NO334074B1 - Anvendelse av en S1P reseptoragonist - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en spingosin-1-fosfat (SIP) reseptoragonist, for fremstilling av et medikament, for å forebygge eller behandle lymfoproliferative eller myeloproliferative lidelser.

SIP reseptoragonister er lymfocyttmålsøkende (LH) midler som utløser en lymfopeni som resultat av en omfordeling, fortrinnsvis reversibel, av lymfocytter fra sirkulasjonen til sekundært lymfatisk vev uten å igangsette noen generalisert immunsuppresjon. Naive celler sekvesteres; CD4- og CD8 T-celler og B-celler fra blodet stimuleres til å migrere inn i lymfeknuter (LN) og Peyers puter (PP) og således inhiberes for eksempel infiltrering av celler inn i transplanterte organer.

SIP reseptoragonister er spingosinanaloger.

Egnede SIP reseptoragonister er:

- Forbindelser som beskrevet i EP627406A1, for eksempel en forbindelse med formel 1

der Ri er en rett- eller forgrenet (Ci2-22)karbonkjede

som i kjeden kan ha en binding eller et heteroatom valgt fra en dobbeltbinding,

en trippelbinding, O, S, NR6, der R.6er H, alkyl, aralkyl, acyl eller alkoksykarbonyl og karbonyl, og/eller

som, som en substituent, kan ha alkoksy, alkenyloksy, alkynyloksy, aralkyloksy,

acyl, alkylamino, alkyltio, acylamino, alkoksykarbonyl, alkoksykarbonylamino, acyloksy, alkylkarbamoyl, nitro, halogen, amino, hydroksyimino, hydroksy eller karboksy; eller

Ri er

- en fenylalkyl der alkyl er en rett eller forgrenet (C8-2o)karbonkjede; eller en fenylalkyl der alkyl er en rett eller forgrenet (Ci-3o)karbonkjede der fenylalkyl

er substituert med

- en rett eller forgrenet (C6-2o)karbonkjede som eventuelt er substituert med halogen, - en rett eller forgrenet (C6-2o)alkoksykjede som eventuelt er substituert med halogen,

- en rett eller forgrenet (C6-2o)alkenyloksy,

- fenylalkoksy, halofenylalkoksy, fenylalkoksyalkyl, fenoksyalkoksy eller fenoksyalkyl,

- cykloalkylalkyl substituert med C6-2oalkyl,

- heteroarylalkyl substituert med C6-2oalkyl,

- heterocyklisk C6-2oalkyl, eller

- heterocyklisk alkyl substituert med C2-2oalkyl,

og der

alkyldelen kan ha

- i karbonkjeden, en binding eller et heteroatom valgt blant en dobbeltbinding, en trippelbinding, O, S, sulfinyl, sulfonyl eller NR6, der R.6er som definert ovenfor, og - som en substituent, alkoksy, alkenyloksy, alkynyloksy, aralkyloksy, acyl, alkylamino, alkyltio, acylamino, alkoksykarbonyl, alkoksykarbonylamino, acyloksy, alkylkarbamoyl, nitro, halogen, amino, hydroksy eller karboksy, og hver av R2, R3, R4og R5uavhengig er H, d^alkyl eller acyl, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav; Forbindelser som beskrevet i WO02/18395, for eksempel en forbindelse med formelen IVa

der Xaer O, S, NRiseller en gruppe -(CH2)na-, hvilken gruppe er usubstituert eller substituert med 1 til 4 halogen; na er 1 eller 2, Ris er H eller (Ci^alkyl) der alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; RJaer H, OH, (Ci-4)alkyl eller 0(CM)alkyl der alkyl er usubstituert eller substituert med 1 til 3 halogen; Riber H, OH eller (Ci.4)alkyl, der alkyl er usubtituert eller substituert med halogen, hver R2auavhengig er valgt blant H eller (Ci-Oalkyl, hvilken alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; R3aer H, OH, halogen eller 0(Ci^)alkyl, der alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; eller et farmasøytisk akseptable salter eller hydrater derav.

En foretrukket forbindelse med formel I er 2-amino-2-tetradecyl-l,3-propandiol. En spesielt foretrukket SIP reseptoragonist med formel I er FTY720, dvs. 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]propan-l,3-diol i fri form eller i en farmasøytisk akseptabel saltform (heretter angitt som forbindelse A), for eksempel hydrokloridet som vist:

En foretrukket forbindelse med formel IVa er FTY720-fosfat (Pv2a er H, R.3a er OH, Xaer O, Riaog Riber OH). En foretrukket forbindelse med formel IVb er forbindelse C-fosfatet (R2aer H, R3ber OH, Xaer O, Riaog Riber OH, Yaer O og R4aer heptyl).

Når forbindelsene med formel I eller IVa har ett eller flere asymmetriske sentra i molekylet, skal det være klart at oppfinnelsen skal forstås til å omfatte de forskjellige optiske isomerer så vel som racemater, diastereoisomerer og blandinger derav.

Eksempler på farmasøytisk akseptable salter av forbindelsene med formlene I eller IVa inkluderer salter med uorganiske syrer som hydroklorid, hydrobromid og sulfat, salter med organiske syrer, som acetat, fumarat, maleat, benzoat, citrat, malat, metansulfonat og benzensulfonat, eller, der det går, salter med metaller som natrium, kalium, kalsium og aluminium, salter med aminer, som trietylamin og salter med dibasiske aminosyrer som lysin. Forbindelsene og saltene ved metodene ifølge oppfinnelsen omfatter hydrat-og solvatformer.

SIP reseptoragonistene ifølge foreliggende oppfinnelse, på basis av observert aktivitet, for eksempel målsøking av lymfocytter, for eksempel som beskrevet i EP627406A1 eller USP 6.004.565, har blitt funnet å være brukbare for eksempel som immunsuppressiva, for eksempel ved behandling av akutt allograftavstøtning. Det er nå funnet at SIP reseptoragonistene har interessante egenskaper som gjør dem brukbare for cancerkjemoterapi.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av:

1) en SIP reseptoragonist med formel I

hvori

Ri er en rett eller forgrenet (C12-22) karbon kjede

- som i kjeden kan ha en binding eller heteroatom valgt fra en dobbeltbinding, en trippel binding, O, S, NR6; hvori R6er H, alkyl, aralkyl, acyl eller alkoksykarbonyl og karbonyl og/eller - som kan ha som substituent alkoksy, alkenyloksy, alkynyloksy, aralkyloksy, acyl, alkylamino, alkyltio, acylamino, alkoksykarbonyl, alkoksykarbonylamino, acyloksy, alkylkarbamoyl, nitro, halogen, amino,

hydroksyimino, hydroksy eller karboksy; eller

Ri er

- en fenylalkyl der alkyl er en rett eller forgrenet (C6-2o)karbonkjede; eller

- en fenylalkyl der alkyl er en rett eller forgrenet (Ci_3o)karbonkjede der fenylalkyl er substituert med - en rett eller forgrenet (C6-2o)karbonkjede som eventuelt er substituert med halogen, - en rett eller forgrenet (C6-2o)alkoksykjede som eventuelt er substituert med halogen,

- en rett eller forgrenet (C6-2o)alkenyloksy,

fenylalkoksy, halofenylalkoksy, fenylalkoksyalkyl, fenoksyalkoksy eller

fenoksyalkyl,

- cykloalkylalkyl substituert med C6-2oalkyl,

- heteroarylalkyl substituert med C6-2oalkyl,

- heterosyklisk C6-2oalkyl, eller

- heterocyklisk alkyl substituert med C2-2oalkyl,

og der

alkyldelen kan ha

i karbonkjeden, en binding eller et heteroatom valgt blant en dobbeltbinding, en trippelbinding, O, S, sulfinyl, sulfonyl eller NR6, der R6er som definert ovenfor, og

som en substituent, alkoksy, alkenyloksy, alkynyloksy, aralkyloksy, acyl,

alkylamino, alkyltio, acylamino, alkoksykarbonyl, alkoksykarbonylamino,

acyloksy, alkylkarbamoyl, nitro, halogen, amino, hydroksy eller karboksy, og hver av R2, R3, R4og R5uavhengig er H, Ci^alkyl eller acyl,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav; eller

2) en forbindelse med formel IVa

hvori

der Xaer O, S, NRiseller en gruppe -(CH2)na-, hvilken gruppe er usubstituert eller substituert med 1 til 4 halogen; na er 1 eller 2, Ris er H eller (Ci^alkyl) der alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; Riaer H, OH, (Ci-4)alkyl eller 0(Ci-4)alkyl der alkyl er usubstituert eller substituert med 1 til 3 halogen; Rn, er H, OH eller (Ci.4)alkyl, der alkyl er usubtituert eller substituert med halogen, hver R2auavhengig er valgt blant H eller (Ci^)alkyl, hvilken alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; R3aer H, OH, halogen eller 0(Ci-4)alkyl, der alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; eller et farmasøytisk akseptable salt eller hydrat derav;

for fremstilling av et medikament for å forebygge eller behandle lymfoproliferative eller myeloproliferative lidelser, hvori medikamentet administreres med et kjemoterapeutisk middel.

Med "lymfatisk cancer" menes for eksempel tumorer i blodet og det lymfatiske system (for eksempel Hodgkins sykdom, ikke-Hodgkins lymfom, Burkitts lymfom, AIDS-relaterte lymfomer, multippel myeloma og malignante plasmacelle neoplasmer, lymfoid leukemi, akutt eller kronisk myeloid leukemi, akutt eller kronisk lymfocytisk leukemi, monocytisk leukemi, andre leukemier av spesifisert celletype, leukemi av ikke-spesifisert celletype, andre og ikke-spesifiserte malignante neoplasmer av lymfoid, hematopoietisk og relaterte vev, for eksempel diffus storcellelymfomer, T-celle lymfoma eller kutanøs T-celle lymfoma). Myeloid cancer inkluderer for eksempel akutt eller kronisk myeloid leukemi.

Med uttrykket "kjemoterapeutisk middel" menes spesielt et hvilket som helst kjemoterapeutisk middel annet enn SIP reseptoragonisten. Det inkluderer, men er ikke begrenset til,

i. en aromataseinhibitor,

ii. et antiøstrogen, et anti-androgen (spesielt når det gjelder prostatacancer) eller en gonadorelinagonist,

iii. en topoisomerase I inhibitor eller topoisomerase II inhibitor,

iv. et mikrotubult aktivt middel, et alkyleringsmiddel, en antineoplastisk antimetabolitt eller en platinaforbindelse, v. en forbindelse som søker/reduserer en protein- eller lipidkinaseaktivitet eller et protein- eller lipidfosfataseaktivitet, en ytterligere antiangiogenisk forbindelse

eller en forbindelse som induserer celledifferensieringsprosessene,

vi. en bradykinin 1 reseptor eller en angiotensin II antagonist,

vii. en cyklooksygenaseinhibitor, et bisfosfonat, en histon deacetylaseinhibitor, en heparanaseinhibitor (forhindrer heparansulfatnedbrytning), for eksempel PI-88, en biologisk responsmodifiserer, fortrinnsvis et lymfokin eller interferoner, for eksempel interferon y, en ubikitineringsinhibitor, eller en inhibitor som

blokkerer anti-apoptotiske veier,

viii. en inhibitor for Ras onkogeniske isoformer, for eksempel H-Ras, K-Ras eller N-Ras eller en farnesyl transferaseinhibitor, for eksempel L-755,832 eller

DK8G557,

ix. en telomeraseinhibitor, for eksempel teomestatin,

x. en proteaseinhibitor, en matriks metalloproteinaseinhibitor, en metionin aminopeptidaseinhibitor, for eksempel bengamid eller et derivat derav, eller en

proteosominhibitor, for eksempel PS-341, og/eller

xi. en mTOR inhibitor.

Uttrykket "aromataseinhibitor" slik det benyttes her, relaterer til en forbindelse som inhiberer østrogenproduksjonen, dvs. omdanningen av substratene androstendion og testosteron til østron henholdsvis østradiol. Uttrykket inkluderer, men er ikke begrenset til, steroider, spesielt atamestan, eksemestan og formestan og særlig ikke-steroider, særlig aminoglutetimid, rogletimid, pridoglutetimid, trilostan, testolakton, ketokonazol, vorozol, fadrozol, anastrozol og letrozol. Eksemestan kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket AROMASIN™. Formestan kan administreres for eksempel i den form som det markedsføres, for eksempel under varemerket LENT ARON™. Fadrozol kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket AFEMA™. Anastrozol kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ARIMIDEX™. Letrozol kan administreres for eksempel i den form den markedsføres, for eksempel under varemerket FEMÅRA TAÆ eller FEMÅR TA/1.Aminoglutetimid kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ORIMETEN™. En kombinasjon av oppfinnelsen omfatter et kjemoterapeutisk middel som er en aromataseinhibitor, er spesielt brukbar for behandling av hormonreseptorpositive tumorer, for eksempel brysttumorer.

Uttrykket "antiøstrogen" slik det benyttes her, relaterer til en forbindelse som antagoniserer effekten av østrogener på østrogenreseptornivået. Uttrykket inkluderer, tamoksifen, fulvestrant, raloksifen og raloksifen hydroklorid. Tamoksifen kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket NOLVADEX™. Raloksifen hydroklorid kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket EVISTA™. Fulvestrant kan formuleres som beskrevet i US 4.659.516 eller kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket FASLODEX™. En kombinasjon av oppfinnelsen omfattende et kjemoterapeutisk middel som er et antiøstrogen, er spesielt brukbar for behandling av østrogenreseptorpositive tumorer, for eksempel brysttumorer.

Uttrykket "anti-androgen" slik det benyttes her, gjelder et hvilket som helst stoff som er i stand til å inhibere de biologiske effekter av androgeniske hormoner og inkluderer bikalutamid (CASODEX™), som for eksempel kan formuleres som beskrevet i US 4.636.505.

Uttrykket "gonadorelinagonist" slik det benyttes her, inkluderer abareliks, goserelin og goserelinacetat. Goserelin er beskrevet i US 4.100.274 og kan administreres for eksempel i den markedsførte formen, for eksempel under varemerket ZOLADEX™. Abareliks kan formuleres for eksempel som beskrevet i US 5.843.901.

Uttrykket "topoisomerasae I inhibitor" slik det benyttes her, inkluderer topotekan, irinotekan, 9-nitrokamptotecin og det makromolekylære kamptotecinkonjugat PNU-166148 (forbindelse Al i WO99/17804). Irinotekan kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket CAMPTOSAR™. Topotekan kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket

HYCAMTIN™.

Uttrykket "topoisomerase II inhibitor" slik det benyttes her, inkluderer antracyklin som doksorubicin (inkludert liposomal formulering, for eksempel CAELYX™), caunorubicin, epirubicin, idarubicin og nemorubicin, antrakinonene mitoksantron og losoksantron, og podofillotoksinene etoposid og teniposid. Etoposid kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ETOPOPHOS™. Teniposid kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket VM 26-BRISTOL™. Doksorubicin kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ADRIBLASTIN™. Epirubicin kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket FARMORUBICIN™. Idarubicin kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ZAVEDOS™. Mitoksantron kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket

NOVANTRON™.

Uttrykket "mikrotubul aktivt middel" angår mikrotubul stabiliserende og mikrotubul destabiliserende midler inkludert taksan, for eksempel paklitaksel og docetaksel, vinca alkaloider, for eksempel vinblastin, og særlig vinblastin sulfat, vinkristin, særlig vinkristin sulfat og vinoelbin, diskodermolider og epotiloner og derivater derav, for eksempel epotilon B eller et derivat derav. Paklitaksel kan administreres for eksempel i den form det markedsføres, for eksempel TAXOL™. Docetaksel kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket TAXOTERE™. Vinblastinsulfat kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket VINBLASTIN R.P.™. Vinkristinsulfat kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket FARMISTIN™. Diskodermolid kan oppnås, for eksempel som beskrevet i US 5.010.099.

Uttrykket "alkyleringsmiddel" slik det benyttes her, inkluderer busulfan, klorambucil, cyklofosfamid, ifosfamid, melfalan eller nitrosourea (BCNU eller Gliadel™). Cyklofosfamid kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket CYCLOSTIN™. Ifosfamid kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket HOLOXAN™.

Uttrykket "antineoplastisk antimetabolitt" inkluderer 5-fluoruracil, cepecitabin, gemcitabin, cytarabin, fludarabin, tioguanin, metotreksat og edatreksat. Capecitabin kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket XELODA™. Gemcitabin kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket GEMZAR™.

Uttrykket "platinaforbindelse" slik det benyttes her, inkluderer karboplatin, cisplatin og oksaliplatin. Carboplatin kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket CARBOPLAT™. Oksaliplatin kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ELOXATIN™.

Uttrykket "forbindelser som søker/reduserer en protein- eller lipidkinaseaktivitet eller ytterligere antiantiogene forbindelser" som benyttet her, inkluderer proteintyrosinkinase- og/eller serin- og/eller treoninkinaseinhibitorer eller lipidkinaseinhibitorer, for eksempel forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av den epidermale vekstfaktorfamilie av reseptortyrosinkinaser (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 som homo- eller heterodimerer), den vaskulære endoteliale vekstfaktorfamilie av reseptortyrosinkinaser (VEGFR), de plateavledede vekstfaktorreseptorer (PDGFR), fibroblastvekstfaktorreseptorene (FGFR), den insulinlignende vekstfaktorreseptor 1 (IGF-IR), Trk-reseptortyrosinkinasefamilien, AxI-reseptortyrosinkinasefamilien, Ret-reseptortyrosinkinasen, Kit/SCFR-reseptortyrosinkinasen, medlemmer av c-Abl-familien og deres genfusjonsprodukter (for eksempel BCR-Abl), medlemmer av proteinkinase C (PKC) og Raf-familien av serin/treoninkinaser, medlemmer av MEK-, SRC-, JAK-, FAK-, PDK- eller PI(3)-kinaserelaterte familien, og/eller medlemmer av den cyklinavhengige kinasefamilie (CDK) og anti-angiogeniske forbindelser med andre mekanismer for sin aktivitet, for eksempel ikke-relatert til protein- eller lipidkinaseinhibering.

Forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av VEGFR er særlig forbindelser, proteiner eller antistoffer som inhiberer VEGF-reseptortyrosinkinasen, inhiberer en VEGF-reseptor eller binder til VEGF, og er i særdeleshet de forbindelser, proteiner eller monoklonale antistoffer som generes og spesifikt er beskrevet i WO 98/35958, for eksempel l-(4-kloroanilino)-4-(4-pyridylmetyl)ftalazin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for eksempel et suksinat, i WO 00/27820, for eksempel et N-aryl(tio)antranilsyreamidderivat, for eksempel 2-[(4-pyridyl)metyl]amino-N-[3-metoksy-5-(trifluormetyl)fenyl]benzamid eller 2[(l-oksido-4-pyridyl)metyl]amino-N-[3-trifluormetylfenyl]benzamid, eller i WO 00/09495, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819 og EP 0769947; de som er beskrevet ved M. Prewett et al i Cancer Research 59 (1999) 5209-5218, v F. Yan et al. i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 93, s. 14765-14770, desember 1996, av Z. Zhu et al i Cancer Res. 58, 1998, 3209-3214, og av J. Mordenti et al. i Toxicologic Pathology, vol. 27, no. 1. s. 14-21,1999; i WO 00/37502 og WO 94/10202; Angiostatin™ , beskrevet av M.S. 0'Reilly et al, Cell 79,1994, 315-328; Endostatin™, beskrevet av M.S. 0'Reilly et al, Cell 88, 1997,277-285; antranilsyreamider; ZD4190; ZD6474; SU5416; SU6668; eller anti-VEGF-antistoffer eller anti-VEGF reseptorantistoffer, for eksempel RhuMab.

Med antistoff menes intakte, monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer danner fra minst 2 intakte antistoffer, og antistoffragmenter så lenge de viser den ønskede, biologiske aktivitet.

Forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av den epidermale vekstfaktorreseptorfamilie er særlig forbindelser, proteiner eller antistoffer som inhiberer medlemmer av EGF-reseptortyrosinkinasefamilien, for eksempel EGF-reseptoren, ErbB2, ErbB3 og ErbB4 eller binder til EGF eller EGF-relaterte ligander, eller som har en dual inhiberingseffekt på ErbB- og VEGF-reseptorkinasen og er særlig de forbindelser, proteiner eller monoklonale antistoffer som generes og spesifikt er beskrevet i WO 97/02266, for eksempel forbindelsene i eksempel 39, eller i EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, US 5.747.498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 og spesielt WO 96/30347 (for eksempel forbindelsen kjent som CP 358774), WO 96/33980 (for eksempel forbindelse ZD 1839) og WO 95/03283 (for eksempel forbindelse ZM105180) eller PCT/EP02/08780; for eksempel trastuzumab (Herpetin<R>), cetuximab, Iressa, OSI-774, Cl-1033, EKB-569, GW-2016, EU, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 eller E7.6.3.

Forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av PDGFR er spesielt forbindelser som inhiberer PDGF-reseptoren, for eksempel et N-fenyl-2-pyrimidin-aminderivat, for eksempel imatinib.

Forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktivitet av c-Abl-familiemedlemmene og deres genfusjonsprodukter, for eksempel et N-fenyl-2-pyrimidin-aminderivat, for eksempel imatinib; PD180970; AG957 eller NSC 680410.

Forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av proteinkinase C, Raf, MEK, SRC, JAK, FAK og PDK familiemedlemmer, eller PI(3) kinase eller PI(3) kinaserelaterte familiemedlemmer, og/eller medlemmer av den cyklinavhengige kinasefamilie (CDK) er spesielt de staurosporinderivater som er beskrevet i EP

0 296 110, for eksempel midostraurin; eksempler på ytterligere forbindelser inkluderer

for eksempel UCN-01, safingol, BAY 43-9006, Bryostatin 1, Perifosin; U0126; Ilmofosin; RO 318220 og RO 320432; GO 6976; Isis 3521; eller LY333531/LY379196.

Ytterligere anti-angiogeniske forbindelser er for eksempel talidomid (THALOMID) og TNP-470.

Forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av et protein eller lipidfosfatase er for eksempel inhibitorer av fosfatase 1, fosfatase 2A. PTEN eller CDC25, for eksempel okadainsyre eller et derivat derav.

Forbindelser som induserer celledifferensieringsprosesser er for eksempel retinonsyre, a-, y- eller 5-tokoferol eller a-, y- eller 8-tokotrienol.

Uttrykket cyklooksygenaseinhibitor slik det benyttes her, inkluderer for eksempel celecoksib (Celebrex<R>), rofecoksib (Vioxx<R>), etoricoksib, valdecoksib eller en 5-alkyl-2-arylaminofenyleddiksyre, for eksempel 5-metyl-2-(2'-klor-6'-fluoranilino)fenyleddiksyre.

Uttrykket "histon deacetylaseinhibitor" slik det benyttes her, inkluderer MS-27-275, SAHA, pyroksamid, FR-901228 eller valproinsyre.

Uttrykket "bisfosfonater" slik det benyttes her inkluderer etridonin-, klodronin-, tiludronin-, pamidronin-, alendronin-, ibandronin-, risedronin- eller zoledroninsyre. "Etridoninsyre" kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket DIDRONEL™. "Klodroninsyre" kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket CARBOPLAT™. for eksempel under varemerket BONEFOS™. "Tiludronsyre" kan administreres for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket SKELID™. "Pamidroninsyre" kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket AREDIA™. "Alendroninsyre" kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket FOSAMAX™. "Ibrandroninsyre" kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket BONDRANAT™. "Risedroninsyre" kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ACTONEL™. "Zoledroninsyre" kan administreres, for eksempel i den markedsførte form, for eksempel under varemerket ZOMETA™.

Uttrykket "matriks metalloproteinaseinhibitor" slik det benyttes her, inkluderer kollagen peptidomimetika og ikke-peptidomimetikainhibitorer, tetracyklinderivater, for eksempel hydroksamat peptidomimetisk inhibitorbatimastat og dennes oralt biotilgjengelige analogmarimastat, prinomastat, BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211 eller AAJ996.

Uttrykket "mTOR inhibitor" slik uttrykket benyttes her, inkluderer rapamycin (sirolimus) eller et derivat derav. Rapamycin er et kjent makrolid antibiotikum som fremstilles av Streptomyces hygroscopicus. Egnede derivater av rapamycin inkluderer for eksempel forbindelser med formel A

der

Riaa er CH3eller C3^alkynyl;

R2aaer H eller -CH2-CH2-OH, 3-hydroksy-2-(hydroksymetyl)-2-metyl-propanoyl eller tetrazolyl, og

Xaa=O, (H,H) eller (H,OH)

forutsatt at R2aaer forskjellig fra H når Xaaer O og Riaa er CH3,

eller et prodrug derav når R2aaer -CH2-CH2-OH, for eksempel en fysiologisk hydrolyserbar eter derav.

Forbindelsene med formel A er beskrevet i WO 94/09010, WO 95/16691, WO 96/41807, USP 5,362,718 eller WO 99/15530. De kan fremstilles som beskrevet eller i analogi til de prosedyrer som er beskrevet i disse referanser.

Foretrukne rapamycinderivater er 32-deoksorapamycin, 16-pent-2-ynyloksy-32-deoksorapamycin, 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dihydro-rapamycin, 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dihydro-40-0-(2-hydroksyetyl)-rapamycin og, mer foretrukket, 40-0-(2-hydroksyetyl)-rapamycin. Ytterligere eksempler på rapamycinderivater inkluderer for eksempel CC1779 eller 40-[3-hydroksy-2-(hydroksymetyl)-2-metylpropanoat]- rapamycin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som beskrevet i USP 5.362.718, ABT578 eller 40-(tetrazolyl)-rapamycin, særlig 40-epi-(tetrazolyl)-rapamycin, for eksempel som beskrevet i WO 99/15530, eller rapaloger som beskrevet i for eksempel WO 98/02441 og WO01/14387, for eksempel AP23573.

Omfattet er på samme måte de farmasøytisk akseptable salter derav, de tilsvarende racemater, diastereoisomerer, enantiomerer, tautomerer, så vel som de tilsvarende krystallmodifikasjoner av de ovenfor beskrevne forbindelser der disse er tilstede, for eksempel solvater, hydrater og polymorfer som er beskrevet der. Forbindelsene som benyttes som aktive bestanddeler i kombinasjonene ifølge oppfinnelsen, kan fremstilles og administreres som beskrevet i de angitte dokumenter. Også innenfor rammen av oppfinnelsen er kombinasjonen av mer enn to separate, aktive bestanddeler som angitt ovenfor, for eksempel kan en farmasøytisk kombinasjon innenfor rammen av oppfinnelsen inkludere tre aktive bestanddeler eller flere. Videre er både det første middel og komidlet ikke den identiske bestanddel.

Anvendeligheten av SIP agonistene ved for behandling av faste tumorer kan påvises i dyreforsøk så vel som klinisk, for eksempel i forbindelse med den nedenfor beskrevne metode.

A. In vitro referanse eksempler

A.l Antitumoraktivitet

En muse-brystcancercellelinje som opprinnelig ble isolert fra mammarkarcinoma ble benyttet, for eksempel JygMC(A). Celletallet justeres til 5xl05 for å bringes på plate i friskt medium før prosedyren. Cellene inkuberes i friskt medium inneholdende 2,5 mM tymidin uten FCS i 12 timer og vaskes så to ganger med PBS, fulgt av tilsetning av friskt medium med 10% FCS og inkuberes i ytterligere 12 timer. Deretter inkuberes cellelinjer med friskt medium inneholdende 2,5 mM tymidin uten FCS i 12 timer. For å frigi cellene fra blokken, vaskes cellene to ganger med PBS og replatteres i friskt medium med 10% FCS. Etter synkronisering inkuberes cellene med eller uten forskjellige konsentrasjoner av en forbindelse med formel I i 3, 6,9,12, 18 eller 24 timer. Cellene høstes etter behandling med 0,2% EDTA, fikseres med iskald 70% etanoloppløsning, hydrolyseres med 250 ug/ml RNaseA (type 1-A: Sigma Chem. Co.) ved 37°C i 30 min. og farges med propidiumjodid ved 10 mg/ml i 20 minutter. Etter inkuberingsperioden bestemmes antallet celler både ved telling av celler i en Coulter counter og ved SRB-kolorimetrisk analyse. Under disse betingelser inhiberer en SIP- agonist, for eksempel forbindelse B i hydrokloridsaltform, prolifereringen av tumorceller i konsentrasjoner i området IO"<12>til IO"6 M.

A.2 SIP-mediert HUVEC rørdannelsesanalyse.

For rørdannelsesanalysen ble HUVEC fra passasje 2-8 benyttet og er aldri mer enn 70% konfluent før innhøsting. Cellene prepareres for analysen ved vasking med herpes balansert saltoppløsning (HBSS fra Clonetics) og så trypsinisering med Trypsin/EDTA (0,25 mg/ml fra Clonetics). Etter at rundt 90% av cellene hadde løftet seg fra platen, ble et likt volum trypsinnøytraliserende oppløsning (TNS fra Conetics) tilsatt og cellene ble samlet i et konisk rør inneholdende minst 10 ml EBM-2 (Clonetics) + 0,1% BSA (Sigma) medium. Cellene ble sentrifugert ved 1000 omdreininger pr. minutt i 5 minutter og supernatanten fjernet og erstattet med 5 ml frisk EBM-2 + 0,1% BSA. Cellene ble talt ved bruk av et hemacytometer og volumet av cellesuspensjonen justeres for å oppnå en konsentrasjon på 500.000 celler/ml. Koniske rør prepareres med testforbindelser ved 100 nM og pertussintoksin (PTx) i en mengde av 10 ng/ml i hver, hvoretter 1 ml av cellesuspensjonen settes til hvert rør. Rørene inkuberes så i en Vi time ved 37°C, 5% CO2. Migreringsanalysen gjennomføres ved bruk av Fluoro-Blok 24-multibrønns innskuddsplater belagt med fibronektin (8 um porestørrelse, Falcon #351147) i stedet for de individuelle innskudd i en 24-brønners plate. Celler og testforbindelser prepareres og pre-inkuberes som beskrevet ovenfor, og deretter settes 100 ul til hver egnede brønn i innskuddsplaten. 300 ul EBM-2 + 2% trekullstrippet medium uten SIP, settes til bunnen av brønnen merket for ingen stimulering (-) og 300 ul av medium inneholdende SIP (500 nM) settes til bunnene av brønner markert for stimulering (+). Platene inkuberes deretter i 4 timer ved 37°C og 5% CO2.

Calcein AM, 50 ug/ampulle (Molecular Probes #C3100) prepareres ved først å sette 20 ul DMSO til ampullen. Deretter oppvarmes 12,5 ml HBSS (pr. plate) til 37°C og 150 ul settes til ampullen. Innholdet av ampullen overføres så tilbake til den gjenværende HBSS for å bringe sluttkonsentrasjonen til 4 ug/ml Calcein AM.

Fluoro-blokkplaten fjernes fra inkubatoren og toppinnskuddsplaten separeres og "flikkes" for å fjerne overskytende media som kleber til innskuddene. Innskuddsplaten overføres så til en frisk 24 brønners plate inneholdende 500 ul/brønn av 4 ug/ml Calcein AM. Platen inkuberes så i 1 V2time ved 37°C, 5% C02.

Etter inkubering blir platene lest på en Cytofluor II ved en eksitasjon på 485 nm og en emisjon på 530 nm. De fluoro-blokk-inneholdende innskuddene tillater kun at celler som har migrert til bunnen, telles. Data overføres til Excel for beregninger, grafer settes opp ved bruk av SigmaPlot og SigmaStat benyttes for signifikanstester (t-test). (Figur 7). Rørdannelsen kvantiteres ved telling av antallet forgreningspunkter (to uavhengige strenger som henger sammen) i 3 uavhengige felt ved 4x forstørrelse. Resultatene er rapportert som følger:

Disse resultater viser den unike evne til FTY720-fosfat eller forbindelse C-fosfat til å virke som en agonist for angiogenese av seg selv, men så overraskende, som en antagonist av SIP-mediert angiogenese. Forbindelse C-fosfat er fortrinnsvis racematet eller R-enantiomeren. PTx benyttes som en kontroll for å inhibere Gia (EDG-1) mediert aktivitet.

B. In vivo referanse eksempler

B. 1 Antitumoraktivitet

Antitumoraktivitet uttrykkes som T/C% (midlere økning i tumorvolumer av behandlede dyr dividert med den midlere økning av tumorvolumene i kontrolldyr multiplisert med 100).

Alikvoter av cancercelelr (lx IO<7>), for eksempel human A375 melanomaceller, transplanteres inn i BALB/ c- nu/ nu mus. Når tumorene har nådd ca. 10 mm x 10 mm i størrelse, tilskrives dyrene vilkårlig fire undergrupper og behandling med en forbindelse med formel I initieres. Dyrene avlives etter 2 ukers behandling på hvilket tidspunkt tumorer og vev høstes og prepareres for morfologisk og molekylær analyse. Størrelsen av tumoren bestemmes med en skyvelær. I denne analyse sinker en SIP agonist, for eksempel forbindelse B eller C (i hydrokloridsaltform) tumorvekst ved administrering i doser på fra 0,5 til 5 mg/kg i forhold til saltoppløsningskontroll, for eksempel resulterte forbindelse C-HC1 med administrering i en dose på 2,5 mg/kg 5x/uke i en endelig T/C-verdi på 30%.

B.2 Kombinasjon med en VEGF-R proteintyrosinkinaseinhibitor Nakne mus som var transplantert med human MDA-MB-435 brysttumorer ble behandlet i 2 uker med en VEGF-R proteintyrosinkinaseinhibitor, for eksempel l-(4-kloroanilino)-4-(4-pyridylmetyl)ftalazinsuksinat i doser på 100 mg/kg p.o. 5x/uke, en SIP-reseptoragonist, for eksempel forbindelse C (hydrokloridsalt) i en dose på 2,5 mg/kg i.v. 5x/uke, eller en kombinasjon av disse. Antitumor uttrykkes som T/C% som antydet ovenfor. En kombinasjon av forbindelse C-HC1 med l-(4-kloroanilino)-4-(4-pyridylmetyl)fralazinsuksinatet gir en større antitumoreffekt (T/C% 27) sammenlignet med hvert av midlene alene (forbindelse C-HC1, T/C 66%; l-(4-kloroanilino)-4-(4-pyridylmetyl)fralazinsuksinat, T/C% 91). Gode antitumorresponser oppnås også når nakne mus transplanteres med human A375 melanomaceller og behandles på tilsvarende måte med den samme kombinasjonen: de kombinerte behandlinger resulterer i en T/C% 15 mens behandling med hvert medium alene resulterte i T/C% 35 henholdsvis 44.

B. 3 Antiangiogenisk aktivitet

Porøse kamre inneholdende (i) spingosin-1-fosfat (5 uM/kammer) eller (ii) human VEGF (1 ug/kammer) i 0,5 ml 0,8% vekt/volum agar (inneholdende 20 U/ml heparin) implanteres subkutant i musenes flanke. SIP eller VEGF induserer vekst av vaskularisert vev rundt kammeret. Denne respons er doseavhengig og kan kvantiteres ved å måle vekten og blodinnholdet i vevet. Mus behandles en gang daglig (i) oralt med forbindelse A (0,3, 3, 30 eller 50 mg/kg) eller (ii) intravenøst med R enantiomeren av forbindelse C (2,5 mg/kg) eller (iii) intravenøst med S enantiomeren av forbindelse C (2,5 mg/kg) eller (iv) oralt eller intravenøst med bærer (5% glukose, 10 ml/kg), med start 4-6 timer før implantering av kamrene, og det hele fortsatte i 4 dager. Dyrene ble avlivet for måling av det vaskulariserte vev 24 timer etter den siste dose. Vekten og blodinnholdet av det vaskulariserte vev rundt kammeret bestemmes. Dyr behandlet med forbindelse A eller med R- eller S-enantiomeren av forbindelse C viste redusert vekt og/eller blodinnhold i det vaskulariserte vev sammenlignet med dyr som kun var behandlet med bærer.

C. Klinisk prøve

Cl Undersøkelse av den kliniske fordel ved en SIP reseptoragonist, for eksempel en forbindelse med formel I, II eller III, for eksempel forbindelse A, B eller C 20 pasienter med fremskredne, avanserte faste tumorer, resistente eller refraktoriske mot standardterapier, fikk nevnte forbindelse i en dose som bestemt ved en doseeskaleringsstudie. Den generelle, kliniske tilstand for pasienten undersøkes hver uke ved fysisk og laboratorieundersøkelse. Forandring i tumor- og metastasebyrden bedømmes hver annen måned ved radiologisk undersøkelse. I utgangspunktet fikk pasientene behandling i 2 måneder. Deretter forble de på behandling så lenge deres sykdom ikke ble alvorligere og medikamentet ble tolerert tilfredsstillende.

Hovedvariabler for evaluering: Sikkerhet (ugunstige evenementer), standard serum biokjemi og hematologi, tumordimensjoner ved datamaskintomografisk (CT) scannering eller magnetisk resonansbilledopptak (MRI).

C.2 Kombinert behandling

Egnede kliniske studier er for eksempel åpenmerkede, ikke-randomiserte doseeskaleringsstudier i pasienter med avanserte, faste tumorer. Slike studier viser særlig synergisme av de aktive bestanddeler i oppfinnelsens kombinasjon. De fordelaktige effekter på proliferative sykdommer kan bestemmes direkte gjennom resultatene av disse studier eller ved forandringer i studieoppsettet slik dette er velkjent for fagmannen. Slike studier er spesielt egnet for å sammenligne effektene av en monoterapi ved bruk av den aktive bestanddel og en kombinasjon ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis blir dosen av middel (a) eskalert til man når den maksimale tolererte dose og ko-midlet (b) administreres med en fastdose. Alternativt blir middel (a) administrert i en fast dose og dosen av ko-middel (b) eskaleres. Hver pasient mottar dosen av midlet (a) enten daglig eller intermittent. Fiktiviteten med behandlingen kan bestemmes i slike studier, for eksempel etter 12,18 eller 24 uker ved radiologisk evaluering av tumorene hver 6. uke.

Alternativt kan en placebo-kontrollert dobbeltblindstudie benyttes for å bevise fordelen ved kombinasjonen av oppfinnelsen som beskrevet her.

Daglige doseringer slik det kreves ved gjennomføring av anvendelsen ifølge oppfinnelsen når en SIP reseptoragonist alene benyttes, vil variere for eksempel avhengig av den benyttede forbindelse, verten, administreringsmodus og alvoret ved tilstanden som behandles. En foretrukket daglig dose ligger fra rundt 0,1 til 100 mg som en enkeltdose eller i oppdelte doser. Egnede, daglige doser for pasienter ligger i størrelsesorden for eksempel fra 0,1 til 50 mg p.o. SIP reseptoragonisten kan administreres på en hvilken som helst hensiktsmessig måte, særlig enteralt, for eksempel oralt, for eksempel i form av tabletter, kapsler, drikkeoppløsninger, nasalt, pulmonært (ved inhalering) eller parenteralt, for eksempel i form av injiserbare oppløsninger eller suspensjoner. Egnede enhetsdoseformer for oral administrering omfatter fra ca. 0,1 til 30 mg og vanligvis 0,25 til 30 mg SIP reseptoragonist, sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable diluenter eller bærere. For å inhibere angiogenese er det viktig å velge en tilstrekkelig høy dose av SIP reseptoragonisten da lave konsentrasjoner SIP reseptoragonister fremmer angiogenese. En egnet dose for å oppnå en antiangiogenisk effekt når en SIP agonist administreres til en pasient, kan velges ved konsentrasjons- og doseeskalerende studier, som beskrevet under A, B og C ovenfor.

Kombinasjonen ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i kombinasjon med kirurgisk intervensjon, mildt forlenget helkroppshypertermi og/eller bestrålingsterapi.

Denne administrering av en farmasøytisk kombinasjon ifølge oppfinnelsen resulterer i

en fordelaktig effekt, for eksempel en synergistisk terapeutisk effekt, for eksempel med henblikk på å sinke, stanse eller reversere neoplasmadannelse, metastasespredning eller -vekst eller lengre varighet av tumorresponsen eller inhibering av angiogenese; den kan også resultere i andre fordelaktige effekter, for eksempel mindre bivirkninger, en forbedret livskvalitet eller en redusert mortalitet og morbiditet, sammenlignet med en monoterapi som kun anvender en av de farmasøytisk aktive bestanddeler som benyttes i kombinasjonen ifølge oppfinnelsen. Særlig er behandlingen av en tumor som er refraktorisk til andre kjemoterapeutika, kjent som anti-cansermidler.

En ytterligere fordel er at de lavere doser av de aktive bestanddeler i kombinasjonen ifølge oppfinnelsen for eksempel kan benyttes idet dosene ikke bare ofte er mindre, men også anvendes mindre hyppig, eller de kan benyttes for å redusere insidensen av bivirkninger mens man kontrollerer veksten av neoplasmadannelsen. Dette er i henhold til ønsker og krav hos pasientene som behandles.

I henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen omfatter en foretrukket, farmasøytisk kombinasjon

a) en forbindelse med formel I eller IVa, og

b) som et ko-middel, en eller flere forbindelser som antydet under avsnittene (ii), (iii), (iv), (v), (vii) eller (xi) ovenfor, for eksempel karboplatin, cisplatinum, paclitaksel,

docetaksel, gemcitabin, doksorubicin, en forbindelse som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av den vaskulære, endoteliale vekstfaktorfamilie av

reseptortyrosinkinaser (VEGFR) eller de plateavledede vekstfaktorreseptorer (PDGFR), et bisfosfonat eller en mTOR-inhibitor.

En ytterligere forbedring ifølge oppfinnelsen ligger i bruken av SIP reseptoragonister (a) i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel (b) ved behandling av lymfatisk eller myeloid cancer, for eksempel som beskrevet ovenfor. Kombinasjonen kan omfatte som ytterligere ko-middel b) for eksempel busulfan, cytarabin, 6-tioguanin, fludarabin, hydroksyurea, prokarbazin, bleomycin eller metotreksat. Topoisomerase II inhibitorer, for eksempel daunorubicin eller spesielt forbindelser som sikter på, reduserer eller inhiberer aktiviteten av PDGFR- eller c-Abl-familiemedlemmer og deres genfusjonsprodukter, for eksempel imatinib, er foretrukne som ko-midler (b), for eksempel som bruk i behandling av en lymfatisk cancer.

Uttrykkene "ko-administrering" eller "kombinert administrering" eller lignende, slik de benyttes her, er ment å omfatte administrering av de valgte, terapeutiske midler til en enkelt pasient, og er ment å inkludere behandlingsregimer der midlene ikke nødvendigvis administreres av det samme administreringsmodus eller samtidig.

En gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe et farmasøytisk preparat omfattende en mengde som, som enhet, er terapeutisk effektiv mot en proliferativ, malignant sykdom, omfattende en kombinasjon ifølge oppfinnelsen. I denne kombinasjonen kan det første middel a) og ko-middel b) administreres sammen, det ene etter det andre eller separat i en kombinert enhetsdoseform eller to separate enhetsdoseformer. Enhetsdoseformen kan også være en fast kombinasjon.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på i og for seg kjent måte og er de som er egnet for enteral, for eksempel oral eller rektal, og parenteral administrering til pattedyr (varmblodige dyr), inkludert mennesker, omfattende en terapeutisk effektiv mengde av minst en farmakologisk aktiv kombinasjonspartner alene, for eksempel som beskrevet ovenfor, eller i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller diluenter, spesielt egnet for enteral eller parenteral applikering.

Egnede, farmasøytiske preparater inneholder for eksempel fra rundt 0,1% til rundt 99,9%, fortrinnsvis fra rundt 1% til rundt 60%, av den eller de aktive bestanddeler. Farmasøytiske preparater for kombinasjonsterapi for enteral eller parenteral administrering er for eksempel de i enhetsdoseformer som sukkerbelagte tabletter, tabletter, kapsler eller suppositorier eller ampuller. Hvis ikke annet er sagt, fremstilles disse på i og for seg kjent måte, for eksempel ved hjelp av konvensjonell blanding, granulering, sukkerbelegging, oppløsning eller lyofilisering. Det er klart at enhetsinnholdet av en kombinasjonspartner inneholdt i en individuell dose av hver doseringsform ikke i seg selv nødvendigvis må utgjøre en effektiv mengde fordi den nødvendige effektive mengde kan nås ved administrering av et antall enhetsdoser.

Særlig kan en terapeutisk effektiv mengde av hver av kombinasjonspartnerne i kombinasjonen ifølge oppfinnelsen administreres samtidig eller sekvensielt og i en hvilken som helst rekkefølge, og komponentene kan administreres separat eller som faste kombinasjoner. For eksempel kan metoden for å forsinke progresjonen eller behandlingen av en proliferativ, malignant sykdom ifølge oppfinnelsen omfatte (i) administrering av det første middel a) i fri eller farmasøytisk akseptabel saltform og (ii) administrering av et ko-middel b) i fri eller farmasøytisk akseptabel saltform, samtidig eller sekvensielt i en hvilken som helst rekkefølge, i tilsammen terapeutisk effektive mengder, fortrinnsvis i synergistisk effektive mengder, for eksempel i daglige eller intermittente doser tilsvarende de her beskrevne mengder. De individuelle kombinasjonspartnere i kombinasjonen ifølge oppfinnelsen kan administreres separat til forskjellige tidspunktet under forløpet av terapien eller samtidig i delte eller enkelte kombinasjonsformer. Videre omfatter uttrykket administrering også bruken av et prodrug av en kombinasjonspartner som in vivo konverteres til kombinasjonspartneren som sådan. Oppfinnelsen skal derfor forstås til å omfatte alle slike regimer av samtidig eller alternerende behandling og uttrykket "administrering" skal derfor interpreteres på tilsvarende måte.

Den effektive dose av hver av kombinasjonspartnerne som benyttes i kombinasjonen ifølge oppfinnelsen kan variere avhengig av den spesielle forbindelse eller den farmasøytiske sammensetning som benyttes, administreringsmodus, tilstanden som behandles, og alvoret i tilstanden som behandles. Således blir doseregimet for kombinasjonen ifølge oppfinnelsen valgt i henhold til et spektrum av faktorer som inkluderer administreringsmåte og pasientens renale og hepatiske funksjon. En lege, medisiner eller veterinær med vanlig fagkunnskap kan lett bestemme og foreskrive den effektive mengde av de enkelte aktive bestanddeler som er nødvendig for å forhindre, motvirke eller stanse progresjonen av tilstanden. Optimal nøyaktighet for å oppnå konsentrasjonen av de aktive bestanddeler innenfor området som gir effektivitet uten toksisitet, krever et regime som er basert på kinetikken for den eller de aktive bestanddelers tilgjengelighet til målsetene.

Daglige doser for det første midlet eller den første komponent (a) vil selvfølgelig variere av et antall faktorer som for eksempel den valgte forbindelse, den spesielle tilstand som behandles og den ønskede effekt. Generelt kan imidlertid tilfredsstillende resultater oppnås ved administrering av en SIP reseptoragonist, for eksempel forbindelse A, B eller C, i daglige dosemenger i størrelsesorden ca. 0,1 til 100 mg som en enkelt dose eller i oppdelte doser. SIP reseptoragonisten kan administreres ad en hvilken som helst konvensjonell vei, særlig enteralt, for eksempel oralt, for eksempel i form av tabletter, kapsler, drikkeoppløsninger, eller parenteralt, for eksempel i form av injiserbare oppløsninger eller suspensjoner. Egnede enhetsdoseformer for oral administrering omfatter fra ca. 0,1 til 30 mg komponent (a), for eksempel 0,1 til 25 mg, sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable diluenter eller bærere.

Fadrozol kan administreres oralt til et menneske i en dose som varierer fra rundt 0,5 til rundt 10 mg/dag, fortrinnsvis fra rundt 1 til rundt 2,5 mg/dag. Eksemestan kan administreres oralt til et menneske i en dose som varierer fra rundt 5 til rundt 200 mg/dag, fortrinnsvis fra rundt 10 til rundt 25 mg/dag, eller parenteralt fra rundt 50 til 500 mg/dag, fortrinnsvis fra rundt 100 til rundt 250 mg/dag. Hvis medikamentet skal administreres i et separat, farmasøytisk preparat, kan det administreres i den form som er beskrevet i GB 2.177.700. Formestan kan administreres parenteralt til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 100 til rundt 500 mg/dag og fortrinnsvis fra rundt 250 til rundt 300 mg/dag. Anastrozol kan administreres oralt til et menneske i en dose som varierer fra rundt 0,25 til 20 mg/dag, fortrinnsvis fra rundt 0,5 til rundt 2,5 mg/dag. Amlinoglutemid kan administreres til et menneske i en dose som varierer fra rundt 200 til 500 mg/dag.

Tamoksifencitrat kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 10 til 40 mg/dag.

Vinblastin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 1,5 til 10 mg/m<2>dag. Vincristinsulfat kan administreres parenteralt til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 0,025 til 0,05 mg/kg kroppsvekt<*>uke. Vinorelbin kan administreres til et menneske i en dose som varierer fra rundt 10 til rundt 50 mg/m<2>dag.

Etoposidfosfat kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 25 til 115 mg/m<2>dag, for eksempel 56,8 eller 113,6 mg/m<2>dag.

Teniposid kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 75 til 150 mg omtrent hver annen uke. Doksorubicin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 10 til 100 mg/m<2>dag, for eksempel 25 til 50 mg/m<2>dag. Epirubicin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 10 til 200 mg/m<2>dag. Idarubicin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 0,5 til 50 mg/m<2>dag. Mitoksantron kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 2,5 til 25 mg/m<2>dag.

Paclitaksel kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 50 til 300 mg/m<2>dag. Docetaksel kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rudnt 25 til 100 mg/m<2>dag.

Cyklofosfatmid kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 50 til 1500 mg/m<2>dag. Melfalan kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 0,5 til 10 mg/m<2>dag.

5-fluorouracil kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 50 til 1000 mg/m<2>dag, for eksempel 500 mg/m<2>dag. Capecitabin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 10 til 1000 mg/m<2>dag. Gemcitabinhydroklorid kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 1000 mg/m<2>/uke. Metotreksat kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 5 til 500 mg/m<2>dag.

Topotecan kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 1 til 5 mg/m<2>dag. Irinotecan kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 50 til 350 mg/m<2>dag.

Karboplatin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 200 til 400 mg/m<2>ca. hver 4. uke. Cisplatin kan administreres til et menneske i et doseområde so varierer fra rundt 25 til 75 mg/m<2>rundt hver 3. uke. Oksaliplatin kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 50 til 85 mg/m<2>hver 2. uke.

Imatinib kan administreres til et menneske i et doseområde på rundt 2,5 til 850 mg/dag, helst 5 til 600 mg/dag og aller helst 20 til 300 mg/dag.

Alendronsyre kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 5 til 10 mg/dag. Clodroninsyre kan administreres til et menneske for eksempel i et doseområde som varierer fra rundt 750 til 1500 mg/dag. Etridonsyre kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 200 til 400 mg/dag. Ibandronsyre kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 1 til 4 mg hver 3. eller 4. uke. Risedronsyre kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 20 til 30 mg/dag. Pamidronsyre kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 15 til 90 mg hver 3. eller 4. uke. Tiludronsyre kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 200 til 400 mg/dag.

Trastuzumab kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 1 til 4 mg/m<2>/uke.

Bikalutamid kan administreres til et menneske i et doseområde som varierer fra rundt 25 til 50 mg/m<2>dag. l-(4-kloroanilino)-4-(4-pyridylmetyl)ftalazin eller salt derav, for eksempel succinat, kan administreres til et menneske i et doseområde på rundt 50 til 1500, fortrinnsvis rundt 100 til 750 og aller helst rundt 250 til 500 mg/dag.

Rapamycin eller et derivat derav, for eksempel 40-O-(2-hydroksyetyl)-rapamycin, kan administreres i et doseområde som varierer fra rundt 0,1 til 25 mg.

Formuleringseksempel: mykkapsler

SIP reseptoragonistene, for eksempel en SIP reseptoragonist omfattende en gruppe med formel X, tolereres godt ved de doser som er nødvendig for anvendelse ifølge oppfinnelsen. For eksempel er den akutte LD50for forbindelse A > 10 mg/kg p.o. i rotter og aper.

I et ytterligere aspekt angår foreliggende oppfinnelse bruken av SIP agonister som proangiogeniske medikamenter. Induksjon av neo-angiogenese er i den senere tid erkjent som et utmerket mål i et antall tilstander (for eksempel myokardial angiogenese, sårheling eller diabetisk vaskulær dysfunksjon/vaskulopati).

Som beskrevet ovenfor, viser høye konsentrasjoner av SIP reseptoragonister (2 uM eller større, for eksempel 2-5 uM eller rundt 5 uM) anti-angiogeniske effekter, og SIP reseptoragonister kan inhibere VEGF-indusert angiogenese. På den annen side har lave konsentrasjoner (0,1-1 uM, for eksempel 0,1-0,5 uM eller 0,5 -1 uM) av SIP agonister en forbedrende effekt på angiogenese og er i stand til å potensiere VEGF-mediert angiogenese. Således kan SIP agonister ha tofaseeffekter ved angiogenese.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre:

8. Anvendelse av en SIP agonist, for eksempel en SIP agonist omfattende en gruppe med formel X, for eksempel forbindelse A eller forbindelse A-fosfat, for induksjon av neo-angiogeneseprosessen, for eksempel som et pro-angiogenetisk middel, for eksempel ved indikasjoner der en promosjon av angiogenese er indikert; 9. En fremgangsmåte for fremstilling av et medikament for behandling eller prevensjon av sykdommer mediert ved inhibering av neo-angiogeneseprosessen, for eksempel mediert av anti-angiogenetiske faktorer, for eksempel i indikasjoner der en promosjon av angiogenese er indikert, for eksempel ved sårheling eller ved behandling av myokardialt infarkt eller diabetisk, vaskulær dysfunksjon/vaskulopati, omfattende bruk av en SIP reseptoragonist, for eksempel en SIP agonist omfattende en gruppe med formel X, for eksempel forbindelse A eller forbindelse A-fosfat, som en aktiv bestanddel; 10. En fremgangsmåte for terapi eller prevensjon av sykdommer mediert ved inhibering av neoangiogeneseprosessen, for eksempel mediert ved anti-angiogenetiske faktorer, for eksempel i indikasjoner der en promosjon av angiogenese er indikert, som for eksempel ved sårheling eller ved behandling av myokardialt infarkt eller diabetisk vaskulær dysfunksjon/vaskulopati, omfattende administrering av en effektiv mengde av en SIP reseptoragonist, for eksempel en SIP agonist omfattende en gruppe med formel X, for eksempel forbindelse A eller forbindelse A-fosfat, til et individ som trenger slik behandling.

SIP agonister som er egnet for å fremme angiogenese inkluderer de som er beskrevet ovenfor i relasjon til behandlingen av cancer, for eksempel SIP agonister omfattende en gruppe med formel X eller forbindelser i henhold til formlene I til IX, eller farmasøytisk akseptable salter eller estere derav. Fortrinnsvis er SIP agonisten forbindelse A-fosfat. SIP agonisten kan benyttes alene eller i kombinasjon med ett eller flere ytterligere midler som fremmer angiogenese, for eksempel VEGF.

For å fremme angiogenese er det viktig å velge en tilstrekkelig lav dose av SIP reseptoragonisten da høye konsentrasjoner av SIP reseptoragonisten inhiberer angiogenese. En egnet dose for å tilveiebringe en pro-angiogenisk effekt når SIP agonisten administreres til en pasient, kan velges ved konsentrasjons- og doseeskalerende studier som beskrevet under A, B og C ovenfor.

Beskrivelse av figurene

Figur 1

viser at forbindelse A-fosfat sterkt fremmer dannelse av kapillærlignende nettverk i en klokkeformet, doseavhengig måte som viser maksimal aktivitet rundt 0,5 uM.

Figur 2

viser at både forbindelse A-fosfat og forbindelse A ved 0,5 -1 uM ikke forringer VEGF-mediert remodellering, men heller samarbeider med polypeptidvekstfaktoren.

Figur 3

viser at forbindelse A-fosfat så vel som SIP-stimulert rørdannelse praktisk talt fullstendig inhiberes av pertussistoksin (PTX, 50 ng/ml), en inhibitor av heterotrimere G-proteiner av ai/0-typen. Dette kan interpreteres som en mulig involvering av EDG-1 (SIPi) reseptormedierte signaleringsevenementer i forbindelse A-fosfat-stimulerte bioresponser.

Figur 4

viser at spingosin i en mengde av 1 uM, som i seg selv synes å være mindre potent enn SIP, forringer evnen til både SIP og forbindelse A-fosfat til å indusere kapillærlignende strukturer, uten å ha noen inhibitorisk effekt på VEGF-indusert rørdannelse. I denne forbindelse oppfører spingosin seg forskjellig fra forbindelse A. Data antyder at balansen mellom spingosin og SIP synes å være kritisk viktig for endotelial celleaktivering/angiogenese, mest sannsynlig via EDG reseptorfamilien. Viktig er at

høye konsentrasjoner av spingosin og forbindelse A (2 - 5 uM) inhiberer VEGF-utløst rørdannelse.

Figur 5

viser at behandlingen av HUVEC med forbindelse A-fosfat i en mengde på 0,5 uM kan resultere i transient aktivering av ERK1/2 med en topp for fosforylering/aktivering ved 10 minutter og retur til grunnlinjen ved 20 minutter.

Figur 6

Viser resultater når det ble testet hvorvidt forbindelse A, forbindelse A-fosfat, spingosin eller SIP også induserer vevfaktor på HUVEC. De data som ble funnet viser at ingen av disse forbindelser alene eller i kombinasjon kan heve vevfaktoraktiviteten som vist i figur 6. Forbindelse A og forbindelse A-fosfat kan forbedre noe VEGF- men ikke TNF-a-indusert vevfaktor.

Figur 7

Viser effekten av forbindelse C i en SIP-mediert HUVEC rørdannelsesanalyse.

De følgende forkortelser benyttes:

BSA: bovin serumalbumin

ECGS: endotelial cellevekstfaktorsett ECL: forbedret kjemiluminescens

S: spingosin PBS: fosfatbufret saltoppløsning JNK1/2: c-jun-N-terminal kinasel/2 RT: romtemperatur

TF ekvivalenter: vevfaktorekvivalenter

EGR-1/NFAT: tidlig vekstresponsprotein 1/nukleær faktor av aktiverte T-celler

F1P: Forbindelse A-fosfat (FTY720-fosfat)

Ved bruk av SIP reseptoragonistene, for eksempel SIP agonistene som omfatter en gruppe med formel X, ved å fremme angiogenese, kan påvises i for eksempel i henhold til de metoder som er beskrevet nedenfor.

D. Cellekultur og materialer

Humane umbilikalvene-endotelialceller (HUVEC) dyrkes ved 37°C og 5% CO2i medium M199 supplert med 20% SCS (HyClone, Logan, UT), lU/ml heparin, 50 ug/ml ECGS, 2 mM glutamin, 100 U/ml penicillin og 0,1 mg/ml streptomycin. Celler benyttes for forsøk opp til passasjenummer 5. Kortsultet HUVEC oppnås ved sulting med 1% SCS-holdig M199 i 5 timer. Rekombinant human VEGF165oppnås fra PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Fosfo-spesifikke ERKl/2, p38 kinase polyklonale antistoffer, nonfosfo ERKl/2 antistoffer og LumiGLO kjemiluminescent reagens er oppnådd fra New England BioLabs (Beverly, MA), polyklonale IkB antistoffer fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California). Peroksidasekonjugerte apeanti-kanin immunoglobulin G (IgG) og saue-anti-muse IgG ble ervervet fra Amersham LIFE SCIENCE (Amersham Place, England). Immobilon-P overføringsmembraner er produkter fra Millipore (Bedford, MA). S oppnås fra Sigma Chemical Co.; SIP fra Biomol. Forbindelse A-fosfat forrådsoppløsning fremstilles i henhold til følgende protokoll. Forbindelse A-fosfat oppløses i metanol fulgt av konsentrert HC1 (0,5 mg forbindelse A-fosfat i 500 ul metanol pluss 2 ul HC1). Oppløsningsmiddel fra den resulterende oppløsning fordampes under vakuum og den oppnådde rest gjenoppløses (variant 1) i 0,1% avfettet BSA-oppløsning i 500 ul deionisert vann eller (variant 2) i 0,5% Triton X-100 i deionisert vann. De resulterende forholdsoppløsninger (2,5 mM) sonikeres og lagres ved 4°C.

Clottinganalvse

Cellene sås i 6-brønners plater ved 80 - 90% konfluens og dyrkes over natten. Cellene skrapes fra platene og analyseres på vevfaktoraktivitet i henhold til metoden som beskrevet av M. Clauss i J. Biol. Chem. 271, 17629-17634 (1996), Mechtcheriakova, D. , Blood 93, 3811-3823 (1999). Kort sagt blir etter induksjon i 4 timer med VEGF (1,5 nM), TNF-a (100 U/ml), S (0,5 - 2 uM), SIP (0,5 - 2 uM), forbindelse A (0,5 - 2 uM) og forbindelse A-fosfat (0,5 - 2 uM) cellene vasket to ganger og så skrapet i 1 ml clottingbuffer (12 mM natriumacetat, 7 mM dietylbarbitat og 130 mM natriumklorid; pH 7,4). 50 ul resuspenderte celler blandes med 50 ul sitrert plasma og clottingstidene bestemmes etter rekalsifisering med 50 ul 20 mM CaCb-oppløsning ved 37°C. TF-ekvivalenter bestemmes ved brujk av en standard kurve oppnådd fra kaninhjerne-tromboplastin.

E. Western blotanalyse

Etter forskjellige behandlinger ble cellene vasket to ganger med kald PBS, lysert i 100 ul Laemmli-buffer, skrapet og oppvarmet i 5 minutter ved 95°C. Totalcellelysater separeres med SDS-PAGE og overføres til Immobilon-P membran. Membranen blokkeres i 30 minutter med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og 3% skummet melk og inkuberes i 1 time ved romtemperatur med et primært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer. Den oppnådde membran vaskes tre ganger i 5 minutter med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og inkuberes med peroksidasekonjugert sekundærantistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter et vasketrinn inkuberes membranen i 1 minutt med ECL reagens og eksponeres til film etter behov. For nyprøving med et annet antistoff vaskes membranen to ganger med PBS, strippes i 30 minutter ved 55°C med strippebuffer (62,5 mM Tris-HCL, pH 6,8, 2% SDS, 100 mM 2-merkaptoetanol) og vaskes tre ganger i 5 minutter med PBS ved romtemperatur. Membranen lagres våtomhyllet i SaranWrap ved 4°C etter hver immunodetektering.

In vitro angiogeneseanalyse på Matrigel

Morfogenese av endotelialceller inn i kapillærlignende strukturer på vekstfaktorredusert Matrigel matriks (BD Bioscience) gjennomføres i henhold til produksjonsprosedyren. Kort sagt blir HUVEC trypsinisert, resuspendert i serumfritt Ml99 medium inneholdende soyabønnetrypsininhibitor (1 mg/ml, Sigma). Etter sentrifugering resuspenderes cellene i serumfritt medium ved en densitet på 0,5 x 10<5>celler/ml, og cellesuspensjonen sås i 96-brønners cellekultur (Costar,Corning Incorporated) forbelagt med 50 ul Matrigel i fravær eller nærvær av forskjellige stimuli: VEGF ved 1,5 nM, SIP ved 0,1 - 2 uM, S ved 0,5 - 2 uM, forbindelse A ved 0,5 - 2 uM og forbindelse A-fosfat ved 0,1-2 uM. 8 timer senere blir celler på Matrigel fiksert med 3% formaldehyd i PBS og holdt ved 4°C. Resultatene kvantiteres fra bilder tatt opp med et Nikon Diafot mikroskop utstyrt med et avkjølt CCD kamera (Kappa GmbH, Gleichen, Tyskland) ved direkte telling av forgreningspunkter på to mikroskopiske felt fra hver brønn, foretatt i duplikat.

F. Forbindelse A-fosfat induserer morfogenese av endoteliale celler ved in vitro rørdannelsesanalyse på Matrigel og en eventuell involvering av Gi-medierte signalveie(r)

Effekten av forbindelse A og forbindelse A-fosfat på morfogenisk differensiering ved endotelialceller bestemmes ved bruk av en in vitro angiogeneseanalyse på Matrigel. Endotelialcellemorfogenese er en kompleks prosess som krever celle-ekstracellulære matriks-interaksjoner fulgt av matriks modellering, stimulert migrering, celleinteraksjoner og perivaskulær proteolyse. Som vist i figur 1, kan forbindelse A-fosfat sterkt fremme kapillærlignende nettverksdannelse på en klokkeformet, doseavhengig måte som viser maksimal aktivitet rundt 0,5 uM. Antallet forgreningspunkter pr. mikroskopisk felt, som reflekterer induksjonspotensen for den angjeldende stimulus, er sammenlignbar for forbindelse A-fosfat og SIP, og kan signifikant overskride de VEGF-utløste effekter. Forbindelse A per se har ved 0,5 -1 uM en svak, i sammenligning med forbindelse A-fosfat, men konsistent, forbedrende effekt. Både forbindelse A-fosfat og forbindelse A forringer ved 0,5 -1 uM ikke VEGF-mediert remodellering, men samarbeider heller med polypeptidvekstfaktor (se for eksempel figur 2). Videre blir forbindelse A-fosfat-, så vel som SIP-stimulert rørdannelse, fullstendig inhibert av pertussistoksin (PTX, 50 ng/ml), en inhibitor av heterotrimere G-proteiner av a,i/0-typen. Dette kan enterpreteres som en mulig involvering av EDG-1 (SIPi) reseptor-mediert signaleringsevenementer i forbindelse A-fosfatstimulert biorespons (se for eksempel figur 3). S ved 1 uM, som i seg selv synes å være mindre potent enn SIP, forringer evnen for både SIP og forbindelse A-fosfat til å indusere kapillærlignende struktur uten å ha noen inhibitorisk effekt på den VEGF-induserte rørdannelse (se for eksempel figur 4). I denne forbindelse oppfører S seg forskjellig fira forbindelse A. Data antyder at balansen mellom S og SIP synes å være kritisk viktig for endotelial celleaktivering/angiogenese, mest sannsynlig via EDG-reseptorfamilien. Viktig er det at høye konsentrasjoner av S og forbindelse A (2 - 5 uM) inhiberte VEGF-utløserrørdannelse. Disse data antyder bifase doseavhengige effekter av forbindelse A og forbindelse A-fosfat på angiogenese in vitre.

G. Aktivering av ERKl/2 kinase med forbindelse A-fosfat

Signaltransduksjon via MAP kinaser spiller en nøkkelrolle ved et antall endotelialcellefunksjoner. Behandling av HUVEC med forbindelse A-fosfat ved 0,5 uM kan resultere i transient aktivering av ERKl/2 med en topp for fosforylering/aktivering ved 10 minutter og retur til bunnlinjen etter 20 minutter (se for eksempel figur 5). Ingen aktivering av p38 kinase og JNK1/2 med forbindelse A-fosfat, er detekterbar i HUVEC. Videre kan forbindelse A-fosfat utløse ERKl/2 aktivering på doseavhengig måte, noe som viser en sterkere aktivitet ved 2 uM. Dette er i motsetning til resultatene fra rørdannelsesanalysene der forbindelse A-fosfat ved 2 uM kan være mindre potent enn ved 0,5 uM. Verken forbindelse A eller S er i stand til å indusere MAP-kinaseaktivering i endoteliale celler i en kinetikk som ligger fra 5 minutter til 60 minutters behandling. For å estimere den mulige rolle ved inflammatorisk/NFKB-avhengig program i forbindelse A-fosfat-stimulerte bioresponser av endoteliale celler, reprobet membraner med anti-licB antistoffer. IicB-nivåene påvirkes ikke av forbindelse A-fosfat-behandling. Videre kan behandling av endotelialceller med forbindelse A-fosfat svikte når det gjelder å indusere E-selektinekspresjon som et NFicB-avhengig sekundærresponsivt gen. Således antyder disse data sterkt at forbindelse A-fosfat signalering ikke involverer NFicB-aktivering, hovedkaskaden i den akutte, inflammatoriske resons i endotelialceller.

H. Forbindelse A og forbindelse A-fosfat induserer ikke vevfaktorekspresjonen i endoteliale celler

Et viktig, karakteristisk trekk ved både klassisk inflammatorisk stimulus TNF-a og den hovedangiogeniske vekstfaktor VEGF på endotelialceller er deres evne til å oppregulere ved faktoren. Forbindelse A, forbindelse A-fosfat, S eller SIP testes hvorvidt disse også induserer vevfaktor på HUVEC. De oppnådde data viser at ingen av disse forbindelser alene eller i kombinasjon kan øke vevfaktoraktiviteten (se for eksempel figur 6). Forbindelse A og forbindelse A-fosfat kan i en viss grad øke VEGF-, men ikke TNF-a-indusert vevfaktor. De oppnådde data antyder at forbindelse A, forbindelse A-fosfat, S og SIP mekanistisk arbeider distinkt til angiogenisk VEGF og inflammatorisk TNF-a. I. Bindingsaffinitet av SIP reseptoragnoister til individuelle human SIP reseptorer kan bestemmes i de følgende analyser:

Transienttransfeksjon av human SIP reseptorer i HEK293 celler

EDG-reseptorer og Gi-proteiner klones og like mengder 4cDNA'er for EDG-reseptoren, Gi-a, Gi-P og Gi-y blandes og benyttes for å transfektere monosjikt av HEK293 celler ved bruk av calsiumfosfatprecipitatmetoden (M. Wigler et al., Cell. 1997; 11; 223 og DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 2000; 57; 753). Kort sagt blir en DNA blanding inneholdende 25 ug DNA og 0,25 M CaCl satt til HEPES-bufret 2 mM Na2HP04. Subkonfluente monosjikt av HEK293 celler forgiftes med 25 mM klorokin og DNA-presipitatet bringes så til cellene. Etter 4 timer vaskes monosjiktene med fosfatbufret saltoppløsning og refed-medium (90% 1:1 Dulbeccos modifiserte essensielle medium (DMEM):F-12 + 10% føtalt bovinserum. Cellene ble høstet 48 - 72 timer etter tilsetning av DNA ved skraping i HME-buffer (i mM: 20 HEPES, 5 MgCl2, 1 EDTA, pH 7,4) inneholdende 10% sukkrose på is, og disruptert ved bruk av en Dounce homogenisør. Etter sentrifugering ved 800xg fortynnes supernatanten med HME uten sukkrose og sentrifugeres ved 100.000xg i 1 time. Den resulterende pellet rehomogeniseres og sentrifugeres en andre time ved lOO.OOOxg. Denne råmembranpellet resuspenderes i HME med sukkrose, alikvoteres og bråfryses ved nedsenking i flytende nitrogen. Membranene lagres ved 70°C. Proteinkonsentrasjonen bestemmes spektroskopisk ved Bradford proteinanalyse.

GTPyS bindingsanalyse ved bruk av SIP reseptor/ HEK293 membranpreparater GTPyS bindingsforsøk gjennomføres som beskrevet av DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 200; 57:753. Ligandmediert GTPyS binding til G-proteiner måles i GTP-bindingsbuffer (i mM: 50 HEPES, 100 NaCl, 10 MgCl2, pH 7,5) ved bruk av 25 ug membranpreparater fra transienttransfekterte HEK293 celler. Ligand settes til membranene i nærvær av 10 uM GDP og 0,1 nM [<35>S]GTPyS (1200 Ci/mmol) og inkuberes ved 30°C i 30 minutter. Bundet GTPyS separeres fra ikke-bundet ved bruk av Brandel-høster (Gaithersburg, MD) og telles i en væskescintillasjonsteller.

Claims (9)

1. Anvendelse av en SIP reseptoragonist med formel I

hvori Ri er en rett eller forgrenet (C12-22) karbon kjede - som i kjeden kan ha en binding eller heteroatom valgt fra en dobbeltbinding, en trippel binding, O, S, NR6; hvori R6er H, alkyl, aralkyl, acyl eller alkoksykarbonyl og karbonyl og/eller - som kan ha som substituent alkoksy, alkenyloksy, alkynyloksy, aralkyloksy, acyl, alkylamino, alkyltio, acylamino, alkoksykarbonyl, alkoksykarbonylamino, acyloksy, alkylkarbamoyl, nitro, halogen, amino, hydroksyimino, hydroksy eller karboksy; eller Ri er - en fenylalkyl der alkyl er en rett eller forgrenet (C6-2o)karbonkjede; eller - en fenylalkyl der alkyl er en rett eller forgrenet (Ci_3o)karbonkjede der fenylalkyl er substituert med - en rett eller forgrenet (C6-2o)karbonkjede som eventuelt er substituert med halogen, - en rett eller forgrenet (C6-2o)alkoksykjede som eventuelt er substituert med halogen, - en rett eller forgrenet (C6-2o)alkenyloksy, - fenylalkoksy, halofenylalkoksy, fenylalkoksyalkyl, fenoksyalkoksy eller fenoksyalkyl, - cykloalkylalkyl substituert med C6-2oalkyl, - heteroarylalkyl substituert med C6-2oalkyl, - heterosyklisk C6-2oalkyl, eller - heterocyklisk alkyl substituert med C2-2oalkyl, og der alkyldelen kan ha i karbonkjeden, en binding eller et heteroatom valgt blant en dobbeltbinding, en trippelbinding, O, S, sulfinyl, sulfonyl eller NR<5, der R6er som definert ovenfor, og - som en substituent, alkoksy, alkenyloksy, alkynyloksy, aralkyloksy, acyl, alkylamino, alkyltio, acylamino, alkoksykarbonyl, alkoksykarbonylamino, acyloksy, alkylkarbamoyl, nitro, halogen, amino, hydroksy eller karboksy, og hver av R2, R3, R4og R5uavhengig er H, Ci^alkyl eller acyl, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, eller en forbindelse med formel IVa

hvori der Xaer O, S, NRiseller en gruppe -(CH2)na-, hvilken gruppe er usubstituert eller substituert med 1 til 4 halogen; na er 1 eller 2, Ris er H eller (Ci^alkyl) der alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; Riaer H, OH, (Ci-4)alkyl eller 0(Ci-4)alkyl der alkyl er usubstituert eller substituert med 1 til 3 halogen; Rn, er H, OH eller (Ci.

4)alkyl, der alkyl er usubtituert eller substituert med halogen, hver R2auavhengig er valgt blant H eller (Ci^)alkyl, hvilken alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; R3aer H, OH, halogen eller 0(Ci-4)alkyl, der alkyl er usubstituert eller substituert med halogen; eller et farmasøytisk akseptable salt eller hydrat derav; for fremstilling av et medikament for å forebygge eller behandle lymfoproliferative eller myeloproliferative lidelser, hvori medikamentet administreres med et kjemoterapeutisk middel.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori lymfoproliferative lidelse er tumorer i tumorer i blod eller det lymfatiske system.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvori myeloproliferative lidelse er myleoid kreft.

4. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori medikamentet administreres intermittent.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori SIP reseptor agonisten er 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]propan-l,3-diol eller en forbindelse med formel IVa hvori R2aer H, R3aer OH, Xaer O og hver av Riaog Riber OH (benevnt FTY720-fosfat), eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvori SIP reseptor agonisten er 2-amino-2-[2-(4-oktylfenyl)etyl]propan-1,3-diol hydroklorid.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori medikamentet administreres samtidig eller i sekvens med det kjemoterapeutiske middel.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori det kjemoterapeutiske middel er valgt fra i. en aromataseinhibitor, ii. et antiøstrogen, et anti-androgen eller en gonadorelinagonist, iii. en topoisomerase I inhibitor eller topoisomerase II inhibitor, iv. et mikrotubulaktivt middel, et alkyleringsmiddel, en antineoplastisk antimetabolitt eller en platinaforbindelse, v. en forbindelse som søker/reduserer en protein- eller lipidkinaseaktivitet eller en protein- eller lipidfosfataseaktivitet, en ytterligere antiangiogenisk forbindelse eller en forbindelse som induserer celledifferensieringsprosessene, vi. en bradykinin 1 reseptor eller en angiotensin II antagonist, vii. en cyklooksygenaseinhibitor, et bisfosfonat, en histon deacetylaseinhibitor, en heparanaseinhibitor, en biologisk responsmodifiserer, en ubikitineringsinhibitor, eller en inhibitor som blokkerer anti-apoptotiske veier, viii. en inhibitor av Ras onkogeniske isoformer, ix. en telomeraseinhibitor, x. en proteaseinhibitor, en matriks metalloproteinaseinhibitor, en metionin aminopeptidaseinhibitor, eller en proteosominhibitor, og/eller xi. en mTOR inhibitor.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori det kjemoterapeutiske middel er valgt fra busulfan, cytarabin, 6-tioguanin, fludarabin, hydroksyurea, prokarbazin, bleomycin, metotreksat, er topoisomerase II inhibitor eller en forbindelse som er målrettet mot, reduserer eller inhiberer aktiviteten av plateavledede vekstfaktorreseptorer (PDGFR) eller c-Abl-familiemedlemmer og deres genfusjonsprodukter og hvori anvendelsen er for behandling eller forebygging av tumorer i blod eller det lymfatiske system.