DE102005017000B4

DE102005017000B4 - Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs

Info

Publication number: DE102005017000B4
Application number: DE200510017000
Authority: DE
Inventors: Gouya Dr. med. Ram-Liebig; Manfred Prof. Dr. med. Wirth; Ursula Prof. Dr. med. Ravens
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Urotiss GmbH
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2005-04-13
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2025-04-14
Also published as: EP1868659A1; WO2006108408A1; US7851217B2; US20060233767A1; DE102005017000A1; US20110081721A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, umfassend die Schritte
(a) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von organspezifischen Gewebezellen;
(b) Aufbringen der organ-spezifischen Muskelgewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran, wobei die Muskelgewebezellen Glattmuskelzellen und fibroblastische Zellen sind; und
(c) Kultivieren der organ-spezifischen Muskelgewebezellen auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung der organ-spezifischen Muskelgewebezellen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, ein derartiges Gewebetransplantatkonstrukt sowie eine Verwendung eines derartigen Gewebetransplantatkonstruktes. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Gewebetransplantatkonstrukt zur Rekonstruktion der Harnblase.
Die Harnblase besteht aus der Mukosaschicht und der Muskulatur. Mukosazellen sind Urothelzellen, die mehrschichtig die Innenseite der Harnblase bedecken und sie gegen Urin schützen. Die Muskulatur, die als Detrusor bezeichnet wird, besteht aus glatten Muskelzellen und dazwischen befindlichen interstitiellen Zellen, bei denen es sich um Fibroblasten oder fibroblastischen Zellen handelt. Die Muskelzellen sind für die Kontraktion, d. h. die Harnblasenentleerung verantwortlich. Die interstitiellen Zellen sind für die Weiterleitung der elektrischen Impulse, die aus Muskelzellen stammen, und damit für die Funktion der Muskelzellen als Einheit verantwortlich.
Die Rekonstruktion der Harnblase kann aufgrund angeborener oder erworbener Erkrankungen wie beispielsweise Meningomyelozele, Blasen- und Kloakaldystrophy, Traumata, Malignome, neuropathische Dysfunktionen, Detrusorinstabilität notwendig sein. Die Rekonstruktion der Harnblase erfolgt klinisch unter Anwendung von Darmabschnitten. Dies ist mit multiplen Komplikationen wie zum Beispiel Infektion, Inkontinenz, maligner Entartung, Diarrhöe, Elektrolytstörung, Malabsorption und erhöhter Morbidität verbunden. Es ist vorgeschlagen worden, die Rekonstruktion, d. h. den Ersatz beschädigter oder erkrankter Bereiche einer Harnblase, mittels Gewebetransplantatkonstrukten, die als eine Matrix für das nachwachsende ursprüngliche Gewebe dienen sollen, durchzuführen. In diesem Zusammenhang ist die Kultivierung von patienteneigenen Harnblasenzellen auf der Membran und somit die In-vitro-Erzeugung von lebensfähigem Blasengewebe mehrfach vorgeschlagen worden [1, 2, 3]. Diese weist aber eine Vielzahl von Problemen auf.
Ferner sind Gewebetransplantatkonstrukte zur Rekonstruktion einer humanen Harnblase bekannt, die eine biologische, kollagenhaltige Membran umfassen, auf die eine oder mehrere Schichten Organ-spezifischer Urothelzellen aufgebracht sind. Die äußere Schicht der Urothelzellen ist eine Schicht terminal differenzierter Gewebezellen [4].
Zur Rekonstruktion einer Harnblase auch im Hinblick auf deren physiologische Funktion sind jedoch nicht nur Urothelzellen als Sperrschicht gegen Urin erforderlich, sondern auch Glattmuskelzellen um deren Kontraktion zu ermöglichen. Es ist jedoch bisher nicht gelungen, Harnblasengewebe mit besäten Membranen zu rekonstruieren, deren Kontraktivität der des nativen Gewebes entspricht, da eine vollständige Generierung der Muskelzellen nach der Implantation nicht erreicht wurde. Ein Grund dafür ist vermutlich, daß adulte Glattmuskelzellen in vitro ihren differenzierteren Phänotyp verlieren [5, 6]. Es ist außerdem unbekannt, ob Glattmuskelzellen überhaupt vollständig nach der Implantation rediffe renzieren können [6]. Anderseits kann die interzelluläre Kommunikation zwischen Glattmuskelzellen durch den Fibroblastenmangel in dem Gewebetransplantatkonstrukt beeinträchtigt werden, was zu einer Entleerungsdysfunktion nach der Konstruktimplantation führen kann [7, 8].
Die Anwendung biochemischer und mechanischer Stimuli zur Steuerung der Funktion von Glattmuskelgewebezellen (SMC) auf Biomaterialen ist. bekannt [Ram-Liebig et al., Engineering of Bladder Muscle Tissue: New Approaches in the Modulation of Viable Constructs, European Urologogy Supplements 4 (2005), 3, 243]. Demnach soll die mechanische Stimulierung mittels einer Streckvorrichtung durchgeführt werden. Eine mechanische und biochemische Stimulation von Glattmuskelzellen und Fibroblasten gemeinsam auf einer Membran wird nichtoffenbart.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes angegeben werden, daß hinsichtlich seiner physiologischen kontraktilen Funktionalität stärker als bisher gesundem natürlichen Gewebe gleicht.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 18 wird 21 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 17, 19 und 20.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs vorgesehen, umfassend die Schritte

(a) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von organ-spezifischen Muskelgewebezellen;
(b) Aufbringen der organ-spezifischen Muskelgewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran, wobei die Muskelgewebezellen Glattmuskelzellen und fibroblastische Zellen sind; und
(c) Kultivieren der organ-spezifischen Muskelgewebezellen auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung der organ-spezifischen Muskelgewebezellen.

