NO811119L - Forbedrede baerere, samt fremgangsmaate ved fremstilling av disse og for aa uttrykke klonede gener - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbedrede vektorer, i det etterfølgende kalt bærere samt fremgangsmåte for fremstilling av slike bærere for å uttrykke klonede gener. Bærerne og metodene som er vist i det etterfølgende er særpreget ved det forbedrede uttrykk for klonede gener, spesielt de av eukaryotisk opprinnelse i prokaryotiske verter. Som det vil fremgå av det etterfølgende kan disse bærere og fremgangsmåter anvendes for å forbedre produksjonen av forskjellige polypeptider, proteiner og aminosyrer i vertsceller.

Produksjonsnivået for et protein i en vertscelle styres av tre hovedfaktorer: antall kopier av dets gener inne i cellen, effektiviteten med hvilken disse genekopier er transkribert og effektiviteten med hvilken den resulterende overbringende RNA ("mRNA") oversettes. Effektiviteten av transkripsjonen og oversettelsen (som sammen utgjør uttrykk (expression)) er på sin side avhengig av nukleotidsekvensen som normalt fore-finnes foran den ønskede kodesekvens. Disse nukleotidsekvenser eller uttrykkskontrollsekvenser definerer bl.a. plasser-ingen ved hvilken RNA-polymerase innvirker (promotorsekvens-en) for å initiere transkripsjon og hvor ribosomer tilknytt-es og samvirker med mRNA (produktet av transkripsjon) for å initiere oversettelse.

Ikke alle slike ekspresjonskontrollsekvenser virker med lik effektivitet. Det er således ofte en fordel å separere de spesifikke kodesekvenser for et ønsket protein fra dets til-støtende nukleotidsekvenser og isteden sammensmelte den med andre ekspresjonskontrollsekvenser for å favorisere høyere ekspresjonsnivåer.. Dette er oppnådd og det nylig "kontruer-te" DNA-fragment kan innføres i "higher copy number" plasmid eller et bakteriofagderivat for å forøke antall genekopier inne i cellen og derved ytterligere forbedre utbyttet av uttrykt protein.

Fordi overproduksjon av selv normalt ikke-toksiske geneprodukter kan være skadelig for vertsceller og føre til nedsatt stabilitet for spesielle vertsbærer (host-vector)-systemer, bør en god uttrykkskontrollsekvens, i tillegg til å forbedre effektiviteten av transkripsjonen og oversettelsen av de klonede gener være kontrollerbar for å kunne kontrollere ekspresjonen under bakterievéksten. F.eks. er de foretrukk-ede ekspresjonskontrollsekvenser de som kan slås av for å muliggjøre at vertscellene formerer seg uten overdreven oppbygning av geneprodukter og deretter kan slås på for å fremme uttrykket, for store mengder av de ønskede protein-produkter.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser som tilfredsstiller noen av de' ovenfor gitte kriteria er anvendt for å forbedre uttrykket for proteiner og polypeptider i bakterieverter. Disse innbefatter f.eks. operatøren, promotoren og.ribosom-binding og innvirkningssekvenser på laktoseoperonet for E. coli (f.eks., K. Itakura et al., "Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science, 198, sidene 1056-63 (1977); D.V. Goeddel et al., "Expression In Escherichia.coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76. sidene 106-10 (1979)), de tilsvarende sekvenser for tryptophan syntetasesystemet hos E. coli (J.S. Emtage et al., "Influenza Antigenic Determinants Are Expressed From Haemagglutinin Genes Cloned In Escherichia coli", Nature, 283, sidene 171-74 (1980); J.A. Martial et al., "Human Growth Hormone: Complementary DNA Cloning And Expression In Bacteria", Science, 205, sidene 602-06 (1979)) og hoved-operator- og promotorområdene for fag A (H. Bernard et al., "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote Gene Expression From The Bacteriophage Lambda P Promoter", Gene, 5 sidene 59-76 (1979)). Foreliggende oppfinnelse vedrører den siste av disse ekspresjonskontrollsekvenser.

Bakteriofag X inneholder tre hovedpromotorer, nemlig P , P og<p>,R*Et repressorprotein, produktet av faggenet cl er kjent for å kontrollere aktiviteten av promotorene P ij og P R. Disse repressorer binder seg til de respektive operatorregi-oner, nemlig 0 Li og 0 R, for disse promotorer og blokkerer initiering av transkripsjon fra den tilsvarende promotor. Ytterligere som følge av dets selvregulerende syntesevirkning

(M. Ptashne et al., "Autoregulation And Function Of A Repressor In Bacteriophage X", Science, 194, sidene 156-61

(1976)), vil en kopi av cl-genet på dette kromosom av en lysogenisk stamme være i stand til fullt å undertrykke P^-ellér P -promotorene som er tilstede i et flerekopiplasmid (infra). Det bør bemerkes at i systemer som innbefatter lac-promotoren er undertrykkelse av promotoren under ikke-induserte betingelser kun partiell (K. Itakura et al., supra;

D. V. Goeddel et al., supra).

Kontrollen som utøves av repressoren over promotorene P og PR kan forandres ved modifikasjon av repressorproteinet eller dets gen. F.eks. er. det kjent en mutasjon hvor repressorproteinet er temperaturfølsomt. Når denne mutasjon anvendes kan promotorene aktiveres eller inaktiveres ved å variere kulturens temperatur og følgelig stabiliteten for repressoren.

Bakteriofag X kan også inneholde genene N og cro. N-genet er under PL-kontroll. Produktet av N-genet er kjent å ..virke som en anti-terminator i bakteriofag X. Anti-termi-nering er fordelaktig for å omgå transkriptterminering eller forsinkelse forårsaket som følge av tilstedeværelse av ter-mineringssekvenser, termineringslignende sekvenser eller transkriberingsforsinkende sekvenser i den spesielle DNA-sekvens som skal transkriberes. Ytterligere vil polaritets-effekter indusert ved tilstedeværelse av meningsløse codoner i promotortranskriptet avlastes av N-genproduktet (N. Franklin&Co. Yanofsky, "The N Protein Of X: Evidence Bearing On

Transcription Termination, Polarity And The Alteration Of

E. coli RNA Polymerase", i RNA Polymerase (Cold Spring Harbor Laboratory) sidene 693-706 (1976)).

Produktet av cro-genet transkribert fra P R-promotoren er kjent å være en sekundær repressor for begge promotorer P og P„ (J. Pero, "Deletion Mapping Of The Site Of The tof Gene Product", i The Bacteriophage X, (Cold Spring Harbor Laboratory), sidene 549-608 (1971); H. Echols, "Role Of The cro Gene In Bacteriophage XDevelopment", J. Mol. Biol., 80, sid ene 203-16 (1973); A. Johnson et al., "Mechanism Of Action Of The cro Protein Of Bacteriophage X" , Proe. Nati. Acad.

Sei. USA, 75, sidene 1783-87 (1978)). Fordi cro-genproduktet samproduseres sammen med de ønskede produkter av verts-vektorkombinasjonen vil cro-genprbduktets effekt på ekspress-sjonen fra P L - eller P R-promotorene ha en tendens til å til-ta med tiden. Derfor er de i ethvert system hvori varig høye ekspressjonsnivåer er ønsket nødvendig å utelate eller inaktivere cro-genet.

Effektiviteten av P Li-promotoren for ekspresjon av klonede gener er vist ved å innarbeide tryptofan (trp)-operonet av E. coli i fag X. (N. Franklin, "Altered Reading Of Genetic Signals Fused To The N Operon Of Bacteriophage X: Genetic Evidence For Modification Of Polymerase By The Protein Product Of The N Gene", J. Mol. Biol., 89, sidene 33-48 (1979); A. Hopkins et al., "Characterization Of X trp - Transducing Bacteriophages Made In Vitro", J. Mol. Biol., 107, sidene 549-69 (1976)). I denne modifiserte fag kan trp-genene transkriberes enten fra deres egen promotor eller fra P^-promotoren, P Li --overført ekspresjon er funnet å være 3-4 ganger høyere enn nivåene som erholdes fra den homologe trp-promotor.

Repressoreffekt på P Lj-overført ekspresjon ble også vist for modifiserte fag. F.eks. i fravær av repressoren var den P Li-kontrollerte ekspresjon for antranilate-syntetase (det førs-te enzym i trp-operonet) 11 ganger større enn den som ble funnet for enzymet under trp-påvirkning i fravær av trp-repressoren (J. Davison et al., "Quantitative Aspects Of Gene Expression In A X trp Fusion Operon", Molec. gen. Genet., 130, sidene 9-20 (1974)). Likevel i nærvær av et aktivt el-gen var den P -overførte ekspresjon nedsatt minst 900 ganger. Disse studier har også vist at fortsatt høyt nivå av P^-over-ført transkripsjon kun var mulig hvis cro-geriet ikke var virksomt i verten.

Problemet er at selv om de ovenfor beskrevne X trp-fager utviser anvendeligheten av PTL-<p>romotorerfor ekspresjon av inn skutte gener er anvendelse av slike fag noe begrenset på grunn av vanskeligheter med hensyn til kontruksjon og stabil vekst av cro -akseptorfag. Uten slike fag ville de observerte høye nivåer for ekspresjonen raskt falle når nivået for samfremstilte cro-genprodukter øker og undertrykker transkripsjonen fra PL~promotoren. Selv om ulempene ved X-fagene i en viss grad er overkommet.ved å klone X -kon-trollelementene på et autonomt repliserende plasmid så som Col EI eller dets derivater (J. Hedgpeth et al., "Lambda Phagé Promoter Used To Enhance Expression Of A Plasmid-Cloned Gene", Molec. gen. Genet., 163, sidene 197-203

(1978)) eller ved å konstruere mindre plasmider hvori kun inngår XP -systemet (H. Bernard et al., supra), disse sistnevnte vektorer er ufordelaktig belemret ved avstanden mellom tilgjengelige posisjoner for innføring av klonede gener og P -promotoren. F.eks. i vektorene beskrevet av H. Bernard et al., supra, er avstanden mellom posisjonene for geneinnføring og P -promotoren på vektoren i området 300 - 8600 baser. Ytterligere er de mere vanlig anvendte EcoRI og BamHI innføringsposisjonene i Bernard et al.'s vektorer ikke nærmere enn henholdsvis 600 - 1000 baser til P -promotoren. I tillegg kan effekten av N-genproduktet på transkripsjonen på de ønskede DNA-sekvenser ikke lett bestemmes i Bernard et al.'s vektorer fordi N-genproduktet er innkodet i selve plasmidet og er ikke av kromosomal opprinnelse. Sluttligen i tillegg til at det ikke finnes noe direkte bevis for at Bernards vektorer kan tilveiebringe høyere nivåer av proteinekspresjon så er det heller ikke an-tydet at disse vektorer fordelaktig kan anvendes i ekspresjonen av eukaryotiske genprodukter i prokaryotiske verter.

Foreliggende oppfinnelse løser de ovenfor nevnte problemer ved å tilveiebringe en forbedret vektor og metode for fremstilling av slike vektorer dg for å uttrykke klonede gener i vertsceller..

Mere spesielt er det i henhold til oppfinnelsen tilveiebrakt en vektor omfattende minst én DNA-sekvens omfattende minst én promotor og<g>n operator avledet fra bakteriofag, og som er særpreget ved minst én endonuklease-gjenkjenningsposisjon lokalisert mindre enn ca. 300 basepar fra den del av DNA-sekvensen som omfatter promotoren og operatoren.

Hovedpromotorene av fag A. i vektorene ifølge oppfinnelsen fremmer transkripsjon av DNA-sekvensene innført i disse vektorer. Fremgangsmåtene og vektorene ifølge oppfinnelsen er ytterligere særpreget ved tilstedeværelse av mange egnede gjenkjenningsposisjoner for innføring av ønskede DNA-sekvenser inn i vektorene nær den valgte promotor. Fortrinnsvis er avstanden mellom den valgte promotor og gjenkjenningsposisjonene mindre enn ca. 300 basepar og mere foretrukket mindre enn ca. 150 basepar. De foretrukne vektorer ifølge oppfinnelsen er også de hvori aktive N-gener og aktive cro-gener er fraværende. Derfor kan ved valg av passende vert, dvs. en inneholdende eller som mangler et aktivt kromosomalt N-gen, en hvilken som helst av vektorene ifølge oppfinnelsen anvendes for å uttrykke DNA-sekvenser i nærvær eller i fravær av N-genproduktet.

