DK170476B1 - Rekombinant DNA-molekyle, uni-cellulær vært transformeret med mindst ét rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til transformering af en uni-cellulær vært, samt fremgangsmåder til fremstilling af et polpeptid, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet af human beta-interferon - Google Patents

Description

i DK 170476 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte rekombinations-DNA-molekyler, uni-cellulær vært transformeret med mindst ét rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til transformering af en uni-cellulær vært, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man i værten indfører et 5 rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåder til fremstilling af et polypeptid, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet af human β-interferon, hvilke fremgangsmåder er ejendommelige ved, at man transformerer en uni-cellulær vært med et rekombinant DNA-molekyle og dyrker værten, eller ved, at man dyrker en uni-cellulær vært, som er 10 transformeret med et rekombinant DNA-molekyle, eller ved, at man dyrker en uni-cellulær vært transformeret med en DNA-sekvens valgt blandt DNA-sekvenserne med formlerne:

ATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAG 15 CTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCA

GTGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCAC AGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGG AGGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAG ACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCT 20 AATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGA

AAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTA TGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACC ATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTT ^ ff : ACCTCCGAAAC, og 25

ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGTGTCAGA AGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCACAGGATGAA CTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCC GCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATT 30 CATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTA

TCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGAT TTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGA TTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAG AGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGA . 35 AAC, hvilken DNA-sekvens er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens i den uni-cellulære vært. Mere specielt vedrører opfindelsen DNA-sekvenser udtrykt i passende værts-organismer.

2 DK 170476 B1

De her omhandlede rekombinations-DNA-molekyler er karakteriseret ved DNA-sekvenser, som koder for polypeptider, hvis aminosyre-sekvens og sammensætning i det væsentlige er konsistente med humant fibroblast-interferon og som har en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende 5 til humant fibroblast-interferon. Som det vil fremgå af det følgende, kan DNA-sekvenserne, rekombinations-DNA-molekylerne og fremgangsmåderne anvendes til fremstilling af polypeptider, der er værdifulde i antivirale og antitumor- eller anticancer-midl er og fremgangsmåder.

I det følgende vil blive anvendt den i Nature, 286, p. 2421 (10.

10 juli 1980) bekendtgjorte interferon-nomenklatur. Denne nomenklatur erstatter den, som har været anvendt i de tidligere patentansøgninger, hvorfra den foreliggende ansøgning påberåber prioritet. Fx. betegnes IF nu IFN og fibroblast-interferon betegnes nu IFN-Ø.

To klasser af interferoner ("IFN") vides at eksistere. Interferoner 15 af klasse (I) er små, syrestabile (glyko)-proteiner, som gør celler resistente mod viral infektion (A. Isaacs og J. Lindenmann, "Virus Interference I. The Interferon", Proc. Royal Soc. Sez. B., 147, pp. 258-67 (1957) og W. E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag (1979) (herefter "The Interferon System")). Klasse (II) IFN'er er syre-20 ustabile. På nuværende tidspunkt er de dårligt karakteriserede. Selvom IFN'er til en vis grad er celle-specifikke (The Interferon System, pp. 135-45), er de ikke virus-specifikke. Tværtimod beskytter IFN'er celler mod et vidt spektrum af virus.

Humane interferoner ("HuIFN") er blevet klassificeret i tre grupper 25 α, β og γ. HuIFN-/} eller fibroblast-interferon produceres ved passende induktion i diploide fibrobiast-celler. Det produceres også i mindre mængder, sammen med en større mængde HuIFN-α, i lymfoblastoide celler.

Det ud fra disse celler fremstillede IFN-/} er blevet grundigt renset og karakteriseret (E. Knight, Jr., "Interferon: Purification And Initial 30 Characterization From Human Diploid Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, pp. 520-23 (1976)). Det er et glyko-protein med en molekylvægt på ca. 20.000 (M. Wiranowska-Stewart, et al., "Contributions Of Carbohydrate Moieties To The Physical And Biological Properties Of Human Leukocyte, Lymphoblastoid And Fibroblast Interferons", Abst. Ann.

35 Meeting Amer. Soc. Microbiol., p. 246 (1978)). Det er også heterogent med henblik på størrelse, antagelig p.g.a. carbonhydrat-delene.

Aminosyre-sammensætningen af autentisk humant fibroblast-interferon er også blevet beskrevet (E. Knight, Jr., et al., "Human Fibroblast Interferon: Amino Acid Analysis And Amino-Terminal Amino Acid Sequence", 3 DK 170476 B1

Science, 207, pp. 525-26 (1980)). Desuden er aminosyre-sekvensen af autentisk humant fibroblast-interferon ved at blive klarlagt. Indtil nu er aminosyre-sekvensen af NHg-enden af det autentiske modne protein blevet beskrevet for de første 13 aminosyre-rester: Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-5 Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser... (E. Knight, Jr., et al., supra).

Det er blevet beskrevet, at to bestemte gener, hvoraf det ene befinder sig på kromosom 2 og det andet på kromosom 5, koder for IFN-/) (D. L. Slate og F. H. Ruddle, "Fibroblast Interferon In Man Is Coded By Two Loci On Separate Chromosomes", Cell, 16, pp. 171-80 (1979)). Andre 10 undersøgelser viser imidlertid, at genet for IFN-0 befinder sig på kromosom 9 (A. Medger, et al., "Involvement Of A Gene On Chromosome 9 In Human Fibroblast Interferon Production", Nature, 280, pp. 493-95 (1979)).

Selvom autentisk Hul FN-/) er glykosyleret, giver fjernelse af 15 carbonhydrat-delen (P.J. Bridgen, et al., "Human Lymphoblastoid

Interferon", J. Biol. Chem., 252, pp. 6585-87 (1977)) eller syntese af .IFN-0 i nærværelsen af inhibitorer, som påstås at udelukke glykosylering (W. E. Stewart, II, et al., "Effect of Glycosylation Inhibitors On’The Production And Properties Of Human Leukocyte Interferon", Virology, 97, 20 pp. 473-76 (1979); J. Fujisawa, et al., "Nonglycosylated Mouse L Cel! Interferon Produced By The Action Of Tunicamycin", J. Biol. Chem., 253, pp. 8677-79 (1978); E. A. Havel1, et al., "Altered Molecular Species Of Human Interferon Produced In The Presence Of Inhibitors of Glycosylation", J. Biol.Chem., 252, pp. 4425-27 (1977); The Interferon System, p.

25 181) en mindre form for IFN-/), som stadig bevarer størstedelen af eller hele dets IFN-aktivitet.

HuIFN-/) kan ligesom mange humane proteiner også være polymorf.

Derfor kan celler af bestemte individer producere IFN-/) typer inden for den mere almene IFN-/J klasse, som er fysiologisk ens, men strukturelt en 30 smule forskellige fra prototypen af den klasse, hvoraf den er en del.

Selvom proteinstrukturen for IFN-/3 kan være generelt veldefineret, kan bestemte individer derfor producere IFN-/)'er, som er lette variationer deraf.

IFN-/) kan sædvanligvis ikke påvises i normale eller raske celler 35 (The Interferon System, pp. 55-57). I stedet produceres dette protein som følge af cellens eksponering for en IFN-inducer. IFN-inducere er sædvanligvis virus, men kan også være af non-viral karakter såsom naturlig eller syntetisk dobbelstrenget RNA, intracellulære mikrober, mikrobiologiske produkter og forskellige kemiske midler. Talrige forsøg har 4 DK 170476 B1 været gjort på at drage fordel af disse non-virale inducere for at gøre humane celler resistente over for vira! infektion (S. Baron og F. Dia-zani (eds.), Texas Reports On Biology And Medicine, 35 ("Texas Reports"), pp. 528-40 (1977)). Disse forsøg har ikke givet megen succes. I 5 stedet foretrækkes nu anvendelse af selve det eksogene HuIFN-/}.

Interferon-terapi mod virus og tumorer eller cancer er blevet foretaget ved varierende dosismængder og ved hjælp af adskillige administreringsmåder (The Interferon System, pp. 305-321). Fx. er interferon blevet effektivt administreret oralt, ved podning -- intravenøst, intra-10 muskulært, intranasalt, intradermalt og subkutant -- og i form af øjen-dråber, salver og sprays. Det administreres sædvanligvis en til tre gange dagligt i doser på 104 til 10^ enheder. Omfanget af terapien afhænger af patienten og tilstanden, som skal behandles. Fx. behandles virusinfektioner sædvanligvis ved daglige eller to gange daglige doser 15 over adskillige dage til to uger og tumorer og cancer behandles sædvanligvis ved daglige eller multiple daglige doser over adskillige måneder eller år. Den mest effektive terapi for en given patient skal naturligvis bestemmes af den tilsynsførende læge, der vil tage velkendte faktorer i betragtning såsom sygdomsforløbet, tidligere terapi og. patient-20 ens reaktion på interferon, når administreringsmåde og dosismængde vælges.

Som et antiviralt middel har HuIFN været anvendt til behandling af følgende: respirationsinfektioner (Texas Reports, pp. 486-96), herpes simplex keratitis (Texas Reports, pp. 497-500); R. Sundmacher, 25 "Exogenous Interferon in Eye Diseases", International Virology IV, The Hague, Abstract nr. W2/11, p. 99 (1978)); akut hæmorrhagisk konjunktiv! ti s (Texas Reports, pp. 501-10); adenovirus keratoconjunctivitis (A. Romano, et al., ISM Memo I-A8131 (oktober 1979)); varicella zoster (Texas Reports, pp. 511-15), cytomeglovirus-infektion (Texas Reports, 30 pp. 523-27) og hepatitis B (Texas Reports, pp. 516-22). Se også The Interferon Sytem, pp. 307-19. Imidlertid kræver anvendelsen af IFN som et antiviralt middel i stor målestok større mængder IFN end der hidtil har været tilgængelige.

IFN har andre virkninger foruden dets antivirale virkning. Fx 35 antagoniserer det virkningen af koloni-stimulerende faktor, inhiberer væksten af hæmopoietiske koloni-dannende celler og interfererer med den normale differentiering af granulocyt og makrofag prækursorer (Texas Reports, pp. 343-49). Det inhiberer også erythroid-differentiering i DMSO-behandlede Friend leukæmi-celler (Texas Reports, pp. 420-28). Det 5 DK 170476 B1 er bemærkelsesværdigt, at nogle celle-linier kan være betydeligt mere følsomme over for HuIFN-/? end over for HuIFN-α i disse henseender (S. Einhorn og H. Strander, "Is Interferon Tissue-Specific? - Effect Of Human Leukocyte And Fibroblast Interferons On The Growth Of Lymphobla-5 stoid And Osteosarcoma Cell Lines", J. Gen. Virol., 35, pp. 573-77 (1977); T. Kuwata, et al., "Comparison Of The Suppression Of Cell and Virus Growth In Transformed Human Cells By Leukocyte And Fibroblast Interferons", J. Gen. Virol., 43, pp. 435-39 (1979)).

IFN kan også spille en rolle ved regulering af immun-responsen. Fx 10 kan IFN i afhængighed af dosis og anvendelsestidsrum i forhold til antigen både være immunopotentierende og immunosuppressivt in vivo og in vitro (Texas Reports, pp. 357-69). Ydermere blev det iagttaget, at specielt sensibiliserede lymfocyter producerer IFN efter kontakt med antigen. Sådant antigen-induceret IFN kunne derfor være en regulator for 15 immun-responsen og indvirke både på cirkulerende antigen-niveauer og ekspression af cellulær immunitet (Texas Reports, pp. 370-74). Det er ..også kendt, at IFN forøger aktiviteten af dræber-lymfocyter og antistofafhængig, celle-medieret cytotoxicitet (R. R. Herberman, et al., "Augmentation By Interferon Of Human Natural And Antibody-Dependent 20 Cell-Mediated Cytotoxicity", Nature, 277, pp. 221-23 (1979); P. Beverley og D. Knight, "Killing Comes Naturally", Nature, 278, pp. 119-20 (1979); Texas Reports, pp. 375-80; J. R. Huddiestone, et al., "Induction And Kinetics Of Natural Killer Cells in Humans Following Interferon Therapy", Nature, 282, pp. 417-19 (19J9); S. Einhorn, et al., "Inter-25 feron And Spontaneous Cytotoxicity In Man. II. Studies In Patients Receiving Exogenous Leukocyte Interferon", Acta Med. Scand., 204, pp.

477-83 (1978)). Begge kan være direkte eller indirekte involveret i det immunologiske angreb på tumor-celler.

Foruden HuIFN's anvendelse som et antiviralt middel har det derfor 30 potentiel anvendelighed i anti-tumor og anti-cancer terapi (The Interferon System, pp. 319-21 og 394-99). Det vides nu, at IFN'er påvirker væksten af mange klasser af tumorer i mange dyr (The Interferon System, pp. 292-304). Som andre anti-tumor midler synes de at være mest effektive, når de rettes mod små tumorer. Anti-tumor-virkningerne af animalsk 35 IFN afhænger af dosis og tid, men er blevet påvist· ved koncentrationer under toxiske niveauer. Følgelig har der været foretaget talrige undersøgelser og kliniske forsøg og sådanne udføres fortsat med hensyn til anti-tumor- og anti-cancer-egenskaber af HuIFN'er. Disse omfatter behandling af adskillige maligne sygdomme såsom osteosarcoma, akut 6 DK 170476 B1 myeloid leukæmi, multiple myeloma og Hodgkin's sygdom (Texas Reports, pp. 429-35). Endvidere er HuIFN-/l fornylig blevet vist at forårsage lokal tumorregression, når det injiceres i subkutane tumorale knuder i melanoma- og bryst-carcinoma-angrebne patienter (T. Nemoto et al., 5 "Human Interferons And Intralesional Therapy Of Melanoma And Breast Carcinoma", Amer. Assoc. For Cancer Research, Abs. nr. 993, p. 246 (1979)). Selvom resultaterne af disse kliniske forsøg er opmuntrende, er anti-tumor- og anti-cancer-anvendelserne af IFN-/J blevet alvorligt hæmmet af manglen på en tilstrækkelig tilførsel af renset IFN-/L 10 Det er bemærkelsesværdigt, at nogle celle-linier, som modstår de anticellulære virkninger af IFN-α, forbliver følsomme over for IFN-ø.

Denne differentielle virkning lader formode, at IFN-0 effektivt kan anvendes over for visse klasser af resistente tumor-celler, som optræder under selektiv tryk i patienter, som er behandlet med høje doser IFN-a 15 (T. Kuwata, et al., supra; A. A. Creasy, et al., "The Role of Gq-Gj Arrest In The Inhibition Of Tumor Celle Growth By Interferon",

Abstracts, Conference On Regulatory Functions Of Interferons, N.Y. Acad.

Sci., nr. 17 (23. til 26. oktober 1979)).

På det biokemiske plan inducerer IFN'er dannelsen af mindst 3 pro-20 teiner, en protein-kinase (B. Lebi au, et al., "Interferon, Double Stranded RNA And Protein Phosphorylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, pp. 3107-11 (1976); A. G. Hovanessian og I.M. Kerr, "The (2'-5') Oligoadenylate (ppp A2'-5A2'5'A) Synthetase And Protein Kinase(s) From Interferon-Treated Cells", Eur. J. Biochem., 93, pp. 515-26 (1979)), en 25 (2'-5')oligo(A)-polymerase (A. G. Hovanessian, et al., "Synthesis Of -Low-Molecular Weight Inhibitor Of Protein Synthesis With Enzyme From Interferon-Treated Cells", Nature, 268, pp. 537-39 (1977); A.G.

Hovanessian og I.M. Kerr, Eur. J. Biochem, supra) og en phosphodiesterase (A. Schmidt, et al., "An Interferon-Induced Phosphodiesterase 30 Degrading (2'-5')oligoisoadenylate And The C-C-A Terminus Of tRNA",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp. 4788-92 (1979)).

Både IFN-0 og IFN-α sætter tilsyneladende lignende enzymatiske veje i gang (C. Baglioni, "Interferon-Induced Enzymatic Activities And Their Role In The Antiviral State", Cell, 17, pp. 255-64 (1979) og begge kan 35 dele en fælles aktiv kærne, fordi de begge genkender en kromosom-21- .

kodet celle-receptor (M. Wiranowska-Stewart, "The Role Of Human Chromosome 21 In Sensitivity To Interferons", J. Gen. Virol., 37, pp. 629-34 (1977)). Fremkomsten af én eller flere af disse enzymer i IFN-behandlede celler skulle tillade en yderligere karakterisering af proteiner med 7 DK 170476 B1 IFN-1ignende aktivitet.

Idag produceres HuIFN-0 ved dyrkning af humane celle-linier i vævskultur. Dette er en dyr fremgangsmåde og giver ringe udbytte. 'En

O

stor producent laver kun 40-50 x 10 enheder råt IFN-0 om året. (V.G.

5 Edy, et al., "Human Interferon: Large Scale Production In Embryo Fibroblast Cultures", i Human Interferon (W. R. Stinebring og P.J.

Chappie, eds.), Plenum Publishing Corp., pp. 55-60 (1978)). Ved rensning gennem absorption på kontrollerede pore-glasperler kan IFN->8 med en specifik aktivitet på ca. 10® enheder/mg udvindes fra de rå celle-ekstrak-10 ter med et udbytte på 50% (A. Billi au, et al., "Human Fibroblast Interferon For Clinical Trials: Production, Partial Purification And Characterization", Antimicrobial Agents And Chemotherapy, pp. 49-55

Q

(1979)). Yderligere rensning til en specifik aktivitet på ca. 10 enheder/mg gennemføres ved zink-chelat affinitetskromatografi med et 15 udbytte på ca. 100% (A. Billiau, et al., "Production, Purification And Properties Of Human Fibroblast Interferon", Abstracts, Conference On Regulatory Functions Of Interferons, N.Y. Acad. Sci., nr. 29 (Ocjtober 23-26, 1979). Da den specifikke aktivitet af HuIFN-^ er så høj, er den til kommercielle anvendelser krævede mængde af IFN-Ø lav. Fx. vil 100 g 20 rent IFN-jS give mellem 3 og 30 millioner doser.

Nylige fremskridt inden for molekylær biologi har gjort det muligt at indføre den DNA, som koder for specifikke non-bakterielle eukaryo-tiske proteiner i bakterieceller. I almindelighed omfatter opbygningen af sådanne rekombinations-DNA-molekyler med anden DNA end den, som frem-25 stilles via kemisk syntese, det trin, at man fremstiller en enkeltstren-get DNA-kopi (cDNA) af en renset budbringer-RNA (mRNA) som skabelon for det ønskede protein, omdanner cDNA'en til dobbeltstrenget DNA, binder DNA'en til et passende punkt i en passende klon-bærer til dannelse af et rekombinations-DNA-molekyle og transformerer en passende vært med dette 30 rekombinations-DNA-molekyle. En sådan transformation tillader værten at producere det ønskede protein. Adskillige non-bakterielle proteiner og gener er blevet opnået i E. coli ved anvendelse af rekombinations-DNA-teknologi. Disse omfatter fx. IFN-ot (S. Nagata, et al., "Synthesis In E. coli Of A Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity", Nature, . 35 284, pp. 316-20 (1980)). Endvidere er rekombinations-DNA-teknologi blevet anvendt til fremstilling af et plasmid, som siges at indeholde en gen-sekvens, der koder for IFN-jff (T. Taniguchi, et al., "Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Fibroblast Interferon Gene Sequence", Proc. Japan Acad. Ser. B, 55, pp. 464- 8 DK 170476 B1 69 (1979)).

Den aktuelle gen-sekvens er imidlertid ikke beskrevet i noget af det foregående og den blev heller ikke sammenlignet med begynde!ses-aminosyre-sekvensen eller aminosyre-sammensætningen af autentisk IFN-/}.

5 Det hidtidige arbejde beskæftiger sig kun med IFN-α, et bestemt kemisk, biologisk og immunologisk klasse (I) interferon af IFN-/3 (jvf. supra).

Den sidstnævnte rapport er udelukkende baseret på hybrideringsdata.

Disse data alene gør det ikke muligt at bestemme, om den udvalgte klon indeholder den komplette eller aktuelle gen-sekvens, der koder for IFN-/J 10 eller om den klonede gen-sekvens vil være i stand til at udtrykke IFN-0 i bakterier. Hydridisering fastslår kun, at en bestemt DNA-indføring i nogen grad er homolog med og komplementær til en mRNA-komponent af poly(A)-RNA'en, som inducerer interferon-aktivitet, når den injiceres i oocyter. Desuden er graden af en hvilken som helst homologi afhængig af 15 de for screening-processen valgte hybridiseringsbetingelser. Derfor beviser hybridisering til en mRNA-komponent af poly(A)-RNA alene ikke,.at den valgte DNA-sekvens er en sekvens, der koder for HuIFN-Ø, eller et polypeptid, der udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til HuIFN-/J, eller at sådanne sekvenser vil være nyttige til 20 fremstilling af sådanne polypeptider i passende værter.

På et seminar i Zurich d. 25. februar 1980 anførte Taniguchi, at han havde bestemt nukleotid-sekvensen for én af sine hybridi serende kloner. Han fremførte også, at de første 13 aminosyrer, som denne sekvens koder for, var identiske med dem af Knight, et al., supra, for 25 autentisk HuIFN-0 bestemte. Taniguchi beskrev ikke den fulde nukleotid-sekvens for sine kloner eller sammenlignede dens aminosyresammensætning med den, der bestemtes for autentisk HuIFN-/). Taniguchi har siden beskrevet den fulde nukleotid-sekvens for sin hybridi serende klon (T.

Taniguchi et al., Gene, 10, pp. 11-15 (1980)). Sekvensen adskiller sig 30 med ét nukleotid fra den, som er beskrevet i den prioritetsbegrundende britiske patentansøgning 8011306, der blev indleveret d. 3. april 1980.

Den af Taniguchi beskrevne aminosyre-sekvens er identisk med den, der er beskrevet i den foregående ansøgning. Taniguchi havde ved indleveringstidspunktet for den prioritetsbegrundende britiske patentansøgning nr.

35 80.18701, der blev indleveret d. 6. juni 1980, heller ikke beskrevet ekspressionen i en passende polypeptid-vært, som udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til HuIFN-jS. 4 I modsætning til, hvad der tilsyneladende er tilfældet med Research Disclosure Nr. 18309, pp. 361-62 (1979), stiler den foreliggende opfin- 9 DK 170476 B1 del se heller ikke mod at fremstille ren eller i det væsentlige ren IFN-a mRNA før forsøget på at klone IFN-genet eller producere fibroblast-interferon-lignende polypeptider i bakterielle værter.

Endelig bør det forstås, at udvælgelsen af en DNA-sekvens eller op-5 bygningen af et rekombinations-DNA-molekyle, som hybridiserer til en mRNA fra polyA RNA, hvilken mRNA producerer HuIFN aktivitet i oocyter, ikke er tilstrækkelig til at påvise, at DNA-sekvensen eller rekombina-tions-DNA-molekylets hybrid-indføring svarer til HuIFN. Tværtimod kan i fravær af en sammenligning mellem aminosyre-sekvensen, for hvilken der 10 kodes af en speciel DNA-sekvens, og aminosyre-sekvensen med det autentiske protein kun fremstillingen af et polypeptid, som udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet af HuIFN, rent faktisk påvise, at den udvalgte DNA-sekvens eller det opbyggede rekombinations-DNA-molekyle svarer til HuIFN. Endnu vigtigere er det, at det først er efter påvis-15 ning af HuIFN aktivitet, at DNA-sekvensen, rekombinations-DNA-molekylet eller de dertil relaterede sekvenser effektivt kan anvendes til udvæl-.gel se af andre sekvenser svarende til HuIFN i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse eller til fremstilling af rekombinations-DNA-molekyler, der kan udtrykke produkter med en immunologisk eller biolo-20 gisk aktivitet, som svarer til HuIFN-j3.

Det vil derfor af det foregående kunne indses, at problemet at fremstille HuIFN-0 ved anvendelse af rekombinations-DNA-teknologi er meget forskelligt fra alle de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Her skal en bestemt DNA-sekvens af ukendt struktur -- som koder for ekspressionen 25 af HuIFN-0 i en passende vært -- findes i og adskilles fra en meget kompleks blanding af DNA-sekvenser før den kan anvendes til fremstilling af HuIFN-/J. Endvidere forstærkes dette lokaliserings- og adskillelsesproblem ved den forudsete særdeles lave koncentration af den ønskede DNA-sekvens i den komplekse blanding og manglen på et effektivt middel 30 til hurtigt at analysere de mange DNA-sekvenser i blandingen til udvælgelse og adskillelse af den ønskede sekvens.

Den foreliggende opfindelse løser de omtalte problemer ved at lokalisere og adskille DNA-sekvenser, som koder for ekspressionen af HuIFN-/l i en passende vært og tilvejebringer herved DNA-sekvenser, rekombina-35 tions-DNA-molekyle og fremgangsmåder, ved hjælp af hvilke en vært transformeres til dannelse af β-type human interferoner.

Ved hjælp af den foreliggende opfindelse er det muligt at opnå β-type interferoner til anvendelse i anti-virale, anti-tumor- eller anti-cancer-midler og fremgangsmåder. Opfindelsen tillader fremstillingen af 10 DK 170476 B1 disse polypeptider i mængder og ved hjælp af fremgangsmåder, som hidtil ikke har været tilgængelige.

