DE2651685C2

DE2651685C2 - Züchtung von Keratinozyten

Info

Publication number: DE2651685C2
Application number: DE2651685A
Authority: DE
Inventors: Howard Brookline Mass. Green; James G. Cambridge Mass. Rheinwald
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1975-11-14
Filing date: 1976-11-12
Publication date: 1982-07-01
Also published as: JPS5718863B2; US4016036A; CA1083987A; JPS5287291A; GB1514629A; FR2331617B1; FR2331617A1; DE2651685A1

Description

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Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 bis 4 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Keratinozyten sind Zellen, die Keratin synthetisieren und in der Lage sind, ein in Schichten angeordnetes squamöses Epithel zu bilden. Die bekanntesten Keratinozyten sind die Epidermiszellen der Haut. Weitere Beispiele sind die Zellen, mit der -,n Mund, ösophagus oder Vagina ausgekleidet sird.

Es ist gelungen, von bestirr Titen Arten von Säugetierzellen serienmäßige Kulturen (Subkulturen) herzustellen. Jedoch gelingt dies bei vielen Säugetierzellen nicht, insbesondere bei Epidermiszellen von Säugetieren. Es gelingt zwar, diese Zellen kurzzeitig in primären Kulturen zu züchten, jedoch sind bisher alle Versuche zu ihrer serienmäßigen Züchtung fehlgeschlagen. Im folgenden werden einige Literaturstellen über die Züchtung von disaggregierten Epidermiskeratinozyten in einschichtigen Zellkulturen (Monolayers) angegeben: F. L Vaughan und I. A. Bernstein, J. Invest Derm., Bd. 56 (1971), S. 454; M. A.Karasek und M. E. Charlton, J. Invest. Derm., Bd. 56 (1971), S. 205; N. E. Fusenig und P. K. M. Worst, J. Invest. Derm., Bd. 63 (1974), S. 187; und S. H. Uspa, D. L. Morgan, R. J. Walker und R. R. Bates J. Invest. Derm. Bd. 55 (1970), S. 379.

Aus Untersuchungen über Explantate oder kurzzeitig disaggregierte Zellkulturen ist es bekannt, daß das Überleben und Wachstum von Epidermiszellen von Mesenchymzellen oder Hautfibroblasten abhängt; vgl. J. W. Dodson, Exp. Cell. Res., Bd. 31 (1963), S. 233; N. K. Wessels, Exp. Cell. Res., Bd30 (1963), S.36; und A.A. Moscona, In the Epidermis, Montagna et al., (1964), S. 83. Trotz dieser Erkenntnis konnten Fibroblastzellen bisher nicht mit Erfolg zur Züchtung von Epidermiszellen verwendet werden. Da nämlich die Fibroblasten in f>o gemischten Kulturen regelmäßig die Epidermiszellen überwuchern, wurde im allgemeinen versucht, die Epidermiszellen von den Fibroblasten zu isolieren und sie allein zu züchten. In derartigen Systemen findet aber nur ein geringes Wachstum statt. f>'

Da die serienmäßige Züchtung von Epidermiszellen bisher noch nicht gelungen ist, war es nicht möglich, Epidermiszellen in großen Mengen herzustellen. Die Abhängigkeit von Hauptbiopsien stellt bei der Beschaffung dieser Zellen ein starkes Hindernis dar. Außerdem haben sich Ersatzprodukte für Epidermiszellen, die beispielsweise zur Abdeckung von entblößten Hautoberflächen bei Brandopfern und bei dermatologischen Untersuchungen von Arzneistoffen verwendet werden, nicht als zufriedenstellend erwiesen. Diese Ersatzprodukte weisen außerdem eine Reihe von Nachteilen auf. Somit ist bei keinem dieser Ersatzprodukte eine Funktion gewährleistet, die der von menschlichen Epidermiszellen vollkommen gleicht

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfugung zu stellen, mit dem größere Mengen von Keratinozyten erhalten werden können.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß sich fieratinozyten unter sehr spezifischen und kontrollierten Bedingungen serienmäßig züchten lassen. Dabei werden menschliche Epidermiszellen oder andere Keratinozyten in Kulturen zusammen mit Fibroblastzellen, die so behandelt sind, daß ihre Vermehrung verhindert wird, gezüchtet Die Dichte der Fibroblastzeiien muß selbstverständlich in diesen Kulturen sorgfältig kontrolliert werden, um die Bildung und das Wachstum von Kolonien von Epidermiszellen zu ermöglichen. Es wurde ferner festgestellt daß Keratinozyten in Gegenwart von Produkten von Fibroblastzellen sowie in Gegenwart von Fibroblastzellen selbst gezüchtet werden können.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt eine serienmäßige Züchtung sowohl von Teratomkeratinozyten als auch von menschlichen Epidermiszellen. Die Anzahl der menschlichen Epidermiszellen in der Primärkultur kann beispielsweise bis zum Faktor 10⁶ oder mehr gesteigert werden.

Erfindungsgemäß gelingt es, ausgehend von einem aus einem transplantierbaren Mäuseteratom isolierten Zeilklon (XB) serienmäßig Teratomkeratinozyten zu züchten. Durch Serienzüchtung dieser Klonzellen erhält man ein in Schichten angeordnetes squamöses Epithel.

Teratome wurden eingehend auf vire Differenzierung untersucht. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, derartige Tumoren auf Zcllkulturbedingungen einzustellen. Variable Differenzierungsgrade führten zur Entwicklung von permanenten Zell-Linien, die nicht die Pluripotentialität der Stammzellen des Teratoms aufweisen, aber Funktionen besitzen, die charakteristisch für bekannte differenzierte Zelltypen sind; vgl. L. J. Kleinsmith und G. B. Pierce, Jr., Cane. Res., Bd. 24 (1964), S. 1544; und M. D. Rosenthall, R. M. Wishnow und G. H. Sato, J. Nat Cane. Inst, Bd. 44 (1970), S. 1001. Bei einer permanenten Zeil-Linie aus einem Zervikalkarzinom, das an ein Wachstum in Suspension angepaßt war, wurde festgestellt, daß es mit den Zell-Linien von Keratinozyten einige ultrastrukturelle Merkmale gemeinsam hat.

Es wurde aber bisher keine Zeil-Linie beschrieben, die die Eigenschaften des Klons (XB) aufweist Die neue Klon-Zell-Linie wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. CL-177 hinterlegt.

Die nachfolgende Beschreibung befaßt sich speziell mit XB-Klonzellen aus Mäuseteratomen, Es ist aber anzunehmen, daß auch andere Teratome, beispielsweise menschliche Teratome zur Isolierung von zur Serienzüchtung geeigneten klonalen Keratinozyten verwendet werden können.

Die Anwesenheit von Fibroblastzellen oder Produkten von Fibroblastzellen, die aus einem Medium, aus dem die Fibroblastkultüren abgeerntet sind, erhalten

werden, ist für eine Unterstützung des Wachstums der Keratinozyten wesentlich. Der genaue Mechanismus, nach dem die Fibroblastzellen oder die Zellprodukte wirken, ist komplex und wenig bekannt Anscheinend erfüllen diese Zellen oder Zellprodukte die folgenden Funktionen: Zunächst sind die Fibroblasten oder deren Produkte zum Wachstum und zur Differenzierung der Keratinozyten notwendig. Ferner kann, wenn das Gewebe, das die Keratinozyten enthält, auch lebensfähige Fibroblasten enthält, die Vermehrung dieser Fibroblasten durch nicht wachstumsfähige Fibroblasten unterdrückt werden. Zellprodukte von Fibroblasten sind für die letztgenannte Funktion nicht ausreichend.

Spezielle Beispiele für Fibroblastzellen sind 3T3-Mäusefibroblasten und menschliche diploide Fibroblasten. 3T3-Zellen sind bevorzugt, da sie offensichtlich das Keratinozytenwachstum wirksamer fördern und lebensfähige Fibroblasten wirksamer unterdrücken.

Fibroblastzellen werden vor der Beimpfung der Epidermiskulturen zur Verhinderung ihrer Vermehrung behandelt Eine wirksame Behandlungsweise besteht in der Bestrahlung der Zellen mit ionisierenden Strahlen, beispielsweise Röntgen- oder y-Strahlen. bis die Vermehrungsfähigkeit der Zellen zerstört ist Derartige Bestrahlungsverfahren sind bekannt Beispielsweise ist ein derartiges Verfahren von T. T. Puck, P. I. Marcus und S. J. Cieciurra in J. Exp. Med„ Bd. 103 (1956), S. 273, beschrieben. Eine typische Dosis von y-Strahlen, die eine derartige Wirkung hervorruft beträgt etwa 6000 rad. Bestrahlte Fibroblasten sind in dem Sinn lebend, daß sie weiterhin einen Stoffwechsel ausüben und zu Synthesen befähigt sind, während sie ihre Fähigkeit zur Vermehrung verloren haben, wenngleich bei einigen Zellen eine oder zwei Teilungen vorkommen.