Det vil forstås av den etterfølgende beskrivelse at vektorer og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen muliggjør konstruksjon av vert-vektor-kombinasjoner som muliggjør forbedret ekspresjon av prokaryotiske ogeukaryotiske produkter i vertsceller. Figur 1 viser skjematisk et område av fag A<_>trp 44 cIAt2cro . Ikke alle begrensningsposisjonene er angitt. Avstanden er angitt i X-enheter slik som beskrevet av E. Szybalski & W. Szybalski, "A Comprehensive Molecular Map Of Bacteriophage Lambda", Gene, 7, sidene 217-70 (1979). Figur 2 indikerer skjematisk konstruksjonen av vektorene i henhold til oppfinnelsen, nemlig pPLa2, pPLa20 og pPLa23. Figur 3 viser skjematisk konstruksjonen av vektorer i henhold til.oppfinnelsen, pPLa2311, pPLa231 og pPLa8. Figur 4 viser skjematisk konstruksjonen av vektorer i henhold til oppfinnelsen, pPLa83, pPLa831, pPLa832, pPLc2,

pPLc23, pPLc236 og pPLc28-.

Figur 5 viser skjematisk konstruksjonen av vektorer ifølge oppfinnelsen, pPLc24.

Figur 6 viser nukleotidsekvensen for 0 PT-området av

LL

pPLa2311.

Figur 7 viser omdannelse av pstl-posisjonen i (3-laktamase . til en BamHI-posisjon. Figur 8 er en autoradiograf overvåket proteinsyntese ved 28°C og 42°C i E. coli K12AHI (pPLa23) og E. coli M5219 (pPLa23). Figur 9 er en autoradiograf overvåket proteinsyntese ved 28°C og 42°C i E. coli K12AHI (pPLa23trpA1) og E. coli K12AHI (pPLa23trpA2). Figur 10 er en autoradiograf overvåket proteinsyntese ved 28°C og 42°C i E. coli K12AHI (pPLc23trpA1). Figur 11 er en autoradiograf overvåket proteinsyntese ved 28°C og 42°C i E. coli K12AHI (pPLa231lR1). Figur 12 viser skjematisk konstruksjonen av pPLc28SV^_5 og pPLc28SVt5-37. Figur 13 viser konstruksjonen av pPLc28SVt5-37 fra pPLc28SVt5 på nukleotidnivå. Figur 14 viser autoradiografisk overvåkning av proteinsyntesen ved 28°C og 42°C av E. coli K12AHI (pPLc28SVt5-37-9) og immunopresipitering med serum fra en SV40-tumor-befengt hamster og proteiner syntetisert fra denne vert etter induk-' sjon ved 4 2°C sammenlignet med immunopresipitasjon av autentisk 1iten-t-antigen syntesisert i SV40-infiserte nyreceller fra afrikansk grønnape, med det samme antiserum.

For lettere å forstå oppfinnelsen skal denne forklares mere detaljert og i denne er bl.a. de følgende betegnelser anvendt:Nukleotid - En monomerenhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerrest (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig hetero-cyklisk base. Basen er forbundet til sukkerresten via gly-kosidkarbonet (1' karbonet i pentosen) og kombinasjoner av basen og sukkeret er et nukleosid. Basen erkarakterisertved nukleotidet. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og tymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA- sekvens - En lineær serie av nukleotider forbundet til hverandre via fosfordiesterbindinger mellom 3' og 5'-karbon-ene i tilstøtende pentoser.

Codon - En DNA-sekvens av tre nukleotider (en triplett) som koder via mRNA, en aminosyre, et oversettelsesstartsignal eller et oversettelsesavslutningssignal. F.eks., nukleotide-triplettene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG koder for amino-syren leucine ("Leu"), TAG, TAA og TGA er oversettelses-stoppsignaler og ATG er et oversettelsesstartsignal.

Polypeptid - En lineær serie av aminosyrer forbundet med hverandre ved peptidbindinger mellom a-amino- og karbok-sylsyregruppene i tilstøtende aminosyrer.

Strukturelt gen - En DNA-sekvens som koder via sitt mRNA

en sekvens av aminosyrer som er særpreget for et spesifikt polypeptid.

Transkripsjon - Prosessen for dannelse av mRNA fra et. strukturelt gen.

Translasjon eller overføring - Prosessen ved fremstilling

av et polypeptid fra mRNA.

Ekspresjon - Prosessen som et strukturelt gen undergår for å danne et polypeptid. Dette er en kombinasjon av transkripsjon og overføring.

Plasmid - En ikke-kromosom dobbeltbunnet DNA-sekvens omfattende en intakt "replicon" slik at plasmidet dubliseres i vertscellen. Når plasmidet er plassert inne i en encelle-organisme vil organismens egenskaper forandres eller omdannes som følge av plasmidets DNA. F.eks. et plasmid som bærer et gen for tetracyklinresistens (Tet ) danner en celle som tidligere var følsom for tetracyklin til en som er resistent mot tetracyklin. En celle omdannet av et plasmid kalles en "transformant".

Fag eller bakteriofag - Bakteriell virus hvorav mange innbefatter DNA-sekvenser innkapslet i en proteinomhylling eller et proteinbelegg ("capsid").

Klonebærer . eller vektor - Et plasmid, fag DNA eller andre DNA-sekvenser som er i stand til å duplisere seg i en vertscelle og er særpreget ved en eller et lite antall endonuklease-gjenkjenningsposisjoner eller begrensningsposisjoner, i hvilke slike DNA-sekvenser kan trenge inn på en bestembar måte uten at det oppstår tap av DNA<1>s nødvendige biologiske funk-sjon, dvs. duplisering, produksjon av dekkende proteiner eller tap av promotor eller bindingsposisjoner, og som inneholder en markør som er egnet for anvendelse ved identifika-sjon av omdannede celler, eksempelvis tetracyklinresistens eller ampicillinresistens.

Kloning - Prosessen for å erholde en populasjon av organis-mer eller DNA-sekvenser avledet fra en slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon.

Rekombinant DNA- molekyl eller hybrid- DNA - Et molekyl som består av segmenter av DNA fra forskjellige genomer (hele DNA i en celle eller en virus) som er forenet ende-til-ende uten-for levende celler og som har evnen til å infisere visse vertsceller og bibeholdes deri.

Ekspresjonskontrollsekvens - En sekvens av nukleotider som kontrollerer ekspresjonen for gener som er operativt forbundet til disse gener.

En hvilken som helst av det store antall tilgjengelige vertsceller kan anvendes i vert-vektorkombinasjonene ifølge oppfinnelsen. Valget av en spesiell vert er avhengig av et antall for fagmannen kjente faktorer.

Disse innbefatter eksempelvis forenlighet med den valgte vektor, toksisiteten for proteinene kodet av hybrid plasmidet, lettheten med hvilken det ønskede protein kan gjenvinnes, ekspresjonsegenskaper, biosikkerhet og omkostninger. En balanse mellom disse faktorer må finnes ut fra den forståel-se at ikke alle verter kan være like effektive med hensyn til ekspresjon av et spesielt rekombinant DNA-molekyl. Innen disse generelle retningslinjer kan nyttige verter innbefatte stammer av E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, samt andre basiller, gjærtyper og mugg, dyre- og planteverter så som dyre- (innbefattet menne-sker) eller planteceller i kulturer eller andre verter.

De foretrukne vertsceller ifølge oppfinnelsen er E. coli-stammene K12 cL ts AHI (K12 M72 lac am AtrrpEA2 Sm<R>(XcI857

N nN ,-AHI bio )) ("K12AHI") (H. Bernard et al., supra) og ambJ R supra)

M5219 (K12 M72 lac trp Sm (Acl857 AHI bio252)) ("M5219").

am am

(H. Greer, "The kil Gene Of Bacteriophage X", Virology, 66, sidene 589-604 (1975)), eller en hvilken som helst annen stamme som bærer enten et kromosomalt- eller plasmidkodet cl857 gen (eller dens ekvivalent).

Begge stammer bærer en mangelfull, ikke-fjernbar X-profag inneholdende et mutant cl-gen. Dette mutante gen koder for en temperaturfølsom repressor hvilket muliggjør transkripsjon fra P -promotoren og aktiveres ved justering av temp-eraturen, ved 28 C er repressoren aktiv og transkripsjon fra P L-promotoren undertrykkes men ved 42°C er repressoren in-aktivert og transkripsjon fra PL~promotoren settes på.

A HI utelatelsen av denne profag fjerner deler av cro-genet og alle andre gener lengre til høyre for cro i profaget (M. Castellazzi et al., "Isolation And Characterization OfDeletions In Bacteriophage A. Residing As Prophage In E. coliK12", Mol. gen. Genet., 117, sidene 211-18 (1972)).

Stamme M5219 inneholder i tillegg en bio252 utelatelse som fjerner alle gener til venstre for cIII innbefattende kil i profaget. Ytterliger ved temperaturinduksjon vil stammen M5219' uttrykke et funksjonelt N-gen-produkt fra et kromosomalt N-gen. Stamme K12AHI, har på den annen side to gule mutasjoner i N hvilket gjør den funksjonelt N-negativ.

Derfor muliggjør de to stammer eksperimentell igangsetning eller avbrytning av ekspresjonen fra P -promotoren. Ytter-L ligere valget av K12AHI eller M5219 muliggjør P L-overført transkripsjon og forløper i fravær eller nærvær av N-genproduktet. Og fordi hverken E. coli K12ÆHI eller E. coli M5219 uttrykker et funksjonelt cro-genprodukt, så unngås sekundær undertrykkelse av PT-overført ekspresjon.

KONSTRUKSJON AV FLERE UTFØRELSESFORMER AV VEKTORENE IFØLGE OPPFINNELSEN

Selv om det er flere velkjente kilder for fag Å-promotorer ble for de følgende illustrerende eksempler på konstruksjon av vektorer i henhold til oppfinnelsen valgt fag X trp. 44 cIAt2cro som en kilde for fag X-promotorer.

Genereringen av fag A. trp 4 4 cIAt2cro er beskrevet av N. Franklin, "The N Operon Of Lambda: Extent And Regulation As Observed In Fusions To The Tryptophan Operon Of Escherichia Coli", i The Bacteriophage X (Cold Spring Harbor Laborator-ies) , sidene 621-38 (1971). At^-mutasjonen i cl-genet gjør repressoren termolabil (M. Lieb, "Studies Of Heat-Inducible Lambda Bacteriophages. I. Order Of Genetic Sites And Pro-perties Of Mutant Prophages", J. Mol Biol., 16, sidene 149-63 (1966)). cro -mutasjonen forhindrer sekundær undertryk-ning av P -funksjonen. Det må naturligvis forstås at selv om det er mindre ønskelig for langtidsekspresjon kan det også anvendes cro<+->fager i vektorene ifølge oppfinnelsen. Den nevnte fag bærer også et funksjonelt N-gen og aktiv P -promotor. Denne fag gir 3- til 4-ganger høyere nivåer for trp-enzymekspresjonen enn det som gis av selve den homologe trp-promotor (N. Franklin, supra).