Som det vil kunne forstås af det følgende, er de omhandlede DNA-sekvenser og rekombinations-DNA-molekyler i stand til at styre fremstil -5 lingen i en passende vært af Ø-type interferoner. Formering af disse DNA-sekvenser og rekombinations-DNA-molekyler i en passende vært tillader også fremstillingen i store mængder af gener, der koder for disse polypeptider. Molekylstrukturen og egenskaberne af disse polypeptider og gener kan let bestemmes. Polypeptiderne og generne er værdifulde, enten 10 som fremstillet i værten eller efter passende derivatisering eller modificering i præparater og fremgangsmåder til påvisning og forbedring af fremstillingen af selve disse produkter og til anvendelse i anti-virale og anti-tumor- eller anti-cancermidler og fremgangsmåder.

Den foreliggende fremgangsmåde kan derfor skelnes fra de tidligere, 15 ovenfor omtalte, kendte fremgangsmåder ved at denne fremgangsmåde i modsætning til de nævnte kendte fremgangsmåder involverer fremstillingen og udvælgelsen af DNA-sekvenser og rekombinations-DNA-molekyler, som indeholder passende DNA-sekvenser, der koder for mindst én j8-type interferon .

20 Det vil af det foregående kunne indses, at et fundamentalt aspekt af den foreliggende opfindelse er tilvejebringelsen af et rekombinant DNA-molekyle, der består af DNA-sekvenser fra forskellige genomer, og som er i stand til at inducere ekspression i en uni-cellulær vært af et polypeptid, der udviser en immunologisk eller biolo-gisk aktivitet af 25 HuIFN-/), hvilket molekyle omfatter en DNA-sekvens valgt blandt: (a) DNA-indføringerne af G-pPla-HFIF-67-12, [HincII-Sau3AI], 6-pPla-HFIF-67-12A19, [HincII-Sau3AI] og G-pPlc-HFIF-67-8 [HincII-Sau3AI] båret af mikroorganismerne identificeret ved accessionsnumrene hhv. DSM 1851-1854, 30 (b) DNA-sekvenser, som hybridiserer til enhver af de foregående DNA-indføringer, og (c) DNA-sekvenser, der er degenereret som resultat af den genetiske kode til DNA-sekvenserne og -indføringerne defineret i (a) og (b), og som ved ekspression koder for et polypeptid med samme aminosyresekvens, 35 idet DNA-sekvensen er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens i det rekombinante DNA-molekyle. Især kan DNA-sekvensen (b), som hybridiserer til DNA-indføringen (a), være DNA-indføringen af G-pPla-HFIF-67-12ΔΜ1 [BamHI-SauAI] båret af mikroorganismen identificeret ved accessionsnummeret ATCC 31824 eller DNA-indføringen af p[325]g-HIF-4[EcoRI] 11 DK 170476 B1 båret af mikroorganismen identificeret ved accessionsnummeret ATCC 31825. Disse sekvenser tillader produktionen af HuIFN-/? og HuIFN-/?-lig-nende polypeptider i værter i henhold til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

5 Opfindelsen belyses i det følgende nærmere under henvisning til tegningen, hvor figur 1 viser et skematisk diagram over én udførelsesform af en fremgangsmåde til fremstilling af en blanding af rekombinations-DNA-molekyler, hvoraf nogle er karakteriserede ved indførte DNA-sekvenser, 10 som koder for polypeptiderne, som udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til HuIFN-/?, figur 2 viser et skematisk diagram over den initiale klonscreeningsproces til identificering af en DNA-sekvens, der er ejendommelig ved, at den koder for et polypeptid, som udviser en immunologisk 15 eller biologisk aktivitet svarende til HuIFN-Ø, figur 3 viser et skematisk diagram over én udførelsesform af en ..klon-screeningsproces under anvendelse af DNA-sekvenser fremstillet som beskrevet heri, figur 4 afbilder komposit-nukleotid-sekvensen af kodningsstrengen 20 for HuIFN-/?-DNA. Sekvensen er nummereret fra begyndelsen af indføringen ψ helt hen til det uoversatte område af indføringen. Nukleotider 65-127 repræsenterer en signal-sekvens og nukleotider 128-625 repræsenterer det "modne" fibroblast-interferon. Aminosyre-sekvenserne af signal-polypep-tidet er afbildet oven over deres respektive nukleotid-sekvenser, idet 25 aminosyrerne af signal-polypeptidet er nummereret fra -21 til -1 og aminosyrerne af modent interferon er nummereret fra 1 til 166. En gennemgang af restriktions- og fragment-analyse-data af HuIFN-/?-DNA'en, som er til stede i de i forbindelse med britisk patentansøgning 80.11306 (indleveret d. 3. april 1980) deponerede kulturer, resulterede i, at to 30 nukleotider i figur 4 blev ændret i sammenligning med figur 4 af nævnte britiske patentansøgning. Disse ændringer går i den uoversatte sekvens forud for den foreslåede signal-sekvens af HuIFN-/?-DNA og har ingen virkning på HuIFN-Ø-DNA-sekvensen eller aminosyre-sekvensen af dens oversættelses-produkt og ændrer ikke sekvensens anvendelse som en hybri-35 diserings-prøve til screening af kloner for HuIFN-/?-relaterede DNA-ind-føringer, figur 5 afbilder orienterings- og restriktions-kortene af forskellige pi asmider ifølge opfindelsen, figur 6 viser en sammenligning mellem aminosyre-sammensætningen af 12 DK 170476 B1 humant fibroblast-interferon som bestemt som beskrevet heri og aminosyre -sammensætn i ngen som bestemt i autentisk fibroblast-interferon, figur 7 afbilder et restriktions-kort af HuIFN-/l-genet og den til sekventering af pHFIF3, pHFIF6 og pHFIF7 anvendte sekventerings-5 strategi, figur 8 viser en skematisk oversigt over konstruktionen af rekombi-nations-DNA-molekyle pPLa-HFIF-67-1 ifølge opfindelsen, figur 9 viser en skematisk oversigt over konstruktionen af rekombi-nations-DNA-molekyle pPLa-HFIF-67-12 og pPLa-HFIF-67-12A19 ifølge 10 opfindelsen, figur 10 viser en skematisk oversigt over konstruktionen af rekom-binations-DNA-molekyle pPLc-HFIF-67-8 ifølge opfindelsen, figur 11 viser en skematisk oversigt over orienteringskortet og det partielle restriktions-kort af pPLa-HFIF-67-12 ifølge opfindelsen, 15 figur 12 visere en skematisk oversigt over orienteringskortet og det partielle restriktions-kort af pPLA-HFIF-67-12A19 ifølge opfindelsen, og figur 13 viser en skematisk oversigt over orienteringskortet og det partielle restriktions-kort af pPLc-HFIF-67-8 ifølge opfindelsen.

20 Til nærmere forståelse af opfindelsen gives i det følgende en mere detaljeret beskrivelse.

I beskrivelsen anvendes følgende udtryk:

Nukleotid --En monomer enhed af DNA eller RNA bestående af en sukkerdel (pentose), et fosfat og en nitrogenhol dig heterocyklisk base.

25 Basen er bundet til sukkerdelen via det glykoside carbon (carbon Γ i pentosen) og denne kombination af base og sukker kaldes et nukleocid.

Basen karakteriserer nukleotidet. De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og thymin ("T"). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil ("U").

30 DNA-sekvens -- En liniær serie af nukleotider, som er bundet til hinanden ved phosphordiester-bindinger mellem nabostillede pentosers 3'-og 5'-carbonatomer.

Kodon -- En DNA-sekvens af tre nukleotider (en triplet), der gennem mRNA indkoder en aminosyre, et oversættelses-startsignal eller et over-35 sættelses-slutsignal. Fx. indkoder nukleotid-tripletterne TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG for aminosyren leucin ("Leu"), TAG, TAA og TGA er oversætte! ses-slutsignal er og ATG er et oversættelses-startsignal.

Læse-rubrik -- Grupperingen af kodoner under oversættelse af mRNA til aminosyre-sekvenser. Under oversættelse skal den rette læse-rubrik 13 DK 170476 B1 bibeholdes. Fx. kan sekvensen GCTGGTTGTAAG udtrykkes i.tre læse-rubrikker eller faser, der hver tilvejebringer en forskellig aminosyre-sekvens: GCT GGT TGT MG -- Ala-Gly-Cys-Lys 5 G CIS GTT ÉJA AG - Leu-Val-Val GC TGG TTG TM G -- Trp-Leu-(STOP).

Polvoeptid --En 1ineær serie af aminosyrer, som er forbundet til hinanden ved hjælp af peptid-bindinger mellem α-amino- og carboxy-grupperne i nabostillede aminosyrer.

10 Genom -- En celles eller virus totale DNA. Det omfatter inter alia de strukturelle gener, der koder for stoffets polypeptider, samt operator, promotor og ribosom binding og interaktions-sekvenser, herunder sekvenser såsom Shine-Dalgarno sekvenser.

Strukturelt gen -- En DNA-sekvens, der gennem dens templat eller 15 budbringer RNA ("mRNA") indkoder en sekvens af aminosyre, som er karakteristisk for et specifikt polypeptid.

Transskription -- Fremgangsmåden til fremstilling af mRNA ud fra et * strukturelt gen.

Oversætte!se -- Fremgangsmåden til fremstilling af et kspeptid ud 20 fra mRNA.

Ekspression -- Den proces et strukturelt gen undergår til dannelse af et polypeptid. Det er en kombination af transskription og oversættelse. ^

Plasmid --En non-kromosomal dobbeltstrenget DNA-sekvens, der om-25 fatter en intakt "replicon", således at plasmidet replikeres eller formeres i en værts-celle. Når plasmidet anbringes i en unicellulær organisme, kan egenskaberne af denne organisme ændres eller transformeres som følge af plasmidets DNA. Fx transformereret plasmid, som bærer genet

D

for tetracyclin-resistens (Tet ), en celle, der forud var følsom over 30 for tetracyclin, til en celle, der er resistent derfor. En celle, som er transformeret med et plasmid, kaldes en "transformant".

Faa eller bakteriofaa -- Bakterielle virus, hvoraf mange består af DNA-sekvenser, der er indkapslet i en proteinomslutning eller et proteinovertræk ("capsid").

35 Kl on-bærer -- Et plasmid, en fag-DNA eller andre DNA-sekvenser, der er i stand til at formeres i en værts-celle, karakteriseret ved én eller et lille antal endonuklease-genkendelsespositioner, hvor sådanne DNA-sekvenser kan skæres på en determinerbar måde uden ledsagende tab af en essentiel biologisk funktion for DNA'en, fx formering, produktion af 14 DK 170476 B1 overtrækningsproteiner eller tab af promotor eller bindings-positioner og som indeholder en markør, der er egnet til brug ved identifikationen af transformerede celler, fx. tetracyclinresi stens eller ampicillin-resistens. En klon-bærer kaldes ofte en vektor.

5 Kloning -- Fremgangsmåde til opnåelse af en population af organis mer eller DNA-sekvenser, der afledes fra én sådan organisme eller sekvens ved asexuel reproduktion.

Rekombinations-DNA-molekvle eller hybrid DNA --Et molekyle, der består af DNA-segmenter fra forskellige genomer, hvis ender er blevet 10 forbundet uden for levende celler, og som har evnen til at inficere en værts-celle og forblive deri.

Ekspressions-kontrolsekvens -- En sekvens af nukleotider, der kontrollerer og regulerer udtrykkeisen af strukturelle gener ved operativ binding til disse gener. De indbefatter lac-systemet, trp-systemet, 15 større operator- og promotorregioner for fag λ , kontrol regionen for fd overtrækningsproteiner og andre sekvenser, som vides at kontrollere gen-ekspressionen for prokaryotiske eller eukaryotiske celler og deres virus.

20 Polvoeotid. der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet svarende til human θ-interferon --

Et polypeptid, som har antiviral aktivitet og/eller er i stand til at inducere 2,5 A syntetase-aktivitet, hvilken antiviral eller 2,5-A syntetase-induktionsaktivitet er i stand til at blive neutraliseret af 25 antistoffer mod nativ human IFN-/5.

Idet der nu henvises til figur 1, ses en skematisk oversigt over en udførelsesform af en fremgangsmåde til fremstilling af en blanding af rekombinations-DNA-molekyler, hvoraf nogle indbefatter indførte DNA-30 sekvenser, der karakteriserer opfindelsen.

Fremstilling af oolvfAl RNA indeholdende human fibroblast-interferon mRNA (IFN-fl-mRNA)

Den ved den foreliggende opfindelse anvendte RNA ekstraheredes fra 35 humane VGS-celler, en diploid fibrobiast-cellelinie, som kan formeres i monolags-kulturer ved 37°C. IFN-0 produceres i disse celler ved induktion med poly(I,C) i nærværelse af cycloheximid.

For en typisk RNA-isolering "præpareredes" 20 såkaldte rulle-flasker, som hver især indeholdt diploide VGS-celler i konfluent mono- 15 DK 170476 B1 lag, natten over med 100 enheder/ml IFN-/J og kulturerne induceredes i 1 time med 100 /ig/ml poly(I,C) og 50 rø/ml cycloheximid, inkuberedes med cycloheximid (50 /zg/ml) i 4 timer, udvandtes ved skrabning i phosphat-pufret saltopløsning og centrifugeredes. Cellerne lyseredes i 15 minut-5 ter ved 0°C til fjernelse af de intakte kærner, som indeholdt DNA'en, og til isolering af den cytoplasmi ske RNA ved suspension i hypotonisk puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl og 1,5 mM MgCl2) og tilsætning af NP40 indtil 1%. Kærner fjernedes ved pelletering i en Sorvall SS-34 rotor i 5 minutter ved 3000 opm. Natriumdodecylsulphat ("SDS") og EDTA 10 sattes til supernatanten indtil hhv. 1% og 10 mM, og blandingen ekstra-heredes 5 gange med 2x vol. af 1:1 omdestilieret phenol-og chloroform-isoamyl-alkohol (25:1), idet den vandige fase, der indeholdt RNA'en, ' separeredes ved centrifugering i en Sorvall SS-34 rotor ved 8000 opm i 10 minutter efter hver ekstraktion. RNA'en udfældedes fra den vandige 15 fase ved tilsætning af 1/10 vol. af 2 M natriumacetat (pH 5,1) og 2,5 vol. ethanol. Sædvanligvis opnåedes 60 til 90 /zg total cytoplasmisk RNA •per rulle-flaske.

Andre fremgangsmåder til ekstraktion af cytoplasmisk RNA blev også anvendt. Fx. lyseredes cellerne fuldstændigt efter homogenisering i 0,2 20 M Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM NaCl, 20 mM EDTA og 0,5% SDS og ekstraheredes med phenol-chloroform som ovenfor (F.H. Reynolds, et al., "Interferon Activity Produced By Translation Of Human Interferon Messenger RNA In Cell-Free Ribosomal Systems And In Xenopus Oocytes", Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 72, pp. 4881-87 (1975)) eller de vaskede celler suspenderedes 25 i 400 /il 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl (pH 7,5) og 0,001 M EDTA ("NTE-puffer") og 2,5 ml 4 M guanidiniumisothiocyanat og 1 M Ø-mercaptoethanol i 20 mM natriumacetat (pH 5,0) tilsattes, og cellerne homogeniseredes. Lysatet lejredes på en 1,3 ml M CaCl pude i et Beckman SW-60 Ti nitrocellulose-rør, centrifugeredes i 17 timer ved 39000 opm for at pelletere 30 RNAén og separere den fra DNA, proteiner og lipider og RNA'en ekstraheredes én gang roed phenol-chloroform (J. Morser, et al., "Characterization Of Interferon Messenger RNA From Human Lymphoblastoid Cells", J. Gen. Virol., 44, pp. 231-34 (1979)).

Den totale RNA analyseredes for tilstedeværelsen af IFN-Ø-mRNA ved 35 injektion i cytoplasmaet af Xenopus laevis oocyter og til bestemmelse af den deri inducerede IFN-jS aktivitet (Reynold, et al., supra). Analysen gennemførtes ved opløsning af RNA'en i vand og injektion af ca. 50 ni i hver oocyt. Oocyterne inkuberedes natten over ved stuetemperatur i Barth-medium (J. Gurdon, 0. Embryol. Exper. Morphol., 20, pp. 401-14 16 DK 170476 B1 (1968)), homogeniseredes i en del af mediet, resten fjernedes ved centrifugering, og IFN-0 aktiviteten af supernatanten bestemtes. IFN-/? aktiviteten påvistes ved reduktion af virus-induceret cytopatisk virkning (W.E. Stewart og S.E. Sulkin, "Interferon Production In Hampsters 5 Experimentally Infected With Rabies Virus", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 123, pp. 650-53 (1966)). Angrebs-virussen var vesicular stomatitis virus (Indiana-stamme) og cellerne var humane di pi oide fibrobi aster, der var trisomiske for kromosom 21 for at muliggøre større IFN-0 sensitivitet.

IFN-/J aktivitet er udtrykt i forhold til IFN-reference-standard 69/19.

10 Poly(A)-RNA indeholdende IFN-/J-mRNA isoleredes fra den cyto-plasmiske RNA ved adsorption til oligo(dT)-cellulose (type 7, P-L Biochemicals) i 0,4 M NaCL, 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM EDTA og 0,2% SDS i 10 minutter ved stuetemperatur. RNA-aggregering reduceredes til et minimum ved at opvarme RNA7en i 2 minutter ved 70°C før adsorption.

15 Efter vaskning af cellulosen med den ovenfor nævnte puffer elueredes poly(A)-RNA-fraktionen med 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1 mM EDTA og 0,2% SDS. Den udgjorde sædvanligvis 45% af den totale RNA som målt ved optisk tæthed ved 260 nm.

En yderligere rensning til berigelse af poly(A)-RNA7en i IFN-ømRNA 20 gennemførtes ved formamid-sakkarose-gradienter (T. Pawson, et al., "The Size of Rous Sarcoma Virus mRNAs Active in Cell-Free Translation",

Nature, 268, pp. 416-20 (1977). Disse gradienter gav meget højere genopløsning end ikke-denaturerende sakkarose-gradienter. Sædvanligvis opløstes ca. 80 /zg poly(A)-RNA i 50% formamid, 100 mM Li Cl, 5 mM EDTA, 25 0,2% SDS og 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), opvarmedes til 37°C i 2 minutter for at forhindre aggregering og fyldtes på en 5-20% sakkarose-gradient i et Beckman SW-60 Ti polyallorner-rør. Efter centrifugering ved 20°C i 4¾ timer ved 60000 opm i Beckman SW-60 Ti rotoren med total C-mærket eukaryotisk RNA som størrelses-markører fraktioneredes gradienten og den 30 optiske tæthed af fraktionen bestemtes. Alle RNA-fraktioner fældedes to gange med 0,5 M NaCl og 2,5 vol. ethanol og analyseredes for interferon-mRNA-aktivitet som ovenfor beskrevet. Disse rensningsprocesser resulterer i en 40-foldig berigelse af poly(A)-RNA7 ens IFN-jS-mRNA-indhold.

Alternativt fraktioneredes den oligo(dT)-adsorberede mRNA (60 35 /ig) ved elektroforese i en 4% polyacrylamidgel i 7 M urinstof, 0,1% e SDS, 50 mM Tris-borat (pH 8,3) og 1 mM EDTA, idet mRNA'en opløstes i dette puffer og opvarmedes i 1 minut til 55°C før tilsætning til gelen.

Efter elektroforese blev 2 mm brede sektioner afskåret fra gelen og RNA'en elueredes fra hver homogeniseret gel-sektion, befriedes yder- 17 DK 170476 B1 ligere for urenheder ved adsorption til oligo(dT)-cellulose og analyseredes for IFN-j8-mRNA som før.

På dette sted bør det bemærkes, at det fra formamid-sakkarose-gra-dienterne og polyacrylamidgel-fraktioner!ngen opnåede poly(A)-RNA-pro-5 dukt indeholder et endda meget stort antal forskellige mRNA'er. Med undtagelse af mRNA'en, der er specifik for IFN-/I, er de andre mRNA'er uønskede kontaminanter (figur 1). Desværre opfører disse kontaminerende RNA'er sig på lignende måde som HuIFN-jSmRNA'er gennem resten af klonings-processen ifølge den foreliggende opfindelse. Derfor resulterer 10 deres tilstedeværelse i poly(A)-RNA'en i der. endelige fremstilling af et stort antal uønskede bakterielle kloner, der indeholder gener, der koder for andre polypeptider end IFN-Ø. Denne kontaminering indebærer omfattende screening-problemer ved isolering af de ønskede IFN-j8 hybride klo ner. I tilfælde af IFN->3 bliver screening-problemet yderligere forværret 15 gennem manglen på en tilstrækkeligt renset prøve på HuIFN-ømRNA eller DNA eller en del deraf som screening-prøve til identifikationen af de ..ønskede kloner. Derfor er screening-processen for IFN-/J klonerne meget tidskrævende og vanskelig. Ydermere er isoleringen af en aktiv klon en screening-proces, der kan sammenlignes med "at finde en nål i en hø-20 stak", fordi kun en meget lille procentdel af selve IFN-/J klonerne kan forventes at udtrykke IFN-/J i en biologisk eller immunologisk aktiv form.

Der kan med fordel anvendes rekombinations-DNA-teknologt til opnåelse af en .renset prøve af HuIFN-/?mRNA eller cDNA eller en del deraf.

25 Disse rensede mRNA'er eller cDNA'er kan anvendes til hurtig screening af et stort antal bakterielle kloner og forøger derved markant sandsynligheden for isolering af en klon, der udtrykker IFN-/J i en aktiv form.

Syntese af dobbeltstrenget cDNA indeholdende IFN-θ cDNA 30 Med IFN-Ø-niRNA beriget poly(A)-RNA anvendtes som en skabelon til fremstilling af komplementær DNA ("cDNA"), i det væsentlige som beskrevet af R. Devos, et al., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Full-Size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA", J.

Mol. Biol. 128, pp. 595-619 (1979) til fremstilling af et plasmid inde-35 holdende en DNA-kopi af bakteriofag MS2 RNA.

Enkelt-strenget cDNA fremstilledes ud fra poly(A)-RNA'en med RNA-afhængig DNA-polymerase (25 enheder) fra aviær myeloblastosis virus ("AMV") revers transkriptase (foræret fra Dr. J. Beard, Life Sciences, Gulfport, Florida), initieredes med en (dT)10 primer (6 /zg, Miles) 18 DK 170476 B1 hybridiseret til RNA'ens poly(A)-hale, i 50 /ti 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgClg, 30 mM /J-mercaptoethanol, 4 mM Na^Oy, 2,5 /tg//tl inaktive-ret okseserumalbumin, dTTP, dATP, dCTP og dGTP, hver ved 0,5 mM og a-^P-dATP (20 /tCi, toersham). Efter 30 minutter ved 41°C afsluttedes 5 reaktionen ved tilsætning af EDTA til 10 mM, reaktionsblandingen ekstra-heredes med samme volumen phenol:chloroform:isoamyl-alkohol (25:24:1) og den vandige fase lagdeltes på en Sephadex G50 søjle og elueredes i TE-puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA). De tomme fraktioner, som udviste radioaktivtet, fældedes ved tilsætning af 10 øg E. coli transfer 10 RNA, kaliumacetat (pH 5,1) til 0,2 M og 2,5 volumen ethanol.

Den ovenfor syntetiserede cDNA-population er i virkeligheden en kompleks blanding af cDNA'er stammende fra de forskellige mRNA'er, som var til stede i den berigede poly(A)-mRNA (figur 1). Ydermere er mange cDNA'er p.g.a. for tidlig afslutning ved AMV revers transkriptase ukom-15 plette kopier af de forskellige mRNA'er i poly(A)-RNA'en (ikke vist i figur 1).

Før cDNA'en,gøres dobbeltstrenget, fjernes den fra dens sammenhæng med den komplementære skabelon RNA ved fældning med ethanol og inkube-ring i TE-puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) med ribonuklease 20 Tj (10 enheder, Sankyo Co., Ltd) og bugspytkirtel-ribonuklease A (10 øg, Sigma) til 10 øl i 30 minutter ved 37°C (ribonukleasen er fri for enkeltstrengede specifikke endo- og exo-deoxyribonukleaser). Ved fjernelsen af skabelon-strengen med ribonuklease i stedet for med base undgås eventuelle cDNA-mutationer ved base-katalyseret deaminering.

25 cDNA-strengen kan gøres dobbeltstrenget med DNA-polymerase I (A.

Efstratiadis, et al., "Enzymatic In Vitro Synthesis Of Globin Genes",

Cell, 7, pp. 279-88 (1976)). Den ovenfor nævnte 10 øl ribonuklease/cDNA-blanding fortyndedes til 20 øl med MgCl^ til 10 mM, DTT til 10 mM, kaliumphosphat (pH 6,9) til 100 mM, dATP, dCTP, dTTP og dGTP hver til 32 30 0,3 mM, a- P-dATP (20 øCi, toersham) og DNA-polymerase I (40 enheder, Biolabs). Efter 6 timer ved 15°C sattes EDTA til 10 mM og SDS til 0,1% og den.dobbeltstrengede cDNA isoleredes ved ekstraktion (phenol chloroform: i soamyl-al kohol), kromatografi (Sephadex G50) og fældning af tomme fraktioner som ovenfor.

