DE102005022032A1

DE102005022032A1 - Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen, Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro und Verwendung der nach dem Verfahren vermehrten Stammzellen

Info

Publication number: DE102005022032A1
Application number: DE200510022032
Authority: DE
Inventors: Markus Dr. Tonak; Philip Dr. Kasten; Julia Dr. Vogel; Wiltrud Prof. Dr. Richter
Original assignee: Stiftung Orthopadische Universitatsklinik; STIFTUNG ORTHOPAEDISCHE UNIVER
Current assignee: Stiftung Orthopadische Universitatsklinik; STIFTUNG ORTHOPAEDISCHE UNIVER
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2005-05-09
Publication date: 2006-11-16
Also published as: WO2006119727A1; EP1880003A1

Abstract

Ein Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, ist derart ausgestaltet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, und ein Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro sowie die Verwendung der nach dem Verfahren vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus.

Bisher gestaltete sich die in vitro Kultivierung von adulten Stammzellen, wie zum Beispiel von mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenders, als sehr anspruchsvoll und schwierig. Dies ist dadurch begründet, dass die zum Zeitpunkt der Entnahme pluripotenten Zellen einem natürlichen Alterungsprozess unterliegen, wodurch die Zellen neben ihrer Teilungsfähigkeit ihren pluripotenten Charakter, also ihre Pluripotenz verlieren. Eine gesteuerte Differenzierung der Stammzellen, z.B. in Knochen oder Knorpel, ist spätestens zu diesem Zeitpunkt nicht mehr möglich. Deshalb ist eine Expansion von mesenchymalen Stammzellen in den bekannten Kulturmedien nur über einen sehr kurzen Zeitraum möglich, nämlich bis zu dem Zeitpunkt der Kultur, an dem die Zellen ihren pluripotenten Charakter verlieren würden. Dieser Zeitraum ist dabei in erheblichem Maß vom Ursprung der Stammzellen abhängig, d.h., dass Stammzellen verschiedener Spender über unterschiedliche Zeiträume kultivierbar sind, bevor sie ihre Pluripotenz verlieren. Zudem sind bisher keine Medien ohne xenogene Zusatzstoffe bekannt, also Medien mit rein allogenen oder autogenen Zusätzen, in denen sich die Stammzellen schnell und in einer für die jeweilige Anwendung ausreichend großen Anzahl expandieren lassen.

Im Allgemeinen werden die MSC aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenderorganismus, welches zum Beispiel aus dem Beckenkamm, dem Sternum oder gelegentlich aus den Röhrenknochen, falls diese im Rahmen einer Operation eröffnet werden, gewonnen. Nach der Entnahme des Knochenmarkaspirats folgen Aufreinigungs- und Selektierungsschritte, um die MSC zu isolieren. Die aufgereinigten und isolierten MSC werden dann in einem Kulturmedium, das xenogene Zusatzstoffe enthält, unter geeigneten Standardkulturbedingungen, üblicherweise mit 6% CO₂ Luftsättigung bei 37°C und 98% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank in Flaschen, Petrischalen oder anderen Kulturgefäßen bis zu einer für die geplante klinische Anwendung ausreichenden Zellzahl expandiert. Ein xenogener Zusatzstoff, der in den von vielen Forschungsgruppen verwendeten Expansionsmedien vorkommt, ist hierbei zum Beispiel ein fötales Rinderserum (FCS).

Als ein Ziel einer klinischen Anwendung wird auf dem Gebiet der rekonstruktiven Medizin die Verbesserung einer Knochenheilung und Knochenherstellung unter Verwendung der expandierten mesenchymalen Stammzellen in Kombination mit einem geeigneten Trägermaterial (z.B. eine Keramik) angesehen.

Häufig scheitern diese klinischen Anwendungen jedoch schon in ihren Ansätzen, da eine ausreichend große Anzahl an Stammzellen, die benötigt wird, um zum Beispiel einen Knochen- oder Knorpeldefekt eines Empfängerorganismus zu heilen, nicht erreicht werden kann, und da die Zellen aufgrund des beschriebenen Alterungsprozesses im Verlauf der Kultivierung ihre Teilungsfähigkeit (Pluripotenz) verlieren und differenzieren. So ist zum Beispiel für einen Knochendefekt von einer Länge von 1,5 cm und einem Durchmesser von 4 mm eine Anzahl von 10⁶ MSC notwendig, um eine befriedigende Heilung des Knochens zu erzielen. Eine Expansion mit einer Zellzahl von mehr als 10⁶ MSC aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenderorganismus ist aber mit den bekannten Kulturmedien fast oder gar nicht möglich (variiert je nach Allgemeinzustand und Alter des Spenders) oder benötigt einen zu langen Zeitraum bis zur klinischen Anwendung.