X.trp 44 cIAt2cro DNA ble fremstilt fra denne fag ved fenolekstraksjon fra CsCl-rensede fagpartikler. Strukturen av PL O Li-regionen av denne fag er vist i fig. 1.

p L -promotoren og tilstøtende operatorer (0 J_|) sammen med starten for N-gensekvensen er definert inne i en blokk av DNA, ca. 100 basepar lang, lokalisert ved ca. 73,4 % på X-kartet (fig.l) (T. Maniatis et al., "Recognition Sequences Of Repressor And Polymerase In Operators Of Bacteriophage Cell, 5, sidene 109-13 (1975); J. Dahlberg & F. Blattner, "Sequence Of Promoter-Operator Proximal Region Of The Major Leftward RNA Of Bacteriophage X", Nucleic Acids Res., 2, sidene 1441-58 (1975)). Likeledes er PR-promotoren og til-støtende operator (0_J sammen med starten for cro-gensekvensen definert inne i en blokk av DNA lokalisert ca. 76,6 % på X-kartet (fig. 1) (T. Maniatis et al., supra).

En hvilken som helst av de metoder for å isolere disse områder fra fag A. DNA kan anvendes for å fremstille kloner inneholdende de ønskede promotorsekvenser. F.eks. kan forskjellige kombinasjoner av begrensningsenzymer anvendes for å spalte de ønskede områder eller regioner fra fag \ DNA (fig. 1). Disse fragmenter kan da anvendes direkte for å fremstille kloner eller fragmentene kan ytterligere anvendes for å avkorte eller forlenge disse ved i og for seg kjente metoder, før kloning.

Etter fremstilling av det passende DNA-fragment kan det inn-føres i en hvilken som helst av de mange kloningsbærere eller vektorer. F.eks. kan nyttige kloningsbærere bestå av segmenter av 'kromosomale, ikke-kromosomale og syntetiske DNA-sekvenser, så som de forskjellige kjente derivater av SV40 og kjente bakterielle plasmider, eksempelvis plasmider fra E. coli innbefattende Col El, pCRl, pBR322, pMB9 og deres derivater, bredere vertsområde-plasmider, eksempelvis RP4 fag DNA'er', eksempelvis de mange derivater av fag \, andre DNA-fager, Filamenteous-enkeltbåndede DNA-fager, eksempelvis Ml3' og vektorer avledet fra kombinasjoner av plasmid og fag-DNA'er eller gjærplasmider så som 2 p plasmidet eller derivater derav.

Ytterligere, innen hver spesifikk kloningsbærer kan anvendes forskjellige posisjoner for innføring av fag X DNA-fragmentet. Disse posisjoner er vanligvis betegnet av det begrensnings-endonuklease som avkutter disse. F.eks. i pBR322 er det tilgjengelig forskjellige restriksjonsposisjoner for DNA-frag-mentinnføringen (F. Bolivar et al., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi—Purpose Cloning System", Gene, 2, sidene 95-113 (1977); J. G. Sutcliffe, "pBr322 Restriction Map Derived From the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Res., 5, sidene 2721-28 (1978)). Se også fig.

2 og 4..

Det må naturligvis forstås at en kloningsbærer som er nyttig ved foreliggende oppfinnelse ikke behøver å ha en restrik-s jonsposis jon for innføring av fag A. DNA-f ragmentet. I stedet kan bæreren forenes til fragmentet på andre måter for å gi den ønskede vektor i henhold til oppfinnelsen.

A. Vektorer i henhold til oppfinnelsen inneholder P^-promotorer anordnet i Anti-Clockwise orientering i forhold til originalen for repliseringen *

1. pPLa23

Under henvisning til fig. 2 ble en forbedret vektor ifølge oppfinnelsen, nemlig pPLa23 fremstilt i en rekke trinn. Disse er vist i fig. 2 og blir beskrevet nærmere i det etter-følgende.

(a) Mellomprodukt Plasmid pPLa2

Xtrp 44 cIAt2cro DNA som isolert ovenfor ble behandlet med BamHI og EcoRI for å avkutte et fragment som utstrekker seg fra ca. 71,3 % til 81,02 % på X-kartet (fig. 1 og 2).

På samme måte ble pBR322 behandlet med BamHI og EcoRI og

fag X DNA-fragmenter innskutt i stedet for det utkuttede EcoRI-BamHI pBR322-fragment (fig. 2).

Den resulterende vektor ble betegnet med pPLa2, idet "a" tjener til å indikere orienteringen mot klokken for P Ju-promotoren i forhold til originalen til kopien. X ""inf ova-sjonen på dette molekyl utstrekker seg fra BamHI-posisjonen av fagen (71,3 % X) til EcoRI-posisjonen (81,02 % X) og inn-

befatter genet N, 0TPT-området, genes rex og cl (mutant),

Li Li

O^P -området, genes cro (mutant) og ell og del av genet 0 (figurene 1 og 2).

E. coli C600 (CaCl2 kompetent) ble transformert med det ovenfor fremstilte pPLa2 under passende betingelser og fremgangsmåter. Transformantene ble utvalgt ved 34°C på LB-plater podet med 10 9 pfu av fag ^X .K _L o. JT mutant (M. Lieb, supra) og også inneholdende 100 pq/ ml karbenicillin. Det valgte

X DNA-fragment innbefatter cIAt2-genet og derfor vil transformanter inneholdende dette fragment være resistent ovenfor fag X. Kl , ar mutant ved 34°C. I tillegg vil det valgte pBR322-fragment innbefatte genet for amp.icillinresistens slik at verter transformert med plasmider inneholdende dette gen intakt vil vokse i en kultur inneholdende det nevnte antibiotikum for derved å ekskludere de verter som ikke er sådant transformert.

* Orienteringen av det opprinnelige segment er tatt som tilstedeværende i pBR322 slik som vanlig vist (Sutcliffe et al. supra).

Tjue transformanter ble utvalgt og kulturer dyrket ved 34°C

-2

i LB-medium inneholdende 100 ug/ml karbenicillin og 10 M MgC^- For å sikre at transformantene var virkelige transformanter inneholdende cl-genet og ikke sjeldne bakterier ute av stand til å absorbere A-fagen ble alikvote deler av

kulturene infisert med enten A., eller A . (F. Jacob &

klar vir

E. Wollman, "Etude Génétique d1 un Bacteriophage Tempere d<1>Escherichia Coli. I. Le Systéme Génétique du Bacteriophage X", Ann. Inst. Pasteur, 87, sidene 653-90 (1954)). Alle tjue transf ormantene utviste resistens mot A °<9>følsom-

het for A...

vir

Form I DNA fra en av disse tjue transformanter ble isolert under anvendelse av standard fremgangsmåter, begrenset med EcoRI og BamHI og størrelsebestemt mot standardmarkører. DNA'.et utviste to bånd tilsvarende de forventede størrelser for pBR322-f ragmentene og for fag A.-f ragmentet.

(b) Plasmid pPLa20 mellomprodukt, eliminering av Bglll-fragmenter fra pPLa2

A--området for pPLa2 innbefatter fire Bglll-posisjoner lokalisert ved henholdsvis 73,77, 78,80, 80,16 og 80,28 % A.

(figurene 1 og 2) (V. Pirotta, "Two Restriction Endonucleas--.; es From Bacillus Globigi;", Nucleic Acids Res.,. 3, sidene 1747-60 (1976); H. Szybalski & W. Szybalski, "A Comprehen-sice Molecular Map of Bacteriophage A,", Gene, 7, sidene 217-70 (1979)).

For å eliminere BglII-fragmentene mellom 73,77 % A. og 80,28 % A. ble pPLa2 DNA behandlet med Bglll, gjenforenet ved en DNA-konsentrasjon på mindre enn 1 pg/ml og omdannet til

E. coli W6 (A ) (CaCl^-kompetent) med en kromosomal A -undertrykker cl for å undertrykke P -avhengig transkripsjon (fig. 2). Karbenicillinresistente kloner ble utvalgt ved vekst i L-buljong inneholdende 100 ug/ml karbenicillin og undersøkt (screened) med hensyn til tap av A. -funksjonen under anvendelse av T4 . ril 638-mutant. X, rex-funksjonen forhindrer vekst av T^ril 638-mutanten (B. Howard, "Phage TL Mutants Deficient In ril Exclusion", Science, 158, sidene 1588-89 (1967)). Derfor vil manglende evne for disse Bglll-begrensede transformanter til å forhindre vekst av ril 638-mutanten sammenlignet med mangel på vekst av mutanten i verter transformert med pPLa2 vise at rex-funksjonen er eliminert fra det pPLa2-rekombinante DNA-molekyl ved BglII-fjerning.

Begrensningsanalyse av de rekombinante DNA-molekyler av disse Bglll-begrensede transformanter viser tilstedeværelsen av en enkelt Bglll-posisjon. Ytterligere vil behandling eller oppslutning med EcoRI og BamHI gi to fragmenter, nemlig et tilsvarende det forventede pBR322-fragment og et andre med den forventede størrelse (1900 basepar) for fag 71 DNA-fragmentet etter eliminering av delen mellom Bglll-posisjonene 73,77 % A. og 80, 28 % A. Dette modifiserte plasmid ble betegnet med pPLa20. Dets A. DNA-innskudd utstrekker seg fra BamHI-posisjonen (71,3 %) til Bglll-posisjonen (73,77 %) og fra Bglll-posisjonen (80,28 %) til EcoRI-posisjonen (81,02 %). Det innbefatter genet N, 0LPL-området og en del av genet 0 (fig. 1).

Selv om resten av dette eksempel ved konstruksjon av utfør-elsesform av vektorer ifølge oppfinnelsen er fokusert på P Li -promotoren, fordi P R-promotoren er eliminert fra pPLa2 med BglII-BglII-fragmentet, bør det forstås at tilsvarende manipulasjoner kunne ha vært anvendt for å eliminere PL~promotoren fra pPLa2 og for å konstruere en vektor hvori bibeholdes P -promotoren. I tillegg kunne vektorer ifølge oppfinnelsen også konstrueres på tilsvarende måte og som inne-

holder både P , og P R-promtorene tilstede, slik at de to pro-Li R

motorer vil virke i samme retning eller i motsatt retning med hensyn til å overføre ekspresjonen av de innskutte DNA-sekvenser.

(c) pPLa23 -- Innføring av en EcoRI-posisjon i en kort av-stand nedstrøms fra PT

, j-,

BglII-BamHI-fragmentet tilstede på pPLa20 inneholder en enkelt Haelll-posisjon [73,1 % A,, Fig. 1] lokalisert ca. 150 nukleotider nedstrøms fra P Li (B. Allet and R. Solem "Separa- tion And Analysis Of Promoter Sites In Bacteriophage A DNA By Specific Endonucieases" J. Mol. Biol. 85, 475-84 (1975)). Denne posisjonen kan omdannes til en EcoRI-posisjon ved glattendet (flush-end) sammenføying av en åpen Haelll- til en åpen EcoRI-ende tidligere "flush-ended" ved utstrekning av den fordypede 3'-ende med DNA-polymerase I i nærvær av deoksyribonukleosid-trifosfater (K. Backman et al. "Construction Of Plasmids Carrying The cl Gene Of Bacteriophage A." , Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73 sidene 4174-78 (1976)). Detaljer ved denne fremgangsmåte er beskrevet nedenfor og vist i fig. 2.

Seks pmol pBR322 ble behandlet med EcoRI. Etter varmeinaktivering av enzymet ble DNA presipitert og oppløst i 250 pl av en bufferinneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl?, 1 mM 3-merkaptoetanol, 2 uM av hver av de fire de-32 32 oksyribonukleosid-trifosfater med a- P-dATP (345 Ci P/mmol)) og 50 ug BSA/ml. Seks enheter DNA-polymerase I fra E. coli (Worthington) ble tilsatt og blandingen inkubert ved 16°C i 90 min. Denne prosess resulterte i "flush-ending" av den åpne 3' EcoRI-posisjon i den lineariserte pBR322.