35 For at åbne den enkeltstrengede hårnål-løkke, som forbliver på den dobbeltstrengede cDNA-struktur, opløstes den fældede cDNA i 100 øl 0,2 M NaCl, 50 mM natriumacetat (pH 4,5), 10 mM zinkacetat og 2 øg varme-dena-tureret kalvethymus-DNA og omsattes med SI nuklease (5 enheder, Sigma) i 30 minutter ved 37°C. Tilsætning af EDTA til 10 mM, ekstraktion med phe- 19 DK 170476 B1 nol:chloroform:isoamyl-al kohol og fældning af den vandige fase ved tilsætning af 10 pg E. coli transfer RNA som bærer, 0,2 M natriumacetat (pH 5,1) og 2,5 vol. ethanol gav en stumpendet dobbeltstrenget cDNA-blånding. Denne blanding er heterogen både som følge af heterogeniteten 5 af poly(A)-RNA'en, der anvendtes som en skabelon til fremstilling deraf (figur 1) og som følge af den for tidlige afslutning af cDNA-transskrip-terne ved AMV revers transskriptase (ikke vist i figur 1).

For at formindske virkningen af den sidstnævnte heterogenitet sorteredes den dobbeltstrengede cDNA efter størrelse ved elektroforese på 10 en 4% polyacrylamidgel i 50 mM Tris-borat puffer (pH 8,3) og 1 mM EDTA, 3? idet 5'- P-mærkede restriktionsfragmenter (ΦΧ174 (RF)-DNA) tjente som størrelses-markører. DNA-bånd af passende størrelse (fx. størrelsesklasser 800-900 bp, 700-800 bp, 650-700 bp og 550-650 bp) udvalgtes. Fordi den ud fra polyacrylamidgel elektroforesebehandlet poly(A)-RNA fremstil-15 lede dobbeltstrengede cDNA udviste et fremtrædende bånd på ca. 850 bp, ansås dette bånd for at repræsentere DNA'en i dens fulde længde. Båndene elueredes ved at knuse gelen i 0,5 M ammoniumacetat og 0,1% SDS pg omrøre natten over. Efter fjernelse af resten ved centrifugering, adsorbe-redes DNA'en til hydroxylapatit-pulver, fyldtes på en Sephadex G50 søjle 20 i 5 mM natriumphosphat (pH 7,5), vaskedes yderst grundigt med puffer, elueredes med 0,45 M natriumphosphat (pH 7,5) og afsaltedes med det samme ved sigte-virkningen af Sephadex G50-matrixen. Fraktionerne, som 32 indeholdt den eluerede DNA, bestemt ved P-radioaktiviteten, udfældedes ved tilsætning af 10 pg E. coli transfer RNA, natriumacetat til 0,2 M og 25 2,5 vol. ethanol.

Et eksempel på effektiviteten af den ovenfor beskrevne cDNA-præpa-ration giver et typisk forsøg, hvor ca. 2 pg poly(A)-RNA efter formamid-sakkarose gradient gav ca. 16 ng dobbeltstrenget cDNA i størrelsesordenen 800 til 900 bp.

30 Igen bør det forstås, at denne dobbeltstrengede cDNA er en blanding af et stort antal cDNA'er, hvoraf kun meget få er IFN-Ø-cDNA (figur 1). Kloning af dobbeltstrenoet DNA

Mange forskellige kombinationer af vært/klon-bærere kan anvendes til kloning af den dobbeltstrengede cDNA, som er fremstillet ifølge den 35 foreliggende opfindelse. Fx. kan nyttige klon-bærere bestå af segmenter af chromosomale, non-chromosomale og syntetiske DNA-sekvenser, såsom forskellige kendte derivater af SV40 og kendte bakterielle plasmider, fx. plasmider fra E. coli inklusive col El, pCRl, pBR322, pMB9 og deres derivater, plasmider fra et større udvalg af værter, fx. RP4, fag-DNA, 20 DK 170476 B1 fx. de talrige derivater af fag-λ, fx. NM 989 og andre DNA-fager, fx.

M13 og filamentøse enkeltstrengede DNA-fager, og fra kombinationer af pi asmider og fag-DNA'er afledte vektorer såsom pi asmider, der er blevet modificeret til at anvende fag-DNA eller andre ekspressions-kontrol-5 sekvenser eller gærplasmider såsom 2 μ plasmidet eller derivater deraf. Nyttige værter kan indbefatte bakterielle værter såsom E. coli, fx. E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRC1 og stammer af Pseudomonas, Bacillus subtil is, Bacillus stearothermophilus og andre baciller, gærarter og andre svampe, dyre- eller planteværter såsom dyre-10 (inkl. menneske-) eller planteceller i kultur eller andre værter. Selvfølgelig kan ikke alle vært/vektor kombinationer være lig virksomme. Det specielle valg af vært/klon-bærer-kombination kan inden for den foreliggende opfindelses rammer, efter behørig overvejelse af de fremsatte principper foretages af fagmanden.

15 Ydermere kan inden for hver specifik klon-bærer vælges forskellige positioner til indføring af den dobbe.ltstrengede DNA. Disse positioner betegnes sædvanligvis ved restriktions-endonukleasen, som skærer dem.

Fx. befinder Pstl-positionen i pBR322 sig i genet for Ø-lactamase, mellem nukleotid-tripletterne, som koder for aminosyrer 181 og 182 af dette 20 protein. Denne position anvendtes oprindeligt af S. Nagata et al., supra, i deres syntese af protein, som udviste en immunologisk eller biologisk aktivitet af IFN-α. 'En af de to Hindll endonuklease-genken-delsespositioner befinder sig mellem tripletterne, der koder for aminosyrer 101 og 102 og én af de forskellige Taq-positioner befinder sig ved 25 tripletten, der koder for aminosyre 45 af /Mactamase i pBR322. På lignende måde ligger EcoRI-positionen og PvuII-positionen i dette plasmid uden for enhver kode-region, idet EcoRI-positionen befinder sig mellem generne, der koder for hhv. tetracyclin- og ampici11 inresistens. Denne position anvendtes af T. Taniguchi et al., supra, i deres rekombina-30 ti ons-synteseskema. Disse positioner er velkendte for fagmanden. Det må selvfølgelig forstås, at en klon-bærer, der er nyttig i forbindelse med den foreliggende opfindelse, ikke behøver at have en restriktions-endo-nukleaseposition til indføring af det valgte DNA-fragment. I stedet kan bæreren forbindes med fragmentet på alternative måder.

35 Vektoren eller klon-bæreren og især den deri valgte position til fastgørelse af et udvalgt DNA-fragment til dannelse af et rekombinations -DNA-molekyle bestemmes af forskellige faktorer, fx antal af positioner, der er modtagelige over for et bestemt restriktionsenzym, størrelse af proteinet, der skal udtrykkes, modtagelighed af det ønskede 21 DK 170476 B1 protein over for proteolytisk degradering med værtscelle-enzymer, kontaminering af proteinet, der skal udtrykkes, af værtscelle-proteiner, der er vanskelige at fjerne under rensning, ekspressions-egenskaber såsom placering af start- og slut-kodoner i forhold til vektor-sekven-5 serne, samt andre af fagmanden kendte faktorer. Valget af vektor og indførings-position for et bestemt gen bestemmes af balancen mellem disse faktorer, idet ikke alle valg er lige virkningsfulde i et givet tilfælde.

Selvom der kendes forskellige fremgangsmåder til indføring af frem-10 med DNA i en klon-bærer eller vektor til dannelse af et rekombinations-DNA-molekyle, er den foretrukne fremgangsmåde til en første kloning en fordøjelse af plasmidet (især pBR322) med det restriktions-enzym, der er •specifikt for den til indføring valgte position (især PstI) og ved tilsætning af dA-haler til 3'-enderne ved terminal transferase. På lignende 15 måde forlænges den dobbeltstrengede cDNA ved tilsætning af dT-haler til 3'-enderne for at tillade forbindelse med hale-plasmidet. Hale-plasmidet .og cDNA'en varmebehandles dernæst for at indføre cDNA'en i den passende plasmid-position og for at cirkulere den hybride DNA, idet halernes komplementære karakter tillader deres kohæsion (figur 1). Det resul-20 terende rekombinations-DNA-molekyle bærer nu et indført gen i den valgte PstI restriktions-position (figur 1). Denne fremgangsmåde til indføring under anvendelse af dA-dT haler er beskrevet af D.A. Jackson, et al., "Biochemical Method For Inserting New Genetic Information Into DNA Of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA Molecules Containing Lambda Phage 25 Genes And The Galactose Operon Of Escherichia coli", Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 69, pp. 2904-909 (1972) og R. Devos, et al., supra. Fremgangsmåden resulterer i ca. 3 gange så mange rekombinations-DNA-plasmider som ved anvendelse af dG-dC haler.

Selvfølgelig er andre kendte fremgangsmåder til indføring af DNA-30 sekvenser i klon-bærere til dannelse af rekombinations-DNA-molekyler ligeledes nyttige i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Disse fremgangsmåder indbefatter fx. anvendelse af dG-dC haler, direkte afsnøring, syntetiske bindere, exonuklease- og polymerase-bundne reparationsreaktioner efterfulgt af afsnøring, eller, udvidelse af DNA-strengen med 35 DNA-polymerase og en passende enkeltstrenget skabelon efterfulgt af afsnøring.

Det bør selvfølgelig forstås, at nukleotid-sekvenserne eller cDNA-fragmentet, som er indført i den valgte position på klon-bæreren, kan indbefatte nukleotider, der ikke er en del af det aktuelle strukturelle 22 DK 170476 B1 gen for det ønskede polypeptid eller muligvis kun indbefatter et fragment af det komplette strukturelle gen for det ønskede protein. Uanset, hvilken DNA-sekvens der indføres, er det kun påkrævet, at en transformeret vært producerer et polypeptid med en biologisk.eller immunologisk 5 aktivitet svarende til HuIFN-/9 eller at selve DNA-sekvensen kan benyttes som hybridiseringsprøve for at udvælge kloner, der indeholder DNA-sekvenser, der er nyttige til fremstilling af polypeptider med en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til HuIFN-/*.

Klon-bæreren eller vektoren, der indeholder det fremmede gen, an-10 vendes til transformering af en vært, således at det bliver muligt for værten at udtrykke polypeptider, der udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til HuIFN-/?, for hvilket den hybride gen koder. Udvælgelsen af en passende vært kontrolleres også af et antal i og for sig kendte faktorer. Disse faktorer indbefatter fx forenelighed med 15 den valgte vektor, toxicitet af proteiner, der er indkodet af det hybride plasmid, let udvinding af det ønskede protein, ekspressions-egenskaber, bio-sikkerhed og omkostninger. Der må opnås en balance mellem disse faktorer og det må forstås, at ikke alle værter kan være lige virkningsfulde til at udtrykke et bestemt rekombinations-DNA-molekyle. .

20 Ved den foreliggende syntese er den foretrukne begyndelsesklonbærer det bakterielle plasmid pBR322 og den foretrukne begyndelsesrestri ktions-endonukleaseposi tion deri Pstl-positionen (figur 1). Plas-midet er et lille (molekylvægt ca. 2,6 megadaltons) plasmid, der bærer resistens-gener for de antibiotiske midler ampicillin (Amp) og tetra-25 cyclin (Tet). Plasmidet er blevet fuldt ud karakteriseret (F. Bolivar et al., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene, pp. 95-113 (1977), J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Derived From The DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5, 30 pp. 2721-28 (1978)); J.G. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence Of The Escherichia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 43, I, pp. 77-90 (1978)). Indføring af DNA-produktet i denne position giver et stort antal bakterielle kloner, som hver indeholder ét af de DNA-gener eller fragmenter deraf, der er til stede i det tidligere fremstil-35 lede cDNA-produkt. Igen vil kun meget få af disse kloner indeholde genet for IFN-α eller fragmenter deraf (figur 1) og ingen af dem tillader måske ekspressionen af polypeptider, som udviser immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til IFN-/J.. Den foretrukne første vært ifølge den foreliggende opfindelse er E. coli HB 101.

23 DK 170476 B1 ’ 1. Fremstilling af Pstl-soaltet. dA-forlænaet dBR322

Plasmid pBR322 fordøjedes fuldstændigt ved 37°C med Pstl-endo-nuklease (New England Biolabs) i 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgClg og 7 mM 2-mercaptoethanol. Denne blanding ekstraheredes med 1 vol. phenol 5 og 10 vol. ether og udfældedes med 2,5 vol. ethanol:0,2 M natriumacetatopløsning.

Tilsætning af homopolymere dA-haler (figur 1) ved terminal dioxy-nucleotidyl-transferase (TdT) (renset ifølge L. Chang og F. J. Bollum, "Deoxynucleotide Polymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland", J. Biol.

10 Chem., 246, pp. 909-16 (1971)) gennemførtes i et 50-/(1 reaktionsvolumen indeholdende 0,14 M kaliumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM

CoS0A, 0,2 /tg//il varme-inaktiveret okseserumalbumin, 0,8 mM DTT, 0,2 mM

^ 32 o dATP og lidt a- P-DATP. Inkubation gennemførtes ved 37 C i 5 minutter før EDTA sattes til 10 mM og SDS til 0,1% og blandingen ekstraheredes 15 med phenol og kromatograferedes på Sephadex G50 i TE puffer. De tomme fraktioner, som indeholdt den lineariserede og forlængede pBR322, rensendes yderligere ved adsorption i 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1 mM EDTA og 0,4 M NaCl til oligo(dT)-cellulose. Efter grundig vaskning elueredes de ønskede fraktioner med 10 mM Tris-HCl (pH 7,8) og 1 mM EDTA.

20

2. Fremstilling af dT-forlænget DNA

Dobbeltstrenget DNA forlængedes med dTMP-rester på lignende måde som beskrevet ovenfor for dA-haler af pBR322 med undtagelse af, at dTTP og lidt 3H-dTTP erstattede dATPén og a-32P-ATP'en. Rensning på oli-25 go(dT)-cellulose blev selvfølgelig udeladt. Som før er den dT-forlængede DNA en blanding af forskellige typer, hvoraf kun meget få er HuIFN-Ø-re-laterede (figur 1).

3. Fremstilling af Ca—-behandlet E. coli HB101 30 Ca++-behandlet E. coli HB101 fremstilledes ved fremgangsmåden ifølge E. M. Lederberg og S. N. Cohen, "Transformation Of Salmonella Typhimurium By Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol., 119, pp. 1072-74 (1974) ved at pode E. coli HB101 (foræret af H. Boyer) i 5 ml LB-medium (10 dele baktotrypton, 5 dele gærekstrakt og 5 dele 35 NaCl per liter) og kulturer dyrkedes natten over ved 37°C. De friske kulturer fortyndedes 1/100 i 20 ml LB-medium og dyrkedes til en tæthed o på ca. 2 x 10 bakterier per ml, afkøledes hurtigt i is og pelleteredes ved 6000 opm i 5 minutter i en Sorvall SS34 rotor ved 4°C. Cellerne, som holdtes ved 0-4°C, vaskedes med 20 ml 100 mM CaClg. Efter 20 minutter i 24 DK 170476 B1 is repelleteredes cellerne og resuspenderedes i 2 ml 100 mM CaClg og holdtes ved 0°C i 15 minutter. Med glycerin til 11% supplerede portioner (200 /il) kunne opbevares i flere måneder ved -80°C uden aktivitetstab (D.A. Morrison, "Transformation In Escherichia col i: Cryogenic Preser-5 vation Of Competent Cells", J. Bacteriol., 132, pp. 349-51 (1977)).

4. Varmebehandling af dA-forlænget dBR322 oa dT-forlænget DNA

De komplementære dA- og dT-haler af vektoren og DNA-indføringen tillader varmebehandling til dannelse af de oprindeligt ønskede hybride 10 plasmider eller rekombinations-DNA-molekyler. Til dette formål opløstes den dA-hale Pstl-spaltede pBR322-vektor og blandingen af de efter størrelse sorterede dT-hale cDNA'er i TSE-puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) til 1,5 jug/ml plasmid og til et molært forhold mellem plasmid og DNA-indføring på 1,5 til 2,0. Efter opvarmning til 15 65°C i 10 minutter afkøledes blandingen langsomt til stuetemperatur over 4 timer.

Produktet er selvfølgelig en omfattende blanding af forskellige rekombinations-DNA-molekyler og nogle klon-bærere uden indførte DNA-sekvenser. Hvert rekombinations-DNA-molekyle indeholder imidlertid et 20 cDNA-segment i Pstl-positionen. Hvert sådant cDNA-segment kan omfatte et gen eller et fragment deraf. Kun meget få af cDNA-fragmenterne koder for HuIFN-/J eller en del deraf (figur 1). Den overvejende del koder for et af de andre proteiner eller dele deraf, hvis mRNA'er var en del af den i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendte poly(A)-RNA 25 (figur 1). Det bør også forstås, at måske tillader ingen af klonerne i-den ovenfor fremstillede samling ekspressionen af polypeptider, som udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet svarende til IFN-j3.

5. Transfektion af E.coli HB1Q1 med de varmebehandlede hybride plasmider 30 P3-beholder-faciliteter anvendtes i det nødvendige omfang til transfektionsprocessen og alle efterfølgende trin, hvori de resulterende transformerede bakterier håndteredes. Portioner (90 /il eller mindre) af den ovenfor anførte blanding afkøledes til 0°C og 1 M CaClg sattes til 0,1 M. Portioner (100 μΐ eller mindre) af denne opløsning 35 sattes til 200 /il Ca++-behandl et E. coli HB101 i is og efter henstand ved 0°C i 30 minutter varmechock-behandledes cellerne i 5 minutter ved 37°C og afkøledes igen til 0°C i 15 minutter. Efter tilsætning af 2 ml LB-medium inkuberedes cellerne ved 37°C i et rystevandbad i 30 til 45 minutter og den bakterielle suspension anbragtes på 1,2% agarplader 25 DK 170476 B1 indeholdende LB-medium suppleret med 10 pg/ml tetracyclin.

Da plasmid pBR322 indbefatter genet for tetracyclin-resistens, vil E. coli værter, der er blevet transformeret med et plasmid, som har dette gen intakt, vokse i kulturer indeholdende dette antibiotikum under 5 udelukkelse af bakterier, som ikke er blevet transformeret på denne måde. Derfor tillader vækst i tetracyclin-holdige kulturer udvælgelse af værter, der er transformeret med et rekombinations-DNA-molekyle eller recirkuleret vektor.

Efter 24 timer ved 37°C udvalgtes individuelle kolonier og suspen-10 deredes i 100 μΐ LB-medium (suppleret som ovenfor) i fordybningerne på mi krotiter-plader (Dynatech). Efter inkubation ved 37°C natten over blandedes 11 μ1 dimethyl sul foxid i hver fordybning og bakkerne forsegledes med klæbebånd. Pladerne opbevaredes ved -20°C og der fremstilledes en samling på 17.000 individuelle kloner af transformeret E. coli HB101.

15 Denne samling opnåedes fra 270 fmol (128 ng) dT-hale cDNA-indføringer, som igen syntetiseredes fra 4,4 øg gradient-renset poly (A)-RNA. Ca. 98% af klonerne i denne samling var følsomme over for carbenicillin Jet mere stabilt ampici1linderivat). Derfor indeholdt ca. 98% af samlingen et plasmid med en indføring i Pstl-positionen af j8-lactamase-genet af 20 pBR322 og kun ca. 2% indeholdt en recirkuleret vektor uden indføring.

Disse 17.000 kloner indeholder forskellige rekombinations-DNA-molekyler, der repræsenterer komplette eller partielle kopier af mRNA-blandingen i poly(A)-RNA-præparationen fra HuIFN-/J-producerende ^ : celler (figur 2). Størstedelen deraf vil kun indeholde et enkelt rekom-25 binations-DNA-molekyle. Kun meget få af disse rekombinations-DNA-mole-kyler er relaterede til HuIFN-/J. Følgelig må klonerne screenes for at adskille de HuIFN-Ø-relaterede kloner fra de andre kloner.

Screening for en klon indeholdende HuIFN-fl-cDNA 30 Der findes forskellige fremgangsmåder til screening for bakterielle kloner indeholdende HuIFN-j3-cDNA. Disse indbefatter fx. RNA udvælgelses-hybridisering (Alwins, et al., infra), differentiel hybridisering (T.P.St. John og R.W. Davis, "Isolation Of Galactose-Inducible DNA sequences From Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaque Filter 35 Hybridization”, Cell, 16, pp. 443-452 (1979)); hybridisering med en syntetisk prøve (B. Noyes, et al., "Detection And Partial Sequence Analysis Of Gastrin mRNA By Using An Oligodeoxynucleotide Probe", Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 76, pp. 1770-74 (1979)) eller screening for kloner, der producerer det ønskede protein gennem immunologiske (L.

26 DK 170476 B1

Villa-Komaroff, et al., "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pp. 3727-31 (1978)) eller biologiske (A.C.Y. Chang, et al., "Phenotypic Expression In E. coli Of A DNA Sequence Coding For House Dihydrofolate Reductase", Nature, 275, pp.

5 617-24 (1978)) analyser. Der er her valgt RNA-udvælgelses-hybridisering som den mest praktiske og lovende metode til primær screening.

A. RNA-udvælqelses-hvbridiserinasanalvse 1. Oversigt over den indledende analyse 10 Idet der nu henvises til figur 2, isoleredes rekombinations-DNA-molekylerne fra individuelle kulturer af ca. 46 carbenici11 in-føl somme og tetracycli n-resi stente kloner fra den ovenfor nævnte klon-samling (to blandinger af 2 kloner vist i figur 2) (trin A). Rekombinations-DNA-molekylerne spaltedes og hybridiseredes til total RNA indeholdende 15 HuIFN-/J-mRNA fremstillet som før (trin B). Alle rekombinations-DNA-mole-kyle-totale RNA-hybrider adskiltes fra den non-hybridiserede totale RNA (trin C). Den hybridiserede totale RNA blev udvundet fra hybriderne og renset (trin D). Den udvundne RNA analyseredes for HuIFN-/?-mRNA-aktivi-tet som ovenfor (trin E). Hvis og kun hvis blandingen af rekombinations-20 DNA-molekyler indeholder et rekombinations-DNA-molekyle med en indført nukleotid-sekvens, der er i stand til at hybridisere til HuIFN-Ø-mRNA'en i den totale RNA under strenge hybridiseringsbetingelser, vil den fra dette hybrid frigjorte mRNA forårsage dannelsen af HuIFN-0 i oocyter, fordi mRNA, som er frigjort fra et hvilket som helst andet rekombina-25 tions-DNA-molekyle-total RNA-hybrid, ikke vil være IFN-jS-relateret. Hvis en gruppe på 46 kloner gav en positiv respons, omgrupperedes klonerne i 6 undergrupper (4 undergrupper på 8 og 2 undergrupper på 7) og hver undergruppe analyseredes som før. Denne proces fortsattes indtil en enkelt klon, der reagerede på denne analyse, var identificeret.

30 Der er ingen sikkerhed for, at de således identificerede rekom-binations-DNA-molekyler og de dermed transformerede bakterielle kulturer indeholder den komplette IFN-/i-cDNA-sekvens eller ikke engang, at DNA-sekvensen virkelig koder for IFN-/} eller vil tillade klonen at udtrykke polypeptider, som udviser en immunologisk eller biologisk 35 aktivitet svarende til IFN-/3. Rekombinations-RNA-molekylerne vil imidlertid under alle omstændigheder indeholder omfattende nukleotid-sekvenser, der er komplementære til IFN-Ø-mRNA kodnings-sekvensen.

Derfor kan rekombinations-DNA-molekylet i det mindste anvendes som prøve-kilde til hurtig screening af andre rekombinations-DNA-molekyler 27 DK 170476 B1 og dermed transformerede kloner for at identificere yderligere klon-sæt, som muligvis indeholder en autentisk eller komplet IFN-0 nukleotid kodnings-sekvens. Disse kloner kan så analyseres for mulig ekspression af polypeptider, som udviser en biologisk eller immunologisk aktivitet 5 svarende til IFN-Ø, og nukleotid-sekvensen af det indførte DNA-fragment af disse hybride pi asmider og dets aminosyre oversætte!ses-produkt kan bestemmes og muligvis korreleres til aminosyre-sammensætningen og den indledende sekvens, der rapporteres for autentisk IFN-/3 (supra).

