DE2304780A1

DE2304780A1 - Plasminostreptin und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2304780A1
Application number: DE2304780A
Authority: DE
Inventors: Masao Isono; Atsushi Kakinuma; Norihiko Moriya; Hiromu Sugino
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-02-08
Filing date: 1973-02-01
Publication date: 1973-08-09
Also published as: CH575467A5; DK130477C; US4014860A; BE794975A; JPS4882089A; NO136204B; NO136204C; FR2181710A1; JPS5434837B2; SE390543B; GB1414696A; NL7301822A; USB328077I5; CA994692A; FR2181710B1; DK130477B

Description

Kein, den 31. Jan. 1973 Kl /Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd ., ' 27, Doshomaohi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Plasminostreptin und Verfahren zu seiner Herstellung

In dem Bemühen, für medizinische Zwecke geeignete Proteaseinhibitoren aus der Mikro^ienwelt zu finden, wurden von der Anmelderin umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, wobei eine Vielzahl von Mikroorganismen aus den verschiedensten Bodenproben untersucht wurden. Bei diesen '· Untersuchungen wurde festgestellt, daß mehrere Stämme der Gattung Streptomyces eine Substanz, die die Aktivität von Plasmin, Trypsin und gewissen alkalischen Proteasen stark hemmt, anzuhäufen vermögen. In weiteren Versuchen gelang die Isolierung dieser Substanz in Kristallform. Von der Anmelderin wurde- diese Substanz als "Plasminostreptin" bezeichnet, und nach weiteren Untersuchungen wurde ein Verfahren zu ihrer Herstellung entwickelt. Gegenstand der Erfindung sind demgemäß Plasminostreptin als neuer Proteaseinhibitor sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Gemäß der Erfindung wird Plasminostreptin hergestellt, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces (z.B. Streptomyces antifibrinolytic us), der Plasminostreptin in einem Mhrmedium, das eine assimilierbare Kohlen-

3098 3 2/1170

quelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, anzuhäufen vermag, unter aeroben Bedingungen bebrütet, bis das Plasminostreptin sich im Kulturmedium stark angehäuft hat, und das angehäufte Plasminostreptin aus dem Kulturmedium isoliert.

Als Mikroorganismen werden für die Zwecke der Erfindung Plasminostreptin bildende Stämme der Gattung Streptomyceo, insbesondere der Stamm Streptomyces antifibrinolyticus verwendet. Diese Stämme können verhältnismäßig leicht nach der Fibrinplattenmethode, die nachstehend näher beschrieben wird, von Bodenproben ausgewählt und isoliert werden. Hierzu wird der zu untersuchende Stamm von Streptomyces, der auf seine Eignung untersucht werden soll und mit Hilfe eines an sich bekannten Routine-Agarmediums für die Isolierung eines Stammes der Gattung Streptomyces isoliert worden ist, in einem flüssigen Medium kultiviert, und die' plasminbemmende Wirkung der entstehenden Kultur wird auf einer Fibrinplatte bestimmt, in der das Fibrin als Substrat von Plasmin (Fibrinolysin) dient.

Zu den Plasminostreptin bildenden Mikroorganismen, die von der Anmelderin von Bodenproben nach der oben beschriebenen Methode isoliert wurden, gehören u.a. Streptomyces antifibrinolyticus Nr.10123 (IFO 13298;, Nr.15807 (IFO 13507) und Nr.21211 (IFO 13508). Diese drei Stämme wurden von Bodenproben bei Nagaökakyo, Kyoto, bei Nishinomiya, Hyogo, und bei Iyomishima, Ehime, Japan, isoliert.

Der Stamm Nr₀10123 hat die folgenden mikrobiologischen Merkmale:

1) Morphologische Eigenschaften

Reichliches und flockiges Luftmyoel Der Hauptstamm entwickelt sich gut und ist unregelmäßig verzweigt. Eine offene Spirale bildet sich am Ende jeder Konidiophore, die einige Zehn Sporen in Kettenanordnung enthält. Die Sporen sind kugelförmig bis oval und haben glatte Oberflächen»

309832/ 1170

2) Kultureigenschaften

a) Glucose-Asparagin-Agar:

Luftmycel: gräulich-weiß mit braunem Stich Substratmycel: gelblich-braun bis dunkelbraun Lösliches Pigment: blaßgelblich-braun

b) Glycerin-Asparagin-Agar:

Luftmycel: gräulich-weiß mit einer kaum wahrnehmbaren Andeutung von braun Substratmycel: gelblich-braun mit grauem Stich Lösliches Pigment: sehr spärlich, hell gelblich-braun

c) Stärkeagar:

Luftmycel: spärlich, gräulich-weiß Substratmycel: gelblich-braun Lösliches Pigment: unwesentlich

d) Nähragar:
Luftmycel: unwesentlich Substratmycel: blaßbraun mit grauem Stich Lösliches Pigment: unwesentlich

e) Hefe-Malzagar:

Luftmycel: gräulich-weiß mit braunem Stich Substratmycel: gelblich-braun mit grauem Stich Lösliches Pigment: unwesentlich

f) Haferschrotmehl-Agar:

Luftmycel: gräulich-weiß mit braunem Stich Stibstratmycel: gelblich-braunmit grauem Stich Lösliches Pigment: unwesentlich

g) Glucose-Bouillon:

Ringbildung auf der Röhrchenwand mit Sedimenten Lösliches Pigment: braun

3) Physiologische Merkmale

a) Maximales Wachstum bei 25-20⁰C, schlechtes Wachstum

8-2/1170

bei 37⁰O, praktisch kein Wachstum bei 45⁰C

b) G-elatine: verflüssigt :

c) Stärke: hydrolysiert

d) Melanoidpigmente: praktisch nicht gebildet

4) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen L-Arabinose, D-G-lucose, Saccharose, Inosit, L-Rhamnose und D-Mannit werden zum Wachstum verwertet. Verwertung von D-Xylose, D-Fructose und .Raffinqse ist zweifelhaft«

Ein Vergleich der vorstehend genannten bakteriologischen Merkmale mit den Merkmalen bekannter Spezies von Streptomyces, wie sie beispielsweise in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7.Auflage (1957) beschrieben werden, ergibt, daß es keinen Mikroorganismus gibt, der mit dem Stamm Nr.10123 völlig identisch ist, der die folgenden Unterscheidungsmerkmale hat: Die Konidiophoren bilden offene Spiralen; das Luftmycel ist auf synthetischem Agar gräulich; das Substratmycel ist gelblichbraun, und lösliche Pigmente, werden gebildet.

Dieser Stamm" wurde somit von der Anmelderin als neuer Stamm ermittelt und als Streptomyces antifibrinolyticus bezeichnet.

Die anderen beiden Stämme Nr.15807 und 21211 teilen viele Merkmale mit dem Stamm 10123, abgesehen von einigen geringen Unterschieden in den Farben des Luft- und Substratmycels auf Hefe-Malzagär, und können ebenfalls als Stämme dergleichen neuen Spezies identifiziert werden. Die drei Stämme wurden im Institute for Fermentation, Osaka, Japan, hinterlegt und erhielten die Zugangsnummern 13507, 13508 und 13298.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Plasminostreptin bildender Stamm von Streptomyces antifibrinolyticus aerob in einem Nährmedium kultiviert.

3098:? 2/1170

_ ₅ - 230A780

Beliebige feste und flüssige Medien können verwendet werden, jedooh ist es im allgemeinen zweckmäßig, ein flüssiges Medium zu verwenden und den Mikroorganismus in der Schüttelkultur oder Submerskultur zu züchten. Die Zusammensetzung drs Nährmediums ist beliebig. Die einzige Voraussetzung ist, dass der Plasminostreptin bildende Stamm auf dem Nährmedium wachsen und Plasminostreptin bilden und anhäufen kann.

Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Glycerin, Stärke, Saccharose, Dextrin, Melasse und organische Säuren. Als Stickstoffquellen sind beispielsweise Proteinhydrolysate,beispielsweise Pepton, Caseminosäuren (Difco), N-Z-Amin A (Sheffield), Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquellwasser, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Nitrate und andere organische und anorganische Stickstoffverbindungen geeignet.

Als anorganische Salze können dem Nährmedium verschiedene Phosphate, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid usw. zugesetzt werden. Ferner können zur Förderung des Wachsturns des Mikroorganismus verschiedene Vitamine, mit Nucleinsäure verwandte Verbindungen usw. zugesetzt werden. In Abhängigkeit von den gewählten Kultivierungsverfahren und -bedingungen kann der Zusatz eines Schaumverhütungsmittels, z.B. eines Siliconöls, eines Propylenglykolderivats oder von Sojabohnenöl, die Anhäufung von Plasminostreptin steigern«

Zur Züchtung des Mikroorganismus ist es zweckmäßig, eine kleine Vorkultur durchzuführen und das Nährmedium anschließend mit der erhaltenen Kultur zu impfen.

Die Kultivierungsbedingungen einschließlich Temperatur, Bebrütungszeit und p^-Wert des Mediums werden so gewählt und geregelt, daß die Anhäufung von Plasminostreptin maximal ist. In vielen Fällen ist es zweckmäßig, eine Kultivierung mit Belüftung 1 bis 6 Tage bei 20-37⁰C durch-

309832/ 1170

zuführen, wotei der ρτ,-Wert des Mediums während der gesamten Bebrütungszeit bei 4,0 bis 9,5 gehalten wird.

Das durch die Kultivierung des Plastninostreptin bildenden Stammes erhaltene Kulturmedium enthält Plasminostreptin. Bei Verwendung eines flüssigen Mediums wird der überwiegende Teil des gebildeten Plasminostreptins in der Flüssigphase angehäuft. Es ist daher zweckmäßig, das Mycel vom Kulturmedium durch Filtration oder Zentrifugieren zu entfernen und dann das Plasminostreptin vom restlichen Filtrat oder überstand abzutrennen. Dies bedeutet nicht, daß das Plasminostreptin nicht unmittelbar aus dem Kulturmedium unter Umgehung der Entfernung des Mycels isoliert werden sollte. Die Abtrennung und Reinigung des Plasminostreptins aus dem Kulturmedium kann leicht mit Hilfe einer geeigneten Kombination von an sich bekannten Verfahren erfolgen, wobei die Kombination von den chemischen und physikalischen Eigenschaften von Plasminostreptin abhängte Geeignet zur Abtrennung sind beispielsweise Verfahren wie Ausfällung mit einem geeigneten anorganischen Salz, ZoBo Ammoniumsulfat, die isoelektrische Fällung in der Nähe des isoelektrischen Punktes von Plasminostreptin, d.h. bei einem ρτ,-Wert von etwa 6, Ausfällung mit Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, z.B· Aceton, Gelfiltration an Säulen von verschiedenen Typen von Dextranperlen, z.B. Sephadex (Pharmacia), Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschern wie DEAE-Cellulose (Midorijuji), DEAE-Sephadex (Pharmacia), Adsorptionschromatographie an verschiedenen Actorptionsmitteln wie Aktivkohle, Kieselgel·, "Asmit" (imacti) und Entfernung der niedrigmolekularen Verunreinigungen durch Dialyse beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten semipermeablen Membran, z.B. eines Zellglasbeutels. Natürlich können außer den vorstehend genannten Methoden beliebige andere Reinigungsverfahren, die die Eigenschaften von Plasminostreptin nicht beeinträchtigen,