Etter varmeinaktivering av enzymet ble blandingen justert til 50 mM NaCl, 7 mM 3-merkaptoetanol og DNA oppsluttet med BamHI. Fragmentene ble separert ved elektroforese på en

1,4 % agarosegel og forløper fullt ved autoradiografi. En gelskive inneholdende den største av de to fragmenter, nemlig pBR322 inneholdende en åpen BamHI-posisjon og en "flush ended" EcoRI-posisjon ble skåret ut og frosset ved -90°C. Dette agarosestykket ble deretter sentrifugert (SS34'rotor (Sorvall)) i 20 min. ved 20 000 omdr./min. Den utpressede supernantant ble fjernet og innfrysnings- og sentrifugerings-trinnene ble gjentatt ytterligere to ganger. Under disse betingelser ble 30 % av DNA<1>et inneholdt i agaroseskiven ut-støtt til supernantanten. Det utstøtte DNA ble presipitert fra de kombinerte supernantanter og oppløst i 10 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 7 mM 3-merkaptoetanol.

2 pmol pPLa20 ble oppsluttet med Bglll og BamHI og fragment ene separert på agarosegel. Det mindre fragment (Bglll-BamHI) ble eluert fra gelen som beskrevet ovenfor og oppsluttet med BspRI, en isoschizomer av Haelll (A. Kiss et al. "A New Sequence-Specific Endonuclease (Bsp) From Bacillus Sphaericus", Gene, 1, sidene 323-29 (1977)) til å gi en blanding av BamHI-BspRI og BspRI-BglII-fragmenter hvorav de sistnevnte bærer en P J_j-promotor. Enzymene Bglll og BamHI gir identiske åpne ender slik at en åpen Bglll-ende kan av-skjæres til en åpnet BamHI-ende og vice versa. Ytterligere er resultatet av hver avdeling ikke lenger et substrat for Bglll eller BamHI, men er gjenkjent av enzymet Sau3Al (Mbol)

(V. Pirotta, supra).

2 pmol av det ovenfor nevnte pBR322-EcoRI-BamHI-større fragment ble avskåret til 0,8 pmol av en blanding av BamHI-BspRI-og BspRI-BglII-fragmenter. Etter avdeling (den åpne BamHI-posisjon på pBR322-fragmentet er tilgjengelig for avskjæring til enten de åpne Bglll- eller BamHI-posisjoner i pPLa20-fragmentene og den "flush ended" EcoRI-posisjon av pBR322-fragmentet er tilgjengelig for avskjæring til BspRI (Haelll)-posisjonene i pPLa20-fragmentene), ble blandingen oppsluttet med BamHI for å eliminere de rekombinante molekyler omfattende det uønskede BamHI-BspRI-fragment innskutt i pBR322-vektoren. Den resulterende blanding ble transformert til

E. coli M5219 og transformanter utvalgt for resistens mot karbenicillin. I alt ble 23 transformanter erholdt og alle disse var følsomme for tetracyklin (også båret av pBR322) fordi BamHI-restriksjonen av pBR322 førte til at genet som koder for Tet R ikke lenger var intakt i det modifiserte plasmid (f ig.. 2) .

Den fortsatte tilstedeværelse i disse kloner av P j_j-bærende BspRI-BglII-fragment ble undersøkt ved å oppslutte DNA'et med HincII. Fordi pBR322 inneholder to HincII-posisjoner (J. Sutcliffe, supra) og det forventede XP i_J-fragment inneholder en enkelt HincII-posis jon (73,4 % A., fig.- 1) (B.Allet and R. Solem, supra) bør korrekt konstruerte rekombinante DNA-molekyler inneholde tre HincII-posisjoner. Av de 23 erholdte transformanter inneholdt 5 de tre forventede HincII-posisjoner. 3 av disse hadde en helt spesiell EcoRI-posisjon som indikerte at i disse 3 . kloner var den korrekte tilknytning mellom BspRI (Haelll)-posisjonen i pPLa20-fragmentet og den "flush ended" EcoRI-posisjon av pBR322-fragmentet erholdt. Disse tre kloner manglet også BamHI-posisjonen som forutsatt av den forventede avskjæring av Bglll-enden av pPLa20-fragmentet til BamHI-enden av pBR322-fragmentet. En av disse kloner ble utvalgt for ytterligere arbeide og betegnet pPLa23 (fig. 2).

pPLa23 består av et pBR322-fragment som utstrekker seg fra BamHI-posisjonen (basepar 377 av pBR322) til EcoRI-posisjonen (basepar 4362 i pBR322) (J. Sutcliffe, supra) (fig. 2). Den gjenværende del av pBR322 er erstattet i pPLa23 av fragmentet av X trp 44 cIAt,. cro DNA lokalisert mellom Haelll-posisjonen ved 73,3 %~A(nå en rekonstruert EcoRI-posis jon)

og Bglll-posisjonen ved 73,77 % X(nå en Sau3A-posisjon)

(fig. 2). Størrelsen av dette fragment ble bestemt ved agarosegel-elektroforese til å være ca. 300 basepar. Innen

dette fragment inneholdes 0TPT-området for de første 115

1jLi

nukleotider av N-gen-transkriptet (J. Dahlberg & F. Blattner supra). Retningen fra transkripsjonen av P -promotoren er fra Bglll-posisjonen mot Haelll-posisjonen og forløper i den samme retning som transkripsjonen fra 3-laktamase-promotoren i pBR322 (J. Dahlberg & F. Blattner, supra; J. Sutcliffe, supra).

2 trekk ved plasmidet er av spesiell interesse: 1) Områd-ene som koder for P Li-promotoren og for (3-laktamasegenet er tilstede i et enkelt HaeII-fragment avgrenset fra Haell-posisjonene ved basepar 2720 og 436 av pBR322 (fig. 3)

(J. Sutcliffe, supra; B. Allet and R. Solem, supra; V. Pirotta, supra). 2) Området for gjentagelse (replication) er lokalisert ved et 370 basepar HaeII-fragment tilstøtende til det 3-laktamasebærende HaeII-fragment (fig. 3). En funksjonell opprinnelse for gjentagelse (replication) krever at tilknytning rundt Haell-posisjonen ved posisjon 2720 bibeholdes (A. Oka et al. "Nucleotide Sequence Of Small Col El Deriva-tives. Structure Of The Regions Essential For Autonomous

Replication And Colicin El Immunity", Mol. gen. Genet., 172, sidene 151-59 (1979)). Disse trekk ved pPLa23 ble utnyttet for å innføre en andre antibiotikaresistent markør i vektoren.

2. pPLa23I og pPLa2311

Innføring av en Kanamycin- resistent markør i pPLa23

Dethenvises til fig. 3 hvori de anvendte trinn for fremstilling av andre vektorer ifølge oppfinnelsen fra pPLa23 er. in-, dikert. Disse trinn er beskrevet nærmere i det etterfølgen-de .

Et HaeII-fragment som koder for resistens mot kanamycin ble erholdt fra plasmid pMK20 (M. Kahn et al., "Plasmid Cloning Vehicles Derived From Plasmids ColEl, F, R6K and RK2", Methods in Enzymology, 68, sidene 268-80 (1979)). Opphavet for gjentagelse (replication) på plasmid pMK20 inneholdes i det vesentlige innen et 359 basepar HaeII-fragment. Imidlertid utstrekker opphavet seg også til tilknytningen mellom dette fragment og et tilstøtende HaeII-fragment (M. Kahn et al., supra). Nukleotidsekvensen rundt denne Haell-posisjonen er identisk med sekvensen funnet i pBR322 rundt Haell-posisjonen ved posisjon 2720 (A. Oka et al., supra; J. Sutcliffe, supra).

En blanding av pPLa23 og pMK20 ble oppsluttet fullstendig med Haell, gjenforenet og omdannet til E. coli M5219 (CaCl2_ kompetent) (fig. 3). Korrekt transformerte kolonier ble valgt på basis av deres resistens mot karbencillin og kanamycin fordi kun kloner inneholdende (3-laktamase-genet fra pBR322 og kanamycin-genet fra pMK20 vil utvise dobbelt antibiotisk resistens. 12 dobbeltresistente transformanter ble utvalgt. Plasmid DNA ble isolert fra disse transformanter som tidligere er angitt, og analysert ved Haell-begrensning og fragmentstørrelse-bestemmelse på 6 % akrylamidgel. 5

av disse kloner hadde kun 3 HaeII-fragmenter, nemlig et HaeII-fragment tilsvarende HaeII-fragmentet i pPLa23 som bærer P -promotoren og !3-laktamasegenet, et HaeII-f ragment tilsvarende HaeII-fragmentet av pMK20 som bærer et gen for

kanamycinresistens og et lite HaeII-fragment også avledet fra pMK20 og som er nødvendig for plasmidduplisering (replication) (fig. 3) .

5 utvalgte kloner ble ytterligere undersøkt for å bestemme orienteringen for det kanamycingeninneholdende Haell-fragment fra pMK20 med hensyn til den rekonstruerte EcoRI-posisjon i HaeII-fragmentet fra pPLa23. Det kanamycingeninneholdende HaeII-fragment fra pMK20 er kjent for å inneholde en unik asymmetrisk Hindlll-posisjon (M. Kahn et al., supra)

(fig. 3). Derfor tilveiebringer denne posisjon et middel for å bestemme orienteringen av fragmentet. 5 kloner ble oppsluttet med Hindlll og EcoRI og de resulterende fragmenter størrelsesbestemt som tidligere. 4 av de 5 kloner hadde den større andel av det Hindlll-spaltede kanamycingeninneholdende HaeII-fragment fra pMK20-tilstøtende det opprinnelig inneholdende mindre HaeII-f ragment. En klon hadde motsatt orientering. Disse to sett kloner ble tilfeldig betegnet henholdsvis pPLa231 og pPLa2311 (fig. 3).

pPLa2311 ble tilfeldig valgt fra de ovenfor konstruerte plasmider og nukleotidsekvensen for P -området bestemt.

Før sekvensbestemmelsé ble 2 sett restriksjonsfragmenter fremstilt fra pPLa2311, nemlig EcoRI-HincII-fragmentene og HincII-EcoRI-XhoI-fragmentene (ikke vist i fig. 3). I begge tilfeller ble pPLa2311 oppsluttet med det første begrens-ningsenzym og de resulterende fragmenter merket med 3 2P under anvendelse av polynukleotid Kinase (P-L Biochemicals) . Deretter ble fragmentene oppsluttet med det andre begrens-ningsenzym eller enzympar for tilfelle av EcoRI-XhoI og fragmentene separert på 6 % agarosegel. Sekvensbestemmelsen ble utført konvensjonelt under anvendelse av fremgangsmåten i henhold til A. Maxam & W. Gilbert, "A New Method For Sequenc-ing DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, sidene 560-64

(1977)-.

Nukleotidsekvensen for dette området er vist i fig. 6. Det utstrekker seg fra Haell-posisjonen i pBR322 til den rekonstruerte EcoRI-posisjon ved overgangen mellom fag X-fragmentet og pBR322. Den bestemte sekvens har de følgende egenskaper sammenlignet med de kjente sekvenser: (1.) nukleotidsekvensen for 0T PT -operator-promotorområdet er identisk med den for sekvensen i dette området ifagA_(T. Maniatis et al., supra); (2) sekvensen mellom Haell-posisjonen og Sau3A-posisjonen ved overgangen mellom Xfag-fragmentet og pBR322 er identisk med den for autentisk pBR322 (J. Sutcliffe, supra), (3) sekvensen for N-gentranskriptet er i overensstemmelse med sekvensen bestemt for mRNA-nivået av Dahlberg & Green-blatt (supra) bortsett fra utelatelsen av en adenosinrest ved posisjon 41 i transkriptet, og (4) sekvensen innbefatter ikke et overførbart startsignal for N-genet (N. Franklin & G. Bennett, "The N Protein Of Bacteriophage X, Defined By Its DNA Sequence, Is Highly Basic", Gene, 8, sidene 107-19 (1979)). 3. pPLa4 og pPLa8 -- Omdannelse av Pstl-posisjonen i (3-laktamasegenet for pPLa2311 til en BamHI- posisjon

Figurene 3 og 7 viser skjematisk omdannelsen av Pstl-posisjonen i (3-laktamasegenet for pPLa2311 til en BamHI-posisjon. Plasmid pPLa2311 ble linearisert med Pstl. Etter fenol- og kloroformekstraksjon ble DNA'et presipitert, gjenoppløst til en konsentrasjon på 50 pmol/ml i 25 mM NaCOOCH3(pH 4,5),

1 mM ZnCOOCH^, 125 mM NaCl og behandlet med Sl nuklease

(Sigma) i en mengde på 1,5 enheter pr. pmol'DNA i 9 0 min ved 25°C for å fjerne de 3'-utstikkende ender (fig. 7). Reak-sjonen ble avsluttet ved tilsetning av EDTA til en mengde på 5 mM. Sl-nukleasen ble fjernet ved inkubering av blandingen i nærvær av 0,2 % SDS i 10 min. ved 70°C etterfulgt av fenol- og kloroformekstraksjon. DNA ble presipitert ved tilsetning av 4 vol 2 M NH4COOCH3og 14 vol etanol.