Um dennoch eine ausreichende Anzahl MSC in kürzester Zeit zu gewinnen, wird daher der Ansatz verfolgt, der eine wiederholte Isolierung von MSC aus nacheinander entnommenem Knochenmarksaspiraten desselben Spenders vorsieht, um die so gewonnen Zellen miteinander zu vermischen. Ein Nachteil dabei ist, dass der Spender wiederholt einer Knochenmarkspunktion unterzogen wird, was einen schmerzhaften und belastenden Eingriff darstellt.

Ein anderer Ansatz zur Gewinnung einer ausreichenden Anzahl MSC ist die Vermischung (das „Poolen") von MSC verschiedener Spender. Ein Problem dabei stellt sich aufgrund der Tatsache, dass der Empfängerorganismus nicht nur eigene (wie im Fall einer Reimplantation oder autologen Transplantation) sondern auch körperfremde Zellen bei der Transplantation (allogene Transplantation) erhält, was zu Infektionen oder zu immunologischen Reaktionen im Empfängerorganismus führen kann. Dies hat zur Folge, dass ein Heilungsprozess des zu behandelnden Knochen- bzw. Knorpeldefekts verschlechtert wird oder sogar bei einer immunologischen Reaktion des Empfängerorganismus auf die körperfremden MSC das transplantierte Gewebe abgestoßen wird. Eine Heilung des zu behandelnden Knochen- bzw. Knorpeldefekts wird dadurch verhindert und insgesamt verschlechtert sich der Gesamtzustand des Empfängers.

Ein noch anderer Ansatz erfolgt durch den Einsatz mit für die Anwendung suboptimalen Zellzahlen. Nachteil dabei ist, dass der Erfolg einer Defektheilung des Knochens oder des Knorpels durch die zu geringe Dichte der transplantierten Stammzellen gefährdet wird.

Ein weiterer Nachteil der Kultivierung von MSC in Expansionsmedien mit xenogenen Zusatzstoffen, wie zum Beispiel Rinderserumprodukten, ist die Gefahr einer Kontamination mit Prionen, die die MSC infizieren und an den Empfängerorganismus bei der Transplantation weitergegeben werden können. Insofern erfolgt die Transplantation von Stammzellen, die in einem Medium expandiert wurden, das Rinderserumprodukte enthält, unter einem erheblichen gesundheitsgefährdenden Potential, nämlich mit der Gefahr, dass der Empfänger an Rinderwahnsinn (BSE) erkrankt. Zudem sind immunologische Reaktionen von humanen Empfängern auf Rinderserumprodukte bekannt geworden.

Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Expansionsmedium und ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, die durch xenogene Komponenten verursacht werden, sowie die Verwendung der vermehrten Stammzellen für klinische Anwendungen zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe hinsichtlich des Expansionsmediums durch eine Zusammensetzung für ein Expansionsmedium mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Danach ist die Zusammensetzung der eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.

Des Weiteren ist die obige Aufgabe im Hinblick auf ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, die durch xenogene Komponenten verursacht werden, durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 10 gelöst. Danach ist ein Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro der eingangs genannten Art derart ausgestaltet, dass die Stammzellen in einem Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe vermehrt werden, welches die für das Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten, plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.

Schließlich ist die obige Aufgabe hinsichtlich der Verwendung der MSC durch die Merkmale des Anspruchs 18 gelöst. Danach ist eine Verwendung der nach dem beanspruchten Verfahren vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus vorgesehen.