3098 32/1170

angewandt werden. Durch Anwendung dieser Methoden in geeigneter Kombination kann das Plasniinostreptin aus dem Kulturmedium in "beliebiger Reinheit gewonnen werden. Das gereinigte Endprodukt kann in kristallinem Zustand erhalten werden.

Die gemäß Beispiel 1 hergestellte kristalline Form von Plasminostreptin hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

1) Aussehen: weiße Kristalle

2) Molekulargewicht: 26.000 + 2000, bestimmt in 0,1-molarem Natriumchlorid nach der Ultrazentrif ugenrnethode von Archibald (Journal of Physical and Colloid Chemistry 5± (1947) 1204); 25.000 + 2000 bei Bestimmung in 0,05-molarem Tris-(hyäroxymethyl)aminomethanhydroehloridpuffer (nachstehend einfach als Tris-HCl-Puffer bezeichnet) und 0,1-molarem Kaliumchlorid nach der Gelfiltrationsmethode von Andrews (Biochemical Journal 91 (1964) 222) unter Verwendung der Ionenaustauscher "Sephadex G-75." und "Sephadex G-100".

Bei Messung in gewissen Lösungsmitteln sinkt jedoch das Molekulargewicht auf ungefähr die Hälfte der oben genannten Werte, wie die folgende Tabelle 1 zeigt.

Tabelle 1 Lösungsmittel Analysenmethode Molekulargewicht

4-molares Guanidin- Gelfiltration an hydrochloride 0,05- "Sephadex G-100" 11.000 + 2.000 molarer Tris-HCl-Puffer - 0,1-molares
Kaliumchlorid (p„ 7,5)

0,1$iges Natriumlauryl- Elektrophorese 11.700 + 2.000 sulfat an Polyacryl-

amidgel

0,1$iges Natriumlau- Gelfiltration 12.000 + 2.000

rylsulfat - 0,05-mola- an "Sephadex *~

rer Tris-HCl-Puffer G-200"

3098 3 2/1170

Tabelle 1 (Forts,) Löungsmittel Analysenmethode Molekulargewicht

0,1-molare Gelfiltration HoOOO + 2*000 Ameisensäure an "Sephadex """

G-100»

5) Sedimentationskonstante

Die Sedimentationskonstante (S 20,w), gemessen durch Ultrazentrifugierung in einer synthetischen Grenzzelle beträgt 2,5 + 0,3 S in 0,1-molarem Natriumchlorid und . 1,2 + 0,3 S in 4-molarem Guanidinhydrochlorid. Die Probe, die eine Sedimentationskonstante von 1,2 + 0,3 S ergab, wurde erneut untersucht, nachdem sie der Dialyse bei 5 0 gegen das 100-fache Volumen von 0,1-molarem Natriumchlorid unterworfen worden war, wobei eine Sedimentationskonstante von 2,5 + 0,3 S erhalten wurde.

4) Elementaranalyse;

C 51,48 + 2,0$; H 6,96 + 0,5$; N 16,63 + 1, S 1,84 + 0,5$.

5) DO²⁷?) ^etWa *"^°° (¹^' schwach alkalisches Wasser)

6) Isoelektrischer Punkt: etwa 6,3» bestimmt nach der isoelektrischen Pokussiermethode (Acta Chimica Scandinavica 20 (I966).820)o

7) Ultraviolettabsorption:

Eine 0,5$ige lösung in 0,1-molarem Natriumchlorid ergibt ein Absorptionsmaximum bei 283 mti ein Absorptionsminimum bei 267 mu eine Schulter bei 288 bis 291 mu (Fig.1).

8) Infrarotabsorption (Fig.2):

Die bedeutsamen Absorptionsbanden in der KBr-Scheibe liegen wie folgt (Wellenzahlen in cm"¹): 3280, 3070, 2960, 1670, 1640, 1530, 1400, 1240, 1160.

9) Bestandteile;

Bei Hydrolyse in 100 Raumteilen 6N-HC1 bei 105°C für

309832/1170

24 Stunden ergeben die Kristalle die folgenden Aminosäuren: Alanin, Valin, Glycin, Threonin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, leucin, Phenylalanin, Arginin, Prolin, Serin, Cystin (Cysteinsäure), Lysin, Tyrosin, Histidin und Methionin. Isoleucin ist nicht nachweisbar. Da Tryptophan unter diesen Bedingungen zersetzt wird, wurde es durch UV-Absorption nachgewiesen (Biochemical Journal 4-0 (1946) 628). Die übrigen Aminosäuren wurden mit einem Aminosäure-Analysator quantitativ analysierte Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 als Durchschnitt von drei Bestimmungen angegeben.

