична ваксина, която съдържа смес от меланомни пептиди (пептидна смес I, раздел D2).

Протоколът за предварителното имунизиране с ваксината^както и вкарването на туморите,отговаря на протокола^описан в пример 2, с тази разлика, че заразяването с тумор се извършва с М-З-клетки (10⁵ клетки за животно). Като контролна ваксина се използва ваксина от цели М-Зклетки, които секретират оптимално количество IL-2 (10002000 единици за 10⁵ клетки) и се получава_?както е описано от Schmidt et al., 1995. При избраните условия на опита тази ваксина достига 100 % защита (Фиг. 4).Четири групи опитни животни получават ваксина с пептидна смес. Две групи получават или s.c. или i.p. пептида₇емулгиран в IFA. Другите две групи получават или s.c. или i.p. пептидите заедно с полилизин (pL 240).

Фиг. 4 илюстрира защитния ефект на пептидната ваксина с полилизин (pl_ 240) като адювант. 50 % от третираните мишки са защитени срещу М-З туморно заразяване в сравнение с нетретираните животни, при които бързо се развиват твърди тумори. Това действие може да се постигне, когато ваксината пептид-полилизин се инжектира подкожно или като хидрогел,нанесен върху кожата (Фиг. 5). В другите три контролни групи, които се третират с пептид/полилизин ваксина i.p. или с пептиди в IFA, ваксината е по същество неактивна. Тук вкараните тумори не се отхвърлят и туморите нарастват в сравнение с нетретираните контролни животни с едно минимално забавяне. Тези резултати показват, че ваксина_?съдържаща пептидна смес_? постига противотуморно защитно действие, ако съдържа полилизин. При избраните условия на опита тази пептидна ваксина има само наполовина от действието на клетъчната IL2 -ваксина, която в съгласие с появилите се напоследък съобщения (Zatloukal, 1993, Zatloukal, 1995) защитава до 100 % от животните срещу инфектиране с тумори с 10⁵ живи М-З клетки.

ПРИМЕР 5

Защита на DBA/2 мишки срещу М-З метастази

а) Прилага се терапевтична ваксина, която съдържа смес от меланомни пептиди (пептидна смес I, описана в раздел D2)· Прилагат се три ваксинирания (sc) в едноседмичен интервал. Първото ваксиниране се осъществява пет дни след вкарването на метастази, след това се ваксинира срещу петдневна метастаза. 1,2 х 10⁴ М-З клетки се инжектират за вкарването на метастази, прилага се описаният във W094/218O8 и при Schmidt et al., 1996 протокол.

Като ваксина се използва пептидна смес I: без адювант (pepmix 1 PBS), с IFA като адювант (IFA pepmix 1) или с модифициран с фукоза полилизин (fpL pepmix 1). Контролните групи не получават ваксина (нетретирани) или получават въведената в пример 4 IL-2 продуцираща М-З ваксина от цели клетки. Фиг. 6 показва, че най-добра защита се постига в групата ^третирана с пептидна смес I с модифициран с фукоза полилизин като адювант (Фиг. 6а). 50% от мишките отхвърлят метастазите (4/8). Това третиране освен това е по-ефикасно_?отколкото с ваксината от цели клетки, която защитават само 33% от мишките (3/9).

Пептидната ваксина с IFA или без адювант води предимно до забавяне нарастването на метастазите до тумор. (Фиг.бЬ).

b) В друг експеримент е изследвано в терапевтичен модел защитното действие на ваксина, която съдържа пептидната смес I и се прилага подкожно. Контролните групи съдържат пептидната смес в PBS (без адювант) или с IFA. Като адювант се използва немодифициран полилизин 240. Освен това, като адювант се използва модифициран с фукоза полилизин 200 (fpL. 200). Като контроли при този експеримент са група от животни с IL-2 експресираща клетъчна ваксина. Както във Фиг. 7а е показано, ваксината пептид/полилизин при обработка с М-З-метастази е ефикасна. Значителна степен на оздравяване се постига в този опит с модифицирания с фукоза полилизин. При това третиране 50%' от животните отхвърлят метастазите, което в сравнение с IL2-ваксината, която в този случай лекува 70 % от животните, е добър резултат.