In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass durch den Zusatz von PRP, das zum Beispiel anstelle von fötalem Rinderserum (FCS) eingesetzt wird, ein Expansionsmedium zur Expansion von humanen Stammzellen bereitgestellt werden kann. Mit anderen Worten ist hierdurch das Risiko des Empfängers nach einer Transplantation oder Reimplantation der expandierten Stammzellen, an BSE zu erkranken, vollkommen ausgeschlossen. Durch den Einsatz des PRP können zudem immunologische Reaktionen oder Infektionen eines humanen Empfängers auf xenogene Zusatzstoffe im Medium, wie zum Beispiel Reaktionen auf Rinderserumprodukte, wirksam vermieden werden. Darüber hinaus ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine Expansion der Stammzellen beschleunigt werden kann. Zudem ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem erfindungsgemäßen Expansionsmedium vermehrten Stammzellen für eine Transplantation und/oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus verwenden lassen.

Folglich ist ein Expansionsmedium und ein Verfahren zur schnellen Vermehrung von Stammzellen in vitro in einer für klinische Anwendungen ausreichenden Anzahl unter Ausschluss von Infektionen oder immunologischen Reaktionen des Empfängerorganismus, welche durch xenogene Komponenten verursacht werden, sowie die Verwendung der vermehrten Stammzellen für klinische Anwendungen realisiert.

Vorzugsweise kann die Zusammensetzung für das Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen plättchenreiches Plasma (PRP) enthalten, dass eine 0,5 bis 2,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut aufweist. Noch bevorzugter weist das PRP eine 2,5 bis 4,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut auf und am meisten bevorzugt weist das PRP eine 3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut auf. Es ist aber auch denkbar, dass das PRP so stark anreicherbar ist, dass eine Konzentration an Thrombocyten von mehr als 6,5-fach im Vergleich zu Vollblut erreichbar ist. In besonders vorteilhafter Weise ist das angereicherte PRP in einer Endkonzentration von 0,5 bis 10 % (v/v) im Expansionsmedium zur Kultivierung der Stammzellen einsetzbar. Je nach Art und Beschaffenheit der Stammzellen ist aber auch eine Endkonzentration des PRP im Expansionsmedium von mehr als 10 % (v/v) verwendbar.

Damit ein speziell auf den Empfängerorganismus abgestimmtes Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung der Stammzellen zur Verfügung gestellt werden kann, welches keine xenogenen Zusatzstoffe enthält, hat das PRP seinen Ursprung in der Art der Empfängers. Im Konkreten hat das PRP zur Expansion von humanen Stammzellen einen humanen Ursprung („allogene Transplantation"). Eine Vermeidung immunologischer Reaktionen auf fremdes plättchenreiches Plasma aus der gleichen Art ist durch die Verwendung des körpereigenen Plasmas des Empfängers zur Vermehrung der eigenen Stammzellen erzielbar („autologe Transplantation").

Als zusätzliche Bestandteile enthält die Zusammensetzung für das Expansionsmedium mindestens zwei unterschiedliche Wachstumsfaktoren. Als besonders vorteilhaft erweist sich dabei in Kombination mit dem PRP ein Plättchen abhängiger Wachstumsfaktor (PDGF) mit einem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um eine schnelle Expansion der Stammzellen, insbesondere von mesenchymalen Stammzellen, zu erreichen. Zur Vermehrung von humanen mesenchymalen Stammzellen bieten sich in Anbetracht der angesprochenen Infektionsproblematik und der Vermeidung der immunologischen Reaktion des Empfängerorganismus auf xenogene Zusatzstoffe besonders rekombinante humane Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel rh EGF und rh PDGF an. In bevorzugter Weise enthält die Zusammensetzung dabei in Kombination mit dem rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh EGF den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDGF-AA, in noch bevorzugter Weise den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDFG-AB und in besonders bevorzugter Weise den rekombinanten humanen Wachstumsfaktor rh PDGF-BB. Dabei wird eine Endkonzentration im Expansionsmedium der jeweiligen Wachstumsfaktoren von 2 bis 5 ng/ml als bevorzugt angesehen. Noch bevorzugter erweist sich eine Endkonzentration von 6 bis 8 ng/ml und am meisten bevorzugt weist das Expansionsmedium eine Endkonzentration der jeweiligen Wachstumsfaktoren von 8 bis 10 ng/ml auf. Je nach Art der Stammzellen und dem zur Verfügung stehenden Zeitraum (bis zur klinischen Anwendung) zur Vermehrung der Stammzellen sind auch, insbesondere zur schnellen Expansion der Zellen in einem möglichst kurzem Zeitraum, Endkonzentrationen der jeweiligen Wachstumsfaktoren von mehr als 10 ng/ml im Expansionsmedium einsetzbar. Dabei ist denkbar, dass bei Verwendung unterschiedlicher Wachstumsfaktoren diese in einem Verhältnis 1:1 oder in einem Verhältnis, das ungleich 1:1 ist, dem Medium hinzugegeben werden, um die Expansionszeit und die Expansion der Stammzellen gezielt steuern zu können.