Tabelle 2

Aminosäure - Gehalt in Gew. -ja

Lysin 3,31 + 0,20

Histidin 2,37+0,14

Arginin 6,72 + 0,40

Asparaginsäure 10,55 + 0,76

Threonin 9,57 + 0,56

Serin 3,75 + 0,22

Glutaminsäure *"" 8,14 + 1,12

Prolin 4,45 + 0,92

Glycin 5,73 + 0,36

Alanin 9,78+1,08

Halb-Cystin 3,53+0,20

Valin 10,52 + 1,04

Methionin 2,27 +0,14

Leucin 7,14 + 0,98

Tyrosin 4,22 + 0,24

Phenylalanin . 6,34 + 0,36

Tryptophan 1,61 + 0,10

10) Farbreaktion:

Hypochloritreagenz: positiv
Folin-Ciocalteu-Reagens: positiv

309832/1170

11) Löslichkeit: ■

Löslich in Wasser und wässrigem Ammoniak, wenig löslich in Pyridin, jedoch nur- schwer löslich in Eisessig, Alkoholen, Aceton, Chloroform, Äther, Hexan und anderen organischen Lösungsmitteln. In wässriger Lösung wird Plasminostreptin durch Ammoniumsulfat bei 60#iger Sättigung fast vollständig ausgefällt, und seine Löslichkeit fällt in der Nahe von p_H 6«,

12) Stabilität:

Mehr als 50$ der ursprünglichen Aktivität bleibt auch nach halbstündiger Behandlung bei Pu-4 bis 9 und bei 100 C er- · halten.

13) Dialyseverhalten:

Bei Auflösung in Wasser (p^ 8,0) in einer Konzentration von 10 mg/ml und Dialyse in einem Zellglasbeutel (Cellophan) gegen das gleiche V/asservolumen (p^ 8,0) bei 4⁰C für 24 Stunden unter Rühren bleibt fast die gesamte Aktivität in der inneren Lösung„

iiie physikalischen und chemischen Eigenschaften von Plasminostreptinkristallen wurden vorstehend genannt,, Nachstehend wird auf die Aktivität von Plasminostreptin als Proteaseinhibitor ausführlich eingegangen. Nachstehend werden die Materialien und Methoden genannt, die zur Bestimmung der Aktivität von Plasminostreptin als Proteaseinhibitor angewandt wurden.

1) Proteasen

a) Plasmin-SK: Die von menschlichem Blutplasma erhaltene Euglobolinfraktion wird im nachstehend genannten Puffer (a) gelöst und dann mit Streptokinase (Lederle) aktiviert (Annual Report of Takeda Research Laboratories 28 (1969) 140).

b) Plasmin-UK (Midorijuji, mit Urokinase aktiviertes^ Plasmin)

3 09832/1170

c) Trypsin (Sigma, kristallin, Typ III)

d) Fusariuin - kristalline alkalische Protease (USA-Patent

3 652 399)

e) Nagarse (kristalline Protease, Nagase Sangyo)

f) Thrombin (Mochida)

2) Substrate

a) Fibrinogen (Armour, Rinderplasma, Fraktion l)

b) Casein (Merck, Hammarsten-Casein)

3) Puffer

a) 0,02-molarer Tris-HCl-Puffer - 0,145-molares Natriumchlorid (p_H 7,4)

b) 0,02-molarer Tris-HCl-Puffer (p_fi 7,4)

C.) 0,1-molarer Glycin-NaOH-Puffer (p_H 10,5)

4) Analysenmethoden

a) Plasmin-Fibrin-System (Fibrinplattenmethode):

In eine Petrischale (9 cm Durchmesser) werden 10 ml einer Fibrinogenlösung (1$ig, Puffer (a)) gegeben und : durch Zusatz von 0,2 ml Thrombin (50 J.P.-Einheiten (Japanese Pharmacopeia-Einheiten)/ml, 0,145-molares Natriumchlorid) gelierte Das Gel wird zur Bildung einer Fibrinplatte 30 Minuten bei 30⁰C gehalten. Inzwischen v/erden Papierscheiben (8 mm Durchmesser, V/asseraufsaugevermögen 0,025 ml) in Plasminostreptinlösungen unterschiedlicher Konzentration getaucht und auf Filterpapier der Trocknung an der Luft überlassen.

Dann v/erden 0,015 ml einer Plasmin-SK-Lösung auf jede Papierscheibe getropft, die auf die vorstehend genannte Fibrinplatte gelegt wird. Nach Stehenlassen des Systems für 5 bis 10 Stunden bei 37⁰C wird die Bildung der Lysiszone bewertete Die Aktivität von Plasminostreptin als Plasmin-Inhibitor wird als Konzentration der Plasminostreptinlösung angegeben, die für vollständige Hemmung der Fibrinolyse erforderlich ist„

