DK159976B - Plasmidvektorer, fremgangsmaade til fremstilling deraf, bakterieceller transformeret med plasmidvektorer samt udtrykkelse af protein i transformerede bakterieceller - Google Patents

Description

t DK 159976 B

Den foreliggende opfindelse angår plasmidvektorer, der er egnet til at modtage og transcribere DNA-fragmenter og deres fremstilling, plasmidvektorer med et indsat eukaryotisk DNA-fragment og deres fremstilling, transformation af bakterieceller med sådanne plasmid-5 vektorer samt fremgangsmåde til udtrykkelse af protein ved dyrkning af således transformerede bakterieceller.

De fleste organismers genetiske indhold er i form af DNA. Denne genetiske information udtrykkes ved en kompleks serie af reaktioner, der omfatter transcription af DNA til RNA og efterfølgende oversæt-10 telse af RNA til protein.

I bakterieceller er transcriptionen og oversatteisen tæt sammenknyttede. Mængden af et givet protein reguleres ved den mængde transcription, der forekommer. Tryptophanoperon (trp-operon) og reguleringen deraf er et godt eksempel på dette. Bakterier syntetiserer tryptophan 15 ved en serie biokemiske reaktioner, der omfatter 5 enzymer. Den genetiske information til fremstilling af disse enzymer er således organiseret, at de individuelle gener følger efter hinanden i genom-et, og at de alle reguleres fra et enkelt sted, operatoren.

Reguleringen af transcriptionen opererer efter et feed-back-princip, 20 idet operonet blokeres eller undertrykkes ved tilstedeværelse af tryptophan, medens det i fravær af tryptophan "af-undertrykkes". I den af-undertrykte tilstand initieres transcriptionen ved promotoren (en region af DNA nær operatoren med høj affinitet for KNA-poly-merase) og forløber gennem operatoren til operonens strukturelle 25 gener.

Det er kendt at indsætte en fuldstændig trp-operon i Gol El-plas-mider. Således beskriver Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73 (1976), side 3838-3843 indsættelsen af et ikke-fraktioneret Eco Rl-fragment, der indeholder den fuldstændige trp-operon fra E. coli i plasmidet 30 Col El, og anfører, at det resulterende plasmid kan være anvendeligt til cloning og amplifikation af forskellige funktionelt definerede gener. Journal of Bacteriology, 126 (1976), side 447-453, beskriver et miniplasmid, der er dannet efter indsættelse af et Eco RI-trp-fragment, der er afledt fra plasmidet pSC105, og som indeholder den

DK 159976 B

2 fuldstændige trp-operon. Begge referencer beskriver anvendelsen af hele trp-operonen, og det er hverken nævnt eller antydet, at et fragment, der kun indeholder en del af trp-operonen, f.eks. omfattende trp-promotoren, trp-E-genet og/eller trp-D-genet, kan opnås og/el-5 ler indsættes i et plasmid til udvikling af ekspression af et ønsket genprodukt.

Dansk patentansøgning nr. 4937/78 beskriver et plasmid, der indeholder plasmider til anvendelse ved fremstillelse af syntetisk somatostatin og humant insulin. Plasmiderne indeholder en kontrolregion i 10 læseramme med DNA-fragmenter, der koder for fusionsproteiner, der kan føre til fremstilling af syntetisk somatostatin og humant insulin. Kontrolregionen er eksemplificeret som lac-operonen, men det er nævnt, at trp-operonen kan anvendes. Det er imidlertid ikke nævnt, at en del af trp-operonen ville kunne anvendes, og det er hverken nævnt 15 eller antydet, hvorledes en sådan del ville kunne opnås. En nærmere beskrivelse af fremstillingen af det syntetiske somatostatin er anført i Science, 198 (1977), side 1056-1063, og fremstillingen af humant insulin er nærmere beskrevet i Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76 (1979), side 106-110. Ingen af de to sidstnævnte referencer nævner 20 eller antyder anvendelsen af trp-operonen eller en del deraf som kontrolregion.

Også Roychoudhury, R., et al. (1976), Nucleic Acids Research, 3, 863-877; og Scheller, R.H., et al. (1977), Science, 196, 177-180) beskriver, at eukaryotiske DNA-fragmenter kan indsættes i bakterielle 25 plasmider. Det er imidlertid klart, at indførte eukaryotiske promotorsekvenser erkendes dårligt af bakteriecellerne, f.eks. af Escherichia coli-RNA-polymerase in vivo. Selv om det er blevet rapporteret, at det har været muligt at komplementere bakteriemutationer ved DNA-fragmenter fra gær, var omfanget af udtrykkelse af det clonede gen 30 således lavt, og der produceredes langsomt voksende bakterier (jfr. f.eks. Carbon, J., et al. (1977), Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Raven Press, New York, 355-378).

På tilsvarende måde skete transcriptionen af clonet mitochondrial DNA fra mus i Escherichia coli fra den forkerte streng (jfr. f.eks.

35 Brown, W.M., et al. (1976), Cell, 7, 517-530).

DK 159976 B

3

Strukturen af plasmidvektorerne ifølge den foreliggende opfindelse er baseret på tilvejebringelsen af et indsættelsessted, især et Hind III-sted, for et valgt eukaryotisk DNA-fragment, hvilket indsættelsessted ligger ved siden af en bakteriel trp-promotor, således 5 at transcriptionen og oversættelsen af DNA-fragmentet reguleres af promotoren. De omhandlede plasmider er almindeligvis også i regionen umiddelbart efter indsættelsesstedet forsynet med genet for tetra-cyclinreslstens, således at man efter indsættelse af det valgte DNA på indsættelsesstedet bekvemt kan bekræfte den af promotoren kon-10 trollerede transcription og oversættelse af det indsatte DNA, eftersom tetracyclinresistensen bevares, når transcriptionen og oversættelsen har fundet sted, og i de fleste tilfælde ødelægges, når transcriptionen og oversættelsen ikke har fundet sted.

En udførelsesform for den foreliggende opfindelse angår et plasmid, 15 som har et indsættelsessted for et eukaryotisk DNA-fragment ved siden af en bakteriel trp-promotor og trpE-genet eller en del deraf og nedstrøms fra et prokaryotisk ribosombindingssted og en trp-ini-tiatorkodon, således at den bakterielle trp-promotor regulerer transcriptionen og oversættelsen af et indsat DNA-fragment, hvilket 20 plasmid har karakteristika som anført i et hvilket som helst af de følgende alternativer (A)-(G): (A) et plasmid med en molekyllængde på 9866 bp; et Hindlll-sted; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Eco Ri-sted 3709 bp fra Sal I; et andet Hind III-sted 31 bp fra 25 Eco RI; et Hpa I-sted 305 bp fra det andet Hind III; et andet

Hpa I-sted 3250 bp fra det første Hpa I og 1950 bp fra det første Hind III, trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i delen på 1950 bp mellem det andet Hpa I-sted og det første Hind III-sted, et gen for tetracyclin-resistens, der følger umiddelbart efter det 30 første Hind III-sted og et gen for ampicillin-resistens i delen på 3709 bp mellem Sal I- og Eco Ri-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH3.

(B) et plasmid med en molekyllængde på 9866 bp; et Hind III-sted; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et

DK 159976B

4

Eco RI-sted 3709 bp fra Sal I; et andet Hind III-sted 31 bp fra Eco RI; et Hpa I-sted 1950 bp fra det andet Hind III-sted; et andet Hpa I-sted 3250 bp fra det første Hpa I-sted og 305 bp fra det første Hind III-sted, trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i delen 5 på 1950 bp mellem det andet Hind III- og det første Hpa 1-sted, et gen for tetracyclin-resistens, der følger umiddelbart efter det første Hind III-sted og et gen for ampicillin-resistens i delen på 3709 bp mellem Sal I- og Eco RI-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH4.

10 (C) et plasmid med en molekyllængde på 6750 bp; et Hind III-sted; et

Bam Hi-sted ved 346 bp fra Hind III-stedet; et Sal I-sted ved 275 bp fra Bam Hi-stedet; et Hpa I-sted ved 4230 bp fra Sal I-stedet og 1950 bp fra Hind III-stedet; trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i delen på 1950 bp, der strækker sig mellem Hpa I-stedet og Hind III- 15 stedet og et gen for ampicillin-resistens i delen på 4800 bp mellem Hind III-stedet og Hpa I-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH5.

(D) et plasmid med en molekyllængde på 4874 bp; et Eco RI-sted; et Hind III-sted 31 bp fra Eco RI-stedet; et Hpa I-sted 313 bp fra Hind III-stedet; et andet Hind III-sted 199 bp fra Hpa I; et 20 Bam I-sted 346 bp fra det andet Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal I og 752 bp fra Eco RI; et gen for tetracyclin-resistens, der strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; et gen for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet, og den clonede del af trp-operonen 25 omfatter området mellem promotoren og den første del af E-genet i området mellem Hpa I-stedet og det andet Hind III-sted; hvilket plasmid betegnes pWTIOl.

(E) et plasmid med en molekyllængde på 4823 bp; et Hpa I-sted; et Hind III-sted 199 bp fra Hpa I; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III; et 30 Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal I og 1045 bp fra Hpa I; hvorhos genet for tetracyclin-resistens strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; et gen for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet og den clonede del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af

DK 159976B

5 E-genet i området mellem Hpa I- og Hind III-stedet; hvilket plasmid betegnes pWTlll.

(F) et plasmid med en molekyllængde på 4837 bp; et Hpa I-sted; et Hind III-sted 206 bp fra Hpa I; et Bam I-sted 353 bp fra Hind III; et 5 Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal I og 1045 bp fra Hpa I; hvorhos genet for tetracyclin-resistens strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; genet for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet og den clonede del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af 10 E-genet mellem Hpa I- og Hind III-stedet; hvilket plasmid betegnes pWTl21, idet fasningen er ændret 1 bp fra pWTlll.

(G) et plasmid med en molekyllængde på 4851 bp; et Hpa I-sted; et Hind III-sted 213 bp fra Hpa I; et Bam I-sted 360 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal I og 1045 15 bp fra Hpa I; hvorhos genet for tetracyclin-resistens strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; og genet for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet og den clonede del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af E-genet mellem Hpa I-stedet og Hind III-stedet, hvilket plasmid 20 betegnes pWT131, idet fasningen er ændret 2 bp fra pWTlll..

Et sådant plasmid kan fremstilles ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved at man (a) til fremstilling af det i krav 1 (A) angivne pEH3 digererer en vildtypestamme af E. coli med restriktionsendonuclease Hind III, 25 ligerer det således vundne fragment til det lineære molekyle, der fås ved begrænsning af plasmidet pBR322 med restriktionsendonuclease Hind III, transformerer E. coli W3110 trpoEVl med det resulterende plasmid og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser tetracyclin-resistens og trp-komplementering, til opnåelse af plasmidet pEH3. 1 (b) til fremstilling af det i krav 1 (B) angivne pEH4 digererer en vildtypestamme af E. coli med restriktionsendonuclease Hind III, ligerer det således vundne fragment til det lineære molekyle, der vindes ved begrænsning af plasmidet pBR322 med restriktionsendonucle-

DK 159976B

6 ase Hind III, transformerer E. coli W3110 trpoEVl med det resulterende plasmid og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser tetra-cyclin-følsomhed og trp-komplementering, til opnåelse af plasmidet pEH4.