Det gjenvunnede DNA ble butt-i-butt forenet (blunt-end lig-ated) til et 10-ganger molart overskudd av BamHI-tilknytnings-molekyler (linker molecules) (Collaborative Research Inc.)

(C. Bahl et al. "A General Method For Inserting Specific DNA Sequences Into Cloning Vehicles", Gene, 1, sidene 81-92

(1977)) (fig. 7). Etter spaltning med BamHI og gjenforening ved lav DNA-konsentrasjon (fig. 7) ble blandingen spaltet med Pstl for å utvelge (counter-select) de molekyler som hadde unnsluppet Sl-nukleasebehandlingen og som bibeholdt en intakt Pstl-posisjon. 2 ug av det behandlede DNA ble omdannet til E. coli M5219 og transformantene ble utvalgt ved kanamycinresistens. I alt 10 transformanter ble erholdt hvorav 2 manglet en Pstl-posisjon og som hadde erholdt en BamHI-posisjon. De rekombinante DNA-molekyler av de sistnevnte 2 transformanter ble betegnet pPLa8 og pPLa4 (fig. 3, hvori pPLa4 ikke er vist). Fragmentene erholdt etter kombinert EcoRI-BamHI-oppslutning av disse rekombinante DNA-molekyler av disse transformanter komigrerte på en 1,4 % 1ig agarosegel med fragmentene erholdt fra pPLa2311 etter EcoRI-Pstl-spaltning. Derfor var Pstl-posisjonen i pPLa2311 erstattet med en BamHI-posisjon.

Det henvises igjen til fig. 7 hvori effekten av

den ovenfor beskrevne sekvens av trinn på (3-laktamasegenet er indikert. Som vist i fig. 7 er sluttresultatet av konstruksjonen en utbytning av Ala-aminosyreresten ved posisjon 182 i (3-laktamaseproteinet med sekvensen Arg-Ile-Arg. Da. denne substitusjon vil la leserammen av 3-laktamasegenet for-bli intakt var det ventet at transformanter av de rekonstruerte kloner ville utvise resistens mot karbencillin. Uvent-et var imidlertid vertsceller transformert med pPLa4 og pPLa8 ikke resistente mot karbencillin.

4. pPLa83 -- Innføring av en BamHI-posisjon ved siden av EcoRI- posis jonen i pPLa8

Plasmid pAD3 (en gave fra H. Schaller) inneholder et 47 basepar-sekvensinnskudd i BamHI-posisjonen av pBR322. Denne sekvens består av de følgende enheter: BamHI-posisjon-EcoRI-posisj on-1aktoseoperator-EcoRI-posisjon-BamHI-posisjon. For å innføre denne sekvens i den rekonstruerte BamHI-posisjon i pPLa8 ble pPLa8 og et 10-gangers overskudd av pAD3 opp sluttet med BamHI, gjenforenet og transformert til E. coli W6 (A. ) (fig. 4). Transformanter ble utvalgt på plater

37 6 X

inneholdende et minimummedium, 50 ug/ml kanamycin, 0,1 % glukose, 40 pg/ml X gal (5-brom-5-klor-3-indolyl-|3-D-galak-tosid) (J. Miller, Experiments In Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) , side 48 (1972) ) , fordi tilstedeværelsen av X gal-fargen tillater påvisning av transformanter som inneholder et laktose-operatorfragment. I realiteten vil i dette medium laktose-operatorinneholdende transformanter være blå og kan derfor lett skjeldnes fra andre transformanter.

De rekombinante DNA-molekyler ble isolert fra en av de blå kolonier som tidligere angitt og oppsluttet med EcoRI. De resulterende 2 fragmenter komigrerte i det alt vesentlige på agarosegel med de 2 fragmentene erholdt ved EcoRI-BamHI-oppslutning av pPLaS, og underbygget således at det ønskede 47 baseparfragment fra pAD3 korrekt var innskutt i den rekonstruerte BamHI-posisjon i pPLa8. Dette plasmid ble betegnet ved pPLa83 (fig.. 4).

5. pPLa831— Bringe BamHI-posisjonen nærmere til P^-promotoren i pPLa8 3 L

For å bringe BamHI-posisjonen nærmere PL-promotoren i pPLa83 ble EcoRI-EcoRI-fragmentet fjernet ved oppslutning av pPLa83 med EcoRI og gjenforenet ved fortynnet DNA-konsentrasjon (fig. 4). Transformering av det resulterende rekombinante DNA-molekyl i E. coli W6 (LDV) og vekst på plater inneholdende et minimummedium supplert som tidligere angitt med X gal og kanamycin muliggjorde utvelgelse av de kloner som ikke lenger inneholdt laktoseoperatorområdet. Begrensning av DNA fra en valgt transformartt med BamHI-XhoI og en sammenligning ved migrering av de erholdte fragmenter med 2 fragmenter erholdt fra EcoRI-XhoI-oppslutning av pPLa8, konfirmerte som forventet at BamHI-posis jonen i det modifiserte plasmid var ca. 150 basepar fra PL-promotoren. Det modifiserte plasmid ble betegnet med pPLa831.

Det bør naturligvis forstås at manipulasjoner tilsvarende de som er beskrevet i hvilke som helst av kapitlene 3, 4 og 5 ovenfor kan avendes for å tilveiebringe andre endonuklease-gjenkjenningsposisjoner mindre enn 300 basispar fra den valgte promotor og operat rer i vektorene ifølge oppfinnelsen. Eksempler på slike manipulasjoner innbefatter de beskrevet

i det følgende. '

6. pPLa832 -- Innføring av en Hindlll-posisjon ved siden av BamHI- posis jonen i pPLa831

Plasmid pADl6 (en gave fra H. Schaller) inneholder et 36 baseparfragment innskutt i BamHI-posisjonen for pBR322, bestående av: BamHI-posisjonen-Hindlll-posisjonen-Hindlll-posisjonen-BamHI-posisjonen. For å innføre denne sekvens ved BamHI-posisjonen i pPLa831 ble pPLa831 og et 10-gangers overskudd av pAD33 spaltet med BamHI, gjenforenet og transformert til E. coli M5219 og utvalgt med hensyn til kanamycinresistens (fig. 4). Da det ikke er noen lett separasjons-metode for å bestemme riktig innføring av det ønskede BamHI-fragment inn i pPLa831 vil analyse av transformantene som vokste i nærvær av kanamycin være avhengig av begrensnings-spaltning av individuelle, tilfeldig valgte kloner. Av 32 analyserte kloner ble en funnet som ga 2 fragmenter etter spaltning med Hindlll (fig. 4). Størrelsen av disse fragmenter kunne ikke på en 1,4 % agarosegel skilles fra fragmenter erholdt etter BamHI-Hindlll-spaltning eller EcoRI-Hindlll-spaltning av pPLa831. Dette modifiserte plasmid ble betegnet med pPLa832.

B. Vektorer med PL-promotoren i "Clockwise" orientering med hensyn til originalen for dupliseringen (Origin Of Replication)

1. pPLc2 -- Kloning av PL~bærende fragment av pPLa832

En ekvimolar blanding' av pBR832 og pPLa832 ble spaltet medBamHI og deretter med Hindlll (fig. 4). Blandingen ble sammenføyet (religated) og omdannet til M5219 velgende for resistens mot karbenicillin. Da korrekt fremstilte rekom binante DNA-molekyler ifølge denne konstruksjon ikke lenger innbefatter et intakt gen for tetracyklin ble transformantene også undersøkt (screened) for tap av resistens mot tetracyklin. Det rekombinante DNA-molekyl ble isolert som tidr ligere fra utvalgte transformanter og analysert ved begrensning. Det valgte plasmid inneholdt en enkel Hindlll-posi^sjon. Kombinert Hindlll-BamHI-oppslutning ga 2 fragmenter som i det vesentlige komigrerte på agarosegel med de 2 fragmenter fremstilt ved en enkel EcoRI-oppslutning. Tilstedeværelsen av det P J_i-bærende fragment ble vist ved HincII-oppslutning. Dette enzym spaltet vektoren i 3 fragmenter hvis størrelse var i overensstemmelse med strukturen for fragmentene vist i fig. 4. Dette plasmid ble betegnet med pPLc2., idet "c" tjener til å indikere den "clockwise" orientering av P J_j-promotoren med hensyn til opprinnelsen for dupliseringen.

2.. pPLc23 -- Fjerning av en EcoRI- posis jon fra pPLc2

Plasmidet pPLc2 inneholder 2 EcoRI-posisjoner, en avledet fra opphavs pBR322-vektoren og en nær BamHI-posisjonen innført ved innskytning av HindIII-BamHI-fragmentene fra pPLa832 (fig. 4). EcoRI-posisjonen avledet fra pBR322 ble fjernet ved.å spalte pPLc2 med Hindlll og Xhol etterfulgt ved oppslutning med Bal31 i 30 min. ved 25°C i 0,6 M NaCl, 12,5 mM hver av CaCl2og MgS04, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 8,1). Eksonuklease Bal31 degraderer 3'- og 5'-endene på en trinnvis måte (H. Gray et al. "Extracellular Nucleases of Pseudomonas Bal31. I. Characterization Of Single Strand-Specific Deoxyriboendonuclease And Double-Strand Deoxyribo-exonuclease Activities", Nucleic Acids Res., 2, sidene 1459-92 (1975)).

Blandingen ble ekstrahert med fenol og kloroform, fortynnet til en DNA-konsentrasjon på 1 pg/ml og avdelt. Hvoretter DNA'et igjen ble spaltet med Xhol og Hindlll for å eliminere opphavs- (parental) plasmidmolekyler og omdannet til M5219 velgende for resistens mot karbenicillin. En transformant ble funnet som manglet en Hindlll- og en Xhol-posisjon. Dette plasmid inneholdt en enkelt EcoRI-posisjon og utviste 3 HincII-posisjoner (fig. 4). Denne sistnevnte egenskap be-krefter at PT-området fremdeles var tilstede. Dette plasmid ble betegnet med pPLc23.

For å bestemme nedbrytningsgraden av eksonuklease av Bal31-enzymet ble pPLc23 DNA spaltet samtidig med BamHI og Pstl og fragmentene størrelsebestemt på 1,4 % 1ig agarosegel. Sammenlignet med PstI-BamHI-fragmentet fra opphavs-pPLc2

så utviste Pstl-BamHI-fragmentet fra pPLc23 en fjernelse eller utelatelse på 800 basepar. Kombinert oppslutning med EcoRI-Pstl-Haell sammenlignet med EcoRI-Pstl-spaltning bekreftet at Haell-posisjonen ved overgangen mellom det P^-bærende fragment og kanamycinfragmentet var bibeholdt.