Als besonders vorteilhaft zur Anzucht von Stammzellen, insbesondere von humanen mesenchymalen Stammzellen, erweist sich eine Zusammensetzung, die die folgenden Komponenten pro einem Liter Medium in der angegebenen Menge bzw. Endkonzentration enthält:

wobei sich die Mediumkomponenten steril filtriert bei –20°C bis zu 8 Wochen lagern lassen und das PRP und die Wachstumsfaktoren frisch zu den Mediumkomponenten hinzugegeben werden. Als besonders vorteilhaft wirkt sich das Stehenlassen und Abkühlen des Mediums und die anschließende Bearbeitung des Mediums, zum Beispiel das Auf- und Abpipettieren oder das Umrühren des Mediums, auf die Teilungsfähigkeit der Stammzellen aus, da durch das Stehenlassen bei Kühltemperaturen die Thrombocyten im Medium Verklumpen und durch die Bearbeitung des Mediums das PRP „Clots" bildet, die positiv auf die Teilungsfähigkeit der Stammzellen wirken.

In vorteilhafter Weise ist eine Kultivierung der Stammzellen über einen langen Zeitraum, nämlich bis zu 8 Wochen, mit dem Expansionsmedium in der oben genannten Zusammensetzung und/oder eine schnelle Expansion der Stammzellen, insbesondere der humanen mesenchymalen Stammzellen innerhalb eines Zeitraumes von wenigen Wochen (2 bis 3 Wochen) erzielbar. Dabei ist von Vorteil, dass die Zellen nicht in Knochen-, Knorpel-, Fett- oder Sehnenzellen differenzieren und darüber hinaus ihre Teilungsfähigkeit beibehalten. Dies ermöglicht es, primäre mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmarkaspirat eines Spenders bis zu einer Anzahl von mehr als 10⁶ Zellen (bis über 10⁸ Zellen) zu expandieren. Dabei ist vorteilhaft, dass eine wiederholte Knochenmarkpunktion an einem Spender überflüssig ist und dass das Knochenmarkaspirat fast jeden Spenders, unabhängig von dessen Alter oder Gesundheitszustand, verwendbar ist.

Bezüglich des beanspruchten Verfahrens wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die Ausführungen und die Vorteilsangaben zu dem beanspruchten Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen verwiesen.

In besonders vorteilhafter Weise lassen sich die nach dem genannten Verfahren in dem genannten Expansionsmedium vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus verwenden. So können zum Beispiel expandierte Stammzellen, die von einem Spender stammen, der unterschiedlich zu dem Empfänger ist, aber der gleichen Art entstammt, für die allogene Transplantation verwendet werden. In bevorzugter Weise werden körpereigene Stammzellen des Empfängers, wie zum Beispiel mesenchymale Stammzellen für eine Reimplantation oder autologe Transplantation zur Behandlung und Heilung eines Knochen- oder Knorpeldefekts des Empfängers verwendet. Genauer gesagt, sind bei der Reimplantation der Spender des Knochenmarks und der daraus expandierten MSC und der Empfänger der expandierten MSC die gleiche Person, womit eine immunologische Reaktion auf körperfremde Antigene ausgeschlossen ist.

Als ganz besonders vorteilhaft erweist sich bei der Transplantation oder Reimplantation, insbesondere bei der Behandlung von größeren Knochen- oder Knorpeldefekten, die Verwendung eines Trägermaterials, auf das und/oder in das sich die Zellen bei der Kultivierung ansiedeln. So können beispielsweise mesenchymale Stammzellen einer Primärkultur eines Spenders in Verbindung mit dem Trägermaterial zur Behandlung und Heilung von Knochendefekten mit einer Größe von 0,5 cm bis 10 cm und 0,5 cm bis 5 cm Durchmesser eingesetzt werden. Als Trägermaterial wird dabei, insbesondere auf dem Gebiet des „Tissue Engineering", bevorzugt Hydroxylapatit (HA), eine dimineralisierte Knochenmatrix (DBM), eine Polyactidmatrix oder Polyglycolmatrix verwendet. Noch bevorzugter wird als Trägermaterial ein β-Trikalziumphosphat (β-TCP) und am meisten bevorzugt Kalzium-defizientes Hydroxylapatit (CDHA) verwendet. Es sind aber auch andere Trägermaterialien, wie zum Beispiel eine Kollagenmatrix, eine Gelatinematrix, eine Chitosanmatrix oder dezellularisiertes Gewebe, wie zum Beispiel Mukosa, oder Kombinationen der hier insgesamt aufgezählten Materialien verwendbar.

Es ist darüber hinaus auch denkbar, dass die nach dem genannten Verfahren vermehrten Stammzellen zur Regeneration, Behandlung und Heilung von anderen Gewebedefekten als den Knochen- oder Knorpeldefekten verwendet werden. So könnten zum Beispiel Bindegewebs-, Nerven-, Gefäß- oder Sehnendefekte behandelt und regeneriert werden. Es ist aber auch denkbar, dass bei Defekten der Haut, die durch Verbrennungen, Infektionen, Erkrankungen und/oder Abschürfungen entstanden sind, Stammzellen vermehrt und verwendet werden, die die Vorläuferzellen der Haut sind. Als Trägermaterialien kommen dabei zum Beispiel resorbierbare Materialien in Betracht, die sich mit den eingewachsenen Zellen wie eine „zweite" Haut auf die Körperpartien auflegen lassen.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Beispiels zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Beispiels werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert, ohne die Lehre darauf einzuschränken.

Beispiel

Humane mesenchymale Zellen wurden aus dem Knochenmarkaspirat gewonnen, das mittels einer Knochenmarkpunktion aus dem Beckenkamm eines Spenders entnommen wurde. Das Knochenmarkaspirat wurde aufgereinigt und selektiert, und die abgesonderten mesenchymalen Stammzellen in einem Expansionsmedium (s.u.) unter Standardkulturbedingungen (6% CO₂, 37°C und 98% Luftfeuchtigkeit) vermehrt. 1 Liter Expansionsmedium wurde wie folgt hergestellt: jeweils 567, 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Flüssigmedium (D-MEM) (1x) (high glucose) (Invitrogen, Cat#41966), 400 ml MCDB 201 (Sigma, Cat#I-1884), 20 ml Supplement ([10 mg/l Endkonz.] humanes Insulin (Sigma, Cat#I-9278), [10 mg/l Endkonz.] humanes Transferrin, Cat#T-8158) und [10 μg/l Endkonz] Natriumselenit (Sigma, Cat#S-9133)), 10 ml [1 % Endkonz] Penicillin/Streptomycin (Biochrom AG, Cat#A-2213), 400 μl [0,02 μM Endkonz.] Dexamethason (Sigma, Cat#D-8893) 20 μg/ml in 1 ml Ethanol zum Lösen in 45 ml sterilem Milli-Q-H₂O) und 580 μl [0,1 mM Endkonz.] Ascorbinsäure-2-phosphat 1,5 mg (Sigma, Cat#A-8960) wurden zusammengegeben und sterilfiltriert. Die so hergestellte Lösung wurde bei –20°C bis max. 8 Wochen eingefroren. Zur Herstellung des frischen Mediums wurde die benötigte Menge Medium aufgetaut und 30 ml [3% Endkonz] aufkonzentriertes frisches PRP (3 bis 6,5-fache Konzentration der Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut) sowie jeweils 250 μl [10 ng/ml Endkonz.] Wachstumsfaktor rh EGF und 250 μl [10 ng/ml Endkonz] rh PDGF-BB (Strathmann Biotec hEGF-500 bzw. hPDGF-BB-10) wurden dazugegeben und nicht mehr sterilfiltriert. Danach folgte das Stehenlassen des Mediums für mindestens 2 Stunden bei –4°C, damit sich die Thrombocyten verklumpten. Nach dem Stehenlassen wurde zur Bildung eines „Clots" das Medium durch Auf- und Abpippettieren verwendungsfertig gemacht.