Weitere Möglichkeiten zur Verhinderung der Zellvermehrung der Fibroblasten bestehen in der UV-Bestrahlung oder Behandlung mit Verbindungen, die die DNA beschädigen, beispielsweise mit Alkylierungsmitteln oder Mitomycin-C. Dem Fachmann sind weitere derartige ',erfahren geläufig. Es können sämtliche Verfahren zur Behandlung der Fibroblastzellen angewendet werden, die, wie vorstehend er'äutert, die Zellvermehrung verhindern.

Die Dichte der Fibroblastzellen in den Keratinozytenkulturen muß selbstverständlich sorgfältig kontrolliert werden. Die Dichte muß ausreichend groß sein, daß die Vermehrung und Differenzierung der Keratinozyten ermöglicht wird. Andererseits muß diese Dichte so gering sein, daß eine Expansion von Keratinozytenkolonien mit dem Zellwachstum möglich ist. Zweckmäßig werden menschliche Epidermiszellen in einer Dichte von etwa 50 bis 5000 Zellen/cm² beimpft, während Kulturen von Klon XB-Zellen in einer Dichte von etwa 50 Zellen/cm² beimpft werden. Diese Werte beruhen auf praktischen Arbeitskonzentrationen, da der Klonbildungswert von menschlichen Epidermiszellen nur etwa 1 Prozent beträgt, während Teratomklone Klonbildungswerte von etwa 40 Prozent aufweisen. Bei menschlichen Epidermiszellen soll die Dichte der 3T3-Zellen etwa 15 000 bis etwa 50 000 3T3-Zellen/cm2 betragen. Zur Züchtung von Mäuseteratom-Klon XB-Zellen beträgt die 3T3-Zelldichte bis zu 15 000 Zellen/cm², da höhere Dichten die Kolonienexpansion hemmen.

Ein tatsächlicher Kontakt mit den Fibroblastzellen ist nicht in allen Fällen für das Wachstum und die Keratinisierung erforderlich. Es wurde festgestellt, daß beispielsweise das Wachstum von XB-klonalen Zellen durch Mäusefibroblast-3T3-Zellen, die sich in einiger Entfernung in der Züchtungsschale befinden, unterstützt wird. XB-Zellen sind auch in der Lage, in Abwesenheit -, von 3T3-Zellen Kolonien zu bilden und zu keratinisieren, wenn das Wachstumsmedium vorher mit 3T3-Zellen konditioniert worden ist Die Konditionierung wird beispielsweise erreicht indem man das Medium 1 Tag Kulturen von 3T3-Zellen von Sättigungsdichte aussetzt.

ίο Das Medium wird anschließend entfernt und filtriert.

Zur erfindungsgemäßen Züchtung der Epidermiszellen sind herkömmliche Zellkulturmedien geeignet. Im allgemeinen handelt es sich dabei um synthetische Medien, die für das Wachstum der Zellen Quellen für Aminosäuren, Vitamine, Glucose und dergl. zur Verfügung stellen. Typische Beispiele für Kulturmedien, die sich zur serienmäßigen Züchtung von Epidermiszellen eignen, sind das Eagle-Medium, das gemäß Dulbecco und Vogt modifizierte Eagle-Medium und das Ham-Medium. Im allgemeinen wird dem Medium Serum zugesetzt, jm bestimmte Proteine ?ur Verfügung zu stellen. Beispielsweise können Kälbe/serum und fötales Kälberserum zugesetzt werden, wobei ein Zusatz von 20 Prozent fötalem Kälberserum in etwa optimale Ergebnisse bringt

Die keratinöse Beschaffenheit des serienmäßig gezüchteten XB-Klons wird durch mehrere Verfahren nachgewiesen. Nach Fixierung und Färben mit Rhodanil-Blau, einem Gemisch aus Rhodamin B und Nilblau,

jo färben sich die Kolonien von XB-Zellen im Inneren rot, während die meisten tierischen Zellen sich blau färben. Die Fähigkeit einer Kolonie zur Rotfärbung mit Rhodanil-Blau steht in guter Beziehung mit der Anwesenheit von in Schichten angeordnetem squamö-

j5 sem Epithel, das durch Schnitte durch die Kolonie nachzuweisen ist Die Kolonien werden in der Petri-Schale fixiert und mit einer Säge herausgeschnitten. Der Kunststoff wird in Xylol gelöst. Nach dem Einbetten der Kolonien in Paraffin werden sie vertikal zerschnitten und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. Dabei zeigt sich, daß die Kolonien tatsächlich aus in Schichten angeordnetem, squamösem Epithel, das aus mehrfachen Zellschichten zusammengesetzt ist, bestehen. Mit Rhodamin B allein läßt sich zwar ein geringer Anteil an histologisch identifizierbarer Differenzierung feststellen, dies zeigt aber, daß dieser Farbstoff ein sehr empfindlicher Indikator für die Keratinisierung ist.

Eine Bestätigung der keratinösen Beschaffenheit von XB-Kolonien läßt sich auch elektronenmikroskopisch erhalten. F i g. 1 zeigt zwei typische elektronenmikroskopische Aufnahmen.

In der 30. Zellgeneration gezüchtete XB-Zellen erweisen sich nach ihrer Isolierung als heteroploid. Die modale Chromosomenanzahl beträgt 76 bei einem engen Streubereich (±2).

Bei den meisten Untersuchungen, bei deneii die XB-Kolonien trypsiniert und die Zellen mit "Λ 3T3-Zellen beimpft werden, liegt der Klonbildungswert in der Größenordnung von 40 Prozent. Dies zeigt, daC viele Zellen au.h in großen XB-Kolonien ihre Lebensfähigkeit behalten und eine Kolonienbildung einleiten können.

Radioautographische Untersuchungen von Schnitten durch große Kolonien (> 1000 Zellen) zeigen, daß viele Zellkerne mit H³ markiertes Thymidin eingebaut haben. Nicht markierte Ktr.ie befinden sich im allgemeinen in den äußersten Oberflächenschichten des am meisten geschichteten Teils der Kolonie und sind häufig

abgeflacht. Die Umwandlung der Keratinozyten zu einem nicht teilenden und differenzierten Zellenstadium in der Kolonie folgt somit in etwa der in vivo-Bildung eines in Schichten angeordneten, squamösen Epithels.

Die im folgenden aufgeführten Eigenschaften der XB-keratinisierlen Linie deuten auf einen differenzierten Zustand ähnlich dem der Epidermis oder verwandter Epithelien hin: Schichtförmige Anordnung der Zellen in den Kolonien; Keratinisierung, nachgewiesen durch Färbung mit Rhodanil-Blau und durch lichtmikroskopische Untersuchungen von Schnitten; ultrastrukturelle Merkmale von Epidermiszellen. wie reichlich Tonofilamente. einige Keratohyalin-Granulate und viele Desmosomen zwischen benachbarten Zellen; und bei einigen Kernen in den Schichten Verlust der Fähigkeit zur Replikation von DNA.

In Kolonien von menschlichen Epidermiszellen und 3T3-Zellen sind wenige Tage nach der Beimpfung runde 7ρ1Ιρπ auf der Oberseite der 3T3-Schicht sichtbar. Es kann sich dabei um Lpidermiszellen handeln. Keratino-/ytenkolonien können erst später endgültig nachgewiesen werden, nachdem die Zellen in Kontakt mit der Schalenoberfläche getreten sind und ein typisches Epithelmuster angenommen haben. Dies ist schon 4 Tage nach der Beimpfung leicht sichtbar, wenn die Kolonien sehr klein sind. Im Gegensatz zu Teratom-Keratinozytenlinien sind menschliche Epidermiskeratinozyten auch in einem sehr frühen Stadium in engen Kontakt miteinander und ordnen sich allmählich schichtweise an Da die Kolonien seitwärts wachsen, tritt eine Verdickung der Zentren ein und die Zellränder sind schwierig zu erkennen. Die Zentren nehmen schließlich ein rissiges Aussehen an. Alle menschlichen Epidermis-Kera'.inozytenkolonien färben sich rot mit Rhodamin B. auch wenn die Kolonien sehr klein sind, während teratomale Keratinozytenkolonien im allgemeinen schichtweise angeordnet sind und sich nur rot färben, wenn die Kolonien groß sind.

Elcktronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten durch die Kolonien bestätigen den schichtweisen Aufbau, die Keratinisierung. die in den oberen Zellschichten am weitesten fortgeschritten ist. und das reichliche Auftreten von Desmosomen in allen Schichten. Das Aussehen gleicht dem der Epidermis. Alle Zellen gehören zur gleichen Art. nämlich zu den Keratinozyten. Die am nächsten zur Oberfläche der Petri-Schale befindlichen Zellen entsprechen, obgleich sie abgeflacht sind, am ehesten den Keimzellen in normaler Epidermis, da die Zellteilung in schichtweise angeordneten Kolonien hauptsächlich in den untersten Schichten stattfindet. F i g. 2 ist eine typische elektronenmikroskopische Aufnahme von menschlichen Epidermis-Zellkolonien.

