JPH0787785B2 - 改良ベクタおよびこの種ベクタの製造方法ならびにクローン化遺伝子の発現方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 改良ベクタおよび原核もしくは真核起源のクローン化遺
伝子の発現方法およびこの種ベクタの製造方法を開示
し、改良ベクタはλファージからのプロモータとオペレ
ータとを含み、好ましくは活性cro遺伝子もしくは活性
Ｎ遺伝子を含まず、ベクタはプロモータおよびオペレー
タから約300塩基対以内の所望の遺伝子をクローン化す
る少なくとも一つのエンドヌクレアーゼ認識部位を有す
ると共に、広汎な種類の原核、真核およびウイルスポリ
ペプチド、ホルモン、酵素、抗原、蛋白質およびアミノ
酸を生産する際のベクタを使用する方法と同様に有用で
ある。

本発明は、改良ベクタならびにこの種ベクタの製造方法
およびクローン化遺伝子の発現方法に関するものであ
る。ここに開示するベクタおよび方法は、クローン化遺
伝子、特に原核宿主における真核起源のものについての
改良された発現を特徴とする。以下の開示から判るよう
に、これらのベクタおよび方法を使用して、宿主細胞に
おける各種のポリペプチド、蛋白質およびアミノ酸の生
産を向上させることができる。

宿主細胞における蛋白質の生産レベルは三つの主要な因
子によって支配される：すなわち、細胞内の遺伝子のコ
ピー数と、それら遺伝子コピーが転写される効率と、得
られたメッセンジャRNA（「mRNA」）が翻訳される効率
とである。転写および翻訳（一緒になって発現を構成す
る）の効率は次いで、通常所望のコード配列の前部に位
置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオ
チド配列または発現制御配列は、特に、RNAポリメラー
ゼが反応して転写を開始する（プロモータ配列）と共に
リボソームがmRNA（転写の生産物）と結合しかつ反応し
て翻訳を開始する位置を規定する。

必ずしもこれら全ての発現制御配列が同等な効率をもっ
て機能するとは限らない。したがって、しばしば、所望
蛋白質に対する特定コード配列を隣接するヌクレオチド
配列から分離しかつこれを他の発現制御配列に融合させ
てより高レベルの発現を促進するようにするのが有利で
ある。これが達成された後、新たに作成されたDNA断片
をより高度のコピー数プラスミドまたはバクテリオファ
ージ誘導体に挿入して細胞内の遺伝子コピー数を増大さ
せ、それにより発現蛋白質の収率をさらに向上させるこ
とができる。

通常、無毒性の遺伝子生産物でさえ過剰に生産されると
宿主細胞に対し有害となり、特定の宿主−ベクタ系の安
定性を低下させることがあるので、良好な発現制御配列
はクローン化遺伝子の転写および翻訳の効率を向上させ
る他、細菌増殖の際発現を変調させるよう制御しうるも
のでなければならない。たとえば、好適な発現制御配列
は、宿主細胞が過剰の遺伝子生産物の蓄積なしに繁殖し
うるよう滅勢され、次いで多量の所望蛋白質生産物の発
現を促進するよう付勢されうるものである。

上記した基準の幾つかを満足させる数種の発現制御配列
が、細菌宿主における蛋白質およびポリペプチドの発現
を向上させるべく使用されている。これらには、たとえ
ばイー・コリ（大腸菌）の乳糖オペロンにおけるプロモ
ータ、オペレータならびにリボソーム結合および相互作
用配列（たとえばケー・イタクラ等、「ホルモン・ソマ
トスタチンに関する化学合成遺伝子の大腸菌における発
現」、サイエンス誌、第198巻、第1056〜1063頁（197
7）；ディー・ヴィー・ゲデル等、「ひとインシュリン
に関する化学合成遺伝子の大腸菌における発現」、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第76巻、第106〜110頁（1979）〕、イー・コリの
トリプトファン合成酵素系の対応配列〔ジェー・エス・
エムタゲ等、「インフレンザ抗原決定因子は大腸菌でク
ローン化されたヘマグルチニン遺伝子から発現され
る」、ネイチャー誌、第283巻、第171〜174頁（198
0）；ジェー・エー・マーシャル等、「ひと成長ホルモ
ン：細菌における補完的DNAクローン化および発現」、
サイエンス誌、第205巻、第602〜606頁（1979）〕およ
びファージλの主要なオペレータおよびプロモータ域
〔エッチ・バーナード等、「バクテリオファージλP_Lプ
ロモータからの遺伝子発現を促進するプラスミドクロー
ン化運搬体の作成」、ジーン誌、第５巻、第59〜76頁
（1979）〕が包含される。本発明は、これら発現制御配
列のうち最後のものに関するものである。

バクテリオファージλは３種の主要なプロモータP_L、P_R
およびＰ′_Rを含有する。リプレッサ蛋白質、すなわち
ファージ遺伝子cIの生産物は、プロモータP_LおよびP_Rの
活性を制御することが知られている。これらリプレッサ
は、これらプロモータの各プロモータ領域（すなわちO_L
およびO_R）に結合して対応プロモータからの転写の開始
を阻止する。さらに、合成に関するその自己調節方式
〔エム・プタシン等、「バクテリオファージλにおける
リプレッサの自己調節および機能」、サイエンス誌、第
156〜161頁（1976）〕により、溶原性菌株の染色体上に
おけるcI遺伝子の一つのコピーは、多コピープラスミド
に存在するP_LもしくはP_Rプロモータを完全に抑制するこ
とができる（下記）。lacプロモータを含む系において
は、非誘発条件下でのプロモータの抑制が部分的に過ぎ
ないことに注目すべきである〔ケー・イタクラ等、上
記；ディー・ヴィー・ゲデル等、上記〕。

プロモータP_LおよびP_Rに対しリプレッサにより発揮され
る制御は、リプレッサ蛋白質またはその遺伝子の改変に
より変化させることができる。たとえば、リプレッサ蛋
白質が温度感受性であるような一つの突然変異が知られ
ている。この突然変異を用いれば、培養の温度すなわち
リプレッサの安定性を変化させることにより、プロモー
タを活性化もしくは失活させることができる。

バクテリオファージλは、また、遺伝子Ｎおよびcroを
も含有する。Ｎ遺伝子はP_L制御下にある。Ｎ遺伝子の生
産物は、バクテリオファージλにおける抗−終止因子と
して作用することが知られている。抗−終止は、転写す
べき特定DNA配列における終止配列、終止様配列または
転写遅延配列の存在により惹起される転写終止もしくは
遅延を克服するのに有利である。さらに、プロモータ転
写においてノンセンスコドンの存在により導入される極
性効果は、Ｎ遺伝子生産物により緩和することができる
〔エヌ・フランクリンおよびシー・ヤノフスキィ、「λ
のＮ蛋白質：イー・コリRNAポリメラーゼの転写終止、
極性および変化に関する証明」、RNAポリメラーゼ（コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）第693
〜706頁（1976）。

P_Rプロモータから転写されたcro遺伝子の生産物は、両
プロモータP_LおよびP_Rに対する二次リプレッサであるこ
とが知られている〔ジェー・ペロ、「tof遺伝子生産物
の部位に関するデレーション・マッピング」、バクテリ
オファージλ（コールド・スプリング．ハーバー・ラボ
ラトリー）第549〜608頁（1971）；エッチ・エコルス、
「バクテリオファージλ発生におけるcro遺伝子の役
割」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第80
巻、第203〜216頁（1973）；エー・ジョンソン等、「バ
クテリオファージλのcro蛋白質の作用メカニズム」、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
ス・USA、第75巻、第1783〜1787頁（1978）〕。cro遺伝
子生産物は宿主とベクタとの組合せの所望生産物と一緒
に共生産されるので、P_LもしくはP_Rからの発現に対する
cro遺伝子生産物の効果は時間と共に増大する傾向があ
る。したがって、連続した高レベルの発現を望む系にお
いては、cro遺伝子の欠失または失活が必要である。

クローン化遺伝子の発現に関するP_Lプロモータの効果
は、イー・コリのトリプトファン（trp）オペロンをフ
ァージλ中に組み込むことにより示されている〔エヌ・
フランクリン、「バクテリオファージλのＮオペロンに
融合した遺伝シグナルの読み変化:N遺伝子の蛋白質生産
物によるポリメラーゼの改変に関する遺伝子的証明」、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第89巻、第
33〜48頁（1979）；エー・ホプキンス等、「試験管内で
作成されたλtrp−形質導入バクテリオファージの特性
化」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第10
7巻、第549〜569頁（1976）〕。この改変ファージにお
いて、trp遺伝子をそれら自身のプロモータから或いはP
_Lプロモータから転写させることができる。P_L媒介の発
現は、同族trpプロモータから得られるレベルより３〜
４倍高いことが判った。

P_L媒介の発現に対するリプレッサの効果も、この改変フ
ァージにおいて示された。たとえば、リプレッサの不存
在下において、アントラニレートシンセターゼ（trpオ
ペロンにおける第一の酵素）のP_L制御された発現は、tr
pリプレッサの不存在下におけるtrpプロモータ制御下で
の酵素につき得られるものより11倍大きいものであった
〔ジェー・ダピソン等、λtrp融合オペロンにおける遺
伝子発現の定量面」、モレキュラー・ゼネラル、ゲネチ
ックス、第130巻、第９〜20頁（1974）〕。しかしなが
ら、活性cI遺伝子の存在において、酵素のP_L媒介された
発現は少なくとも900倍減少された。これらの研究も、
宿主においてcro遺伝子が機能しない場合のみ、連続高
レベルのP_L媒介された転写が可能であったことを示し
た。

問題は、上記したλtrpファージは挿入遺伝子の発現に
対するP_Lプロモータの有用性を示すが、この種のファー
ジの使用はcro受容体ファージの作成および安定な増殖
における困難性により若干制約を受けるということであ
る。この種のファージが存在しないと、観察された高レ
ベルの発現は、共生産されたcro遺伝子のレベルが増大
してP_Lプロモータからの転写を抑制すると直ちに低下す
る。

λファージの欠点は、λ制御エレメントをたとえばColE
lまたはその誘導体のような自己再生プラスミドにクロ
ーン化させることにより〔ジェー・ヘッジペス等、「プ
ラスミド−クローン化遺伝子の発現を高めるため使用さ
れるλファージプロモータ」、モレキュラー・ゼネラル
・ゲネチックス、第163巻、第197〜203頁（1978）〕、
或いはλP_L系のみを組込む比較的小さいプラスミドを作
成することにより〔エッチ・バーナード等、上記〕或る
程度克服されているが、これら後者のベクタはクローン
化遺伝子挿入に使用しうる部位とP_Lプロモータとの間の
距離が欠点となる。たとえば、エッチ・バーナード等
（上記）により記載されたベクタにおいて、ベクタ上の
遺伝子挿入部位とP_Lプロモータとの間の距離は約300〜
約8600塩基の範囲である。さらに、バーナード等のベク
タにおいて特に一般的に使用されるEcoRIおよびBamHI挿
入部位はそれぞれP_Lプロモータに対し600〜1000塩基よ
りも近くない。さらに、所望DNA配列の転写に対するＮ
遺伝子生産物の効果は、バーナード等のベクタにおいて
容易に評価することができない。何故なら、Ｎ遺伝子生
産物はプラスミド自身にコードされており、染色体起源
のものでないからである。最後に、バーナードのベクタ
が高レベルの蛋白質発現を与えるという直接的証明がな
く、さらにバーナードにおいてはそのベクタが原核宿主
における真核遺伝子生産物の発現に有用に使用されると
いう教示がない。

本発明は、上記した諸問題を、改良ベクタならびにこの
種ベクタの製造方法および宿主細胞におけるクローン化
遺伝子の発現方法を提供することにより解決する。

さらに詳細には、本発明者等は本発明により細菌性宿主
中の原核、真核またはウイルスポリペプチドの改善され
た製造方法を提供する。本方法は本発明の組換DNA分子
により形質転換される細菌性宿主を培養する工程からな
る。このような組換DNA分子は、バクテリオファージ
ラムダの左向きプロモータおよびオペレータであるP_LO_L
を有すること、活性cro遺伝子および活性N遺伝子が存在
しないこと、P_LO_Lの下流300塩基対未満に位置し且つ分
子中に存在し得るHaeIII部位（73.1％）の下流にあるラ
ムダDNA由来のあらゆる配列の上流に位置するDNA配列を
有すること、および前記DNA配列の一部であって所望の
原核、真核またはウイルスポリペプチドのコード領域を
有することを特徴としている。

ここで“P_LO_Lの下流300塩基対未満”は、所望のポリペ
プチドのコード領域を特徴とするDNA配列が、その発現
方向にP_LO_Lから300塩基対未満に位置することを意味す
る。用語“HaeIII部位（73.1％）の下流にあるラムダDN
Aのあらゆる配列の上流”は、P_LO_Lと所望のポリペプチ
ドのをコード領域を特徴とするDNA配列との間のいずれ
かのDNA配列がバクテリオファージ ラムダのDNA配列を
包含し得るが、HaeIII部位（73.1％）の（P_LO_Lから発現
の方向に）下流にあるバクテリオファージ ラムダ由来
のどのDNA配列も包含し得ないことを意味する。このこ
とは、下流がP_LO_Lを起点にすると右から左方向であり、
そして上流がHaeIII部位を起点にすると左から右方向で
ある図１を参照することにより最も良く理解することが
できる。この限定は、本発明の組換DNA分子が、P_LO_Lと
所望のポリペプチドのコード領域を特徴とするDNA配列
との間に、バクテリオファージ ラムダのN遺伝子のコ
ード領域由来のあらゆるDNA配列を含有しないことを保
証するものである。

本発明のベクタにおけるファージλの主プロモータは、
これらベクタ中に挿入されたDNA配列の転写を促進す
る。本発明の方法およびベクタは、所望DNA配列を選択
プロモータの近傍においてベクタ中に挿入するための多
数の適当な認識部位が存在することをさらに特徴とす
る。好ましくは、選択プロモータと認識部位との間の距
離は約300塩基対以内、より好ましくは約150塩基対以内
である。本発明の好適ベクタは、さらに、活性Ｎ遺伝子
および活性cro遺伝子が存在しないようなものである。
したがって、適当な宿主、すなわち活性の染色体Ｎ遺伝
子を含有するものまたは欠如するものを選択することに
より、本発明の任意のベクタを使用して、Ｎ遺伝子生産
物の存在下または不存在下にDNA配列を発現することが
できる。

以下の記載から判るように、本発明のベクタおよび方法
は、宿主細胞における原核および真核生産物の改良され
た発現を可能にするような宿主−ベクタ組合せ物の作成
を可能にする。

ここに記載した本発明をより充分に理解するため、以下
詳細に説明する。

本明細書中において、次の用語を使用する。

ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素
複素環塩基とからなるDNAもしくはRNAの単量体単位。塩
基は、グリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し
て糖成分に結合される。塩基と糖との結合はヌクレオシ
ドと呼ばれる。各ヌクレオシドはその塩基を特徴とす
る。４種のDNA塩基はアデニン（“A"）、グアニン
（“G"）、シトシン（“C"）およびチミン（“T"）であ
る。４種のRNA塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル
（“U"）である。

DNA配列：隣接ペントースの３′炭素と５′炭素との間
のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌクレ
オチドの線状列。

コドン:mRNAを介してアミノ酸と翻訳開始シグナルと翻
訳終了シグナルとをコードする３種のヌクレオチド（ト
リプレット）のDNA配列。たとえばヌクレオチドトリプ
レットTTA、TTG、CTT、CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸ロ
イシン（“Leu"）をコードし、TAG、TAAおよびTGAは翻
訳終了シグナルであり、ATGは翻訳開始シグナルであ
る。

リーディングフレーム：アミノ酸配列までmRNAを翻訳す
る際のコドンのグループ化。翻訳の際、適切なリーディ
ングフレームを維持せねばならない。たとえば、配列GC
TGGTTGTAAGは３つのリーディングフレームすなわち相に
おいて翻訳することができ、その各々は異なるアミノ酸
配列GCT GGT TGT AAG‐‐Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG--Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G--Trp-Leu-（停止） を与える。

ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合され
たアミノ酸の線状列。

ゲノム：細胞もしくはウイルスの全DNA。これは、特に
物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子、ならびに
オペレータ、プロモータおよびリボソーム結合ならびに
たとえばシャイン−ダルガルノ配列のような配列を含め
て相互作用配列を包含する。

構造遺伝子：雛型もしくはメッセンジャーRNA（“mRN
A"）を介して、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の
配列をコードするDNA配列。

転写：構造遺伝子からmRNAを生成する過程。

翻訳:mRNAからポリペプチドを生成する過程。

発現：ポリペプチドを生成するための構造遺伝子により
受ける過程。これは、転写と翻訳との組合せである。

プラスミド：完全「レプリコン」からなる非クロモソー
ム二重鎖DNA配列であり、これによりプラスミドは宿主
細胞内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのDNAの結果として
変化または形質転換する。たとえば、テトラサイクリン
耐性（Tet^R）についての遺伝子を担持するプラスミドは
従前テトラサイクリンに感受性であった細胞をこれに対
し抵抗性の細胞に形質転換させる。プラスミドにより形
質転換された細胞「（トランスホーマント）」と呼ぶ。

ファージまたはバクテリオファージ：細菌性ウイルスで
あり、その多くは蛋白質エンベロプもしくはコート
（「カプシド」）中にカプセル化されたDNA配列からな
っている。

クローン化運搬体（cloning vehicle）：宿主細胞中に
複製しうるプラスミド、ファージDNAまたはその他のDNA
配列であり、これは１個または少数のエンドヌクレアー
ゼ認識部位を特徴とし、この部位においてこのDNA配列
はDNAの本質的な生物学的機能（たとえば複製）、コー
ト蛋白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合部
位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、またこの部位
は形質転換細胞の同定（たとえばテトラサイクロン耐性
またはアンピシリン耐性）に使用するのに適するマーカ
を含有する。クローン化運搬体はしばしばベクタ（Vect
or）と呼ばれる。

クローン化：微生物またはDNA配列の繁殖を得る過程で
あって、無性増殖によりこの種の一種の微生物または配
列から得られる。

組替えDNA分子またはハイブリッドDNA:生体細胞の外部
で末端−末端結合されかつ宿主細胞を感染してそこに維
持される能力を有する、異なるゲノム（細胞又はウイル
スの全DAN）からのDNA断片よりなる分子。

発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合これら遺
伝子の発現を制御および調整するヌクレオチド配列。

本発明の宿主細胞 多数の入手しうる宿主細胞の任意のものを、本発明の宿
主−ベクタ組合せ物に使用することができる。特定宿主
の選択は当分野で知られた多くの因子に依存する。これ
らには、たとえば選択ベクタとの和合性、ハイブリッド
プラスミドによりコードされる蛋白質の毒性、所望蛋白
質の回収の容易さ、発現特性、生物安全性および価格が
包含される。これら因子のバランスは必ずしも全ての宿
主が特定組替えDNA分子の発現に関し同等に有効ではな
いという理解に基づいて決定せねばならない。これら一
般的指針のうち、有用な宿主はイー・コリ（大腸菌）、
シュードモナス（Pseudomonas）、枯草菌（Bacillus su
btilis）、高熱菌（Bacillus stearothermophilus）お
よびその他細菌、酵母およびその他真菌類の菌株、動物
または植物宿主、たとえば培養物における動物（人間を
含む）または植物細胞、或いはその他宿主を包含する。

本発明における好適な宿主細胞はイー・コリ菌株K12cI
_tsΔHI〔K12M72lac_amΔtrpEA2Sm^R（λcI857N_am7N_am53Δ
HIビオ^-）〕（「K12ΔHI」）〔エッチ・バーナード等、
上記〕およびM5219〔K12M72lac_amtrp_amSm^R（λcI857 Δ
HIビオ252）〕（「M5219」）〔エッチ・グリア、「バク
テリオファージλのkil遺伝子」、バイロロジー、第66
巻、第589〜604頁（1975）〕または染色体−もしくはプ
ラスミド−コード化されたCI857遺伝子（またはその等
価物）を有するその他任意の菌株である。

両菌株は、欠陥のある非切除性のλプロファージを有
し、これは突然変異cI遺伝子を担持している。突然変異
遺伝子は温度感受性リプレッサをコードし、したがって
温度の調整によりP_Lプロモータからの転写を活性化させ
ることができ、すなわち28℃においてこのリプレッサは
活性であってP_Lプロモータからの転写を抑制するが、42
℃においてこのリプレッサは失活してP_Lプロモータから
の転写を付勢する。

プロファージのΔHI欠失はcro遺伝子の一部とプロファ
ージにおけるcroのさらに右方に対する全ての他の遺伝
子を除去する〔エム・カステラッチ等、「イー・コリK1
2にプロファージとして存在するバクテリオファージλ
における欠失物の単離および特性化」、モレキュラー・
ゼネラル・ゲネチックス、第117巻、第211〜218頁（197
2）〕。

さらに、菌株M5219はbio252欠失をも含み、これはプロ
ファージにおけるkilを含めcIIIの左方に対する全ての
遺伝子を除去する。さらに、温度誘発の際菌株M5219は
染色体Ｎ遺伝子からの機能性Ｎ−遺伝子生産物を発現す
る。他方、菌株K12ΔHIはＮにおける二つのアンバ（amb
er）突然変異体を有し、これらはこの菌株を機能的にＮ
−陰性にする。

したがって、二種の菌株はP_Lプロモータからの発現を実
験的に付勢または滅勢することが可能である。さらにK1
2ΔHIまたはM5219の選択は、P_L媒介の転写をＮ遺伝子生
産物の不存在下または存在下に進行させるのを可能にす
る。また、イー・コリK12ΔHIもイー・コリM5219も機能
性cro遺伝子生産物を発現しないので、P_L媒介の発現に
おける二次抑制が避けられる。

本発明のベクタにおける幾つかの具体例の作成 ファージλプロモータについては幾つかの起源が周知さ
れているが、本発明によるベクタの作成に関する以下の
例示目的には、ファージλtrp44cI At₂cro^-をファージ
λプロモータの起源として選択した。

ファージλtrp44 cI At₂cro^-の生成はエヌ・フランクリ
ンにより記載されている〔「λのＮオペロン：大腸菌の
トリプトファンオペロンに対する融合物において観察さ
れる程度および調整」、ザ・バクテリオファージλ（コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリース）、第
621〜638頁（1971）〕。cI遺伝子におけるAt₂突然変異
はリプレッサを温度感受性にする〔エム・リーブ、「熱
誘発性λバクテリオファージの研究.I.突然変異プロフ
ァージの遺伝子部位の程度および性質」、ジャーナル・
モレキュラー・バイオロジー、第16巻、第149〜163頁
（1966）〕。cro^-突然変異は、P_L機能の二次抑制を防止
する。勿論、長期発現については大して好ましくない
が、cro⁺ファージも本発明のベクタに使用しうるであろ
うことを了解すべきである。さらに、ファージは機能性
Ｎ遺伝子活性P_Lプロモータとを担持する。ファージは、
同族のtrpプロモータ自体によって得られるものよりも
３〜４倍高いレベルのtrp酵素発現を与える〔エヌ・フ
ランクリン、上記〕。

λtrp44cI At₂cro^-DNAは、CsCl精製されたファージ粒子
からのフェノール抽出によりこのファージから調製し
た。このファージのP_LO_L領域の構造を第１図に示す。

P_Lプロモータと隣接オペレータ（O_L）とは、Ｎ遺伝子配
列の開始部と共に、DNAの延びすなわち約100塩基対長さ
内に規定され、λ地図上の約73.4％に位置する（第１
図）〔ティー・マニアチス等、「バクテリオファージλ
のオペレータにおけるリプレッサおよびポリメラーゼの
認識配列」、セル誌、第５巻、第109〜113頁（1975）；
ジェー・ダールベルクおよびエフ・ブラットナー、「バ
クテリオファージλの主要左方RNAのプロモータ−オペ
レータ近心域における配列」、ヌクレイック・アシッド
・リサーチ、第２巻、第1441〜1458頁（1975）〕。同様
に、P_Rプロモータと隣接オペレータ（O_R）とは、cro遺
伝子配列の開始部と共に、DNAの延び内に規定されてλ
地図上の約76.6％に位置する（第１図）〔ティー・マニ
アチス等、上記〕。

これら領域をファージλDNAから単離するための幾つか
の手段のいずれかを用いて、所望プロモータ配列を有す
るクローンを調製することができる。たとえば、制限酵
素の種々な組合せを使用して所望領域をファージλDNA
から開裂させることができる（第１図）。次いで、これ
ら断片を直接に使用してクローンを調製するか、或いは
クローン化前に当分野で知られた方法により断片をさら
に処理してこれらを切断または伸長させることもでき
る。

適当なDNA断片を調製した後、これを幾つかのクローン
化用運搬体もしくはベクタのいずれかに挿入することが
できる。たとえば、有用なクローン化用運搬体は染色
体、非染色体および合成のDNA配列の断片、たとえばSV4
0および公知細菌プラスミドの各種公知誘導体、たとえ
ばColEI、pCR1、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体を
包含するイー・コリからのプラスミド、広宿主範囲のプ
ラスミド、たとえばRP4、スァージDNA、たとえばファー
ジλの多数の誘導体、その他DNAファージ、フィラメン
ト状単一鎖DNAファージ、たとえばM13ならびにプラスミ
ドとファージDNAもしくは酵母プラスミド（たとえば２
μプラスミド）との組合せから得られるベクタまたはそ
の誘導体から構成することができる。

さらに、各特定のクローン化運搬体において、種々の部
位を用いてファージλDNA断片を挿入することができ
る。これらの部位は通常、それらを切断する制限エンド
ヌクレアーゼにより命名される。たとえば、pBR322にお
いてはDNA断片挿入に使用しうる種々の制限部位が存在
する〔エフ・ボリバール等、「新規なクローン化運搬体
の作成および特性化。II、多目的クローン化系」、ジー
ン誌、第２巻、第95〜113頁（1977）；ジェー・ジー・
サットクリフ、「DNA配列から誘導されるpBR322制限地
図:4361ヌクレオチド対長さまでの正確なDNA寸法マー
カ」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第５巻、第
2721〜2728頁（1978）〕。第２図および第４図をも参
照。勿論、本発明に有用なクローン化運搬体はファージ
λDNA断片を挿入するための制限部位を有する必要はな
いことを了解すべきである。寧ろ、運搬体は、本発明に
よる所望ベクタを生産する別の手段により断片に結合さ
せることができた。

A.複製開始点に対し反時計方向にP_Lプロモータを有する
本発明によるベクタ＊ I.pPLa23 次に第２図を参照して、本発明のpPLa23の一改良ベクタ
を順次の過程において調製した。これらを第２図に示
し、以下さらに詳細に説明する。

（ａ）中間プラスミドpPLa2 上記で単離されたλtrp44cI At₂cro^-DNAをBamHIおよびE
coRIで消化して、λ地図上の約71.3％から81.02％まで
延在する断片を切除した（第１図および第２図）。開始
点断片の方向性は、通常示されると同様にpBR322中に存
在すると解釈される（サットクリス等、上記）。同様に
して、pBR322をBamHIおよびEcoRIにて消化しそしてファ
ージλDNA断片を切除EcoRI-BamHI pBR322断片の代りに
挿入した（第２図）。

得られたベクタをpPLa2と名付け、ここで「ａ」は複製
開始点に対しP_Lプロモータの反時計方向を示す。この分
子に関するλ情報はファージのBamHI部位（71.3％）か
らEcoRI部位（81.02％λ）まで延在し、これは遺伝子
Ｎ、O_LP_L領域、遺伝子rexおよびcI（突然変異体）、O_RP
_R領域、遺伝子cro（突然変異体）およびcII、ならびに
遺伝子Ｏの部分を包含する（第１図および第２図）。

イー・コリc600（Cacl₂コンピテント）を、適当な条件
および封じ込めの下に、上記で調製されたpPLa2により
形質転換させた。形質転換種をファージλクリヤ変異体
の10⁹pfuが接種され（エム・リーブ、上記）かつ100μg
/mlのカルベニシリンをも含有するLB平板培地上で34℃
にて選択した。選択したλDNA断片はcI At₂遺伝子を含
み、したがってこの断片を含有する形質転換種は34℃に
おいてファージλクリヤ突然変異体に対し耐性である。
さらに、選択pBR322断片はアンピシリン耐性に関する遺
伝子を含み、したがってこの完全遺伝子を有するプラス
ミドで形質転換させた宿主は、このように形質転換させ
た宿主を除き、抗生物質を含有する培養物において増殖
するであろう。

20種の形質転換種を選択し、培養物を100μg/mlのカル
ベニシリンと10^-2MのMgCl₂とを含有するLB培地において
34℃で増殖させた。形質転換種がcI遺伝子を有する真正
の形質転換種であって、λファージを吸着しえない稀な
細菌ではないようにするため、培養物の一部にλクリヤ
またはλウイルスのいずれかを感染させた。〔エフ・ヤ
コブおよびイー・ウォールマン、「大腸菌のバクテリオ
ファージの発生研究.I.バクテリオファージλの発生
系」、アナーレン・インスチチュート・パスツール、第
87巻、第653〜690頁（1954）〕。20種の形質転換種は全
て、λクリヤに対する耐性とλウイルスに対する感受性
とを示した。

これら20種の形質転換種の１種からの型I DNAを標準法
により単離し、EcoRIおよびBamHIで制限しそして標準マ
ーカに対し大きさを決定した。DNAは、pBR322断片とフ
ァージλ断片との予想した大きさに対応する二つの帯域
を示した。

（ｂ）中間プラスミドpPLa20、すなわちpPLa2からのBgl
II断片の除去 pPLa2のλ領域は４個のBglII部位を有し、これらは73.7
7、78.80、80.16および80.28λに位置する（第１図およ
び第２図）〔ヴィー・ピロッタ、「バチルス・グロビギ
ィからの２種の制限エンドヌクレアーゼ」、ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ、第３巻、第1747〜1760頁（19
76）；エッチ・スジバルスキィおよびダブリュ・スジバ
ルスキィ、「バクテリオファージλの広汎な分子地
図」、ジーン誌、第７巻、第217〜270頁（1979）〕。

73.77％λと80.28％λとの間のBglII断片を除去するた
め、pPLa2DNAをBglIIで消化し、１μg/ml以下のDNA濃度
で再連結しそしてP_L依存性転写を阻止させるよう染色体
λリプレッサcIを有するイー・コリW6（λrex）（CaCl₂
コンピテント）に対し形質転換させた（第２図）。100
μg/mlのカルベニシリンを含有するＬ−ブロスにおいて
増殖させることによりカルベニシリン耐性クローンを選
択しそしてT₄rII638突然変異体を用いてλrex機能の損
失につき選別した。λrex機能はT₄rII638突然変異体の
増殖を防止する〔ビー・ハワード、「rII排除に欠ける
ファージλ突然変異体」、サイエンス誌、第158巻、第1
588〜1589頁（1967）〕。したがってpPLa2により形質転
換させた宿主における突然変異体の増殖の欠如に対比し
てT₄rII638突然変異体の増殖をこれらBglII制限形質転
換種が阻止しえないことは、BglII削除によりrex機能が
pPLa2組替えDNA分子から除去されていることを示してい
る。

これらBglII制限形質転換種の組替えDNA分子の制限酵素
分析は、単一BglII部位の存在を示した。さらに、EcoRI
およびBamHIでの消化は２個の断片をもたらし、一方は
予想pBR322断片に相当し、他方はBglII部位73.77％λと
80.28％λとの間の部分を除去した後のファージλDNA断
片の予想サイズ（1900塩基対）に相当した。この改変プ
ラスミドをpPLa20と名付けた。そのλDNA挿入物はBamHI
部位（71.3％）からBglII部位（73.77％）までおよびBg
lII部位（80.28％）からEcoRI部位（81.02％）まで延在
する。これは遺伝子ＮとO_LP_L領域と遺伝子Ｏの部分とを
含有する。（第１図）。

本発明におけるベクタの具体例の作成に関するこの実施
例の残余部分はP_Lプロモータ（すなわちBglII-BglII断
片と共にP_RプロモータがpPLa2から除去されたもの）に
向けられるが、同様な操作を用いてP_LプロモータをpPLa
2から除去すると共にP_Rプロモータを保持するベクタを
作成しうることも了解すべきである。さらに本発明の範
囲内のベクタはP_LとP_Rとの両プロモータを有する同様な
手段により作成することができ、これら二つのプロモー
タは挿入DNA配列の発現を媒介すべく調和してまたは相
反して作用する。

（ｃ）pPLa23、すなわちP_Lから下方の短距離におけるEc
oRI部位の導入 pPLa20上に存在するBglII-BamHI断片は、P_Lの下方約150
個のヌクレオチドに位置する単一のHaeIII部位を有する
〔73.1％λ、第１図〕〔ビー・アレットおよびアール・
ソレム、「バクテリオファージλDNAにおけるプロモー
タ部位の特定エンドヌクレアーゼによる分離および分
析」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第85
巻、第475〜484頁（1975）〕。この部位は、デオキシリ
ボヌクレオシド三燐酸の存在下にDNAポリメラーゼＩで
１日３′−末端を伸長させることにより予めフラッシュ
末端化された開裂EcoRI末端に対し、開裂HaeIII末端を
フラッシュ末端連結させてEcoRI部位に変換することが
できる〔ケー・ベックマン等、「バクテリオファージλ
のcI遺伝子を有するプラスミドの作成」、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第7
3巻、第4174〜4178頁（1976）〕。手順の詳細を以下に
説明しかつ第２図に図示する。

6pモルのpBR322をEcoRIで消化した。酵素を熱失活させ
た後、DNAを沈澱させそして50mMのトリス−HCl（pH7.
8）と5mMのMgCl₂と1mMのβ−メルカプトエタノールと２
μＭのそれぞれ４種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸
〔α‐P³²-dATP(345CiP³²／ミリモル）を有する〕と50
μｇのBSA/mlとを含有する緩衝液250μｌ中に溶解させ
た。イー・コリからのDNAポリメラーゼＩ（ワーシント
ン社）の６単位を加えそして混合物を16℃にて90分間培
養した。この過程により、線状化pBR322における開裂
３′EcoRI部位のフラッシュ末端化（flushending）が達
成された。

酵素を熱失活させた後、混合物を50mMのNaCl、7mMのβ
メルカプトエタノールまで調整し、そしてDNAをBamHIに
より消化した。1.4％アガロースゲル上での電気泳動に
より断片を分離し、オートラジオグラフにより検定し
た。２個の断片のうち大きい方を含むゲル切片（すなわ
ち開裂BamHI部位とフラッシュ末端化EcoRI部位とを有す
るpBR322）を切り取って−90℃にて凍結させた。次いで
このアガロース片をソルバールSS34型ロータにて20,000
rpmで20分間遠心分離した。排除された上澄液を取り出
し、凍結および遠心分離過程をさらに２回繰り返した。
これら条件下において、アガロース切片中に含有された
DNAの約30％が上澄液中に浸出した。浸出されたDNAを合
併上澄液から沈澱させ、10mMのトリス−HCl（pH7.4）と
50mMのNaClと7mMのβ−メルカプトエタノールとの10μ
ｌ中に溶解させた。

2pモルのpPLa20をBglIIとBamHIとで消化し、断片をアガ
ロースゲル上で分離した。小さい方の断片（BglII-BamH
I）を上記のようにゲルから溶出させ、BspRIすなわちHa
eIIIのイソシゾマー〔エー・キス等、「バチルス・スフ
ァエリクス（Bacillus sphaericus）からの新規な配列
特異性エンドヌクレアーゼ（Bsp）」、ジーン誌、第１
巻、第323〜329頁（1977）〕により消化してBamHI-BspR
I断片とBspRI-BglII断片との混合物を生成させ、後者の
断片はP_Lプロモータを有した。酵素BglIIとBamHIとは同
一の開裂端部を作り、したがって開裂BglII端部を開裂B
amHI端部に連結させることができ、またその逆もでき
る。さらに、いずれかの連結の結果はもはやBglIIもし
くはBamHIに対する基質とはならないが、酵素Sau3A1（M
boＩ）により認識される。（ヴィー・ピロッタ、上
記〕。

2pモルの上記pBR322-EcoRI-BamHIの大きい断片をBamHI-
BspRI断片とBspRI-BglII断片との混合物0.8pモルに連結
させた。連結後（pBR322断片上の開裂BamHI部位はpPLa2
0断片の開裂BglIIまたはBamHI部位のいずれかに連結さ
せるのに使用でき、さらにpBR322断片上のフラッシュ末
端化EcoRI部位はpPLa20断片のBspRI（HaeIII）部位に連
結させるのに使用できる）、混合物をBamHIで消化し
て、pBR322ベクタ中に挿入された望ましくないBamHI-Bs
pRI断片からなる組替え分子を除去した。得られた混合
物でイー・コリM5219を形質転換させ、形質転換種をカ
ルベニシリン耐性について選別した。全部で23種の形質
転換種が得られた。これら形質転換種の全てはテトラサ
イクリン感受性（pBR322も有している）であった。何故
なら、pBR322のBamHI制限酵素処理は、Tet^Rをコードす
る遺伝子をもはや改変プラスミドにおいてもとのままに
しないからである。（第２図）。

P_L担持BspRI-BglII断片のこれらクローンにおける継続
的存在を、HincIIでのDNAの消化により検査した。pBR32
2は２個のHincII部位を有し〔ジェー・サットクリフ、
上記〕かつ予期したλP_L断片は単一のHincII部位（73.4
％λ、第１図）を有する〔ビー・アレットおよびアール
・ソレム、上記〕ので、正しく作成された組替えDNA分
子は３個のHincII部位を有する筈である。得られた23種
の形質転換種のうち、５種のものが３個の予想HincII部
位を有した。これらのうち３種は独特のEcoRI部位を有
し、これらクローンにおいてpPLa20断片のBspRI（HaeII
I）部位とpBR322断片のフラッシュ末端化EcoRI部位との
間に正確な接合部を形成したことを示した。これら３種
のクローンは、さらに、pBR322断片のBamHI末端に対す
るpPLa20断片のBglII末端の予期した連結により予想さ
れるように、BamHI部位を欠如した。これらクローンの
うち１種を後の研究用として選択し、pPLa23と名付け
た。（第２図） pPLa23は、BamHI部位（pBR322の塩基対377）からEcoRI
部位（pBR322の塩基対4362）まで延在するpBR322断片か
らなっている。〔ジェー・サットクリフ、上記〕（第２
図）。残部のpBR322は、pPLa23において、73.3％λにお
けるHaeIII部位（今回再編成されたEcoRI部位）と73.77
％λにおけるBglII部位（今回のSau3A部位）との間に位
置するλtrp44cI At₂cro^-DNAの断片により代替されてい
る（第２図）。この断片の大きさを、アガロースゲル電
気泳動により約300塩基対であると推定した。この断片
には、O_LP_L領域とＮ遺伝子転写物の最初の115個ヌクレ
オチドとが含有される〔ジェー・ダールベルクおよびエ
フ・ブラットナー、上記〕。P_Lプロモータの転写の方向
は、BglII部位からHaeIII部位の方向に指向し、pBR322
のβ−ラクタマーゼプロモータからの転写と同方向であ
る〔ジェー・ダールベルクおよびエフ・ブラットナー、
上記；ジェー・サットクリフ、上記〕。

プラスミドの二つの特徴は特に興味がある。

（１）P_Lプロモータとβ−ラクタマーゼ遺伝子とをコー
ドする領域は単一のHaeII断片上に存在し、pBR322の塩
基対2720および436におけるHaeII部位により示される
（第３図）〔ジェー・サットクリフ、上記；ビー・アレ
ットおよびアール・ソレム、上記；ヴィー・ピロッタ、
上記〕。（２）複製開始点は、β−ラクタマーゼ担持Ha
eII断片に隣接した370塩基対HaeII断片上に位置する
（第３図）。機能性複製開始点は、位置2720におけるHa
eII部位近傍の接合部が維持されることを必要とする
〔エー・オカ等、「小ColEl誘導体のヌクレオチド配
列。自己再生およびコリシンEl免疫に対し必須とされる
領域の構造」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチック
ス、第172巻、第151〜159頁（1979）〕。pPLa23のこれ
ら特徴を利用して、第二の抗生物質耐性マーカをベクタ
中に導入した。

2.pPLa231およびpPLa2311、すなわちpPLa23中へのカナ
マイシン耐性マーカの導入 第３図を参照して、pPLa23から本発明の他のベクタを調
製するため使用した過程を示す。これら過程を以下、一
層詳細に説明する。

カナマイシン耐性をコードするHaeII断片をプラスミドp
MK20から得た〔エム・カーン等「プラスミドColElから
誘導されたプラスミドクローン化運搬体、Ｆ、R6Kおよ
びRK2」、メソッド・イン・エンザイモロジー、第68
巻、第268〜280頁（1979）〕。プラスミドpMK20に関す
る複製開始点は、主として359塩基対HaeII断片内に含有
された。しかしながら、この開始点はさらに、この断片
と隣接HaeII断片との間の接合部を離間する〔エム・カ
ーン等、上記〕。このHaeII部位近傍のヌクレオチド配
列は、位置2720におけるHaeII部位近傍でpBR322におい
て見られる配列と同一である〔エー・オカ等、上記；ジ
ェー・サットクリフ、上記〕。

pPLa23とpMK20との混合物をHaeIIにより完全に消化さ
せ、再連結しそしてイー・コリM5219（CaCl₂コンピテン
ト）を形質転換させた（第３図）。正しく形質転換した
コロニを、それらのカルベニシリンおよびカナマイシン
耐性に基づいて選択した。何故なら、pBR322からのβ−
ラクタマーゼ遺伝子とpMK20からのカナマイシン遺伝子
とを有するクローンのみが、二重の抗生物質耐性を示す
からである。12種の二重耐性形質転換種を選択した。こ
れらの形質転換種から上記と同様にプラスミドDNAを単
離しそしてHaeII制限および６％アクリルアミドゲル上
での断片寸法決定とにより分析した。これらクローンの
うち５種は僅か３個のHaeII断片、すなわちP_Lプロモー
タとβ−ラクタマーゼ遺伝子とを有するpPLa23のHaeII
断片に対応するHaeII断片と、カナマイシン耐性に関す
る遺伝子を持ったpMK20のHaeII断片に対応するHaeII断
片と、pMK20から誘導されかつプラスミド再生に必要と
される小HaeII断片とを有した（第３図）。

これら５種の選択クローンをさらに検査して、pPLa23か
らのHaeII断片における再編成EcoRI部位に対する、pMK2
0からのHaeII断片を有するカナマイシン遺伝子の方向性
を決定した。pMK20からのHaeII断片を有するカナマイシ
ン遺伝子は、独特の非対称HindIII部位を有することが
知られている〔エム・カーン等、上記〕（第３図）。し
たがって、この部位は断片の方向性を決定する手段を与
える。

５種のクローンをHindIIIおよびEcoRIで消化し、得られ
た断片を前記のようにサイズ決定した。５種のクローン
のうち４種が、pMK20からのHaeII断片を有するHindIII
開裂カナマイシン遺伝子の大きい方の部分を開始点含有
の小HaeII断片に隣接して有した。１種のクローンは反
対の方向性を示した。これら二組のクローンをそれぞれ
任意にpPLa231およびpPLa2311と命名した（第３図）。

pPLa2311を上記作成に係るプラスミドから任意に選択
し、P_L領域のヌクレオチド配列を決定した。

配列決定するに先立ち、二組の制限断片をpPLa2311から
調製し、すなわちEcoRI-HincII断片とHincII-EcoRI-Xho
断片とである（第３図に示さず）。両場合において、pP
La2311を第一制限酵素で消化し、得られた断片にT₄ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（P-Lビオケミカルス社）を用い
てP³²をラベルした。次いで、断片を第二制限酵素また
はEcoRI-XhoＩの場合には酵素対により消化し、そして
断片を６％アガロースゲル上で分離した。配列決定は、
エー・マキサムおよびダブリュ・ギルバートの手順を用
いて常法で行なった。〔「DNAの新規な配列決定法」、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
ス・USA、第74巻、第560〜564頁（1977）〕。

この領域のヌクレオチド配列を第６図に示す。これは、
pBR322におけるHaeII部位から、λファージ断片とpBR32
2との間の接合部における再編成EcoRI部位まで延在す
る。決定された配列は、公知配列と比較して次の特徴を
有する。（１）O_LP_Lオペレータ−プロモータ領域のヌク
レオチド配列は、ファージλにおけるこの領域の配列と
同一である〔ティー・マニアチス等、上記〕。（２）Ha
eII部位と、λファージ断片とpBR322との間の接合部に
おけるSau3A部位との間の配列は、標準pBR322における
それと同一である〔ジェー・サットクリフ、上記〕。
（３）Ｎ遺伝子転写物の配列は、ダールベルクおよびグ
リーンブラット（上記）によりmRNAレベルにおいて決定
された配列と一致し、ただし転写物の位置41において１
個のアデノシン残基が削除されている。（４）この配列
はＮ遺伝子の翻訳開始信号を含まない〔エヌ・フランク
リンおよびジー・ベネット「バクテリオファージλのDN
A配列により規定されるそのＮ蛋白質は高度に塩基性で
ある」、ジーン誌、第８巻、第107〜119頁（1979）〕。

3.pPLa4およびpPLa8、すなわちpPLa2311のβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子におけるPst部位からBamHI部位への変換 第３図および第７図は、pPLa2311のβ−ラクタマーゼ遺
伝子におけるPstＩ部位からBamHI部位への変換を大略示
している。プラスミドpPLa2311をPstＩにより線状化さ
せた。フェノールおよびクロロホルム抽出の後、DNAを
沈澱させ、25mMのNaCOOCH₃（pH4.5）と1mMのZnCOOCH₃と
125mMのNaClとに50pモル/mlの濃度で再溶解させそしてD
NApモル当り1.5単位のS1ヌクレアーゼ（シグマ社）によ
り25℃にて90分間処理して３′−突出末端を除去した
（第７図）。反応は、5mMまでのEDTAの添加により停止
させた。混合物を0.2％SDSの存在下に70℃で10分間培養
することによりS1ヌクレアーゼを除去し、次いでフェノ
ールおよびクロロホルム抽出を行なった。DNAを、４容
量の2M NH₄COOCH₃と14容量のエタノールとの添加により
沈澱させた。

回収されたDNAは、10倍モル過剰のBamHIリンカ分子（コ
ラボラチブ・リサーチ・インコーポレーション）に平滑
末端（blunt-end）連結させた（シー・バール等、「ク
ローン化用運搬体中に特定DNA配列を挿入する一般的方
法」、ジーン誌、第１巻、第81〜92頁（1977）〕（第７
図）。BamHIでの開裂および低DNA濃度での再連結の後
（第７図）、混合物をPstＩで開裂させて、S1ヌクレア
ーゼ処理を逃れかつ完全PstＩ部位に保持されているよ
うな分子を選択した。次いで２μｇの処理DNAをイー・
コリM5219に形質転換させ、形質転換種をカナマイシン
耐性により選択した。全部で10種の形質転換種が得ら
れ、そのうちの２種はPst部位を欠如しかつBamHI部位を
獲得していた。これら後者２種の形質転換種の組替えDN
A分子をpPLa8およびpPLa4と名付けた（第３図、pPLa4は
第３図に図示せず）。これら形質転換種の組替えDNA分
子における混成EcoRI-BamHI消化の後に得られた断片
は、EcoRI-PstＩ開裂後にpPLa2311から得られた断片と
一緒に1.4％アガロースゲル上にて移動した。したがっ
て、pPLa2311におけるPstＩ部位は、BamHI部位により交
換されている。

再び第７図を参照して、β−ラクタマーゼ遺伝子に関す
る過程の上記配列の効果を示す。第７図に示されている
ように、作成の最終的結果は、β−ラクタマーゼ蛋白質
における位置182のAlaアミノ酸残基を配列Arg-Ile-Arg
により交換することである。この交換はβ−ラクタマー
ゼ遺伝子のリーディングフレームを完全のままにするの
で、再編成クローンの形質転換種はカルベニシリン耐性
を示すことが予想された。この予想に反し、pPLa4およ
びpPLa8により形質転換させた宿主細胞はカルベニシリ
ン耐性でなかった。

4.pPLa83、すなわちpPLa8のEcoRI部位に隣接するBamHI
の導入 プラスミドpAD3（エッチ・シャラーにより寄贈）は、pB
R322のBamHI部位に挿入された47個の塩基対配列を有す
る。この配列は次の単位からなっている：BamHI部位−E
coRI部位−乳糖オペレータ−EcoRI部位−BamHI部位。こ
の配列をpPLa8の再編成BamHI部位に挿入するため、pPLa
8と10倍過剰のpAD3とをBamHIによって消化し、再連結し
そしてイー・コリW6（λrex）に形質転換させた（第４
図）。形質転換種を、最少量の培地と50μg/mlのカナマ
イシンと0.1％のグルコースと40μg/mlのXgal（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
シド）とを含有する平板上で選別した〔ジェー・ミラ
ー、エキスペリメント・イン・モレキュラー・ゲネチッ
クス（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
ス）、第48頁（1972）〕。何故なら、Xgal色素の存在
は、乳糖−オペレータ断片を含有する形質転換種の検出
を可能にするからである。実際、その培地において、乳
糖オペレータ含有の形質転換種は青色になり、したがっ
て他の形質転換種から容易に区別できる。

組替えDNA分子を上記のように青色コロニーの一つから
単離し、EcoRIによって消化した。得られた２個の断片
は、pPLa8のEcoRI-BamHI消化から得られた２個の断片と
実質的に一緒にアガロースゲル上で移動し、それにより
pAD3からの所望の47塩基対断片がpPLa8の再編成BamHI部
位に正しく挿入されたことを確認した。このプラスミド
をpPLa83と名付けた（第４図）。

5.pPLa831、すなわちpPLa83におけるP_Lプロモータに対
しBamHI部位の一層の近接 pPLa83におけるP_Lプロモータに対しBamHI部位をより近
接させるため、EcoRI-EcoRI断片をEcoRIでのpPLa83の消
化および希薄DNA濃度における再連結により除去した
（第４図）。得られた組替えDNA分子からイー・コリW6
（λrex）への形質転換および上記したようなXgalおよ
びカナマイシンを補填した最少量培地を含む平板上での
増殖は、もはや乳糖オペレータ領域を持たないようなク
ローンの選別を可能にした。選別形質転換種からのDNA
のBamHI-XhoＩによる制限、および得られた断片の移動
とpPLa8のEcoRI-XhoＩ消化から得られた２個の断片の移
動との比較により、予想通り、改変プラスミドにおける
BamHI部位がP_Lプロモータから約150塩基対にあったこと
を確認した。この改変プラスミドをpPLa831と名付け
た。

勿論、上記３、４および５のいずれかに記載されたと同
様な操作を用いて、本発明のベクタにおける選択プロモ
ータおよびオペレータから300塩基対以内に他のエンド
ヌクレアーゼ認識部位を与えうることも了解すべきであ
る。このような操作の例は下記のものを包含する。

6.pPLa832、すなわちpPLa831のBamHI部位に隣接したHin
dIII部位の挿入 プラスミドpAD16（エッチ・シャラーにより寄贈）は、B
amHI部位−HindIII部位−HindIII部位−BamHI部位から
なるpBR322のBamHI部位に挿入された36塩基対断片を含
有する。この配列をpPLa831のBamHI部位に挿入するた
め、pPLa831と10倍過剰量のpAD16とをBamHIで開裂さ
せ、再連結しそしてイー・コリM5219を形質転換させ、
カナマイシン耐性につき選別した（第４図）。pPLa831
中への所望BamHI断片の適切な挿入を決定するための容
易な選別方法が存在しないので、カナマイシンの存在下
で増殖した形質転換種の分析は、個々のランダム選択し
たクローンの制限開裂に依存した。分析した32種のクロ
ーンのうち、HindIIIでの開裂後に２個の断片を生成す
る１種を見出した（第４図）。これら断片の大きさは、
pPLa831のBamHI-HindIII開裂またはEcoRI-HindIII開裂
の後に得られた断片から1.4％アガロースゲル上で区別
できなかった。この改変プラスミドをpPLa832と名付け
た。

B.複製開始点に対し時計方向の方向性でP_Lプロモータを
含有するベクタ 1.pPLc2、すなわちpPLa832のP_L担持断片のクローン化 pBR322とpPLa832との等モル混合物をBamHIにより、次い
でHindIIIにより開裂させた（第４図）。この混合物を
再連結し、M5219を形質転換させてカルベニシリン耐性
につき選択した。この構成の正しく調製された組替えDN
A分子はもはやテトラサイクリンに対する完全遺伝子を
含まないので、これら形質転換種をさらにテトラサイク
リン耐性の喪失につき選別した。組替えDNA分子を上記
と同様に選択形質転換種から単離し、制限により分析し
た。選択したプラスミドは単一のHindIII部位を含有し
た。混成HindIII-BamHI消化は２つの断片をもたらし、
これらはアガロースゲル上において、単一のEcoRI消化
により得られた２つの断片と実質的に一緒に移動した。
P_L担持断片の存在はHincII消化により証明された。この
酵素はベクタを３個の断片に開裂し、それらの大きさは
第４図に示した断片の構造と一致した。このプラスミド
をpPLc2と名付け、ここで「ｃ」は複製開始点に対しP_L
プロモータの時計方向の方向性を示す。

2.pPLc23、すなわちpPLc2からの１個のEcoRI部位の除去 プラスミドpPLc2は２つのEcoRI部位を含有し、１つは親
pBR322ベクタから由来したものであり、１つはpPLa832
からのHindIII-BamHI断片の挿入により導入されたBamHI
部位に近接するものである（第４図）。pBR322から由来
したEcoRI部位を、HindIIIおよびXhoＩでのpPLc2の開裂
に続き、0.6MのNaClと各12.5mMのCaCl₂およびMgSO₄と1m
MのEDTAと20mMのトリス−HCl（pH8.1）とにおけるBal31
での25℃、30分間の消化によって除去した。エンドヌク
レアーゼBal31は３′−および５′−未満を段階的に滅
勢する〔エッチ・グレー等、「シュードモナスBal31の
細胞外ヌクレアーゼ。I.単一鎖−特異性デオキシリボエ
ンドヌクレアーゼおよび二重鎖デオキシリボエキソヌク
レアーゼ活性の特性化」、ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ、第２巻、第1459〜1492頁（1975）〕。

混合物をフェノールとクロロホルムとで抽出し、DNA濃
度／μg/mlまで希釈し、次いで連結した。連結後、DNA
をXhoＩおよびHindIIIにより再び開裂させて親プラスミ
ド分子を除去しそしてM5219を形質転換させてカルベニ
シリン耐性につき選別した。HindIIIおよびXhoＩ部位を
欠如する１つの形質転換種を見出した。このプラスミド
は単一のEcoRI部位を含むと共に、３つのHincII部位を
有した（第４図）。この後者の性質により、P_L領域がま
だ存在することが確認された。このプラスミドをpPLc23
と名付けた。Bal 31酵素によるエキソヌクレアーゼ減成の程度を評価
するため、pPLc23DNAをBamHIとPstＩとにより同時に開
裂させ、これら断片を1.4％アガロースゲル上で大きさ
を決定した。親pPLc2からのPstI-BamHI断片と比較し
て、pPLc23からのPstI-BamHI断片は800塩基対以上の除
去を示した。EcoRI-PstＩ開裂に対比してEcoRI-PstI-Ha
eIIによる混成消化は、P_L担持断片とカナマイシン断片
との間の接合部におけるHae部位が維持されていること
を確認した。

3.pPLc236、すなわちpPLc23へのHindIII部位の導入 プラスミドpPLc23は、P_Lプロモータから下方約150ヌク
レオチドに位置する独特のEcoRIおよびBamHI部位を含有
する。HindIII挿入部位を、pPLc832から得られたBamHI-
HindIII-HindIII-BamHI断片をpPLc23のBamHI部位に連結
することにより、pPLc23中に導入した。M5219において
形質転換種を得、これらをHindIII部位の存在について
制限分析により選別した。代表的クローンの構造は、Ps
tI-EcoRI、PstI-BamHIもしくはPstI-HindIII消化の後に
得られた断片のアガロースゲル電気泳動により確認し
た。これら各混成消化の後に得られた断片は1.4％アガ
ロースゲル上にて実質的に一緒に移動し、このことはEc
oRI、BamHIおよびHindIII部位が互いに近接して偏在す
ることを示している。このプラスミドをpPLc236と名付
けた（第４図）。

プラスミドpPLc236の大きい方の部分は、位置377におけ
るBamHI部位（ジェー・サットクリフ、上記）から位置4
160近傍におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子の少なくとも
開始部位（ジェー・サットクリフ、上記）までpBR322に
由来する。残部は次のものから構成される：（１）Xho
部位とこの断片の１つのHaeII末端との間に位置するカ
ナマイシン遺伝子の部分に由来する配列；（２）約300
個のヌクレオチドからなりかつpPLa832に由来するP_Lプ
ロモータを含有するHaeII-BamHI断片；（３）BamHI-Hin
dIII-HindIII-BamHI部位をコードする配列。

4.pPLc28、すなわちpPLc236からの除去 pPLc236における２つの隣接するHindIII部位の重複はBa
lＩ部位である（第４図に示さず）。さらに、このプラ
スミドは、pBR322部分の塩基対2067に、独特のPvuII部
位を含有する〔ジェー・サットクリフ、上記〕（第４
図）。酵素BalＩおよびPvuIIの両者はフラッシュ末端を
もたらす。pPLc236DNAをBalＩおよびPvuIIによって開裂
し、低DNA濃度で再連結した。形質転換種をM5219にて獲
得し、カルベニシリン耐性につき選択した。代表的クロ
ーンのDNAは制限により分析した。BamHI開裂は単一の断
片を生成し、これは1.4％アガロースゲル上においてBam
HI-PvuII開裂後のpPLc236の大きい方の部分と共に移動
した。PstI-EcoRI、PstI-BamHIまたはPstI-HindIIIのい
ずれかによる混成消化は、各場合に２つの断片を生成
し、その小さい方の断片は1.4％アガロースゲル上にお
いてpPLc236から得られたPstI-EcoRI断片と実質的に一
緒に移動した。このプラスミドをpPLc28と名付けた（第
４図）。

pPLc28は、本発明により記載された他のプラスミドと同
様に、さらに処理して他の制限部位を挿入しうることは
勿論である。たとえば、次のもの：Xba制限部位‐Sal制
限部位‐Xba制限部位‐Pst制限部位‐Xba制限部位、を
含有する断片は、pPLc28中のHindIII制限部位に挿入さ
れている。このプラスミドをpPLc2819と名付けた。他の
同様な操作は、pPLc28のBamHI部位に挿入された断片Pst
制限部位‐Sal制限部位‐Xba制限部位‐Sal制限部位‐X
ba制限部位を含有するプラスミドを与えた。このプラス
ミドをpPLc2833と名付けた。

5.pPLc24、すなわちpPLc28中へのバクテリオファージMS
2レプリカーゼ蛋白質のリボソーム結合部位およびアミ
ノ末端部分の挿入 バクテリオファージMS2レプリカーゼ遺伝子のリボソー
ム結合部位および最初の98個のアミノ酸残基をコードす
る431塩基対EcoRI-BamHI断片をプラスミドpMS2-7から得
た〔アール・デボス等、「バクテリオファージMS2RNAの
ほぼ完全サイズDNAコピーを含有するプラスミドの作成
および特性化」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロ
ジー、第12巻、第595〜619頁（1979）〕。この断片をプ
ラスミドpPLc28中に挿入して、そこの元来のEcoRI-BamH
I断片を交換した（第５図）。pPLc24と名付けたこの得
られたプラスミドの構造を、EcoRI-BamHIでの制限分析
ならびに、得られた断片とpMS2-7およびpPLc28のEcoRI-
BamHI消化により得られたものとの比較により証明し
た。pPLc24において、MS2レプリカーゼ蛋白質断片の翻
訳はP_Lプロモータからの転写と平行して進行し、したが
ってP_L制御下におかれる。

本発明のベクタにより形質転換された宿主細胞の生物学
的性質 1.28℃における安定性 上記ベクタのいずれかにより形質転換させた菌株K12ΔH
IまたはM5219を、抗生物質耐性マーカに関する選択なし
に、LB培地において20世代にわたり28℃にて増殖させ
た。次いで培養物の適当な希釈物を、所望の抗生物質の
存在下または不存在下のいずれかにおいて28℃にて平板
に接種した。全ての場合、得られた集落の数は抗生物質
耐性についての選択とは無関係に同じであり、このこと
はベクタがこれら宿主において28℃で完全に安定であっ
たことを示している（第１表参照、下記）。

さらに、全てのベクタは、バクテリオファージλに対し
溶原性の宿主菌株を形質転換させることができた。存在
ファージが野性型cI生産物を合成するこの種の菌株は高
温（37℃）にて生存可能であった。これに対し、非溶原
性宿主はこれらベクタにより形質転換させ得なかった。
寧ろ、これら実験から得られた稀な形質転換種は常に、
P_L領域の全部または殆んどを除去する欠失を伴なったベ
クタを含んでいた。

2.42℃における長期誘発後のP_Lベクタを含有する細胞の
挙動 本発明のベクタにより形質転換させた菌株K12ΔHIおよ
びM5219の42℃における平板接種の効果を、抗生物質選
択の存在または不存在下で決定した。

複製開始点に対し時計方向の方向性にてP_Lを挿入したベ
クタ（pPLc型）は同様に挙動した。pPLc236により得ら
れた結果を第１表に示す（下記）。pPLc236で形質転換
させた菌株K12ΔHIを、抗生物質選択を行なったかどう
かには無関係に、42℃におけると同様に28℃においても
平板接種した。

pPLc236で形質転換させた菌株M5219を非選択平板上に接
種して１の効果を得た。しかしながら、抗生物質選択を
行なった場合、接種の効果は少なくとも1000倍低下し
た。非選択平板上で42℃にて得られた集落は、もはや抗
生物質マーカに対する耐性を持たなかった。

複製開始点に対し反時計方向の方向性で挿入されたP_Lを
有するベクタ（pPLa型）は、42℃においてより複雑なパ
ターンの集落形成を示した。菌種M5219の形質転換種
は、抗生物質選択の不存在においてさえ、42℃において
集落を形成しなかった（接種の効果は10^-3以下であっ
た。第１表）。42℃における菌株K12ΔHIの形質転換種
の挙動は、存在するベクタの性質に依存した。たとえ
ば、抗生物質選択を行なっても行なわなくとも、pPLa83
2を含有する形質転換種は常に少なくとも1000倍の接種
効果減少を示したのに対し、pPLa23またはpPLa2311を含
有する形質転換種は１〜10^-3の範囲の接種効果を示し、
しばしば集落の大きさにおける大きな不均一性を伴なっ
た。

したがって、42℃におけるpPLa型ベクタの発現は、宿主
代謝に対する阻害をひき起こし、プラスミドに対する選
択の不存在においてさえこの高温度では細胞が生存しえ
ないようにした。この効果は、M5219宿主を使用した場
合特に顕著である。逆に、pPLc型ベクタは宿主細胞代謝
に関し直接には阻害しない。何故なら、選択的圧力の不
存在において誘発細胞の100％生存が観察されるからで
ある。しかしながら、M5219におけるＮ遺伝子の発現と
同時的なP_Lプロモータからの継続的転写は、M5219菌株
におけるベクタ再生の阻止をもたらすであろう。このこ
とは、選択平板上において42℃でこれら細胞が増殖しえ
ないことにより示される。

＊細菌培養物を抗生物質の存在下で28℃にてLB培地にお
いて飽和するまで培養させた。適当な希釈物を抗生物質
の存在下または不存在下で平板接種し、28℃または42℃
にて培養した。得られた集落の数を測定した。

本発明のベクタにおける遺伝子の発現 1.一般的手順 本発明のベクタは、所望ポリペプチドもしくは蛋白質を
コードする遺伝子からなるDNA配列をプロモータおよび
オペレータに隣接するエンドヌクレアーゼ認識部位の一
つにおいてベクタ中に挿入し、これら挿入DNA配列を有
するベクタにより適当な宿主を形質転換させ、宿主を培
養しそしてポリペプチドもしくは蛋白質生産物を回収す
ることにより、種々のポリペプチドおよび蛋白質を生産
するため有用に使用することができる。この種のポリペ
プチドおよび蛋白質の例は、白血球インターフェロン、
インシュリン、肝炎の抗原、脚および口疾患の抗原、繊
維芽細胞インターフェロン、ひと成長ホルモン、免疫イ
ンターフェロンならびに各種の他の原核、真核およびウ
イルス酵素、ホルモン、ポリペプチド、抗原および蛋白
質を包含する。

これらの処理を説明するため、本発明のベクタにおける
特定遺伝子生産物の合成を、誘発細胞のパルス−ラベル
化（pulse-labelling）およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動でのラベル化蛋白質の分析により検定した。

本発明のベクタで形質転換させた細胞を、抗生物質のな
いLB培地において28℃にて２×10⁸/mlの密度まで増殖さ
せた。細胞を遠心分離により集め、19mMのNH₄Clと86mM
のNaClと42mMのNa₂HPO₄と1mMのMgSO₄と0.2％のグルコー
スと0.05％のカサミノ酸（ディフコ社）と0.01％の酵母
エキスと50μg/mlのＬ−トリプトファンとよりなる培地
の初期容量に懸濁させ、細胞をC¹⁴−アミノ酸混合物も
しくは上記培地でラベルし、ただし後者の培地はカサミ
ノ酸および酵母エキスの代りに５％メチオニン分析培地
（ディフコ社）を使用して細胞をS³⁵−メチオニンでラ
ベルした。28℃における培養を60分間続けた。次いで培
養物の半分を42℃に変化させた。誘発後の種々な時間に
おいて、28℃および42℃培養物からの部分をC¹⁴−アミ
ノ酸混合物またはS³⁵−メチオニン（アメルシャム社）
でラベルした。

ラベルの組込みは、フェノール抽出により停止させた。
合成蛋白質を５容量のエタノールの添加によりフェノー
ル層から沈澱させ、１％のSDSと１％のβ−メルカプト
エタノールと10％のグリセリンと62.5mMのトリス−HCl
（pH6.8）とに再溶解させた。試料を５分間煮沸し、120
00xgにて遠心分離しそしてユー・ラエムリの方法〔「バ
クテリオファージT4の頭部を組立てる際の構造蛋白質の
開裂」、ネイチャー誌、第227巻、第680〜682頁（197
0）〕によりSDS含有ポリアクリルアミドゲル（10〜15％
アクリルアミド）にて電気泳動にかけた。電気泳動の
後、ゲルをダブリュ・ボナーおよびアール・ラスキーの
方法〔「ポリアクリルアミドゲルにおけるトリチウム標
識した蛋白質および核酸の薄膜検出法」、ヨーロピアン
・ジャーナル・バイオケミストリー、第46巻、第83〜88
頁（1974）〕により螢光写真分析用に調整し、ただしPP
O-DMSOの代りにEN³HANCE（NEN）を使用した。

2.原核遺伝子 （ａ）β−ラクタマーゼ遺伝子 pPLa23（第３図）は、P_Lプロモータから下流に読み取れ
る方向性でβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。したがっ
て、β−ラクタマーゼ遺伝子によりコードされる蛋白質
の生産は、原核遺伝子を発現する際のベクタの効率を示
すものとして検定することができる。

pPLa23を有するK12ΔHIまたはM5219の形質転換種、すな
わちイー・コリK12ΔHI（pPLa23）およびイー・コリM52
19（pPLa23）、を上記のように調整しそしてその蛋白質
合成を検定した。その結果を第８図に示す。ここで判る
ように、それぞれ27.5Kおよび30Kの見掛け分子量を有す
る２種の蛋白質の合成速度における著しい増加が、42℃
における形質転換種の誘発直後に起こった。これら発現
された蛋白質の大きさは、成熟β−ラクタマーゼおよび
その先駆体の予想長さと一致する〔ジェー・サットクリ
ス、上記〕。さらに、これら蛋白質の誘発合成はオーカ
ラガン等の方法〔「染色体セファロスポリン基質を使用
するβ−ラクタマーゼの新規な検出方法」、アンチミク
ロビアル・エージェント・アンド・ケモテラピー、第１
巻、第283〜288頁（1972）〕により決定されるβ−ラク
タマーゼの酵素活性増加と平行しており、両蛋白質を抗
−β−ラクタマーゼ血清により特異的に沈澱させた。比
較として、ベクタpPLa23により形質転換されてない宿主
における蛋白質合成を検定した。これら非形質転換宿主
からは、２種の上記蛋白質のいずれの合成も観察されな
かった。

第８図に示されるように、これら形質転換種における蛋
白質合成の全体的パターンは28℃および42℃において極
めて類似する。しかしながら、幾つかの蛋白質の合成速
度は、細胞を42℃に移行させることにより顕著に変化す
ると思われる。pPLa23により形質転換されてない細胞に
おいても同様な挙動が観察された。さらに、第８図に示
されるように、２種のβ−ラクタマーゼ関連蛋白質にお
ける大きい方（すなわちβ−ラクタマーゼに対する未処
理先駆体）の相対的量は、誘発後の時間と共に増大す
る。先駆体蛋白質の蓄積へのこの指向は、細胞のβ−ラ
クタマーゼ処理装置の飽和を示すことがある。

形質転換種の全新規蛋白質合成に対比したβ−ラクタマ
ーゼの合成割合を決定するため、β−ラクタマーゼ（2
7.5K）とその先駆体（30K）とに対する蛋白質帯域を乾
燥ゲルから切除しそしてそれらの放射能をゲルに施こさ
れた全放射能と比較した。これらの結果を第２表に示
す。

第２表に示したように、β−ラクタマーゼおよびその先
駆体の合成は、両宿主細胞菌株において全新規蛋白質合
成の約30％という最高レベルに達する。しかしながら、
このレベルに達する速度は、２種の菌株について異なっ
ている。すなわち、30％レベルを達成するには、菌株K1
2ΔHIは菌株M5219よりも約20分遅れる。如何なる理論に
も拘束されるものでないが、菌株K12ΔHIの不存在下に
菌株M5219の誘発の際生産されるＮ遺伝子蛋白質は、P_L
プロモータから下方のDNA配列において或る種の転写遅
延信号を打ち破り、それにより菌株M5219におけるβ−
ラクタマーゼ合成を早めることがありうるであろう。

これら形質転換種における全蛋白質合成の速度を決定す
るため、特定時間間隔で組込まれた全放射能を測定し、
これを０〜10分間隔で組込まれたものと比較した（すな
わち、初期間隔は、比較用として任意に100％として選
択した）。その結果を第３表に示す。

第３表に示したように、イー・コリM5219（pPLa23）に
おける全蛋白質合成は、誘発後に急速に遅延した。これ
は、M5219形質転換種が42℃にて生存しえないという先
の観察と一致する。イー・コリM5219（pBR322）におい
ては、蛋白質合成の同様な抑制は観察されない。イー・
コリK12ΔHI（pPLa23）においては42℃での長期培養後
に、全蛋白質合成の相当な低下が観察される。しかしな
がら、これら細胞は温度42℃において生存することがで
きる。

（ｂ）トリプトファンシンセターゼＡ遺伝子 （ｉ）pPLa23 サルモネラ・トリフイムリウム（Salmonella tryphimur
ium）のtrpAシストロンを含有するEcoRI断片（5300b.
p.）をpES9から得〔イー・セルカー等、「プラスミドCo
lEl中に挿入されたサルモネラ・トリフイムリウムのtrp
AのマイトマイシンＣ誘発された発現」、ジャーナル・
バクテリオロジー、第129巻、第388〜394頁（197
7）〕、これをpPLa23のEcoRI部位に挿入した。P_Lプロモ
ータの方向に対し２つの可能な方向性のいずれかで挿入
されたこの断片を有する２種の代表的プラスミドをpPLa
23trpA₁およびpPLa23trpA₂と名付けた。

pPLa23trpA₁またはpPLa23trpA₂のいずれかを含有する菌
株K12ΔHIの誘発状況を第９図に示す。約25000ダルトン
の主要部分はpPLa23trpA₁により誘発されたが、pPLa23t
rpA₂を含有する誘発細胞には存在しなかった。この蛋白
質の観測された分子量はサルモネラ・トリフイムリウム
trpA遺伝子のヌクレオチド配列から予測された理論値
（28500）と一致した〔ビー・ニコルスおよびシー・ヤ
ノフスキイ、「サルモネラ・トリフイムリウムおよび大
腸菌のtrpAのヌクレオチド配列：発生比較」、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・US
A、第76巻、第5244〜5248頁（1979）〕。さらに、酵素
活性は、オー・スミスおよびシー・ヤノフスキイの手法
〔「トリプトファンの生合成に関与する酵素」、メソッ
ド・イン・エンザイモロジー、第５巻、第794〜806頁
（1962）〕により決定されるtrpA遺伝子生産物の存在と
一致し、この誘発蛋白質の蓄積と平行して増大した。

pPLa23trpA₁とpPLa23trpA₂との両者の長期誘発の後、約
18Kの分子量を有する蛋白質が合成される（第９図）。
形質転換種の全新規蛋白質合成に比較したこの蛋白質の
合成割合は、P_Lプロモータからの転写方向に対するEcoR
I trpA断片の方向性とは無関係である。したがって、恐
らくこの蛋白質の合成は、trpAについて必要とされるよ
りずっと大きなコード能力を備えた5300塩基対EcoRI tr
pA断片に存在するやや温度依存性の細菌プロモータによ
り制御されるであろう（イー・セルカー、上記）。

形質転換種における全新規蛋白質合成に比較したtrpAの
合成割合は、β−ラクタマーゼにつき前記したものとほ
ぼ同様に決定した。その結果を第４表に示す。ここで
も、trpA合成は全新規合成の約30％という最高レベルに
達した。

（ii）pPLa2311 pPLa23trpA₁に同一であり、pPLa2311に基づく組替えDNA
分子を前記したとほぼ同様に調製した。pPLa2311trpA₁
を有するK12ΔHI形質転換種は、pPLa23trpA₁のそれと同
様に挙動した（ただし、この実験において全新規合成の
最大レベルは150分後に僅か20％であった）。ここで
も、長期誘発は全蛋白質合成における正味の低下をもた
らした。

（iii）pPLc23 pES9のEcoRI断片はtrpB遺伝子内に位置する１つの末端
部を有し、EcoRI部位から約2500塩基対のところに単一
のSalＩ部位を含有する（イー・セルカー等、上記）。t
rpA遺伝子はSalＩ部位を含有しないので（ビー・ニコル
スおよびシー・ヤノフスキイ、上記）、trpA遺伝子は第
一EcoRI部位からSalＩ部位まで延在するpES9のEcoRI断
片の部分に完全に位置せねばならない。したがって、pE
S9の前記で調製したEcoRI断片をSalＩで消化し、得られ
た断片をそこのEcoRI-SalＩ断片に対する代替としてpPL
c23中に挿入した（第４図）。pPLa23trpA₁およびpPLa23
trpA₂におけるtrpA遺伝子の翻訳における観察方向に基
づいて、P_Lプロモータからの転写と平行してtrpA遺伝子
を有するpPLc23に基づく組替えDNA分子をpPLc23trpA₁と
名付けた。

イー・コリK12ΔHI（pPLc23trpA₁）の誘発（42℃）の
際、trpAは３時間の誘発後に全新規蛋白質合成の約40％
という最高レベルまで合成された。さらに、この高レベ
ルの新規合成は２時間にわたり維持された（第10図）。
これらの結果を第５表に示す（下記）。したがって、pP
La型ベクタの挙動に対比し、pPLc型形質転換種の蛋白質
合成は、誘発後５時間まで低下しない。

上記形質転換種中に蓄積する誘発蛋白質の実際の量を
も、誘発細胞の連続ラベリングによって測定した。イー
・コリK12ΔHI（pPLc23trpA₁）をLB培地で28℃にて１×
10⁷細胞/mlの密度まで増殖させた。次いで、細胞を10μ
CiのC¹⁴−アミノ酸混合物でラベルした。４×10⁷細胞/m
lの培養密度にて、細胞を42℃に変化させ、培養を続け
た。培養物が飽和に達した後（誘発６時間後）、蛋白質
を細胞から抽出し、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で
分離した。trpA帯域中に組込まれた放射能の割合を測定
した。使用条件下において、細胞は均一にラベルされ、
したがって蛋白質中に組込まれた放射能は細胞中に存在
するその蛋白質の実際の量を反映すると推定できる。tr
pA蛋白質は全細胞蛋白質の10％になることが判明した。

イー・コリK12ΔHI（pPLc23trpA₁）の全細胞蛋白質にお
けるtrpAのこの10％という濃度は、エッチ・バーナード
等（上記）のベクタを含有するλP_Lと本発明のものとの
間における重要な相違を示すにも役立つ。本発明のベク
タにより与えられる10％という実際のtrpA濃度に対比
し、エッチ・バーナード等はtrpAの僅か6.6％濃度を報
告している〔これは、trpA酵素活性と蛋白質の推定比活
性とに基づいて推定される〕。さらに、エッチ・バーナ
ード等により報告された6.6％というtrpA濃度は、活性
Ｎ遺伝子をも含むベクタにより観察され、したがって恐
らく転写が抗−終止性Ｎ遺伝子産物の存在下で行なわれ
たことに注目すべきである。活性Ｎ遺伝子を持たないベ
クタについては、僅か２％のtrpA濃度がエッチ・バーナ
ード等により報告された。これに対し、本発明の改良ベ
クタにより観察された10％trpA濃度は、Ｎ遺伝子産物の
不存在下に得られた。したがって、本発明のベクタおよ
び方法は、従来記載されたようなベクタおよび方法に比
べ、顕著な改良を構成する。

（ｃ）バクテリオファージMS2レプリカーゼ蛋白質遺伝
子 プラスミドpMS2-7は、RNAバクテリオファージMS2のゲノ
ムのほぼ完全な大きさのコピーを含有する〔アール・デ
ボス等、上記〕。

ファージレプリカーゼ遺伝子（Ｒ）はEcoRI-PstＩ断片
内に含有される。この断片を、このベクタのEcoRI-Pst
Ｉ断片の単純交換によりpPLa2311中に挿入した。アンピ
シリン耐性に関する遺伝子はpPLa2311R₁においてもはや
完全でないため、形質転換種イー・コリK12ΔHI（pPLa2
311R₁）をカルベニシリン感受性につき選別した。挿入
断片の本質を、アガロースゲル上においてpMS2-7DNAか
らの既知断片と共に電気泳動にかけて確認した。pPLa23
11R₁において、MS2レプリカーゼ蛋白質の転写はP_Lプロ
モータからの転写と平行する。

イー・コリK12ΔHI（pPLa2311R₁）の誘発細胞は、約59K
の見掛け分子量を有する蛋白質を合成する（第11図）。
この蛋白質の大きさは、ウイルスRNAの配列データからM
S2レプリカーゼにつき計算された60692ダルトンの分子
量と一致する〔ダブリュ・ファイエル等、「バクテリオ
ファージMS2RNAの完全ヌクレオチド配列：レプリカーゼ
遺伝子の一次および二次構造」、ネイチャー誌、第260
巻、第500〜507頁（1976）〕。

pPLa2311R₁で形質転換された細胞の蛋白質産物における
機能的MS2レプリカーゼ蛋白質の存在は、同様にMS2アン
バー突然変異体についての相補分析により証明された。
この分析により、pPLa2311R₁で形質転換された細胞はレ
プリカーゼ遺伝子中に障害を有するMS2突然変異体の産
物と特異的に相補する産物を生成し、pPLa2311R₁で形質
転換されていない細胞はこの種の突然変異体の産物を相
補しなかったことが確認された。

MS2レプリカーゼ蛋白質合成に関し、イー・コリK12ΔHI
（pPLa2311R₁）とイー・コリM5219（pPLa2311R₁）との
両者は同様に挙動した（すなわち、30分間の誘発後、MS
2レプリカーゼの合成割合は全新規蛋白質合成の29％で
あり、蛋白質合成のレベルは、さらに誘発すると急速に
低下した）（第11図）。合成におけるこのような低下は
β−ラクタマーゼまたはtrpAの合成においては観察され
なかったので、この低下はMS2レプリカーゼの特殊な性
質により惹起されるのであろう。たとえば、ファージレ
プリカーゼがシストロンの中央近傍の部位においてそれ
自身のmRNAに結合するという観察された傾向〔マイヤー
等、「ＱβRNAの結合部位」、エキスペリエンタ、第31
巻、第143頁以降（1975）〕は、複雑mRNAがさらに翻訳
されるのを阻害するであろう。

3.真核遺伝子 （ａ）猿ウイルス40遺伝子の小−ｔ抗原 SV40小−ｔ抗原に関する全コード配列を含むHindIIIDNA
断片〔ジー・ボルケルト等、「猿ウイルス40小−ｔ遺伝
子のヌクレオチド配列」、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミー・サイエンス・USA、第75巻、第2160〜2
164頁（1978）〕をpBR322のHindIII部位に挿入した（第
12図）。挿入物の方向性を、不対称配置TagＩ部位の存
在に基づく制限分析により決定した。このハイブリッド
DNA分子から、上記HindIII断片とpBR322の部分とを含む
EcoRI-BamHI断片を切除し、EcoRI-BamHI断片に対する代
替物としてpPLc28中に挿入し、その小−ｔ抗原の翻訳の
方向性をP_Lプロモータからの転写と平行にした（第12
図）。得られた組替えDNA分子をpPLc28SV_t5と名付け
た。

P_Lプロモータと小−ｔ抗原をコードする遺伝子の開始コ
ドン（ATG）との間の間隔を短縮させるため、pPLc28SV_t
5を改変させて、遺伝子とP_Lプロモータとの間のEcoRI-H
indIII断片を除去した。この操作を第12図および第13図
に示す。これは、pPLc28SV_t5をClaＩで開裂させ、T4DNA
ポリメラーゼの３′エキソヌクレアーゼ活性を使用して
それぞれGTPおよびTTPの存在下に２つの別々の過程にお
いてDNAの３′末端を減成し、S1ヌクレアーゼによって
さらに処理し、EcoRIリンカを平滑末端部に付加し、こ
の断片をEcoRIで開裂させそして相補的末端部を連結す
ることからなっている。

これら改変ハイブリッドDNA分子によるイー・コリK12Δ
HIの形質転換と誘発とは、14Kの見掛け分子量を有する
かなり多量の蛋白質の発現を与えた（第14図）。この蛋
白質は誘発なしには生産されず、SV40DNAを含むベクタ
により形質転換されてない宿主細胞では生産されなかっ
た。

標準小−ｔ抗原は19Kの分子量を有し、これら形質転換
細胞で生産された蛋白質はSV40の大−Ｔ抗原に対し発生
する抗体によって極く僅かしか沈澱しなかったが、この
蛋白質および標準小−ｔ抗原から誘導されたトリプチッ
ク（tryptic）ペプチドの二次元フィンガプリント〔pH
3.5における電気泳動、および次いでブタノール／酢酸
／ピリジン／水（15:3:10:12）におけるクロマトグラフ
ィー〕は、２者が関連していることを確認した。如何な
る理論にも拘束されるものでないが、P_Lプロモータから
出発するmRNAの二次構造は小−ｔ抗原の内部開始コドン
における開始が真正開始シグナルにおける開始よりも好
ましいようなものであると云える。この仮説は、ディー
・イセレンタントおよびダブリュ・フアイエル、の手法
〔「mRNAの二次構造および翻訳開始の効率」、ジーン
誌、第９巻、第１〜12頁（1980）〕を用いて、これらSV
_t含有ベクタの幾つかにおけるヌクレオチド配列から得
られる二次構造とも一致する。

上記のように調製した改変pPLc28SV_t5組替えDNA分子の
１つは、主として14K蛋白質成分の他に、少量の17K成分
をも発現した。この分子をpPLcSV_t5‐37と名付けた。17
K蛋白質の存在は大−Ｔ抗血清での特異的免疫沈澱によ
ってのみ初めて検出できたが、この分子をさらに改変さ
せると17K成分の向上した合成が可能となった。この改
変は、pPLc28SV_t5‐37をEcoRIで開裂させ、旧３′末端
をDNAポリメラーゼＩで伸長させ〔ケー・ベックマン
等、上記〕そして平滑末端部を再連結させることからな
り、mRNAの二次構造を変化させることができた。pPLc28
SV_t5‐37-9により形質転換された宿主は、誘発の際全新
規蛋白質合成の約40％を17K蛋白質成分として与えた。
これらの結果を第14図に示す。第14図に系統ｃで示すよ
うに、17K成分は、SV40感染したアフリカ緑猿腎臓細胞
で増殖した標準小−ｔ抗原とほぼ同じ程度に、SV40−腫
瘍ハムスターから血清により免疫沈澱された。

（ｂ）ヒト繊維芽細胞インターフェロン（HFIF）遺伝子 1980年６月６日付出願の英国特許出願第80.18701号明細
書に記載されているように、ヒト繊維芽細胞インターフ
ェロンをコードする遺伝子をベクタpPLa8およびpPLc24
に挿入して組替えDNA分子を生成させ、これらは形質転
換宿主において適当な誘発の後に標準ヒト繊維芽細胞イ
ンターフェロンに酷似した抗ウイルス的、物理−化学
的、免疫的かつ生物学的活性を有する蛋白質を発現する
ことができる。

1.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-1の構築 プラスミドG-pBR322（Pst）/HFIF-6をEcoRIとPstＩによ
り切断し、次いでこれを、PstＩとPvuＩにより切断され
たプラスミドG-pBR322（Pst）/HFIF-7に結合した。結合
に続いて、混合物をEcoRIとHaeIIにより消化した。次い
でこの混合物の４倍モル過剰を、HaeIIとEcoRIにより消
化したプラスミドG-pPLa2311に結合した。このプラスミ
ドは、独自のEcoRI部位と独自のPstＩ部位を含んでい
た。混合したEcoRI-PstI消化は、２つの断片を生成し‐
‐このより小形断片は、G-pBR322（Pst）/HFIF-6のEcoR
I-PstＩ切断の後得られた断片と共に共移動した。BglII
消化は、約650塩基対の小形断片に切断した。より後期
断片の大きさは、クローンG-pBR322（Pst）/HFIF-6の近
位BglII-PstＩ断片を、G-pBR322（Pst）/HFIF-7の遠位P
stI-BglII部位へ結合した後に、期待の大きさに一致し
ている。HincII消化は、P_L領域中のHincII部位、β−ラ
クタマーゼ遺伝子のアミノ末端部位、及びHulFN−βのD
NA配列の翻訳しない５′末端の存在から期待される通
り、３つの断片を生成した。このプラスミドは、G-pPLa
-HFIF-67-12と命名された。

2.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12の構築 構成における次の工程は、G-pPLa-HFIF-67-1から、ポリ
（A.T）尾部及び逆方向３′末端断片の部分を除去に向
けられた。G-pPLa-HFIF-67-1DNAを、BglIIとHpaIIによ
り切断した。得られたBglII断片を、BamHIにより消化さ
れたプラスミドG-pPLaBへ結合した。酵素BglIIとBamHI
は、同じ千鳥配列の末端を、BglIIとBamHIの末端が開放
されたBamHI部位へ結合され得るようにし、逆もまた同
じである。このような再構築された部位は、最早BglII
又はBamHIに対する基質でなくて、酵素Sau3AI（MboＩ）
により認識される［V.ピロッタ、「バシラス−グロビギ
ルからの２つの制限酵素」、核酸研究（Nucleic Acids
Res.）第３巻、第1747-1760頁、（1976年）］。連結反
応に続いて、この混合物を再びBamHIにより切断して、
簡単に再環化したG-pPLaB分子を除去した。形質転換体
を、カナマイシン抵抗性を選択するC600r_Km_K ⁺（λ）中
に得た。

形質転換体を、IFN−β−関連組換体プラスミドの特徴
付けの為に、上述のように、アガロースゲル上の未切断
DNAの分子量決定により選抜した。G-pPLaB親より僅かに
大きいと証明されたクローンを更に、PstＩ又はHincII
のいずれかにより制限分析に賦した。一つのクローン
は、単PstＩ部位と３つのHincII部位を含むことが分か
った。このクローンの一つの断片は、P_Lから誘導された
pPLaBからβ−ラクタマーゼ領域へ、HincII断片と共に
共移動した。クローンのもう一つのより小さい断片は約
400塩基対と測定され‐‐これは、P_Lプロモーターに関
して感覚配向中のG-pPLaB中へBgiII断片の挿入と矛盾し
ない。このプロモータは、G-pPLa-HFIF-67-12と命名さ
れた。

次ぎにE.coli K12ΔHIとM5219を、特徴付けしたプラス
ミドG-pPLa-HFIF-67-12により形質転換した。

3.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ19の構築 G-pPLa-HFIF-67-12をHincIIにより部分消化した。約0.0
1μg/mlのDNA濃度にての連結反応に続いて、DNAを、
３′突出末端を生成するPvuＩのアイソシゾマーであるX
orIIにより切断し、かつ低いDNA濃度において再結合し
た。親プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12は、２つのXorII部
位を含む：その一つの部位は、カナマイシン遺伝子を不
活性化し、もう一つの部位は、プラスミドから除去され
るべきHincII断片中に位置する。XorII消化−再結合工
程の目的は、HincII酵素により切断されない親DNA分子
を除去する為である。このような分子は、２つのXorII
部位を有し、かつ連結反応に使用した条件下において、
２つの断片は、再結合されるとはとても思われない。形
質転換体は、カナマイシンを選択するC600r_K ^-m_K ⁺（λ）
中に得られ、かつ単PvuＩ部位の存在に対する制限分析
により選抜された。更にクローンの分析を、HincII消化
を使用して実施した。最小HincII断片を欠くけれども、
その他の点ではG-pPLa-HFIF-67-12と一致する一つのク
ローンは、G-pPLaHFIF-67-12Δ19と命名された。

4.プラスミドG-pPLc-HFIF-67-8の構築 G-pPLa-HFIF-67-1DNAを、BglIIにより消化し、かつBamH
I−切断pPLc24DNAと結合した。連結反応混合物を、BamH
Iで再切断して、親pPLc24分子を除去しかつカルベンシ
リン抵抗性を選択するC600r_K ^-m_K ⁺（λ）中に形質転換し
た。形質転換体をHincIIによる制限により分析した。pP
Lc24の制限部位の既知位置から、P_Lに関して感覚配向中
にBglII-IFN−β断片の挿入が、約650塩基対のHincII外
断片を生成すべきことは予言することが出来る。この立
体配置を現す典型的クローンをpPLc-HFIF-67-8と命名さ
れた。E.coliK12ΔHIとM5219を、特徴付けしたプラスミ
ドG-pPLc-HFIF-67-8により形質転換した。

（ｃ）FMDV抗原遺伝子 1980年８月15日付出願の英国特許出願第80.26661号明細
書に記載されているように、FMDウイルス抗原の特異性
を示すポリペプチドをコードするDNA配列をベクタpPLc2
4中に挿入して組替えDNA分子を生成させ、これらは形質
転換宿主において適当な誘発の後に、FMDウイルス抗原
の特異性を有するポリペプチドを発現することができ
る。

ベクタpPLc24を、制限酵素BamHIとHindIIIにより制限し
て、pFMDV-1034による制限DNA配列を有するサブ配列連
結反応に対する相補末端を与えた。

切断ベクタとDNA断片を、1:2の割合で結合し、エタノー
ルで沈澱させた。沈澱物を分離しかつT4 DNAリガーゼ緩
衝液（３μｇベクタ/ml）中に再溶解し、連結反応を15
℃で一晩進行させた。

P_L調節発現を防止する為の染色λレプレッサ−clを有す
る、CaCl₂受容E.coliW6（λ_rex）を、リガーゼ混合物
と、49μg/mlアンピシリンを補充したＬ−培養液中で増
殖した後に選択されたアンピシリン抵抗性コロニーとに
より形質転換した。ベクタpPLc24はβ−ラクタマーゼを
コードする遺伝子を含むので、この無傷遺伝子を有する
プラスミドにより形質転換されたE.coli宿主は、そのよ
うに形質転換されない細菌の排除の為のアンピシリンを
含む媒質中で増殖するだろう。

50個のアカデミー抵抗性クローンを拾い挙げ、かつM.グ
ルンシュタインとD.S.ホグネス、「コロニーハイブリッ
ド形成：特定遺伝子を含むクローン化DNAの単離方法」
プロシーディング ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス USA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第72巻、
第3961-65頁、（1975年）により記載されるようにし
て、E.coliDNA ポリメラーゼ Ｉ及びα−³²P‐dATPの
存在下におけるニックトランスレーションにより調製さ
れた³²P−標識したPstI-pFMDV-1034プローブによりハイ
ブリッド形成した。７個の非常に陽性のクローンを選択
した。これら７個のクローンは、次のように同定して良
い：E.coliW6（λ_rex‐pPLc24（BamHI-HindIII）/FMDV-
1034（BamHI-HindIII）。これらのクローンをE.coliW6
（λrex-pPL-VP1-1）、これらのプラスミドをpPL-VP1-
1、及びこれらのDNA挿入断片をVP1-1として、夫々呼ぶ
であろう。E.coliW6（λ_rex‐pPL-VP1-5）として同定さ
れた第二クローンも選択された。最近の検定において、
E.coliNF1（λN^-cro^-cI_ts-pPL-VP1-5）のコロニーは、3
7℃で一晩の増殖の後に、VP1−関連抗原の存在と矛盾し
ない応答を発揮する細菌抽出物を生成した。

プラスミドDNAを、上述のようにして、強くハイブリッ
ド形成するクローンから単離され、かつE.coliNF1（K12
M72 lac_amΔtrpEA2Sm^R）（λcl851N_am7N_am53ΔHIbi
o^-）（“E.coliNF1（λN^-cro^-cl_ts）”）の（CaCl₂受
容）細菌株を形質転換するのに使用された［U.H.バーナ
ード等、「バクテリオファージλP_Lプロモータからの遺
伝子発現を促進するプラスミドクローン用運搬体の構
築」遺伝子（Gene）、第５巻、第59-76頁、（1979）
年）］。

他の株類、例えば、N−遺伝子生成物を発現するE.coliM
219（K12 M72 lac_amtrp_amSm^R（λc1857ΔHIbio252）
［H.グリール、「バクテリオファージλのKil遺伝
子」、ウイルス学（Viroogy）、第66巻、第589-604頁、
（1975年）］もまた、本発明において使用出来るだろ
う。

形質転換した宿主のクローンを、40μg/mlのアンピシリ
ンを補充したＬ−培養液中で、28℃にて増殖し、かつク
ローンを７セットの形質転換体の夫々から無作為に選択
した。更に、プラスミドpPLc24により形質転換した宿主
のクローンを、28℃で増殖し、かつクローンをこれらの
形質転換体から無作為に選択した。これらのクローンは
次のように同定された：E.coli NF1（λN^-cro^-cI_ts-pPL-VP1-1）E.coli NF1（λN^-cro^-cI_ts-pPLc24） 本明細書中に記載した方法により調製された微生物およ
びベクタは、米国メリーランド州ローックビル所在のア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクションに1980年
９月８日付で寄託した培養物によって例示され、これら
は次のようにPL-A乃至PL-Dとして同定されている。

Ａ、イー・コリM5219（pPLa2311） Ｂ、イー・コリK12ΔHI（pPLa8） Ｃ、イー・コリK12ΔHI（pPLc28） Ｄ、イー・コリM5219（pPLc24） これらの培養物には、受託番号ATTC31694〜31697がそれ
ぞれ付与されている。

さらに、本明細書中に記載した方法で調製されかつ発現
用として挿入DNA配列を含有する微生物およびベクタ
は、西ドイツ連邦共和国ゲッチンゲン所在のカルチャー
コレクションであるドイツチェ・ザンムルンク・フォン
・ミクロオルガニスメンに寄託された培養物によって例
示され、これらは次のように同定されている： HFIF-D:イー・コリM5219（G-pPLa-HFIF-67-12）〔DSM18
51〕 HFIF-E:イー・コリK12ΔHI（G-pPLa-HFIF-67-12）〔DSM
1852〕 HFIF-F:イー・コリM5219（G-pPLa-HFIF-67-12Δ19）〔D
SM1853〕 HFIF-G:イー・コリM5219（G-pPLc-HFIF-67-8）〔DSM185
4〕 FMDV-A:イー・コリW6（λrex-pPL-VP1-1）〔DSM1879〕 FMDV-B:イー・コリNF1（λN^-cro^-cI_ts-pPL-1）〔DSM188
0〕 FMDV-C:イー・コリNF1（λN^-cro^-cI_ts-pPL-VP1-5）〔DS
M1881〕 培養物HFIF-D〜HFIF-Gは1980年６月５日付で寄託され、
培養物FMDV-A〜FMDV-Cは1980年７月31日付で寄託され
た。

以上、本発明の多くの具体例を提示したが、この基本構
成を変化させて、本発明の方法および組成物を使用する
他の実施態様をも与えうることは明らかである。したが
って、本発明は上記の実施例に示された特定実施態様の
みに限定されず、本発明の範囲は特許請求の範囲の記載
により規定されることが了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はファージλtrp44cI AT₂ cro ^-の領域の略図であ
って、制限部位の全部は示されておらず、イー・スジバ
ルスキイおよびダブリュ・スジバルスキイにより記載さ
れたような〔「バクテリオファージλの広汎分子地
図」、ジーン誌、第７巻、第217〜270頁（1979）〕、λ
単位において距離を地図化し、第２図は本発明によるベ
クタ、すなわちpPLa2、pPLa20およびpPLa23の作成の略
図であり、第３図は本発明によるベクタ、すなわちpPLa
2311、pPLa231およびpPLa8の作成の略図であり、第４図
は本発明によるベクタ、すなわちpPLa83、pPLa831、pPL
a832、pPLc2、pPLc23、pPLc236およびpPLc28の作成の略
図であり、第５図は本発明によるベクタ、すなわちpPLc
24の作成の略図であり、第６図はpPLa2311のO_LR_L領域の
ヌクレオチド配列を示し、第７図はβ−ラクタマーゼに
おけるPst部位からBamHI部位への変換を示し、第８図は
イー・コリK12ΔHI（pPLa23）およびイー・コリM5219
（pPLa23）における28℃および42℃でのオートラジオグ
ラフ検定による蛋白質合成であり、第９図はイー・コリ
K12ΔHI（pPLa23trpA₁）およびイー・コリK12ΔHI（pPL
a23trpA₂）における28℃および42℃でのオートラジオグ
ラフ検定による蛋白質合成であり、第10図はイー・コリ
K12ΔHI（pPLc23trpA₁）における28℃および42℃でのオ
ートラジオグラフ検定による蛋白質合成であり、第11図
はイー・コリK12ΔHI（pPLa2311R₁）における28℃およ
び42℃でのオートラジオグラフ検定による蛋白質合成で
あり、第12図はpPLc28SV_t5およびpPLc28SV_t5-37の作成
の略図であり、第13図はヌクレオチドレベルにおけるpP
Lc28SV_t5からのpPLc28SV_t5-37の作成を示し、第14図は
イー・コリK12ΔHI（pPLc28SV_t5-37-9）の28℃および42
℃におけるオートラジオグラフ検定による蛋白質合成で
あって、SV40−腫瘍を有するハムスターから42℃での培
養後に合成された蛋白質をこの宿主からの血清により免
疫沈澱させたものと、SV40感染したアフリカ緑猿の腎臓
細胞で合成された標準小−ｔ抗原を同抗血清により免疫
沈澱させたものとの比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＤＳＭ １８５３ 微生物の受託番号 ＤＳＭ １８５４ 微生物の受託番号 ＤＳＭ １８７９ 微生物の受託番号 ＤＳＭ １８８０ 微生物の受託番号 ＤＳＭ １８８１ 審査前置に係属中

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】組換DNA分子により形質転換された細菌性
   宿主を培養する工程からなり、前記組換DNA分子は、バ
   クテリオファージ ラムダの左向きプロモータおよびオ
   ペレータであるP_LO_Lを有すること、活性cro遺伝子およ
   び活性N遺伝子が存在しないこと、P_LO_Lの下流300塩基対
   未満に位置し且つ分子中に存在し得るバクテリオファー
   ジ ラムダのHaeIII部位（73.1％）の下流にあるラムダ
   DNA由来のあらゆる配列の上流に位置し、所望の原核、
   真核またはウイルスポリペプチドのコード領域を含有す
   るDNA配列を有することとを特徴とする、原核、真核ま
   たはウイルスポリペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】前記組換DNA分子が、さらにP_LO_Lと所望の
   ポリペプチドのコード領域との間に位置するリボゾーム
   結合部位を有している特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. 【請求項３】リボゾーム結合部位が、バクテリオファー
   ジ MS2レプリカーゼのそれである特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
4. 【請求項４】組換DNA分子が、さらに所望のポリペプチ
   ドのコード領域から下流のバクテリオファージ ラムダ
   由来のDNAを含まない特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
5. 【請求項５】組換DNA分子が、さらにP_LO_Lの上流のバク
   テリオファージ ラムダ由来のDNAを含まない特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】組換DNA分子が、ドイツチェ ザンムルン
   ク フォン ミクロオルガニスメン（DSM）のカルチャ
   ーコレクションに寄託され、且つDSM1851、DMS1852、DM
   S1853、DMS1854、DMS1879、DSM1880、およびDSM1881と
   して同定され、そしてアメリカン タイプ カルチャー
   コレクション（ATCC）に寄託され、且つATCC31694、A
   TCC31695、ATCC31696およびATCC31697として同定された
   プラスミドベクタ由来である、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。