10 2. Udførelse af den indledende analyse

Trin A Fremstilling af rekombinations-DNA-molekvlblandinaen Kopier af en mikrotiterplade indeholdende 96 kloner fra den ovenfor nævnte klon-samling fremstilledes på LB-agarplader, hvoraf den ene indeholdt 10 Mg/ml tetracyclin og den anden var suppleret med 100 /zg/ml 15 carbenicillin. På denne måde udtoges to sæt på ca. 45-46 tetracyclin-resistente og carbenici11 i n-føl somme kloner og kultiveredes hver for sig •natten over ved 37°C i 100 ml LB-medium, der indeholdt 10 øg/ml tetracyclin. Disse kulturer samledes i en pool, centrifugeredes i en Sorvall GS-3 rotor ved 8000 opm i 10 minutter, vaskedes to gange med TES-puffer 20 (50 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM NaCl) og resuspenderedes i 40 ml TES per liter oprindeligt dyrkningsvolumen. Cellerne lyseredes med lysozym-Triton X-100 (M. Kahn, et al., "Plasmid Cloning Vehicles Derived From Plasmids Col El, F, R6K And RK2" i Methods In Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu, ed.) (1980) (under tryk)). 40 ml af de TES-25 suspenderede celler kombineredes med 20 ml 10% saccharose i 50 mM Tris-HCl (pH 8) og lysozym til 1,3 mg/ml og fik lov til at stå ved stuetemperatur i 20 minutter. Til denne suspension sattes 1 ml 0,5 M EDTA-NaOH (pH 8), 8 ml 0,2% Triton X-100, 25 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8) og lysis tilendebragtes ved stuetemperatur i 30 minutter. Cellerester og 30 det meste af den kromosomale DNA fjernedes ved pelletering i en Beckman SW27 rotor ved 24.000 opm i 45 minutter. Supernatanten isafkøl edes, kombineredes med 1/3 vol. 40% polyethylenglycol 6000-2 M NaCl og fik lov til at stå natten over ved 0°C. Det resulterende bundfald opsamledes i en Sorvall HB4 rotor ved 5000 opm i 10 minutter ved 4°C og opløstes i 35 TES-puffer. Opløsningen med 0,2 vol. 10 mg/ml ethidiumbromid (Serva) og CsCl til 1 g/ml centrifugeredes i en Beckman R60 Ti-rotor ved 40.000 opm i mindst 48 timer, idet ét polyallorner-rør sædvanligvis er tilstrækkeligt for lysatet fra 1-2 liter oprindeligt dyrkningsvol umen. Under UV-belysning kunne der ses to DNA-bånd i røret. Båndet med den højeste 28 DK 170476 B1 tæthed svarer til plasmid form I DNA, det andet bånd svarer til form II og form III plasmid DNA'er og lidt kromosomal DNA. Det første bånd opsamledes fra røret, ethidiumbromid fjernedes ved seks isoamylalkohol-ekstraktioner og den vandige fase fortyndedes med 3 yol. vand suppleret 5 med indtil 0,2 M natriumacetat (pH 5,1) før DNA-udfældning med 2,5 vol. ethanol. DNA'en genopløstes, ekstraheredes med phenol og udfældedes igen med ethanol. DNA-kval iteten kontrolleredes ved elektroforese på en 1% agarose-gel i 40 mM Tris-HOAc (pH 7,8), 20 mM natriumacetat og 2 mM EDTA efterfulgt af ethidiumbromid-pletning. Hvis DNA7en var forurenet med for 10 meget RNA, blev den yderligere renset ved neutral saccharose-gradient centrifugering: 300 /tg DNA i 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) og 1 mM EDTA fyldtes på en 36 ml 5-20% saccharose-gradient i 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA og 1 M NaCl, centrifugeredes i polyallorner-rør i 16 timer ved 24.000 opm i en Beckman SW27 rotor ved 18°C og de DNA-holdige fraktioner 15 (0^260^ sam^edes i en P°°l °9 udfældedes med natriumacetat-ethanol.

Trin B Hvbridiserina af DNA'en med total RNA

De således fremstillede ca. 150 øg DNA kombineredes med lidt ens-32 artet mærket P-markør DNA og 2 /tg pSTNV-l-DNA (et rekombinations-20 plasmid indeholdende en cDNA-kopi af satellit-tobak-nekrose-virus i fuld størrelse ("STNV")-RNA; J. Van Emmelo, et al., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Full-Size DNA Copy Of Satellite Tobacco Necrosis Virus RNA", J. Mol. Biol., (under tryk) som intern kontrol, klippedes ved lydbehandling i en MSE-sonikator og 25 udfældedes med natriumacetat-ethanol.

En diazobenzyloxymethyl-(DBM)-cellulose fast matrix (Cf., J.C.

Alwine, et al., "Method For Detection Of Specific RNAs In Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl Paper And Hybridizing With DNA Probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 5350-54 (1977)) frem-30 stilledes ifølge metoden beskrevet af J.C. Alwine, et al., "Detection Of Specific RNAs Or Specific Fragments Of DNA Fractionation In Gels And Transfer To Diazobenzyloxymethyl Paper", Methods-Enzymology, 68:

Recombinant DNA (R. Wu, ed.) (1980). For en papirmatrix udblødtes et ark Whatman 540 papir ensartet i en opløsning indeholdende 2-3 mg l-(m-35 nitrobenzyloxy)methyl-pyridiniumchlorid (NBPC/BDH og 0,7 ml natrium- ft - f acetattrihydrat i 28,5 /il vand per cnr, inkuberedes ved 60 C til tørhed og i yderligere 10 minutter og bagtes ved 130-135°C i 30-40 minutter.

Efter flere vaskninger med vand (ca. 20 minutter), 3 vaskninger med acetone (ca. 20 minutter) og tørring blev det opbevaret. Papiret inku- 29 DK 170476 B1 beredes ved 60°C i 30 minutter i 0,4 ml 20% natriumdi thionit-vand per cm under lejlighedsvis omrystning. Papiret vaskedes igen 4 gange med vand, én gang med 30% eddikesyre i 5 minutter og 4 gange med vand, overførtes til 0,3 ml per cm2 iskoldt 1,2 M HC1, hvortil der var sat 10 5 mg/ml frisk NaNOg umiddelbart før anvendelse i 30 minutter ved 0°C, og vaskedes to gange hurtigt med iskoldt vand og én gang med 80% dimethyl -sul foxid (spektrophotometrisk sortering, Merck)-20% 25 mM natrium-phosphat (pH 6,0). For en pulvermatrix fulgtes grundlæggende samme fremgangsmåde under anvendelse af mikrogranulært cellulosepul ver (Whatman 10 CC31), idet mængderne udtryktes i forhold til den tilsvarende vægt af cellulosematricen.

Indledningsvis anvendtes der en pulvermatrix, fordi bindingsevnen var højere, således at der kunne anvendes relativt mindre volumener for hybridisering, vaskninger og eluering. Følgelig anvendtes der en papir-15 matrix for individuel klon-screening. Anvendelse af papir tillader effektiv eluering med vand, hvilket viste sig at være bedre for den „ senere analyse af IFN-Ø-mRNA.

Den ovenfor fremstillede DNA opløstes i 25 mM natriumphosphat (pH

6,0), opvarmedes i 1 minut, afkøledes og der tilsattes 4 vol. DMSO.

20 Kobling til matricen (50 mg pulver) eller en papirskive (10 mm diameter) foregik sædvanligvis i løbet af en weekend ved 4°C under fortsat blanding. DNA-volurnenet holdtes temmelig lavt for at tillade tæt kontakt med matricen og dermed at forøge effektiv kobling af DNA'en til matricen.

Efter kobling vaskedes matricen 4 gange med vand og 4 gange med 0,4 N 25 NaOH ved 37°C i 10 minutter hver, igen 4 gange med vand ved stuetemperatur og endelig to gange med hybridi seringspuffer (50% formamid (deioni-seret, Baker), 40 mM piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsyre) (pH 6,4) ("PIPES", Sigma), 1 mM EDTA, 0,6 M NaCl og 0,1% SDS ved 4°C. Koblings- 32 effektiviteten måltes ved P-radioaktivitet.

30 20 øg total RNA fremstillet som ovenfor og 50 ng STNV-RNA opløstes i 250 øl (50 øl for papirmatrice) hybridiseringspuffer og sattes til den DNA-koblede matrix. Matricen opvarmedes til 70°C i 2 minutter og holdtes ved 37°C natten over under forsigtig blanding.

35 Trin C Adskillelse af hvbridiseret total RNA-DNA fra_

non-hvbridiseret total RNA

Efter centrifugering af pulvermatricen fjernedes de uhybridi serede RNA7er og matricen vaskedes syv gange med ialt 2 ml 50% formamid, 10 mM PIPES (pH 6,4), 1 mM EDTA, 0,3 M NaCl og 0,1% SDS, idet det lavere salt- 30 DK 170476 B1 indhold af disse vaskninger destabiliserede non-specifik RNA-DNA binding. Hver vaskning efterfulgtes af centrifugering og resuspendering af matrixen i pufferen. Til efterfølgende analyse samledes den første vaskning i en pool med den uhybridiserede RNA ("fraktion 1") og vaskninger 5 2-4 ("fraktion 2") og vaskninger 5-7 ("fraktion 3") samledes i en pool.

Ved hybridisering er til en papirmatrix benyttedes en lignende fremgangsmåde med undtagelse af, at det totale vaskningsvolumen var begrænset til 1 ml.

10 Trin D Rensning af hvbridiseret total RNA

Den hybridi serede totale RNA-DNA elueredes fra en pulvermatrix med 3 elueringer af ialt 900 μ\ 99% formamid, 0,2% SDS ved 70°C i 2 minutter og isafkøl edes. Den totale hybridi seringsproces og eluering med formamid gennemførtes i det væsentlige som beskrevet af A.G. Smith (personlig 15 kommunikation). Den hybridiserede totale RNA-DNA elueredes fra en papirmatrix ved først at vaske den med 100 /il iskoldt vand efterfulgt af to elueringer med vand (ialt 300 /il) ved 80°C i 2 minutter. Disse elueringer og 100 μΐ vaskningen samledes i en pool ("fraktion 4") til efterfølgende analyse.

20 Til halvdelen af hver af de 4 fraktioner sattes 0,1 Mg kalvelever-tRNA eller ri bosomal RNA (fraktioner 1A, 2A, 3A og 4A) og til den anden halvdel sattes 8 Mg eukaryotisk poly(A)-RNA eller ri bosomal RNA (fraktioner IB, 2B, 3B, 4B). Fraktionerne rensedes ved fældning ved tilsætning af 0,5 M NaCl og 2,5 vol. ethanol til fjernelse af spor af formamid 25 og andre urenheder.

Trin E Bestemmelse af IFN-fl-mRNA-aktivitet

Fraktioner 1A, 2A, 3A og 4A oversattes i 24 Ml nuklease-behandlet kanin-retikulocyt-lysat (fremstillet ifølge fremgangsmåden beskrevet af 30 R.B. Pelham og R.J. Jackson, "An Efficient mRNA-Dependent Translation

System For Reticulocyte Lysates", Eur. J. Biochem., 7, pp. 247-56 (1976)) ved fremgangsmåden beskrevet af B. LeBleu, et al., "Translation

Of Mouse Interferon mRNA In Xenopus Laevis Oocytes And In Rabbit

Reticulocyte Lysates", Biochem. Biophys. Res. Commun., 82, pp. 665-673 35 35 (1978) med undtagelse af, at der i nærværelse af S-methionin (0,5 mCi/ml, Amersham) tilsattes 250 mM spermidin-HCl, 1 mM fruktose-1,6-diphosphat. Efter inkubering kombineredes 25 μ\ af det ovenfor beskrevne retikulocytlysat med 1 μ! 10% deoxycholat-10% Triton X100 og 2 Ml anti-serum-PBS (1:9) og opvarmedes til 37°C i l time. 20 μ! Staphylococcus 31 DK 170476 B1 aureus Cowan I (frisk vasket, S.W. Kessler, et al., "Rapid Isolation Of Antigens From Cells With A Staphylococcal Protein A-Antibody Adsorbent: Parameters Of The Interaction Of Antibody-Antigen Complexes With Protein A", J. Immunology, 115, pp. 1617-1624 (1975)) i 10% 100 mM NaCI, 10 mM 5 Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 0,05% NP40 tilsattes og blandingen holdtes på 20°C i 30 minutter og centrifugeredes i en Eppendorf 5412 centrifuge i 2 minutter. Pillen vaskedes og centrifugeredes to gange med PBS og den sidste pille opløstes i prøvepuffer og elektroforeseredes på en 13% polyacrylamidgel som beskrevet af U.K. Laemmli, et al., "Cleavage Of 10 Structural Proteins During The Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4", Nature, 227, pp. 680-85 (1970), og autoradiograferedes. Sammenligning mellem STNV-RNA oversættelsesprodukterne i fraktion 1A og 4A antyder effektiviteten af hybridisering og RNA-degradering ved fremgangsmåden.

15 Fraktion IB, 2B, 3B og 4B opløstes i 2 μΐ vand og analyseredes i oocyter for IFN-ØmRNA indhold som ovenfor beskrevet.

* 3. Efterfølgende analyse - hybridisering til nitrocellulosesark

Nogle efterfølgende analyser af individuelle kloner gennemførtes på 20 nitrocelluloseark (M. Cochet, et al., "Cloning Of An Almost Full-Length Chicken Conalbumin Double-Stranded cDNA", Nucleic Acids Research, 6, pp. 2435-2452 (1979)). DNA'en opløstes i 2 M NaCI og 0,2 M NaOH, opvarmedes til 100°C i 1 minut, afkøledes og plettedes på detergent-frie Millipore-fi 1 tre (porestørrelse 0,45 um; 8 mm diameter). Filtrene bagtes i 2 timer 25 ved 80°C, vaskedes i 0,3 M NaCI, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH

7.5) og tørredes ved stuetemperatur. RNA'en hybridiseredes i 3 timer ved 47°C i 30% formamid, 0,5 M NaCI, 0,4% SDS, 2 mM EDTA, 50 mM PIPES (pH

7.5) . Hybridisering afsluttedes ved fortynding med 10 vol. 0,1 M NaCI og filtrene vaskedes flere gange i 15 ml 0,3 M NaCI, 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 30 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) under rystning ved 45°C og flere gange i den samme opløsning uden SDS ved 4°C. Eluering af den hybridiserede RNA-DNA gennemførtes i 30 μΐ 5 mM kaliumchlorid ved 100°C i 1 minut.

4. Resultater af RNA-udvælqelses-hvbridiserinasanalvsen 35 16 grupper på ca. 46 kloner screenedes (grupper A-P). I seks af grupperne indeholdt fraktion IB den eneste IFN-/JmRNA aktivitet, i 8 af grupperne opdagedes ingen IFN-/imRNA og i to grupper (grupper C og 0) iagttoges IFN-Ø-mRNA i fraktion 4B. Gruppe C og O analyserne er rapporteret i følgende format: logaritme af IFN-j8-enheder (kalibreret i 32 DK 170476 B1 forhold til referencestandard 69/19) påvist i analysen af fraktion IB (non-hybridiseret) og i analyserne af fraktion 4B (hybridi seret). Påvisningsgrænsen var 0,1.

5 Gruppe Fraktion IB Fraktion 4B

C 1,0 0 0,5 0,5 0 0,2 0 0 0 10 0,2 0,5

Gruppe 0 underopdeltes i 6 undergrupper (undergrupper Oj til 0g; fire ud af otte kloner og to ud af syv kloner) og hybridiseredes og analyseredes som før, med undtagelse af, at der anvendtes en 400 ml kultur 15 per klon. Undergrupperne gav følgende resultater, angivet i samme format som ovenfor. Hybridisering gennemførtes på DMB-cellulosepul ver, undtagen når andet er anført.

33 DK 170476 B1

Undergruppe Fraktion IB Fraktion 4B

Oj O 1,2 O 1,5 O 0,5 5 O 0,5 0,2 0,5 . * O 1,2

02 0,7 O

03 0,7 O

10 0,5 O

04 O O

05 0,5 O

Og O o

Undergruppe Oj underopdeltes i dens individuelle kloner (kaldet 15 kloner Oj^ - Oj^g) og hybridi seredes og analyseredes som før med undtagelse af, at der anvendtes en 700 ml kultur per klon. Hybridi seringen • gennemførtes på DBM-cellul osepul ver, undtagen når andet er anført.

20 * DBM cellulosepapirmetode ét» 34 DK 170476 B1

Klon Fraktion IB Fraktion 4B

Ojyj 0,2 0 0,7 0 5 0,7 0* ** 1.0 o °l/2 J·* °.

0,2 0 ** 0,7 0 10 01/3 1,2 0 1.0 0,2 1,2 1,0(?)* ** 1,2 0 °l/4 0 15 1,2 0 * 1,0 0 ** 1,2 0 °l/5 0,7 0 * 0,7 *0,2 20 1,0 0 °l/6 °’7 0 * 1,0 <0,2 ** 0,5 0 °l/7 0,5 °* 25 1,2 0 <0,2 0,5^ °l/8 0 1,?* <0,2 1,2 ** 0 0,7 30 0 1,0 * DBM cellulosepapimetode ** Nitrocelluloseark 35 Derfor indeholder klon O^g et rekombinations-DNA-molekyle, der er i stand til at hybridisere IFN-jsmRNA fra total RNA indeholdende IFN-ØmRNA.

Non-specifik RNA-DNA binding er højst usandsynlig, fordi en sammenligning af fraktion 1A og 4A i det væsentlige ikke afslørede en non- 35 DK 170476 B1 specifik binding af STNV-DNA i de samme forsøg, fx. som kontrolleret ved 35 oversættelse i et kanin-retikulocyt-lysat i nærværelse af S-methionin efterfulgt af gel-elektroforese som ovenfor beskrevet. Klon Oj^g kaldtes E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIFl ("G-HB101-pHFIFl"), dens rekombina-5 tions-DNA-molekyle Gp(BR322 (Pst)/HFIF1 ("pHFIFl”) og dens hybride indføring "pHFIFl-fragment". Denne nomenklatur antyder, at klonen og rekombinations-DNA-molekylet stammede fra Gent ("G") og omfatter plasmid pBR322, som i Pstl-positionen indeholder HuIFN-/i-cDNA ("HFIF"),idet det bestemte molekyler er det først lokaliserede ("1").

10

Identificering af kloner indeholdende rekombinations-DNA-molekvler. som krvds-hvbridiserer til dHFIFI

Den ovenfor isolerede pHFIFl anvendtes til screening af den tidligere fremstillede klon-samling for bakterielle kloner indeholdende 15 rekombinations-DNA-molekyler med relaterede hybride DNA-indføringer ved kolonihybridisering (M. Grunstein og D.S. Hogness, "A Method For The ..Isolation Of Cloned DNA's That Contain A Specific Gene", Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 72, pp. 3961-3965 (1975)). Denne metode tillader hurtig identificering af relaterede kloner ved hybridisering af en radioaktiv 20 prøve fremstillet fra pHFIFl til DNA'en af lyserede bakterielle kolonier, der er fastgjort i nitrocellulosefil tre.

Klon-samlingen, der som ovenfor beskrevet var opbevaret i mikro-titer-plader, kopieredes på nitrocelluloseark af lignende størrelse (0,45 /mi pqrediameter, Schleicher og Schuel eller Millipore), som 25 tidligere var blevet kogt til fjernelse af detergent, og arkene anbragtes på tetracyclinholdige (10 øg/ml) LB-agarplader. Bakterielle kolonier dyrkedes natten over ved 37°C. Lysis og fiksering af bakterierne på nitrocellulosearkene fandt sted ved efter hinanden følgende vaskninger i 0,5 N NaOH (to gange i 7 minutter), 1 M Tris-HCl (pH 7,5) 30 (7 min.), 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl (7 min.), 2 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat (pH 7,2) (7 min.)). Efter grundig skylning med ethanol og lufttørring bagtes arkene ved 80°C i 2 timer i vakuum og opbevaredes ved stuetemperatur.

Et Hinf I restriktionsfragment, der er specifik for pHFIFl-35 fragmentet (infra), tjente som prøve for kolonihybridisering (beskrevet infra). Dette fragment (-170 basepar) rensedes ved elektroforese af Hinf fordøjelsesprodukterne af pHFIFl i en 6% polyacrylamidgel.

Efter pletning af DNA-båndene med ethidiumbromid elueredes det speci-fikke fragment, elektroforeseredes på ny og P-mærkedes ved "nick 36 DK 170476 B1 oversættelse" (P.W.J. Rigby et al., "Labeling Deoxyribonucleic Acid To

High Specific Activity In Vitro By Nick Translation With DNA Polymerase

I", J. Mol. Biol., 113, pp. 237-251 (1977)) ved inkubation i 50 μΐ 50 mM

Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 20 mM 0-mercaptoethanol, indeholdende 5 hhv. 2,5 μΐ dCTP, dTTP og dGTP ved 400 μΜ, 100 p-mol a-ATP (Amersham, 2000 Ci/mmol) og 2,5 enheder DNA-polymerase I (Boehringer) ved 14°C i 45 minutter. De uomsatte deoxynukleosid-triphosphater fjernedes ved gel- 32 filtrering over Sephadex G-50 i TE-puffer. Den højt P-mærkede DNA fældedes med 0,1 vol. af 2 M natriumacetat (pH 5,1) og 2,5 vol. ethanol 10 ved 20°C.

Hybridisering af den ovenfor nævnte prøve til den filter-imprægnerede DNA gennemførtes i det væsentlige som beskrevet af D. Hanaban og M. Meselson (personlig kommunikation): De ovenfor fremstillede filtre præ-inkuberedes i 2 timer ved 68°C i 0,1% Ficoll, 0,1% polyvinylpyrro-15 lidon, 0,1% okseserumalbumin, 0,15 M NaCl, 0,03 M Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA og skylledes med 0,02% Ficoll, 0,02% polyvinylpyrrol idon, 0,02% okseserumalbumin, 0,75 M NaCl, 0,15 M Tris-HCl (pH 8), 5 mM EDTA og 0,5% SDS. Hybridiseringen fandt sted natten over ved 68°C i en opløsning, der var identisk med den ovenfor anførte skylleopløsning under anvendelse af 20 den ^P-mærkede prøve, som var blevet denatureret ved 100 C i 5 minutter før anvendelse. De hybridiserede filtre vaskedes to gange med 0,3 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl (pH 8), 2 mM EDTA i 2 timer ved 68°C før lufttørring og autoradiografi.

Der screenedes ca. 1350 kloner, som stammede fra de 800-900 DNA-25 størrelsesklasser. Tretten kolonier, indbefattende pHFIFl, gav et positivt resultat. Disse kloner kaldtes G-HB101-pHFIFl til 13 og deres rekombinations-DNA-molekyler kaldtes pHFIFl til 13. Én af disse kloner, pHFIF2, hybridi seredes med poly(A)-mRNA indeholdende IFN-/J-mRNA og analyseredes under anvendelse af DBM-cellulosepapir (supra). Fordi den 30 totale IFN-RNA-aktivitet blev påvist i den hybridiserede fraktion og den uhybridiserede RNA ikke indeholdt nogen påviselig aktivitet, er det klart, at kloner, som blev identificeret ved kolonihybridisering til en del af pHFIFl-fragmentet, også hybridiserede til IFN-Ø-mRNA.

Det er selvfølgelig klart, at denne metode til klon-screening under 35 anvendelse af HuIFN-j3-DNA-indføringen af pHFIFl eller en anden DNA-ind-føring af en klon, der blev identificeret ved hjælp af DNA-indføringen af pHFIFl som beskrevet ovenfor, ligeså godt kan anvendes på andre kloner, der indeholder DNA-sekvenser stammende fra rekombinations-DNA-teknologi, syntese, naturlige kilder eller en kombination af disse eller 37 DK 170476 B1 kloner indeholdende DNA-sekvenser, der ved mutation er beslægtede med en hvilken som helst af de ovenfor nævnte DNA-sekvenser, indbefattende enkelte eller multiple basesubstituenter, indføjninger, inversioner eller udslettelser.

5 karakterisering af de IFN-fl-relaterede rekombinationsplasmider

De tretten kloner (pHFIFl-13), som påvistes ved kolonihybridise-ring, karakteriseredes yderligere. Der fremstilledes et fysisk kort af disse kloners indføringer og orienteringen af disse indføringer i de 10 forskellige kloner bestemtes.

Plasmidernes fysiske kort fremstilledes ved fordøjelse med forskellige restriktionsenzymer (New England Biolabs) i 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgClg og 7 mM /J-mercaptoethanol ved 37°C ved hjælp af velkendte fremgangsmåder. Fordøjelsesprodukterne elektroforeseredes i 15 2,2% agarose- eller 6% polyacrylamidgel i 40 mM Tris-HOAc (pH 7,8), 20 mM EDTA, analyseredes efter synliggørelse ved pletning med ethidium-bromid og sammenlignedes med det detaljerede fysiske kort af pBR322 (J.G. Sutcliffe, supra). Restriktionskort af de forskellige plasmider fremstilledes på basis af disse fordøjelsesmønstre. Disse blev forbedret 20 ved sekventering af DNA-indføringerne i forskellige plasmider, i alt væsentligt ved fremgangsmåden beskrevet af A.M. Maxam og W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 560-564 (1977).

Plasmid DNA fremstilledes fra forskellige pHFIFl-13 ifølge opfin-25 del sen ved den af Kahn et al. (supra) beskrevne metode, som tidligere blev anvendt heri for at isolere DNA'en fra klonsættene for screening.

Den isolerede form I DNA rensedes ved neutral saccharosegradient centrifugering som før og begrænsedes med forskellige restriktions-enzymer, i det væsentlige som anbefalet af leverandøren (New England Biolabs).

30 Begrænset DNA dephosphorylari seredes i 30 minutter ved 65°C i nærværelse af 4 enheder bakteriel alkalisk phosphatase og 0,1% SDS. Efter to phenol ekstraktioner og ethanol bundfældning mærkedes DNA'en ved 5'-32 enderne med γ- P-ATP (-3000 Ci/mmol) og polynukleotid kinase (P-L Biochemical s,. Inc.).