Kolonien mit mehr als iOOO Zellen werden I Tag mit H'-Thymidin markiert und mit einer photographischen Emulsion bedeckt. Die Autoradiographie ergibt, daß die nahe am. Kolonienrand befindlichen Kerne eine reichliche Schwärzung hervorrufen, während die Kerne im Innern der Kolonien eine nur sehr schwache oder gar keine Schwärzung hervorrufen. Werden die gleichen Kulturen mit C "-Thymidin markiert, ergibt sich, daß viele Kerne in den inneren Bereichen der Kolonien markiert sind. Diese Kerne sind vermutlich so tief innerhalb der Kolonie, daß vom Tritium imitierte ^-Teilchen die Emulsion nicht erreichen können. Aber auch nach einer Behandlung mil O'-Thymidin sind unmarkierte Kerne in großen abgeflachten Zellen mit verdickten Zellmembranen in den Oberflächenschichten der dickeren Kolonien sichtbar. Diese Kerne nehmen offensichtlich am DifferenzierungsprozeD zur squamösen Beschaffenheit teil. Radioautographien von Querschnitten von großen Kolonien, die mit tritiertem Thymidin markiert sind, zeigen, daß in Bereichen, wo keine Schichtbildung auftritt, keine markierten Kerne in den oberen Schichten vorhanden sind.

Der Klonbildungswert von menschlichen Keratinozyten ist variabel, aber immer beträchtlich niederiger als der entsprechende Wert von XB-Teratomkeratinozyten. Im allgemeinen beträgt der Anteil von Keratinozytenkolonien. die durch primäre disaggregierte Hautzellen gebildet werden. 0.1 bis 1,0 Prozent. Auch bei Subkulturen erreicht der Klonbildungswert nur gelegentlich 10 Prozent und liegt im allgemeinen bei I bis 5 Prozent für neugeborene Spender. Gegen Ende ihres Kulturlebens beträgt der Klonbildungswert bei Epidermiskeratinozyten sowohl bei neugeborenen als auch bei älteren Spendern beträchtlich weniger als 1 Prozent.

F.s wurde festgestellt, daß der Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) den Klonbildungswert von menschlichen Epidermiszellen erhöht. EGF wurde im Jahr 1962 bei Arbeiten entdeckt, bei denen die Submaxillaris-Drüse von Mäusen auf die Anwesenheit eines Nerven-Wachstumsfaktors untersucht wurden; vgl. S.Cohen, »Isolation of a Mouse Submaxillary Gland Protein Accelerating Irtcision Eruption and Eyelid Opening in the New-Bo-n Animal«, J. Biol. Chem.. Bd. 237 (1962). S. 1 555 bis 1562. In der Zwischenzeit wurde festgestellt, daß EGF ein Polypeptid aus 53 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 6000 ist. Unter diesen Aminosäuren fielen Alanin, Phenylalanin und Lysin; vgl. C. R. Savage. T. Inagami und S. Cohen, »The Primary Structure of Epidermal Growth Factor«, J. Biol. Chem., Bd. 24 F, (1972), S. 7612 bis 7621; und C. R. Savage und S. Cohen, »Epidermal Growth Factor and a New Derivative. Rapid Isolation Procedures und Biological and Chemical Characterization«, J. Biol. Chem, Bd. 24 F (1972), S. 7609 bis 7611. Auf diese Literaturstellen wird vollinhaltlich Bezug genommen. Durch Zusatz von EGF zu Kulturen von menschlichen Epidermiszellen in Konzentrationen von etwa 1 bis 30 Nanogramm/ml steigt der Klonbildungswert bei nachfolgenden Übertragungen um etwa den Faktor 3 bis 10. Eine ähnliche Wirkung läßt sich beim Klonbildungswert von Teratom-XB-Klonen nicht feststellen.

Die durchschnittliche Verdopplungszeit der XB-Linie von Teratomkeratinozyten beträgt etwa 19 Stunden. Menschliche Epidermiskeratinozyten in primären oder nachfolgenden Kulturen weisen eine Verdopplungszeit von etwa 32 Stunden vom Zeitpunkt der Beimpfu' ; bis zur Entwicklung von Kolonien mit einem Durchschnitt von etwa 1000 Zellen auf. Da in diesem Zeitraum auch die Haftung der Kolonien fällt, ist es wahrscheinlich, daß die Verdopplungszeit in der Exponentiellen Phase merklich kürzer ist Die Wachstumsgeschwindigkeit der Keratinozyten verändert sich offensichtlich bei serienmäßigen Subkulturen bis knapp zum Ende ihres Züchtungslebens, wo ein starker Abfall eintritt, nicht stark.

Die von Menschen verschiedener Altersstufen von der Geburt bis zu einem Alter von 34 Jahren erhaltenen Keratinozytenstämme zeigen eine begrenzte Kulturlebensdauer. Sämtliche Stämme wachsen nach mindestens 2 Übertragungen, während keiner der Stämme mehr als 6 Übertragungen durchhält. Menschliche Keratinozyten haben eine diploide Anzahl von Chromosomen.

Es wurde berichtet, daß Hydrocorlison die Kcratinisierung von Hautexplanlaten beschleunigt. Bei intakten Tieren nimmt man an. daß Hydrocortison das HpidermiswachsH<m unterdrückt. Aufgrund dieser Tatsachen wurde die Wirkung von Hydrocortison auf die .Serienzüchtung von menschlichen Epidermiszellen untersucht.

Be;,' Ausstreichen einer durch Hautbiopsy erhaltenen Zelisuspension zusammen mit 3T3Zellen läßt sich bei Zusatz von Hydrocortison an den in der Primärkulttir wachsenden Zellen kein U Herschied in der Wachstumsgeschwindigkeit oder der Morphologie feststellen. Bei sekundären und nachfolgenden Kulturen wird jedoch zweckmäßig mindestens etwa 0,03 jig/ml Hydrocortison zugesetzt um eine Bildung von regelmä-Qigen. in Schichten angeordneten, squamösen Kolonien anzuregen. In Abwesenheit von Hydrocortison entstehen 'Iiο Kolonien mit der gleichen Geschwindigkeit.

zent fötalem Kälberserum versetzt ist, gezüchtet. Das Medium wird 2mal wöchentlich erneuert. Sobald die Sekundärkultur das Stadium des Zusammenfließens erreicht, erweisen sich die meisten Zellen deutlich als l'ibroblasten, wobei aber auf der Oberseile der Fibroblastschicht einige Nichtfibroblastzellen vorhanden sind. Durch eine 2 minütige Inkubation mit 0,05 Prozent Trypsin werden viele dieser Zellen, jedoch nur wenige Fibroblasten freigesetzt. Die abgelösten Zellen werden in einer 15 mm Petri-Schale ausgestrichen. 2 Wochen später lassen sich 5 Kolonien von kleinen Epithelzellen beobachten, die mit einer Verdopplungszeit von etwa 24 Stunden wachsen. Nach 3 Wochen (die Kolonien haben sich zu mehreren hundert Zellen entwickelt) wird die Kultur trypsiniert und in einer Verdünnung von I : 4 übertragen. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt. Nach 6 Wochen weisen mehr als 80 Prozent der Zellen ihr ursprüngli-

cior-Lnr- -.n rhpc Anithplialpc Aticcphon

I inip wird :»K

l'ibroblasten erinnernden Aussehen gebildet. Ferner entsteht während des Beginns der Kolonienbildung vor der Expansion über die Oberfläche der Schale ein größerer Zellklumpen. Nach unterschiedlichen Zeiträumen, sobald die Kolonien größer geworden sind, nehmen Teile der einzelnen Kolonien oder die ganzen Kolonien die normale in Schichten angeordnete Epithelmorphologie an. Die Kolonien lassen sich immer vollständig mit Rhodamin färben. Da die ursprüngliche Kolonienexpansion in Abwesenheit von Hydrocortison verzögert wird, ist die durchschnittliche Wachstumgsgeschw idigkeit der Keratino/vten während jeder Passage (Übertragung) geringer als bei Zusatz von Hydrocortison. Bei einem Zusatz von mehr als etwa 10 μg/ml wird das Zellwachstum unterdrückt. Aus diesem Grund wird zweckmäßig etwa 0.03 bis 10μg/ml zu Kulturen von s> menschlichen Epidermiszellen gegeben, um das Kolonienwachstum und die Morphologie bei sekundären und späteren Kolonien zu verbessern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung von Keratinozyten erweist sich als wertvoll zur Herstellung ·»" von Epidermiszellen. Diese Zellen können zum Bedekken von entblößten Stellen bei Behandlung von Brandverletzungen dienen. Außerdem können sie zur Untersuchung von Arzneistoffen verwendet werden, da sich damit eine große Anzahl von Verbindungen au( ihre ■· > dermatologischen Eigenschaften untersuchen läßt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Zellinien aus einem transplantierbaren Teratom