3. pPLc236 -- Innføring av en Hindlll- posisjon i pPLC23

Plasmid pPLc23 inneholder unike EcoRI- og':BamHI-posisjoner plassert ca. 150 nukleotider nedstrøms for P^-promotoren

(fig. 4). En Hindlll-innføringsposisjon ble innført i pPLc23 ved sammenbinding av BamHI-Hindlll-Hindlll-BamHI-fragmentet erholdt fra pPLa832 til BamHI-posisjonen i pPLc23. Transformanter ble erholdt i M5219 og siktet ved restriksjonsanalyse for tilstedeværelse av Hindlll-posisjonen. Strukturen for en representativ klon ble bekreftet ved agarosegelelektroforese av fragmentene erholdt etter Pstl-EcoRI, Pstl-BamHI eller Pstl-Hindlll oppslutning. Fragmentene erholdt etter hver av disse kombinerte oppslutninger komigrerte på en 1,4 % agarosegel hvilket viste at EcoRI-, BamHI- og Hindlll-posisjonene er lokalisert i en umiddelbar nærhet av hverandre. Dette plasmid ble betegnet pPLc236 (fig. 4).

Den større del av plasmidet pPLc236 er avledet fra pBR322 fra BamHI-posisjonen ved stilling 377 (J. Sutcliffe, supra) og opp til i det minste begynnelsen av 3-laktamasegenet rundt posisjon 4160 (J. Sutcliffe, supra). Den gjenværende del består av 1) sekvenser avledet fra en del av kanamycin-genet liggende mellom Xhol-posisjonen og en Haell-ende av dette fragment; 2) et HaeII-BamHI-fragment inneholdende P - promotoren og omfattende ca. 300 nukleotider og avledet fra pPLa832, 3) en sekvens som koder for BamHI-Hindlll-Hindlll-BamHI-posisjonene.

4. pPLc28 — Fjernelse fra pPLc236

En ball-posisjon (ikke vist i fig. 4) overlapper de to til-støtende Hindlll-posisjoner i pPLc236. Plasmidet inneholder også en unik PvuII-posisjon ved basispar 2067 i pBR322-delen (J. Sutcliffe, supra) (fig. 4). Enzymene Ball og PvuII danner begge glatte ender "flush ends". pPLc236 DNA blespaltet med Ball og PvuII og på ny sammenbundet ved lav DNA-konsentrasjon. Transformantene ble erholdt i M5219 velgende for resistens mot karbencillin. DNA av de respektive kloner ble analysert ved begrensning. BamHI-spaltning ga et enkelt fragment som på 1,4 %<1>ig agarosegel komigrerte med en større del av pPLc236 etter BamHI-PvuII-spaltning. Kombinert oppslutning med enten Pstl-EcoRI, Pstl-BamHI eller Pstl-Hindlll ga i hvert tilfelle 2 fragmenter, hvorav det minste i det vesentlige komigrerte på en 1,4 %'ig agarosegel med et Pstl-EcoRI-fragment erholdt fra pPLc236. Dette plasmid ble betegnet med pPLc28 (fig. 4).

pPLc28 kan på samme måte som de andre beskrevne plasmider i henhold til oppfinnelsen bearbeides ytterligere for å inn-føre andre begrensningsposisjoner. F.eks. et fragment med følgende innhold: Xba-begrensningsposisjon - Sal-begrensningsposisjon - Xba-begrensningsposisjon - Pst-begrensningsposisjon - Xba-begrensningsposisjon er utført i pPLc28 ved Hindlll-begrensningsposi-sjonen. Dette plasmid ble betegnet med pPLc2819. En annen tilsvarende manipulasjon ga et plasmid inneholdende fragmentet Pst-begrensningsposisjon - Sal-begrensningsposisjon - Xba-begrensningsposisjon - Sal-begrensningsposisjon - Xba-begrensningsposisjon innskutt ved BamHI-posisjonen av pPLc28. Dette plasmidet ble betegnet med pPLc2833.

5. pPLc24 -- Innføring av ribosombindings-posisjonen og aminoterminaldelen av bakteriofag MS2 replikase-protein i pPLc28

Et 4 31 basepar EcoRI-BamHI-fragment som koder for ribosom-bindingsposisjonen og de første 98 aminosyrerester i bakteriofag MS2 replikasegen ble erholdt fra plasmid pMS2-7 (R.Devos et al., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Full-Size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol., 128, sidene 595-619 (1979).). Dette fragment ble innført i plasmid pPLc28 og erstattet det opprinnelige EcoRI-BamHI-fragment i dette (fig. 5). Strukturen av det resulterende plasmid, betegnet pPLc24, ble bekreftet ved begrensningsanalyse med EcoRI-BamHI og størrelsesammen-ligning av de resulterende fragmenter med de erholdt etter EcoRI-BamHI-oppslutning av pMS2-7 og pPLc28. I pPLc24 for-løper oversettelse av MS2-replikaseprotein-fragmentet kolineært med transkripsjonen fra P -promotoren og er følgelig

under PT-kontroll.

J_J

BIOLOGISKE EGENSKAPER FOR VERTSCELLER TRANSFORMERT MED VEKTORER IFØLGE OPPFINNELSEN

1. Stabilitet ved 28°C

Stammene'K12AHI eller M5219 transformert med enhver av de ovenfor beskrevne vektorer ble dyrket ved 28°C i 20 genera-sjoner i LB-medium uten seleksjon for antibiotisk resistens-markør. Egnede fortynnede kulturer ble deretter påført plater ved 28°C enten i nærvær eller fravær av det ønskede antibiotikum. I alle tilfeller var antallet erholdte kolonier det samme uansett seleksjon for antibiotisk resistens, hvilket demonstrerte at vektorene var fullt ut stabile i disse verter ved 28°C (se tabell 1, infra).

Alle vektorer kunne også transformeres til en vertsstamme som var lysogen for bakteriofagX. Slike stammer hvor den inneholdende fag syntetiserte et "vilt" cl-produkt var levende (dyrkbar) ved forhøyet temperatur (37°C). I motsetning til dette kunne ikke ikke-lysogene verter omdannes med disse vektorer. I steden inneholdt de få transformanter som ble erholdt ved disse forsøk alltid vektorer med utelatelse som fjerner alt eller det meste av P .Li-området.

2. Oppførsel for celler inneholdende PL~vektorer etter forlenget induksjon ved 42°C

Effektiviteten ved vekst pa plater ved 42 oC av stammene K12AHI og M5219 transformerte med vektorer ifølge oppfinnelsen ble bestemt i nærvær eller fravær av antibiotikaselek-sjon.

Vektorer med P innført i "clockwise" orientering med hensyn til opphavet for dupliseringen (pPLc-type) oppførte seg på samme måte. Resultatene erholdt' med pPLc236 er angitt i den etterfølgende tabell I, inf ra. Stamme K12Z\HI transformert med pPLc236 vokste like bra ved 42°C som 28°C uansett hvor vidt antibiotisk seleksjon ble anvendt eller ikke. Stamme M5219 transformert med pPLc236 lot seg dyrke på ikke-selek-tive plater med en effektivitet på 1. Imidlertid når antibiotisk seleksjon ble anvendt falt dyrkningseffektiviteten minst 1000 ganger. Koloniene erholdt ved 42°C på ikke-selek-tive plater bar ikke resistens til den antibiotiske markør.

Vektorer med PjT _i innført i "anticlockwise" orientering i forhold til opphavet for dupliseringen (pPLa-type) utviste et

mere komplekst mønster ved koloniformasjon ved 4 2°C. Transformanter av stamme M5219 dannet ikke kolonier ved 42°C selv i fravær av antibiotisk seleksjon (effektiviteten ved kulti--3

vering på plater var mindre enn 10 , tabell I). Oppførsel-en for transformanter av stammen K12AHI ved 4 2°C var avhengig av den tilstedeværende vektors natur. F.eks. mens transformanter inneholdende pPLa832 alltid utviste minst 1000

gangers nedsettelse av plateveksteffektiviteten, så vel med som uten antibiotisk seleksjon så utviste transformanter inneholdende pPLa23 eller pPLa2311 plateveksteffektiviteter i området 1 til 10 _ 3, ofte med en utbredt heterogenitet i kolonistørrelsen.

Derfor forårsaker ekspresjonen for pPLa-type vektorer ved 4 2°C vil innvirke på vertens metabolisme og føre til at cellene ikke er i stand til å overleve ved denne høye temperatur, selv i fravær av seleksjon for plasmidet. Denne effekt er mest utpreget ved anvendelse av M5219-verter. På den motsatte side vil pPLc-type vektorer ikke innvirke direkte på vertscellens metabolisme fordi 100 % overlevelse av induserte celler i fravær av seleksjonspåvirkning er observert. Fortsatt transkribsjon fra PL~promotoren sammen med ekspresjonen for N-genet i M5219 kan imidlertid føre til inhibering av vektordupliseringen (replication) i M5219-stammer. Dette vises ved slike cellers manglende evne til å gro ved 4 2°C på selektivt virkende plater.

EKSPRESJON AV GENER I VEKTORENE IFØLGE OPPFINNELSEN

1..Generell prosedyre

Vektorene ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes for

å produsere et antall polypeptider og proteiner ved innfør-ing av DNA-sekvenser omfattende gener som koder for de ønskede polypeptider eller proteiner inn i vektorene ved en av endonuklease-gjenkjenningsposisjonene tilstøtende promotoren og operatoren, transformere passende verter med vektorene inneholdende disse innførte DNA-sekvenser, kultivere vertene og utvinne polypeptidene eller proteinproduktene. Eksempler på slike polypeptider og proteiner innbefatter leukocytt-interferon, insulin, antigener av hepatitt, antigener for munn- og klovsyke, fibroblastinterferon, humant veksthormon, immun interferon og et antall prokaryotiske, eukaryotiske og viralenzymer, hormoner, polypeptider, antigener og proteiner.

For å vise disse prosesser ble syntese av spesifikke genprodukter i vektorene ifølge oppfinnelsen fulgt eller overvåket ved puls-merking av induserte celler og analyse av de merkede proteiner ved polyakrylamidgel-elektroforese.

Celler transformert med vektorer ifølge oppfinnelsen ble dyrket i et LB-medium uten antibiotika ved 28°C til et antall på 2 x 10 p/ml. Cellene ble gjenvunnet ved sentrifuger-ing og gjensuspendert i det opprinnelige volum av et medium bestående av 19 mM NH4Cl, 86 mM NaCl, 42 mM Na2HP04, 1 mMMgS04, 0,2 % glukose, 0,05 % casaminosyrer (Difco), 0,01 % gjærekstrakt og 50 ug/ml/ L-tryptofan for merking av cellene

14

med C-aminosyreblandingen eller i det ovenfor nevnte medium bortsett fra at casaminosyrene og gjærekstraktet ble erstattet med 5 % metionin-analysemedium (Difco) for merking

35 o

av vertscellene med S-metionin. Inkubasjon ved 28 C ble utført i 60 min. Halvparten av kulturen ble deretter inkubert ved 42°C. Ved forskjellige tidspunkter etter induksjon ble alikvoter fra 28°C og 42°C kulturene merket med 14 C -aminosyreblanding eller med<35>S-metionin (Amersham).

Innarbeidelse av markørene ble avsluttet ved fenolekstrak sjon. De syntetiserte proteiner ble presipitert fra fenol-laget ved tilsetning av 5 vol etanol og gjenoppløst i 1 % SDS, 1 % 3-merkaptoetanol, 10 % glyserol, 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8). Prøver ble kokt i 5 min. sentrifugert ved 12000

x g og elektroforert i SDS-inneholdende polyakrylamidgeler (10 % - 15 % akrylamid) i henhold til fremgangsmåten ifølge U. Laemmli, "Cleavage Of Structural Proteins During the Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4", Nature, 227, sidene 680-82 (1970). Etter elektroforese ble gelene pre-parert for fluorografi i henhold til fremgangsmåten ifølge W. Bonner & R. Laskey, "A Film Detection Method For Tritium-Labelled Proteins And Nucleic Acids In Polyacrylamide Gels", Eur. J. Biochem., 46, sidene 83-88 (1974) bortsett fra atEN<3>HANCE (NEN) ble anvendt i stedet for PPO-DMSO.

2. Prokaryotiske Gener

(a) 3-Laktamasegenet

pPLa23 (fig. 3) innbefatter 3-laktamasegenet orientert ned-strøms for P Ju-promotoren. Derfor kan produksjon av protein kodet for av 3-laktamasegenet følges som en indikasjon på vektorens effektivitet med hensyn til å uttrykke prokaryotiske gener.