5 (c) til fremstilling af det i krav 1 (C) angivne pEH5 begrænser pEH3 med restriktionsendonuclease Eco RI, digererer det lineære molekyle med exonuclease III og Si-nuclease, behandler med DNA polymerase I, ligerer det lineære molekyle med DNA ligase, transformerer E. coli W3110 trpoEVl med det resulterende plasmid og selekterer de kolonier, 10 der udviser trp-komplementering og ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pEH5.

(d) til fremstilling af det i krav 1 (D) angivne pWTIOl begrænser pEH5 med restriktionsendonuclease Hinf I til dannelse af et fragment indeholdende den komplette trp-promotor og doner fragmentet ind i 15 Hind III-stedet i plasmidet pBR322, idet man behandler Hinf I-endeme af fragmentet med DNA polymerase I, behandler fragmentet med Hind III-linkere i nærværelse af DNA ligase, behandler det ligerede molekyle med Hind III-restriktionsendonuclease til dannelse af et lineært molekyle med Hind III-klæbrige ender, ligerer dette lineære molekyle 20 til Hind III-stedet i plasmidet pBR322, transformerer E. coli K12 HB101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pWTIOl.

(e) til fremstilling af det i krav 1 (E) angivne pWTlll begrænser 25 pWTIOl med restriktionsendonuclease Eco RI, digererer det lineære molekyle med exonuclease III og Sl-nuclease, behandler med DNA polymerase I, religerer det lineære molekyle, transformerer E. coli K12 HB101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet 30 pWTlll.

(f) til fremstilling af det i krav 1 (F) angivne pWT121 begrænser pWTlll med restriktionsendonuclease Hind III, behandler det linære molekyle med DNA polymerase I, ligerer med Hind III-linker DNA, begrænser med restriktionsendonuclease Hind III, religerer det line

DK 159976B

7 ære molekyle, transformerer E. coli K12 HB101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pWT121.

(g) til fremstilling af pWT131 som angivet i krav 1 (G) begrænser 5 pWT121 med restriktionsendonuclease Hind III, behandler det linære molekyle med DNA polymerase I, ligerer med Hind Ill-linker DNA, begrænser med restriktionsendonuclease Hind III, religerer det lineære molekyle, transformerer E, coli K12 HB 101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-10 resistens, til opnåelse af plasmidet pWTl31.

Nærmere bestemt kan plasmidet pEH5 fremstilles på følgende måde: (a) Isolering af Hind III trpE-fragmentet

Dette fragment kan isoleres enten ved Hind III (EC3.1.23.21)-dige-rering af DNA fra de fleste stammer af Escherichia coli, f.eks.

15 Escherichia coli stamme W3110, eller ved Hind III-digerering af plasmid pRHl/trpE. pRHl er i sig selv fremstillet ved Eco RI (EC3,1.4.32)-digerering af Escherichia coli-plasmider pDS1118 og pML2, ligation af de således fremstillede fragmenter og selektion for ampicillin- og kanamycinresistens. Ved Hind III-digerering af 20 pRHl og ligation med Hind III-digereret DNA fra stamme Escherichia coli W3110 og efterfølgende transformation til stamme W3110 trp oEVl og dyrkning i fravær af tryptophan blev vundet pRHl/trpE.

(b) Cloning af Hind III trpE-fragmentet

Det på den ovenfor beskrevne måde vundne Hind III trpE-fragment blev 25 covalent bundet til et fragment fremstillet ved Hind III-restriktion af plasmidet pBR322 (jfr. f.eks. Bolivar, F., et al. (1977), Gene, 2, 95-113). Det bundne DNA blev anvendt til transformering af Escherichia coli W3110 trpVoE 1, og kolonier blev udvalgt for ampicillin-resistens og trp-komplementering. De vundne plasmider viste sig at 30 være af to typer, afhængig af orienteringen af fragmenterne under

DK 159976 B

8 ligationen; disse to plasmider, nemlig de ovenfor beskrevne plasmider pEH3 og pEH4, er vist i henholdsvis fig. 2 og 3. Plasmidet pEH3 blev selekteret på basis af dets tetracyclinresistens og anvendt til næste trin i produktionen af de her omhandlede plasmider. Plasmidet pEH3 5 har som omtalt ovenfor følgende karakteristika:

En molekyllængde på 9866 bp; et Hind III-sted; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III-stedet, et Sal I-sted 275 bp fra Bam I-stedet, og et Eco Ri-sted 3709 bp fra Sal I-stedet; et andet Hind III-sted 31 bp fra Eco Ri-stedet; et Hpa I-sted 305 bp fra det andet Hind III-stedet; et 10 andet Hpa I-sted 3250 bp fra det første Hpa I- og 1950 bp fra det første Hind III-sted, idet plasmidet har trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i portionen på 1950 bp mellem det andet Hpa I-sted og det første Hind III-sted; genet for tetracyclinresistens umiddelbart efter det første Hind III-sted og genet for ampicillinresistens 15 i portionen på 3709 bp mellem Sal I- og Eco- Ri-stedet.

(c) Sletning af det Hind III-sted, der ligger nærmest Eco Ri-stedet i pEH3 pEH3 digereres med Eco RI til dannelse af lineære molekyler, som digereres med exonuclease III (EC 3.1.4.27) og derefter med SI nucle-20 ase (EC 3.1.4.-) til fjernelse af de 5'-udragende haler og til dannelse af stumpe ender. Derefter ligeres de lineære molely ler med T4-induceret DNA ligase (EC 6.5.1.1), og det således vundne plasmid anvendes til transformering af trp oEVl-stamme og selekteres for trp-komplementering og ampicillinresistens til opnåelse af plasmidet 25 ifølge opfindelsen, som betegnes pEH5 (vist i fig. 1).

Plasmidet pEH4 har som ovenfor omtalt følgende egenskaber:

En molekyllængde på 9866 bp; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III-ste-det, et Sal I-sted 275 bp fra Bam I-stedet, et Eco RI-sted 3709 bp fra Sal I-stedet; et andet Hind III-sted 31 bp fra Eco RI-stedet, et 30 Hpa I-sted 1950 bp fra det andet Hind III-sted, et andet Hpa I-sted 3250 bp fra det første Hpa I-sted og 305 bp fra det første Hind III-sted, hvor plasmidet har trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i portionen på 1950 bp mellem det andet Hind III-sted og det første

DK 159976 B

9 )Hpa I-sted; genet for tetracyclinresistens umiddelbart efter det første Hind III-sted og genet for ampicillinresistens i portionen på 3709 bp mellem Sal I-stedet og Eco Ri-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH4. pEH4 kan fremstilles på lignende måde som pEH3 bortset 5 fra, at selektionen udføres på basis af dets tetracyclinsensitivitet.

Som ovenfor nævnt, er det et særligt nyttigt træk ved de her omhandlede plasmider, at de har et klart defineret sted, som er bekvemt for indføringen af et ønsket eukaryotisk DNA-fragment, og at plasmidernes struktur er en sådan, at transcriptionen af det indførte DNA kontrol-10 leres af den trp-promotor, som er associeret med det definerede indføringssted, f.eks. Hind III-stedet i plasmidet pEH5 (illustreret i fig. 1). Dette plasmid udgør derfor et værdifuldt slutmellempro-dukt, af hvilket der kan fremstilles plasmider, i hvilke der på indsættelsesstedet, f.eks. Hind III-stedet, er indsat genetisk infor-15 mation i form af passende modficeret DNA, der er tilpasset til at fremstille et ønsket polypeptidprodukt.

I en anden udførelsesform angår opfindelsen et sådant plasmid, hvori der på indsættelsesstedet er indsat et eukaryotisk DNA-fragment. Det eukaryotiske DNA-fragment kan indsættes i det fremstillede plasmid 20 ved kendte metoder.

Fremgangsmåderne til fremstilling af det ønskede DNA, dets modifikation til indsætning og indsætningsfremgangsmåderne samt de efterfølgende fremgangsmåder til proteinfremstilling er generelt kendte og kan sammenfattes og eksemplificeres på følgende måde: 25 Fortegnelse over figurer fig. 1 viser plasmid pEH5, fig. 2 viser plasmid pEH3, fig. 3 viser plasmid pEH4, fig. 4 viser plasmid pWTIOl,

DK 159976 B

10 fig. 5 viser fremstilling af plasmiderne pWTlll, pWT121 og pWT131, fig. 6 viser pWT121 med indsat syntetisk hønsepestvirus (FPV)-gen (pWT121/FPB), fig. 7 viser agarosegel med restriktionsendonucleasestederne fra 5 Hpa I. Hind III og Bam HI i pEH3 og pEH4 og orientering af clonet trpE-DNA i disse plasmider, fig. 8 viser en 5% acrylamidgel med DNA-fragmenter fra pBR322, pEH3 og pEH4 efter digerering med Hpa I, Bam HI, Hind III og Sal I, fig. 9 viser overlevelse (%) på medium indeholdende stigende kon-10 centrationer af tetracyclin for E. coli W3110 trpoEVl-stammer: -Δ-plasmidfrie celler; med pEH4; -0- med pEH3, præinkuberet med tryptophan; - · - med pEH3, fig. 10 viser en 1% agarosegel, der viser fjernelse af Hind III- og Hpa-steder fra pEH3, 15 fig. 11 viser fremstilling og karakterisering af pWTlOl, fig. 12 viser ændringer under faseændring fra pWTlll til pWT131, fig. 13 viser Hae II-restriktionskort af pWT-plasmider, fig. 14 viser restriktion af faseændrede pWT-plasmider (111, 121, 131) og pAT153 med Bam HI og Pst I, 20 fig. 15 viser en 3,5% acrylamidgel med Pst I- og Bam HI-digererede Nic~-derivater af pWT131, 121 og 111 (b, c, d), pWT131 (a) og pATl53 (e), fig. 16 viser 3,5% acrylamidgel med Hind III-digereringer af henholdsvis pWT231 (a), 221 (b), 211 (c) og 131 (d), 1 fig. 17 viser 3,5% acrylamidgel med Hae II-digereringer af henholds-

DK 159976 B

11 vis pBR322 (a), pAT153 (b), pWT231 (c), pWT221 (d), pWT211 (e) og pWT131 (f).

(1) Kilde for det DNA, der skal indsættes 5 DNA til indsætning kan fås på mange forskellige måder. F.eks. kan oligonucleotider af forskellige længder syntetiseres ved kendte metoder (jfr. f.eks. Hsiung, et al. (1979), Nucleic Acids Research, 6, 1371-1385).

Mange oligonucleotider kan som følge af deres specifikke basepar-10 ringsegenskaber samles til længere dobbeltstrengede molekyler. Dette molekyles oligonucleotidkomponenter kan sammenknyttes (ligeres) ved hjælp af enzymet DNA-ligase.

Alternativt kan DNA-molekyler af ønsket genetisk specificitet syntetiseres ved anvendelse af enzymet "reverse transcriptase", idet der 15 som skabelon anvendes RNA af den ønskede specificitet. RNA'et kan isoleres fra celler ved kendte metoder.

(2) Fremstilling af DNA til indsætning DNA kan modificeres til indsætning i plasmidet ved mange forskellige metoder. F.eks. kan DNA fremstilles som beskrevet ovenfor på 3'-ter-20 minalen på hver af dobbeltstrengene forlænges ved hjælp af enzymet terminaltransferase (EC 2.7.7.31) til opnåelse af en homopolymer enkeltstrenget forlængelse. 3'-Terminalen på det Hind III-digererede plasmid kan ligeledes forlænges. Hvis forlængelsen af det fremstillede DNA er (dA)n, og forlængelsen af plasmidet er (dT)n eller vice 25 versa, eller hvis forlængelsen af det fremstillede DNA er (dG)n og forlængelsen af plasmidet (dC)n eller vice versa, kan DNA'et til indsætning og plasmidet hybridiseres ved disse enkeltstrengede forlængelser på en sådan måde, at der dannes cirkulære molekyler, hvor det fremstillede DNA er indsat i plasmidets Hind III-sted. Sådanne 30 plasmider kan anvendes til transformering af Escherichia coli-celler og kolonier af transformanterne udvalgt ved kendte metoder (jfr. f.eks. Glover, D., New Techniques in Biophysics og Cell Biology,

DK 159976 B

12 (Eds. Pain, R.H., og Smith, B.J.), S, 125-145, (Wiley, New York, 1976)). Alternativt kan enderne af det på den ovenfor beskrevne måde fremstillede DNA ligeres med enzymet DNA-ligase til korte dobbeltstrengede DNA-molekyler (Hind III-linkere, fås fra Collaborative 5 Research, Waltham, Mass., U.S.A.), der indeholder den sekvens, som genkendes af restriktionsenzymet Hind III. Ved digerering af disse molekyler med dette enzym efter ligeringen vil der fås Hind III-terminaler ved enderne af det fremstillede DNA. Det fremstillede DNA kan derefter indsættes i plasmidet efter digereringen med Hind III 10 ved kendte metoder.

(3) Fremstilling af peptid

De kendte mekanismer for virkningen af bakteriepromotorer sammen med de ovenfor angivne data førte til den konklusion, at når operatoren er åben, vil transcriptionen fra promotoren forløbe fra trpE og trpD 15 gennem Hind III-stedet og til regioner af genomet på den anden side af Hind III-stedet. Oversættelse af transcriptionsproduktet vil give et "read-through" polypeptid knyttet til D-genet (medmindre der i indsætningen er inkorporeret et termineringskodon). Det fremstillede polypeptid kan identificeres ved kendte metoder, f.eks. ved at over-20 føre plasmidet til en stamme, som producerer miniceller (jfr. f.eks.

Meagher, R.B., (1977), Cell, 10, 521-536), hvor polypeptidprodukterne af plasmidgenomer let erkendes, eller ved immunologiske metoder (jfr. f.eks. Broome, S., og Gilbert, W., (1978), Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A., 75, 2746-2749).

25 Read through-polypeptidet kan renses ved kendte metoder, og det ønskede polypeptidprodukt kan genereres ved digerering af polypepti-det ved specifikke kemiske eller enzymatiske metoder.

Som nævnt ovenfor kan plasmidet pEH5 ifølge opfindelsen anvendes som kilde for DNA, af hvilket der kan konstrueres en yderligere serie 30 plasmidvektorer, den såkaldte "pWT"-serie. Nærmere bestemt kan plasmidet pEH5 behandles med restriktionsendonuclease Hinf I (EC 3.1.23.22) til dannelse af et fragment på ca. 497 bp indeholdende den komplette trp-promotor, ledersekvens og de første 7 aminosyrer af

13 DK 159976 B

trpE. Det på denne måde vundne Hinf I-fragment kan derefter dones i Hind III-stedet i det kendte plasmid pBR322. Denne cloning kan udføres ved behandling af Hinf I-enderne i fragmentet med DNA-polymera-se I (EC.2.7.7.7) og udsætte de DNA-fyldte Hinf I-fragmenter for 5 indvirkning af Hind III-linkere i nærværelse af DNA-ligase og Hind III-restriktionendonuclease efter hinanden til tilvejebringelse af fragmentet med Hind III-"klæbrige ender".

Derefter kan Hinf I-fragmentet dones ind i plasmidet pBR322 ved Hind Ill-restriktion af pBR322 og ligation af det restriktionsbehandlede 10 plasmid med Hinf I-fragmentet.

Hinf I-fragmentet vil blive indsat i Hind III-stedet i pBR322 i én af to orienteringer som beskrevet ovenfor i forbindelse med pEH3 og 4.

En af disse, hvor trp-promotoren transcriberes i retning af tet-generne, selekteres ved restriktionsenzym-analyse af individuelle 15 doner. (Sekvensen af pBR322 er kendt, jfr. f.eks. Sutcliffe, J.G.,

Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, (1978), XL11, 77-90. Sekvensen af trp-promotor/operatoren er også kendt, jfr. f.eks. Bennett, G.N., et al. (1978), J. Mol. Bid., 121, 113-137, og Lee, F., et al. J. Mol. Biol., (1978), 121, 193-217).

20 Det resulterende plasmid betegnes her som pWTIOl, der er beskrevet ovenfor, og hvis struktur er illustreret i fig. 4. På grund af den ovenfor beskrevne fremstilling deraf har plasmidet pWTIOl to Hind III-steder, et i hver ende af det indsatte Hinf I-fragment fra det oprindelige pEH5. 1 2 3 4 5 6

Til sikring af at indsatte DNA vil blive anbragt ved siden af trp- 2 promotoren, er det nødvendigt at slette Hind III-stedet opstrøms trp- 3 promotoren, og dette kan udføres som beskrevet ovenfor ved restrik 4 tion af plasmidet pWTIOl med restriktionsendonuclease Eco RI, digere- 5 ring med exonuclease III og Si, behandling med DNA polymerase I (til 6 at fylde eventuelle asymmetriske ender produceret ved SI nuclease- digerering) og ligation af de frie ender i plasmidet til dannelse af det ovenfor beskrevne derivat af pWTIOl, der er betegnet pWTlll, som kun har ét Hind III-sted og det nedstrøms trp-promotoren.

DK 159976 B

14

Plasmidet pWTlll ifølge opfindelsen er således beregnet til at modtage indsat DNA på Hind III-stedet, hvilket resulterer i, at DNA'et er under direkte indflydelse af trp-promotoren. Transcription af det indsatte DNA kan let bekræftes, da plasmidet nedstrøms det indsatte 5 fragment indeholder genet for tetracyclinresistens, således at tran-scriptionen gennem det indsatte DNA forløber videre gennem tet-r-genet, der producerer tetracyclinresistens, som ikke produceres, hvis der ikke sker transcription gennem det indsatte DNA.

Afhængigt af arten af det DNA-fragment, som ønskes indsat, er det 10 nødvendigt at sikre korrekt orientering i plasmidet tilpasset fasningen af det DNA, der skal indsættes. Dobbeltstrenget cDNA fremstillet ved omvendt transcription fra mRNA indeholder således, hvis det er komplet, normalt en længde nucleotider som lederregion før proteinsekvensen. Af denne grund bliver oversættelse af proteinet som 15 en del af et sammensmeltet polypeptid i et plasmid såsom pWTlll (clonet ind ved Hind III-stedet) afhængig af antallet af nucleotider i lederen, dvs. ufuldstændig omvendt transcription kan reducere ledersekvensen og således ændre læserammen. Af denne grund vil det være essentielt, at expressionsplasmider konstrueres, så at de er i 20 stand til at oversætte for alle tre læserammer.

Plasmid pWTlll tillader oversættelse af DNA indsat på Hind III-stedet som et sammensmeltet polypeptid i kun én læseramme (hvis det indsatte DNA har sit eget funktionelle ribosom bindested, gælder dette ikke). Oversættelsen starter med de første 7 aminosyrer af trpE efterfulgt 25 af 2 aminosyrer fra Hind III-linker DNA og vil derefter forløbe ind i den indsatte sekvens. Hvis der ikke var nogen stopkodoner til stede i denne sekvens, ville oversættelsen slutte ved den første stopkoden i tetracyclinregionen.

Nucleotidsekvensen over Hind III-stedet i pBR322 viser, at den første 30 stopkodon for pWTlll er 26 nucleotider nedstrøms fra Hind III-stedet.

Til ændring af fasningen fra Hind III-stedet i pWTlll kan plasmidet, som beskrevet ovenfor, underkastes restriktionsbehandling med Hind III, 5'-forlængelserne fyldes med DNA-polymerase I, og Hind III-linker DNA-ligeres. Restriktion med Hind 111 til fjernelse af over-

DK 159976 B

15 skud af linkere og tilvejebringelse af "klæbrige ender" og religation gav "pWT121". Denne procedure tilføjer 14 bp DNA og ændrer læserammen fra det nye Hind III-sted (det gamle sted er nu ukomplet) med plus ét nucleotid.

5 Den tredje læseramme, dvs. pWTlll plus to nucleotider, bliver som omtalt ovenfor opnået ved at gentage samme serie af reaktioner på pWT121, og det resulterende plasmid betegnes "pWT131".

Strukturen af plasmiderne pWTlll, pWT121 og pWT131 fremgår af fig. 5.

Sekvenserne omkring Hind III-stedet i pWTlll, pWT121 og pWT131 er som 10 følger: pWTlll

Hind III-sted

5' ATG.CAA.ACA.CAA.AAA.CCG.ACT.CCA.AGC.TTT.AAT.GCG.-GT...3' pWTIU

15 Hind III-sted 5' ATG,CAA,ACA,CAA,AAA,CCG,ACT,CCA,AGC,TCC,‘aAG,CTT, -GGA,GCT,TTA,ATG,C...3' PWT131

Hind III-sted 20 5' ...AAA,CCG,ACT,CCA,AGC,TCC,AAG,CTG,CAA,GCT,TGG,AGC,- TTG,GAG,CTT,TAA,TG...3'

For oversigtens skyld viser de ovenstående sekvenser kun én streng af DNA'et.

Som illustration kan effektiviteten af plasmiderne pWTlll, pWT121 og 25 pWT131 som vektorer for indsatte DNA ses af de resultater, der fås ved, at der i pWT121, det plasmid, der i dette tilfælde har den korrekte fase, indsættes et syntetisk hønsepestvirus (FPV-gen) (jfr.

DK 159976 B

16 f.eks. britisk patentansøgning nr. 80 10777 og J.S. Emtage et al.

(1980), Nature, 283, 171-174).

Det ovennævnte syntetiske FPV-gen kan dones i pWT121 på følgende måde: 5 Plasmidet pWTl21 underkastes restriktionsbehandlingen med Hind III og behandles med alkalisk phosphatase (EC 3.1.3.1) til fjernelse af 5'-phosphatgrupperne. Hind III-linkere ligeres til enderne af det syntetiske FPV-gen, som derefter behandles med Hind III-restriktionsendo-nuclease til dannelse af Hind III-klæbrige ender. Det således behand-10 lede syntetiske FPV-gen og det Hind III-restriktionsbehandlede pWT121 ligeres derefter til dannelse af plasmidet pWT121/FPV. Alternativt kan det syntetiske FPV-gen dones i plasmidet pBR322 og derefter overføres til pWT121 på kendt måde.

Den generelle struktur af plasmidet pWT121/FPV fremgår af fig. 6.

15 Strukturen kan yderligere defineres som følger:

En molekyllængde på 6532 bp; et Hind III-sted; et Sma I-sted 365 bp fra Hind III-stedet; et Eco RI-sted 910 bp fra Sma I-stedet; et andet Hind III-sted 460 bp fra Eco Ri-stedet; et Bam Hi-sted 353 bp fra det andet Hind III-sted; et Sal I-sted 275 bp fra Bam Hi-stedet; et Pst 20 I-sted 2958 bp fra Sal I-stedet; et Hpa I-sted 1045 bp fra Pst I-stedet og 206 bp fra det første Hind III-sted; det syntetiske FPV-gen i delen på 1735 bp mellem det første og det andet Hind III-sted; genet for tetracyclinresistens strækkende sig fra det andet Hind III-sted til på den anden side af Bam Hi-stedet og genet for ampicillinresi-25 stens i området for Pst I-stedet.

Afhængigt af orienteringen af FPV-genet findes plasmidet at være tetracyclinresistent (som illustreret i fig. 6) eller tetracyclin-følsomt med FPV-genet i omvendt orientering.

Transformerede Escherichia coli-kolonier indeholdende pWT121/FPV-30 plasmiderne med hæmagglutinin(HA)-genet i hver orientering screenes for FPV-HA-antigen. Det viser sig, at tetracyclinresistente kolonier udtrykker et FPV-HA-antigen, hvilket bekræfter korrekt indsætning af

DK 159976 B

17 det syntetiske FPV-gen. De kolonier, i hvilke FPV-genet er orienteret som vist i fig. 6, viser tetracyclinresistens, og de kolonier, der har omvendt orientering, er tetracyclinfølsorame, I førstnævnte tilfælde er udtrykkeisen af HA-antigenet under trp-kontrol.

5 FPV-HA-antigenudtrykkelse kan bekræftes på følgende måde:

Escherichia coli-kolonier indeholdende det ovenfor beskrevne tetra-cyclinresistente pWTl21/FPV-plasmid screenes for FPV-HA-antigen under anvendelse af en fast-fase-immunologisk metode (jfr. f.eks. S. Broome og W. Gilbert (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 2746-2749).

10 Kort fortalt dyrker man små kulturer af individuelle kolonier, som høstes og lyseres under anvendelse af lysozym og "Triton" X-100 (Triton er et varemærke). ("Triton X-100” er isooctylphenoxypoly-ethoxyethanol, et ikke-ionisk detergent).

Tilstedeværende HA-sekvenser bindes til et polystyrenrør, der er 15 overtrukket med FPV-HA-specifikt IgG. Bundet antigen mærkes derefter specifikt med 125^^^, med høj specifik aktivitet.

Immunreaktiviteten påvises i alle kolonier indeholdende et FPV-HA-gen indsat; de kolonier, der kun indeholder det tilgrundliggende pWT121-plasmid, viser ikke nogen aktivitet (jfr. den nedenstående tabel): 20 _

Radioimmunoassay af FPV-HA i lysater af bakterier indeholdende pWT121/FPV-plasmider HA-indhold 25 Koloni nr. (ng/50 μΐ) Phenotype Indsætning

2 >20 Tcr A

5 0 Tcr

6 >20 Tcr A

8 0 Tcr

30 11 >20 Tcr A

13 0 Tcr 14 0 Tcr

DK 159976 B

18

15 >20 Tcr A

16 >20 Tcr A

Som anført ovenfor påvises der immunreaktivitet i alle kolonier inde-5 holdende et indsat FPV-HA-gen (A); de kolonier, som kun indeholder det tilgrundliggende pWT121-plasmid, viser ingen aktivitet.

I tilfælde af den såkaldte pWT-serie af udtrykkelsesplasmider er der ligesom med pBR322 den mulighed, at disse normalt mobiliserings -minus-plasmider (mob ) under passende betingelser kan mobiliseres 10 (dvs. overføres fra en bakterie til en anden). Det er for nylig blevet vist (jfr. f.eks. A.J. Twigg og D.J. Sherratt (1980), Nature 283, 216-218), at selv om DNA, der koder for Col El-mobilitetsprotein eller -proteiner, ikke er til stede i pBR322, kan dette protein alligevel inducere mobilitet ved transkomplementeringen, når det er 15 til stede i samme celle på et kompatibelt plasmid, såsom Col K.

Stedet for bindingen til mobilitetsproteinets eller mobilitetsproteinernes plasmid DNA er blevet vist at være det såkaldte "nic-sted" eller "overføringsudgangssted", (jfr. f.eks. G.J. Warren, et al.

(1978), Nature, 274, 259-261). Dette sted sidder f.eks. i pBR322 i 20 622 bp Hae IIB-fragmentet. Mutationer i mobilitetsgenet er mob . De kan imidlertid komplementeres med mob+ Col El-derivater eller relaterede plasmider, hvilket antyder et trans-virkende protein.

Plasmider af Col El-typen er ikke-konjugative, men mobiliseres, når der i cellen indføres en kønsfaktor, f.eks. en F'- eller R-faktor.

25 Mobiliseringen af et nic+-, men mob -plasmid såsom pBR322 kræver derfor tilstedeværelsen af to andre plasmider, nemlig en kønsfaktor og et kompatibelt mob+-plasmid af Col El-type.

Nic-stedet er specifikt nødvendigt for mobiliseringen, og plasmider, som ikke har dette sted, kan ikke komplementeres. 1

Selv om således pBR322 og plasmiderne af pWT-serien ikke indeholder alle mobilitetsgenerne, indeholder de alle nic-stedet og kan derfor 19

DK 15997 6 B

komplementeres for mobilitet. Til fremstilling af sikrere, ikke-mobile vektorer er det ønskeligt at fjerne nic-stedet. Dette kan f.eks. ske ved at slette et Hae II-fragment.

Nic-stedet kan fjernes fra plasmiderne pWTlll, pWT121 og pWT131 på 5 følgende måde:

En betragtning af Hae Il-restriktionskortene i de ovennævnte plas-mider viser, at kun to fragmenter (B og H) kan fjernes og stadig efterlade ampicillin- og tetracyclin-generne, trp-promotoren og replikationsudgangsstedet. Der henvises i denne sammenhæng til fig.

10 13. Fragment B er 622 bp, og fragment H er 83 bp. Nic -plasmider (minus B og H) mangler derfor 705 bp. Dette må naturligvis tages i betragtning ved karakteriseringen af nic -derivaterne af de ovennævnte plasmider. Således er f.eks. i pWTlll (nic ) Pst I-stedet 2253 bp fra Sal I-stedet.

15 Nic~-derivaterne af pWTlll, pWT121 og pWT131 betegnes henholdsvis pWT211, pWT221 og pWT231.

Det første trin i dette eksempel på en fjernelsesprocedure er partielt at digerere plasmidet, således at hvert molekyle gennemsnitligt spaltes to eller tre gange. Digereringsprodukterne religeres derpå 20 under anvendelse af T4 DNA-ligase, og det ligerede DNA transformeres til Escherichia coli K12, f.eks. HB101. Transformanter selekteres på ampicillin og tetracyclin under anvendelse af minimale agarplader til inducering af trp-transcription og sikring af tetracyclinresistens.

De resulterende kolonier vil indeholde de igen ringsluttede udgangs-25 plasmider samt eksempler, der mangler et af eller begge Hae Il-fragmenterne. De sidstnævnte kan identificeres ved screening af enkeltkolonier og observation for plasmider, som er mindre end udgangs-plasmidet. Potentielle nic -derivater kan bekræftes ved restriktionsenzymanalyse af renset plasmid DNA. 1 I stedet for at anvende den ovenfor som et illustrerende eksempel angivne fremgangsmåde omfattende partielle restriktioner, der nødvendiggør screeningen af måske hundredevis af kolonier, er det al-

DK 159976 B

20 mindeligvis mere bekvemt at konstruere nic -derivaterne på den måde, som fremgår af fig. 14.

Kort fortalt underkastes pWT-plasmiderne restriktionsbehandling med Pst I og Bam HI, og bånd, der indeholder trp p/o-regionen, isoleres 5 fra polyacrylamidgeler. Plasmid pAT153 (nic ) underkastes restriktionsbehandling med Pst I og Bam HI, og båndet på 2531 bp isoleres fra en polyacrylamidgel. De førstnævnte bånd ligeres individuelt med det sidstnævnte bånd under anvendelse af T4 DNA-ligase, og det lige-rede materiale anvendes til transformation af Escherichia coli HB 10 101. DNA fra enkeltkolonier kan isoleres og dets struktur bekræftes ved restriktionsenzymanalyse, f.eks. Hae II-digereringsprodukter af pATl53, pWT-serien og pWT (nic )-serien.

Nic -derivaterne kan med andre ord konstrueres ved substitution af den region i pWT-plasmiderne, som grænser op til Pst I- og Bam HI-15 stederne indeholdende replikationsudgangsstedet og nic-stedet med den tilsvarende region fra pAT153, som er et sletningsderivat af pBR322 og mangler 622 bp Hae IIB-fragmentet og det nabostillede 83 bp Hae IIH-fragment.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende detaillerede eksempler: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fremstilling af pEH3, pEH4 og pEH5: 2

Kulturer af Escherichia coli, stamme K12 HB101 (jfr. f.eks. Boyer, 3 H., et al, (1969), J. Mol. Biol., 41, 459-472) indeholdende plasmidet 4 pBR322 dyrkes enten i L-bouillon eller i M9-salte, glucose, casami- 5 nosyrer medium (jfr. f.eks. Miller, J.H., Experiments in Molecular 6

Genetics, Appendix 1, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (1972), 7 431-435). Ved en A^qq på 0,6 sættes der chloramphenicol til plas- 8 midkulturerne til en slutkoncentration på 150 pg/ml, og irikuberingen 9 fortsættes i 16 timer ved 37°C. DNA isoleres fra cellelysater ved 10 centrifugering i CsCl/ethidiumbromid-gradienter (jfr. f.eks. Katz, 11 L., et al, (1975), J. Bacteriol, 114, 577-591; og Wensink, P.C., et al, (1974), Cell, 3, 315-325). DNA-bånd fjernes ved sidepunktur med en 1 ml sprøjte og en 16 G nål under belysning fra 366 nm UV-lys, og

DK 159976 B

21 ethidiumbromid fjernes ved passage gennem "Dowex AG50" (Dowex er varemærke) (sur kationbytterharpiks).

Alle DNA-opløsninger dialyseres mod TE-puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH-værdi 7,5) til fjernelse af overskud af CsCl, koncentreres ved 5 ethanoludfældning og opbevares ved -70°C. Den vundne DNA-blanding digereres med Hind III på følgende måde: 2 /ig pBR322 inkuberes med 5 enheder Hind III i en puffer indeholdende 50 mM Tris-HCl pH-værdi 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5mM /3-mercapto-ethanol og 2mM dithiothreitol. Inkuberingen foretages ved 37°C i 90 10 minutter i et rumfang på 40 μΐ. Reaktionen afsluttes derefter ved 5 minutters inkubation ved 65°C,

Isolering af Hind III trp-E-fragmentet: 20 /ig pRHl/trpE grænsedigereres med Hind III og underkastes elek-trophorose på 1% agarosegeler, og båndet indeholdende lineært trpE 15 fjernes. trpE-Fragmentet fjernes fra gelskiven ved elektrophorese over i en dialysepose og efterfølgende phenolekstraktion og ethanol-udfældning.

Ligation

Ligaseinkubationerne indeholder 0,2 μ% af trpE-fragmentet, 0,4 pg af 20 Hind III-restriktionsbehandlet pBR322 og 0,1 enhed T^-polynucleotid-ligase pr. 20 μΐ reaktionspuffer. Reaktionsblandingen inkuberes i 4 timer ved 16°C.

Transformation 0,01 μg af det ligerede DNA anvendes til transformering af Escheri-25 chia coli W3110 trp-o-E V 1-stamme.

DK 159976 B

22

Der udvælges ampicillin-resistente recombinanter, der er i stand til at komplementere disse trpE -celler. Pr. Mg plasmid DNA fås 1,2 x 10^ amp-r-kolonier, der kan gro i fravær af tryptophan.

50 af disse kolonier udvælges tilfældigt og overføres ved hjælp af 5 tandstikker på minimale agarplader (jvf. f.eks. Miller, J.H., loc. cit.), der indeholder 100 Mg/ml ampicillin og 12,5 Mg/ml tetracyclin.

31 af de 50 kolonier voksede efter inkubation natten over, hvilket angiver tilstedeværelse af et tetracyclin-resistent protein i denne population.

10 Plasmid-DNA isoleres fra repræsentative kolonier af de tetracyclin-følsomme og -resistente grupper, og Hind III-fragmentmønstrene analyseres ved gelelectrophorese på 1% agarosegeler. Plasmid-DNA fra alle de ampicillin-resistente, trp+-cloner indeholder moder-pBR322 DNA med Mr 2,8 x 10® (4,361 kb) og E Coli Hind III trpE-fragmentet med Mr 3,5 15 x 10® (5,350 kb). De resulterende plasmider underkastes følgende yderligere procedurer til bekræftelse af deres struktur.

Orientering af trpE-fragmentet

En konsekvens af religatering af Hind III digereringer af pBR322 med trpE-fragmentet er, at trpE-fragmentet kan indsættes i én af to 20 forskellige orienteringer. Transcription fra trp-promoteren kan forløbe enten gennem plasmidets tet-gen eller bort fra tet-genet. Orienteringen af det tet-resistente plasmid (pEH3) og det tet-føl-somme plasmid (pEH4) bestemmes (jvf. f.eks. Bennett, Μ. E., et al.

(1976), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73, 2351 - 2355) i lyset af 25 eksisterende Hpa I-steder i trpE-fragmentet og Bam HI-steder i pBR322 (jvf. f.eks. Bolivar, F., et al., loc. cit). Fig. 7 viser resultaterne af begrænset digerering af plasmiderne pBR322, pEH3 og pEH4 med enten Hind III, Hpa I (EC 3.1.23.23), Bam HI (EC 3.1.23.6) eller en kombination af disse enzymer. 1

Fig. 7 viser en agarosegel med restriktionsendonucleasestedeme for

DK 159976 B

23

Hpa I, Hind III og Bam HI i pEH3 og pEH4 og orienteringen af det clonede trpE-DNA i disse plasmider.

Sporene a til j indeholder følgende DNA med størrelser i kllobasepar (kb) : 5 a) PM2 DNA digereret med Hind III som størrelsesmarkører. Synlige bånd er 1 til 6 af størrelse henholdsvis 5,4, 2,35, 1,05, 0,475, 0,45 og 0,27 kb.

j) λ c.I857,S7 DNA digereret med Hind III som størrelsesmarkør.

Synlige bånd er A til G af størrelse henholdsvis 21,79, 9,38, 6,30, 10 4,20, 2,38, 2,11 og 0,47 kb.

b) Super-coiled pBR322 DNA.

c) pBR322 inkuberet med Hpa I.

d) pEH3 digereret med Hind III.

e) pEH3 digereret med Hind III og Hpa I. Båndene måler 4,3, 3,25, 15 1,95 og 0,30 kb.

f) pBR322 digereret med Bam HI.

g) pEH3 digereret med Bam HI.

h) pEH4 digereret med Bam HI og Hpa I. De komplette digereringsfrag-menter måler 5,7, 3,25 og 0,67 kb.

20 i) pEH3 digereret med Bam HI og Hpa I. De komplette digereringsfrag-menter måler 4,3, 3,25 og 2,4 kb.)

Der er ingen Hpa I-steder i pBR322 (jfr. banerne b og c) og ingen Bam Hi-steder i trpE (jfr. banerne f og g). Både pEH3 og pEH4 giver lineære pBR322- og trpE-fragmenter, når de begrænses med Hind III 25 alene (bane d). Dobbeltdigereringer af pEH3 og pEH4 med Hind III og Hpa I giver også identiske profiler (bane e). I dette tilfælde regenereres lineær pBR322 (4,360 kb) sammen med tre andre fragmenter på

DK 159976 B

24 3250, 1950 og 305 bp. Eftersom pBR322 ikke har nogen Hpa I-mål (jvf. f.eks. Bolivar, F., et al., loc. cit.), må det konkluderes, at der er to Hpa I-mål i trpE-fragmentet. Det ene er allerede rapporteret og ligger i promotor-området (jvf. f.eks. Bennett, Μ. E., et al., loc.

5 cit.), det andet sted ligger ca. 300 bp fra et af Hind III-stederne.

Der anvendes dobbeltdigereringer med Bam HI og Hpa I til bestemmelse af trpE-fragmentets orientering og positionen for det andet Hpa I-sted. De resulterende fragmenter er vist i bane h for pEH4 og i bane i for pEH3. Det er klart, at disse plasmider indeholder trpE-fragmen-10 ter i forskellige orienteringer. Størrelsen af det mindste fragment afledt af pEH4 vurderes lettere ud fra de resultater, der er vist i fig. 8 på tegningen. Fig. 8 viser de små fragmenter, der stammer fra restriktionsdigereringer af pEH3, pEH4 og pBR322 med Sal I (EC 3.1.23.27), Bam HI, Hpa I, Eco RI og Hind III.

15 (Fig. 8 viser en 52's acrylamidgel med DNA-fragmenter af lav molekylvægt fra pBR322, pEH3 og pEH4 efter digerering med Hpa I, Bam HI,

Hind III og Sal I restriktionsendonuclease. Sporene a til i indeholder følgende DNA med størrelser i basepar (bp): a,i) PM2 DNA digereret med Hind III som størrelsesmarkør. Størrelsen 20 af båndene 1 til 7 er henholdsvis 5400, 2350, 1050, 475, 450, 270 og 110 bp.

b) pEH3 digereret med Bam HI og Hpa I.

c) pEH4 digereret med Bam HI og Hpa I. Det mindste bånd vurderes til 640 bp.

25 d) pEH3 digereret med Hind III og Hpa I. Det mindste bånd vurderes til 295 bp.

e) pBR322 digereret med Bam HI og Sal I. Det mindste bånd vurderes til 275 bp.

f) pBR322 digereret med Hind III og Sal I. Det mindste bånd vurderes 30 til 620 bp.

DK 159976 B

25 g) pBR322 digereret med Bam HI og Hind III. Det mindste bånd vurderes til 350 bp.

h) pBR322 digereret med Eco RI og Hind III. Det mindste bånd vurderes til 25 bp.) 5 Ud fra de ovennævnte resultater er restriktionskortene for pEH3 og pEH4 konstrueret, som vist i fig. 2 og fig. 3. At det andet Hpa listed ligger "opstrøms" i forhold til trp-promotoren, er baseret på kendt størrelse af trpE-proteinet, anthranilat synthetase og det trpD-fragment, der er indeholdt i Hind III trpE-fragmentet. An-10 thranilat-synthetase er et protein på 60.000 Daltons (jvf. f.eks.

Ito, J., et al., (1969), J, Bacteriol, 97, 725 - 733) (ca. 500 aminosyrer), medens kun ca. 1/6 af trpD-proteingenet (svarende til 275 bp) er specificeret af dette Hind Ill-fragment (jvf. f.eks. Hopkins, A.S., et al., (1976), J. Mol. Biol., 107, 549 - 569). Der kræves 15 således en DNA-længde på ca. 1800 bp til specifikation af disse polypeptider. Der er desuden 162 baser i ledersekvensen ved 5'-enden af trp mRNA og yderligere 11 baser fra begyndelsen af trp mRNA til Hpa I-målet i trp-promotoren (jvf. f.eks. Lee, F., et al., (1978), J.

Mol. Biol., 121, 193 - 217). Denne samlede størrelse på 1948 bp 20 mellem Hpa I og Hind III er i overensstemmelse med Hpa I -Hind III-afstanden på 1950 bp, der er bestemt ved gelanalyser, og stemmer overens med den konklusion, at det andet Hpa-sted ligger "opstrøms" i forhold til trp-promotoren.

Regulering af tetracyclin-følsomhed fra trp-promotoren 25 Ved at anbringe det lille Hpa I-Hind Ill-fragment "opstrøms" i forhold til trp-promotoren angives utvetydigt, at transcription fra trp-promoteren i den tetracyclin-resistente gruppe af plasmider (pEH3) styres mod tetracyclingenet, medens det modsatte gælder det tetracyc-lin-følsomme plasmid (pEH4). På grundlag heraf må det forventes, at 30 udtrykkelse af tetracyclingenet i pEH3 reguleres fra trp-promotoren, og at enhver indsættelse i Hind III-stedet hos pBR322 ødelægger te tracyc1inpromotoren.

DK 159976 B

26

Dette er blevet testet ved undersøgelse af tetracyclin-resistensen hos pEH3-indeholdende E. coli dyrket i nærværelse og fravær af tryptophan, hl.a. under betingelser, hvor trp-generne enten burde undertrykkes eller af-undertrykkes. Plasmid pEH3 i stammen W3110 trp o EV1 5 dyrkes på et medium indeholdende M9-salte, glucose, casaminosyrer og 5/ig/ml tetracyclin. Ved et på 0,05 deles kulturen, og 200 /ig/ml tryptophan sættes til den ene halvdel. Efter inkubation i yderligere 1 time fortyndes cellerne og udsås på agarplader indeholdende stigende koncentrationer af tetracyclin. De celler, der dyrkes i 1 time på 10 200 /ig/ml tryptophan, dyrkes på minimale agarplader suppleret med tryptophan.

Resultaterne af disse forsøgsrækker er vist i fig. 9.

(Fig. 9 viser effektiviteten af at udså trp o E V 1-stammen og dens derivater på stigende koncentrationer af tetracyclin. Kulturer af trp 15 o E V1-stammen indeholdende de angivne plasmider dyrkes i nærmere bestemte medier og behandles som beskrevet nedenfor. Overlevelsesprocenten bestemmes i forhold til den pågældende plade, der ikke indeholder tetracyclin. Der anvendes plader med 80 - 400 kolonier til bestemmelse af overlevelsesprocenten. Følgende tetracyclinkoncentra-20 tioner, der er i stand til at dræbe 50% af celler, bestemt ved kolo-ni-assay (EOP 50%), måles ud fra figuren: 12 /ig/ml for plasmid-frie celler; 4,5 /ig/ml for pEH4-holdige celler; 23 /ig/ml for pEH3-holdige celler, der er præ-inkuberet med 200 μg/ml tryptophan; 56 /ig/ml for pEH3-holdige celler, der dyrkes uden tryptophan).

25 Tilstedeværelsen af tryptophan i mediet forårsager en 2,5-dobbelt stigning i tetracyclin-resistensen forårsaget af pEH3. Lignende forsøg med pEH4 og plasmid-fri W3110 trp o E71 (hvor det første initialvækstmedium ikke indeholder tetracyclin) viser, at disse bakterier er følsomme over for meget lave koncentrationer af tetracyclin. 1

Det Hind Ill-sted, der er nabostillet til Eco RI af pEH3, fjernes på følgende måde til fremstilling af plasmid pEH5:

DK 159976 B

27 20 /xg pEH3 fremstillet som beskrevet ovenfor digereres med Eco RI, gelfiltreres på "Sephadex ® G-50" (perleformet tværbundet dextrangel) i 50 mM natriumchlorid med 0,1% v/w SDS, og det udelukkede DNA-maksi-mum koncentreres ved hjælp af ethanoludfældning og opløses i vand.

5 Det lineære Eco RI-digererede pEH3 digereres med exonuclease III ved 20eC. Blandingen indeholder 10 /ig lineært plasmid, 60 mM Tris med pH-værdi 8, 0,66 mM magnesiumchlorid, 4mM dithiothreitol og 40 enheder exonuclease III i et totalvolumen på 200 μΐ. 100 μΐ aliquoter (5 μg) fjernes efter 5 og 10 minutter, ekstraheres med phenol og chloroform 10 og fældes med ethanol.

5 μg exonuclease ΙΙΙ-behandlet plasmid behandles med Sl-nuclease i 15 minutter ved 30eC i et volumen på 100 μΐ, hvorved der fås stumpe ender. Reaktionsblandingen indeholder 150 mM natriumchlorid, 25 mM natriumacetat med pH-værdi 4,6, 0,1 mM zinksulfat, DNA og 2,5 enheder 15 Sl-nuclease. Efter inkubation ekstraheres blandingen med phenol og chloroform og fældes derefter med ethanol. 3 μg Sl-digereret DNA ligeres i et slutvolumen på 10 μΐ med 1 μΐ T4 DNA-ligase (0,8 enheder) ved 15°C i 16 timer og dernæst ved 4eC i 24 timer.

(Fig. 10 viser en 1%'s agarosegel, der viser fjernelse af Hind III-20 og Hpa I-steder fra pEH3.

Sporene a til i indeholder følgende DNA med størrelser i kilobasepar (kb): a,i) λ cI857,S7 digereret med Hind III som størrelsesmarkør. Synlige bånd i agarose er A til F af størrelsen henholdsvis 21,79, 9,38, 6,30 25 og 4,20 kb; b) pEH3 digereret med Hind III; c) pEH3 digereret med Sal I; d) forenede kolonier digereret med Hind III; e) pEH5 digereret med Hind III;

DK 159976B

28 f) pEH505 digereret med Hind IH (PEH505 er et laboratorieplasmid i familie med plasmidet pEH5); g) pEH5 digereret med Hpa I;

Fremstilling af plasmider af pWT-serien 5 Bakterier og plasmider

De anvendte bakteriestammer er begge Escherichia coli Kl2-derivater; HB101 F" pro leu thi lac Y strr rk' mk* Endo 1* rec A* & ED8689 trpR" rk" mk+.

Medier og transformation 10 Kulturer dyrkes i M9-salte, glucose, casaminosyrermedium (jvf. f.eks.

Miller, J. H., loc. clt.) til plasmid-DNA-præparationer og tetra-cyclin-følsomhedstestning. Til plasmid-holdige stammer sættes antibiotika i passende koncentration. Celler til brug ved transformation dyrkes i L-medium.

15 Under hele tetracyclin-følsomhedstesten udplades celler på M9, glucose, casaminosyrer-minimum agar, der er suppleret med 0 til 80 /ig/ml tetracyclin, 20 /ig/ml 3/3- indolacrylsyre eller 100 /ig/ml tryptophan, hvor det er angivet.

Glovers (loc. cit.) transformationsprotokol følges. Cellerne udplan-20 tes enten på næringsagar nr. 2 suppleret med 100 /ig/ml ampicillin eller på M9, glucose, casaminosyrer-minimum agar 2 suppleret med 100 /tg/ml ampicillin eller 10 /ig/ml tetracyclin.

Fremstilling af plasmid DNA

DK 159976B

29

Plasmid DNA fremstilles enten som beskrevet ovenfor for pEH5 eller ved phenol/chloroform-ekstraktioner af klarede lysater efterfulgt af isopropanolfældning af DNA og endelig gensuspension i TE-puffer (10 mM Tris-HCl, pH-værdi 7,5, 1 mM EDTA).

5 Enzymreaktioner

Restriktions-endonuclease-digereringer: DNA-restriktions-digereringer udføres i et enten højt eller lavt saltpuffer-system ved 37°C i 2 timer, idet reaktionsvolumenet varierer fra 10 til 200 μΐ og mængden af tilsat enzym fra 1 til 20 en-10 heder pr. /zg plasmid DNA. Bam HI-, Eco RI-, Hha I- (EC 3.1.23.19),

Hind III- og Pst I- (EC 3,1,23.31) digereringer udføres i 10 mM Tris-HCl med pH-værdi 7,5, 10 mM magnesiurachlorid, 50 mM natriumchlorid, 1 mM dithiothreitol og 100 /zg/ml gelatine. Hvad angår Hpa I-digere-ringer, afviger reaktionsblandingen kun derved, at 50 mM natrium-15 chlorid erstattes af 5 mM natriumchlorid. Hinf I virker lige godt i begge reaktionsblandinger.

Hvor plasmid DNA, der ikke er fremstillet ved cæsiumchlorid/ethidium-bromidmetoden, digereres, indeholder reaktionsblandingen også ribo-nuclease af typen I-A (varmebehandlet i 10 minutter ved 95®C til 20 fjernelse af eventuel DNA-aseaktivitet) ved 50 pg/ml til fjernelse af RNA, der udfælder sammen med DNA ved rensning.

Alle reaktioner afsluttes med opvarmning til 65®C i 5 minutter.

Ligation

Ligationer med sammenhængende ender udføres ved volumener på fra 10 25 til 20 μΐ i 50 mM Tris-HCl ved pH-værdi 7,8, 10 mM magnesiumchlorid, 20 mM dithiothreitol, 1 mM ATP under anvendelse af 0,01 - 0,02 enheder ligase for 0,5 - 3/zg DNA. Reaktionerne inkuberes natten over ved 15°C. Til ligationer med stumpe ender anvendes samme reaktions-

DK 159976 B

30 blanding, men ligasen øges til fra 0,2 til 0,6 enheder for 1 - 3pg DNA og inkubationstemperaturen hæves til 25°C.

DNA-polymerase I-opfyldning af 5'-forlængelser: 0,5 - 3,5 pg DNA polymerasefyldes i 50 mM Tris-HCl ved pH-værdi 7,8, 5 10 mM raagnesiumchlorid, ImM /J-mercaptoethanol, 0,1 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP i et volumen på 50 pi under anvendelse af 0,25 - 1,5 enheder polymerase. Blandingen inkuberes i 10 minutter ved 10°C, hvorefter en aliquot kan anvendes direkte til ligation med stumpe ender, eller det hele phenol/chloroformen ekstraheres, hvor-10 efter der udfældes med ethanol.

Polynucleotidkinasering af Hind III-linker-DNA

2,5 pg decamer Hind III-linker kinaseres i 60 minutter ved 37°C med 10 enheder kinase i 25 mM Tris-HCl ved pH-værdi 7,8, 5 mM magnesium- chlorid, 0,125 mM ATP, 25 pg/ml bovint serumalbumin. 5'-endepunkterne 32 15 mærkes ved tilsætning af 100 pCi (γ- P) ATP (3000 Ci/millimol) til reaktionen. Reaktionen afsluttes ved tilsætning af SDS til 0,1% w/v og EDTA til 10 mM, og det hele chromatograferes på en søjle på 30 x 0,7 cm af "Sephadex G-50"® (SF) ekvilibreret i 50 mM natriumchlorid pr. 0,1% w/v SDS. De ekskluderes fraktioner samles, ethanolfældes og 20 resuspenderes i vand til 50 pg/ml.

Bakteriel alkaliphosphatase-behandling af Hind III begrænset pBR322: 5 - 10 pg lineæriseret pBR322 i 20 mM Tris-HCl med pH-værdi 7,5 og 0,1% w/v SDS behandles med 5 pg bakteriel alkaliphosphatase i 60 minutter ved 37°C. Dette ekstraheres derefter med phenol/chloroform, 25 og DNA ethanolfældes.

Exonuclease III og Sl-nucleasedigerering af Eco RI begrænset pWTIOl: Fremgangsmåden er den samme som beskrevet for fjernelsen af Hind III-

DK 159976B

31 stedet i pEH3, bortset fra, at 3,3 /*g - aliquoterne fjernes efter 1, 3 og 5 minutter exonuclease III-digerering.

Fremstilling af gelprøver fra helcellelysater

Til fremstilling "helcellelyse"-agarosegeler samles en repræsentativ 5 prøve af plasmid-holdige celler fra en kulturplade ved hjælp af en steril plastløkke og resuspenderes i 200 μΐ agaroseelectrophorese-puffer. Hertil sættes 50 μΐ "Ficoll"-puffer (5% w/v SDS, 10% w/v Ficoll (copolymer af saccharose og epichlorhydrin) og 0,06% w/v bromphenolblåt), og blandingen inkuberes ved 65eC i 30 minutter, 10 hvorved cellerne lyseres og derefter hvirvles rundt i 1 minut. Ca.

40 μ! af en sådan prøve var tilstrækkelig til plasmididentifikation.

RNA, der er til stede sammen med DNA, kan fjernes enten ved at sætte op til 50 /ig/ml ribonuclease til prøven, efterfulgt at inkubation i 30 minutter ved 37°C, eller ved at sætte det direkte til agarosegel-15 matrixen op til 1 /ig/ml. Begge metoder fjerner RNA-pletten, som ellers vil være til stede på gelen.

Gelelektroforese 20 x 15 x 0,5 cm agarosegeler af sammensætning fra 0,8 til 1,4% køres under konventionelle betingelser. Gelerne udsættes enten for elektro-20 forese ved 40 volt natten over eller i 3 timer ved 120 volt, hvorefter de farves og fotograferes.

20 x 15 x 0,15 cm acrylamidgeler med sammensætning fra 5 til 10% anvendes til at identificere små restriktionsfragmenter. Der farves og fotograferes som nævnt ovenfor.

25 Isolering af trp-promotor-operator-ffinf I-fragment og fæstnelse af Hind Ill-linker.

6 μξ pEH5 Hinf I-begrænses og elektroforeres på en acrylamidgel (5% w/v), hvorefter 497 bp Hinf I-trp-promotor-operatoren og co-migre-

DK 159976 B

32 rende pBR322-bånd udskæres fra gelen, og DNA ekstraheres på kendt måde.

Hinf I-enderne fyldes derefter med DNA-polymerase I, og Hind III-linker tilknyttes ved stump-ende-ligation i et forhold på 50 linker-5 fragmenter pr. Hinf I-fragment (dette reducerer muligheden for, at Hinf I-fragmenteme selvligerer). Der fremstilles klæbrige ender ved at begrænse blandingen med Hind III, DNA ethanolfældes, resuspenderes i 50 μΐ 50 mM natriumchlorid, 0,1% w/v SDS, hvorefter det hele chro-matograferes på en søjle på 50 x 0,7 cm "G150 Sephadex" (forækvili-10 breret med 50 mM natriumchlorid og 0,1% w/v SDS). Den ekskluderede top samles, og DNA ethanolfældes.

Konstruktion af pWTlOl

Den fuldstændige E. coli-trp-promotor-, operator-, ledersekvens og de første syv aminosyrer af trpE er indeholdt I et Hinf I-fragment på 15 ca. 497 bp i pEH5. 497 bp Hinf I-fragmentet dones til Hind III-stedet af pBR322 ved hjælp af decamer Hind III-linker-DNA. For at opnå dette, må Hinf I-enderne først fyldes med DNA-polymerase I for at muliggøre vedhæftning af linker-DNA. Fragmentet ligeres derpå til bakteriel alkalisk phosphatase-behandlet Hind III-skåret pBR322, og 20 blandingen anvendes til at transformere E. coli HB101 under udnyttelse af en næringsagarampicillinselektion. Der fås en samlet mængde på 582 kolonier fra transformationen.

Cloning til Hind III-stedet af pBR322 inaktiverer tetracyclinpromo-toren, hvorved enhver transformant bliver tetracyclin-følsom, med-25 mindre det clonede stykke har sin egen promotor, der transcriberer over i tetracyclingenerne. Da Hinf I-fragmentet indeholder trp-promoter -oper ator -området, bør de transformanter, der indeholder et plasmid med fragmentet clonet i den korrekte orientering, dvs. tran-scriberende mod tetracyclin-promoteren, være tetracyclin-resistente.

30 For at afprøve dette, påføres 48 tilfældigt valgte kolonier fra ampicillin-transformationspladerne på minimale agarplader med M9 casamino-syrer suppleret med 10 /ig/ml tetracyclin. Heraf var 11 tetracyclin-resistente, hvilket var det forventede antal, idet der

DK 159976 B

33 ved tilstedeværelse af to fragmenter var en mulighed på 1:4 for at få den korrekte orientering.

Tilstedeværelse af indsat DNA kan også bekræftes ved at tage kolonier fra begge sæt plader og afprøve dem mod en pBR322-kontrol ved hjælp 5 af helcelleagarosegeler. Ved disse metoder isoleres ampicillin-resi-stente, og ampicillin- og tetracyclin-resistente kolonier, der indeholder plasmider med indsat DNA. Plasmid-DNA'er fremstilles fra et antal af disse kolonier til restriktionsendonucleaseanalyse.

Fig. 11 viser fremstillingen og karakteriseringen af pWTIOl og kan 10 fortolkes på følgende måde: a) pEH5 digereret med Hinf I og Hpa I; b) pEH5 digereret med Hinf I alene; c) pWTIOl digereret med Hind III; d) pWTIOl digereret med Hind III og Hpa I.

Konstruktion af pWTIOl 15 Fjernelse af Hind III-stedet distalt i forhold til trp-promotoren.

Det distale Hind III-sted fjernes ved hjælp af Eco Ri-spaltning efterfulgt at fjernelse af DNA ved exonuclease III- og SI-nuclease digerering. Der medtages også et DNA-polymerase I-trin forud for ligering for at udfylde alle asymmetriske ender, der er tilbage efter 20 Sl-nucleasedigerering.

Der vælges digereringstider på 1, 3 og 5 minutter.

De tre DNA-blandinger efter Eco RI-restriktion, exonuclease III-digerering (1, 3 og 5 minutter), DNA-polymerase I-udfyldning og stump-ende-ligering anvendes til at transformere HBlOl-celler. En 25 dobbelt antibiotikumselektion anvendes ved udsåning på M9, casamino-syrerminimalagar suppleret med ampicillin og tetracyclin; den dobbelte selektion sikrer, at ^-lactamase- og tetracyclingenerne forbliver intakte.

DK 159976B

34

Til yderligere karakterisering af de mulige deletanter udvælges to transformanter både fra 1-minuts- og 5-minutsfraktionen samt fire fra 3 -minutsfraktionen.

Karakterisering af deletantplasmiderne 5 Ingen af de 8 plasmider producerer et 512 bp-fragment, når de skærers med Hind III, og alle vandrer til en position over 4,36 kb-fragmentet af Hind III-begrænset pWTIOl. Alle plasmider dobbeltdlgereres med Hpa I og Pst I, hvorved der produceres to fragmenter, hvoraf det mindste strækker sig over det pågældende område (området omkring Eco RI-10 stedet i pWTIOl). Størrelserne af de fragmenter, der generers i pWTIOl, er 3777 og 1096 bp. Nærmere undersøgelser viser klart, at sidstnævnte fragment er fjernet i alle tilfælde, medens det førstnævnte, som ventet, er forblevet uændret. Mængderne af fjernet DNA ligger fra 51 bp i pWTlll (1 minuts exonuclease III-digerering) til 15 361 bp i pWT118 (5 minutters exonuclease III-digerering).

Da det har vist sig, at pWTlll fik fjernet den mindste mængde DNA, og tetracyclin-effektiviteten af udsåningsresultaterne viser, at det er lige så effektivt som pWTIOl til transcription fra trp-promotoren, er det valgt som Hind III-cloningsmiddel til anvendelse ved oversættel-20 sesfaseændring.

Konstruktion af pWT121

For at ændre fasingen fra /find-stedet af pWTlll fyldes 5'-extensionen med DNA-polymerase I og ligeres på Hind Ill-linker DNA, begrænses med Hind III til fjernelse af overskud af linker og til dannelse af 25 klæbrige ender, hvorefter der ligeres endnu en gang. Herved tilføjes 14 bp DNA, og læserammen ændres fra det nye Hind III-sted (det gamle sted er nu ufuldstændigt) med plus ét nucleotid.

DK 159976B

35

Konstruktion af pWTl31

Den tredje læseramme dvs. pWTlll plus 2 nucleotider, fås ved at gentage de samme serier reaktioner på dette faseændrede plasmid.

Disse plasmider producerer, ligesom pWTlll, små polypeptider, der 5 initieres ved begyndelsen af trpE og afsluttes ved stopkodoner (forskellige i hvert tilfælde) foran tetracylingenerne. På grund af ændringerne i "læserammen" har imidlertid alle polypeptiderne imidlertid forskellige C-terminal-aminosyresekvenser, skønt N-terminal-sekvenserne er de samme.

10 Fig. 12 viser de ændringer, der sker under faseændringen fra pWTlll pWT131. Figuren kan fortolkes på følgende måde: a) pWTlll digereret med Hha I; b) pWT121 digereret med Hha I; c) pWT131 digereret med Hha I.

15 Fremstilling af pWT121/FPV samt assay af genudtrykkelse af FPV-HA-antigen til illustration af, at der kan indsættes DNA i plasmidet pWT121.

10 pg pWT121 grænsedigereres med Hind III. De resulterende 5'-ter-minalphosphater i vektorerne fjernes ved behandling med 20 μg bak-20 teriel alkalisk phosphatase i 30 minutter ved 37°C i en 25 μΐ's inkubation indeholdende 20 mM Tris HC1 med pH-værdi 7,5 og 0,1% w/v SDS. Efter phenolekstraktion og ethanoludfældning ligeres 0,2 /tg DNA til ca. 40 ng FPV-HA-gen i en 20 μΐ' s inkubation indeholdende 50 mM Tris-HCl med pH-værdi 7,5, 10 mM magnesiumchlorid, 20 mM dithio-25 threitol (DTT), 1 mM ATP og 0,02 enheder t4 DNA-ligase (New England Biolabs). Efter inkubation natten over ved 15®C fortyndes blandingen til 100 μΐ med TCM (10 mM Tris-HCl med pH-værdi 7,5, 10 mM calcium-chlorid og 10 mM magnesiumchlorid) og anvendes til at transficere 200 μΐ calciumchlorid-behandlet E. coli K12 HB101 ved en kendt fremgangs-30 måde. De transformenter, der er til stede efter vækst i 16 timer ved 37®C på L-agar plus 100 μg/ml carbenicillin (Pyopen, a-carboxy-ben-zylpenicillin), testes for tetracyclin-resistens ved at sætte dem på

DK 159976 B

36 agar-plader indeholdende M9-salte, glucose og casaminosyrer plus carbenicillin og tetracyclin (10 /ig/ml).

Assay for genudtryk 5 ml flydende kulturer af individuelle kolonier dyrkes i M9-medium 5 suppleret med 20 /xg/ml /?- indolacrylsyre og 100 pg/ml tryptophan, hvor det er angivet. Cellerne høstes ved centrifugering, suspenderes i 0,3 ml 25% w/v kold saccharose/50 mM Tris med pH-værdi 8 og inkuberes med 0,1 ml lysozym (10 mg/ml). 0,1 ml 0,5M EDTA og dernæst 0,5 ml isafkølet "Triton"-opløsning tilsættes med 5 minutters intervaller (Tri-10 ton-opløsning er 60 mM EDTA, 50 mM Tris med pH-værdi 8 og 0,1% w/v "Triton X-100"). Dette lysat anvendes til antigen-assay uden yderligere behandling.

HA-antigen-assays udføres i polystyrenkulturrør (Nunc No. 1410) under anvendelse af en antistofsandwichteknik. Kanin-anti-FPV HA renses ved 15 ammoniumsulfatudfældning og DEAE-cellulose-chromatografi før an- 125 vendelse og mærkes med I. Rørene dækkes med 50 μΐ 0,2M NaHC03 med pH-værdi 9 indeholdende 60 μξ/τοί renset, umærket IgG i 10 minutter ved stuetemperatur, vaskes med 3 x 1 ml aliquoter af vaskepuffer og inkuberes derefter ved stuetemperatur enten med kendte mængder (0,5 - 20 5 ng) sprængt FPV eller med bakterielysater. Efter 2 timer vaskes rørene med 4 x 1 ml aliquoter af vaskepuffer, og inkuberes endelig ved 4°C i 16 timer med 50 μΐ vaskepuffer indeholdende 200.000 cpm 125 I-anti HA. Rørene vaskes igen og tælles i en Packard 7-tæller. Det tilstedeværende antigen mængdebestemmes fra standardkurver, idet den 25 bundne radioaktivitet relateres til mængden af tilstedeværende FPV.

Fremstilling af nic -derivater

Restriktion af de tre fase-ændrede pWT-plasmider og pAT153 med både Bam HI og Pst I genererer to fragmenter fra hvert plasmid. Dette vises i fig. 14.

DK 159976 B

37 pATl53 producerer fragmenter af 1129 bp og 2529 bp, idet det sidstnævnte større fragment indeholder det oprindelige, men uden nic-stedet.

pWT-Plasmiderne producerer alle det samme 3233 bp-fragment indehold-5 ende det oprindelige og nic-stedet, men forskellige mindre fragmenter indeholdende trp-kontrol-elementer; forskellene opstår på grund af fase-ændrings-forandringer ved Hind III-stedet.

Plasmiderne begrænses med Pst I og Bam HI, undergår elektroforese på en 3,5X's acrylamidgel, og pAT153 2529 bp-, pWTlll 1590 bp-, pWT121 10 1604 bp- og pWT131 1618 bp-båndene skæres ud og udvindes fra acryla- midet. pAT153-båndet ligeres derpå uafhængigt til de 3 pWT-bånd, og ligationsblandingerne anvendes til at transformere E. coli HB 101-celler, idet der selekteres på næringsagar indeholdende carbenicillin ved 100 μg/ml. Da pAT153-fragmentet i sig selv ikke er i stand til at 15 meddele resistens mod ampicillin og tetracyclin, og da pWT-fragmen-terne mangler et oprindelsessted, sikrer selektion på carbenicillin, at de opnåede rekombinantmolekyler indeholder disse to fragmenter. Plasmid-DNA'er fremstilles fra et antal af de kolonier, der blev dyrket på transformationsplader, og disse anvendes til at bekræfte 20 tilstedeværelsen af de ønskede plasmider ved restriktionsanalyse.

Følgende enzym-digereringer udføres:

Pst I og Bam HI-digerering til generering af de ligerede fragmenter:

Under henvisning til fig. 15 er sporene b, c og d digereringer af nic’-derivater af henholdsvis pWTl31, 121 og 111. Spor a er en di-25 gerering af pWT131, og spor e er en digerering af pAT153. Som det fremgår af gelen, har alle tre nic'-trp-plasmider tilegnet sig pAT153 2529 bp-fragmentet, men bibeholder stadig de oprindelige trp-kontrol-fragmenter.

Hind III-digerering for at vise, at trp p/o-kontrolleret udtrykssted 30 stadig fungerer: Under henvisning til fig. 16 er sporene a, b, c og d digereringer af henholdsvis pWT231, 221, 211 og 131. Alle 3 nic -

Claims (8)

10 Plasmidet pWT221, der er det ovenfor beskrevne nic'-derivat af plasmidet pWT121, blev anvendt til cloning af et eucariotisk gen. Nærmere bestemt blev det syntetiske gen for urogastron eller human epidermisk vækstfaktor, hvilket gen er beskrevet i Ref. Smith et al., 1982, Nucleic Acids Research, 10, side 4467-4482, indsat mellem Hind III-15 og BamHI-stederne i plasmidet pW221, således at urogatrongenet blev udtrykt fra trp-promotoren.

1. Plasmid, kendetegnet ved, at det har et indsættelsessted for et 20 eukaryotisk DNA-fragment, der ligger ved siden af en bakteriel trp--promotor, trpE-genet eller en del deraf, hvilket indsættelsessted er "nedstrøms" i forhold til et prokaryotisk ribosombindingssted og at det har en trp-initiatorkodon, så at den bakterielle trp-promotor kontrollerer transcription og oversættelse af et indsat DNA-fragment, 25 og at det har karakteristika som anført i et hvilket som helst af de følgende alternativer (A) -(G): (A) et plasmid med en molekyllængde på 9866 bp; et Hindlll-sted; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Eco Ri-sted 3709 bp fra Sal I; et andet Hind III-sted 31 bp fra Eco 30 RI; et Hpa I-sted 305 bp fra det andet Hind III; et andet Hpa I-sted DK 159976 B 3250 bp fra det første Hpa I og 1950 bp fra det første Hind III, trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i delen på 1950 bp mellem det andet Hpa I-sted og det første Hind III-sted, et gen for tetra-cyclin-resistens, der følger umiddelbart efter det første Hind III-5 sted og et gen for ampicillin-resistens i delen på 3709 bp mellem Sal 1- og Eco Ri-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH3. (B) et plasmid med en molekyllængde på 9866 bp; et Hind III-sted; et Bam I-sted 346 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Eco RI-sted 3709 bp fra Sal I; et andet Hind III-sted 31 bp fra Eco

10 RI; et Hpa I-sted 1950 bp fra det andet Hind III-sted; et andet Hpa I-sted 3250 bp fra det første Hpa I-sted og 305 bp fra det første Hind III-sted, trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i delen på 1950 bp mellem det andet Hind III- og det første Hpa I-sted, et gen for tetracyclin-resistens, der følger umiddelbart efter det 15 første Hind III-sted og et gen for ampicillin-resistens i delen på 3709 bp mellem Sal I- og Eco RI-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH4. (C) et plasmid med en molekyllængde på 6750 bp; et Hind III-sted; et Bam Hi-sted ved 346 bp fra Hind Ill-stedet; et Sal I-sted ved 275 bp 20 fra Bam HI-stedet; et Hpa I-sted ved 4230 bp fra Sal I-stedet og 1950 bp fra Hind Ill-stedet; trp-promotoren, E-genet og en del af D-genet i delen på 1950 bp, der strækker sig mellem Hpa I-stedet og Hind III-stedet og et gen for ampicillin-resistens i delen på 4800 bp mellem Hind III-stedet og Hpa I-stedet, hvilket plasmid betegnes pEH5. 1 2 3 4 5 6 (D) et plasmid med en molekyllængde på 4874 bp; et Eco Ri-sted; et 2 Hind III-sted 31 bp fra Eco RI-stedet; et Hpa I-sted 313 bp fra Hind 3 Ill-stedet; et andet Hind III-sted 199 bp fra Hpa I; et Bam I-sted 4 346 bp fra det andet Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst 5 I-sted 2958 bp fra Sal I og 752 bp fra Eco RI; et gen for tetracyc- 6 lin-resistens, der strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; et gen for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet, og den clonede del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af E-genet i området mellem Hpa I-stedet og det andet Hind III-sted; hvilket plasmid betegnes pWTIOl. DK 159976 B (E) et plasmid med en molekyllængde på 4823 bp; et Hpa I-sted; et Hind III-sted 199 bp fra Hpa I; et Barn. I-sted 346 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal I og 1045 bp fra Hpa I; hvorhos genet for tetracyclin-resistens strækker 5 sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; et gen for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet og den clonede del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af E-genet i området mellem Hpa I- og Hind III-stedet; hvilket plasmid betegnes pWTlll. 10 (F) et plasmid med en molekyllængde på 4837 bp; et Hpa I-sted; et Hind III-sted 206 bp fra Hpa I; et Barn I-sted 353 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal 1 og 1045 bp fra Hpa I; hvorhos genet for tetracyclin-resistens strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; genet for 15 ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet og den clonede del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af E-genet mellem Hpa I- og Hind III-stedet; hvilket plasmid betegnes pWT121, idet fasningen er ændret 1 bp fra pWTlll. (G) et plasmid med en molekyllængde på 4851 bp; et Hpa I-sted; et 20 Hind III-sted 213 bp fra Hpa I; et Bam I-sted 360 bp fra Hind III; et Sal I-sted 275 bp fra Bam I; et Pst I-sted 2958 bp fra Sal I og 1045 bp fra Hpa I; hvorhos genet for tetracyclin-resistens strækker sig fra området for Hpa I-stedet til ud over Sal I-stedet; og genet for ampicillin-resistens i området for Pst I-stedet og den clonede 25 del af trp-operonen omfatter området mellem promotoren og den første del af E-genet mellem Hpa I-stedet og Hind III-stedet, hvilket plasmid betegnes pWT131, idet fasningen er ændret 2 bp fra pWTlll.

2. nic -derivat af et plasmid ifølge krav 1, fortrinsvis fremstillet ved at man fjerner nic-stedet fra et plasmid eller konstruerer et 30 plasmid på en sådan måde, at nic-stedet ikke er til stede.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af et plasmid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man DK 159976 B (a) til fremstiling af det i krav 1 (A) angivne pEH3 digererer en vildtypestamme af E. coli med restriktionsendonuclease Hind III, ligerer det således vundne fragment til det lineære molekyle, der fås ved begrænsning af plasmidet pBR322 med restriktionsendonuclease

4. Plasmid, kendetegnet ved, at det er et plasmid ifølge krav 1 eller 2, der på indsætningsstedet har indsat et eukaryotisk DNA-fragment.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af det i krav 4 angivne plasmid, kendetegnet ved, at man indsætter et eukaryotisk DNA-fragment ved indsættelsesstedet i et plasmid som angivet i krav 1 eller 2.

5 HB101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-koloni- er, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pWTlll. (f) til fremstilling af det i krav 1 (F) angivne pWtl21 begrænser pWTlll med restriktionsendonuclease Hind III, behandler det linære 10 molekyle med DNA polymerase I, ligerer med Hind III-linker DNA, begrænser med restriktionsendonuclease Hind III, religerer det lineære molekyle, transformerer E. coli K12 HB101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pWT121. 15 (g) til fremstilling af pWT131 som angivet i krav 1 (G) begrænser pWT121 med restriktionsendonuclease Hind III, behandler det linære molekyle med DNA polymerase I, ligerer med Hind Ill-linker DNA, begrænser med restriktionsendonuclease Hind III, religerer det lineære molekyle, transformerer E. coli K12 HB101 med de resulterende 20 plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pWT131.

5 Hind III, transformerer E. coli W3110 trpoEVl med det resulterende plasmid og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser tetracyclin-resistens og trp-komplementering, til opnåelse af plasmidet pEH3. (b) til fremstilling af det i krav 1 (B) angivne pEH4 digererer en vildtypestamme af E. coli med restriktionsendonuclease Hind III, 10 ligerer det således vundne fragment til det lineære molekyle, der vindes ved begrænsning af plasmidet pBR322 med restriktionsendonuclease Hind III, transformerer E. coli W3110 trpoEVl med det resulterende plasmid og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser tetra-cyclin-følsomhed og trp-komplementering, til opnåelse af plasmidet 15 pEH4. (c) til fremstilling af det i krav 1 (C) angivne pEH5 begrænser pEH3 med restriktionsendonuclease Eco RI, digererer det lineære molekyle med exonuclease III og Sl-nuclease, behandler med DNA polymerase I, ligerer det lineære molekyle med DNA ligase, transformerer E. coli

20 W3110 trpoEtfl med det resulterende plasmid og selekterer de kolonier, der udviser trp-komplementering og ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pEH5. (d) til fremstilling af det i krav 1 (D) angivne pWTlOl begrænser pEH5 med restriktionsendonuclease Hinf I til dannelse af et fragment 25 indeholdende den komplette trp-promotor og doner fragmentet ind i Hind III-stedet i plasmidet pBR322, idet man behandler Hinf I-enderne af fragmentet med DNA polymerase I, behandler fragmentet med Hind III-linkere i nærværelse af DNA ligase, behandler det ligerede molekyle med Hind III-restriktionsendonuclease til dannelse af et lineært 30 molekyle med Hind III-klæbrige ender, ligerer dette lineære molekyle til Hind III-stedet i plasmidet pBR322, transformerer E. coli K12 HB101 med de resulterende plasmider og selekterer de E. coli-kolonier, der udviser ampicillin-resistens, til opnåelse af plasmidet pWTlOl. DK 159976 B (e) til fremstilling af det i krav 1 (E) angivne pWTlll begrænser pWTIOl med restriktionsendonuclease Eco RI, digererer det lineære molekyle med exonuclease III og SI-nuclease, behandler med DNA polymerase I, religerer det lineære molekyle, transformerer E. coli K12

6. Transformeret bakteriecelle, hvori der er indført et plasmid 30 ifølge krav 4 eller fremstillet ifølge krav 5.

7. Fremgangsmåde til transformation af en transformerbar bakteriecelle , DK 1S9976B kendetegnet ved, at man indfører et plasmid ifølge krav 4 eller et plasmid fremstillet ifølge krav 5 i en egnet bakteriecelle.

8. Fremgangsmåde til udtrykkelse af et protein, kendetegnet ved, at man dyrker en celle ifølge krav 6.