Das feste, transplantierbare Teratom Nr. 69 691 wird gemäß Dr. L C. Stevens durch Transplantieren eines 6 Tage alten Embryos auf den Testis einer ausgewachsenen CXBGB/By Maus erzeugt; vgl. LC. Stevens, »Developmental Biol.«, Bd. 21 (1970), S. 364. Dieser Tumor wurde 2 Jahre im Laboratorium des genannten Autors durch subkutane Injektion von zerkleinerten Tumorfragmenten an isologe Mäuse erhalten. Es bilden sich eine Reihe von Gewebearten, einschließlich 6" Nerven, Drüsen, Muskeln Knorpeln und Knochen. Eine Maus mit einem derartigen Tumor wird verwendeL

Der Tumor wird zerkleinert und in Gegenwart von 0,25 Prozent Trypsin disaggregiert Die freigesetzten Zellen werden in hoher Dichte ausgestrichen, bis zur Sättigung gezüchtet und dann wieder bei hoher Dichte der Subkulturbildung unterworfen. Teratomlculturen werden in verstärktem Eagle-Medium, das mit 20 ProΧΛΙ.2 bezeichnet. Zahlreiche Klone werden später isoliert (XB und dergl.). Diese Familie von Zellinien wurde über 100 Generationen gezüchtet.

Beispiel 2

Verwendung einer bestrahlten 3T3-Schicht zur

Unterstützung des Wachstums von Teratomzellen und zur Unterdrückung des Fibroblastenwachstums

3T3-Zellen wurden auf folgende Weise einer Letalbcstrahlung unterzogen. Zusammenfließende Kulturen, die in verstärktem Eagle-Medium mit einem Gehalt an 10 Prozent Kälberserum gezüchtet sind und die 3- 10* Zellen in 100 mm-Schalen enthalten, werden innerhalb von 35 Sekunden mit einer Kobaltquelle einer /-Strahlung von 6000 rad unterzogen.

Einschichtige Zellkulturen von letal bestrahltem 3T3 werden trypsiniert. Anschließend werden die Zellen mit einer Dichte von etwa V₃ der Sättigung (1,6 · IO⁴ Zellen/cm² oder »Vj«) zusammen mit XA1.2-Zellen in verstärktes Eagle-Medium mit einem Gehalt an 10 Prozent fötalem Kälberserum überimpft. Die XA 1.2-Zellen wachsen offensichtlich zunächst auf der Oberseite der 3T3-Schicht, treten aber bald in Kontakt mit der Oberfläche der Züchtungsschale, indem sie sich zwischen die 3T3-Zellen eingraben. Epithelkolonien werden mit einem Klonbildungswert von etwa 40 Prozent gebildet. Diese Kolonien expandieren auf der Schalenoberfläche und stoßen die 3T3-Zellen zum Rand hin weg. Nach zwei aufeinanderfolgenden Kolonienisolationen mit "Λ 3T3 sind die Klonen frei von kontaminierenden Fibroblasten.

Beispiel 3

Isolierung von keratinisierenden Klonen und deren Nachweis mit Rhodanil-Blau

300 XAI-2-Zellen werden in einer 100 mm Schale mit "Ii 3T3-Zellen in Eagle-Medium mit einem Gehalt an 20 Prozent fötalem Kälberserum ausgestrichen. 2 Wochen später wird eine dicke Kolonie mit einer netzartigen Schicht über ihrem Zentrum isoliert (Klon XB). Dieser Klon wird mit 3T3-Zellen wieder ausgestrichen. Die meisten sich von diesem Klon bildenden Kolonien haben das gleiche Aussehen wie im lebenden Zustand, jedoch ergibt sich bei Fixierung und Färbung mit Rhodanii-Biau eine rote Färbung. Die meisten tierischen Gewebe färben sich blau, während sich keratinisiertes Epithel rot färbt.

Die Färbung wird durchgeführt, indem man die Kulturen in einer lOprozentigen Formalinlösung in isotonem Phosphatpuffer fixiert und 30 Minuten mit Rhodanil-Blau, das durch Vermischen von gleichen Volumina von 2prozentigem Rhodamin B und 2 Prozent Nilbiau hergestellt worden ist, färbt. Die Kulturen werden mit Wasser entfärbt, bis die blaue Farbe von den Kolonienzentren verschwindet. Dies dauert im allgemeinen etwa 2 Minuten.

Eine 18 Tage alte Kultur wird aus 200 XB-Zellen, die mit "Λ 3T3-Zellen ausgestrichen sind, entwickelt. Nach dem Färben ist das Innere der meisten Kolonien rot gefärbt, während der äußere Rand und die 3T3-Zellen sich blau färben. Verwendet man die beiden Farbstoffbestandteile in anderen Kulturen gelrennt, so wird durch Rhodamin B nur das Innere der Kolonien und durch Nilblau nur der Rand und der 3T3-Hintergrund gefärbt. Somit kann Rhodamin B auch allein zur Identifizierung von keratinisierenden Kolonien verwen-ÜL'i werden, iinr liüci' üic ripc/.itiidi Vüii Rhudnmiri 5 uZ'i Anwendung auf die Zellkulturen eine größere Sicherheit zu bekommen, wird das Anfärbeverhalten von Kolonien bekannter Kulturlinien, die nicht aus der Epidermis stammen, untersucht. 3T3, 3T6. SV40, ein Polyom- Vinistransformationsprodukt von 3T3. Heia, menschliche diploide Fibroblasten, I.-Zellen, ν7^, H4IIEC|. HTC, BRI. und vier weitere Teratomlinien. deren Morphologie sich von XB unterscheidet, werden in geringer Dichte mit und ohne "Λ 3Τ3 ausgestrichen. Die erhaltenen Kolonien ergeben unabhängig davon, ob sie dick oder dünn sind, sich in stationärem Zustand oder im Wachstum befinden, nur nach Färbung mit Rhodanil-Blau eine blaue Anfärbung.

Die Beziehung zwischen der Fähigkeit einer Kolonie zur Rotfärbung mit Rhodanil-Blau und der Anwesenheit eines in Schichten angeordneten, squamösen Epithels, das sich in Schnitten durch die Kolonie nachweisen laßt, wurde folgendermaßen festgestellt: Die Kulturschalen wurden in Van de Grift-Fixativ oder 10 Prozent Formalin fixiert, mit 95prozentigem Äthanol gespült, mit lOOprozentigem Äthanol entwässert und mit Zedernöl getränkt. Die einzelnen Kolonien werden mit einem Schneidegerät, das mit einer Schleifscheibe ausgerüstet ist, herausgeschnitten. Der Kunststoff der Schale wird in Xylol gelöst. Die Kolonien werden wieder mit Zedernöl getränkt, bei 60^cC in Paraffin eingebettet und anschließend zu 5 oder ΙΟμ-Querschmtten zerschnitten. Die Schnitte werden mit Hematoxylin/Eosin gefärbt und photographiert. Die Bilder zeigen, daß die einzelnen Kolonien tatsächlich aus einem in Schichten angeordnetem, squamösen Epithel bestehen, das aus mehreren Zellschichten zusammengesetzt ist. Es läßt sich bei der Färbung der intakten Klone mit Rhodamin B eine geringfügige Differenzierung histologisch in den Schnitten festste!- len. was zeigt, daß der Farbstoff ein sehr empfindlicher Indikator für eine Keratinisierung ist. Die am nächsten zur Kunststoffoöerfläche befindlichen Zellen weisen die größten Analogien zu den Grundzcllen auf, während die

■-> oberen Schichten im allgemeinen stärker keratinisiert sind.

Diese Koloniencpithelien sind weniger gut organisiert als entsprechende Epithelien, die man nach ähnlichen Methoden aus normaler menschlicher Haut

ίο erhält. In · einigen Teilen läßt ihr Aussehen auf neoplastische Veränderungen schließen. Es findet sich kein Hinweis auf 3T3-Zellen in den Schnitten, was den an den lebenden Kulturen gewonnenen Eindruck bestätigt, daß die XB /eilen die 3IJ /eilen bei einer

r· Expandierung der Kolonien von der Oberfläche der Petri Schale verdrängen, jedes als Kolonie gebildete Epithel ist somit das Ergebnis der Differenzierung <l°r Abkömmlinge einer einzigen XB /eile.

XB-Zellen bilden keine Tumoren in isologen oder

^1;: iithvrrii^chcr! N'iäiiser! ijuch wen" !(V-Z^ü^n !ητ'ί^Γ! werden.