.35 Til sekventering behandledes mærkede fragmenter på to måder. Nogle rensedes på en polyacrylamidgel før spaltning med et andet restriktionsenzym. Andre spaltedes med det samme med et andet restriktionsenzym. I begge tilfælde adskiltes de ønskede fragmenter på en polyacrylamidgel i Tris-borat-EDTA-puffer. Figur 7 viser de forskellige restriktionsfrag DK 170476 Bl 38 menter (cirklerne viser mærket og pilen viser sekventeringsretningen) og den benyttede sekventeringsstrategi under anvendelse af pHFIFl, pHFIF3, pHFIF6 og pHFIF7.

Fragmenterne degraderedes ifølge fremgangsmåden af A.M. Maxam og W.

5 Gilbert (supra). Produkterne fraktioneredes på polyacrylamidgel er med forskellige koncentrationer og længder i 50 mM Tris-borat, 1 mM EDTA (pH 8,3) ved 900 V til 2000 V.

Hver strækning cDNA-indføring sekventeredes fra begge strenge og hver restriktionsposition, der tjente som mærket ende, sekventeredes 10 under anvendelse af et fragment, der spandt det. Den komposite nukleo-tidsekvens, der således opnåedes for kodningsstrengen af IFN-Ø-DNA eller -gen og dens tilsvarende aminosyresekvens er vist i figur 4. Fordi ingen af pi asmiderne pHFIFl-13 indeholdt det komplette gen for HuIFN-jS, er figur 4 resultatet af en kombination af data fra mindst to sådanne 15 plasmider. I denne henseende viser figur 5 slægtskabet mellem indføringer pHFIFl, pHFIF3, pHFIF6 og pHFIF7, idet de sorte pile eller vinkler viser orienteringen af de forskellige indføringsdele.

Idet der nu henvises til figur 4, flankeres den heteropolymere del af indføringen ved den ene ende af et segment, der er rigt på Tér, og af 20 en kæde af A'er (der sandsynligvis afspejler polyA-enden af mRNA'en).

For reference er indføringen nummereret fra det første nukleotid af komposit-indføringen til et nukleotid helt ind iden uoversatte del af indføringen. En ATG-begynde!sestripiet ved position 65-67 og en TGA-sluttriplet ved position 626-628 definerer en læserubrik, der ikke er 25 afbrudt af nonsens-kodoner. Enhver anden translatabel sekvens, dvs. i forskellige læserubrikker, der er flankeret af en ATG eller en GTG og et slutsignal, er for kort til at kode for et polypeptid af den forventede størrelse af IFN-/J. Derfor indbefatter området mellem nukleotider 65 og 625 højst sandsynligt nukleotidsekvensen for den komposite DNA-sekvens, 30 som koder for IFN-j8 ifølge opfindelsen.

Denne sekvens udelukker ikke muligheden af, at forandringeri genet såsom mutationer, inklusive enkelte eller multiple basesubstitueringer, udsletninger, indføjninger eller inversioner ikke allerede er optrådt i genet eller ikke kan anvendes sidenhen for at modificere dets egenskaber 35 eller egenskaberne af polypeptiderne, der er oversat derfra. Den udelukker heller ikke polymorfi, som kunne resultere i gener eller polypeptid-er, der er fysiologisk lignende, men strukturelt let forskellige fra dem, der er rapporteret i figur 4 (supra, p. 3). Fx. har en anden klon, der er identificeret ifølge opfindelsen, et "T" i stedet for et "C" ved 39 DK 170476 B1 nukleotidsekvensens nukleotid 90, der koder for IFN-/J. Denne forandring af det tredje nukleotid af kodonen ændrer ikke den derfra kodede aminosyre. Aminosyresekvensen, for hvilken der kodes af DNA-sekvensen i figur 4, er identisk med den af Taniguchi et al., supra, rapporterede amino-5 syresekvens.

Det bør selvfølgelig forstås, at den med almindelige fremgangsmåder fra polyA-RNA klonede cDNA (A. Efstratiadis et al., supra) kan mangle 5'-terminale nukleotider og endda kan indeholde artifaktsekvenser (R.I. Richards et al., "Molecular Cloning And Sequence Analysis Of Adult 10 Chicken jS-Globin cDNA", Nucleic Acids Research, 7, pp. 1137-46 (1979)). Derfor er det ikke sikkert, at den ved nukleotider 65-67 tilstedeværende ATG virkelig er den første ATG af autentisk IFN-/J kodningssekvens. Til • brug i den følgende beskrivelse antages det imidlertid, at ATG'en ved nukleotider 65-67 er den første ATG af autentisk IFN-j3-mRNA.

15 Ved sammenligning af det polypeptid, for hvilket der kodes ved dette indføringsområde, med denne sekvens på 13 amino-terminale amino-.syrer af autentisk humant fibroblast-interferon -- MetSerTyr AsnLeuLeu GlyPheLeuGlnArgSerSer -- bestemt af Knight et al. (supra), ser det"ud til, at den valgte læserubrik er korrekt og at nukleotider 65-127 kan 20 kode for et signalpeptid, som går forud for nukleotidsekvensen, der koder for det "modne" polypeptid.

Ydermere er i eukaryotiske mRNAér den første AUG-triplet fra 5'-enden normalt begyndelsespositionen for proteinsyntese (M. Kozak, "How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions In Messenger RNA?", 25 Cell, 15, pp. 1109-25 (1978)). Her er kodonen i komposi tfragmentet, der svarer til den første aminosyre af fibroblast-interferon, 22 kodoner fra den første ATG. Dette lader igen formode, at DNA-sekvensen, der koder for fibroblast-interferon, kan blive forudgået af en sekvens, der bestemmer et signal-polypeptid på 21 aminosyrer. Den formodede signal -30 sekvens indeholder en række hydrofobe aminosyrer. En sådan akkumulation af hydrofobe rester er selvfølgelig karakteristisk for signalsekvenser (jvf. B.D. Davis og P.C. Tai, "The Mechanism Of Protein Secretion Across Membranes", Nature, 283, pp. 433-38 (1980)).

Nukleotidsekvensen, der tilsyneladende svarer til "moden" HuIFN-0 35 omfatter 498 nukleotider, som koder for 166 aminosyrer. Under antagelse af, at ingen carboxyterminal bearbejdning finder sted, er molekylvægten af interferon-peptidet 20085. Base-sammensætningen af kodnings-sekvensen er 45% G+C. Kodon-anvendel sen inden for interferon-kodningssekvenserne er i rimelig overensstemmelse med den, der er fundet for pattedyr- 40 DK 170476 B1 mRNA'er i almindelighed (R. Grantham et al., "Coding Catalog Usage And The Genome Hypothesis", Nucleic Acids Research, 8, pp. 49-62 (1980)).

Eventuelle afvigelser herfra må tilskrives det lille antal, der er ' involveret.

5 Strukturen af det i figur 4 viste polypeptid for komposit-fragmen tet tager selvfølgelig ikke hensyn til ændringer i polypeptidet, som er forårsaget af dets interaktion med in vivo enzymer, fx. giykosyl ering.

Derfor bør det forstås, at den i figur 4 viste aminosyresekvens muligvis ikke er identisk med HuIFN-Ø, der er fremstillet in vivo.

10 Sammenligningen af de første 13 aminosyrer af autentisk fibroblast-interferon (Knight et al., supra) med den fra komposit-genet i figur 4 udledte sekvens viser ingen forskelle. Aminosyresammensætningerne, der på den ene side bestemmes direkte for autentisk fibroblast-interferon og på den anden side udledes fra sekvensen af komposit-genet ifølge opfin-15 delsen, viser også væsentlige overensstemmelser. Figur 6 viser en sammenligning af disse sammensætninger.

Selvom ingen af de oprindeligt ifølge opfindelsen fremstillede rekombinations -DNA-molekyl er indeholder den komplette DNA-sekvens for fibroblast-interferon, udgør de en nyttig prøve til screening af DNA-20 sekvens-samlinger for sekvenser, som er relaterede til HuIFN-/l. Endvidere falder en kombination af indføringsdele af disse rekombinations-DNA-molekyler til opnåelse af den komplette IFN-/3 kodningssekvens, som vist herefter, inden for fagmandens område. Fx. kan det under henvisning til figur 5 og figur 8 let ses, at Pstl-BglIl-fragmentet af pHFIF6 kan 25 forbindes med Pstl-Haell-fragmentet af pHFIF7 eller at EcoRI-PstI-fragmentet af pHFIF6 kan forbindes med PstI-HaelI-fragmentet af pHFIF7 eller at Bglll-Pstl-fragmentet af pHFIF6 kan forbindes med Pstl-BglII-fragmentet af klon 7 til dannelse af en komposit-HuIFN-Ø-kodningssekvens. Forbindelsen af disse fragmenter kan selvfølgelig gennemføres før eller 30 efter indføring af det klonede fragment i et ønsket plasmid.

Fremstilling af pi asmider indeholdende den komplette DNA-sekvens. der koder for HuIFN-θ for at udtrykke Dolvoeptider. der udviser HuIFN-θ-aktivitet

35 Bakteriofag λ indeholder to stærke promotorer, PL og PR, hvis aktivitet er under kontrol af et repressor-protein, produktet af faggenet cl. I nærværelse af repressor er transskription fra disse promotorer fuldt ud undertrykt. Fjernelse af repressor åbner op for stærk transskription fra PL og PR (for reference se H. Szybalski og W. Szybalski "A

41 DK 170476 B1

Comprehensive Molecular Map Of Bacteriophage λ", Gene, 7, 217-270 (1979)).

Der fremstilledes derivater af multi kopi-pi asmidet pBR322 (F.

Bolivar et al. "Construction And Characterization Of New Cloning 5 Vehicles. II. A Multiple Cloning System", Gene, 2, 95-113 (1977)) for at inkorporere P^-promotoren.

A. Struktur af Diasmider indeholdende P^-promotoren Plasmid pPLa2311 10 Plasmid pPLa2311 (vist i figur 8) består af tre HaelI-fragmenter.

Det største fragment, ca. 1940 base-par, indeholder PL0L-området fra bakteriofag λ og /Maktamase-genområdet fra pBR322 (J. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence Of The Escherichia coli Plasmid pBR322",

Cold Spring Harbor Symposium, 49, 77-90, (1978)). I umiddelbar nærhed af 15 dette fragment befinder sig et 370-basepar HaelI-fragment opnået fra plasmid Col Ej. Replikationsoprindelsen spænder over forbindelsen mellem -disse to fragmenter (A. Oka et al. "Nucleotide Sequence Of Small ColΕ^ Derivatives. Structure of The Regions Essential For Autonomous Replication And Colicin Ej Immunity", Mol. Gen. Genet., 172, 151-159 (1979)).

20 Det tredje HaelI-fragment, ca. 1600 basepar i længde, koder for resi-

P

stens over for kanamycin. Dette fragment opnåedes oprindeligt fra plasmid pCRj (C. Covey et al., "A Method For The Detection Of Restriction Sites In Bacterial Plasmid DNA", Mol. Gen. Genet., 145, 155-158 (1976)). Transskriptionsretningen fra P^-promotoren forløber på samme vis som β-25 laktamase-genet. Plasmid pPLa2311 giver resistens over for 100 /jg/ml carbenicillin og 50 /zg/ml kanamycin.

Plasmid G-pPLa8

Plasmid G-pPLa8 (vist i figur 9) opnåedes fra pPLa2311 ved at om-30 danne Pstl-positionen i ^-laktamase-genet til en BamHI-position. Dette gennemførtes ved Sj-nukleasebehandling af Pstl-åbnet pPLa2311 efterfulgt af stump-endet afsnøring til et BamHI-forbindel sesfragment (opnået fra Collaborative Research Inc., Waltham, Mass.) og recirkulering af molekylet efter BamHI-spaltning. Plasmid pPLa8 specificerer ikke 35 længere for resistens over for carbenicillin, men giver stadig resistens over for kanamycin.

Plasmid G-dPLc24

Plasmid G-pPLc24 (vist i figur 10) indeholder ^-laktamase-genet og 42 DK 170476 B1 replikationsoprindelsen fra pBR322. Et 290-basepar Haell-EcoRI-fragment indeholder P^-området fra bakteriofag λ. Transskriptionsretningen fra P^-promotoren er mod EcoRI-positionen. Et 431-basepar EcoRI-BamHI-fragment koder for ribosom-forbindelsespositionen og de første 98 amino-5 syrerester af bakteriofag-MS2-replikasegenet, der er opnået fra plasmid pMS2-7 (R. Devos et al., "Construction And Characterization Of A Plasmid Containing A Nearly Fullsize DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA", «3. Mol. Biol., 128, 595-619 (1979)). Oversættelse af MS2-replikase-proteinfragmentet forløber kolineær med transskriptionen fra P^-pro-motoren.

10 B. Temperaturafhænaia igangsættelse af P^-oromotoraktivitet

Transskription fra P^-promotoren — der er til stede på pi asmider pPLa2311, pPLa8 og pPLc24 -- undertrykkes ved at holde pi asmiderne i en E. coli stamme, som syntetiserer repressor-proteinet. P.g.a. dens 15 selvregulerende syntesemåde (M. Ptashne et al. "Autoregulation And Function Of A Repressor In Bacteriophage λ", Science, 194, 156-161 (1976)) er en kopi af cl-genet på kromosomet af en lysogen stamme i stand til fuldt ud at undertrykke P^-promotoren, der er til stede på et multi kopi-plasmid.

20 De ved den foreliggende opfindelse anvendte stammer var E. coli Κ12ΔΗΙ (K12 M72 lac^ AtrpEA2 SmR (AcI857 Nam7Nam53AHI bio); U. Bernard et al. "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote Gene Expression From The Bacteriophage λ P^ Promoter”, Gene, 5, 59-76 (1979)) og E. coli M5219 (K12 M72 1acamtrparnSmR (AcI857 ΔΗΙ 25 bio252); H. Greer, "The kil Gene Of Bacteriophage λ", Virology, 66, 589-604 (1975)). Begge stammer indeholder et defekt, ikke-udskærbart λ-profag, som bærer et muteret cl-gen. Det muterede gen koder for en temperaturfølsom repressor og tillader herigennem igangsættelse af transskription fra P^-promotoren ved temperaturændring -- ved 28°C er 30 repressoren aktiv og undertrykker transskription fra P^-promotoren, men ved 42°C er repressoren inaktiveret og transskription fra P^-promotoren påbegyndes.

ΔΗΙ-sletningen af profaget fjerner en del af cro-genet og alle andre gener til højre for cro (M. Castellazzi et al. "Isolation And 35 Characterization Of Deletions In Bacteriophage λ Residing As Prophage I E. coli K12", Mol. Gen. Genet., 117, 211-218 (1972)). Sletningen af cro-genet er fordelagtig, fordi akkumulering af cro-proteinet vides at undertrykke transskription fra P^-promotoren (A. Johnson et al., "Mechanism Of Action Of The cro Protein Of Bacteriophage λ", Proc.

43 DK 170476 B1

Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 1783-1787 (1978)). Stamme M5219 indeholder endvidere bio252-sletningen, som fjerner alle gener til venstre for cl II, indbefattende kil.

Ved temperaturinduktion udtrykker stamme M5219 et funktionelt N-5 gen-produkt. På den anden side har stamme Κ12ΔΗΙ to ambi-mutationer i N, som gør den funktionelt N-negativ. Produktet af N-genet vides at fungere som en anti-terminator i bakteriofag A37 (J. W. Roberts, "Transcription Termination And Late Control In Phage λ", Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A., 72, 3300-3304 (1975)). Anti-terminationsvirkningen 10 iagttoges ligeledes ved terminatorsekvenser, der ikke er naturligt til stede på fag λ DNA (fx. det naturlige stop ved enden af trp-operonen), under forudsætning af, at RNA-transskriptet begynder ved P^-promotoren. Desuden udløstes under virkningen af N-gen-proteinet polaritetseffekter, som blev forårsaget ved nærværelse af en nonsens-kodon i P^-transskrip-15 tet (for reference se N.Franklin og C. Yanofsky, "The N Protein Of λ: Evidence bearing On Transcription Termination, Polarity And The Alteration Of E. col i RNA Polymerase" in RNA Polymerase (Cold Spring Harbor Laboratory, 1976), pp. 693-706).

Derfor kan aktiviteten af PL-promotor, når man har de ovenfor 20 nævnte pi asmider i en termo-inducerbar bakteriel cl-baggrund, påbegyndes og afbrydes eksperimentelt. Valget af Κ12ΔΗΙ eller M5219 tillader også transskription at fortsætte enten i fravær eller nærværelse af N-genproduktet. Som beskrevet ovenfor, kunne det sidstnævnte være fordelagtigt i tilfælde, hvor der skal transskriberes DNA-områder, som inde-25 holder transskriptions-terminator-lignende sekvenser eller slow-down sekvenser for RNA-polymerasen.

C. Konstruktion af kloner, som har en DNA-sekvens. som koder for HuIFN- B. der er indført i et plasmid indeholdende P^-promotoren 30 I den følgende beskrivelse gennemførtes isolering af plasmid DNA, restriktionsanalyse af DNA og afsnøring af DNA-fragmenter som beskrevet ovenfor til kloning af dobbeltstrenget DNA. Transformeringstrinnet var også som beskrevet ovenfor, med undtagelse af, at når stammerne Κ12ΔΗΙ • eller M5219 anvendtes som værter, gennemførtes varmechocket ved 34°C i 5 35 minutter og de transformerede celler inkuberedes ved 28°C.

1. Konstruktion af olasmid G-pPLa-HFIF-67-1

Den logiske begrundelse for denne konstruktion var iagttagelsen af, at kombination af passende restriktionsfragmenter fra kloner 44 DK 170476 B1 G-pBR322(Pst)/HFIF-6 og G-pBR322(Fst)/HFIF-7 tillader rekonstruktionen af en komplet, fortløbende kodningssekvens af IFN-Ø. Strømmen af de opnåede fragmenter gennem de forskellige konstruktionstrin er vist skematisk i figur 8. Plasmid G-pBR322(Pst)/ HFIF-6 spaltedes med EcoRI og 5 PstI og snøredes til plasmid G-pBR322(Pst)/HFIF-7, som var blevet spal tet med PstI og HaelI. Efter afsnøring fordøjedes blandingen med EcoRI og Haell. Et firedobbelt molært overskud af denne blanding snøredes dernæst til plasmid G-pPLa2311, som var blevet fordøjet med HaelI og EcoRI. Transformanter opnåedes i stamme C600r^mK+(X) (som anvendtes p.g.a.

10 dens relativt høje transformeringsevne og fordi den indeholder en vild type cl gen) ved udvælgelse for kanamycinresistens. Ud af 15 screenede transformanter havde to tabt resistens over for carbenicillin. Restriktionsanalyse af den fra plasmiderne af disse transformanter isolerede DNA afslørede, at én havde den ønskede struktur af G-pPLa-HFIF-67-1, der 15 er vist i figur 8. Dette plasmid indeholdt en enkelt EcoRI-position og en enkelt Pstl-position. Kombineret EcoRI-Pstl-fordøjelse producerede to fragmenter -- hvoraf det mindre fragment bevægede sig sammen med et fragment opnået efter EcoRI-Pstl-spaltning af G-pBR322(Pst)/HFIF-6.

BG1II-fordøjelse afspaltede et lille fragment på ca. 650 basepar. Stør-20 reisen på det sidstnævnte fragment stemmer overens med den forventede størrelse efter forbindelse af det proximale BglII-PstI-fragment af klon G-pBR322(Pst)/ HFIF-6 til den distale Pstl-BGlIl-del af G-pBR322 (Pst)/HFIF-7. HincII-fordøjelse frembragte tre fragmen-ter som forventet p.g.a. tilstedeværelsen af HincII-positionerne i P^-området, den amino-25 terminale del af Ø-laktamase-genet og den uoversatte 5'-ende af DNA-sekvensen af HuIFN-Ø. Dette plasmid kaldtes G-pPLa-HFIF-67-1.

På grundlag af den ovenfor nævnte karakterisering ved restriktionsenzymanalyse skulle plasmid G-pPLa-HFIF-67-1 indeholde den komplette kodningssekvens for HuIFN-/J. Retningen af den ønskede transskription 30 forløber kolineær med retningen af P^-promotoren. Mellem P^- og HuIFN-Ø-kodningssekvensgenet bibeholder plasmidet stadig poly(A.T)-halen og et omvendt 3'-ende-fragment som i G-pBR322 (Pst)/HFIF-6.

2. Konstruktion af olasmid G-pPLa-HFIF-67-12 35 Det næste konstruktionstrin stilede mod fjernelse af poly(A.T)-halen og del af det omvendte 3'-ende-fragment (se figur 9) fra G-pPLa-HFIF-67-1. G-pPLa-HFIF-67-l-DNA spaltedes med BglII og HPall. Da HuIFN-/) kodningssekvensen ikke indeholder nogen HPall-position resulterer denne behandling i, at BglII-fragmentet indeholder hele kodningssekvensen for 45 DK 170476 B1 IFN-/J og samtidig inaktiverer den resterende del af vektoren. Det resulterende B61II-fragment snøredes til plasmid G-pPLa8, som var blevet fordøjet med Baml. Enzymerne Bglll og BamHI laver identiske forskudte ender, således at BglIl-ender kan snøres til en åbnet BamHI-position og 5 omvendt. En sådan rekonstrueret position er ikke længere et substrat for BglII eller BamHI, men genkendes af enzymet Sau3AI (Mbol) (V. Pirotta, "Two Restriction Endonucleases From Bacillus globigii", Nucleic Acids Res., 3, 1747-1760 (1976)). Efter afsnøring spaltedes blandingen igen med BamHI for at eliminere G-pPLa8-molekyler, som kun havde recirku-10 leret. Transformanter opnåedes igen i C600rKmK+(A), der udvælger for kanamyci n-resi stens.

Transformanterne screenedes ved størrelsesbestemmelse af uspaltet • DNA på agarosegel som beskrevet ovenfor til karakterisering af de IFN-/3-relaterede rekombinationspi asmider. Kloner, som viste sig at være lidt 15 større end den parentale G-pPLa8, underkastedes yderligere restriktionsanalyse med enten PstI eller Hindi. Der fandtes én klon, som indeholdt -en enkelt Pstl-position og tre HinclI-positi oner. 'Et fragment af denne klon komigrerede med et HincII-fragment fra pPLa8 opnået fra P^- til β-laktamase-området. Et andet lille fragment af klonen målte ca. 400 20 basepar - i overensstemmelse med indføring af BglII-fragmentet i G-pPLa8 i den sande orientering med hensyn til P^-promotoren. Dette plasmid kaldtes G-pPLa-HFIF-67-12. De til konstruktionen af dette plasmid anvendte trin er vist skematisk i figur 9. Et mere detaljeret kort af dette plasmid er vist i figur 11. Størrelsen af plasmidet (-4450 base-25 par) bedømtes ved størrelsen af dets fragmenter, som igen var blevet bedømt ved deres relative bevægelighed ved elektroforese i agarosegel.

E. coli Κ12ΔΗΙ og M5219 transformeredes dernæst med det karakteriserede plasmid G-pPLa-HFIF-67-12.

Undersøgelse af de bestemte nukleotidsekvenser omkring Bglll/BamHI-30 forbindelsen i G-pPLa-HFIF-67-12 afslørede et interessant træk. Polypep-tidet, som igangsættes ved AUG af /J-laktamase-kodningssekvensen af dette plasmid, slutter ved en dobbelt ambi-kodon, som befinder sig inden for den uoversatte.5'-ende af HuIFN-/} kodningssekvensen. Disse slutkodoner befinder sig 23 nukleotider før den igangsættende AUG af HuIFN-Ø 35 signalpeptidet, fx.:

Forbindelse 181* BamHI/BgIII

CCC.CGG.AUC.UUC.AGU.UUC.GGA.GGC.AAC.CUU.UCG.AAG.CCU.

Pro -Arg-Ile- Phe- Ser- Phe-Gly- Gly- Asn- Leu- Ser- Lys- Pro- 46 DK 170476 B1 UUG.CUC.UGG.CAC.AAC.AGG.UAG.UAG GCGACACUGUUCGUGUUGUCAAC Leu- Leu- Trp- His- Asn- Arg am am AUG-(HuIFN-/l signal peptid-kodningssekvens)-AUG-(moden HuIFN-/? 5 kodningssekvens).

Indramningen henviser til antallet af aminosyrerester i /1-1 akta- * maseproteinet af pBR322 (J. Sutcliffe, supra). Stjernen ( ) antyder, at CCU-kodonen, der er til stede ved denne position på pBR322 var 10 ændret til CCC som en konsekvens af omdannelsen af Pstl-positionen i pPLa2311 til en BamHI-position i pPLa8 (se ovenfor).

Derfor åbner denne konstruktion muligheden for ny igangsæt-• telse ved AUG af HuIFN-/? signalpeptidet og derfor muligvis ekspressionen af IFN-/J, der er fusioneret til dens signalpeptid, men ikke 15 fusioneret til en del af /Maktamase. En sådan intern ny igangsættelse efter for tidlig afslutning er blevet iagttaget i repressorgenet af E. coli laktose-operonen (T. Platt et al. "Translational Restarts: AUG Reinitiation Of A lac Repressor Fragment", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 897-901 (1972)). Denne konstruktion muliggør eventuelt 20 udsondringen af moden IFN-ø ved korrekt bakteriel genkendelse af HuIFN-/3 signal sekvensen.