c) В друг експеримент се изпитва в терапевтичен модел как действат на противотуморното действие промените и модификациите на поликатионите. При това се изпитват в допълнение към немодифицирания и модифицирания с фукоза полилизин 200, немодифицирания къс полилизин pl_16, дълъг полилизин pL 450 и един друг поликатион, а именно полиаргинин (pArg 720). Като позитивна контрола се използва клетъчна М-З ваксина секретираща оптимално количество (> 10 ng за 10⁵ клетки) GM-CSF ( Schmidt, 1995). Също и в този опит контролните групи получават пептидната смес в IFA или без адювант. Както в пример 5 Ь) най-добър резултат се получва, когато се приложи като адювант фукоза-полилизин (Фиг. 7 Ь). В тези групи 40 % от животните отхвърлят метастазите, в сравнение с 30 % в групата с късия полилизин pL 16. Освен в групата, която получава пептидите заедно с полиаргинин, животните в останалите групи, на които е приложена пептидна ваксина показват само кратко забавяне при възникването на тумори. Немодифицираният полиаргинин в този опит е точно толкова ефикасен както модифицирания с фукоза полилизин, той води до отхвърляне на метастазите от четири от десет животни.

Фиг. 7с показва повторението на този постигнат с полиаргинин ефект в един независим експеримент. Също и тук ваксинирането с пептидна смещсвързана с полиаргинин, показва при четири от осем третирани животни противотуморно действие.

ПРИМЕР 6

Зареждане на клетки с тирозиназа при използване на полилизин като адювант

Този пример служи като опит да се покаже, че полилизинът като адювант е подходящ за зареждане на клетки с по-големи протеинови фрагменти или цели протеини, при което като клетки заместващо се използват. М-З клетки.

За зареждане на клетките най-напред 160 gg FITCмаркирана тирозиназа (ЕС 1.14.18.1;Sigma) се смесва с 3 gg полилизин (pL 240) и се инкубира 3 h при стайна температура. След това полученият разтвор се инкубира при 37°С, в Т 75 съд за клетъчни култури с прибавени 2 х 10⁶ М-З-клетки. След това клетките се промиват два пъти с PBS, обработват се с

PBS/2 mM EDTA и се смесват c 1 ml PBS/5% FCS за FACSанализ. Фиг.8 показва зареждането на М-З клетки с тирозиназа (лявата крива показва контролата, дясната зареждането с тирозиназа).

ПРИМЕР 7

Определяне на активирането на Т-клетки след имунизиране в терапевтичен модел

След като пептид/поликатионната ваксина в терапевничен модел на мишки (виж пример 5) ясно е паказала действие, се изследва дали това лечение води също до активиране на Т-клетките. За целта се използва цитокиновата секреция след съинкубиране на клетки от далака на ваксинирани животни с парентални М-З клетки,заместващо използвани като маркери (Kawakami et al., 1994b). ^т

Приготвят се суспензии от отделни клетки от далак * на ваксинирани и нетретирани животни, последван от анализ ^: на еритроцитите с хипотоничен буфер (0,15 NH₄CI, 1 mM КНСОз, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Слепените клетки се отстраняват, при което 3 х 10⁶ клетки от далака на ml DMEM среда (10% FCS) се инкубират при 37°С, в панички на Петри, в продължение на 90 min. Неслепените клетки се съинкубират внимателно,пипетират и съкултивират с 1 х 10³ парентални клетки в различни количествени съотношения. Клетките се култивират в 200 μΙ DMEM-среда (10% FCS), 2 mM L-глутамин и 20 μρ/ΓηΙ гентамицин в 96-ямкови плоскодънни панички за тъканни култури. На ден 9-ти се събират 100 μΙ надутаечна течност и се измерва съответното съдържание на IFN-γ при използване на търговско дъстъпен прибор за ELISA (Endogen, Cambridge, МА, USA) съгласно указанията на производителя. Показва се, че след девет дни инкубация само клетките от далака на ваксинираните животни секретират поголеми количества IFN-γ в средата, докато в съкултури на клетки от далака на нетретирани животни и М-З клетки, на практика не се доказва IFN-γ. Резултатът от този опит е представен на Фиг. 9.