3 0 9 8 3 2/1170

b) Plasmin-Fibrin-System (Bestimmung der Auflösungszeit von Gerinnseln): In ein kleines Reagensglas werden 0,4 nil einer Fibrinogenlösung (0,25$>ig, Puffer (a)), 0,3 rrl Puffer (a) und 0,1 ml Plasminostreptinlösung unterschiedlicher Konzentration gegossen, worauf 0,1 ml Plasmin-UK-Lösung (0,8 Caseineinheiten/ml, Puffer (a)) zugesetzt wird. Der Inhalt wird gut gemischt, und unmittelbar anschließend werden 0,1 ml einer Thrornbinlösung (50 J.Po-Einheiten/ml, 0,145-molares Natriumchlorid) zugesetzt. Das hierbei gebildete Gel wird bei 37°C stehen gelassen, und die zur Auflösung des Gerinnsels erforderliche Zeit wird gemessen. Die plasminhemmende Aktivität von Plasminostreptin wird nach der in Biochimica Biophysica Acta 214 (1970) 411 beschriebenen Methode bestimmt. Hierbei wird die Plasminostreptinmenge, die für eine im Reaktionsgemisch stattfindende 50$ige Inhibition der Aktivität von 0,08 Caseineinheiten von Plasmin-UK erforderlich ist, aus der Plasminostreptinkonzentration bestimmt, die die-. Lysiszeit des Gerinnsels in Abwesenheit von Plasminostreptin verdoppelt. Diese Menge wird in ID(-₀-Einheiten angegeben.

c) Plasmin-Casein-System

In ein Reagensglas werden 1 ml Caseinlösung (4$ig, Puffer (b)), 0,5 ml Puffer (b) und 0,3 ml einer Plasminostreptinlösung unterschiedlicher Konzentration gegossen, worauf 0,2 ml Plasmin-UK-Lösung (2 Caseineinheiten/ral, Puffer (b)) zugesetzt werden. Die Bestandteile werden gut gemischt und 20 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Die Reaktion wird durch Zusatz von 2 ml 1,7-molarer Perchlorsäure abgebrochen, worauf das Gemisch eine weitere Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen wird. Das Reaktionsgemisch wird durch Filterpapier filtriert und die Extinktion des erhaltenen Filtrats bei 280 ma gemessen.

309832/1 170

Die plasminhemmende Aktivität von Plasminostreptin wird wie folgt "bestimmt und angegeben: Bestimmt wird die Plasminostreptinmenge, die für eine 5O$ige Inhibition der Aktivität erforderlich ist, die 0,4 Gaseineinheiten von Plasmin-UK in Abwesenheit von Plasminostreptin haben» Das Ergebnis wird in IDj-Q-Einheiten angegeben.

d) Trypsin-Casein-System ·

In ein Reagensglas werden 1 ml Caseinlösung (2$ig, Puffer (b)), 0,5 ml Puffer.(b) und 0,3 ml Plasminostreptinlösung unterschiedlicher Konzentration gegossen. Nach Zugabe von 0,2 ml einer Trypsinlösung (50 jug/ml, Puffer (b)) werden die Bestandteile gut gemischt und unter den gleichen Bedingungen, wie sie für das Plasmin-Casein-System genannt wurden, stehen gelassen« Anschließend wird ebenfalls in der oben beschriebenen Weise die Plasminostreptinmenge bestimmt, die für eine 5O^ige Inhibition der Aktivität, die 10 yag Trypsin in Abwesenheit von Plasminostreptin haben, erforderlich ist. Diese Menge wird in ID^-Einheiten angegeben.

e) System alkalische Fusariumprotease-Casein und Nagarse-Oasein-System

In ein Reagensglas werden 1 ml einer Caseinlösung Puffer (c)), 0,5 ml Puffer (c) und 0,4 ml einer Piasminostreptinlösung von unterschiedlicher Konzentration gegossen. Nach Zusatz von 0,1 ml einer Lösung von alkalischer Fusarium-Protease (40 ug/ml, Puffer (c)) oder Nagarse-Lösung (100 ug/ml, Puffer (c)) werden die Bestandteile gut gemischt und unter den gleichen Bedingungen, die vorstehend für das Plasmin-Casein-System genannt wurden, stehen gelassen. Anschließend wird ebenfalls in der vorstehend beschriebenen Weise die Plasminostreptinmenge bestimmt, die für eine 50^c/oige Inhibition der Aktivität, die 4 ng alkalische Fusarium-Protease und 10 ug Nagarse in Abwesenheit von Plasminostreptin haben, erforderlich ist, und in IDcQ-Einheiten

3098 32/1170

angegeben,

Die in der vorstehend beschriebenen Weise bestimmten Aktivitäten von Plasminostreptin als Inhibitor von Plasmin, Trypsin und alkalischen Proteasen sind nachstehend in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3
Proteäse-Substrat Aktivität al3 Protease-Inhibitor

Konzentration für vollständige Inhibition, ug/ml /

Plasmin-Pibrin <C30

(Fibrinplatte)

Plasmin-Fibrin

(Auflösungszeit des

Gerinnsels) < 10

Pläsmin-Casein <ü 10

Trypsin-Casein ' < 5

Alkalische Fusarium-

Protease-Casein <C 6

Fagarse-Casein < 5

Die Inhibition der Aktivität von Kallikrein (Bayer, Depot-Padutin) durch Plasminostreptin kann kaum nachgewiesen werden. Beispielsweise wurde eine 50$ige Hemmung der Esteraseaktivität von 0,8 biologischen Einheiten von Kallikrein gegen Benzoylargininäthylester mit weniger als 800 ag Plasminostreptin nicht erreicht.