Transformanter av K12AHI og M5219 med pPLa23 — E. coli K12AHI (pPLa23) og E. coli M5219 (pPLa23) — ble fremstilt som beskrevet tidligere og deres proteinsyntese overvåket.Resultatene er vist i fig. 8. Det kan ses at en dramatisk forøkning i syntesehastigheten for de to proteiner med en tilsynelatende molekylvekt på henholdsvis 27,5K og 30K, fant sted raskt etter induksjonen av transformantene ved 4 2°C. Størrelsen av disse uttrykte proteiner er i overensstemmelse med den forventede lengde av moden 3_laktamase og dens forløper (J. Sutcliffe, supra). Ytterligere ble den induserte syntese av disse proteiner medfulgt av en forøket enzymatisk aktivitet av 3-laktamasen, bestemt ved fremgangsmåten ifølge 0'Callaghan et al., "Novel Method For Detection Of 3-Lactamases By Using A Chromogenic Cephalosporin Sub-strate", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1, sidene

283-88 (1972) og begge proteinene ble selektivt presipitert av anti-p-laktamaseser.um. Som en kontroll ble proteinsyntesen i verter, ikke transformert med vektorene pPLa23 overvåket. Det ble ikke observert syntese av de ovenfor beskrevne proteiner fra disse ikke-transformerte verter.

Som det fremgår av fig. 8 er totalmønsteret for proteinsyntesen i disse transformanter meget like ved 28°C og 42°C. Imidlertid synes syntesehastigheten av visse av proteinene

å endres betydelig ved å kultivere cellene ved 42°C. En tilsvarende oppførsel er observert i celler som ikke er transformert med pPLa23. I tillegg, slik som vist i fig. 8 så stiger den relative mengde av det største av de to 3~lakta-masebeslektede proteiner, nemlig den ubehandlede forløper for (3-laktamase, med tiden etter induksjon. Denne helning mot oppbygning av forløperproteinet kan indikere en metning av 3-laktamasebearbeidnings-mekanismen for cellen.

For å bestemme den prosentvise syntese av 3-laktamase sammenlignet med den totale de novo proteinsyntese av transformanten ble proteinbåndene for 3-laktamase (27,5K) og dens for-løper (30K) skåret ut fra den tørkede gel og deres radioaktivitet sammenlignet med den totale radioaktivitet tilført gelen. Disse resultater er vist i tabell II.

Som det fremgår av tabell II når syntese av |3-laktamase og dets forløper et maksimumnivå på ca. 30 % av total de novo proteinsyntese i begge stammer av vertscellene. Imidlertid er kinetikken for å nå dette nivå forskjellige for de to stammer, idet stamme K12AHI ligger ca. 20 min. etter stamme M5219 for å oppnå 30 % nivå. Dette kan muligens skyldes at N-genproduktet, samprodusert ved indusering av stammen M5219, men i fravær av stamme K12AHI må overkomme visse transkrip-sjonsforsinkelsessignaler i DNA-sekvensene nedstrøms for PL~promotoren og derved påskynde (3-laktamasesyntesen i stamme M5219.

For å bestemme hastigheten for den totale proteinsyntese i disse transformanter ble den totale radioaktivitet innarbeidet under et spesielt tidsintervall bestemt og sammenlignet med den innarbeidet under 0-10 min. intervallet (dvs. det initiale intervall ble tilfeldig valgt som 100 % for en re-feranse) . Resultatene er vist i tabell III.

Som det fremgår av tabell III faller den totale proteinsyntese i E. coli M5219 (pPLa23) raskt etter induksjon. Dette er i overensstemmelse med den tidligere observerte manglende evne for M5219-transformanter til å overleve ved 42°C.

Ingen tilsvarende inhibiering av proteinsyntesen ble observert for E. coli M5219 (pBR322). En vesentlig reduksjon i den totale proteinsyntese er også observert for E. coli K12AHI (pPLa23) etter forlenget inkubasjon ved 42°C. 'Imidlertid er disse celler i stand til å overleve tempera-turer på 4 2°C.

(b) Tryptofansyntetase A gen

(i) pPLa2 3

Et EcoRI-fragment (5300 b.p.) inneholdende trp A cistronet av Salmonella typhimurium ble erholdt fra pES9 (E. Selker et al., "Mitomycin C Induced Expression Of trp A Of Salmonella tryphimurium Inserted Into The Plasmid ColEl", J. Bacteriolo-gy, 129, sidene 388-94 (1977)) og innført i pPLa23 ved dets EcoRI-posisjon. To representative plasmider med dette inn-førte fragment i en av de to mulige orienteringer med hensyn til retningen for P Li-promotoren ble betegnet med

pPLa23trpA-L og pPLa23trpA2.

Induksjonsprofiler for stammen K12AHI inneholdende enten pPLa23trpA1eller pPLa23trpA2er vist i fig..9. En hoved-proteinandel på ca. 25000 daltons ble indusert av pPLa23trpA^men var fraværende i induserte celler inneholdende pPLa23trpA2- Den observerte molekylvekt for dette protein var i overensstemmelse med den teoretiske verdi

(28500) forventet fra nukleotidsekvensen av S. typhimurium trp A genet (B. Nicols&C. Yanofsky, "Nucleotide Sequences Of trp A Of Salmonella tryphimurium And Escherichia coli: An Evolutionary Comparison", Proe Nati. Acad. Sei. U.S.A., 76, sidene 5244-48 (1979). Ytterligere tiltok enzymaktivi-teten i overensstemmelse med tilstedeværelsen av et trp A-genprodukt, bestemt i henhold til fremgangsmåten ifølge 0. Smith & C. Yanofsky "Enzymes Involved In The Biosynthesis Of Tryptophan", Methods in Enzymology, 5, sidene 794-806,

(1962) parallelt med akkumuleringen av dette induserte protein.

Etter forlenget induksjon av både pPLa23trpA^og pPLa23trpA2ble det syntetisert et protein med en molekylvekt på ca. 18K (fig. 9). Den prosentvise syntese av dette protein sammenlignet med den totale de novo proteinsyntese for transformanten er uavhengig av orienteringen av EcoRI trp A-fragmentet med hensyn til retningen for transkripsjonen fra P Li-promotoren. Det er derfor trolig at syntesen av dette protein kon-trolleres av en eventuelt lite temperaturavhengig bakterie-promotor tilstede i 5300 basepar EcoRI trp A-fragmentet hvis kodekapasitet i realiteten er meget større enn den som er nødvendig for trp A (E. Selker, supra).

Den,prosentvise syntese av trp A sammenlignet med den totale de novo proteinsyntese i transformanten ble bestemt i det vesentlige slik som beskrevet tidligere for (3-laktamase. Resultatene er vist i tabell IV. Igjen nådde trp A-Syntesen et maksimalt nivå på ca. 30 % av den totale de novo-syntese.

(ii) pPLa2311

Et rekombinant DNA-molekyl identisk med pPLa23trpA-^, men basert på pPLa2311, ble også fremstilt i det vesentlige på samme måte som tidligere beskrevet. K12AHI-transformanter med pPLa2311tr<p>A^ oppførte seg på samme måte som de med pPLa23trpA-^(bortsett fra at i dette forsøk var det maksimale nivå i forhold til den totale de novo syntese kun 20% etter 150 min) i Igjen førte en forlengdet induksjon til en netto senk-ning i den totale proteinsyntese.

(iii) pPLc23

EcoRI-fragmentet fra pES9 har en ende plassert inne i trp B-genet og inneholder en enkelt Sall-posisjon ca. 2500 basepar fra EcoRI-posisjonen (E. Selker et al., supra). Da trp A-genet ikke inneholder en Sall-posisjon (B. Nichols & C. Yanofsky, supra), må trp A-genet være lokalisert fullstendig i den del av EcoRI-fragmentet av pES9 som utstrekker seg fra den første EcoRI-posisjon til Sall-posisjonen. Derfor når det tidligere fremstilte EcoRI-fragmentet av pES9 bli oppsluttet med Sali og det resulterende fragment innført i pPLc23.som en erstatning for EcoRI-Sall-fragmentet deri

(fig. 4) basert på den observerte retning for translasjonen av trp A-genet i pPLa23trpA-^ og pPLa23trpA2har det pPLc23-baserte rekombinante DNA-molekyl et trp A-gén kolineært med transkripsjonen fra P^-proraotoren og dette ble betegnet med pPLc2 3tr<p>A1.

Ved induksjon (42°C) av E. coli K12AHI (pPLc2 3trpA1) ble trp A syntetisert til et maksimalt nivå på ca. 4 0 % av den totale de novo proteinsyntese etter 3 h induksjon. Ytterligere/ dette høye nivå av de novo' syntese ble bibeholdt i 2 h (fig. 10). Disse resultater er vist i den etterfølgende tabell V, infra. Derfor i motsetning til oppførselen for pPLa-type vektorene så avtar ikke proteinsyntesen for pPLc-type transformantene før opptil 5 h etter induksjon.

Den aktuelle mengde av indusert protein akkumulert i oven-

for nevnte transformanter ble også målt ved kontinuerlig merking av induseo rte celler. E. coli K12AHI (pPLc23tr 1pA )

ble dyrket ved 28 C i LB-medium til et antall på 1X10 cell-14

er/ml. Cellene ble deretter merket med 10 uCi C-aminosyreblanding. Ved en kulturtetthet på 4 x 10 7 celler/ml ble cellene kul-tivert ved 42°C oct inkubasjonen fortsatt. Når kulturen nådde metnina (6 h

etter induksjon), ble proteinene ekstrahert fra cellene og separert på SDS-polyakrylamidgeler. Den prosentvise radioaktivitet innarbeidet i trp A-båndet ble bestemt. Under de anvendte betingelser kan det antas at cellene ble jevnt merket slik at radioaktiviteten innarbeidet i proteinet reflek-terer den aktuelle mengde av det protein som er tilstede i cellen. Et trp A-protein ble funnet å utgjøre 10 % av de totale celleproteiner.

Denne 10 % konsentrasjon av trp A i de totale celleproteiner i E. coli' K12AHI (pPLc23trpA^) tjener også til å vise den viktig^ e forskjJ ellen mellom de A- p L-inneholdende vektorer i henhold til H. Bernard et al., supra, og de ifølge foreliggende oppfinnelse. I motsetning til en 10 %'ig aktuell trp-konsentrasjon som oppnås med vektoren ifølge oppfinnelsen så rapporterte H. Bernard et al. kun 6,6 % konsentrasjon av trp A, bestemt på basis av trp A enzymatisk aktivitet og en an-tatt spesifikk aktivitet for proteinet. Det bør også bemerkes at 6,6% trp A-konsentrasjonen rapportert av H. Bernard et al. ble observert med vektorer som også innbefattet et aktivt N-gen og derfor var transkripsjonen antakelig opp-stått i nærvær av det anti-terminerende N-genprodukt. Kun 2 % trp A-konsentrasjon ble rapportert av H. Bernard et al. med en vektor som ikke innbefattet et aktivt N-gen. I motsetning til dette ble den observerte 10 % trp A-konsentrasjon med de forbedrede vektorer ifølge oppfinnelsen oppnådd i fravær av N-genprodukter. Derfor utgjør de foreliggende vektorer og fr-emgangsmåter en markant forbedring over de kjente vektorer og fremgangsmåter.

(c) Bakteriofag MS2 replikase proteingen

Plasmid pMS2-7 inneholder en kopi i nesten full størrelse av genomet av RNA bakteriofag MS2 (R. Devos et al., supra).