XB-Zellen erweisen sich bei einer Analyse in der 30. Zellgeneralion nach ihrer Isolierung als heleroploid. Die modale Chromosomenan/ahl beträgt 76 bei einem

J' engen Streubereich ( ± 2). Die kcratinöse Beschaffenheit der Kolonien und die Bildung eines epidermisartigen Gewebes lassen sich elektronenmikroskopisch bestätigen. Die Kulturen werden gewaschen, in 2 Prozent Glutaraldehyd fixiert, in I Prozent Osmiumtetroxid nachfixiert und in 1 Prozent Uranylacetat vorgefärbt. Sodann werden die Kulturen in Araldit-Epon eingebettet und in 500 Α-Schnitte zerschnitten. Die Schnitte werden mit 2 Prozent Uranylacetat und Reynolds-Blei gefärbt und in einem )EM-IOOB-Mikroskop untersucht. Fig. 1 zeigt zwei typische elektronenmikroskopische Aufnahmen. Es ist ersichtlich, daß jede Kolonie aus 5 bis 10 abgeflachten Zcllschichten besieht. Die elektronenmikroskopische Aufnahme zeigt die schichtmäßige Anordnung der Schichten in der Nähe der Oberfläche im Kontakt mit dem Medium. Tonofilamente und Desmosomen treten reichlich auf und smd in allen Zellschichten vorhanden. Ferner lassen s'"h Aggregationen von Tonofiiamenten und die Anwesenheit von Teilchen, die Keratohyalin-Granulaten gleichen, beobachten und zwar im allgemeinen in den äußeren Zellschichten mit größerer Deutlichkeit.

Beispiel 4

Wirkung de·· Verhältnisses von 3T3-Zellen

zu XB-Zellen auf das Wachstum und die

Keratinisierung

Kulturen mit variierenden Verhältnissen von bestrahlten 3T3-Zellen und XB-Zellen werden gemäß Beispiel 3 hergestellt. Man erhält folgende Ergebnisse:

Anzahl der	Anzahl der	Wachstum der	Keratinisierung
XB-Zellen	3T3-Zellen	Kolonien
150	10*	ia. aber die Kolonien	ja
		bleiben sehr klein
	3X1O-W3)	ja. stärkere seitliche	ja
		Expansion
	10?	ja	Optimal
	3X10*	ja	praktisch keine
	I&¹	Ja	keine

26 5\ 685

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K)-

Anzahl der

3X KV 3 X KV 3 X 10-

i der

Kolonien

nein
ja

KeniliniskTiini:

keine
gut
keine
keine

Beispiel 5

Wachstum von XB-Zellen in einem Medium mit einem Gehaltan JTJ-Zellen,die sich von den XB-Zcllen

entfernt befinden

J ■ 10"' 3T3Zellen werden auf eine schräggestcllte Schale überimpft und im unteren Drittel zum Haften gebracht. Sodann werden XB-Zeilen auf die geradegestellte Platte überimpft und zum Wachstum gebracht. ILs bilden sich atf uer bloßen Plattenoberfläche kcratinisierende KoIo -ien auch in einem beträchtlichen Abstand von den 3T3-Z.ellen. Kolonicnbildung findet innerhalb der 3T3-Schicht statt, wobei aber die Kolonien klein bleiben, was auf die hohe Dichte an 3T3-Zellen zurückzuführen ist. Somit kann das Wachstum und die Keratinisierung von XB-Zellen durch 3T3-Zellen, die sich in einigem Abstand befinden, unterstützt werden.

Beispiel 6

Wachstum von XB-Zellen in einem mit Fibroblasten konditionierten Medium

Ein konditioniertes Medium wird hergestellt, indem man Kulturen von unbestrahlten 3T3-Zellen mit Sättigungsdichte 1 Tag mit einem Medium mit einem Geh.-'lt an 30 Prozent fötalem Kälberserum inkubiert. Das Medium wird anschließend entfernt, durch ein Nitrocellulose-Membranfilter gegeben und anschließend entweder direkt oder nach Verdünnung mit 20 Prozent seines Volumens eines frischen, serumfreien Mediums verwendet. Schalen werden mit 200 XB-Zellen in regulärem Medium beimpft. Am nächsten Tag ersetzt man dieses Medium durch das konditionierte Medium. Die Kulturen erhalten lmal wöchentlich eine Nährstoffzufuhr durch konditioniertes Medium. Die nach 2V₂ bis 3 Wochen mit einem Klonbildungswert von etwa 20 Prozent gebildeten Kolonien sind ebenso groß und ebenso gut in Schichten angeordnet, als wenn sie in Anwesenheit von "Λ 3T3-Zellen gezüchtet worden wären. Die meisten Kolonien färben sich gut mit Rhodamin B.

Konditionierte Medien, die unter Verwendung von anderen Linien auf die gleiche Weise hergestellt worden sind, werden auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung der Kolonienbildung und der Keratinisierung durch XB-Zellen untersucht. Die Keratinisierung wurde von ( + ) bis (+ + +) bewertet

kunJtlli tilt. I ί H(K-	üibllik
Λ Il I mi.	Κ.·I,Mil
X₁₁₁-I	klein
II T(	winzig
llehi	keine
ΙΙ4ΙΙ1 (	keine
en-1	keine

nicii^i:.ii uzt
i-ili*iiί iiuin-l ,:rl">iinL!

keine

SB. ein Stamm von fötalen, menschlichen fibroblasten unterstützen sowohl die Kolonienbildiing als auch die Keratiiiisierurg durch XB-Zellen. Kein mit einer anderen Zellinic konditioniertes Medium ergibt vergleichbare Ergebnisse. Das von Kulturen von 1.51 78^. einer Maus-l.ymphom-l.inie. und von Xi n-1. einer nicht keratinisierenden Tcratom-I.inie. geerntete Medium unterstützt die Rildung von kleinen Kolonien von XB-Zellen, wobei die Kolonien aber sieh nicht zu Schichten anordnen oder sich mit Rhodamin farben. Das mit HTC-Zellen (einer LCbCr-ZeIl-LmIe) konditionierte Medium unterstützt die Bildung von nur winzigen Kolonien, die sich mit Rhodamin färben lassen. Das Medium von Kulturen von HcIa. 1141 IfX, (eine Hcpatom-1 r ie) i'.nd ep-1 (eine mehl keratinisierende Teratom-I.ir.ie vjn cpithclialcm Aussehen) unterstützt die Ko'onienbil'Jung nicht. Von den untersuchten Linien sind ni. · die Fibroblast-Linien in der Lage, eine wirksame Konditionierung des Mediums im Hinblick auf Wachstum und Keratinisi.'runt? hervorzurufen.

Beispiel 7
Autoradiograph ie -I' η ie r sue nun ge"

Au toradiographie-Unter such unten ar schnitten durch große Kolonien ( > 1000 Zellen) w. Jen 20 Stunden nach Markierung mit rl'-Thv;r :.·, (0.5 uCVmi) durchgeführt. Es ergibt sich, daü vieh Kerne Thymidin eingebaut haben. Die nicht markier ι Kerne befinden sich im aligemeinen in den äußerten Oberflächenschichten des am stärksten schichtweise angeordneten Kolonienteils und sind häufig abgeflacht. Die Umwandlung der Keratinozyten zu nicht teilenden und differenzierten endgültigen Zellen in der Kolonie folgt daher in etwa einem Muster, das einem schichtweise angeordneten, squamösen in vivo-Epithel gleicht.

konditionierende
Zeil-Linie

gebildete
Kolonie

Intensität der Rhodamin-Färbung

keine	keine
3T3	groß
SB	groß
L5178_Y	klein

keine

Beispiel 8

Häufigkeit von Keratinozytenkolonien in primären Ausstrichen des transplantierten Teratoms

Drei Versuche wurden durchgeführt, wobei die Züchtung und die Färbung mit Rhodamin B gemäß Beispiels vorgenommen wird Man erhält folgende Ergebnisse:

	Anzahl dc gestrichen	13	26	51 685	14	0,42 4,4XlO-J 1,2X10-·	10 0 3	Anteil der gesamten Kolonien
Versuch	2.2 XlO* 3.3X10» 1.8X10"	r aus- en Zeilen	Gesamtzahl der kolonienbildenden /eilen (Anteil der ausgestrichenen Zellen)		Kolonien mit XB-ähnlicher Morphologie nicht keratinisert keratinisiert Anzahl der Anteil der gesamten Anzahl der Kolonien Kolonien Kolonien		1,7X10-2 < 4,0 X10-3 3,8Xl(H
A B C		2,6 XlO--¹ 8,1X10- 4.5 X HH	92 12 10

Gesamt

2,0X10*

13

Sämtliche erhaltenen zahlreichen Zellkolonien gleichen den XB-Zellen, wobei aber die meisten Kolonien eine schichtweise Anordnung und keine Keratinisierung zeigen. Zaei von drei Versuchen ergeben auch keine keratinisierten Kolonien, die im lebenden Zustand festzustellen sind. Die durchschnittliche Häufigkeit von keratinisierenden Kolonien für die drei Versuche beträgt 6 - !0~⁶ pro ausgestrichene ZeHe.

Ein großer Anteil der von den primären Ausstrichen erhaltenen Kolonien weist das Aussehen von Fwroblasten auf. Von den übrigen Kolonien, die als Nichtfibroblasten bezeichnet werden, sind die meisten nicht vom Keratinozytentyp, werden aber nicht näher identifiziert. Beim Vorhandensein* von Fibroblasten in sehr großer Anzahl stören sie die Entwicklung von Epithelkolonien, auch in Gegenwart von "Ij 3T3-Zellen. Bei einiger Erfahrung kann man sich auf die Morphologie der lebenden Zellen fast ebenso gut verlassen wie auf die Färbung mit Rhodamin B zur Identifizierung der Keratinisierung. Es ist deshalb möglich, Keratinozytenkolonien (ähnlich XB) aus primären Teratomkulturen zu isolieren und sie serienmäßig zu übertragen.

Beispiel 9

Wachstum und Keratinisierung von menschlichen,
diploiden Epidermiszellen

Durch Biopsi gewonnene Vorhautproben oder andere Hauptproben werden bei Raumtemperatur aseptisch in verstärktes Eagle-Medium mit einem Gehalt an 10 Prozent Kälberserum gegeben. Innerhalb von 3 Stunden läßt sich das subkutane Gewebe mit einer Operationsschere zum Großteil entfernen. Die verbleibende Haut (1 bis 3 cm²) wird mit der Schere in feine Stücke von weniger alsl mm Durchmesser zerkleinert. Diese Stücke werden bei 37"C in 0,25prozentigem Trypsin gerührt. Nach Iminütigem Absetzen wird der Überstand, der >95 Prozent Einzelzellen enthält, in Abständen von 30 Minuten entfernt und mit frischer Trypsinlösung ersetzt Die Zellen werden zentrifugiert, in Medium mit einem Gehalt an 20 Prozent fötalem Kälberserum und 0,4 μξ/πι\ Hydrocortison resuspen diert, mit letal bestrahlten 3T3-Zellen vermischt und ausgestrichen. 3 bis 5 Tage später wird das Medium ausgewechselt, wenn die meisten Epidermiszellen haften. Anschließend wird 2mal wöchentlich das Medium ausgewechselt, bis die Zellen einer Subkultur unterworfen oder fixiert und gefärbt werden.

In diesen Kulturen bilden die 3T3-Zellen rasch eine einschichtige Kultur auf der Oberfläche der Schale, wobei aber die Epidermiszellen häufig mehrere Tage bis zur Haftung erfordern. Diese menschlichen Epidermiskeratinozyten kommen schließlich in Kontakt mit der Oberfläche der Schale und wachsen als expandierende Kolonien auf der Gcfäßobcrflächc, wobei sie die 3T3-Zellen an den Rand abdrängen.

Subkulturen werden hergestellt nachdem man nahezu alle 3T3-ZeIIen und lebensfähigen Fibroblasten entfernt hat indem man die Kultur 15 Sekunden einer 0,02prozentigen EDTA-Lösung aussetzt und heftig pipettiert Die Keratinozytenkolonien, die haften bleiben, werden anschließend in einer Lösung, die gleiche Teile EDTA und eine 0,Q5prozentige Trypsinlösung enthält zu Einzelzellen disaggregiert Anschließend werden die Zellen wieder mit frischen, bestrahlten 3T3-Zellen ausgestrichen. Die Keratinozyten werden im allgemeinen einer Subkultur unterworfen, wenn die durchschnittliche Koloniengröße etwa 1000 Zellen erreicht hat

Die Wirksamkeit der Kolonienbildung durch die Keratinozyten wird bestimmt indem man 10³ bis 10⁵ Zellen zusammen mit "h 3T3 ausstreicht 2 bis 4 Wochen später fixiert und mit Rhodanil-Blau färbt. Der Kontaminationsgrad miic menschlichen Fibroblasten wird bestimmt indem man 300 bis 10⁴ Zellen mit "I₃ 3T3 ausstreicht Die Kulturen werden 1 bis 2 Wochen später fixiert und mit Hematoxylin gefärbt um die Fibroblastkolonien zu zählen.

Die Ergebnisse einer serienmäßigen Züchtung von menschlichen diploiden Epidermiszellen von verschiedenen Spendern sind in der Tabelle am Ende dieses Beispiels zusammengestellt

Vertikale Schnitte durch die Kolonien nach deren Anfärbung mit Hematoxylin und Eosin zeigen ein in Schichten angeordnetes, squamöses Epithel, das regelmäßiger aufgebaut ist, als das durch die XB-Linie erzeugte Epithel. Die Koionienoberfläche ist einheitlicher und weist keine runden Zellen auf.

Der Klonbildungswert von menschlichen Keratinozyten variiert ist aber immer beträchtlich niedriger als der entsprechende Wert von XB-Teratomkeratinozyten. Die nachstehende Tabelle zeigt daß die Anzahl der Keratinozytenkolonien, die von primären, disaggregierten Hautzellen gebildet wird, im allgemeinen 0,1 bis 1,0 Prozent beträgt Da die meisten Epidermiszellen der Haut wahrscheinlich nicht zur Teilung befähigt sind und - ")") die Biopsien auch dermale Zellen enthalten, scheint dies ein vernünftiger Wert zu sein. Auch bei Subkulturer liegt der Klonbildungswert nur gelegentlich bei 10 Prozent und beträgt im allgemeinen sogar bei neugeborenen Spendern nur I bis 5 Prozent. Gegen das Ende der Kulturlebensdauer ergeben Epidermiskeratinozyten von neugeborenen und älteren Spenderr Klonbildungswerte, die beträchtlich unter 1 Prozent liegen.

Menschliche Epidermiskeratinozyten in primärer Kulturen oder Subkulturen weisen eine Verdopplungs zeit von etwa 32 Stunden innerhalb der Zeitdauer vor der Überimpfung bis zur Entwicklung von Kolonien mii einem durchschnittlichen Gehalt an etwa 1000 Zeller

auf. Da diese Zeit auch den Zeitraum der Haftung der Zellen einschließt, ist es wahrscheinlich, daß die Verdopplungszeit in der exponentiellen Phase beträchtlich kürzer ist. Die Wachstumsgeschwindigkeit von Keratinozyten ändert sich bei Subkulturen bis kurz vor dem Ende der Kulturlebensdauer, wo ein starker Abfall eintritt, nicht stark.

Keratinozytenstämme von Menschen verschiedenen Alters von der Geburt bis zu einem Alter von 34 Jahren zeigen eine begrenzte Kulturlebensdauer. Sämtliche Stämme wachsen mindestens während zwei Übertragjungen, während keiner der Stämme mehr als sechs Übertragungen übersteht.

Die Anzahl der Zellgenerationen kann nicht aus der Verdünnung bei jeder Übertragung erhalten werden, da der Klonbildungswert gering ist. Die Anzahl der bei jeder Übertragung gebildeten Kolonien wird aufgrund von Platten geschätzt, die mit 10³ bis 10⁵ Zellen (vgl. nachstehende Tabelle, Spalte II) beimpft sind. Die endgültige Zellausbeute aus jeder Platte (vgl. nachstehende Tabelle, Spalte IV) wird dann mit der Anzahl der kolonienbildenden Zellen in bezug gesetzt. Auf diese Weife erhält man die Anzahl der in jeder Subkultur gewachsenen Zellgeuerationen. Diese Werte und die durch Addition erhaltenen Gesamtwerte sind in der Tabelle zusammengestellt. Es ergibt sich, daß von 7 nach der Biopsie erhaltenen Kulturen die Anzahl der gewachsenen Zellgenerationen 20 bis 50 beträgt. Diese Werte liegen vermutlich an der Untergrenze. Nach der Schichtbildung der Kolonien teilen sich die Zellen in den oberen Schichten nicht und differenzieren sich offensichtlich in Richtung zu einer Schuppenbildung. Die verbleibende, sich teilende Population unterliegt somit mehre--en Teilungen als es sich aus der Gesamtausbeute an Zellkolonien errechnen läßt.

Es ist wahrscheinlich, daß wie im Fall von menschlichen Fibroblasten die Epidermiszellen von älteren Spendern ein vermindertes Wachstumspotential aufweisen, da Keratinozyten von Personen im Alter von i bis 34 Jahren insgesamt ein Wachstum von 20 bis 27 Generationen aufweisen, während Keratinozyten von Neugeborenen ein Wachstum von 25 bis 51 Generationen zeigen. Der Klonbildungswert der Keratinozyten von älteren Spendern liegt immer im Bereich von

ίο weniger als 1 Prozent, während der entsprechende Wert von Neugeborenen häufig im Bereich von 2 bis 10 Prozent liegt (vgl. nachstehende Tabelle, Spalte II). Es ist ferner möglich, daß die Herkunft der Keratinozyten einen gewissen Einfluß auf ihr Kulturverhalten hat,

π da die Keratinozyten der zwei ältesten Spender aus Abdominalhaut stammen, während die anderen Keratinozyten aus Vorhaut gewonnen sind.

Die minimale Anzahl von 20 Zellgeneratioa^n, über die die Keratinozyten hinweg gezüchtet werden können, entspricht einem Anstieg in der Zellmasse um einen Faktor von etwa 10⁶, unter der Annahme, daß sämtliche Abkömmlinge eine Kolonienbildung hervorrufen können. Angesichts des niedrigen Klonbildungswerts bei Subkulturen wird ein derartiger Zuwachs an Zellmasse tatsächlich nicht erreicht. Es ist aus diesem Grunde wertvoll, die tatsächliche Expansion der Keratinozytenpopulation im Verlauf der Serienzüchtung zu berechnen, ohne auf die Verluste aufgrund des geringen Klonbildungswerts zu korrigieren. Die nach-

JD stehende Tabelle zeigt, daß die Werte von 2,6 bis über 10⁴ variieren. Der Mittelwert beträgt 600. Es ist anzunehmen, daB eine Verbesserung in den Züchtungsbedingungen zu einem erhöhten Klonbildungswert führt und somit eine stärkere Expansion der Keratinozyten-

i> populationen ermöglicht.

Serienzüchtung von menschlichen Keratinozytenstämmen in Kultur

	AlU	:r des Datum des	Passage	Kolonien pro 100 überimpfte Zellen	1	1	I	I	Keratino-	Kultur; 626fach	0.9	Kultur: 442fach	2.8	C	Fibro-	Keratinozyten-	Kolonien	700	Anzahl der	zusammen
	Spc	nders Ausstrichs		2	2	2	10'	7>ton	5 XIO-'	2.3	5X10'	1.7		blasten	ausbeute	V	2500	Generationen
Stamm			η- Inokulum	3	3	3	5X ICH		3 XIO-'	0.6	2X10'	0.2		Zellen	2000	jeweilige
			Nummern (Zellen)	Keratinozytenpopulation in	4	4		Il	10'	0.14	10'	MI	IV	300	Passage
	P.	10. 9.74		11.2.75	Kcratinozytenpopulalion in		10'	0.7	2X10'	10'		10*			10.4
		24. 9.74		24.2.75	11.2.75	Kultur: 1.5 X	5		3.8X10"	240		20.7
HFE		4.10.74	1	6.3.75	24.2.75	3XI0¹	2		2.0X10'·	2 500	10,4	30.7
		15.10.74	2	21..1.75	6.3.75	10-'	0.3		2.0X ICH	9000	10.3	36.7
	der		3	21.175	5X10*	lOTach				10
	η		4		0.8	0,04	2.6: '10'	4 500	6	10
Expansion		Keratinozytenpopulation in	2.5	0,7	1.4X10''	6900		19
HFE(O		9.1.75	1.8 >	10	2.6X10"	600	10	27
	der	24.1.75			287 ~	9
	η	7.2.75	0.8	3,8X10"		8	10
Expansion		1.0	2.5X)0"	14000		19-
Λ		l/l	7.0X10'	3000	10	29
		m	C	200	9	-38
	der				10
	η	1,8	2,7X10"	9.,	8
Expansion		6.5	8.4X10'		16
n		4.7	10'	8	25
		28		8
				9

	Fortsetzung	26 51 685	I	100 übe	rinipl'ie ZeI	0,15	in Kultur: 560fach	0,15	0,45	in Kultur: 952fach	■' Zellen zusammen	0,1	blasten	en	18	3T3 beimpft sind:	Die 3T3-Zellen um	,!■".! 11'.	Kolonien	40	Anzahl t	er	/usammen	en als das P	rodukt der Steigeruni: bei	^; , : ■ j.' .	DTA ent	crnt und
17			in Kultur: 23fach			8,2	105	15,7	0,3	3X105	0,3				ΙΟ⁴ Zellen zusammen mit '730 3T3 beimpft sind:	heftiges Pipettieren und Ansaugen entfernt. Die verbleibenden ZeIk	'-^ -	V	3600		Cieneralionen
		105		Kemlino- Fihro-	10,0	5X10⁴	3,3	3,007	10⁵		III			IV: Zellenschichten werden 20 Sekunden mit KDTA behandelt.	gezählt (restliche 3T3-Zellen sind nicht eingeschlossen: vgl	iniT-M		15000		jeweilige				ph ,If .JiI"
Kolonien pro	105		zylon	4,8	3X105	1,8		in Kultur: 2,6fach				V: berechnet aus den Werten in den Spalten I und 11:	j : η ι-: ι rnr r; ^:i ■]:	2100		Passage		:rt! j-i.-v!	llil.! (ii,- K	ίΤΐ₍;..'[Ι ■	ieder in d	cn Spalten !
	2X105		2,0	105	1,2	0,7			0,2	Keralino/jien-	Die Kxpansion der Keratinozytenpopulationen in Kultur wir	I III'. I- ¹CII,	550			i- 'Ti 11	,.-! -_v\\ Vi-V	>Ki-;\phir· C
Stamm Aller des Datum des Passagen- Inokulum	3X105	II	0.5	105	0,6	0,15		0,27	ausbeule	ii-ul IV aufgeführten l'.isvig'jn 'f^:hertrat	:■'...1:im Tiicdi-	UOO		12,5	n<-l Nl;,	:'!■> · !'i", I	" ^K ■-■■'■'
Spenders Aussirichs Nummern (Zellenl	1,1X105		3X10⁴	in Kultur: 2.2XlOTaCh	I Γι: Kulturen aus Suspensionen von mit Trypsin disaggregierten >	0,2	Zellen	:: <:. -si i.ilzt au¹· der (linvhv'liniltli.-b>:n KnI ·! π ■ il ,!uIim;"i: ' ■ ■ π ί:ίι·'πη ιί M'V-nt U ' ί > ' ι ι ί' I : )				21	.,,JC-VoIt₁ [I	i·: \::iiiriJi(	,,-I₁,- ,w\|,,r	^:..^sf!:^i::
	2X105	0,04	10*	II: geschätzt aus Kulturen, die mit 10"' bis H	0,1	IV	/ΧιιΐΐΜ ;ι.^! ■ ι·/; .ipiiie-! J;iH:rr>ii':h		150	12,5	28,5		)ΐ(Ί ) · I j I ■ ι Ι ,,..., ,,]■,-,;!.-.[■,	;,,. -ι,.-., ι	phiMlw	ι':,-.-.,:·,!'!-!
		3,6	2X10⁴	III: Schätzung aus Kulturen, die mit 300 bis	1,2		i^;i:if· An; ιwMnr\ ,.,,!-,.· ·.·, ..,i . ·- κ.;¹		8200	8,5	35,5	\ ■■':.,£! ■ ■: . Π '-Ί1		VM(I .\|i,	I jii^:il ,i' in
Expansion der Keratinozytenpopulation		7,5	1,4X105		2,7X105	Ci-.-lvilt ;:n nu-hr .;!-. i(>"^f /.■■.■':< :^:\ '!ui;·		10000	7,5	45	r ■.;-. !-''P. '": ■ :· ii ■	\V, .,!.τι	Hübt, (J.
C η 4.475 1	0,7	in Kultur: 45fach		1,3X10··	ni.iri niiirkioric. "!>■■■,:;'..:■■■ ?', ":11,, !. ■: '	9600	7	51			(-mc
24.4.75 2	0,5	3X10⁴	0,12	2,5X10^h	!ill'. r.\-..-\!\ (::-ui0\|-\|, I. ί .:' :l\,n , ':'■■) Ί ·■' ·■<·■'■ ' i -T' i πι' Ό] 1' ill	3000	9,5			,._:r i-,^;7
8.5.75 3	0 55	10⁴	0,1	2,6X105	ι .. !. ι I ,1 I· lih-il'lly. I '.I . ! ■■.'·.!:■; ι Γ ι.. I ι /-,ι: ι.·". ,;,:,;' ] '	1000	6^i	10	■■r. Vn : ■ ■ ί Π '	!,■'ν'.;..."''!
21.5.75 4	in Kultur: 1500fach		3,7X10^;	'. :i'\;- ■..-■:,'! ' Mi., ι.-ιι ,· .,: ·; ■.. .· '.-			16
5.6.75 5	105	0,5	C	150	10	22
17.6.75 6	105	0,2		7 850	6	28
Expansion der Keratinozytenpopulation	IO⁵	>0,l	1,4X105	10000	6	36
E(D η 24.4.75 1	2X105		6.0X105	1800	6	45
I 8.5.75 2	i,5Xiö⁵	0,12	5,8X105	1200	8
I 17.7.75 3	2X105	<0.1	4,6X105	180	9··	10
% 27.5.75 4	<0,l	7,5XiO³			18
I 4.6.75 5 I 17.6.75 6	0,2	C	45	10	26
i Expansion der Keratinozytenpopulaiion	0,4		60	8	34
i E(O η 24.4.75 1	1,3	1,5X105	10 ~	8	42
\ (Wiederholung) 10.5.75 2		1,5X10"		8	51
I 21.5.75 3	5	2,3X10"	200	8
i 4.6.75 4	0,25	5,1X105	150	9	10
': 17.6.75 5	1,8	3,7X105			21,5
30.6.75 6		105	300	10	26,5
Expansion der K;:ratinozytenpopulation			300	11,5
' GRE 3 Jahre !0.2.75 1		5,6X10»		5·'	12.5
; 25 2.75 2		1,6X105			23,0
i 21.3.75 3	<0,01	C		12.5
f" Expansion der Keratinozytenpopulation	0,4			10,5	10.5
HAE 12 Jahre 25.10.74 1		1,1 X 10⁶			20
8.11.74 2		2.6X105		10.5
Expansion der Keratinozytenpopulation			9,5
CS-I 34 Jahre 16.4.75 1		3,8X105
8.5.75 2		2,2X105		vorden sind:
: Expansion der Keratinozytenpopulation
Anmerkungen:		lebensfähig erhalten
n: neugeboren:			die menschlichen Kibroblasten werden durch
	.eilen, die in gefrorenem Zustand		η werden anschließend mit Trvpsin-I
mit "/3		Angaben über Versuchsdurchlulirung).

;! erhall


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W ι,

₍

Einbau bei vielen Kernen in den inneren Bereichen der Kolonien. Diese Kerne befinden sich vermutlich so tief innerhalb der Kolonie, daß aus dem Tritium imitierte /J-Teilchen die Emulsion nicht erreichen. Aber auch nach Behandlung mit C^H-Thymidin lassen sich unmarkierte Kerne in großen abgeflachten Zellen mit verdickten Zellmembranen in den Oberflächenschichten der dickeren Kolonien feststellen. Diese Kerne gehören offensichtlich zu Zellen, die am Prozeß der Differenzierung zu Schuppen teilnehmen. Autoradiographische Aufnahmen von Querschnitten von großen Kolonien, die mit tritiertem Thymidin markiert sind, zeigen, daß in Bereichen, wo eine Schichtbildung auftritt, in den oberen Schichten keine markierten Kerne vorhanden sind.

Beispie! Π
Elektronenmikroskopische Aufnahmen

Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Querschnitten durch die Kolonien bestätigen den schichtförtnigen Aufbau, die Keratinisierung (in den oberen Zellschichten am weitesten fortgesehnt'jn) und das reichliche Vorhandensein von Desmosomen in allen Schichten. F i g. 2 ist eine typische elektronenmikroskopische Aufnahme. Es läßt sich ein ähnliches Aussehen wie von Epidermis erkennen. Sämtliche Zellen sind vom gleichen Typ, d. h. Keratinozyten. Trotz ihrer Abflachung entsprechen die am nächsten zur Oberfläche der Petri-Schale angeordneten Zellen am meisten den Keimzellen in normaler Epidermis, da die Zellteilung in schichtweise angeordneten Kolonien hauptsächlich in den tieferen Schichten stattfindet.

Beispiel 12
Chromosomenbesetzung der Epidermiszellen

Um die Chromosomen von menschlichen Epiderm.iskeratinozyten zu untersuchen, ist es notwendig, Zellen zu erhalten, die vollkommen frei von menschlichen Fibroblasten sind. Dies wird erreicht, indem man primäre, disaggregierte Vorhautzellep in einer solchen Anzahl aufstreicht, daß man etw;i 3 Epidermiskolonien pro Platte erreicht. Eine Kolonie wird isoliert, trypsiniert und auf Schalen Obertragen, die "h und ⁿ/₃o 3T3 enthalten. Die Reinheit der isolierten Kolonie wird durch die Abwesenheit von Fibroblastenkolonien aui der "/io-einschichtigen Zellkultur bestätigt. Epidermiszellen, die auf den "/s-Schichten wachsen, werden 2 Stunden mit Colchicin (2 · 10~⁶m) behandelt Die Metaphasenpräparate werden nach üblichen Verfahren hergestellt und mit Orcein gefärbt. Ungeachtet der großen Bestrahlungsdosis treten häufig abnormale 3T3-Metaphasen auf, die sich aber leicht indentifizieren lassen. Gut verteilte menschliche Metaphasen werden gezählt. Sie haben eine diploide Anzahl von Chromosomen.

Beispiel π

Abhängigkeit des Wachstums vor menschlichen

Epithelzellen von der Anwesenheit von

Fibroblastzellen

Es wird versucht, menschliche diploide Epithelzellen gemäß Beispiel 9 zu züchten, wobei aber in Abwesenheit von Fibroblas'.en gearbeitet wird. Sämtliche Versuche führten nicht zur Kolonienbildung.

Beispiel 14

Wirkung von unterschiedlichen Dichten der

Fibroblastzellen auf die Fähigkeit von menschlichen

Epidermiskeratinozyten zur Kolonienbildung

Gemäß Beispiel 9 werden Kulturen mit verschiedenen 3T3-Zelldichten hergestellt. Man erhält folgende Ergebnisse:

Anzahl der	Anzahl der	Anzahl der	Keratini
ausgestrichenen	ausgestrichenen	gebildeten	sierung
Keratinozyten	3T3-Zel!cn	Keratinozytcnkolonien
10»	10"(«)	600	+
1(H	3X10W3)	600	+
W	l,5X10'("/6)	240	+
1O>	7.5XKH-712)	90	+
10»	3.8X1O(«/24)	3	+

Beispiel 15

Wirkung von vorherigem Wachstum mit EGF auf die
Kolo'.iienbildung von menschlichen
Epidermiskerai iriozYt

'<)'■ mcrischli': :--· Fpidenniskr.-r.iMf.-'yte.ii wi-rd.jn mi
urer ■"'! ■ 3T3-r^:ibmb!as!fcns'.iii;.i'' i ' l'.'fc'cnv. ;ίί i:^:··

Abwesenheit von 30 ng/ml EGF ausgestrichen. Das Wachstum und die Kolonienbildung der Keratinozyten wird in Abständen von 2 oder 3 Tagen gemessen. ( + ) oder ( — ) bedeuten die Anwesenheit b/'v. die Aiiwcsen· hei' von FGF. Hs werden folgende Wirkungen auf el·.·;· Nl');ibilci'ir'!i'sv'.'..;r! festgestellt.

Λη/:!|) ιΐιτ

/iirhtnni! ' i
i'n hei il-.v liehs
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21 22

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St,mim VlAiIiI der /minimi: IdI und kloilhildlingswerl ( ' I

(ieneratinnen hci ilcr n.ich>lcn Passage
beim Aiisslrich Passage ! P.i'-sagc 2 Passage 3 Passage 4 Passage

Mil Il + 12.5

27 + + + 3.0

39 + + + + 0.3

Ais diesen Werten geht hervor, daß ΓΧίΓ die Kiilnirlebenvkiuer wrliuigert und den Klonhildiingswer

erhoit.

Beispiel lh

'iVirknng \ on [Xi] auf die Wiichsiunisgeschw indigkei! und die KolonienbildiingsfiiliigkeU \on menschlichen

!piderniiskeratino/vten. ge/uchtet nut "/, jT"3

Menschliche Stamme \(in lipidermisker.itino/N ten festgestellt. Wie sich aus den nachstehenden Werten

'Aerck-n nut jiner ! Π-Schicht in (,egetnsarl oder ergibt, wird durch ΙΛιΙ sowohl das /eüwachsuim als

•\bnesfnheit mim SO ng-'ml HCiI-' ge/uchtet. Die amli die Kolonienbildiingsfahigkcit gesteigerl. Kok-nienhilcliingsfahigkei! und die /.ellaiisbeute wird

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung von Keratinozyten mit Hilfe von Fibroblastzellen bei der Vermehrung, Differenzierung und Kolonienexpansion der Keratinozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kulturen Fibroblastzellen, die so behandelt sind, daß ihre Vermehrung verhindert wird, oder ein mit Fibroblastzellen kondttioniertes Medium zusetzt ic

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fibroblastzellen 3T3-Mäusefibroblastzellen einsetzt, die in ihrer Vermehrung verhindert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- is zeichnet, daß die 3T3-Mäusefibroblastzellen durch Bestrahlen mit einer ionisierenden Strahlenquelle in ihrer Vermehrung verhindert sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es serienmäßig durchführt