Yon 5 Ratten (männlich, SD, 7 Wochen alt) wurden Blutproben vor der Verabreichung von Plasminostreptin sowie eine Stunde nach intravenöser Verabreichung von 0,8 mg Plasminostreptin entnommen. Das Plasma wird von den Blutproben abgetrennt, worauf die vorstehend genannte Plasmin-ÜK-Lösung jeder Plasmaprobe bis zu verschiedenen Konzentrationen zugesetzt wird»

Unmittelbar anschließend wird die Aktivität von Plasmin in jeder Plasmaprobe unter Verwendung von Gasein als

3 0 9 8 3 2/1170

Substrat bestimmt. Die Piasminaktivität der Blutplasmaproben jeder Ratte vor und nach der Verabreichung von Plasminostreptin wird verglichen. .Dieser Vergleich zeigt, daß die Plssninaktivität durch die Verabreichung von Plasminostreptin stark gehemmt wird. Der Grad der Inhibition der Piasminaktivität, gemessen nach Zugabe von 100 Caseineinheiten von Plasmin-UK pro ml Plasma,beträgt 3 bis 35$ (durchschnittlich 18$).

Die Toxizität von Plasminostreptin ist äußerst gering. Die durch Tests auf akute Toxizität bei der Maus bestimmten LDp-Q-Werte betragen mehr als 5 g/kg oral, mehr als 5 g/kg intraperitoneal und 2 bis 3 g/kg intravenös»

Plasmirostreptin zeichnet sich aus durch seine hervorragende Fähigkeit zur Inhibition der proteolytischen Aktivität von Plasmin und Trypsin und seine vielseitige Anwendungsmöglichkeit in der Medizin, z.B. in der Prophylaxe und Therapie verschiedener Störungen der Bauchspeicheldrüse, bei Entzündungen, äußeren Verletzungen und Hämorrhagie auf Basis von Fibrinolysinämie, die insbesondere beispielsweise bei obstetrischen, urinologischen oder chirurgischen Operationen auftreten kann«.

Die Darreichungsart und die Dosierung bei medizinischen Anwendungen sind verschieden in Abhängigkeit von der Art der Krankheiten, der Schwere der Symptome usw. Im'allge^ meinen wird Plasminostreptin örtlich oder durch Infusion angewandt. Bei intravenöser "Infusion können etwa 5 mg bis 5 g pro Tag dem Erwachsenen für eine Zeit von einigen Tagen verabreicht werden.

Vorstehend wurden das Herstellungsverfahren, die physikalischen und chemischen Eigenschaften, die Aktivität als Proteaseinhibitor und die Anwendungen von Plasminostreptin beschrieben, das ein neuer Proteaseinhibitor ist, der erfolgreich von Kulturmedien von Stämmen der Gattung* Streptomyces, speziell Streptomyces antifibrinolyticus,

309832/ 1 170

von der Anmelderin isoliert, gereinigt und in kristalliner Form gewonnen wurde. Das Verfahren zur Herstellung dieses Inhibitors gemäß der Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben. In diesen Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Die Prozentsätze sind auf der Basis von Gewicht in Gramm pro 100 ml ausgedrückt»

Beispiel 1

Mit Streptomyces antifibrinolyticus Nr.10123 (IFO 13298), der 7 Tage bei 28⁰C auf einem Agarmedium (p_H 7,3), das 1$ Glucose, 0,1$ Hefeextrakt, 0,1$ Fleischextrakt, 0,2$ N-Z-Amin A (Sheffield) und 2$ Agar enthält, gezüchtet worden ist, werden 40 Raumteile eines flüssigen Mediums (P_H 7,0), das 1$ Glucose, 1$ Pepton, 0,7$ Fleischextrakt, 0,3$ Natriumchlorid und 0,2$ Kaliummonohydrogenphosphat enthält, in einem Kolben, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hat, geimpft. Das System wird 2 Tage auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C bebrütet. Die erhaltene Kultur wird in einen Fermenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hat und 500 Raumteile des flüssigen Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung enthält.

Das System wird unter Belüftung und unter Rühren 2 Tage bei 28 C bebrütet, wobei 500 Raumteile Kulturmedium erhalten werden ο Das Kulturmedium wird zur Impfung von 30000 Raumteilen des gleichen flüssigen Mediums, dessen Zusammensetzung vorstehend genannt wurde, in einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen verwendet. Dem .Fermenter werden 50 Gew.-Teile eines Schaumverbütungsmittels zugesetzt, worauf die Bebrütung .48 Stunden bei 28⁰C als Submerskultur durchgeführt wird. .·

Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium mit einer Filterpresse unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert, wobei 28000 Raumteile Filtrat erhalten werden. Diesem Filtrat wird kristallines Ammoniura-