ПРИМЕР 8

Индуциране на противовирусен имунитет посредством инфлуенцануклеокапсид-пептид ASNENMETM и фукозилиран полилизин като адювант

Поставя се ваксина, която съдържа за 1 mg пептид ASNENMETM 75 цд fpLys. Ваксината се прилага чрез еднократно инжектиране, както е дадено в частта за методите, при което се инжектира 100 цд пептид/ 7,5 цд fpLys на животно. За контрола се прави инжекция от 100 цд пептид самостоятелно (PBS) съответно не се предприема инжектиране (нетретирани контроли)

Клетки от RMA-S миши лимфом се инкубират една нощ в несъдържаща серум среда, при 26°С, с 10 цд пептид ASNENMETM.

дни след ваксинирането се изолират клетки от далака на ваксинираните животни, смесват се със заредените с пептид RMA-S клетки в съотношение 5:1 и се култивират още 5 дни допълнително (Stuber et al., 1994). Определя се броягна преживелите ефекторни далачни клетки в различните култури, след това клетките се смесват за определяне на CTLактивност посредством стандарт 41п-анализ за освобождаване на еуропий (Bomberg et al., 1993) в различни съотношения с RMA-S-клетки, които предварително са смесени с пептида

ASNENMETM и c хелат на еуропий. Както показва фиг. 10, в този опит се постига специфичен имунитет само чрез ваксиниране с пептид и fpLys, не обаче когато се приема само пептида.

ПРИМЕР 9

Изпитване на различни основни полиаминокиселини за тяхната способност да усилват навлизането и/или свързването на пептидите с APCs.

За този тест се прилага флуоресцентен анализ: Модел пептиден антиген с последователност LFEAIEGFI (МНС Kd-рестрингиран) се маркира с флуоресцентно багрило флуоресциинизотиоцианат (FITC) съгласно указанието на производителя (Molecular Probes). Поглъщането, съотв. свързването на FITC-маркирания пептид самостоятелно (’’pulsed¹) или заедно с различни концентрации на основни аминокиселини (полилизин с дължина на веригата от 16 до 490, полиаргинин с дължина на веригата от 15 до 720) се измерва посредством цитометрия в поток чрез MHC-Kdрестрингираща клетъчна линия моноцити-макрофаги Р 388D1. За целта 1 х 10⁶ Р 388D1 клетки се инкубират при 37°С в краен обем от 1 ml среда (DMEM/10% FCS) в центрофужни тръбички с 5 цд FITC-маркиран пептид самостоятелно или със смес от пептид и полиаминокиселина в продължение на 30 min и след това се промива обилно, за да се отстрани свободният пептид. Полиаминокиселините се прибавят в концентрация от 50, 25, 12, 6 и 3 pg за ml среда, съдържаща 5 pg FITC-маркиран пептид. Относителният интензитет на флуоресценцията на различните проби се сравнява, за да се прецени ефективността на свързването и/или поглъщането на пептида. Резултатът от този опит е представен на Фиг. 11;

опитите се провеждат с по 25 цд pL 450 съотв. рАгд 450. При избраните условия на опита, полиаргининът се оказва около пет пъти по-ефективен,отколкото полилизина.