Das verwendungsfertige frische PRP-Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe wurde mit einem üblichen Expansionsmedium mit xenogenem Zusatz von FCS (fötales Rinderserum) bezüglich der Proliferationsrate der in den Medien kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen verglichen. Dabei wurde eine Proliferationsrate der MSC im PRP-Expansionsmedium gemessen, die signifikant höher als die Proliferationsrate der MSC im FCS-Expansionsmedium lag (p < 0,05).

Die Verwendung des PRP-Expansionsmediums ohne xenogene Zusatzstoffe zur Expansion von mesenchymalen Stammzellen wurde im Tiermodell für das sogenannte „Tissue-Engineering", nämlich in Verbindung mit Trägerstoffen, wie zum Beispiel in Verbindung mit einer dimineralisierten Knochenmatrix (DBM), einem β-Trikalziumphosphat- (β-TCP) und einem Kalzium-defizienten Hydroxylapatit-(CDHA) Keramikkörper mit 84 % Porosität mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser im makroskopischen Bereich von 0,2 bis 0,6 mm (55 vol %) und einem Porendurchmesser im mikroskopischen Bereich von < 5 μm und einer spezifischen Oberfläche von durchschnittlich 0.5 m²/g erprobt. Dabei konnte eine ektope Knochenbildung nach 8 Wochen in 4 von 16 MSC behandelten CDHA-Keramikkörpern und in 2 von 16 behandelten β-TCP-Keramikkörpern in immundefizienten Mäusen festgestellt werden.

Neben der Eigenschaft des Mediums MSC schneller und zuverlässiger im Vergleich zu den bekannten Medien zu expandieren, wurde zudem die Fähigkeit der in dem PRP-Expansionsmedium hergestellten MSC in vivo ektop Knochen bilden zu können, bewiesen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die MSC ihre gewünschten Eigenschaften behalten, in Knochen und Knorpel zu differenzieren. Zudem konnte festgestellt werden, dass die gewünschten Oberflächenmarker der Zellen im Expansionsprozess erhalten bleiben.

Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Beispiel lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Beispiel einschränkt.

Claims

Expansionsmedium zur in vitro Kultivierung von Stammzellen in einer Zusammensetzung, die unter Ausschluss von xenogenen Zusatzstoffen alle für ein Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.
Expansionsmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das PRP eine 3 bis 6,5-fach erhöhte Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut aufweist.
Expansionsmedium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung humanes PRP enthält.
Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens zwei unterschiedliche Wachstumsfaktoren enthält.
Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung rekombinante humane Wachstumsfaktoren enthält.
Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung die Wachstumsfaktoren EGF und PDGF-BB, PDGF-AA oder PDGF-AB enthält.
Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend:
Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen unter geeigneten Kultivierungsbedingungen über einen langen Zeitraum kultivierbar sind und/oder deren schnelle Expansion ohne Differenzierung und unter Beibehaltung der Teilungsfähigkeit erzielbar ist.
Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur in vitro Kultivierung von mesenychmalen Stammzellen.
Verfahren zur Vermehrung von Stammzellen in vitro, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen in einem Expansionsmedium ohne xenogene Zusatzstoffe vermehrt werden, welches die für das Wachstum der Stammzellen erforderlichen Komponenten, plättchenreiches Plasma (PRP) und mindestens einen Wachstumsfaktor enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass PRP mit einer 3 bis 6,5-fach erhöhten Konzentration an Thrombocyten im Vergleich zu Vollblut verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 unter Verwendung von humanem PRP.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 unter Verwendung von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 unter Verwendung von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14 unter Verwendung der Wachstumsfaktoren EGF und PDGF-BB, PDGF-AA oder PDGF-AB.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Expansionsmedium die folgende Formulierung enthält:
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmarkaspirat von Spendern vermehrt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17 zur Vermehrung humaner mesenchymaler Stammzellen aus einer Primärkultur eines Spenders bis zu einer Anzahl von ≥ 10⁶ Zellen.
Verwendung der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 in dem Expansionsmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 9 vermehrten Stammzellen zur Transplantation oder Reimplantation in einen Empfängerorganismus.
Verwendung nach Anspruch 19 zur Transplantation oder Reimplantation an und/oder in einem Trägermaterial.
Verwendung nach Anspruch 19 oder 20 der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 vermehrten mesenchymalen Stammzellen zur Behandlung eines Knochen-, Knorpel-, Bindegewebs-, Nerven-, Gefäß- oder Sehnendefekts.