AT505008B1 - Verfahren zum kultivieren von sehnenzellen aus nicht embryonalen pluripotenten zellen mesenchymaler herkunft - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Kultivieren von Sehnenzellen aus nicht embryonalen pluripotenten Zellen mesenchymaler Herkunft, wobei die isolierten Zellen in einem Kulturmedium unter Standardkulturbedingungen in einem Kulturgefäß kultiviert werden.

Sehnenzellen sind für die Synthese und den Erhalt des Bindegewebes zwischen Knochen und Muskeln zuständig. Die Zellen sind von einem ausgedehnten, dreidimensionalen Netzwerk aus Matrixkomponenten umschlossen, das vorwiegend aus fibrillären Kollagenen des Typs I (95 % des Sehnenmaterials), des Typs III und V, aus Proteoglykanen, aus Elastin und aus Fibronektin besteht. Diese sehnenspezifischen Komponenten der extrazellulären Matrix geben den Sehnen ihre erstaunliche Festigkeit und Formstabilität. Die Differenzierung der Sehnenzellen ist unklar. Man geht davon aus, dass sie von pluripotenten Zellen mesenchymaler Herkunft abstammen. Diese mesenchymalen Stammzellen sind Abkömmlinge von Neuralleistenzellen oder von mesodermalen Somitenzellen und sind Ausgangszeilen für unterschiedliche Zellarten, wie Adipo-zyten, Muskelzellen, Osteoblasten, Chondrozyten und eben Sehnenzellen. Die Differenzierung in die einzelnen Zellklassen wird von verschiedenen Wachstumsfaktoren gesteuert.

Unter normalen physiologischen Bedingungen sind Sehnen schlecht vaskularisiert und enthalten mitotisch wenig aktive Sehnenzellen. Das wird als Hauptgrund für die langwierige Heilung von verletzten Sehnen angesehen. Zudem ist in verletzten Sehnen die Qualität der Matrixkomponenten schlecht. Deshalb wurde versucht, den Heilungsprozess durch die Transplantation von Sehnenzellen in einer entsprechenden Matrix zu beschleunigen. Allerdings wurden die Erwartungen nicht erfüllt.

Ein anderer Weg um funktionelle Sehnentransplantate herzustellen, ist die Kultur von Vorläuferzellen als Ausgangspunkt. Diese Vorläuferzellen werden von mesenchymalen Stammzellen gewonnen und in vitro unter Einsatz bestimmter Wachstumsfaktoren differenziert (DE 10 2005 022 032 A1, EP 0 952 792 B1). Damit die Zellen erfolgreich transplantiert werden können, sollten sie jedoch in einem aktivierten Zustand sein, d.h. vermehrt Kollagen, vor allem Kollagen des Typs I, produzieren, das für die Sehnenfunktion von besonderer Bedeutung ist. Der Einsatz von Ascorbinsäure und Ascorbinsäure-2-Phosphat ist in diesem Zusammenhang bekannt (DE 102005022023 A1, WO 1996/040866 A1). Außerdem ist ein serumfreies Kulturmittel für blutbildende Stammzellen auf der Basis von Pepton bekannt (WO 96/40866 A1), wobei die Osmolalität der Lösung, die unter anderem auch Ascorbinsäure enthalten kann, mit Hilfe von Natriumchlorid auf einen Wert zwischen 232 und 377 mosmol/kg eingestellt wird. Zur Differenzierung von Stammzellen zur Knochenmarktransplantation wurde vorgeschlagen (US 2006/0205071 A1), ähnlich dem pH-Wert die Osmolalität des Kulturmediums zwischen 290 und 340 mosmol/kg einzustellen. Zur Kultivierung von embryonalen Stammzellen unter Einsatz von Wachstumsfaktoren für Fibroblaste ist es darüber hinaus bekannt (WO 2006/036925 A1), die Osmolalität bestimmter Kulturmedien, die auch Ascorbinsäurephosphat enthalten können, mit Hilfe von Natriumchlorid auf 340 mosmol/kg anzuheben. Schließlich wird berichtet (WO 2006/029198 A1), dass für unterschiedliche Kulturmedien vorteilhafte Proliferationsverhältnisse für undifferenzierte embryonale menschliche Stammzellen bei einem pH-Wert von 7,2, einer Osmolalität von 350 mosmol/kg und einer Atmosphäre mit einem Gehalt an Kohlendioxid von 10 % und an Sauerstoff von 5 % eingehalten werden konnten. Ein solcher Stand der Technik gibt allerdings keinen Hinweis auf eine Aktivierung von Sehnenzellen.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Kultivieren von Sehnenzellen aus pluripotenten Zellen mesenchymaler Herkunft der eingangs geschilderten Art so auszugestalten, dass die Sehnenzellen in vitro in einen für eine Transplantation vorteilhaften Zustand überführt werden können.

Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe dadurch, dass die Zellen vor ihrer vollständigen Konfluenz einerseits in einem mit Ascorbinsäure und/oder Ascorbinsäure-2-Phosphat in einer Konzentration von 25 bis 75 pg/ml versetzten Kulturmedium weiterkultiviert und anderseits einer hyperosmolaren Behandlung in einem Kulturmedium ausgesetzt werden, dessen Osmolarität 3 AT 505 008 B1 auf 350 bis 500 mosmol/l eingestellt wird.

Durch den an sich bekannten Einsatz von Ascorbinsäure bzw. von Ascorbinsäure-2-Phosphat kann zwar die Kollagenproduktion der Zellkultur angeregt werden, doch ist die damit verbundene Aktivierung für eine erfolgversprechende Transplantation nicht ausreichend. Sehnenzellen werden vor allem durch eine mechanische Belastung aktiviert, die in einer Zellkultur nur schwierig umzusetzen ist. Diese Belastung entspricht biophysikalisch einer Veränderung der lonen-druckverhältnisse in der Zelle, also der Osmolarität, sodass mit Hilfe einer hyperosmolaren Behandlung die beim natürlichen Heilungsvorgang auftretenden Zugbelastungen simuliert werden können. Wird nämlich die Osmolarität des Kulturmediums mit osmotisch wirksamen chemisch und biologisch inerten Molekülen, wie Saccharose, Mannitol u. dgl., erhöht, so kommt es aufgrund eines Wasseraustritts aus der Zelle zu einer der Druckbelastung vergleichbaren Zellenschrumpfung, was neben einem geringfügigen Anstieg der Kollagensekretion eine deutliche Steigerung der Vernetzung der extrazellulären Matrix und damit eine erhebliche Verbesserung der mechanischen Eigenschaften eines Sehnentransplantats mit sich bringt. Da der Einfluss ionischer Substanzen auf die osmotischen Verhältnisse innerhalb einer Zelle von ihrer Dissoziierbarkeit im Lösungsmittel abhängt, kann durch eine Einstellung der Osmolalität zum Unterschied zur Einstellung der Osmolarität, bei der alle anionischen Teile gleichermaßen osmotisch wirksam werden, keine kontrollierte Simulation einer mechanischen Zellbelastung herbeigeführt werden.

Obwohl die hyperosmolare Behandlung der Zellen auch nach ihrer Anregung zur vermehrten Kollagenproduktion durch Ascorbinsäure bzw. Ascorbinsäure-2-Phosphat durchgeführt werden kann, wenn der zeitliche Abstand dieser Behandlungen ausreichend kurz gewählt wird, ergeben sich besonders günstige Verfahrensbedingungen bei einer Behandlung der Zellen mit Ascorbinsäure bzw. Ascorbinsäure-2-Phosphat in einem hyperosmolar eingestellten Kulturmedium. Eine bevorzugte Osmolarität beträgt 350 bis 400 mosmol/l. Zur Einstellung der Osmolarität können übliche chemisch und biologisch inerte, osmotische Stoffe eingesetzt werden. Die Kultivierung der Zellen unter den geforderten hyperosmolaren Bedingungen erfolgt üblicherweise im Allgemeinen während eines Zeitraumes von 12 bis 120 h, vorzugsweise von 48 bis 72 h.

Um für eine gute Proliferationsrate zu sorgen, können die Zellen in Primärkultur unter Standardkulturbedingungen kultiviert und vor ihrer Konfluenz passagiert werden, wobei dann vorzugsweise die erste Passage unter Standardkulturbedingungen bis zur logarithmischen Wachstumsphase weiterkultiviert wird, bevor die Behandlung der Zellen mit Ascorbinsäure bzw. As-corbinsäure-2-Phosphat unter hyperosmolaren Bedingungen erfolgt. Unter Standardkulturbedingungen versteht man die Inkubation der Zellen in einem dafür vorgesehenen Brutschrank bei 36 bis 38°C, 5 % Kohlendioxid und einer Luftfeuchtigkeit von 95 bis 100 %. Anstelle der Begasung mit Kohlendioxid kann auch eine Pufferung mit HEPES gewählt werden. Die Anregung der Zellen einer sehr niedrigen Passagenzahl, vorzugsweise der ersten Passage, zur verstärkten Kollagenproduktion unter hyperosmolaren Bedingungen hilft außerdem, einer Dedifferenzierung der Zellen vorzubeugen. In diesem Zusammenhang ist festzuhalten, dass die Differenzierung der pluripotenten mesenchymalen Zellen unter Standardkulturbedingungen mit Hilfe der Ascorbinsäure bzw. des Ascorbinsäure-2-Phosphates ohne Einsatz von transformierenden Wachstumsfaktoren vorgenommen werden kann, was das Kultivieren gentechnisch nicht manipulierter Sehnenzellen als vorteilhafte Voraussetzung für autologe Transplantate erlaubt, obwohl der Einsatz entsprechender Wachstumsfaktoren bei der Kultivierung mesenchymaler Vorläuferzellen für besondere Einsatzfälle keineswegs ausgeschlossen ist.

Ausführungsbeispiel:

Zur Isolierung pluripotenter Zellen mesenchymaler Herkunft werden kleine Stücke der Substan-tia spongiosa, die aus der menschlichen Beckenschaufel biopsiert werden, bei 37°C in 2 ml DMEM (Dulbecco's modified eagles medium mit 4,5 g/l Glucose) mit 2,5 mg/ml Kollagenase für 3 h verdaut. Das aus den verdauten Stücken durch ein mehrmaliges Zentrifugieren erhaltene

Claims (4)

1. 4 AT 505 008 B1 Zellpellet wird in einer Dichte von 200000 Zellen/cm2 ausgesät und für 24 h Stunden in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) inkubiert, und zwar bei 37°C, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit. Eine Präparation ergibt eine Wachstumsfläche von 60 bis 180 cm2. Das Kulturmedium wird zwei Mal pro Woche gewechselt. Bevor die Zellen nach sechs Tagen konfluent sind, werden sie in herkömmlicher Weise passagiert. Die erste Passage wird unter den geschilderten Standardbedingungen bis zum Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase nach drei Tagen weiterkultiviert. Danach wird das Kulturmedium gegen ein Medium ausgetauscht, das mit Hilfe von Saccharose auf eine Osmolarität von 360 mosmol/l eingestellt wurde und neben mit 10 % FCS versetztem DMEM 50 pg/ml Ascorbinsäure-2-Phosphat enthält. Die Zellen werden vier Tage in diesem Kulturmedium inkubiert. Die Behandlung mit Ascorbinsäure-2-Phosphat unter hyperosmolaren Bedingungen führt zu einer Veränderung des zellulären Phänotyps: Die Zellen werden fibroblastisch, wie es für Sehnenzellen zu erwarten ist. Außerdem steigt die Sekretion von Kollagen des Typs I und dessen Vernetzung. Nach der Anregung der Zellen zur gesteigerten Kollagensekretion unter hyperosmolaren Bedingungen werden sie in einem Standardkulturmedium für weitere 12 h kultiviert, um sie danach zu untersuchen. In der Zeichnung sind die Untersuchungsergebnisse veranschaulicht. Es zeigen Fig. 1 die Zellkultur vor ihrer Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat in einer schematischen Darstellung, Fig. 2 die Zellkultur nach ihrer Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat in einer der Fig. 1 entsprechenden Darstellung und Fig. 3 eine Western Blot Analyse einer Zellkultur vor ihrer Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat, nach ihrer Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat und nach einer Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat unter hyperosmolaren Bedingungen. Wie sich aus der Fig. 1 ergibt, zeigen die Zellen vor ihrer Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat eine polygonale Struktur. Durch die Behandlung mit Ascorbin-2-Phosphat werden die in der Fig. 2 angedeuteten fibroblastischen Strukturen erreicht, wie sie für Sehnenzellen erforderlich sind, ohne dass hierfür transformierende Wachstumsfaktoren eingesetzt werden müssen, so-dass die Zellen keiner gentechnischen Behandlung unterworfen werden. Die Fig. 3 zeigt schematisch das Ergebnis einer Western Blot Analyse für die Kollagenprodukti-on, wobei die Probe a eine Zellkultur ohne Behandlung mit Ascorbinsäure-2-Phosphat, die Probe b eine Zellkultur mit einer Behandlung durch Ascorbinsäure-2-Phosphat und die Probe c eine Zellkultur mit einer Behandlung durch Ascorbinsäure-2-Phosphat unter hyperosmolaren Bedingungen betrifft. Es zeigt sich bei den Proben b und c ein deutlicher Anstieg der Sekretion von Kollagen des Typs I, was durch die Doppelbande im Bereich der Molekularmasse von 130 kD ersichtlich wird. Im Vergleich mit der Probe b zeigt die unter hyperosmolaren Bedingungen behandelte Probe c im Bereich von 400 kD die verstärkte Vernetzung des Kollagens durch die erhöhte Osmolarität des Kulturmediums an. Die Probe c wird durch dies Vernetzung gegen den Verdau mit Pepsin resistenter. Patentansprüche: 1. Verfahren zum Kultivieren von Sehnenzellen aus nicht embryonalen pluripotenten Zellen mesenchymaler Herkunft, wobei die isolierten Zellen in einem Kulturmedium unter Standardkulturbedingungen in einem Kulturgefäß kultiviert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor ihrer vollständigen Konfluenz einerseits in einem mit Ascorbinsäure und/oder Ascorbinsäure-2-Phosphat in einer Konzentration von 25 bis 75 pg/ml versetzten Kulturmedium weiterkultiviert und anderseits einer hyperosmolaren Behandlung in einem Kulturmedium ausgesetzt werden, dessen Osmolarität auf 350 bis 500 mosmol/l eingestellt wird. 5 AT 505 008 B1
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hyperosmolare Behandlung der Zellen und ihre Behandlung mit Ascorbinsäure bzw. Ascorbinsäure-2-Phosphat gleichzeitig erfolgt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die hyperosmolare Behandlung der Zellen in einem Kulturmedium erfolgt, dessen Osmolarität auf 350 bis 400 mosmol/l eingestellt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in Primärkultur unter Standardkulturbedingungen kultiviert und vor ihrer Konfluenz passagiert werden, dass dann vorzugsweise die erste Passage unter Standardkulturbedingungen bis zur logarithmischen Wachstumsphase weiterkultiviert wird, bevor die Behandlung der Zellen mit Ascorbinsäure bzw. Ascorbinsäure-2-Phosphat unter hyperosmolaren Bedingungen erfolgt. Hiezu 1 Blatt Zeichnungen