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AR129714A1 - Edición de base diversificadora - Google Patents

Edición de base diversificadora

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AR129714A1
AR129714A1 ARP230101631A ARP230101631A AR129714A1 AR 129714 A1 AR129714 A1 AR 129714A1 AR P230101631 A ARP230101631 A AR P230101631A AR P230101631 A ARP230101631 A AR P230101631A AR 129714 A1 AR129714 A1 AR 129714A1
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AR
Argentina
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diversifying
cell
nucleic acid
base editor
base
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ARP230101631A
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Vleesschauwer David De
Frank Meulewaeter
Katelijn Dhalluin
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BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
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Abstract

Se refiere al campo del aumento de la diversidad genética de manera dirigida. En particular, a la provisión de métodos y medios para la diversificación de secuencias dirigidas, mediante el uso de editores de bases con un espectro de mutación ampliado, lo que incluye la provisión de sistemas de edición de base diversificadora Cas12a, y usos de estos. Reivindicación 1: Un método para la edición de base diversificadora dirigida de al menos un segmento de ácido nucleico diana, caracterizado porque comprende (a) proporcionar al menos una célula o constructo que comprende al menos un segmento de ácido nucleico diana; (b) introducir en la célula diana, o poner en contacto con el constructo diana; (i) al menos un editor de base diversificador (DBE), o al menos una molécula de ácido nucleico que lo codifica; y (ii) al menos un ARN guía adecuado o al menos una molécula de ácido nucleico que lo codifica; (c) permitir la formación de complejos de (i) el al menos un editor de base diversificador y (ii) el al menos un ARN guía adecuado; (d) obtener al menos una célula o constructo que comprende al menos un segmento de ácido nucleico diana modificado; en donde la eficiencia de edición de base total de introducir al menos una sustitución de cualquier tipo en el al menos un segmento de ácido nucleico diana es al menos 0,2%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, o al menos 25%, en donde el límite superior es 100% o menos; y/o en donde la al menos una modificación del segmento de ácido nucleico diana se produce en una ventana de edición de base ampliada; y en donde el método no comprende el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y/o un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal, y/o procesos para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos. y en donde el editor de base diversificador comprende una porción CRISPR-Cas originada a partir de una endonucleasa CRISPR-Cas de Clase 2 Tipo V. Reivindicación 2: El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el editor de base diversificador comprende una porción CRISPR-Cas que se originó a partir de una endonucleasa Cas12a. Reivindicación 3: El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la al menos una célula diana es una célula procariota, que incluye una célula bacteriana o una célula de arquea, o una célula eucariota, que incluye una célula de insecto, una célula de mamífero o una célula vegetal. Reivindicación 4: El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la al menos una célula diana es una célula vegetal, que incluye un protoplasto vegetal. Reivindicación 5: El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el al menos un editor de base diversificador comprende (i) una o más porciones de citosina deaminasa, (i) una o más porciones de adenina deaminasa, (iii) una o más porciones CRISPR-Cas, preferentemente en donde el dominio CRISPR-Cas no escinde ambas cadenas de ADN bicatenario, (iv) una, dos, tres o más secuencias de localización nuclear; y (v) al menos una región ligadora, preferentemente una o más regiones ligadoras entre (i) y (ii), y opcionalmente una o más regiones ligadoras entre (ii) y (iii). Reivindicación 6: El método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el al menos un editor de base diversificador de la etapa (b-i) es al menos un editor de base diversificador en forma de una proteína de fusión, preferentemente en donde las porciones (i), (ii) y (iii) como se define en la reivindicación 5 están dispuestas, en dirección del terminal N al terminal C, en el orden de (i) - (ii) - (iii) con una o más regiones ligadoras entre cada segmento, con mayor preferencia, en donde una, dos, tres o más secuencias de localización nuclear (iv) están ubicadas en el terminal C del editor de base diversificador, o en donde una o más secuencias de localización nuclear (iii) están ubicadas en el terminal N y una o más secuencias de localización nuclear (iii) están ubicadas en el terminal C del editor de base diversificador. Reivindicación 8: El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7, caracterizado porque las porciones de adenina deaminasa y/o las porciones de citosina deaminasa están ligadas a al menos una porción de proteína de unión a ssARN o dsARN, preferentemente en al menos una porción de proteína MS2, y el al menos un ARN guía adecuado está adaptado para permitir la interacción con la al menos una porción de proteína de unión a ssARN o dsARN, preferentemente en donde la una o más porciones editoras de bases de adenina y/o la una o más porciones editora de base de citosina están ligadas a al menos una porción de proteína MS2 y el ARN guía adecuado está adaptado para comprender dos tallosbucles de MS2, opcionalmente en donde el ARN guía adecuado comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID Nº 38 a SEQ ID Nº 41 o una secuencia que tiene al menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con esta. Reivindicación 15: El uso de al menos un editor de base diversificador o al menos un complejo de editor de base diversificador, o al menos una molécula de ácido nucleico que la codifica, de acuerdo con la reivindicación 11; o al menos un vector o constructo de expresión de acuerdo con la reivindicación 12; o al menos una célula de acuerdo con la reivindicación 13; o de al menos un kit de acuerdo con la reivindicación 14; para la evolución directa dirigida de al menos un segmento de ácido nucleico diana, preferentemente evolución directa dirigida en planta de al menos un segmento de ácido nucleico diana, que incluye un uso para optimizar o modificar un rasgo en una planta, que incluye la optimización o modificación de un rasgo relacionado con el rendimiento, o un rasgo relacionado a la resistencia a enfermedades o patógenos, en donde la causa de la enfermedad es, o el patógeno se selecciona de un virus, una bacteria, un hongo, un nematodo, o un insecto, o un rasgo relacionado a la resistencia de herbicidas, o un rasgo relacionado al estrés abiótico, que incluye un rasgo relacionado al estrés por sequía o salinidad, que incluye además un uso de identificación de al menos un gen principal.
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