Fag replikasegenet (R) inneholdes inne i et EcoRI-Pstl-fragment . Dette fragment ble innført i pPLa2311 ved en enkel erstatning av EcoRI-Pstl-fragmentet av denne vektor. Transformanter E. coli K12AHI (pPLa231lR^) ble siktet med hensyn til karbenicillinsensitivitet fordi genet for ampicillin resistens ikke lenger er intakt i pPLa231lR^. Identiteten for det innskutte fragment ble etablert ved koelektroforese på agarosegeler med kjente fragmenter fra pMS2-7 DNA. I pPLa2311R-^forløper transkripsjonen av MS2-replikaseprotein-et kolineært med transkripsjonen for P^-promotoren.

Induserte celler av E. coli K12AHI (pPLa231lR1) syntetiserte et protein med en tilsynelatende molekylvekt på 59K (fig. 11). Størrelsen av dette protein er i overensstemmelse med 60692 daltons molekylvekt, beregnet for MS2-replikase fra sekvens-data for viral RNA (W. Fiers et al., "Complete Nucleotide Sequence Of Bacteriophage MS2 RNA: Primary And Secondary Structure Of The Replicase Gene", Nature, 260, sidene 500-507 (1976)).

Tilstedeværelsen av funksjonell MS2-replikaseprotein i proteinproduktene fra celler transformert med pPLa231lR-^

ble også verifisert ved komplementeringsanalyse med MS2 gule mutanter. Denne analyse beskreftet at celler transformert med pPLa2311R-^produserte et produkt som spesifikt komple-' menterte produktet av en MS2-mutant som bærer en lesjon i replikasegenet og at celler som ikke er transformert med pPLa2311R1komplementerte ikke produktet av en slik mutant.

Med hensyn til MS2-replikaseproteinsyntesen så oppførte både E. coli K12AHI (pPLa23HR1) og E. coli M5219 (pPLa231lRx)

seg likt, idet etter 30 min. induksjon var den prosentvise syntese av MS2-replika'se 29 % av den totale de novo proteinsyntese og hvor nivået for proteinsyntesen falt raskt ved ytterligere induksjon (fig. 11). Da et slikt fall i syntese-nivået ikke ble observert for syntese av 3-laktamase eller trp A, kan dette fall eller reduksjon være forårsaket av en spesiell egenskap for MS2-replikasen. F.eks. den observerte tendens for fag-replikase til å binde seg til sitt eget mRNA ved en posisjon nær midten av cistronet (Meyer et al., "The Binding Sites Of Q3 RNA", Experienta, 31, sidene 143 et seq.

(1975)) kan interferere med ytterligere translasjon av den komplekserte mRNA.

3. Eukaryotiske gener

(a) Det lite-t-antigen av Simian Virus 40-genet

Et Hindlll DNA-fragment inneholdende den fullstendige kodesekvens for SV40 lite-t-antigen (G. Volckaert et al., "Nucleotide Sequence Of The Simian Virus 40 Small-t Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 75, sidene 2160-64 (1978)) ble inn-ført i Hindlll-posisjonen i pBR322 (fig. 12). Orienteringen av innskuddet ble bestemt ved begrensningsanalyse basert på tilstedeværelsen av en asymmetrisk lokalisert Taql-posisjon. Fra dette hybrid DNA-molekyl ble utskåret et EcoRI-BamHI-fragment inneholdende det ovenfor nevnte HindIII-fragment og deler av pBR3 2 2 ble fjernet og innført i pPLc28 som erstatning for dets EcoRI-BamHI-fragment, slik at essensen av translasjonen av det lille-t-antigen forløper kolineært med transkripsjonen fra P -promotoren (fig. 12). Det resulterende rekombinante DNA-molekyl ble betegnet med pPLc28SVt5.

For å avkorte avstanden mellom P -promotoren og den initier-ende codon (ATG) for genet som koder for lite-t-antigen.ble pPLc28SVt5 modifisert for å eliminere EcoRI-HindIII-fragmentet mellom genet og P -promotoren. Disse manipulasjoner er vist i fig. 12 og 13. De består av å spalte pPLc28SVt5 med Clal, tilbakekutning av 31 enden av DNA1 et i 2 separate trinn under anvendelse av 3' eksonukleaseaktiviteten til T4 DNA polymerase i nærvær av henholdsvis GTP og TTP, ytterligere behandling med Sl nuklease, addere EcoRI-tilknyttere til den butte ende, spalte fragmentet med EcoRI og sammenknytte de komplementære ender.

Transformering av E. coli K12AHI med disse modifiserte hyb-ride DNA-molekyler og induksjon ga en ekspresjon for relativt store mengder av et protein med en tilsynelatende molekylvekt på 14K (fig. 14). Dette protein ble ikke produsert uten induksjon og ble ikke produsert av vertsceller som ikke var transformert med vektorene inneholdende SV40 DNA.

Selv om autentisk lite-t-antigen har en molekylvekt på 19K

og proteinet fremstilt i disse transformerte celler kun i

liten grad ble presipitert av antilegemer dannet mot det større-T-antigen av SV4 0, så underbygget todimensjonal fingertrykk (elektroforese ved pH 3,5 etterfulgt av kromato-grafi i butanol/eddiksyre/pyridin/vann (15:3:10:12)) av tryptiske peptider avledet fra dette protein og autentiske liten-t-antigen at de to var beslektede. En mulig teori er at den sekundære struktur av mRNA-starten ved P ij-promotoren er slik at initiering ved en intern initieringscodon av lite-t-antigenet favoriseres fremfor initiering av det sanne startsignal. Denne hypotese er også i overensstemmelse med at den sekundære struktur kunne avledes under anvendelse av prosedyren ifølge D. Inserentant & W. Fiers, "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of Translation Initi-ation", Gene, 9, sidene 1-12 (1980), fra nukleotidsekvensene av visse av disse SV^.-inneholdende vektorer.

En av de modifiserte pPLc28SVt5 rekombinante DNA-molekyler, fremstilt som ovenfor uttrykte en mindre mengde av en 17K-komponent i tillegg til hoved 14K proteinkomponenten. Dette molekyl ble betegnet med pPLcSV"t5-37. Selv om tilstedeværelsen av 17K proteinet kun opprinnelig kunne påvises ved spesifikk immunopresipitering med stor-T-antiserum, muliggjorde ytterligere modifikasjon av molekylet en forbedret syntese av 17K-komponenten. Denne modifikasjon som besto av spalting av pPLc28SVt5-37 med EcoRI, forlenging av de nedtrykkede 31 ender med DNA-polymerase I (K. Backman et al., supra) og igjen sammenbinder de avkuttede ender kan ha for-andret den sekundære struktur av mRNA. Verter transformert med pPLc28SVt5-37-9 ga ca. 4 % av deres totale de novo proteinsyntese som en 17K proteinkomponent ved induksjon. Disse resultater er vist i fig. 14. Som vist i linje c i fig. 14 ble 17K-komponenten immunopresipitert med serum fra en SV40-tumorinfisert hamster i det vesentlige i den samme grad som autentisk liten-t-antigen dyrket i SV40-infiserte afrikanske grønnape-nyreceller.

(b) Human fibroblastinterferon (HFIF) gen

Som beskrevet i britisk patentsøknad nr. 80.18701 ble genet som koder for human fibroblastinterferon innført i vektorene pPLa8 og pPLc24 for å gi rekombinante DNA-molekyler som er i stand til å transformere verter etter passende induksjon for å uttrykke proteiner som utviser antivirale, physio-kjemiske, immunologiske og biologiske aktiviteter som nær tilsvarer aktivitetene til autentisk human fibroblastinterferon.

(c) Et FMDW-antigen

Som beskrevet i britisk patentsøknad nr. 80.26661 ble en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som utviser, spesi-fisiteten for FMD-viralantigener innført i vektoren pPLc24 til å gi rekombinante DNA-molekyler som er i stand til i transformerte verter etter passende induksjon og uttrykke polypeptider med en spesifisitet tilsvarende FMD-viralantigener.

De beskrevne mikroorganismer og vektorer er eksemplifisert med kulturer deponert i the American Type Culture Collection Rockville, Maryland, United States, 8. september 1980 og

er identifisert som PL-A til PL-D:

Disse kulturer ble gitt henholdsvis tilgangsnummerene ATTC 31694-31697.

I tillegg er de heri beskrevne mikroorganismer og vektorer fremstilt ifølge foreliggende fremgangsmåte og som også inneholder innskutte DNA-sekvenser for ekspresjon eksemplifisert ved hjelp av kulturer deponert i kultursamlingen i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Gottingen, Vest-Tyskland og identifisert som følger:HFIF-D: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1851] HFIF-E: -E. coli K12AHI (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1852] HFIF-F: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12A19) [DSM 1853] HFIF-G: E. cOli M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8) [DSM 1854]

FMDV-A: E. coli W6 (X v - pPL-VPl-1) [DSM 1879]

FMDV-B: E. coli NFl (AN~cro clt -pPL-VPl-1) [DSM 1880] FMDV-C: E. coli NFl (AN~cro~cit-pPL-VPl-5) [DSM 1881].

Kulturene HFIF-D - HFIF-G ble deponert 5. juni 1980. Kulturene FMDV-A - FMDV-C ble deponert 31. juli 1980.

Selv om det i foreliggende beskrivelse er presentert et antall utførelsesformer ifølge oppfinnelsen vil det være åpenbart at denne basiske konstruksjon kan variere til å gi andre utførelsesformer hvori anvendes fremgangsmåter og kompo-sisjoner ifølge foreliggende oppfinnelse. Det vil derfor være åpenbart at omfanget av. foreliggende oppfinnelse er definert av de vedheftede krav og ikke er begrenset til de spesielle utførelsesformer som er presentert for å eksempli-fisere oppfinnelsen.

Claims (10)

1. En vektor omfattende minst én DNA-sekvens omfattende minst én promotor og én operator avledet fra bakteriofag A, karakterisert ved minst én endonuklease-gjenkjenningsposisjon lokalisert mindre enn ca. 300 basepar fra den del av DNA-sekvensen :som omfatter promotoren og operatoren.

2. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at gjenkjenningsposisjonen er lokalisert mindre enn 150 basepar fra den delen av DNA-sekvensen som omfatter promotoren og operatoren.

3. Vektor ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det i en av dens endonukleasegjenkjenn-ingsposis joner er innbefattet en DNA-sekvens som koder for et eukaryotisk-, prokaryotisk- eller viralt protein, polypeptid, enzym, hormon, antigen eller fragment derav.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbedret klone-vektor ifølge kravene 1-3, karakterisert ved å innføre i en eksisterende klonebærer minst én DNA-sekvens omfattende minst én promotor og én operator avledet fra bakteriofag A og bestående av PR O K eller P Li QT Li og for-syne klonebæreren med minst én endonukleasegjenkjennings-posisjon mindre enn ca. 300 basispar fra den del av DNA-sekvensen som består av promotoren og operatoren.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at gjenkjenningsposisjonen omfatter EcoRI, BamHI, Hindlll, Pstl, Xba eller Sal.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved innføring av en ribosombindende posisjon i vektoren.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakteri sert ved at den ribosombindende posisjon er avledet fra bakteriofag MS2 replikase.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av et rekombinant DNA-molekyl, karakterisert ved og innføre en DNA-sekvens som koder for et eukaryotisk, prokaryotisk eller viralt protein, polypeptid, enzym, hormon, antigen eller fragment derav i minst én endonukleasegjenkjennings-posisjon i en vektor omfattende (1) minst én DNA-sekvens omfattende minst én promotor og operator avledet fra bakteriofag A og bestående av P_,0 eller PO , og (2) hvor minst en av endonukleasegjenkjenningsposisjonene er lokalisert mindre enn ca. 300 basepar fra den del av DNA-sekvensen som omfatter promotoren og operato ren.

9. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid, karakterisert ved å kultivere en vert transformert med en vektor ifølge krav 3 og gjenvinne polypeptidet.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at polypeptidet omfatter leukocyttinter-feron, fibroblastinterferon, immuninterferon, insulin, human vektshormon, dyre-veksthormon, antigener av hepatitt, munn- og klovsyke og andre virus, og andre prokaryotiske, eukaryotiske og virale enzymer, hormoner, polypeptider, proteiner eller aminosyrer.