3. Konstruktion af plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A19

Fra den kendte sekvens af pBR322 og HuIFN-/J kodningssekvensen kan 25 det afledes, at sletning af det lille hincll-fragment fra G-pPLa-HFIF-67-12 (fra indenfor /J-laktamase indtil 3 nukleotider foran AUG, som igangsætter HuIFN-/J signalpeptidet) resulterer i en fortløbende translationel læserubrik, der begynder ved AUG af /3-laktamase og slutter efter HuIFN-/i kodningssekvensen. Denne konstruktion forudsiges derfor at kode 30 for et polypeptid bestående af 82 aminosyrerester fra Ø-laktamase kodningssekvensen, en aminosyre kodet i den fusionerede HincII-position, HuIFN-0 signalpeptidet og moden HuIFN-ø, dvs: 82 35 GUU.AAC.AUG-(HuIFN-j3 signalpeptid kodningssekvens)-AUG-Val -Asn- Met (moden HuIFN-j3 kodningssekvens)

Indramningen henviser til antallet af aminosyrerester i /J-lakta- 47 DK 170476 B1 maseproteinet af pBR322 (J. Sutcliffe, supra). Derfor kan denne konstruktion udtrykke et fusioneret polypeptid bestående af en β-1aktamasedel, der er fusioneret gennem én aminosyre til HuIFN-/J signalpeptidet, som selv er fusioneret til moden HuIFN-/i. Et sådant 5 fusionsprotein kan udsondres fra cellen.

G-pPLa-HFIF-67-12 blev delvist fordøjet med Hindi. Efter afsnøring ved en DNA-koncentration på ca. 0,01 øg/ml spaltedes DNA'en med Xorll, en isoschizomer af Pvul, dér producerer 3'-udragende ender (R. Wang et al., Biochim. Biophys. Acta, under tryk) og relegeredes ved lav DNA-10 koncentration. Parental G-pPLa-HFIF-67-128 indeholder to Xorll-positioner: én position inaktiverer kanamycin-genet og den anden befinder sig i HineII-fragmentet, som skal slettes fra plasmidet.

Formålet med Xorll-fordøjelses-relegeringstrinnet er eliminering af parentale DNA-molekyler, der ikke er spaltet af HindI-enzymet. Sådanne 15 molekyler har to Xorll-positioner og under afsnøringsbetingelser er det højst usandsynligt, at to fragmenter igen bliver forbundet. Transfor-.„manter opnåedes i C600r^’m^+(X), der udvælger for kanamycin, og screenedes ved restriktionsanalyse for tilstedeværelsen af en enkelt -Pvul-position. Yderligere analyse af klonerne gennemførtes under 20 anvendelse af HincII-fordøjelse. 'En klon, der manglede det mindste HincII-fragment, men ellers var identisk med G-pPLa-HFIF-67-12, kaldtes G-pPLa-HFIF-67-12Å19. De til konstruktion af dette plasmid anvendte trin er vist skematisk i figur 9. Et mere detaljeret kort af'dette plasmid er .vist i figur 12. Størrelsen af plasmidet (-4050 basepar) 25 bedømtes ved at sammenlægge størrelsen af dets del fragmenter, som igen var blevet bedømt ved deres relative bevægelighed ved elektroforese i agarosegeler. E. coli Κ12ΔΗΙ og M5219 transformeredes dernæst med det karakteriserede plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A19.

30 4. Konstruktion af plasmid G-dPLc-HFIF-67-8

Plasmid G-pPLc24 byder på en anden mulighed for indføring af HuIFN-Ø-sekvenser på en sådan måde, at et andet fusionspolypeptid potentielt kan syntetiseres. Indføring af BglII-fragmentet fra G-pPLa-HFIF-67-1 i BamHI-positionen af G-pPLc24 resulterer i en fortiøb-35 ende læserubrik, der koder for 98 aminosyrerester fra MS2 replikasegenet (W. Fiers et al. "Complete Nucleotide Sequence Of Bacteriophage MS2 RNA: Primary And Secondary Structure Of The Replicase Gene", Nature, 260, 500-507 (1976)), 27 aminosyrer kodet ved sekvenser mellem BglII-posi-tionen og den igangsættende AUG af signal sekvensen af HuIFN-j3, efter- 48 DK 170476 B1 fulgt af HuIFN-0 signal pepti det og moden HuIFN-/J, dvs: 98 UGG.GAU.CUU.CAG.UUU.CGG.AGG.CAA.CCU.UUC.GAA.GCC.UUU.GCU.

5 Trp- Asp- Leu-Gln- Phe- Arg- Arg-Gln- Pro- Phe- GIu- Ala- Phe- Ala- CUG. GCA.CAA.CAG.GUA.GUA.GGC.GAC.ACU.GUU.CGU.GUU.GUC. AAC.

Leu- Ala- Gin- Gin- Val- Val- Gly- Asp-Thr- Val- Arg- Val- Val- Asn-AUG-(HuIFN-jS signal peptid kodningssekvens)-AUG-(moden HuIFN-^8 10 Met kodningssekvens)

Indramningen henviser til antallet af aminosyrerester i MS2 re-plikase-genproteinet (R. Devos et al., supra; W. Fiers et al., supra). Derfor kan denne konstruktion udtrykke et fusioneret polypeptid be-15 stående af en del af MS2 replikase fusioneret gennem 27 aminosyrer til HuIFN-jS signalpeptidet, som selv er fusioneret til moden HuIFN-jS.

G-pPLa-HFIFr67-l-DNA fordøjedes med Bglll og snøredes med BamHI-spaltet pPLc24-DNA. Afsnøringsblandingen blev skåret igen med BamHI for at eliminere parentale pPLc24-molekyler, og transformeret i 20 C600r^(A), der udvælger for carbenicillinresistens. Transformanter analyseredes ved restriktion med Hindi. Af de kendte stillinger af restriktions-positioner på pPLc24 kan det forudsiges, at indføring af Bglll-IFN-Ø-fragmentet i den sande orientering med hensyn til PL skulle producere et ekstra HincII-fragment med ca. 650 basepar. En repræsen-25 tativ klon, som udviste denne konfiguration, kaldtes pPLc-HFIF-67-8. Dé til konstruktion af dette plasmid anvendte trin er vist skematisk i figur 10. Et mere detaljeret kort af dette plasmid er vist i figur 13. Plasmidstørrelsen (-3850 basepar) bedømtes ved at sammelægge størrelsen af dettes fragmenter, som igen var blevet bedømt ved deres relative 30 bevægelighed ved elektroforese i agarosegeler. E. coli Κ12ΔΗΙ og M5219 transformeredes med det karakteriserede plasmid G-pPLc-HFIF-67-8.

5. Konstruktion af plasmid G-pPla-HFIF-67-12A279T

Plasmid pKT279 (en gave fra K. Talmadge; pKT279 er et derivat af 35 pBR322, hvor en del af genet for Ø-laktamase er slettet og som har en Pstl-position konstrueret ved aminosyre 2 af /J-laktamase) fordøjedes med PstI, den 3'-terminale forlængelse fjernedes og fragmentet gjordes stump-endet ved behandling med E. coli DNA-polymerase I (Klenow-frag-ment) under tilstedeværelsen af deoxy-nukleosid-triphosphater. Det PstI- 49 DK 170476 B1 1 ineariserede og 3'-stump-endede DNA-fragment af pKT279 fordøjedes dernæst med EcoRI til fremstilling af et fragment, der inter alia koder for signal sekvensen af ^Maktamase og de første 4 aminosyrer af det modne protein.

5 Dette lille fragment anvendtes dernæst til erstatning af Hpal-

EcoRI-fragmentet af pPLa-HFIF-67-12A19 (Hpal-positionen fremkommer som konsekvens af den ovenfor beskrevne sletning fra G-pPLa-HFIF-67-12) ved afsnøring af den Hpal-EcoRI-begrænsede pPLa-HFIF-67-12A19 med dette fragment i nærværelse af T4 DNA ligase.

10 Den forudsagte sekvens ved PstI (stump-endet)-Hpal-forbindelsen er: (Ø-laktamase signalpeptid kodningssekvens)-CAC.CGC.AAC.

His- Arg- Asn- AUG-(HuIFN-)8 signalpeptid kodningssekvens}-AUG-(moden HuIFN-/? 15 Met kodningssekvens).

Følgelig resulterer konstruktionen i IFN-/J, som er forudgåejt af to signal sekvenser i tandem -- en bakteriel signalsekvens (/Makta-mase) og IFN-/3-signal sekvensen -- forbundet af flere aminosyrer.

20 Derfor kan denne konstruktion udtrykke moden HuIFN-/?, som er fusioneret til to signal peptider eller konstruktionen kan, hvis tandem-kombinationen af en bakteriel signalsekvens og HuIFN-Ø's signalsekvens genkendes af bakterien og spaltes korrekt, udtrykke moden HuIFN-j8 og 4 dens udsondring fra cellen.

25 E. coli M5219 transformeredes med pPLa-HFIF-67-12A279T.

6. Konstruktion af plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A218Ml

Plasmid pKT218 (en gave fra K. Talmadge; pKT218 er et derivat fra pBR322, hvor en del af genet for /Maktamse og dets signal sekvens er 30 slettet og som har en Pstl-position konstrueret ved aminosyre 4 af signal sekvensen af /Maktamase) fordøjedes med EcoRI og Alul til fremstilling af et fragment, der inter alia koder for begyndelsesdelen af /Maktamase signalpeptidet. Dette fragment afsnøredes i nærværelse af T4 DNA ligase med et fragment fremstillet fra pPLa-HFIF-67-12A19 ved 35 Alul-fordøjelse i nærværelse af actinomycin D (0,05 mM) (for at indskrænke plasmidet ved Alul-positionen i IFN-/J signalpeptidet) og restriktion med EcoRI.

Det resulterende plasmid, kaldet pPLa-HFIF-67-12A218Ml, indeholdt begyndelsesdelen af genet, der koder for /Maktamase signal peptidet, en 50 DK 170476 B1 del af genet, der koder HuIFN-/) signalpeptidet og genet, der koder for moden HuIFN-/8. Den forudsagte sekvens af relevante områder af plasmidet er: 5 4 CAA.GCU.CUU.UCC.AUG-(moden HuIFN-/) kodningssekvens)

Gin- Ala- Leu- Ser- Met-

Indramningen henviser til antallet af aminosyrerester i /Maktamase 10 signalpeptidet af pKT218. Derfor kan denne konstruktion tillade ekspressionen af moden HuIFN-j8, der er fusioneret til en del af en bakteriel signalsekvens og en del af dens egen signal sekvens. Igen kunne moden HuIFN-jS, hvis den bakterielle vært genkender og korrekt spalter hybridsignal sekvensen, udtrykkes fra dette plasmid og udsondres fra cellen.

15 E. coli M5219 transformeredes med pPLa-HFIF-67-12A218Ml.

7. konstruktion af plasmid G-pPLa-HFIF-67-12AHl

Plasmid pPLa-HFIF-67-12A19 lineariseredes som før med Alul i nærværelse af actinomycin D (0,05 mM) for at frembringe et snit ved 20 Alul-positionen i signalpeptidet af HuIFN-/). Efter fordøjelse med Hpal recirkuleredes DNA'en i nærværelse af T4 DNA ligase. Det resulterende plasmid, kaldet pPLa-HFIF-67-12AMl, havde kun en lille del af IFN-/J signal sekvensen, der forudgik DNA-sekvensen, der koder for moden IFN-j3.

Den forudsagte forbindelsessekvens er: 25 82 GUI). CUC. UUU. CCA. UGA.

Val- Leu- Phe- Pro- STOP

A UG-(moden HuIFN-Ø kodningssekvens) 30

Den lodrette indramning henviser til antallet af aminosyrerester i Ø-laktamase. Den vandrette indramning henviser til sekvensen i en anden læserubrik. Derfor bliver oversættelsen af Ø-laktamase kodningssekvensen og den resterende del af kodningssekvensen for signalpeptidet 35 af IFN-0 bremset ved UGA-stop-kodonen. Start-kodonen (AUG) for moden IFN-0 er imidlertid til stede ved samme sted, omend i en anden læserubrik. Derfor kan ny igangsættelse af oversættelsen til fremstilling af moden HuIFN-/S finde sted ved dette punkt.

E. coli M5219 transformeredes med pPLa-HFIF-67-12AMl.

DK 170476 B1 si 8. Konstruktion af plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2

Plasmid pPLa-HFIF-67-12A19 lineariseredes med Hpal og behandledes med exonuklease BAL 31 til sekventiel fjernelse af basepar fra enden af det lineariserede DNA-fragment (H. Gray et al., "Extra-5 cellular Nucleases Of Pseudomonas Bal 31" I. Characterization Of Single Strand-Specific Doxyribendonuclease", Nucleic Acids Res., 2, pp. 1459-92 (1975)). Ved at variere tid og betingelse for exonukle-asebehandlingen, konstrueres en række DNA-fragmenter med forskelligt nukleotidantal fra kodningssekvensen for signalpeptidet af 10 HuIFN-/3, hvis et sådant findes, der går forud for AUG start-kodo-nen af moden HuIFN-/l. Disse fragmenter kan så manipuleres til at konstruere ribosomale forbindelsespositioner i forskellige afstande fra start-kodonen for at opnå den ønskede sekundære struktur i nærheden af denne kodon for at forstærke ekspression af moden HuIFN-Ø.

15 De exonuklease-behandlede fragmenter gjordes stump-endede med E. coli DNA-polymerase I (Klenow-fragment) i nærværelse af dATP og dGTP for at udfylde eventuelt tilstedeværende 5'-udragende ender. Dernæst afsnøredes en dobbeltstrenget Xhol-forbindelse med sekvensen 5'-CCTCGAGG-37 (Collaborative Research) på de stump-endede DNA-fragmenter.

20 Disse fragmenter udvidedes dernæst med en dobbeltstrenget EcoRI-forbindelse med sekvensen 5'-CCGAATTCGG-3' (Collaborative Research). Efter EcoRI-fordøjelse recirkuleredes fragmenterne med "klæbrige" EcoRI-ender med E. coli DNA-ligase. Anvendelsen af denne ligase i stedet for T4 DNA-ligase forhindrer recirkuleringen af stump-endede fragmenter.

25 Ét plasmid blev udvalgt og kaldt pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2. Det har en Xhol-position ca. 25 basepar foran AUG-start-kodonen af moden HuIFN-β. Xhol-positionen forudgås også af en EcoRI-position, der er dannet ved afsnøring af EcoRI-forbindel sen af Hpal-fragmentet til EcoRI-positionen, der går umiddelbart forud for P^-promotoren i pPLa-HFIF-67-12A19. Der-30 for er /3-laktamase kodningssekvensen blevet slettet. Endvidere er kun ekspression af moden HuIFN-j3 mulig, fordi i det mindste en del af HuIFN-β signalsekvensen er blevet fjernet.

E. coli K12AHI transformeredes med pPLa-HFIF-67-12Δ19 BX-2.

35 Isolering og karakterisering af bakteriefremstillet HuIFN-θ A. Fremstilling af bakterielle ekstrakter 1. Induktionsmetode

En portion fra lager-kul turer (frosset ved -80°C i 50% glycerol-50% LB-medium), indbefattende lager-kulturer af stamme Κ12ΔΗΙ og 52 DK 170476 B1 M5219 transformeret med pi asmiderne, som indeholder de ovenfor beskrevne I FN-/?-f ragmenter, podedes i friskt LB-medium med det ønskede antibiotikum og dyrkedes til mætning ved 28°C. To 500 ml portioner LB-medium uden antibiotikum podedes hver med 1 ml mættede celler og dyrkedes ved 5 28°C under kraftig omrystning til en celletæthed på 2 x 10 /ml. 'En portion bragtes til 42°C under fortsat omrystning. Afhængig af det anvendte plasmid blev kulturen udvundet på forskellige tidspunkter efter ændringen til 42°C. Kontrol kul turen, som forblev på 28°C, blev udvundet samtidig med 42°C kulturen. Cellerne opsamledes ved centrifugering i 10 GSA-rotoren (Sorvall) ved 8000 opm i 10 minutter. Pillerne vaskedes i 20 ml 50 mM Tris HC1 (pH 7,4), 30 mM NaCl og pelleteredes igen i SS34-rotoren (Sorvall) i 10 minutter ved 10.000 opm. Pillen blev hurtigt ' frosset i tøris-methanol og opbevaret ved -80°C. Når det ønskedes at chokere de udvundne celler osmotisk, blev frysetrinnet udeladt.

15 Der blev anvendt to forskellige metoder til lysis og ekstraktion af bakterierne.

2. Ekstraktionsmetoder

Lvsis A

20 Celler resuspenderedes i et slutvolumen på 4 ml af den ovenfor beskrevne puffer og der tilsattes lysozym (Sigma) til 1 mg/ml. Inkubation gennemførtes i 30 minutter ved 0°C. Suspensionen undergik to fryse-optø-nings-cykler ved sekventiel dypning i en ethanol-COg-blånding (-80°C) og et 37°C vandbad. S-100-fraktionen fremstilledes ved ultracentrifugering 25 af de lyserede bakterier (4 ml) i en Beckman SW60 Ti rotor i 1 time ved 60.000 opm og 4°C, hvorefter supernatanten videreanvendtes.

Lvsis B

Lysis B gennemførtes som beskrevet ovenfor (lysis A) med undtagelse 30 af, at 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)-30 mM NaCl opløsningen erstattedes med 50 mM HEPES (Sigma)-NaOH (pH 7,0), 30 mM NaCl, 3 mM Ø-mercaptoethanol og 3% serum fra nyfødte kalve (Gibco).

Osmotisk chok 35 Umiddelbart efter udvinding og vaskning resuspenderedes celle-pillen i 20% saccharose, 100 mM EDTA, 100 mM Tris HC1 (pH 7,4) ved en maksimal celletæthed på 1 x 10^/ml. Suspensionen holdtes på is i 10 minutter og centrifugeredes dernæst i 10 minutter ved 10.000 opm i Sorvall SS34 rotoren. Saccharoseopløsningen drænedes forsigtigt fra 53 DK 170476 B1 røret og pillen resuspenderedes i samme volumen vand (celletæthed på 1 x 10*°/ml). De resuspenderede celler forblev på is i 10 minutter og underkastedes dernæst igen centrifugering ved 10.000 opm i 10 minutter i SS34 rotoren (Sorvall). Supernatanten gjordes 3% i føtalt kalveserum, 50 mM i 5 HEPES puffer (pH 7), 30 mM i NaCl og 3 mM i Ø-mercaptoethanol. Til denne supernatant henvises der som "osmotisk chok supernatant". Den opbevaredes ved 0°C.

3. Ammoniumsulfat-fældnina 10 1 ml (NH4)2S04-opløsning, mættet ved stuetemperatur, sattes til 0,5 ml kontrol opløsning eller en S-100-ekstrakt. Blandingen holdtes på is i mindst 30 minutter, hvorefter bundfaldet pelleteredes i en Eppendorf centrifuge i 10 minutter ved stuetemperatur. Pillen genopløstes i PBS (phosphat-pufret saltopløsning).

15 B. Interferon-titrerino 1. Direkte antiviral analyse

HuIFN-/3 analyseredes i mikrotiter-bakker (Sterilin) ved hjælp af en CPE (cytopatisk effekt)-inhiberingsteknik i humane fibroblaster triso-20 mi sk for kromosom 21. Cellerne podedes én dag før anvendelse, inkuberedes med serie-fortyndinger (log^ = 0,5) af prøven i 24 timer og blev angrebet med vesikuløs stomatitis virus (Indiana-stamme) 10”3 fortyndin- 6 9 ger af et lager indeholdende 10 muse C-929 plaque-dannende enheder/-ml. CPEén optegnedes 24 timer efter VSV-angreb og interferon-endepunktet 25 defineredes som prøvefortyndingen, der forårsagede 50% reduktion af viral CPE. Alle analyser omfattede en intern standard af HuIFN-j3, som selv blev kalibreret i forhold til den NIH-humane fibroblast-reference G023-902-527.

Celle-linien, der er trisomisk for kromosom 21 (herefter kaldet 30 T2j), opnåedes fra en hudbiopsi af en kvindelig patient med Down's syndrom. Dens karyotyp blev oprettet og viste diploidi for alle kromosomer med undtagelse af kromosom 21 (trisomisk). Denne celle-linies følsomhed over for interferon ser ud til at kunne sammenlignes med følsomheden af celle-linier, der er trisomisk for kromosom 21 som 35 beskrevet af E. De Dlercq et al., "Non-antiviral Activities Of Interferon Are Not Controlled By Chromosome 21", Nature, 256, pp.

132-134 (1975) og E. De Clercq et al., "Chromosome 21 Does Not Code For An Interferon Receptor", Nature, 264, 249-251 (1976).

I andre analyser blev der anvendt celle-linien EjSM (A. Bi 1Ί i au 54 DK 170476 B1 et al., "Human Fibroblast Interferon For Clinical Trials: Production, Partial Purification And Characterization", Anti-microbial Agents And Chemotherapy, 16, 49-55 (1979)). Denne celle-linie er et diploid fibroblast, der er di somi sk for kromosom 21 og blev opnået fra en to måneder 5 gammel human foetus. Sammenlignet med T21 celle-linien, er EjSM mindre følsom over for HuIFN-Ø med en faktor på 10.

2. 2.5-A svntetase-analvse

En anden metode til at påvise nærværelsen af interferon består i 10 anvendelsen af en 2,5-A syntetase-analyse. Det har vist sig, at interferon inducerer dette enzym, som omdanner ATP i trimere (og til en mindre grad dimere, tetramere og multimere) af 2,5-A (A. Kimchi et al., "Kinetics Of The Induction Of Three Translation-Regulatory Enzymes By

Interferon", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 3208-3212 (1979).

2 15 Konfluente 25 cm kolber indeholdende kulturer af EjSM-celler (A. Billiau et al., supra) behandledes i 20 timer med en 1:6 fortynding „af bakterielle ekstrakter eller kontrol-interferon i MEM-10% foetal kalveserum. Kulturerne frigjordes med trypsin (0,25%), EDTA (0,17%) og vaskedes meget grundigt med 140 mM NaCl i 35 mM Tris puffer (pH 7,5).

20 Alle efterfølgende operationer gennemførtes ved 4°C. Celler homogeniseredes i 1,5-2,0 volumen 20 mM HEPES puffer (pH 7,4) indeholdende 10 mM KC1, 1,5 mM magnesiumacetat og 0,5 mM dithiothreitol ("lysis-puffer I") i en Dounce glas-homogenisator. Homogenisatet centrifugeredes i 20 minutter ved 10.000 x g og supernatanten (S10) opbevaredes i flydende 25 nitrogen, når den ikke anvendtes med det samme.

5

Konfluente mi krotiter-plader med 96 fordybninger (10 celler i 0,2 ml per 0,28 cm fordybning) behandledes med interferon eller de pågældende bakterielle ekstrakter som ovenfor. Efter 20 timers behandling isafkøl edes pladerne og vaskedes tre gange med 140 mM NaCl i 35 mM 30 Tris-puffer (pH 7,5). Kulturerne lyseredes dernæst ved at tilsætte hver fordybning 5 /il af en opløsning indeholdende 0,5% Nonidet P40 og 1 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) i lysis-puffer I. Efter kraftig omrystning i 20 minutter på is opsamledes cellelysaterne og centrifugeredes i 20 minutter ved 10.000 x g som ovenfor.

35 3,5 /il lysat, fremstillet som beskrevet ovenfor (lysis A eller lysis B), inkuberedes i 2 timer ved 31°C i 6 μΐ af en inkubationsblanding indeholdende 100 mM kaliumacetat, 25 mM magnesiumacetat, 10 mM HEPES/K0H (pH 7,4), 5 mM ATP, 4 mM fruktose 1,6 bis-phosphat, 1 mM dithiothreitol og 20 μg/m^ poly(I).poly(C) og 2 μΟι lyofiliseret (a- 32 55 DK 170476 B1 P)-ATP (400 Ci/mmol fra The Radiochemical Centre, Amersham, U.K.).

Efter at have tilendebragt omsætningen ved opvarmning til 95°C i 3 minutter og klarering i 2 minutter ved 9.000 x g behandledes prøverne med 150 U/ml alkalisk phosphatase fra kalveindvolde (Boehringer, 5 Mannheim, kat. nr. 405612) i 1 time ved 37°C, klareredes igen og plette-des (1 jul per prøve) på tyndtlags-plader af polyethylenimin-cellul ose (Polygram, cel 300 PEI 20 x 20 cm fra Macherey-Nagel Col, Duren Tyskland). Pladerne vaskedes to gange i 2 1 destilleret vand og tørredes under vakuum før kromatografering i 1 M eddikesyre i 2-3 timer. Efter 10 tørring underkastedes de autoradiografi i 1-24 timer.