Erfindungsgemäß werden die organ-spezifischen Gewebezellen vor dem Aufbringen auf die Membran isoliert und zweidimensional kultiviert. Nach der Vermehrung der zweidimensional kultivierten Gewebezellen werden die so erhaltenen Gewebezellen auf die Membran aufgebracht und dort unter biochemischer Stimulierung und unter mechanischer Stimulierung weiter kultiviert. Die biochemische Stimulierung und die mechanische Stimulierung werden vorzugsweise gleichzeitig durchgeführt. Die mechanische Stimulierung kann dabei kontinuierlich oder in Intervallen erfolgen.
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, daß die mechanische Stimulierung der auf der Membran kultivierten Gewebezellen zu Transplantatkonstrukten führt, deren Membran dicht von Gewebezellen durchsetzt ist, wobei die Gewebezellen ihren natürlichen Phänotyp aufweisen. Die Gewebezellen sind Muskelgewebezellen.
Der Begriff "organ-spezifische Gewebezellen" soll hierbei so verstanden werden, daß Gewebezellen desselben oder eines gleichen Organs, das rekonstruiert werden soll, auf die Membran aufgebracht werden. Soll beispielsweise eine Harnblase rekonstruiert werden, so sind hier unter organ-spezifischen Gewebezellen Urothelzellen und/oder Muskelgewebezellen zu verstehen.
Organe sind funktionelle Einheiten des Körpers. Bevorzugtes Beispiel ist die Harnblase.
Die Begriffe "Membran" und "Matrix" werden hier, soweit nicht anders angegeben, synonym verwendet. Die Membran sollte die Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM), insbesondere deren Wachstumsfaktoren, enthalten. Vorzugsweise ist die Membran eine biologische Membran, besonders bevorzugt eine biologische Membran, die im Körper zu nicht-toxischen Stoffen abgebaut und durch eine körpereigene Gewebestruktur ersetzt wird.
Unter einer kollagenhaltigen Membran soll hier eine Membran hauptsächlich auf Kollagenbasis verstanden werden.
Unter Rekonstruktion wird der Ersatz von beschädigten oder kranken Bereichen eines menschlichen oder tierischen Organs, insbesondere einer Harnblase verstanden.
Die Gewebezellen sind Muskelgewebezellen, stärker bevorzugt Muskelgewebezellen der Harnblase. Die Muskelgewebezellen sind besonders bevorzugt Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen, d.h. Fibroblasten, der Muskelschicht der Harnblase in deren natürlichem Verhältnis. Muskelgewebezellen der Harnblase werden im folgenden auch als Detrusorgewebezellen oder Detrusorzellen bezeichnet.
Unter biochemischer Stimulation werden hier die urotheliale Induktion und die Seruminduktion verstanden. Ein bevorzugtes Beispiel der biochemischen Stimulation ist die mitogene Stimulation des Urotheliums und des Serums.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Muskelgewebezellen, nachdem sie auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultiviert. Vorzugsweise sind die Muskelgewebezellen, die auf die Membran aufgebracht werden, zweidimensional kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 2 bis 7, stärker bevorzugt 3 bis 6, am stärksten bevorzugt der Passage 3.
Das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) sollte unter urothelialer Induktion und adaptierter Serumkonzentration erfolgen. Die urotheliale Induktion kann durch Verwendung eines Mediums erfolgen, das mittels Urothel konditioniert wurde. Dabei kann das Medium ein mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium oder ein mit terminal differenziertem Urothel konditioniertes Medium sein.
Unter "proliferierendem Urothel" oder "proliferativem Urothel" werden Urothelzellen verstanden, die auf einer azellulären Membran in einem Kulturmedium mit einem konstanten FKS-Zusatz (beispielsweise 5 %) proliferiert wurden. Die Urothelzellen wurden dann in DMEM inkubiert und das Medium geerntet. Dieses Medium wird als mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium bezeichnet. Dieses Medium kann anschließend mit FKS supplementiert werden.
Unter "terminal differenziertem Urothel" werden Urothelzellen verstanden, die auf einer azellulären Membran in einem Kulturmedium mit einem abnehmenden FKS-Zusatz (beispielsweise von 5 % auf 1 %) unter fibroblastischer Induktion proliferiert wurden. Die Urothelzellen wurden dann in DMEM inkubiert und das Medium geerntet. Dieses Medium wird als mit terminal differenziertem Urothel konditioniertes Medium bezeichnet. Dieses Medium kann anschließend mit FKS supplementiert werden.
Das Urothel kann aus der Mukosaschicht der Harnblase stammen, vorzugsweise der Harnblase, aus deren Muskelschicht die Muskelgewebezellen entnommen wurden. Fibroblasten, die zur Induktion der terminal differenzierten Urothelzellen verwendet werden, können aus der Submukosaschicht derselben Harnblase gewonnen werden.
Das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) sollte in einem mittels Urothel konditionierten Medium erfolgen, das ferner fötales Rinderserum (FKS) oder autologes Serum enthält. Vorzugsweise enthält das Medium 5 % FKS oder autologes Serum. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration an FKS oder autologem Serum während der Kultivierung der Muskelgewebezellen auf der Membran schrittweise auf 0 % verringert.
Unter zweidimensionaler Kultivierung wird die Kultivierung in einer Ebene, beispielsweise auf dem Boden eines Kulturgefäßes verstanden. Unter dreidimensionaler Kultivierung wird die Kultivierung in einem dreidimensionalen Raum verstanden, beispielsweise derart, daß die Gewebezellen die Membranoberfläche bedecken und die Membran darüber hinaus durchsetzen.
Das mechanische Stimulieren in Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durchgeführt werden, indem die Membran, auf die die Gewebezellen aufgebracht sind, gestreckt wird. Die Membran kann statisch und/oder zyklisch gestreckt werden. Demnach kann das mechanische Stimulieren

(c1) das Strecken der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum;
(c2) die Relaxation der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum; und
(c3) das n-fache Wiederholen der Schritte (c1) und (c2), wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist, umfassen.

Wird die mechanische Stimulation ausgeführt, indem die Membran gestreckt wird, so wird die Membran vorzugsweise entlang ihrer Längsachse gestreckt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Muskelgewebezellen und das Urothel von einer Harnblase, besonders bevorzugt von derselben Harnblase.
Die Erfindung ist insbesondere zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion der Harnblase geeignet. Ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion der Harnblase umfaßt

(a*) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von Muskelgewebezellen der Harnblase
(b*) Aufbringen der Muskelewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
(c*) Kultivieren der Muskelgewebezellen auf der Membran unter urothelialer Induktion und adaptierter Serumkonzentration sowie unter mechanischer Stimulierung der Muskelgewebezellen.

Die Muskelgewebezellen umfassen Glattmuskelzellen und interstitielle Zellen vorzugsweise in deren natürlichen Verhältnis.
Vorzugsweise werden die Muskelgewebezellen der Harnblase, nachdem sie auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultiviert. Besonders bevorzugt sind die Muskelgewebezellen der Harnblase, die auf die Membran aufgebracht werden, zweidimensional kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 2 bis 7, stärker bevorzugt 3 bis 6, am stärksten bevorzugt der Passage 3. Dabei ist zu berücksichtigen, daß sich mit zunehmender zweidimensionaler Passagierungszahl der Zellen deren Vermehrungspotential verringert.
Das Kultivieren der Muskelgewebezellen der Harnblase in Schritt (c*) sollte in einem Medium durchgeführt werden, daß ein mit Urothel konditioniertes Medium, vorzugsweise ein mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium ist. Vorzugsweise wird die Konzentration an Serum (FKS oder autologes Serum) während des Kultivierens schrittweise verringert, beispielsweise in drei Schritten, zum Beispiel von 5 % auf 1 % auf 0 %.
Die Muskelgewebezellen, die zur Herstellung eines Transplantatkonstruktes zur Rekonstruktion der Harnblase eingesetzt werden, sind Glattmuskelzellen und Fibroblasten, vorzugsweise in deren natürlichen Verhältnis, wie es in der Muskelschicht einer natürlichen gesunden Harnblase gefunden wird. Aus der Muskelschicht einer Harnblase können die Glattmuskelzellen und Fibroblasten gewonnen werden, indem die Muskelschicht von Urothel, Lamina propria und Serosa befreit wird. Die so behandelte Muskelschicht wird dann zerkleinert und mit Kollagenase behandelt. Die einzelnen Zellen können dann durch Zentrifugieren gewonnen, zweidimensional kultiviert und bei Konfluenz passagiert werden.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können erstmals Gewebetransplantatkonstrukte erhalten werden, die biokompatible Membranen aufweisen, die von Gewebezellen mit nativen Phänotyp durchsetzt sind. Aufgrund des hohen Durchsetzungsgrades weisen die Membranen ein dreidimensionales Netzwerk von Gewebezellen auf, d h. im Fall von Muskelgewebezellen der Harnblase ein dreidimensionales Netzwerk von Glattmuskelzellen und Fibroblasten. Die Anwesenheit der Fibroblasten fördert die interzelluläre Kommunikation der Glattmuskelzellen und ist daher von Bedeutung für die physiologische Funktionalität, insbesondere die Kontraktivität, des Transplantatkonstruktes nach dessen Implantierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Isolierung von Muskelgewebezellen aus einer Harnblasenbiopsie; die zweidimensionale Proliferation der Muskelgewebezellen in der Kulturflasche; das Aufbringen der proliferierten Muskelgewebezellen der Passage 3 (P3-Zellen) auf die Oberfläche einer biokompatiblen Membran; und das Kultivieren der P3-Zellen unter

(i) urothelialer Induktion unter Verwendung eines mit proliferierendem Urothel konditionierten Mediums und
(ii) Seruminduktion und
(iii) mechanischer Stimulierung.

Wird die urothelialer Induktion 32 Tage durchgeführt, so umfaßt die Seruminduktion die Verringerung der Serumkonzentration von 5 % (Tage 1 bis 14) auf 1 % (Tage 15 bis 28) und dann weiter auf 0 % (Tage 29 bis 32). Die mechanische Stimulierung wird über den gesamten Zeitraum der urothelialen Induktion (32 Tage) aufrechterhalten, wobei die Membran vorzugsweise zyklisch gedankt und relaxiert wird.
Die Membranoberfläche ist vorzugsweise bis zu 40 cm² groß.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ferner ein Gewebetransplantatkonstrukt zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs vorgesehen, das

(a) eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und
(b) organ-spezifische Muskelgewebezellen, die auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung kultiviert worden sind, umfaßt, wobei die Muskelgewebezellen Glattmuskelzellen und fibroblastische Zellen sind.

Das erfindungsgemäße Gewebetransplantatkonstrukt ist somit ein kontraktionsfähiges Gewebetransplantatkonstrukt.
Ein solches Gewebetransplantatkonstrukt kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden. Vorzugsweise sind die organ-spezfischen Gewebezellen Muskelgewebezellen einer Harnblase. Die Muskelgewebezellen der Harnblase sind Glattmuskelzellen und Fibroblasten, vorzugsweise in deren natürlichem Verhältnis.
Die erfindungsgemäßen Gewebetransplantatkonstrukte können zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, vorzugsweise zur Rekonstruktion einer menschlichen oder tierischen Harnblase verwendet werden.
Die vorteilhaften Ergebnisse basieren auf folgenden Erkenntnissen: Nach dem Aufbringen der Gewebezellen auf die Membran war der dynamische Prozeß der Zellmigration zu der Membran die Antwort auf die Migrationssignale, die durch die Matrix der Membran bereitgestellt werden. Offensichtlich gibt es rezeptive Proteine auf der Zelloberfläche, die diese Migrationssignale in das Innere der Zelle kommunizieren.
Unter den mitogenen Wirkungen von FKS waren Zellen der Passage 3 (sogenannte P3-Zellen) fähig, Membranoberflächen von bis zu 40 cm² innerhalb weniger Tage konfluent zu bedecken, während die Bedeckung der Membran durch P7-Zellen aus ähnlicher Biopsiegröße, d. h. Zellen nach siebenmaligem Passagieren in der Kulturflasche unter konventionellen Bedingungen) nicht vollständig war. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß in zweidimensionalen Kulturen unter konventionellen Bedingungen in der Kulturflasche die Zellen zunehmend ihre proliferative Fähigkeit mit erhöhender Anzahl an Passagen verlieren.
Eine Hauptfunktion von SMC ist die Kontraktion. Durch die Dedifferenzierung verlieren unter konventionellen Bedingungen zweidimensional kultivierte Harnblasen-SMCs ihre Kontraktilitätsantwort auf verschiedene In-vivo-Agonisten [5]. Andererseits ist die potentielle Fähigkeit der in vitro dedifferenzierten Zellen zu redifferenzieren nicht bekannt [6]. Bedenkt man, daß das zelluläre Tissue-Engineering mit Harnblasen-SMCs für klinische Anwendungen bestimmt ist, so sollten die Gewebezellen ihren entsprechenden Phänotyp für die Funktion des Transplantats, wenn es in den Wirt implantiert wird, aufweisen. Aus diesem Grund wurden schon bei Passage 3 die Gewebezellen auf dreidimensionale Biomaterialien gesät, um es ih nen zu ermöglichen, mindestens teilweise ihren differenzierten Phänotypen aufrechtzuerhalten, indem sie früh genug sich in drei Dimensionen durch Interaktion mit der tragenden extrazellulären Matrix proliferieren. Folglich beeinflußte die physiologische Umgebung das Zellverhalten [9, 10, 11]. Wenn tatsächlich Gewebezellen zweidimensional unter konventionellen Bedingungen für sieben Passagen kultiviert wurden, bevor sie auf die Membran aufgebracht wurden, färbten sich nur weniger als 5 % der Gewebezellen mit SMA-Antikörpern positiv, während etwa 20 % der P3-Zellen SMA exprimierten, wenn sie unter denselben Bedingungen kultiviert wurde.
Bei der Harnblasenregeneration ist bekannt, daß Epithel-Stroma-Interaktionen die SMC-Proliferation und -Differenzierung regulieren [12, 13]. Um herauszufinden, wie Detrusorzellen auf Epithelreize auf azellulären Membranen reagieren, wurden Gewebezellen charakterisiert, die mit Medien kultiviert wurden, welche durch Urothel (d. h. Epithelzellen der Harnblase) konditioniert worden waren. Für diesen Zweck wurde proliferatives einerseits und terminal differenziertes Urothel anderseits verwendet. Tatsächlich hatte proliferatives Urothel eine stärkere proliferative Wirkung auf die Zellkulturen, während nur eine geringere Wirkung durch terminal differenziertes Urothel erreicht wurde. Jedenfalls erhöhte das Urothel-konditionierte Medium mit proliferativen Urothelzellen und schrittweise verringerter Konzentration und später der Abwesenheit von Serum [14] die SMA-Proteinexpression, auch wenn dies die SMA-Proteinexpression nicht vollständig induzieren konnte (60 %).
Es ist bekannt, daß mechanische Spannung die SMC in unterschiedlichen Weisen, d. h. Proliferation, Differenzierung, Bildung von extrazellulärer Matrix und Wachstumsfaktoren, induzieren [15–19]. Interessanterweise sind einige dieser Wirkungen charakteristisch für einen stärker differenzierten Phänotyp, während andere auf einen synthetischeren proliferierenden, d. h. weniger differenzierten Zustand hinweisen. Mit der vorliegenden Erfindung wurde durch mechanische Stimulierung ein stärker bewachsenes Gewebe mit erhöhter Expression von SMA erreicht. Außerdem zeigten die Gewebezellen ein unterschiedliches Beweglichkeitsmuster als unter Bedingungen ohne mechanische Stimulierung. In dem letzteren Fall bewegten sich stärker persistente Zellen meistens in zwei Richtungen über die Membranoberfläche. Unter mechanischer Streckung und Relaxation drangen weniger persistente Zellen in mehreren Richtungen in das Innere der Membran durch Überwindung des Matrixwiderstandes ein, indem deren dreidimensionale Struktur abgebaut wurde. Die Verwendung der mechanischen Stimulierung in Urothel-konditionierten Kulturen ermöglichte es den SMCs, ihren differenzierten Phänotypen zu zeigen, wenn die mitogene Wirkung von FKS verringert und anschließend beseitigt wurde. In diesem Fall waren etwa 80 % der Gewebezellen für SMA positiv. SMA ist ein Marker für den differenzieren Phänotyp von SMC.
Die unlöslichen Signale der dreidimensionalen extrazellulären Matrix, die mit den löslichen Faktoren des Urothel-konditionierten Mediums interagieren, und mechanischen Kräfte in der schrittweise angepaßten Serumkonzentration förderten die Migration, Teilung und Differenzierung von SMC. Die Induktion der SMC-Differenzierung als Antwort auf das Urothel-konditionierte Medium ist charakteristisch für einen endogenen Regulationsmechanismus. Außerdem zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung, daß SMC die mechanische Spannung registriert, die außerdem die Zelldifferenzierung induziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wirkungen der mechanischen Umgebung auf andere Wege als Wachstumsfaktor/Rezeptorbindung hinweisen. Auf Basis dieser Erkenntnisse ist es möglich, wirksame zelluläre Strategien für eine proliferativere oder differenziertere Aktivität von Gewebezellen zu entwickeln, um die Gewebeentwicklung zu verbessern.
Der Detrusor ist dafür bekannt, ein großflächiges Netzwerk an Fibroblasten aufzuweisen. In den nachfolgend beschriebenen Beispielen waren etwa 20 % der isolierten Detrusorzellpopulation Fibroblasten, die für Vimentin positiv, aber für SMA negativ färben, was Ergebnisse [8] bestätigt, die aufgrund von Immunoreaktivitäts- und Ultrastrukturanalysen darauf schließen lassen, daß diese Zellen Fibroblasten sind. Da die c-kit-ähnliche Immunoreaktivität kein zuverlässiger Indikator eines Myofibroblastphänotyps sind und es außerdem keinen konkreten Beweis für die Gegenwart von diesen Zellen in dem Blasendetrusor [8] gibt, wurde deren Expression in den nachfolgend beschriebenen Kulturen nicht bewertet. Die Fibroblasten zeigten dabei nur schwache Immunoreaktivität gegen biochemische und mechanische Reize, die die Differenzierung des SMC induzierten. Da angenommen wird, daß die Ausbreitung von aktivierenden Impulsen in der Blase durch interstitielle Zellen, die Fibroblasten sind, vermittelt wird, kann die Gegenwart von diesen Zellen in unserem Modellsystem die Merkmale der Funktionalität des Transplantats nach der Einpflanzung verbessern.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen
1 Aufnahmen zur Charakterisierung von Blasendetrusorzellen auf einer azellulären Gewebemembran ( 1A: Färbung mit BCECF, 40fache Vergrößerung; 1B: Färbung der zellulären DNA mit DAPI, 100fache Vergrößerung);
2 immunohistochemische Färbungen von Blasendetrusorzellkulturen der Passage 3 auf azelluären Membranen unter Verwendung von Antikörper für alpha-Glattmuskelaktin (2A: Kultivierung ohne urotheliale Induktion und mechanische Stimulation; 2B: Kultivierung unter urothelialer Induktion bei Verringerung der Serumkonzentration; 2C: Kultivierung unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation bei Serumverringerung, Tag 32, Fig. 2D bis 2F: pentrierende SMC in der Membran am Kulturtag 21 unter Beibehalt ihres differenzierten Phänotyps (positive Reaktion mit alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper);
3 Hematatoxylin- und Eosin-Anfärbungen mit unter urothelialer Induktion und ohne mechanische Stimulation kultivierten Blasendetrusorzellen am Tag 18 auf der Membran (3A: Kultivierung der Blasendetrusorzellen unter Induktion mit terminal differenziertem Urothelmedium; 3B: Kultivierung der Blasendetrusorzellen unter Induktion mit proliferierendem Urothel-konditioniertem Medium);
4 Hematatoxylin- und Eosin-Anfärbungen der unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation kultivierten Blasendetrusorzellen am Tag 18 auf der Membran (4A und 4B zeigen die Bewegung der Zellen innerhalb der Membran);
5 Hematatoxylin- und Eosin-Anfärbungen der unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation kultivierten Blasendetrusorzellen auf der Membran (5A: Zellschichten auf der Membran; 5B: Penetration der Zellen innerhalb der Membran in verschiedenen Richtungen; 5C: vollständig durchdrungene Membran am Tag 32); und
6 immunhistochemische SMA-Anfärbungen der Blasendetrusorzellen auf der Membran, die unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation kultiviert wurden. Im Vergleich zu SMC färbten sich die fibroblastischen Zellen nicht mit alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper und zeigen damit nicht die entsprechende braune Farbe.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Harnblasen-Gewebetransplantatkonstrukten.
Soweit nicht gesondert angegeben, haben die verwendeten Abkürzungen folgende Bedeutung:

BCECF: 2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5/6-carboxyfluorescein
DAPI: 4'-6-Diamidino-2-phenylindol
DMEM: Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium,
ECM: extrazelluläre Matrix,
FB: Fibroblast
FKS: fötales Rinderserum
PI: Propidiumiodid
SIS: small intestinal submukosa
SMA: alpha-Glattmuskel-Aktin (alpha smooth muscle actin)
SMC: Glattmuskelzellen

Materialien und Methoden
Herstellung azellulärer Gewebemembranen Azelluläre Gewebemembranen (hierin auch als azelluläre Membranen bezeichnet) wurden aus porzinen Harnblasen-, Aorta-, Dünndarm- und Hautproben hergestellt. Sie wurden in Triton X 1 % (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) 24 bis 48 h in Gegenwart von 0,1 % Natriumazid unter Rühren in ein Wasserbad bei 37 °C azellulär gewonnen. Die Extraktion aller zellulären Elemente wurde histologisch bestätigt. Zusätzlich wurde lyophilisiertes Dünndarmsubmukosa (SIS) von Cook Biotech (Mönchengladbach, Deutschland) bereitgestellt.
Zellisolation, Kultur und Charakterisierung Die Muskelschicht von porzinen (n = 8) und humanen (n = 4) Harnblasenproben (0,5×0,5 cm) wurde von dem Harnwegsepithel, Lamina propria und Serosa Bisseziert, zerkleinert und mit Kollagenase B 0,5 % 2 h behandelt (Worthingto Biochemical, Lakewood, NJ, USA). Einzelne Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, und die Pellets wurden in Kulturflaschen, enthaltend DMEM (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), supplementiert mit 5 % FCS, überführt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert. P3- und P7-Zellen wurden auf den Oberflächen von azellulären Membranen (bis zu 40 cm²) kultiviert. Die kulti vierten Zellen wurden histologisch und immunohistochemisch unter Verwendung der Hematoxylin- und Eosin-Färbung (H & E), SMA- und Vimentin-Antikörper (Dako, Glastrup, Dänemark) analysiert. Der Apoptoseindex wurde mit 4'-6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) bestimmt, die Vitalität der Zellen mit 2',7'-Bis-carboxyethyl-5 und 6-Carboxyfluorescein (BCECF) und Propidiumiodid (PI) (beide MoBiTec, Göttingen, Deutschland).
Urothel-konditionierte Medien. Um Urothel-konditionierte Medien herzustellen, wurden Urothelzellen (erhalten aus der Mukosaschicht von Proben derselben Harnblase auf der Oberfläche von azellulären Membranen kultiviert. Wie in [4], wurden Urothelzellen in zwei unterschiedlichen Gruppen gehalten, entweder in einem proliferativen Phänotyp in Gegenwart von 5 % FKS oder terminal differenziert durch die Verringerung der FKS-Konzentration auf 1 % unter fibroblastischer Induktion (aus der Lamina propria derselben Harnbalsen). Urothelzellen wurden dann in DMEM 24 h inkubiert, und die konditionierten Medien wurden geerntet. Detrusorzellen, die auf Gerüsten kultiviert wurden, wurden jeweils mit Medium, konditioniert mit proliferierenden oder mit terminal differenzierten Urothel, bei den nachstehend erläuterten FKS-Konzentrationen, gespeist.
FCS-konditionierte Medien. FKS wurde zu Urothel-konditionierten Medien, d. h. entweder mit proliferativen oder mit terminal differenzierten Urothel konditionierten Medium, bei einer konstanten Konzentration von 5 % von Tag 1 bis Tag 32 supplementiert. Alternativ wurde FKS in drei Schritten verringert: 5 % von Tag 1 bis 14, 1 % bis Tag 28 und anschließend serumfreier Zustand für 4 Tage. In den Kontrollgruppen wurden die Zellen mit Medien, die dieselben Se rumkonzentrationen enthalten, aber denen die Urothelkonditionierung fehlte, kultiviert. Die Kulturmedien wurden alle drei Tage gewechselt, außer in serumfreien Zuständen, wo sie täglich gewechselt wurden, um die Verfügbarkeit von ausreichenden Nährstoffen für die Zellen zu gewährleisten.
Mechanische Stimulation. Ein spezieller Bioreaktor wurde verwendet, um die Wirkungen der mechanischen Stimulation auf die Membran-Zell-Komposite nachzuweisen. Mit Zellen besähte Membranen wurden einer Streckung um 10 % der Oberfläche unterzogen, was eine passive Dehnung der Zellen erzeugte. Die Vorrichtung bestand aus einem motorgetriebenen System, das die gleichzeitige Ausübung einer mechanischen Streckung bei vier rechteckig geformten Membranen ermöglichte (1). Die Membran-Zell-Komposite, d. h. die Membran, auf die die Gewebezellen aufgebracht worden sind, wurden parallel und in sterilen Kammern plaziert. Die Medien wurden separat durch eine Rollenpumpe in die unterschiedlichen Kammern mit 1 ml/h injiziert und an der gegenüberliegenden Seite in einer sterilen Flasche aufgefangen. Die Kulturen wurden mit 95 % Luft und 5 % CO₂ bei 37 °C versorgt. Die Membranen wurden einheitlich in horizontale Richtung gestreckt und an jeder Seite zwischen zwei Platten befestigt. Die Wirkungen der mechanischen Streckung wurden unter kontinuierlicher Dehnung sowie unter zyklischer Dehnung und Relaxation untersucht (20 s Dehnung und 10 s Relaxation oder 10 s Dehnung und 10 s Relaxation).
Die mechanische Streckung kann mittels eines Bioreaktors durchgeführt werden. Einzelheiten des Bioreaktors werden in DE 101 51 822 beschrieben.
Ergebnisse
Die frisch aus der porzinen oder humanen Harnblase isolierten Detrusorzellen wiesen eine spindelförmige Morphologie auf, wobei etwa 80 % der Zellen positiv mit Antikörpern gegenüber SMA färbten, und etwa 20 % waren Vimentin-positive Zellen, die keine SMA-Expression zeigten. Die Fraktion von SMA-positiven Zellen verringerte sich mit der erhöhenden Anzahl von Passagen unter 2D-Bedingungen und betrug weniger als 60 % bei Passage 7, wobei eine Variabilität zwischen unterschiedlichen Tieren und Patienten festgestellt wurde.
Es konnten keine großen Unterschiede zwischen Zellkulturen auf den Matrizes aus unterschiedlichen Quellen nachgewiesen werden. Fluoreszenzmikroskopische Analysen (1) zeigten, daß die Zellen auf dem Gerüst bis zu 32 Tage hafteten und lebensfähig blieben (> 80 %). DRPI-Färbung von kultivierten Zellen auf den Membranen zeigte Zellkerne mit einer Apoptoserate von weniger als 20 %.
1 zeigt Aufnahmen zur Charakterisierung der Gewebezellen auf der Membran. 1A zeigt in 40facher Vergrößerung einen Assay zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Gewebezellen auf der Membran. Als Farbstoff wurde BCECF (grüne Farbe) verwendet. Der Fluoreszenzfarbstoff BCECF ist spezifisch für lebende Zellen und zeigte eine hohe Zellvitalität der Gewebezellen 32 Tage nach dem Aufbringen der Gewebezellen auf die Membran. 1B zeigt in 100facher Vergrößerung Anfärbungen der zellulären DNA mit DRPI. Erkennbar sind mehrere sich teilende Zellkerne auf der Membran 14 Tage nach dem Aufbringen der Gewebezellen.
Histologische Analysen zeigten, daß P3-Zellen gleichmäßig auf der Oberfläche der Membran fünf Tage nach dem Aufbringen verteilt waren, während P7-Zellen, die aus ähnlich großen Biopsien erhalten wurden, nur teilweises und weniger gleichmäßig verteiltes Wachstum zeigen. Am Tag 32 waren die Zellpopula tionen auf den Membranen beinahe 10mal höher mit P3-Zellen als mit P7-Zellen. Jedoch sank der Prozentsatz von Zellen, die für SMA positiv färben, im wesentlichen auf etwa 20 % in Kulturen mit P3-Zellen und auf 5 % in Kulturen mit P7-Zellen, wenn die Zellen auf der Oberfläche von größeren Membranen (> 10 cm²) kultiviert wurden.
Die Entfernung des Serums führte zwar zur Unterdrückung der Zellproliferation und -migration, induzierte aber nicht die Differenzierung von SMC auf den Membranen wirksam (20 bis 30 % Exprimierung von SMA in P3-Zellen, 5 bis 10 % in P7-Zellen an Tag 32).
Die 2A bis 2F zeigen Aufnahmen immunohistochemischer Analysen von Membran-Zell-Kompositen unter Verwendung von SMA-Antikörpern jeweils in 20facher Vergrößerung. Auf die Membran wurden Gewebezellen der Passage 3 transferiert. 2A zeigt kultivierte Gewebezellen im Ruhezustand, d. h. Gewebezellen, die ohne urotheliale Induktion und ohne mechanische Stimulation kultiviert wurden. Diese Gewebezellen zeigten nach 32 Tagen etwa 20 % positive Färbung mit SMA-Antikörper (braune Farbe). 2B zeigt, daß etwa 60 % der Gewebezellen einen differenzierten (reifen) Phänotyp auf der Membranoberfläche an Tag 32 nach der Serumentfernung aufwiesen, wenn die Gewebezellen unter in mit proliferativem Urothel konditioniertem Medium kultiviert wurden. Die 2C bis 2F zeigen Zellen, die auf der Membranoberfläche unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation kultiviert worden waren. Mehr als 80 % der Zellen zeigen positive Reaktionen mit SMA-antikörper an Tag 32 nach der Serumentfernung (2C). Im Serum-abgereicherten Medium (1 % FCS) waren am Tag 21 unter urothelialer und mechanischer Stimulation Gewebezellen in das Innere der Membran gelangt, wobei die Gewebezellen ihren differenzierten Phänotyp beibehalten haben (2D bis 2F).
Die Zellproliferation und -migration wurde durch ein Medium induziert, das mit proliferierendem Urothel konditioniert worden war. Tatsächlich bildeten bereits am Tag 18 die P3-Zellen, die in diesem Medium kultiviert wurden, 3 bis 5 Schichten auf der Oberfläche der Membran, während Kulturen, die mit Medium gespeist wurden, das mit terminal differenziertem Urothel konditioniert wurden war, nur 1 bis 2 Schichten von Zellen bildeten (3).
Die 3A und 3B zeigen Aufnahmen von H & E-Anfärbung von kultivierten Membran-Zell-Kompositen am Tag 18 nach dem Aufbringen der P3-Gewebezellen auf die Membran in 20facher Vergrößerung. In dem Kultursystem, konditioniert mit terminal differenziertem Urothel ohne mechanische Stimulierung, bildeten die Gewebezellen 1 bis 2 Schichten und drangen dann in die Membran ein (3A). Im Vergleich zu diesem System induziert das Medium, das mit proliferierendem Urothel konditioniert worden war, eine höhere Proliferation der P3-Gewebezellen und Penetration der Membran (3B). Tatsächlich konnten 3 bis 5 Zellschichten auf der Oberfläche der Membran identifiziert werden, die ebenso mit stärker pene trierten Zellen durchsetzt ist (3B).
Der Prozentsatz von SMA-positiven Zellen betrug in der zweiten Gruppe (d. h. Zellen, die mit proliferativem urothelialen Medium kultiviert wurden) etwa 60 % an Tag 32 (4B) im Vergleich zu 40 % in der ersten Gruppe (d. h. Zellen, die mit terminal differenziertem urothelialen Medium kultiviert wurden), wenn das Serum in den drei Schritten abgereichert wurde. Unter den zweiten Bedingungen (mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium) induzierte die zusätzliche mechanische Streckung nicht nur die Zellpenetration und -migration in unterschiedliche Richtungen in Gegenwart von Serum (Tag 1 bis 28; 4, 5), sondern erhöhte ebenso den Anteil von SMA-positiven Zellen (2C bis 2F). In diesem Kultursystem färbten sich über 80 % der P3-Zellen positiv für SMR an Tag 32, wenn das Serum in den drei Schritten reduziert wird (2C). Die übrigen 20 % der Zellpopulation (Fibroblasten) färbten sich positiv für Vimentin, während sie sich für SMA negativ färbten und nur schwache Empfindlichkeit für die mechanischen Verformungen und biochemischen Stimuli zeigten (6). In Kulturen mit konstanter Serumkonzentration (5 % FKS, Tag 1 bis 32) migrierten die P3-Zellen in die unter Spannung stehende Membran, wenn sie mit Urothel-konditioniertem Medium ernährt wurden, zeigten aber nur teilweise SMA-Expression (40 % SMA-positive Zellen in mit proliferierendem Urothel konditioniertem Medium und 30 % SMA-positive Zellen in, mit terminal differenziertem Urothel konditioniertem Medium).
Die 4A und 4B zeigen Aufnahmen von H & E-Anfärbungen der P3-Zellen auf der azellulären Membran in 20facher Vergrößerung. Sichtbar ist die räumliche Zellbewegung im Inneren der dreidimensionalen Struktur der azellulären Membran unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation an Tag 18 nach dem Aufbringen der Zellen auf die Membran (4A, 4B). Die Zellen lösen die Zell-Zell-Adhäsion während der Migration ab. Der Abbau der extrazellulären Matrix durch die wandernden Zellen konnte nachgewiesen werden. Beachtenswert ist insbesondere die längliche Form der wandernden Zellen unter Streckung.
Die 5A bis 5C zeigen weitere Aufnahmen von H & E-Anfärbungen der Membran-Zell-Komposite in 20facher Vergrößerung. Sichtbar ist die Penetration der Membran durch die P3-Gewebezellen unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation. Die stark beweglichen Zellen bewegten sich auf der gesamten Oberfläche der Membran und bildeten darauf viele Schichten (5A). Sie drangen stark in das Innere der Membran in unterschiedliche Richtungen ein und hielten zunächst die Zell-Zell-Adhäsion aufrecht (5A), wobei die extrazellulären Matrixkomponenten abgebaut werden, und überwanden deren räumliche Barriere (5A bis 5C). Die Membran war am Tag 32 vollständig von Gewebezellen nach der Serumentfernung durchsetzt 5C).
6 zeigt eine Aufnahme einer SMA-Anfärbung eines Membran-Zell-Komposits. Zu erkennen ist sind die in die Membran eingedrungenen Zellen. Die Fibroblasten färbten mit SMA-Antikörper unter urothelialer Induktion und mechanischer Stimulation nicht positiv. Im Vergleich dazu zeigten die Glattmuskelzellen eine positive Reaktion mit dem Antikörper (braune Farbe) unter denselben Bedingungen. Die Fibroblasten sind durch Pfeile gekennzeichnet.
Literatur

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Claims

Verfahren zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstruktes zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, umfassend die Schritte (a) Isolieren und zweidimensionales Kultivieren von organspezifischen Gewebezellen; (b) Aufbringen der organ-spezifischen Muskelgewebezellen auf eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran, wobei die Muskelgewebezellen Glattmuskelzellen und fibroblastische Zellen sind; und (c) Kultivieren der organ-spezifischen Muskelgewebezellen auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung der organ-spezifischen Muskelgewebezellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen Muskelgewebezellen der Harnblase sind.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen, nachdem sie auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen, die auf die Membran aufgebracht werden, unter mitogener Stimulation kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 2 bis 7 sind.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen kultivierte Muskelgewebezellen der Passagen 3 bis 6 sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) unter urothelialer Induktion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur urothelialen Induktion ein mit proliferierendem Urothel konditioniertes Medium verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur urothelialen Induktion ein mit terminal differenziertem Urothel konditioniertes Medium verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Urothel aus der Mukosaschicht der Harnblase stammt.
Verfahren nach einem Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren der Muskelgewebezellen in Schritt (c) in einem mittels Urothel konditionierten Medium erfolgt, das ferner fötales Rinderserum (FKS) oder autologes Serum enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium 5 % FKS oder autologes Serum enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an FKS oder autologem Serum während der Kultivierung der Muskelgewebezellen auf der Membran schrittweise auf 0 % verringert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Stimulieren in Schritt (c) das Strecken der Membran, auf die die Gewebezellen aufgebracht sind, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das mechanische Stimulieren (c1) das Strecken der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum; (c2) die Relaxation der Membran für einen vorgegebenen Zeitraum; und (c3) das n-fache Wiederholen der Schritte (c1) und (c2), wobei n eine Ganzzahl größer oder gleich 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran entlang ihrer Längsachse gestreckt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen und das Urothel von einer Harnblase stammen.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Muskelgewebezellen und das Urothel von derselben Harnblase stammen.
Gewebetransplantatkonstrukt zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs, umfassend (a) eine biologisch kompatible, kollagenhaltige Membran; und (b) organ-spezifische Muskelgewebezellen, die auf der Membran unter biochemischer und mechanischer Stimulierung kultiviert sowie biochemisch und mechanisch stimuliert worden sind, umfaßt, wobei die Muskelgewebezellen Glattmuskelzellen und fibroblastische Zellen sind.
Gewebetransplantatkonstrukt nach Anspruch 18, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
Gewebetransplantatkonstrukt nach Anspruch 18 oder Anspruch 19 zur Rekonstruktion einer menschlichen oder tierischen Harnblase, dadurch gekennzeichnet, daß die organ-spezfischen Muskelgewebezellen Muskelgewebezellen einer Harnblase sind.
Verwendung eines Gewebetransplantatkonstruktes nach Anspruch 18 oder Anspruch 19 zur Rekonstruktion eines menschlichen oder tierischen Organs.
Verwendung eines Gewebetransplantatkonstruktes nach Anspruch 20 zur Rekonstruktion einer menschlichen oder tierischen Harnblase.