309832/1170

sulfat bis zu 60$ Sättigung zugesetzt, worauf das Gemisch etwa 3 Stunden "bei Raumtemperatur gerührt wird. Die Fällung wird mit einer Filterpresse, abfiltriert, wobei wiederum Diatomeenerde (Hyflo Super CeI) als Filterhilfsmittel verwendet wird. Der Filterkuchen enthält das Filterhilfsmittel, Daher wird der Filterkuchen nach Zusatz von schwach alkalischem Wasser in einem Behälter gerührt und filtriert. Das Filtrat wird abgenommen und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Diese Behandlung wird wiederholt. Die Filtrate werden zusammengegossen (10000 Raumteile) und unter vermindertem Druck "bei 50 C auf 2000 Raumteile eingeengt. Das Konzentrat wird gegen fließendes Wasser unter Verwendung eines Zellglasbeutels (Cellophan) 2 'iiage dialysiert, Mach Entfernung des Ammo η i ums u If at s wird der Rückstand an einer Säule von DEAl-Cellulose adsorbiert» die vorher mit 0,5N-Salzsäure und 0,5N~-Natriumhydroxyd behandelt und dann mit Wasser gut gewaschen werden ist. Die Säule wird mit Wasser gut gewaschen, worauf die aktive Substanz mit 0,05-molarem Natriumchlorid eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und gefriergetrocknet, wobei ein weißes Pulver mit gelbem Stich erhalten wird. Dieses Pulver wird in destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule des Ionenaustauschers "Sephadex G-15" geleitet.

Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen, eingeengt und stehen gelassen, wobei sich weiße Kristalle abscheiden. Die Kristalle werden abfiltriert, und die Mutterlauge •wird zur Gewinnung weiterer Kristallmengen eingeengt« Die Kristalle werden zusammengegeben und in schwach alkalischem Wasser in einer Konzentration von 3 bis 5$ gelöst. Die Lösung wird auf einen p_H-Wert von etwa 6 eingestellt und dann bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei sich erneut weiße Kristalle abscheiden. Diese Kristalle werden abfiltriert, mehrmals mit destilliertem Wasser bei p„ β gewaschen und getrocknet. Hierbei werden 1,8 Gew,-Teile

0 9 8 3 2/1170

230A780

kristallines Plasminostreptin erhalten. Dieses kristalline Produkt ergibt bei der Elektrophorese auf Polyacrylamidgel eine einzelne Bande und zeigt bei der Ultrazentrifugen-Analyse ein einzelnes Maximum» Die zur vollständigen Inhibition der Fibrinolyse erforderliche Menge dieses Produkts beträgt 20 ug/ml, bestimmt nach der oben beschriebenen Fibrinplattenmethode. . ^;.

Beispiel 2

Mit Streptomyces antifibrinolyticus Nr₀15807 (IPO 13507), der 5 Tage bei 28⁰C auf einem Agarmedium (p_H 7,3), das 1$ Maltose, 0,1$ Hefeextrakt, 0, 1$ Fleischextrakt, 0,2$ JT-Z-Amin A (Sheffield) und 2$ Agar enthält, gezüchtet worden ist, werden 40 Raumteile eines flüssigen Nährmediums (p_H 7,0) geimpft, das 1$ Glucose, 1$ Pepton, 0,7$ Fleischextrakt, 0,3$ Natriumchlorid und 0,2$ Kaliummonohydrogenphosphat enthält und in einem Kolben mit einem Passungsvermögen von 200 Raumteilen enthalten ist. Das System wird auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 28⁰C bebrütet» Die erhaltene Kultur wird in einen Fermenter überführt, der ein Passungsvermögen von 2000 Raumteilen hat und 500 Raumteile des vorstehend genannten flüssigen Mediums enthält«

Der Fermenter wird unter Belüftung und Rühren 3 Tage bei 28⁰C bebrütet, wobei 5QO Raumteile Kulturmedium erhalten werden. Mit dem Kulturmedium wird ein Fermenter geimpft, der ein Passungsvermögen von 50000 Raumteilen hat und 30000 Raumteile des flüssigen Mediums der vorstehend genannten Zusammensetzung enthält« Nach Zusatz von 50 Gew,-Teilen eines Sohaumverhütungsmittels wird die Fermentation als Submerskultur 60 Stunden bei 28°C durchgeführt. Das Kulturmedium wird in einen Feritenter überführt, der ein Fassungsvermögen von 2 000 000 Raumteiler hat und 1 000 Raumteile des gleichen flüssigen Mediums enthält» Nach Zugabe von 500 £ew_a-Teilen des gleichen Schaumverhütungsmittels wird die Kultivierung 60 Stunden bei 28°G unter

309832/1 170

Belüftung und unter Rühren durchgeführt.

Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium mit einer Filterpresse unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert, wobei 980.000 Raumteile Filtrat erhalten werden» Dem Filtrat wird kristallines Ammoniumsulfat bis zu 60$ Sättigung zugesetzt, worauf das Gemisch etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird, Die gebildete Fällung wird mit einer Filterpresse unter Verwendung des Filterhilfsmittels "Hyflo Super CeI" abfiltrierto Dem Filterkuchen werden 50000 Raumteile Wasser unter Rühren zugesetzt. Das Geraisch wird filtriert. Diese Behandlung wird wiederholt. Die Filtrate werden zusammengegossen (IOO0QOO Raumteile)ο

Den vereinigten Filtraten wird kristallines Ammoniumsulfat bis zu 60$ Sättigung zugesetzt. Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen zweimal mit je 15.000 Raumteilen V/asser gewaschen und filtriert. Die Filtrate werden vereinigt und an einer Säule von 3000 Raumteilen DEAE-Cellulose chromatographiert, die vorher mit 0,5N-Salzsäure und 0,5N-Natriumhydroxyd behandelt und dann mit Wasser gut gewaschen worden ist. Die Säule wird mit IO0OOO Raumteilen Wasser gewaschen.

Zu 40.000 Raumteilen der Lösung aus vereinigtem Eluat und. Waschwasser wird kristallines Ammoniumsulfat bis zu 50$ Sättigung gegeben. Das Gemisch wird zur Abtrennung der gebildeten Fällung auf einem'Büchnertrichter filtriert. Die Fällung wird in 7000 Raumteilen 0,05-molarem Tris-HCl-Puffer (p_H 7,5) gelöst. Die ungelösten Stoffe werden abfiltriert. Das Filtrat wird zur Entsalzung durch eine Säule des Ionenaustauschers "Sephadex G-15" (siehe oben), der vorher mit dem vorstehend genannten Puffer gewaschen worden ist, geleitet« Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und durch eine vorher mit dem vorstehend genannten Puffer behandelte Säule von DEAE-Cellulose(I500 Raumteile) gegossen, wobei 25.000 Raurnteile Eluat erhal-

3098 "* 2/1170

ten werden. Zum Eluat wird kristallines Amino η i ums u If at Ms zu 5O^ Sättigung gegeben. Die gebildete Fällung wird durch Zentrifugieren abgetrennt und in 4000 Raumteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird zur Entsalzung durch eine Säule des Ionenaustauschers "Sephadex G-15" geleitet. Hierbei werden 6000 Raumteile aktive Fraktionen erhalten, die bei 5⁰C stehen gelassen werden, wobei ' 45 Gew.-Teile weiße Kristalle (Trockenbasis) erhalten werden, die in den physikalischen und chemischen Eigenschaften und in der Protease-Inhibitionsaktivität mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Plasminostreptin übereinstimmen O

Beispiel 3

Auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise wird Streptomyces antxfibrinolyticus Nr.21211 (IPO 13508) gezüchtet. Hierbei werden 950.000 Raumteile Kulturmedium erhalten, das auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise, jedoch unter Verwendung einer Säule von 5000 Raumteilen "Asmit 173 N" (Imacti) an Stelle der in Beispiel 2 verwendeten Säule von 3000 Raumteilen DEAE-CeIlulose gereinigt wird. Als Produkt werden 30 Gew_o-Teile Plasminostreptin in Form von weißen Kristallen erhalten.

309832/1170

Claims

Patentansprüche

)) Verfahren zur Herstellung des neuen Proteaseinhibitors "Plasmj.nostreptin", dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der Pla3ininostreptin in einem Nährmedium zu bilden vermag, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwerfbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet, "bis sich Plasminostreptin im Kulturmedium stark angehäuft hat, und das angehäufte Plasminostreptin aus dem Kulturmedium isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Streptomyces antifibrinolytieus verwendet wird. .
3) Plasminostreptin als neuer Proteaseinhibitor, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Molekulargewicht 26000 + 2000, bestimmt in 0,1-molarem Natriumchlorid nach der Ultrazentrifugenmethode von Archibald, und 25000 + 2000, bestimmt in 0,05-molarem Tris-HCl-Puffer-0,1-molarem Kaliumchlorid nach der Andrewschen Gelfiltrationsmethode;

b) durch TJltrazentrifugierung ermittelte Sedimentationskonstante (S₂₀» ^w)^: 2,5 + 0,3 S in 0,1-molarem Natriumchlorid und 1,2+0,3 S in 4-molarem Guanidinhydrochlorid;

c) Slementaranalyse: C 51,48 + 2,0$, H 6,96 + 0,5Jo, N 16,63 + 1,056, S 1,84 + O,5?6;

d) spezifische Drehung B-J^ etwa -90°(C=1, in schwach alkalischer Lösung);

e) Isoelektrischer Punkt etwa 6,3, bestimmt nach der isoolektrischen Eokussierungsmethode;

f) seine O,Oi$Lge Lösung in 0,1-molarem Natriumchlorid ergibt ein Absorptionsmaximum bei 283 mu, ein

3 0 9 8 3 2/1170

Absorptionsminimum bei 267 ιημ und eine Schulter bei 288 bis 291 πω;

g) bedeutsame Infrarotabsorptionsbanden bei folgender¹ V/ellenzahlen (cm"" ):
3280, 3070, 2960, 1670, 1640, 1530, HOO, 1240, 1160;

h) enthält Alanin, Valin, Glycin, Threonin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin, Phenylalanin, Arginin, Prolin, Serin, Cystin oder Cystein, Lysin, Tyrosin, Histidin, Methionin und Tryptophan und kein Isoleucin;

i) positive Farbreaktion mit Hypochloritreagenz und Folin-Ciocalteu-Reagens;

j) löslich in Wasser, wässrigem Ammoniak, wenig löslich in Pyridin, jedoch schwer löslich in Eisessig, Alkoholen, Aceton, Chloroform, Äther und Hexan; fast vollständige Ausfällung durch Ammoniumsulfat bei 60$iger Sättigung und abnehmende Löslichkeit in ^;-der Nähe von p_H 6;

k) mehr als 5O°/o seiner Anfangsaktivität bleibt nach halbstündiger Behandlung bei p_H 4 bis 9 und 100°C erhalten;

1) Dialysenverhalten: fast die gesamte Aktivität bleibt in der inneren Lösung, wenn es in Wasser (p_H 8,0) "in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und in einem Zellglasbeutel (Cellophan) gegen das 10-fache Wasservolumen (p_H 8,0) 24 Stunden bei 4⁰C dialysiert v/ird ο

309832/1170

Leerseite