C. Påvisning af HuIFN-fl-aktivitet i bakterielle ekstrakter 1. Kontrolforsøg

Der opstod to hovedproblemer ved gennemførelsen af de ovenfor be-15 skrevne analyser. Begge er vigtige ved fortolkningen af analysedata. Bakterielle ekstrakter (indbefattende· kontrol ekstrakter), der resulterer fra lysis ved hjælp af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, ser ud til at indbefatte en non-interferon-relateret faktor, som udviser anti-viral aktivitet i analysen. Det er uklart, om faktoren selv var et anti-viralt 20 middel eller om denne faktor inducerede en anti-viral substans, fx. interferon, under analysebetingelserne. Tilstedeværelsen af faktoren opdagedes gentagne gange i S100 ekstrakter. Aktiviteten af denne faktor var, måske p.g.a. celletæthed, ofte højere i kontrol ekstrakter af E. col i HB101 end i lignende kontrol ekstrakter af Κ12ΔΗΙ eller M5219 25 værtsbakterierne, hvor aktiviteten af denne faktor altid var mindre end . ca. 0,7 logjg/ml. Af en eller anden grund blev den anti-virale aktivitet af denne faktor reduceret eller nogle gange endda elimineret fuldstændigt ved fældning med (NH^SO^ under betingelser, som også fældede interferon i kontrolforsøg.

30 P.g.a. den anti-virale aktivitet, som kan tilskrives denne for

urenende faktor, er det vanskeligt at drage slutninger om tilstedeværelsen af spormængder af interferon i bakterielle ekstrakter. Det var imidlertid muligt at skelne mellem den anti-virale aktivitet af denne faktor og aktiviteten af autentisk interferon under anvendelse af de 35 diploide fibroblaster EjSM. Disse celler er mindre følsomme over for HuIFN-/J end de almindelige celler, der er tri somi ske for kromosom 21. Cellerne er imidlertid meget mere følsomme over for denne faktor end de er over for ægte interferon. Ved anvendelse af fx. pMS2-7 (R. Devos et al., "Construkcti.on And Characterization Of A Plasmid Containing A

56 DK 170476 B1

Nearly Full-size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol., 128, 595-619 (1979)) i E. col i HB101 (H. Boyer og D. Rouland-Dussoix, "A Complementation Analysis Of Restriction And Modification Of DNA In Escherichia coli", J. Mol. Biol., 41, 459-472 (1969)) eller K12AHI-G-5 pPLa2311 som kontrollysater vises data, der demonstrerer denne relative virkning, i den følgende tabel, idet den anti-virale aktivitet måles som log10 enheder/ml.

10 T21 EjSM

HB101-pMS2-7 (lysis A) 0,7 HB101-pMS2-7 (lysis B, men ingen Ø-mercaptoethanol og 15 ingen kalveserum) <0,2 1,2 HB101-pMS2-7 (lysis B) ikke udført 0,7 HB101-pMS2-7 (lysis B) 0,2 1,0 HB101-pMS2-7 (lysis B) 0,7 2,5 K12AHI-G-pPLa2311 (lysis B) 0,2 4,0 20 K12AHI-G-pPLa2311 (42°C, osmotisk chokat) 0,5 >1,7

Ydermere afspejles tilstedeværelsen af autentisk HuIFN-j3 ved et forskelligt værdiforhold på TgjrEjSM og en høj værdi på i sammen-25 ligning med den ved tilstedeværelsen af nævnte faktor forårsagede værdi. Dette er vist af de følgende data: 57 DK 170476 B1

T21 EjSM

osmotisk K12AHI-G-pPLa2311 (42°C) 0,5 2,5 chok Κ12ΔΗΙ-G-pPLa2311 (42°C) 1,5 2,5 5 supernatent + HuIFN-/J (autentisk) lysis B HB101-pMS2-7 0,2 2,5 efter HB101-pMS2-7 + HuIFN-0 2,7 2,5 (NH4)2S04 (autentisk) bundfældning (tilsat før lysis) 10

Derfor tillader en sammenligning af aktiviteterne T2i:EjSM og en måling af den absolutte aktivitet på Tgj-celler anvendelsen af de oven-• for beskrevne anti-virale analyser til entydig påvisning af tilstedeværelsen af HuIFN-yS i et bakterielt ekstrakt. Desuden bør det bemærkes, 15 at en sådan forstyrrelse gennem den ukendte faktor i de anti-virale analyser var mindre alvorlig for ekstrakter af kulturer af E. coli (enten Κ12ΔΗΙ eller M5219), der var transformeret med nogle plasmider ifølge opfindelsen, fx. G-pPla-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12A19, G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67-12A279T, G-pPLa-HFIF-67-12A218MI, G-20 pPLa-HFIF-67-12AMI eller G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2. I disse analyser udviste de ikke-højt koncentrerede ekstrakter (fx. lyseredes og ekstra-

O

heredes celler fra 150-ml kulturer ved 6 x 10 celler/ml i 4 ml) en lav eller uopdaget grad af anti-viral aktivitet, som kan tilskrives den ukendte faktor.

25 Tilstedeværelsen af denne forurenende faktor har også vist sig at kunne påvises i 2,5-A syntetase-aktivitets-analysen. Her kan denne faktor imidlertid elimineres fuldstændigt ved fældning med (NH^SO^. Derfor kan den virkelige tilstedeværelse af HuIFN-jS i et bakterielt ekstrakt til forskel fra tilstedeværelsen af den forurenende faktor også 30 påvises entydigt i denne analyse.

Ekstrakter fra E. coli HB101/G-pBR322(Pst)/HFIF-6, som har en ukomplet kolineær kodningssekvens (kun de sidste få basepar mangler) og derfor ikke er i stand til at udtrykke et modent polypeptid, har imidlertid gentagne gange ydet en positiv 2,5-A syntetase-aktivitet, men 35 hidtil ingen mærkbar anti-viral aktivitet. Dette demonstrerer, at 2,5-A-analysen ikke kan anses for det eneste kriterium for tilstedeværelsen af en komplet bakteriefremstillet interferon. Det demonstrerer også, at mindre end den komplette modne interferon kan have nyttig aktivitet.

32 2,5-A-syntetase-aktivitet måles ved P-inkorporering i 2,5-A-tri- 58 DK 170476 B1 meren som vist ved autoradiografi. Resultater (gentaget 3 gange) er vist i den følgende tabel, idet voksende positive værdier afspejler forøget 32 inkorporering af P.

5 ekstrakt a/pHFIF-6-*+++; efter (NH^SO^ fældning-*++ ekstrakt b/pMS2-7-*+++; efter (NH^SO^ fældning-*· -ekstrakt b/pMS2-7-*+++; efter (NH^SO^ fældning-n-+ plus HuIFN-0 10 Et andet vigtigt problem i disse analyser er den lave genvinding af HuIFN-/?, der udsondres af humane fibroblaster under og efter forskellige eksperimentelle trin. En sammenligning af genvindinger af leukocyt-in-' terferon og fibroblast-interferon sat til et S-100 ekstrakt demonstrerer, at HuIFN-0 kun genvindes med 10% effektivitet i modsætning til 15 HuIFN-a's 100% genvinding (anti-virale værdier er anført som log1Q enheder/ml; analyseret på T21 -celler).

IFN-α fortyndet i S-100-ekstrakt af HB101-pMS2-7 (lysis A) 2,5 IFN-qc fortyndet i E-MEM plus 3% kalveserum 2,7 20 IFN-/? fortyndet i S-100-ekstrakt af HB101-pMS2-7 (lysis A) 0,7 IFN-0 fortyndet i E-MEM-plus 3% kalveserum 1,7

Andre forsøg, hvor IFN-/? sattes til cellepilien før lysis og ekstraktion (endda når der tilsættes kalveserum til 3% som en stabil i-25 sator) viste, at kun 10-30% IFN-/? blev genvundet.

logjQ enheder/ml HEPES T21 EjSM 30 HB101-pMS2-7 (lysis B, men ingen pH 8 0,7 (10%) 1,7 plus IFN-/J /J-mercaptoethanol pH 7 1,0 (20%) 1,7 eller kalveserum) pH 6 0,7 (10%) 1,7 IFN-/? (samme behandling som pH 6 1,7 (50%) 1,5 (ingen bakterier) i lysis B) 35

Yderligere forsøg udførtes for at teste stabiliteten og genvindingen af IFN-/3-aktivitet. Fældning med (NH^SO^ som beskrevet ovenfor, enten i nærværelse eller fravær af bakterielle ekstrakter, forårsagede ofte en reduktion af titeren i den anti-virale analyse: 59 DK 170476 B1 log^Q enheder/ml Fældning med (NH4)2S04 før efter I FN-/? 1,0. 0,5 5 I FN-/? 2,7 2,5 HB101 -pMS2-7 + IFN-jS (lysis B) 1,5 1,2 K12ÅHI-G-pPLa2311 (28°C) + IFN-yS (lysis B) 1,7 1,5 Κ12ΔΗΙ-G-pPLa2311 (28°C) + IFN-jS (lysis B) 2,2 3,0 10 Dialyse af IFN-jS (natten over ved 4°C mod PBS) enten i nærværelse eller fravær af bakterielle ekstrakter resulterede normalt også i en formindsket genvindel se af IFN-/J-aktivitet.

log1Q enheder/ml 15 _

Dialyse før efter I FN-/? i PBS , 1,0 0,5 IFN-/3 i PBS 2,7 2,5 K12ÅHI-G-pPLa8 (28°C) + IFN-£ (lysis B) 1,2 <0,2 20 K12AHI-G-pPLa8 + I FN-/? (lysis B) 3,0 1,7 K12ÅHI-G-pPLa8 + I FN-/? (lysis B) 2,5 1,0 Κ12ΔΗΙ-G-pPLa8 + IFN-0 (lysis B) 1,5 0,5

Da IFN-jS er en type I interferon, burde dens aktivitet være syre-25 stabil. Dette testedes ved at dialysere IFN-/?-prøver i nærværelse eller fravær af bakterielle ekstrakter natten over i 5 mM glycin-HCl (pH 2,2) ved 4°C. Denne behandling forårsagede dannelsen af et bundfald, som pelleteredes i en Eppendorf centrifuge ved 12.000 x g i 2 minutter. Supernatanten testedes dernæst for anti-viral aktivitet. Selvom der til -30 bageblev noget af den anti-virale aktivitet efter denne behandling, skete der et betydeligt tab i mængden af genvundet interferon.

60 DK 170476 B1 log10 enheder/ml

Dialyse før efter HB101 -pMS2-7 (lysis A) + IFN-/J 0,7 0,5 5 K12AHI-G-pPLa2311 (28°C) osmotisk chokat + IFN-Ø 1,2 1,2 M5219-G-pPLa8 (42°C) (lysis B) + IFN-0 1,2 0,7 M5219-G-pPLa8 (28°C) (lysis B) + I FN-/? 3,0 2,0 10 Reduktionen af HuIFN-/5-aktivitet, der iagttoges ved disse forskellige behandlinger af de ovenfor beskrevne kontrol ekstrakter, må fortolkes med forsigtighed. De lavere anti-virale titere betyder ikke nødvendigvis, at interferon bliver omdannet. De lavere titere kan skyldes en ikke-specifik hæftning af HuIFN-j3 til dialysemembraner eller til kompo-15 nenter i de bakterielle ekstrakter, fx. membrankomponenter. Fx. er det velkendt, at I FN-/? er et hydrofobt protein (dets hydrofobi er også -underbygget af dets aminosyresekvens), som på en ikke-specifik måde kan klæbe fast til rørvægge eller andre overflader. Endvidere kan bakteriel IFN-/3, som mangler glycosylering, være endnu mere hydrofobt. Derfor kan 20 slutninger om genvinding af det glycosylerede IFN-/?, som udskilles fra humane celler, ikke nødvendigvis ekstrapoleres til IFN-/J af bakteriel oprindelse.

2. Demonstration af IFN-fl-aktivitet 25 a. Ånti-viral aktivitet

Bakterielle ekstrakter af E. coli M5219 eller Κ12ΔΗΙ, som indeholder pi asmiderne G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPLa-HFIF-67-12A19, G-pPLc-HFIF-67-8, G-pPLa-HFIF-67-12Δ279Τ, G-pPLa-HFIF-67-12A218MI, G-pPLa-HFIF-67-12ΔΜΙ eller G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX analyseredes for IFN-/3 30 anti-viral aktivitet. Fremgangsmåderne for induktion og fremstilling af S-100 ekstrakterne og de osmotiske chok supernatanter er grundlæggende

Q

beskrevet ovenfor. Der anvendtes 150 ml bakterielle kulturer (3-6 x 10 celler/ml) per forsøg. Alle biologiske titere er anført i log1Q enheder/ml.

35 G-pPLa-HFIF-67-12 G-pPLa-HFIF-67-12 anvendtes til transformering af E. coli M5219 og E. coli Κ12ΔΗΙ og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Aller prøver fældedes med (NH^JgSO^ før de testedes for anti-viral aktivitet.

61 DK 170476 B1

T21 E1SM

K12AHI-G-pPLa-HFIF-67-12 (28°C) <0,2 <1,0 K12AHI-G-pPLa-HFIF67-12 (42°C, 5 90 min.) 0,2/0,5 <1,0/<1,0 M5219-G-pPLa-HFIF-67-12 (28°C) <0,2 <1,0 M5219-G-pPLa-HFIF-67-12 (42°C, 90 min.) 0,7/0,7 <1,0/<1,2 10 Det andet tal i den ovenfor anførte tabel er den ved genanalyse af samme prøve bestemte titer. Et kontrolforsøg, hvor autentisk IFN-/3 sattes til E. col i HB101-pMS2-7 før lysis af cellerne, viste en IFN-/3 genvinding på 30% i analysen. Derfor er det indlysende, at IFN-/I anti-viral aktivitet påvises efter induktion i det bakterielle lysat. Titrene 15 viser, selvom de er under påvisningsgrænsen for EjSM-celler, tydeligt, at IFN-^-aktiviteten ikke skyldes en forurenende bakteriel aktivitet. En sådan forurenende bakteriel aktivitet ville give værdier på mindst 2,0 på EjSM for at svare til værdierne på 0,5 eller 0,7 på Tgj-celler (se kontrolforsøg ovenfor).

20 G-pPLa-HFIF-67-12A19

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A19 anvendtes til transformering af E. coli M5219 og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Alle prøver T ' ; fældedes med (NH^gSO^ som beskrevet ovenfor og analyseredes for anti- 25 vira! aktivitet. Igen er tilstedeværelsen af HuIFN-0 anti-viral aktivitet i ekstrakterne indlysende. Værdien i parentes viser påvisningsgrænsen, som skyldes en let toxicitet af de specielle prøver for de humane celler i vævskultur.

30 i) M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (28°C) ii) M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C, 90 min., endelig celletæthed = 3 x 108/ml)

på T21 på EjSM

35 _ _; i) < 0,5 2,2 (< 2,0) ii) 2,2 (< 0,5) 2,2 « 2,0)

Et kontrolforsøg, hvor autentisk IFN-/3 sattes til HB101-pMS2-7 62 DK 170476 B1 før lysis af cellerne, udviste 30% genvinding. Her antyder de høje værdier på Tgj-celler og aktivitetsforholdet på Tgj over det på EjSM, at der ikke fandtes nogen forurenende bakteriel aktivitet af betydning (som anført ovenfor) i de temperatur-inducerede prøver.

5 G-dPLc-HFIF-67-8

Plasmid G-pPLc-HFIF-67-8 anvendtes til transformering af E. coli M5219 og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Alle prøver fældedes med (NH^SO^ og analyseredes for anti-viral aktivitet.

10 i) M5219-G-pPLc-HFIF67-8 (28°C) ii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 min., endelig celletæthed 0 6 x 10®/ml)

på Tgj på EjSM

15 _ _ i) < 0,5 2,2 (< 2,0) ii) 2,2 (< 0,5) 2,2 (< 2,0) Værdien i parentes viser påvisningsgrænsen, der skyldes toxicitet.

20 Et kontrolforsøg, hvor autentisk IFN-0 sattes til HB101-pMS2-7 før lysis af cellerne, udviste en 30%ig genvinding. Igen er det indlysende, at det bakterielle ekstrakt udviste HuIFN-jS anti-viral aktivitet.

I et andet forsøg analyseredes den osmotiske chok supernatant af disse celler for IFN-/3 anti-viral aktivitet: 25 i) kontrol: M5219-G-pPLa-HFIF-67-12ål9 (28°C) i i) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (28°C) iii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 min., celletæthed = 6 x 10®/ml).

30

Analyserne gennemførtes på T21 -celler både før og efter (NH^SO^-fældning. Værdien i parentes viser påvisningsgrænsen.

Før fældning Efter fældning 35 i) < 0,2 <0,2 ii) < 0,2 < 0,2 iii) 1,5 (< 0,2) 0,7 (< 0,2)

Genvindingen af IFN-0 var ca. 10% i kontrolforsøg. Kontrol! y s aterne 63 DK 170476 B1 viste ingen påviselig aktivitet på EjSM. De opnåede værdier med de osmotiske chok supernatanter gør det klart, at det temperatur-inducerede M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 ekstrakt har en anti-viral aktivitet, der ikke er til stede i de non-inducerede prøver. Prøve (iii) dialyseredes til pH 5 2,2 efter fældning med (NH^SO^, der har en titer på 0,7 log1Q enheder per ml, som beskrevet ovenfor og udviste ingen aktivitetsfald af betydning. Denne syrestabilitet er en speciel, egenskab af type I interferoner, fx. IFN-£.

10 G-pPLa-HFIF-67-12A279T

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12Δ279Τ anvendtes til transformering af E. coli M5219 og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Prøver fældedes med (NH^)2S04 før analyse med CPE på Tgj-celler. De ved 42°C inducerede celleekstrakter udviste en anti-viral titer på 1,5-1,7 log10 u/ml 15 ekstrakt.

G-pPLa-HFIF-67-12A218MI

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A218MI anvendtes til transformering af E. coli M5219 og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Prøver 20 fældedes med (NH^SO^ før analyse med CPE på Tgj-celler. De ved 42°C inducerede celleekstrakter udviste en anti-viral titer på 1,5 logjQ u/ml ekstrakt.

G-pPLa-HFIF-67-12AMI

25 Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12AMI anvendtes til transformering af E. coli M5219 og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Prøver fældedes med (NH^JgSO^ før analyse med CPE på Tgj-celler. De ved 42°C inducerede celleekstrakter udviste en anti-viral titer på 2,0 log1Q u/ml ekstrakt.

30 G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2

Plasmid G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2 anvendtes til transformering af E. coli Κ12ΔΗΙ og S-100 ekstrakter fremstilledes ved lysis B. Prøver fældedes med (NH^J^SO^ før analyse med CPE på l^-og FS-4-celler. De ved 35 42°C inducerede celleekstrakter udviste en anti-viral titer på 1,7-2,0 log10 u/ml ekstrakt.

b. Antistof-neutraliserino af HuIFN-8 anti-viral aktivitet

Yderligere bevis, der underbygger bakteriel ekspression af IFN-/J, 64 DK 170476 B1 gives af antistof-neutraliserings-forsøg. Anti-interferon antiserum fremstilledes i geder, immuniseredes med 10^ enheder autentisk IFN-j3 (sekreteret af humane fibrobiastceller) og rensedes på kontrollerede poreglasperler (A. Bi 11 i au et al*, supra). Efter analyse af de bakteri-5 elle ekstrakter for anti-viral aktivitet som ovenfor sattes seriefortyndinger af antiserum til lignende prøver, blandingerne inkuberedes i 1 time ved 37°C, sattes til humane diploide fibroblaster T21 og analyseredes for anti-viral aktivitet som beskrevet ovenfor. Neutraliseringsgraden ved IFN-j8 antiserum varierer fra +++ (fuldstændig neutralisering) 10 til - (ingen neutralisering). Værdien i parentes viser den omtrentlige antiserum-fortynding for 50% neutralisering.

1) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 min; som gav 2,2 log1Q anti-virale enheder/ml på l^-celler).

15 2) M5219-G-pPLa-8 (42°C, 180 min.), hvortil der sattes IFN-0 (fra humane fibroblaster) før lysis (som gav 1,7 log10 anti-virale enheder på Tgj-celler).

Fortynding af antiserum (1) (2) _3 20 10 +++ +++ 10'4 + +++ 10'5 ± (10"4,5) +++ 10"6 - ± (10"6) _7 10 ' 25

Lignende resultater opnåedes med ekstrakter fra M5219-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C). Forskellene i neutraliseringstiter mellem den bakterielle IFN-0 ifølge opfindelsen og autentisk IFN-0 kan skyldes forskelle i antigenicitet eller den specifikke IFN-aktivitet af disse bakterielle 30 proteiner i forhold til autentisk IFN-jÉl, forårsaget af manglen på glycosylering i de bakterielle proteiner.

c. Stabilitet af HuIFN-θ anti-viral aktivitet (11 Varmebehandling 35 I modsætning til IFN-α har IFN-0 den meget usædvanlige egenskab, at dens anti-virale aktivitet genvindes efter kogning i 1% SDS, 1% Æ-mer-captoethanol, 5 M urinstof (Stewart, W.E. II et al., Distinct Molecular Species of Human Interferon, Requirements For Stabilization And Reactivation Of Human Leucocyte And Fibroblast Interferon, J. Gen. Virol., 26, 65 DK 170476 B1 327-331, (1975)), selvom en 100% genvindelse normalt ikke opnås. For denne analyse resuspenderedes de bakterielle celler af en 150 ml kultur i pufferet for lysis B og samme volumen 2% SDS, 2% j8-mercaptoethanol og 10 M urinstof tilsattes, blandingen kogtes i 2 minutter og S-100 frak-5 tioner fremstilledes.

i) kontrol: M5219-G-pPLa-HFIF-67-12A19 (28°C) ii) kontrol: 3 1 °9χο en^e<^er HuIFN->3 fortyndet i lysis B puffer 10 iii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C, 180 min., celletæthed = 6 x 10^/ml).

Analyserne gennemførtes på l^-celler. Værdien i parentes viser påvisningsgrænsen, der skyldes indre toxicitet.

15 Før kogning Efter kogning i) <1,5 <1,5 ii) 2,2 (< 1,5) 2,0 (< 0,5) iii) 3,0 (< 2,0) 2,2 (< 1,5) 20

Kontrolforsøgene viste en genvinding på ca. 10% af IFN-Ø-aktivite-ten. Der var ingen påviselig værdi i EjSM i parallele kontrollysater.

Disse data gør det klart, at IFN->S anti-viral aktivitet var tilstede i ekstraktet fra den temperatur-inducerede M5219-G-pPL-c-HFIF-67-8 kultur 25 endda efter denne alvorlige behandling, selvom kun ca. 10% af det ti 1 satte IFN-Ø er genvundet i kontrolforsøgene. Faktisk fandtes en højere anti-viral aktivitet efter denne behandling i sammenligning med lysis B fremgangsmåden, hvilket antyder en mulig fastklæbning af IFN-J3 til cel-lekomponenter ved den sidstnævnte fremgangsmåde.

30 (21 Dialyse

Den HuIFN-Ø anti-virale aktivitet er også non-dialyserbar. Fx bibeholdtes den anti-virale aktivitet (log1Q u/ml) af de bakterielle ekstrakter efter dialyse mod PBS i 16 timer ved neutral pH og 4°C, omend 35 dog med reduceret titer: i) M5219-pPLc-HFIF67-8 (42°C) ii) M5219-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C) iii) IFN-/3 i M5219-pPLa-8 . (42°C) 66 DK 170476 B1 Før dialyse Efter dialyse i) 2,3 2,3 i) 3 2,3 i) 1,5 1,3 5 ii) 2,3 1,3 ii) 2,3 2 ii) 2,3 1

Det iagttagne aktivitetsfald efter dialyse kan skyldes non-specifik 10 vedhæftning af IFN-jS til dialysemembraner, etc.

(31 Fældning med (NH^KSQ^

Den anti-virale aktivitet (log10 u/ml) af de bakterielle ekstrakter ifølge opfindelsen opretholdtes efter fældning med 67% mættet ammonium-15 sulfat (2 vol (NH^SO^ opløsning til 1 vol. ekstrakt), en koncentration, der vides at fælde HuIFN-/?. Efter 30 minutter på is centrifugeredes “pillen ved 12000 x g i 10 minutter og genopløstes i PBS til analyse: i) M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42°C) 20 ii) M5219-pPLa-HFIF67-12A19 (42°C) iii) I FN-/? i M5219-pPLa-8 (42°C) Før fældning Efter fældning ' i) 2 2 25 i) 2 2,3 ii) 2 2 iii) 1,3 1,3 iii) 1,5 1,3 30 (41 oH 2-behand1ing

Den anti-virale aktivitet (log^ u/ml) af de bakterielle ekstrakter ifølge opfindelsen var også syrestabil. Ekstrakterne dialyseredes enten i 15 timer mod 50 ml glycin-HCl (pH 2,2) efterfulgt af dialyse mod PBS i 3 timer eller gjordes sure med HC1 efterfulgt af neutralisering med 35 NaOH. Efter fjernelse af bundfaldet gennemførtes ainalysen: i) M5219-pPLc-HFIF67-8 (42°C) i i) H5219-pPLa-HFIF-67-12A19 (42°C) iii) IFN-/5 i M5219-pPLa-8 (42°C) 67 DK 170476 B1 Før svre Efter svre i) 2 1,3 i) 0,7 0,7 ii) 2 1 5 i i i) 3 2 d. 2.5-A svntetase-aktivitet

De osmotiske chokater af M5219-G-pPLc-HFIF67-8 (beskrevet ovenfor) analyseredes for tilstedeværelsen af 2,5-A-syntetase som beskrevet 10 ovenfor med mi krotiterplader, med undtagelse af, at der anvendtes Hela-celler i stedet for EjSM-celler. Der opnåedes de følgende resultater: i) M5219-G-pPLc-HFIF67-8 (28°C) (se ovenfor) ii) M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 (42°C) (se ovenfor) 15 Værdierne, der afspejler 2,5-A syntetase-aktiviteten, viser den· 32 i den trimere form af 2,5-A inkorporerede P-radioaktivitet.