ПРИМЕР 10

Изследване на механизма, по който пептидите се приемат от APCs

Пептидите могат да се приемат от APCs чрез специфични механизми като макропиноцитоза или ендоцитоза с посредничеството на рецептор (Lanzavecchia, 1996). Алтернативен механизъм може да се състои в това, че полиаминокиселините могат да направят клетъчната мембрана, проницаема и по този начин правят възможна дифузията на пептидите от средата в цитоплазмата.

а) Дали настъпва пермеабилизиране на клетъчната мембрана се изпитва,като се измерва освобождаването на цитоплазмения ензим лактатдехидрогеназа (LDH) след инкубация на Р 388D1 клетки с полиаминокиселини (полилизин или полиаргинин) при условия на изотоничност при използване на търговско достъпен прибор (Cytotox 96, Promega, Madison, Wisconsin, USA) съгласно указанията на производителя. На основата на получените във Фиг. 12а резултати може да се приеме, че действието на pLys се състои в това, че той прави клетъчните мембрани пропускливи, което се изразява в по-високи концентрации на освобождавания при изотонични условия цитоплазмен ензим. В противоположност на това след обработка с рАгд (Фиг. 12Ь) практически не се доказва LDH. При сравнение на проби, които са обработени само с полиаминокиселини, не е установена при сравнение на обработването със смес от полилизин или полиаргинин с петид някаква разлика в освобождаването на LDH. След инкубация само с пептид самостоятелно не е доказана измерима разлика в LDHактивността.

Ь) Дали настъпва навлизане на FITC-маркирани пептиди в присъствието или отсъствието на основни полиаминокиселини,се изледва въз основа на приципа публикуван от Midoux et al., 1993: Навлезлите от клетките частици се пренасят в ендозомите. В сравнение със цитоплазмата или средата за клетъчна култура, които показват неутрални pH-стойности, тези органели са кисели, с pH стойност около 5. Емитираната от FITC флуоресценция е силно зависима от pH. В една област с pH условията, каквито са в ендозомите, флуоресценцията се потиска. Затова FITCмаркираните пептиди, които са погълнати от клетките в ендозомите,показват намалена флуоресценция. При * прибавяне на монензин ниската pH-стойност на ендозомите се неутрализира, което води до измеримо засилена флуоресценция на навлезлите FITC-маркирани пептиди.

Клетките се инкубират със смес от полиаргинин (средно молекулно тегло около 100,000. Дължина на веригата 490) и петид маркиран с флуоресцентно багрило при_4°С или 37°С. Аликвотна част от инкубираните при 37°С проби се запазва и преди анализа с цитометрия в поток се обработва при 4°С с монензин.

Показва се, че инкубацията на APCs с определени основни полиаминокиселини като полилизин (pLys) и полиаргинин (pArg) усилва приемането,съотв. свързването на пептида с APCs.

Както се вижда от Фиг. 13, в клетките, които са обработени само с пептид и монензин, се наблюдава само минимално покачване на флуоресценцията. В противоположност на това, флуоресцентните сигнали в пробите, които са обработвани с монензин и смес от полиаргинин и пептид, силно се повишават. Не се наблюдава приемане на пептида, когато пробите са инкубирани при 4°С. Значителното покачване на флуоресценцията след обработката с монензин е указание за това, че причиненото от pArg зареждане на пептида води до това, че той се натрупва в мехурчетата във клетката (Midoux et al., 1993; Фиг. 13). Както се очаква, след обработка с монензин на незаредените с полилизин проби се наблюдава само минимално повишение на флуоресценцията. Зареждането с полилизин при 4°С предизвиква измеримо покачване на флуоресценцията, което е друго указание за това, че действието на полилизина трябва да се обяснява главно с повишаване на пропускливостта на клетъчната мембрана.

ПРИМЕР 11

Изследване на зареждането на APCs с къси пептиди Произлизащи от костен мозък, получени с GM-CSF APCs се изследват с комбинация на флуоресцентно маркиран пептид плюс полилизин (pL 200; Sigma) или с пептид самостоятелно посредством флуоресцентна микроскопия. За микроскопско доказване на приемането на пептида APCs се посяват на предметни стъкла и се инкубират 30 min при 37°С с 40 цд маркиран с флуоресцеин пептид LFEAIEGFI самостоятелно или със смес с 50 gg/ml полилизин (pL 200) и цд/ml пептид LFEAIEGFI самостоятелно или със смес с 50 цд/т1 полилизин (pl_ 200) и 40 цд/т1 пептид LFEAIEGFI. След обилно промиване клетките се фиксират с 4% параформалдехид, покриват се с anti-Fadent (Dako, Glostrup, Danemark) и се наблюдават под флуоресцентен микроскоп (Zeiss). Ядрата се контрастират с 4,6-диамидино-2фенилиндол (DAPI;Sigma). Както е показано от флуоресцентните фотографии на фиг. 14, клетките,които са _ инкубирани с пептид и полилизин (А),показват спрямо клетките, които са третирани само с пептид (В), отчетливо засилено приемане на пептид. Докато флуоресценцията при клетките, които са третирани само с пептид (pulsed”) настъпва частично и единично, заредените с пептид клетки в присъствие на полилизин показват интензивна флуоресценция, която не е локализирана, а се разпределя общо равномерно по цялата клетка.

ПРИМЕР 12

Количествено определяне на зареждането на клетките с пептид посредством цитометрия в поток (’Transloading Assay”)

а) След като в проведения в пример 11 опит е доказано, че APCs са предпочитани целеви клетки за зареждането с малки пептиди,са проведени in vitro FACSанализи, да се идентифицират подходящите адюванти за пептидна ваксина. Този анализ позволява бързо количествено изпитване на флуоресцентно маркирани пептиди; като моделен пептид се използва пептид с последователност LFEAIEGFI. В тези опити се използват като APCs миша клетъчна линия от Р 388D1. 1х 10⁶ клетки в краен обем 1 ml

5Ί

DMEM-среда с високо съдържание на глюкоза и 10% FCS се инкубират 30 min при 37°С с 5 цд пептид при крайна концентрация на флуоресцеин 5 nmol/ml. Клетките се обработват или с пептид самостоятелно,или с комбинация на пептид и поликатиони или пептид и хистони при нарастващи концентрации (3 до 50 ug/ml),както е дадено на Фиг. 15. Използвани са следните съединения: А: Полиорнитин (средно молекулно тегло в областта 110,000, дължина на веригата 580); В: богат на аргинин хистон; С: богат на лизин хистон; D: полиаргинин (средно молекулно тегло в областта 100,000, дължина веригата 490); Е: полилизин (средно молекулно тегло в областта 94,000, дължина на веригата 450). В предваретелни опити е установено, че инкубационно време от 30 min осигурява максимално приемане на пептид. Попродължителна обработка (4 съотв. 8 h) не дава значимо увеличаване на флуоресцентните сигнали. Преди анализа клетките се промиват 5 пъти с голям обем РВЗ^ъдържащ 0,2% BSA. Клетките се смесват отново с 1 ml леденостуден PBS/0,2% BSA и се изследват посредством цитометрия в поток (FACScan; Beckton Dickinson, San Jose, CA,USA).

Полиаргининът и полилизинът се показват като найефективни адюванти; полиорнитинът, при избраните условия на опита,показа цитотоксично действие. Усилването на приемането на пептид чрез полиаргинин и полилизин корелира с концентрацията (Фиг. 15 d, е); приемането се увеличава с дължината на веригата (Фиг. 16).

Наблюдавано е, че полиаргининът показва с едно покачване с 3 десетки процента спрямо контролите, пошироко подхождаща област на концентрациите_лотколкото полилизина, който показа максимално повишение от по-малко от 2 десетки процента, и че той при всички приложени дължини на веригите е по-ефективен за преноса на протеини, отколкото полилизина (Фиг. 16); полиаргининът прави вазможен ефикасен пренос при ниски концентрации като 3 цд/т1, докато за полилизина се изискват концентрации > 25 цд/т1, за да предизвика значимо повишаване на флуоресценцията (Фиг. 15 d, е).

b) За да се потвърди дали за преноса на пептидите съществува долна граница на дължината на веригата, са синтезирани полиаргинини с различни дължини на веригите (10-30 остатъци) и се изследва способността им да повишават преноса на пептиди при високи концентрации на поликатиони * (Фиг. 17). За тези опити се използва пептидът LFEAIEGFI, изпитваните полиаргининполимери се въвежда в концентрация¹ от 100 цд/т1. ^s

Едно макар и минимално покачване на пептидния пренос се наблюдава вече дори с най-късия изпитван полиаргинин.

c) Основните аминокиселини са положително заредени молекули. От тук може да се приеме, че отрицателно заредените пептиди биха могли да се свързват с тези поликатиони чрез електростатични взаимодействия, което е възможно да води до усилено приемане на пептиди. За да се провери тази хипотеза, е сравнена способността на катионните полиаминокиселини да поемат къси пептиди в зависимост от техния заряд в Р 388D1-клетки. В таблицата подолу са изброени използваните отрицателно заредени пептиди, които изпълняват всички изисквани условия за МНС1-свързването (Rammensee et al., 1995). Пептид 1 е изведен от миши-TRP (’’tyrosinase related protein”), пептид 2 произлиза от инфлуенца-хемаглутинин (SCHmidt et al.,1996), пептид 3 от миша тирозиназа, пептид 4 от Р 198-туморен антиген, пептид 5 от бета-галактозидаза (Gavin et al.,1993) (”Мг” означава областта на молекулното тегло.

ТАБЛИЦА

Последова телност	Мг	Мг флуоресцеин	Зареждане	Зареждане + флуоресцеин
AEDYEEL	1031	1389	4 х отрицателно	6х отрицателно
LFEAIEGFI	1038	1396	2 х отрицателно	4х отрицателно
IFMNGTMSQV	1127	1485	неутрално	2 х отрицателно
KYQAVTTTL	1024	1382	1 х отрицателно	1 х отрицателно
TPHPARIGL	961	1319	2х отрицателно	неутрално

На основата на приложения метод за маркиране на пептидите с флуоресцеин се въвеждат два отрицателни заряда. Оказва се, че след инкубация с полиаргинин пептидите (5 nmol за проба) с най-високо число на отрицателния товар са най-ефективно пренасяни в Р 388D1 клетките, което говори за това, че йонното взаимодействие между пептида и поликатиона допълнително повишава преноса на пептиди в клетките (Фиг. 18). Все пак, в сравнение с клетките, които са обработени само с пептид, също в случай на неутрален пептид, в присъствие на поликатиони се приемат по-големи количества. Обработката само с пептид води при всички изпитвани пептиди до почти идентични флуоресцентни сигнали; от съображения за представяне, на фиг. 18 като ’’само пептид” е показано заместващо полученият флуоресцентен сигнал с пептида LFEAIEGFI.

Claims (33)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Фармацевтичен състав с имуномодулиращо действие на на базата на пептиди, характеризиращ се с това, че включва един или повече пептиди, протеини или фрагменти на протеини и адювант.
2. 2. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът, съотв. клетъчният продукт на разграждане на протеина или протеиновият фрагмент,е лиганда за най-малко една МНС-молекула, която се експресира от лекувания индивид.
3. 3. Фармацевтичен състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че пептидът, съотв. клетъчният продукт на разграждане на протеина или протеиновият фрагмент_?е лиганда за МНС-1-молекула.
4. 4. Фармацевтичен състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че пептидът, съотв. клетъчния продукт на разграждане на протеина или протеиновия фрагмент,е лиганда за МНС-П-молекула.
5. 5. Фармацевтичен състав съгласно някоя от предходните претенции, характеризиращ се с това, че съдържа пептид, който произлиза от протеин на патогенен

   I причинител на заболяване.
6. 6. Фармацевтичен състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че пептидът произлиза от бактериален протеин.
7. 7. Фармацевтичен състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че пептидът произлиза от вирусен протеин.
8. 8. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенции 1 до 4 за приложение като туморна ваксина, характеризиращ се с това, че протеинът е туморен антиген, съотв. протеиновият фрагмент или пептидът, съотв. пептидите произлизат от туморния(те) антиген(и).
9. 9. Фармацевтичен състав съгласно претенция 8 за терапевтично приложение, характеризиращ се с това, че туморният антиген, съотв.туморните антигени_?произлизат съотв. са туморни антигени, които са експресирани от индивида₇който ще се лекува.
10. 10. Фармацевтичен състав съгласно претенция 8 за профилактично приложение, характеризиращ се с това, че туморните антигени произлизат от представители на често срещани туморни антигени.
11. 11. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 8 до 10, характеризиращ се с това, че туморният, съотв. туморните антиген(и),са меланомни антигени.
12. 12. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 8 до 11, характеризиращ се с това, че съдържа и цитокин.
13. 13. Фармацевтичен състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че цитокинът е избран от групата IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω, TNF-a, GM-CSF, или смеси от тях.
14. 14. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 2 до 11, характеризиращ се с това, че съдържа няколко пептида, които се различават по това, че се свързват с различни МНС-подтипове на индивида, който ще се лекува.
15. 15. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 2 до 14, характеризиращ се с това, че съдържа един или няколко пептида, които произлизат от един природно срещан имуногенен протеин или туморен антиген, съотв. клетъчен продукт на разграждане на същите.
16. 16. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 2 до 14, характеризиращ се с това, че съдържа един или няколко пептида, които са различни от пептидите, които са произлезли от природно срещани имуногенни протеин(и) или туморен антиген(и), съотв. клетъчнни разградни продукт(и) на същите.
17. 17. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът е антагонист на пептид, получен от протеин, който причинява автоимунно заболяване.
18. 18. Фармацевтичен състав съгласно някоя от предходните претенции, характеризиращ се с това, че адювантът е органичен поликатион или смес от органични поликатиони.
19. 19. Фармацевтичен състав съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че пептидът е отрицателно зареден.
20. 20. Фармацевтичен състав съгласно претенция 18 или 19, характеризиращ се с това, че адювантът е основна полиаминокиселина или смес от основни полиаминокиселини.
21. 21. Фармацевтичен състав съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че адювантът е полиаргинин.
22. 22. Фармацевтичен състав съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че адювантът е полилизин.
23. 23. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 18 до 21 .характеризиращ се с това, че адювантът е конюгиран с клетъчна лиганда.
24. 24. Фармацевтичен състав съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че лигандата е въглехидрат.
25. 25. Фармацевтичен състав съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че лигандата е фукоза.
26. 26. Фармацевтичен състав съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че лигандата е трансферин.
27. 27. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 18 до 26, характеризиращ се с това, че освен това съдържа ДНК, която не съдържа последователности, кодиращи за функционални протеини.
28. 28. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 18 до 26, характеризиращ се с това, че освен това съдържа ДНК, която кодира за имуномодулиращ протеин.
29. 29. Фармацевтичен състав съгласно претенция 28, характеризиращ се с това, че имуномодулиращият протеин е цитокин от групата IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω, TNF-a, GM-CSF.
30. 30. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 1 до 29, за парентерално приложение.
31. 31. Фармацевтичен състав съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че представлява разтвор или суспензия на пептида и адюванта във фармацевтично приемлив носител.
32. 32. Фармацевтичен състав съгласно някоя от претенциите 1 до 29, за топично приложение.
33. 33. Фармацевтичен състав съгласно претенция 32, под формата на хидрогел.