(målte (efter subtraktion 20 tællinger) (af endogen baggrund) 1) ikke-behandlede celler 3342 cpm 0 cpm 2) bakterielt ekstrakt (i): fortynding 1/6 1972 cpm -1370 cpm 3) bakterielt ekstrakt 25 (ii): fortynding 1/6 6960 cpm 3618 cpm 4) bakterielt ekstrakt (i) + IFN-j3 til 1,5 1 ogjq enheder/ml 7037 cpm 3695 cpm 5) se 3, men inkuberet 30 med anti-IFN-0 antiserum 3950 cpm 608 cpm 6) se 4, men inkuberet med anti-IFN-j3 antiserum 2960 cpm -382 cpm 35 7) kontrol-IFN-0 0,5 log^Q enheder/ml 4463 cpm 1120 cpm 8) kontrol-IFN-0 1 logjQ enheder/ml 7680 cpm 4338 cpm 9) kontrol-IFN-0 68 DK 170476 B1 1,5 log1Q enheder/ml 13615 cpm 10273 cpm

10) kontrol-1FN-/J

2 log^Q enheder/ml 25040 cpm 21698 cpm 5 Resultaterne af 2,5-A syntetase-aktivitetsanalysen demonstrerer, at den osmotiske chokat supernatant af den temperatur-inducerede M5219-G-pPLc-HFIF-67-8, som har anti-viral aktivitet (se ovenfor), også inducerer 2,5-A syntetaseaktivitet, mens den non-inducerede bakterielle stamme ikke gør det. Dette paralleliserer resultaterne af 10 de anti-virale aktivitetsanalyser.

Stimuleringsgraden af 2,5-A syntetase er lig med IFN-/l-aktiviteten, der sættes til kontrollysatet (sammenlign prøver (3) og (4)). Anvendelse af en koncentrationskurve, der blev udviklet fra prøver (7) til (10)) viser, at der under hensyntagen til fortyndingen kan 15 skønnes en aktivitet på log^g 1,7 enheder/ml i begge prøver (3) og (4), som er forenelig med værdierne i de direkte anti-virale analyser, dvs. 1,5 1 °9χο en*ie<^er f°r begge prøver. Denne forsøgsrække demonstrerer også, at induktionen af 2,5-A syntetase kan neutraliseres af anti-IFN-)3 antiserum, som det er tilfældet i den anti-virale analyse.

20 e. Anti-viral-aktivitet på andre cellelinier

Ekstrakterne (i) og (ii) (M5219-G-pPLc-HFIF-67-8 ovenfor) testedes også for anti-viral aktivitet på forskellige cellelinier af katte-, muse-, abe- eller kanin-oprindelse. De viste ingen påviselig anti-25 vira! aktivitet på disse celler; dette gjorde autentisk IFN-/J fremstillet af humane celler heller ikke. Der fandtes heller ingen aktivitet på en katte-1unge-linie, som var følsom over for humant leukocyt-interferon. Disse resultater underbygger yderligere, at bakterie fremstillet IFN-/J udviser egenskaber, som i det væsentlige er identiske med dem af 30 IFN-Ø, der udsondres af inducerede humane fibrobiast-celler.

f. Følsomhed over for protease Følsomheden af IFN-/3 fra de bakterielle værter ifølge opfindelsen testedes ved behandling af fortyndede bakterielle ekstrakter med til-35 tagende mængder af trypsin i 1 time ved 37°C. Den anti-virale aktivitet af IFN-/J ophævedes af trypsinen ved en lignende koncentration som den, der ophævede aktiviteten af autentisk IFN-Ø, der sattes til et inaktivt kontrollysat.

69 DK 170476 B1

Trypsin-endepunkt fms/ml) M5219-pPLa-HFIF67-12A19 (42°C) (1000 u/ml) 0,03 5 M5219-pPLc-HFIF-67-8 (42°C) (1000 u/ml) 0,03 IFN-/} i M5219-pPLa-8 (42°C) (1000 u/ml) 0,03 M5219-pPLc-HFIF67-8 (42°C) ( 30 u/ml) 0,03 I FN-/} i M5219-pPLa-8 (42°C) ( 30 u/ml) 0,03 10 3. Identificering af det aktive IFN-fl-orodukt

Forskellige forsøg har demonstreret, at præ-HuIFN-Ø ikke er aktivt og ikke forarbejdes af bakterielle celler eller under analysebetingelser til et aktivt produkt. Derfor skyldes IFN-/?-aktiviteten, der blev påvist i de ovenfor beskrevne forskellige bakterielle eks-15 trakter, sandsynligvis forarbejdning af de forventede fusionerede proteiner (fx. HuIFN-/} fusioneret til Ø-laktamase, MS2 eller bakterielle signal sekvenser) af bakterierne eller under analysebetingelserne til et aktivt produkt.

Det er ikke sikkert, at det aktive produkt i sådanne ekstrakter 20 er moden HuIFN-^ (moden HuIFN-/S er selvfølgelig produktet af G-pPLa-HFIF-67-12ΔΜ1 og G-pPLa-HFIF-67-12A19 BX-2). Fraktionering af de bakterielle ekstrakter, der fx. er opnået fra induceret M5219-pPLa-HFIF-67-12Δ19 eller fra induceret M5219-pPLc-HFIF-67-8, ved polyacrylamidgel -el ektroforese under denaturerende betingelser afslørede imidlertid 25 tilstedeværelsen af to aktive produkter. Det første af disse produkter havde en omtrentlig størrelse på 15000-18000 daltons og kunne svare til moden IFN-/?. Det andet produkt, som havde en højere molekylvægt, kan være et fusionsprodukt eller et ufuldstændigt forarbejdet produkt, som har IFN-/3 aktivitet, eller kan være et produkt, som er forarbejdet til 30 moden IFN-/} under analysebetingelserne. Aminosyresekventering af de forskellige ekspressionsprodukter under anvendelse af velkendte metoder vil tillade en bestemmelse af, hvilke af de eventuelt tilstedeværende proteinprodukter som foruden moden HuIFN-/} udviser aktiviteten svarende til HuIFN-/}.

35 70 DK 170476 B1

Forbedring af udbyttet oa aktiviteten af Dolvpeotider. som udviser_

HuIFN-fl-aktivitet fremstillet ifølge opfindelsen

Fremstil!ingsniveauet af et protein reguleres af tre hovedfakto-5 rer: antallet af kopier af dets gen inden for cellen, effektiviteten, hvormed disse genkopier transskriberes og effektiviteten, hvormed de oversættes. Transskriptionseffektivitet og oversættelse (som tilsammen udgør ekspression) er igen afhængige af nukleotidsekvenser, som normalt befinder sig foran den ønskede kodningssekvens. Disse nukleotidsekvenser 10 eller ekspressionskontrolsekvenser definerer inter alia stedet, hvor RNA-polymerase griber ind for at påbegynde transskription (promotorsekvensen) og hvor ribosomer forbinder sig og påvirker mRNA'en (transskriptionsproduktet) for at påbegynde oversættelse. Ikke alle sådanne ekspressions-kontrolsekvenser fungerer lige effektivt. Det er 15 således en fordel at separere de specifikke kodningssekvenser for det ønskede protein fra deres nabostiIlede nukleotidsekvenser og i stedet •fusionere dem til andre kendte ekspressions-kontrolsekvenser for at begunstige højere ekspressionsniveauer. Efter at dette er opnået, kan det nyt fremstillede DNA-fragment indføres i et plasmid med et højere 20 kopi-antal eller et bakteriofag-derivat for at forøge antallet af genkopier inden for cellen og derved yderligere forbedre udbyttet af det udtrykte protein.

Der kan anvendes forskellige ekspressions-kontrolsekvenser som beskrevet ovenfor. Disse indbefatter operatoren, promotoren, ribosom-25 bindingen og interaktionssekvenserne (inklusive sekvenser såsom Shine-Dalgarno-sekvenser) af laktose-operonen af E. coli ("lac-systemet"), de tilsvarende sekvenser af tryptofan-syntetase-systemet af E. coli. ("trp- . systemet"), de hovedsagelige operator- og promotorområder af fag λ (0^ som beskrevet ovenfor og 0^), et kontrolområde af filamentøse 30 enkelt-strengede DNA-fager eller andre sekvenser, som kontrollerer genekspressionen af prokaryotiske eller eukaryotiske celler og deres virus. Derfor kan til forbedring af produktionen af et bestemt polypeptid i en passende vært genet, der koder for dette polypeptid, fremstilles som før og fjernes fra et rekombinations-DNA-molekyle, der er nærmere på dens 35 tidligere ekspressions-kontrolsekvens eller under kontrol af én af de ovenfor nævnte ekspressions-kontrolsekvenser. Sådanne metoder er kendte for fagmanden.

Andre metoder til forbedring af oversættelseseffektiviteten indebærer indføring af kemisk eller enzymatisk fremstillede oligonukleoti- 71 DK 170476 B1 der foran den igangsættende kodon. Ved denne fremgangsmåde kan der opnås en mere optimal primær og sekundær struktur af budbringer-RNA'en. Mere specielt kan sekvensen konstrueres således, at den igangsættende AUG-kodon forekommer i en let tilgængelig position (dvs. ikke maskeret af 5 sekundær struktur), enten på spidsen af en hårnål eller i andre enkeltstrengede områder. Ligeledes kan positionen og sekvensen af det før nævnte Shine-Dalgarno-segment også optimeres. Vigtigheden af den generelle struktur (foldning) af budbringer-RNA'en er dokumenteret (D. Iserentant og W. Fiers "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of 10 Translation Initiation", Gene, 9, 1-12 (1980).

Yderligere forøgelse af det cellulære udbytte af de ønskede produkter er afhængig af en forøgelse af gen-antallet, som kan udnyttes i cellen. Dette kan opnås ved indføring af HuIFN-/J-genet (med eller uden dets transskriptions- og oversætte!ses-kontrolelementer) i et plasmid 15 med endnu højere kopi-antal eller i et plasmid med temperatur-kontrolleret kopi-antal (dvs. et plasmid, som bærer en sådan mutation, at kopiantallet af plasmidet forøges efter temperaturforøgelse; B. Uhlin et al. "Plasmids With Temperature-dependent Copy Number For Amplification Of Cloned Genes And Their Products", Gene, 6, 91-106 (1979)). Alternativt 20 kan en forøgelse af gen-dosering fx. opnås ved indføring af rekombina-tions-DNA-molekyler, der er fremstillet på den tidligere beskrevne måde, i det tempererede bakteriofag λ, lettest ved fordøjelse af plasmidet med et restriktionsenzym, for at opnå et lineært molekyle, som derefter blandes med en indskrænket fag λ klon-bærer (fx. af typen beskrevet af 25 N.E. Murray et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants", Mol. Gen. Genet., 150, 53-61 (1977) og N. E. Murray et al., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4", J. Mol. Biol., 132, 493-505 (1979) og det ved inkubering med DNA-ligase fremstillede rekombinations-DNA-molekyle. Den ønskede rekombina-30 tions-fag udvælges dernæst som før og anvendes til at lysogenisere en værtsstamme af E. coli.

Specielt nyttige λ klon-bærere indeholder en temperaturfølsom mutation i repressionsgenet cl og undertrykbare mutationer i gen S, hvis produkt er nødvendigt til lysis af værtscellen, og gen E, hvis produkt 35 er det hovedsagelige kapsel-protein af virussen. Med dette system dyrkes de lysogene celler ved en relativt lav temperatur (fx. 28-32°C) og opvarmes dernæst til en højere temperatur (fx. 40-45°C) for at inducere udskæring af profagen. Forlænget dyrkning ved en højere temperatur fører til høje produktionsniveauer for proteinet, som er holdt tilbage inden 72 DK 170476 B1 for cellen, da disse ikke er lyseret ved fag-gen-produkter på sædvanlig måde, og da fag-gen-indføringen ikke er indkapslet, forbliver den tilgængelig for yderligere transskription. Kunstig lysis af cellerne frigjorde dernæst det ønskede produkt i højt udbytte. Da der ved den fore-5 liggende opfindelse også anvendes λ repressor-systemet til ekspressions-kontrol, er det muligvis nødvendigt at kontrollere udskæringen af profagen og siden kopiantallet af genet ved et heteroimmunt kontrolområde, fx. opnået fra den lambdoide fag 21.

Det bør forstås, at polypeptider, der udviser IFN-Ø-aktivitet 10 (fremstillet ifølge opfindelsen), kan fremstilles i form af et fusioneret protein (fx. bundet til et prokaryotisk N-terminalt segment, som styrer udskillelse), eller i form af prointerferon (fx. begyndende med interferon-signal sekvensen, som kunne afspaltes efter udskillelse) eller som modent interferon (sidstnævnte er muligt, fordi modent fibroblast-15 interferon begynder med methionin, en aminosyre, der anvendes til translationsigangsættelse). Udbyttet af disse forskellige former for polypep-~ tider kan forbedres ved en hvilken som helst- eller en kombination af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder. Også forskellige kodoner for nogle ' eller alle af de i den foreliggende DNA-sekvens anvendte kodoner kunne 20 substitueres. Disse substituerede kodoner kan kode for aminosyrer, der er identiske med dem, for hvilke der kodes af de erstattede kodoner, men resulterer i et højere udbytte af polypeptidet. Alternativt kan erstatningen af én eller en kombination af kodoner, der fører til åmino-syre-erstatning eller til et længere eller, kortere HuIFN-Ø-relateret polypep-25 tid, forandre dets egenskaber på en nyttig måde (fx. forøge stabiliteten, forøge opløseligheden, forøge den anti-virale aktivitet, forøge 2,5-A syntetase-aktiviteten eller forøge værts-specificitets-området).

Endelig kan aktiviteten af polypeptiderne, der er fremstillet af rekombinations-DNA-molekylerne beskrevet heri, forbedres ved fragmen-30 tering, modificering eller derivatisering af DNA-sekvenserne eller polypeptiderne beskrevet heri på velkendte måder.

Identificering af et kromosomalt oen. der koder for HuIFN-fl

En samling af hybride fag opnået fra fragmenter af foetal human 35 kromosomal DNA, som ver blevet fremstillet ved delvis spaltning med Haelll og Alul, og forbundet med EcoRI-forbi ndel ser til λ Charon 4A-arme, er blevet fremstillet af R. M. Lawn et al., Cell, 15, pp. 1157-74 (1978). Denne genbank screenedes ved en "in situ" fremgangsmåde (W. D. Benton og R. W. Davis, Science, 196, pp. 180-82 (1977); T. Maniatis et 73 DK 170476 B1 . 32 al., Cell, 15, pp. 687-701 (1978) under anvendelse af den P-mærkede IFN-/3-cDNA-indføring, der var udskåret ved Taql-BglIl-restriktion fra pHFIF-21 , som prøve. En hybridiserings-positiv fag-klon isoleredes fra 600.000 plaquer ved gentagen plaque-rensning (T. Maniatis et al., 5 supra). Denne plaque kaldtes ACH4A-gHFIF-l. Restriktions-analyse af denne plaque demonstrerede, at den indeholder ca. 16,3 Kb human DNA.

EcoRI-fordøjelse af XCH4A-gHFIF-l frembragte ud over de to Charon 4A-fag-arme otte indføringsfragmenter -- 4,6 - 3,5 - 2,4 - 1,9 -1,3 - 1,2 - 0,8 og 0,6 Kb i længden. Efter Southern-pletning hybridiserede kun 10 1,9 Kb-fragmentet til Taql-BglIl-fragmentet af pHFIF-21.

1,9 Kb-fragmentet klonedes igen direkte i EcoRI-positionen af pBR325 (et derivat af pBR322, som også bærer en chloramphenicol -resistent markør indeholdende en enkelt EcoRI-position). Efter afsnøring af 0,6 pg EcoRI-fordøjet XCH4A-gHFIF-l-DNA til 100 ng pBR325 og 15 transformering i E. coli HB101 udvalgtes forskellige kloner. Kun kloner, der indeholdt 1,9 Kb-fragmentet, hybridiserede til IFN-/?-cDNA-prøven.

Denne klon kaldtes p(325)-gHFIF-4.

Sammenligning af det fra pHFIF-21 og p(325)-gHFIF-4 afledte restriktions-fragment demonstrerede, at der ikke findes nogen inter-20 venerende sekvenser i den kromosomale klon og at DNA-informationen, der bæres af klonen, er identisk med den af pHFIF-21.

Identificeringen og isoleringen af den kromosomale DNA, der koder for HuIFN-/l muliggør omdannelsen af passende værter med denne DNA og ekspressionen af HuIFN-0 derfra. En sådan ekspression er fordelagtig, 25 fordi de forskellige med kromosomal DNA forbundne signaler vil være til stede i sådanne kloner. Disse signaler vil så være tilgængelige til igangsættelse af højere udbytter ved ekspression og måske post-ekspressions-forarbejdning af polypeptidet, for hvilket der kodes ved kodnings-området af den kromosomale DNA.

30 Mi kro-organismer og rekombinations-DNA-molekyler, der er fremstillet ved de heri beskrevne fremgangsmåder, eksemplificeres ved kulturer, der er deponeret i kultur-samlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Gottingen, Vesttyskland d. 2. april 1980 og 35 ...........

* Plasmid pHFIF-21 identificeredes ved screenings-fremgangsmåderne ifølge opfindelsen. Taql-BglII-fragmentet af dette plasmid indeholder næsten det totale 5'-uoversatte område og det totale kodningsområde af IFN-ø.

40 DK 170476 Bl 74 identificeret som HFIF-A til C: A: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF3) B: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF6) C: E. coli HB101 (G-pBR322(Pst)/HFIF7) 5

Disse kulturer tildeltes hhv. accessions-numre DSM 1791-1793. De eksemplificeres også ved kulturer, der er deponeret i kultur-samlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Gottingen, Vesttyskland d. 5. juni 1980 og identificeret som HFIF-D til G: 10 D: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) E: E. coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-12) F: E. coli M5219 (G-pPLa-HFIF-6712A19) G: E. coli M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8)

Disse kulturer tildeltes hhv. accessions-numre DSM 1851-1854.

15 De er også eksemplificeret ved kulturer, der er deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, d. 26. februar 1981 og identificeret som HFIF H og I: Η: E. coli M5219 (pPLa-HFIF-67-12ΔΜΙ) I: E. coli HB101 (p[325]-gHFIF-4) 20 Disse kulturer tildeltes hhv. accessions-numre ATCC 31824 og 31825. Alle de ovennævnte deponeringer er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

Selvom der i det foregående er beskrevet et antal udførelsesformer af den foreliggende opfindelse, er det indlysende, at grundkonstruktion-25 en kan ændres til opnåelse af andre udføre!sesformer. Derfor skal opfindelsens omfang defineres ved de efterfølgende krav og ikke ved de specifikke udførelsesformer, som er blevet eksemplificeret i det foregående.

Claims (16)

75 DK 170476 B1

1. Rekombinant DNA-molekyle, der består af DNA-sekvenser fra forskellige genomer, og som er i stand til at inducere ekspression i en 5 uni-cellulær vært af et polypeptid, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet af human β-interferon, KENDETEGNET ved, AT molekylet omfatter en DNA-sekvens valgt blandt: (a) DNA-indføringerne af G-pPla-HFIF-67-12, [HincII-Sau3AI], G-pPla-HFIF-67-12A19, [HinclI-Sau3AI] og G-pPlc-HFIF-67-8 [HincII-

2. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at nævnte DNA-sekvens (b), der hybridiserer til nævnte DNA-indføring (a), er DNA-indføringen af G-pPLa-HFIF-67-12ΔΜ1 [BamHI-Sau3AI], båret af mikroorganismen identificeret ved accessionsnummeret ATCC 31824.

3. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at nævnte DNA-sekvens (b), der hybridiserer til nævnte DNA-indføring (a), er DNA-indføringen af p[325]-gHFIF-4[EcoRI] båret af mikroorganismen identificeret ved accessionsnummeret ATCC 31825.

4. Rekombinant DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, KENDETEGNET ved, at DNA-sekvensen er valgt blandt DNA-sekvenser med formi en: ATGACCAACAAGTGTCTCCTC.CAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAG

35 CTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCA GTGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCAC AGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGG AGGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAG ACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCT 76 DK 170476 B1 AATGTCTATCATCAGATAMCCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGA AAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTA TGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACC ATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTT 5 ACCTCCGAAAC, og ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGTGTCAGA AGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCACAGGATGAA CTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCC 10 GCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATT CATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTA TCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGAT TTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGA TTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAG 15 AGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGA AAC.

5. Rekombinant DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, KENDETEGNET ved, at ekspressionskontrolsekvensen er valgt blandt et 20 lac system, et /Mac system, et trp system, hovedoperator- og promotorområder af fag Λ, kontrolområdet af fd overtræksprotein og andre sekvenser, som kontrollerer gen-ekspressionen for prokaryotiske eller eukaryo-tiske celler og deres vira.

6. Rekombinant DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, KENDETEGNET ved, at det er valgt blandt G-pPLa-HFIF-67-12, G-pPla- HFIF-67-12A19 og G-pPla-HFIF-67-8, idet disse rekombinant DNA-molekyl-er bæres af mikroorganismerne identificeret ved accessionsnumrene hhv.. DSM 1851-1854. 30

7. Rekombinant DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, KENDETEGNET ved, at det er G-pPLa-HFIF-67-12AMl og bæres af mikroorganismen identificeret ved accessionsnummer ATCC 31824.

8. Uni-cellulær vært transformeret med mindst ét rekombinant DNA- mol ekyl e ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

9. Transformeret vært ifølge krav 8, valgt blandt E.coli M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 1851], E.coli Κ12ΔΗΙ(G-pPLa-HFIF-67-12) [DSM 77 DK 170476 B1 1852], E.col i M5219 (G-pPLa-HFIF-67-12A-19) [DSM 1853], E.coli M5219 (G-pPLc-HFIF-67-8) [DSM 1854] og E.coli Κ12ΔΗΙ (G-pPLa-HFIF-67-8).

10. Transformeret vært ifølge krav 8, valgt blandt E.coli M5219 5 (pPLa-HFIF-67-12AMl) [ATCC 31824].

10 Sau3AI] båret af mikroorganismerne identificeret ved accessionsnumrene hhv. DSM 1851-1854, (b) DNA-sekvenser, som hybridiserer til enhver af de foregående DNA-indføri nger, og (c) DNA-sekvenser, der er degenereret som resultat af den genetiske 15 kode til DNA-sekvenserne og -indføringerne defineret i (a) og (b), og som ved ekspression koder for et polypeptid med samme aminosyresekvens, idet DNA-sekvensen er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens i det rekombinante DNA-molekyle.

11. Fremgangsmåde til transformering af en uni-cellulær vært, KENDETEGNET ved, at man i værten indfører et rekombinant DNA-molekyle i følge et hvilket som helst af kravene 1-7. 10

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet af human ^-interferon, KENDETEGNET ved, at man transformerer en uni-cellulær vært med et rekombinant DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 og dyrker 15 værten.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet af human ^-interferon, KENDETEGNET ved, at man dyrker en uni-cellulær vært, som er transforme- 20 ret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, KENDETEGNET ved, at polypeptidet, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet 25 af human 0-interferon, er valgt blandt polypeptider med formlerne: Met-Thr-Asn-Lys-Cys-Leu-Leu-Gln-Ile-Ala-Leu-Leu-Leu-Cys- Phe-Ser-Thr-Thr-Ala-Leu-Ser-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly- Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu-Leu-

30 Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg- Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr-Glu-Met-Leu-G1n-Asn-Ile-Phe-Ala-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn-Val-

35 Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys- Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr- 78 DK 170476 B1 Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn, og Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu-Leu-Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-5 Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu- G1u-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-Ala-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-10 Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr- Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Πe-Leu-Hi s-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-Hi s-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn. 15

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser *'den immunologiske eller biologiske aktivitet af human β-interferon, KENDETEGNET ved, at man dyrker en uni-cellulær vært transformeret med en DNA-sekvens valgt blandt DNA-sekvenserne med formlerne: 20 ATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAG CTCTTTCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCA GTGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCAC" AGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGG 25 AGGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAG ACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCT AATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGA AAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTA TGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGGCTGGACC 30 ATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTT ACCTCCGAAAC, og ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGTGTCAGA AGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGCACAGGATGAA 35 CTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCC GCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATT CATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTA TCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGAT TTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGA 79 DK 170476 B1 TTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAG AGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGA AAC, 5 hvilken DNA-sekvens er operativt bundet til en ekspressionskontrolsekvens i den uni-cellulære vært.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, at det polypep-tid, der udviser den immunologiske eller biologiske aktivitet af human 10 β-interferon, er valgt blandt polypeptiderne med formlerne: Met-Thr-Asn-Lys-Cys-Leu-Leu-Gln-Ile-Ala-Leu-Leu-Leu-Cys-Phe-Ser-Thr-Thr-Ala-Leu-Ser-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu-Leu-15 Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg- Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-Ala-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-Glu-Thr-Ile-Val-GIu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn-Val-20 Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys- Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-GIu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-25 Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn, og Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu-Leu-Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-30 Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala- Leu-Thr-Ile-Tyr-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-Ala-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-35 Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr- Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-GIu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn.