NO308618B1 - Kimær DNA-sekvens som koder for et membranbundet protein, ekspresjonskassett og celle som omfatter sekvensen, samt anvendelse av nevnte celle og retroviruskonstruksjon som omfatter nevnte ekspresjonskassett - Google Patents

Description

Området for denne oppfinnelse er kimær DNA-sekvens som koder for et membranbundet protein, ekspresjonskassett og celle som omfatter sekvensen, samt anvendelse av nevnte celle og retrovirus-konstruksjon som omfatter nevnte ekspresjonskassett .

Regulering av celleaktiviteter oppnås ofte ved binding av liganden til en overflatemembranreseptor. Dannelse av komplekset med den ekstracellulære del av reseptoren resulterer i en forandring i konformasjon, idet cytoplasmådelen av reseptoren gjennomgår en forandring som resulterer i at et signal overføres i cellen. I noen tilfeller resulterer forandringen i cytoplasmadelen i binding til andre proteiner, hvor de andre proteiner aktiveres og kan utføre forskjellige funksjoner. I noen situasjoner blir cytoplasmadelen autofosforylert eller fosforylert, hvilket resulterer i en forandring i dens aktivitet . Disse fenomener er ofte koplet med sekundære bud-bringere, så som kalsium, syklisk adenosinmonofosfat, inositolfosfat, diacylglycerol og liknende. Binding av liganden resulterer i at et spesielt signal induseres.

Det er en rekke tilfeller hvor man kan ønske å få indusert et signal ved anvendelse av en annen ligand. Man kan for eksempel ønske å aktivere spesielle T-celler, hvor T-cellene så vil være effektive som cytotoksiske midler, eller aktive-ringsmidler ved utsondring av interleukiner, kolonistimule-rende faktorer eller andre cytokiner, hvilket resulterer i stimulering av en annen celle. T-celle-reseptorens evne til å oppfatte antigen er begrenset ved verts-MHC-molekylenes be-skaffenhet. Således vil anvendelse av en kimær T-cellereseptor hvor et ikke-MHC-begrenset ligandbindingsområde er knyttet direkte til det signaltransduserende område i T-cellereseptoren, gi mulighet for anvendelse av den resulterende gensløyd-dannede effektor-T-celle i hvilket som helst individ, uansett MHC-genetisk bakgrunn. På denne måte kan man forandre liganden som starter den ønskede respons, hvor det naturlige agens av visse grunner kanskje ikke er så godt egnet.

Det er derfor interesse for å finne måter til modulering av celleresponser ved å få i stand anvendelse av andre ligander enn den normale ligand for overføring av et ønsket signal.

T-celle-antigenreseptoren har en ikke-kovalent forbindelse mellom en heterodimer og de ikke-variable kjeder av CD3 (Weiss og Imboden (1987) Adv. Immunol., 41:1-38; Cleavers et al. (1988) Ann. Rev. Immunol., 6:62 9-662; Frank et al. (1990) Sem. Immunol., 2:89-97). Beskrivelse av zetakjeden kan finnes i Ashwell og Klausner (1990) Ann. Rev. Immunol., 8:139-167. Weissman et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol 85, 1988 s. 9709-9713 beskriver kloning og kromosomal plassering av en T-celle reseptorkomponent (zetakjeden).

Den fosfatidylinositol-spesifikke fosfolipase C-innledede aktivering ved T-cellereseptoren ("TCR") er beskrevet av Weiss et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:416-4173; og Imboden og Stobo (1985) J. Exp. Med., 161:446-456. TCR aktiverer også en tyrosinkinase (Samelson et al. (1986) Cell, 46:1083-1090; Patel et al. (1987) J. Biol. Chem., 262:5831-5838; Chsi et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:10836-10842, hvor zetakjeden er ett av substratene i kinaseveien (Baniyash et al. (1988) J. Biol. Chem., 263:18225-18230; Samelson et al.

(1986), som ovenfor). Fyn, et medlem av src-familien av tyrosinkinaser, angis å utfelles sammen med CD3-komplekset, hvilket gjør den til en utmerket kandidat for en TCR-aktivert kinase (Samelson et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:4358-4362) .

Beskaffenheten av zetakjeden i TCR-komplekset er beskrevet av Baniyash et al. (1988) J. Biol. Chem., 263:9874-9878, og Orloff et al. (1989), samme sted, 264:14812-14817. Det heterodimere zeta- og etaprotein er beskrevet av Jin et al.

(1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:3319-3323. Omtale av homo- og heterodimerene kan finnes i Mercep et al. (1988) Science, 242:571-574; og Mercep et al. (1989), samme sted, 246:1162-1165. Orloff et al., Nature 1990, vol 344, s. 1989-1991 beskriver dimerisering av komponenter i T-cellereseptoren og Fc-reseptoren. Byrn et al., Nature vol 344, 1990, s. 667-670 omhandler kombinering av CD4 og et immunoglobulin. Se også Sussman et al. (1988) Cell, 52:85-95. For undersøkelser av zeta-proteins rolle, se Weissman et al. (1989) EMBO J., 8:3651-3656; Frank et al. (1990) Science, 249:174-177; og Lanier et al. (1989) Nature, 342:803-805. Lanier et al. lærer at T-cellereseptor zetakjeden assosierer med IgG Fc-reseptoren.

For omtale av gamma-underenheten av FceRl-reseptoren, uttrykt på mastceller og basofile celler, og dens homologi med zeta-kjeden, se Bevan og Cunha-Melo (1988) Prog. Allergy, 42:123-84; Kinet (1989) Cell, 57:351-354; Benhamou et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:5327-5330; og Orloff et al.

(1990) Nature, 347:189-191.

Intracellulær sekundærbudbringer-aktivering oppnås ved anvendelse av kimære proteiner med en cytoplasmaregion i tilknytning til transduksjon av et signal og aktivering av et sekundærbudbringer-system, som ofte innbefatter en kinase, og en ekstracellulær region som kan bindes til en spesifikk ligand og overføre et signal til cytoplasmaregionen ved dannelse av et bindingskompleks. Spesielt anvendes cytoplasma-sekvenser av zeta- og etakjedene av TCR og gammakjeden av FceRl knyttet til annet enn den naturlige ekstracellulære region ved et transmembranområde. På denne måte kan celler som kan uttrykke det kimære protein, aktiveres ved kontakt med liganden, i motsetning til den normale aktiveringsmåte for cytoplasmadelen.

Foreliggende oppfinnelse omhandler kimære DNA-sekvenser som koder for membranbundet protein, kjennetegnet ved at DNA-sekvensen omfatter i leseramme:

en sekvens som koder for en signalsekvens,

en sekvens som koder for et ekstracellulært bindingsområde for et overflatemembranprotein som bindes spesifikt til i det minste en ligand, hvor nevnte ligand er et protein på over-flaten av en celle eller et viralt protein, en sekvens som koder for et transmembranområde, og en sekvens som koder for et cytoplasmatisk område av et protein istand til å overføre et signal hvor nente cytoplasmatiske område er en eta- eller zetakjede av en T-celle reseptor eller gammakjeden til Fc£Rl-

reseptoren, hvor nevnte ekstracellulære område og cytoplasmatiske område ikke naturlig er knyttet sammen og nevnte cytoplasmatiske område ikke naturlig er knyttet til et ekstracellulært ligand-bindingsområde og når nevnte kimære DNA-sekvens uttrykkes som et membranbundet protein i en valgt vert under betingelser egnet for ekspresjon,

fører binding av en ligand til det ekstracellulære området til transmisjon av et signal til det cytoplasmatiske området resulterende i aktivering av en signal-reaksjonsvei i nevnte vert.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen er en ekspresjonskassett som omfatter en transkripsjons-startregion og en DNA-sekvens som definert i krav 1. Ytterligere aspekter ved foreliggende oppfinnelse er celler, spesielt pattedyrceller som omfatter nevnte DNA-sekvens samt anvendelse av celler ifølge kravene 9-16 og 16-21 for aktivering ved hjelp av en sekundær budbringer-vei.

Også retrovirus-RNA- eller DNA-konstruksjoner som omfatter de før nevnte ekspresjonskassetter er del av foreliggende oppfinnelse.

Nye DNA-sekvenser, så som DNA-sekvenser som deler av ekspresjonskassetter og vektorer, så vel som tilstedeværelse av dem i celler, er tilveiebrakt, hvor de nye sekvenser omfatter tre områder som ikke finnes sammen naturlig: (1) et cytoplasmaområde, som normalt overfører et signal som resulterer i aktivering av et budbringersystem, (2) et transmembranområde, som krysser den ytre cellemembran, og (3) et ekstracellulært reseptorområde som tjener til binding til en ligand og overfø-ring av et signal til cytoplasmaområdet, som resulterer i aktivering av budbringersystemet.

Cytoplasmaområdet kan stamme fra et protein som er kjent for å aktivere forskjellige budbringersystemer, idet G-protei-nene normalt er unntatt. Proteinet som cytoplasmaområdet stammer fra, behøver ikke selv ha ligandbindende evne; det er tilstrekkelig at et slikt protein kan være knyttet til et annet protein som gir slik evne. Aktuelle cytoplasmaregioner innbefatter zetakjeden av T-cellereseptoren, etakjeden, som bare er forskjellig fra zetakjeden ved sitt mest C-terminale ekson som et resultat av alternativ oppsplitting av zeta-mRNA og gammaunderenheten av FceRI-reseptoren, og slike andre cytoplasmaregioner som kan overføre et signal som et resultat av vekselvirkning med andre proteiner som kan bindes til en ligand.

En rekke cytoplasmaregioner eller funksjonelle fragmenter eller mutanter derav kan anvendes, vanligvis i regionen fra ca. 50 til 500 aminosyrer, hvor hele den naturlig forekommende cytoplasmaregion kan anvendes, eller bare en aktiv del derav. De cytoplasmaregioner som er av spesielle interesse, er slike som kan inngå i én eller flere sekundærbudbringer-veier, spesielle veier i forbindelse med en proteinkinase, mer spesielt proteinkinase C (PKC).

Aktuelle veier innbefatter den fosfatidylinositol-spesifikke fosfolipase-omfattende vei, som normalt inngår ved hydrolyse av fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat, som resulterer i dannelse av sekundær-budbringerne inositol-1,4,5-trisfosfat og diacylglycerol. En annen vei er den kalsiumformidlede vei, som kan være et resultat av direkte eller indirekte aktivering ved cytoplasmadelen av det kimære protein. Kinaseveien kan også inngå i seg selv eller i kombinasjon med en annen vei, som kan innbefatte fosforylering av cytoplasmadelen av det kimære protein. Én eller flere aminosyre-sidekjeder, spesielt tyrosiner, kan fosforyleres. Det er visse tegn på at fyn, et medlem av src-familien av tyrosinkinaser, kan inngå når det gjelder zetakjeden.

Skjønt hele cytoplasmaregionen vanligvis vil anvendes, vil det i mange tilfeller ikke være nødvendig å anvende hele kjeden. I den utstrekning en avskåret del kan finne anvendelse, kan en slik avskåret del anvendes i stedet for den intakte kjede.

Transmembranområdet kan være området av proteinet som bidrar til cytoplasmadelen, området av proteinet som bidrar til den ekstracellulære del, eller et område knyttet til et helt annet protein. Det vil hovedsakelig være hensiktsmessig å ha transmembranområdet naturlig knyttet til ett eller annet av de andre områder, spesielt det ekstracellulære område. I noen tilfeller vil det være ønskelig å anvende transmembranområdet av zeta-, eta- eller FceRl-gammakjedene som inneholder en cysteinrest som er i stand til disulfidbinding, slik at det resulterende kimære protein vil være i stand til å danne disulfid-bundne dimerer med seg selv, eller med ikke-modifi-serte former av zeta-, eta-, gamma- eller beslektede proteiner. I noen tilfeller vil transmembranområdet utvelges slik at man unngår binding av et slikt område til transmembranområdet i det samme eller et annet overflatemembranprotein.

Det ekstracellulære område kan fås fra hvilket som helst av de mange forskjellige ekstracellulære områder eller utson-drede proteiner som er knyttet til ligandbinding og/eller signaltransduksjon. Det ekstracellulære område kan være en del av et protein som er monomert, homodimert, heterodimert eller knyttet til et større antall proteiner i et ikke-kovalent kompleks. Spesielt kan det ekstracellulære område bestå av en tung Ig-kjede som i sin tur kan være kovalent knyttet til lett Ig-kjede ved tilstedeværelsen av CH1- og hengselregi-oner, eller som kan bli kovalent knyttet til andre tung/lett-Ig-kjedekomplekser ved tilstedeværelse av hengsel-, CH2- og CH3-områder. I sistnevnte tilfelle kan tung/lett-kjedekomp-lekset som blir knyttet til den kimære konstruksjon, utgjøre et antistoff med en spesifisitet som er forskjellig fra antistoff spesifisiteten av den kimære konstruksjon. Avhengig av antistoffets funksjon, den ønskede struktur og signaltransduk-sjonen, kan hele kjeden anvendes, eller det kan anvendes en avkuttet kjede, hvor alle, eller en del av, CH1-, CH2- eller CH3-områdene kan være fjernet, eller hele, eller en del av, hengselregionen kan være fjernet. Forskjellige naturlig forekommende reseptorer kan også anvendes, hvor reseptorene er knyttet til overflatemembranproteiner, så som CD4-, CD8-alfa-, eller cytokin- eller hormonreseptorer. Reseptoren kan være mottakelig for en naturlig ligand, et antistoff eller et fragment derav, et syntetisk molekyl, f.eks. et legemiddel, eller hvilket som helst annet middel som kan frembringe et signal.

Når en reseptor er et molekylkompleks av proteiner, hvor bare én kjede har den hovedrolle å binde til liganden, vil det vanligvis være ønskelig å anvende bare den ekstracellulære del av det ligandbindende protein. Når den ekstracellulære del kan kompleksbindes med andre ekstracellulære deler av andre proteiner, eller danne kovalent binding gjennom disulfidbindinger, kan man også tilveiebringe dannelse av slik ekstracellulær dimer-region. Når hele den ekstracellulære region ikke er nødvendig, kan det også anvendes avkuttede deler av dette, hvor en slik avkuttet del er funksjonell. Når den ekstracellulære region av CD4 anvendes, kan man spesielt anvende bare de sekvenser som er nødvendige for binding av gpl20, HIV-kapselglykoproteinet. I det tilfelle hvor lg anvendes som den ekstracellulære region, kan man ganske enkelt anvende de antigenbindende regioner av antistoffmolekylet og se bort fra de konstante regioner av molekylet (for eksempel Fc-regionen som består av CH2- og CH3-områdene). De lette og tunge regioner kan koples sammen under dannelse av en variabel region.

I noen tilfeller kan noen få aminosyrer i koplingsregi-onen av det naturlige protein utelukkes, vanligvis ikke mer enn 10, mer vanlig ikke mer enn 5. Man kan også ønske å innføre et lite antall aminosyrer i ytterkantene, vanligvis ikke mer enn 10, mer vanlig ikke mer enn 5. Utelukkelse eller innføring av aminosyrer vil vanligvis være som et resultat av behovene ved konstruksjonen, idet det tilveiebringes hensikts-messige restriksjonssteder, manipulerings-letthet, forbedring ved ekspresjonsnivåer eller liknende. Dessuten kan man ønske å erstatte én eller flere aminosyrer med en annen aminosyre av liknende grunner, idet man ikke erstatter mer enn ca. 5 aminosyrer i noe område. Cytoplasmaområdet som allerede angitt, vil vanligvis være fra ca. 50 til 500 aminosyrer, avhengig av det spesielle anvendte område. Transmembranområdet vil vanligvis ha fra ca. 25 til 50 aminosyrer, mens det ekstracellulære område vanligvis vil ha fra ca. 50 til 500 aminosyrer.

Normalt vil signalsekvensen ved den 5'-terminale ende av den åpne leseramme (ORF) som leder det kimære protein til overflatemembranen, være signalsekvensen for det ekstracellulære område. I noen tilfeller kan man imidlertid ønske å bytte denne sekvens med en annen signalsekvens. Siden signalsekvensen vil bli fjernet fra proteinet ved bearbeidelse under leding til overflatemembranen, vil imidlertid den spesielle signalsekvens ikke være avgjørende for den foreliggende oppfinnelse. I tilknytning til signalsekvensen vil det likeledes være et naturlig forekommende spaltningssete, som også normalt vil være det naturlig forekommende spaltningssete knyttet til signalsekvensen eller det ekstracellulære område.

Den kimære konstruksjon ifølge oppfinnelsen som koder for det kimære protein, vil bli fremstilt på vanlige måter. Siden naturlige sekvenser hovedsakelig kan anvendes, kan de naturlige gener isoleres og manipuleres ettersom det passer, for å gjøre mulig riktig sammenkopling av de forskjellige områder. Således kan man fremstille den avkuttede del av sekvensen ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen (PCR) under anvendelse av passende primere som resulterer i utelukkelse av de uønskede deler av genet. Alternativt kan man anvende primer-reparasjon hvor den aktuelle sekvens kan klones i en passende vert. I alle tilfeller kan det anvendes primere som resulterer i terminale deler som gir mulighet for kopling av sekvensene slik at man får den ønskede åpne leseramme som koder for det kimære protein. Således kan sekvensene utvelges slik at det tilveiebringes restriksjonsseter som er stumpendet eller som har komplementære overlappinger. Under ligering er det ønskelig at hybridisering og ligering ikke gjendanner noen av de opprinnelige restriksjonsseter.

Hvis ønskelig kan det ekstracellulære område også innbefatte transkripsjons-startregionen, hvilket vil gjøre mulig ekspresjon i målverten. Alternativt kan man ønske å tilveiebringe en annen transkripsjons-startregion som kan gi mulighet for konstitutiv eller induserbar ekspresjon, avhengig av målverten, formålet for innføringen av det aktuelle kimære protein i en slik vert, det ønskede ekspresjonsnivå, beskaffenheten av målverten og liknende. Man kan således tilveie bringe ekspresjon ved differensiering eller utvikling av målverten, aktivering av målverten eller liknende.

Mange forskjellige promoterer er blitt beskrevet i litte-raturen som er konstitutive eller induserbare, hvor induksjon kan være knyttet til en spesifikk celletype eller et spesifikt utviklingsnivå. Alternativt er det kjent en rekke virus-promoterer som også kan finne anvendelse. Aktuelle promoterer innbefatter S-aktin-promoteren, tidlig- og sen-SV40-promoterer, immunglobulin-promoter, human cytomegalovirus-promoter og Friend-miltfokusdannende virus-promoteren. Promoterene kan være knyttet til "enhancere" eller ikke, hvor "enhancerne" kan være naturlig knyttet til den spesielle promoter eller knyttet til en annen promoter.

Sekvensen i den åpne leseramme kan fås fra genom-DNA eller cDNA, eller ved syntetisering, eller fra kombinasjoner av disse. Avhengig av størrelsen av genom-DNA og antallet introner, kan man ønske å anvende cDNA eller en kombinasjon derav. I mange tilfeller er det funnet at introner stabiliserer mRNA. Det kan også tilveiebringes ikke-kodende regioner som stabiliserer mRNA.

En termineringsregion vil tilveiebringes i 3'-stilling i forhold til cytoplasmaområdet, hvor avslutningsregionen kan være naturlig knyttet til cytoplasmaområdet, eller det kan stamme fra en annen kilde. Termineringsregionene er hovedsakelig ikke avgjørende, og det kan anvendes mange forskjellige termineringsregioner uten at ekspresjonen påvirkes på en ugunstig måte.

De forskjellige manipulasjoner kan utføres in vi tro eller de kan innføres i vektorer for kloning i en passende vert, f.eks. E. coli. Etter hver manipulering kan således den resulterende konstruksjon fra sammenføyning av DNA-sekvensene klones, vektoren isoleres og sekvensen undersøkes ved screening for å forsikre om at sekvensen koder for det ønskede kimære protein. Sekvensen kan undersøkes ved restriksjons-analyse, sekvensering eller liknende. Før kloning kan sekvensen forøkes under anvendelse av PCR og passende primere, for tilveiebringelse av en rikelig tilførsel av den ønskede åpne leseramme, mens mengden av forurensende DNA-fragmenter som kan ha vesentlig homologi med delene av hele den åpne leseramme, reduseres.

Målcellen kan transformeres med den kimære konstruksjon på hvilken som helst hensiktsmessig måte. Teknikker innbefatter kalsiumfosfat-utfelt DNA-transformering, elektroporering, protoplastkopling, biolistikk, anvendelse av DNA-belagte partikler, transfeksjon og infeksjon, hvor den kimære konstruksjon innføres i et passende virus, spesielt en ikke-replikativ form av viruset, eller liknende.

Når målverten er blitt transformert, vil integrering vanligvis være resultatet. Ved hensiktsmessig valg av vektorer kan man imidlertid tilveiebringe episomal-opprettholdelse. Det er kjent et stort antall vektorer som er basert på virus, hvor kopitallet av viruset som opprettholdes i cellen, er lavt nok til opprettholdelse av cellens levedyktighet. Illustre-rende vektorer innbefatter SV40, EBV og BPV.

Konstruksjonene vil bli utformet slik at vekselvirkning mellom dem og andre overflatemembranproteiner som er naturlige i målverten, unngås. Man vil således hovedsakelig unngå at det kimære protein bindes til andre proteiner i overflatemembranen. For oppnåelse av dette kan man utvelge et transmembranområde som er kjent for ikke å bindes til andre transmem-branområder, man kan modifisere spesifikke aminosyrer, f.eks. erstatte en cysteindel, eller liknende.

Når man har påvist at den transformerte vert er i stand til å uttrykke det kimære protein som overflatemembranprotein i henhold til den ønskede forordning og ved et ønskelig nivå, kan man så bestemme hvorvidt transmembranproteinet er funk-sjonelt i verten under tilveiebringelse av den ønskede signalinduksjon. Siden virkningen av signalinduksjon av det spesielle cytoplasmaområde vil være kjent, kan man anvende den etablerte metodologi for bestemmelse av induksjon for verifi-sering av det kimære proteins funksjonelle evne. For eksempel resulterer TCR-binding i induksjon av CD69-ekspresjon. Når det gjelder et kimært protein med et zeta-cytoplasmaområde, hvor vertscellen er kjent for å uttrykke CD69 ved aktivering, ville man således vente at man kunne bringe den transformerte celle i kontakt med den foreskrevne ligand og deretter analy-sere med hensyn til ekspresjon av CD69. Det er selvfølgelig viktig å vite at hjelpesignaler ikke er nødvendige fra andre proteiner i forbindelse med det spesielle cytoplasmaområde, slik at mangel ved tilveiebringelse av transduksjon av signa-let kun kan tilskrives ikke-funksjonsdyktighet hos det kimære protein i den spesielle målvert.

Det kan anvendes mange forskjellige målverter, normalt celler fra virveldyr, mer spesielt pattedyr, ønskelig husdyr eller primater, spesielt mennesker. De foreliggende kimære konstruksjoner kan anvendes for undersøkelse av spesielle veier som reguleres ved signaltransduksjon, for starting av celleresponser ved anvendelse av forskjellige ligander, for eksempel for indusering av aktivering av et spesielt under-sett av lymfocytter, hvor lymfocyttene kan aktiveres ved spesielle overflatemarkører av celler, så som neoplastiske celler, virusinfiserte celler eller andre angrepne celler, som tilveiebringer spesifikke overflatemembranproteiner som kan skilles fra overflatemembranproteinene på normale celler. Cellene kan modifiseres ytterligere slik at ekspresjonskassetter kan innføres hvor aktivering av den transformerte celle vil resultere i utsondring av et spesielt produkt. På denne måte kan man tilveiebringe styrt avgivelse av spesifikke agenser, så som interferoner, TNF'er, perforaner, naturlig forekommende cytotoksiske midler eller liknende, hvor utson-dringsnivået kan være sterkt forsterket i forhold til den naturlig forekommende utsondring. Videre kan cellene spesifikt rettes mot målstedet ved anvendelse av injeksjoner, katetere eller liknende, for tilveiebringelse av lokalisering av responsen.

Den foreliggende oppfinnelse kan finne anvendelse med cytotoksiske lymfocytter (CTL), naturlige "dreper"-celler (NK) , tumorinfUtrerende lymfocytter (TIL) , nøytrofile celler, basofile celler, T-hjelpeceller eller andre celler som er i stand til å drepe målceller eller som er i stand til å ut-sondre cytokiner når de er aktivert. Således kan angrepne celler, så som celler infisert med HIV, HTLV-I eller II, cytomegalovirus, hepatitt B- eller C-virus, myobacterium avium o.s.v., eller neoplastiske celler, hvor de angrepne celler har en overflatemarkør knyttet til den angrepne tilstand, gjøres til spesifikke mål for de cytotoksiske celler eller de cyto-kinutsondrende celler. Alternativt kan spesielle MHC-proteiner kompieksbundne med peptidligander være de mål som oppfat-tes av de kimære T-cellereseptorer beskrevet i det foreliggende. Det kan tilveiebringes et ekstracellulært reseptorområde, f.eks. CD4, som bindes til en overflatemarkør ved en patogen eller neoplastisk tilstand, f.eks. gpl20 for HIV. Ved ytterligere modifisering av cellene for unngåelse av ekspresjon eller vandring av funksjonelle klasse I- og/eller -II-MHC-antigener, vil cellene være i stand til å unngå opp-fattelse hos verts-immunsystemet som fremmed.

Andre anvendelser innbefatter transformering av vertscel-ler fra et gitt individ med retrovirus-vektorkonstruksjoner som styrer syntesen av den kimære konstruksjon. Ved transformering av slike celler og innføring i pasienten på nytt, kan man oppnå autologe genterapianvendelser.

Når det gjelder antistoffreseptoren, kan aktuelle ligander innbefatte virusproteiner, for eksempel gB-kapselglykoproteinet hos human cytomegalovirus, og overflateproteiner som finnes på kreftceller på en spesifikk eller forøket måte, for eksempel HER-2-proteinet som ofte er forøket ved bryst- og ovariekarsinomer hos mennesker. Når det gjelder andre reseptorer, er de spesielt aktuelle reseptorer og ligander CD4, hvor liganden er HIV gpl20-kapselglykoproteinet, og andre virusreseptorer, for eksempel ICAM, som er reseptoren for det humane rhinovirus, og det beslektede reseptormolekyl for poliovirus.

Følgende eksempler er gitt for illustrasjonsformål.

EKSPERIMENTELT

Materialer og metoder:

CD 8/f-kimærkonst ruksj on

Polymerasekjedereaksjonen, PCR (Mullis et al. (1986) Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, LI, 263-273) ble anvendt for forøkning av ekstracellulær- og transmembran-delen av CD8a (rester 1-187) fra pSV7dCD8a og cytoplasmadelen av human-fkjeden (restene 31-142 fra pGEM3zf. DNA-sekvenser er fra (Littman et al. (1985) Cell 40:237-246; CD8), og (Weissman et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:9709-9713; f)- Plasmidene pSV7d-CD8o! og pGEM3zf ble vennlig tilveiebrakt av henholdsvis Dr. Dan Littman og Julie Turner (Univ. og CA, S.F.) og Dr. R.D. Klausner og A.M. Weissman (N.I.H.). Primere som koder for 3'-sekvensene av CD8-fragmentet og 5'-sekvensene av zetafragmentet, ble utformet til å overlappe slik at kopling av de to produkter ga et hybrid-templat. Fra dette templat ble kimærene forøket under anvendelse av eksterne primere inneholdende Xbal- og BamHI-klo-ningsseter. CD8/f-kimærene ble subklonet i pTfneo (Ohashi et al. (1985) Nature, 316:606-609) og sekvensert via Sanger dideoksynukleotid-teknikken (Sanger et al. (1977) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467).

Antistoffer

C305- og Leu4-mAb'er oppfatter henholdsvis Jurkat Ti S-kjeden og en ekstracellulær determinant for CD3 e. OKT8, levert fra ATCC, oppfatter en ekstracellulær epitop av CD8. Anti-f-kaninantiserum, nr. 387, frembrakt mot et peptid omfattende aminosyrene 132-144 i muse-f-sekvensen (Orloff et al.

(1989) J. Biol. Chem., 264:14812-14817) ble vennlig tilveiebrakt av Dr. R.D. Klausner, A.M. Weissman og L.E. Samelson. Antifosfotyrosin-mAb, 4G10, var en generøs gave fra Dr. D. Morrison, B. Druker og T. Roberts. W6/32 oppfatter en ikke-variabel determinant uttrykt på humane antigener av typen HLA klasse 1. Leu23, som reagerer med CD69, ble levert fra Bec-ton-Dickinson Monoclonal Center (Milpitas, Ca.). MOPC 195, et IgG2a, (Litton Bionetics, Kensington, MD) ble anvendt som kontroll-mAb i FACS-analyse. Ascitesvæsker med mAb ble anvendt i en sluttfortynning på 1:1000 (en metningskonsentra-sjon) i alle forsøk dersom ikke annet er angitt.

Cellelinjer og transfeksjoner

Den humane leukemi-T-cellelinje Jurkat og dens derivat J.RT3-T3.5 ble holdt i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), glutamin, penicillin og strepto-mycin (Irvin Scientific). Kimær-transfekterte kloner ble overført i ovennevnte medium med tilsetning av Geneticin (GIBCO, Grand Island, NY) med 2 mg/ml. Elektroporering av pTfneo-CD8/f i Jurkat og J.RT3-T3.5 ble utført i en Bio-Rad Gen-pulsator under anvendelse av en spenning på 250 V og en kapasitet på 960^F med 20/zg plasmid pr. 10 celler. Etter transfeksjon ble cellene dyrket i to dager i RPMI-medium før utplating i Geneticin-holdig medium. Det ble oppnådd kloner ved begrensningsfortynninger, og disse ble undersøkt ved screening med hensyn til TCR- og CD8/f-ekspresjon ved strøm-ningscytometri (se nedenfor). Jurkat CD8-klonen, transfektert med villtype-CD8-proteinet, ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Julia Turner og Dan Littman.

Strømningscytometri

Ca. lx IO<6>celler/"condition" ble farget med mettende konsentrasjoner av antistoff, deretter inkubert med fluorescein-konjugert geit-antimus-Ab før analyse i en FACScan (Beck-ton Dickinson) som beskrevet tidligere (Weiss og Stobo 1984). Celler analysert med hensyn til CD69-ekspresjon ble farget direkte med fluorescein-konjugert Leu 23 (anti-CD69-mAb) eller MOPC 195 (kontroll-mAb).

[Ca<2+>]^-måling ved fluorimetri

Kalsium-følsom fluorescens ble kontrollert som tidligere beskrevet (Goldsmith og Weiss 1987 Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:6879-6883). Cellene ble stimulert med løselig mAb C305 og 0KT8 ved metningskonsentrasjoner (1:1000 fortynning av ascites). Maksimal fluorescens ble bestemt etter lyse av cellene med Triton X-100; minimal fluorescens ble oppnådd etter chele-ring av Ca<2+>med EGTA. [Ca2+]^ ble bestemt under anvendelse av likningen [Ca2+]. = K, s (F , . - F . )/(F . - 3 i d observert mm ' maks Fobservert^ ' mec* Kd= 250 nM som t,es^crevet (Grynkiewica et al.

(1985) J. Biol. Chem., 260:3440-3448).

Inositolfosfat-måling

Celler ble tilført [ 3H]myo-inositol (Amersham) med 40/xCi/ml i 3 timer i fosfatbufret saltløsning og deretter dyrket over natten i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum. Cellene ble stimulert i 15 minutter med de angitte antistoffer ved en fortynning på 1:1000 av ascites i nærvær av 10 mM LiCl under inhibering av defosforylering av IP-^Ekstraksjonen og kvantifiseringen av løselige inositolfosfater var som beskrevet (Imboden og Stobo (1985) J. Exp. Med., 161:446-456) .

Overflatejoderinger

Celler ble merket med<125>I under anvendelse av laktoper-oksydase/glukoseoksydase-(Sigma)-fremgangsmåten som beskrevet (Weiss og Stobo (1984) J. Exp. Med., 160:1284-1299).

Immun-utfeininger

Celler ble lysert ved 2 x IO<7>celler/200 ml i 1% NP40 (Nonidet P40), 150 mM NaCl og 10 mM Tris pH 7,8 i nærvær av proteaseinhibitorer, 1 mM PMSF, aprotinin og leupeptin. Lysebuffer for lysater for analyse med hensyn til fosfotyro-sin-innhold ble supplert med fosfatase-inhibitorer som beskrevet (Desai et al. 1990, Nature, vol. 348:66-69). Joderte lysater ble supplert med 10 mM jodacetamid under forhindring av post-lyse-disulfidbindingsdannelse. Digitonin-lyse ble utført i 1% Digitonin, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,8 og 0,12% Triton X-100. Etter 30 minutter ved 4°C, ble lysatene sentri-fugert i 10 minutter ved 14 000 rpm (omdreininger pr. minutt), og deretter for-klaret med fikserte Staphylococcus aureus

(Staph A; Calbiochem-Behring). Alternativt ble lysater av celler stimulert med antistoff før lyse, for-klaret med sepha-

roseperler. De for-klarede lysater ble inkubert med Protein A Sepharose CL-4B-perler som var blitt for-utrustet med det immunutfellende antistoff. Vaskede immunutfeininger ble gjenoppslemmet i SDS-prøvebuffer +/- 5% S-merkaptoetanol og kokt før elektroforese på 11% polyakrylamidgeler.

Stimulering av celler for vurdering av fosfotyrosininnhold.

Celler ble stimulert i serumfritt medium i en konsentra-sjon av 2 x 10 celler/200 jil med antistoffer i en fortynning på 1:250 i ascites. Etter 2 minutter ved 37°C, ble mediet avsugd, og cellene ble lysert i 100/il NP40-lysebuf f er. Lysatene ble for-klaret og deretter ultrasentrifugert, og prøvene ble oppløst ved hjelp av SDS PAGE.

Immunblot

Geler ble ekvilibrert i overføringsbuffer (20 mM Tris-base, 150 mM glycin, 20% metanol) i 30 minutter og overført til nitrocellulosemembraner i et Western-blotting-apparat av typen Bio-Rad kjørt ved 25 volt over natten. Membraner ble blokkert i TBST (10 mM Tris HCl [pH 8], 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) pluss 1,5% ovalbumin, og deretter inkubert enten med mAb 4G10 eller kanin-anti-f-antiserum (nr. 387). Immunblot'-ene ble vasket og inkubert med en 1:7000-fortynning av alka-lisk fosfatase-konjugert geit-antimus- eller geit-antikanin-antistoff. Etter 1-2 timer ble blot'ene vasket og fremkalt med nitroblått-tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat-substrater ifølge fabrikantens instruksjoner (Promega).

IL-2-bioanalyse

For stimulering ble cellene belagt med de angitte antistoffer ved metningskonsentrasjoner (1:1000 fortynning av ascites) i 30 minutter ved 4°C. Etter fjerning av ubundet antistoff, ble cellene spunnet på 24-brønns vevskulturplater som var blitt for-belagt med kanin-antimus-Ig (Zymed Labs) og blokkert med medium pluss 10% FBS. Forbolmyristatacetat, PMA (Sigma) og ionomycin (Calbiochem) ble tilsatt til sluttkonsen-trasjoner på henholdsvis 10 mg/ml og 1 mM. Cellefrie superna- tanter ble høstet etter 20 timers dyrkning og vurdert med hensyn til IL-2-innhold under anvendelse av den IL-2-avhengige CTLL-2.20-cellelinje i MTT kolorimetrisk analyse som beskrevet (Mosmann 1983, J. Immunol. Meth., 65:55-63).

RESULTATER

Karakterisering av CD8/f-kimærer i T-celle-reseptor-positive og -negative Jurkatceller

CD8/f-kimær-konstruksjonen beskrevet tidligere ble transfektert via elektroporering både i den humane Jurkat-T-leukemicellelinje, som ga klon JCD8/f 2, og en Jurkat-avledet mutant, JRT3.T3.5 som manglet Ti S-kjedetranskripter med full lengde, og protein, som ga J£-CD8/f 14. Skjønt JRT3.T3.5 uttrykker normale nivåer av Ti a og CD3-subenhetene, resulterer dens mangel på Ti S-ekspresjon i fravær av TCR-ekspresjon på celleoverflaten (Ohashi et al. (1985) Nature, 316:606-609). Transfeksjon av chimerene i denne celle gjorde mulig vurdering av f'er som signaliserte fenotype uten komplisering av de ytterligere TCR-kjeder. Nivåer av overflateekspresjon av chimerene og TCR i stabilt transfekterte kloner ble kvantifi-sert ved strømningscytometri under anvendelse av mAb'er som oppfatter enten CD8 (0KT8) eller CD3 e-subenheten av TCR (Leu 4). Fluorescens-histogrammer av disse kloner som begge uttrykker høye nivåer av CD8/f, ble observert; denne celle ble anvendt som kontroll i alle forsøkene. De tre kloner uttrykker sammenliknbare nivåer av CD8-epitoper og T-cellereseptorer med unntak av JS-CD8/z 14, som ikke uttrykker overflate-TCR. Således kan CD8/f-chimerene uttrykkes på celleoverflaten i fravær av TCR-kjedene.

For karakterisering av strukturen av det kimære CD8/f-protein, ble cellene overflate-radiojodert, lysert i 1% NP4 0

og underkastet immunutfelling med OKT8 eller et normalt kanin-antiserum frembrakt mot en cytoplasma-peptidsekvens av muse-f. Under reduserte betingelser utfeller antistoffer mot enten CD8 eller f et enkelt protein på 34-35 kD fra den chimer-transfekterte celle, mens 0KT8 utfeller et 29 kD protein som represen-

terer villtype-CD8 fra Jurkat CD8. Skjønt CD8 i sitt normale miljø har en tilsynelatende molekylvekt på 32-34 kD, (Snow og Terhorst (1983), J. Biol. Chem., 258:14675-14681, tyder fore-løpige forsøk hvor CD8 i Jurkat sammenliknes med en CD8-posi-tiv linje, HPB.ALL, på at størrelsesreduksjonen av CD8 observert her er et resultat av et typisk glykosyleringsmønster i Jurkat-verten. Under ikke-reduserende betingelser sees et mer komplekst proteinmønster i immunutfellinger både av CD8 ogCD8/f-kimærene. Denne kompleksitet er karakteristisk for CD8-utfellinger, siden homo-multimerer og hetero-multimerer er blitt observert tidligere (Snow og Terhorst (1983), som ovenfor) . De to fremtredende forbindelser immunutfelt fra JDC8/f2 som vandrer ved ca. 70 og 100 kD, representerer sannsynligvis homodimerer og homotrimerer av kimærene. Siden det ikke er noen cysteinrester for dannelse av disulfidbindinger med f-delen av kimærene, må alle disulfidbindinger som dannes i kimærene, skje gjennom CD8. Derfor er det sannsynlig at hvilket som helst protein som danner en heterodimer med CD8/f, danner én med villtype-CD8, og bør således ikke være ansvarlig for noen signaliserings-forhold som spesifikt kan tilskrives CD8/f-kimærene.

Ikke-kovalent tilknytning av kimærene til endogent CD3 y, 5 og e kan komplisere tolkningen av signaler overført av kimærene. For bestemmelse av om hvorvidt fjerning av ekstracellulær- og transmembranområdene av f er tilstrekkelige til at man får ekspresjon av den uavhengig av CD3-kjedene, ble celler overflatejodert og lysert i digitonin, en detergent kjent for å bevare TCR-kompleksets helhet. Immunutfeininger av TCR både i Jurkat CD8 og den TCR-uttrykkende kimær-transfektant JCD8/f2 viser identiske mønstre som er karakteristiske for en CD3-(Leu 4)-immunutfelling. Skjønt TCR-tilknyttet f ikke er skikkelig jodert, siden dens ekstracellulære område ikke inneholder noen tyrosinrester for merking, stadfester f-immunblot av CD3-immunutfellinger sin tilstedeværelse under lyse-betingelser. En liten mengde merket CD3 e sees i Leu 4-immunutfellingen av den TCR-manglende celle, til tross for at dette samme mAb ikke merket denne celle. Den lille mengde immunutfelt protein som sees, skyldes sannsynligvis radio-merking av indre CD3 e i et lite antall permeabiliserte eller ikke-levedyktige celler i løpet av merkingsprosessen. Mer viktig er det at ingen CD3-kjeder kan påvises i utfellinger av CD8/f-kimærene verken i TCR-positive eller -negative celler, og heller ikke er det synlig noen kimærer i Leu 4-utfeiningen av JCD8/f2. Tilsiktet overeksponering av autoradiogrammet viser heller ikke TCR-kjeder som utfelles samtidig med kimærene. For ytterligere å belyse spørsmålet om ko-assosia-sjon av kimærene og TCR-kjedene, ble effekten av antistoff-bevirket nedmodulering av TCR på kimærekspresjon vurdert. Skjønt inkubering over natten av JCD8/$"2 med mettende mengder av C305, et mAb mot en epitop av Jurkat Ti S-kjeden, resul-terte i internalisering av 94% av TCR, var overflateekspresjon av CD8/f-kimærene upåvirket. Ved disse to uavhengige kri-terier finnes det ingen skjelnbar forbindelse mellom CD8/f og CD37-, 6 og e-kjedene.

For bestemmelse av om hvorvidt det finnes en kovalent binding mellom endogen f og CD8/f-kimærene,^ ble det utført f-immunoblot-analyse med sammenlikning av f- og OKT 8-immun-utfelninger i Jurkat CD8 og JCD8/f2. Anti-f-antiserumet immunutfeller både kimærene og f fra JCD8/f 2, men bare endogen f fra Jurkat CD8-kontrollen. I motsetning til anti-f-antiserumet, immunutfeller 0KT8 kimærene, men ikke f i JCD8/f 2, mens ingen av materialene er påvist i Jurkat CD8. Sammen tyder resultatene fra disse forsøk og de som er beskrevet ovenfor, på en vekselvirkning mellom kimærene og endogene T-cellereseptor-subenheter.

Stimulering av CD8/f resulterer i aktivering av fosfatidylinositol- og tyrosinkinaseveiene.

For bestemmelse av om hvorvidt binding av det ekstracellulære område av CD8/f vil resultere i intracellulære signali-seringsforhold, ble 0KT8 's evne til frembringelse av en økning i fritt cytoplasma-kalsium ([Ca<2+>]^) i kimærtransfekterte celler undersøkt. En fluorimetri-oppsporing oppnådd med JCD8/f2 ved stimulering av dens TCE med det monoklonale anti-Ti S-antistoff C305 ble oppnådd. Ved tilsetning av løselig 0KT8 sees en vesentlig økning i kalsium ( [Ca2 + ] .), hvilket tyder på at cytoplasmaområdet av f er i stand til å koples til signaliserende maskineri, hvilket resulterer i aktivering av fosfolipase C. Kimærenes evne til overføring av et signal i celler som mangler overflateekspresjon av TCE-kjedene, ble deretter undersøkt. Stimulering av den TCR-negative J£-CD8/f 14 med C305 resulterer ikke i noen påviselig økning i [Ca<2+>]^; imidlertid er 0KT8 fremdeles i stand til å frembringe en sterk kalsiumrespons. Mangelen på en betydelig økning i [Ca2+]^ med 0KT8-stimulering i Jurkat CD8 viser at f-delen av kimærene er nødvendig for den frembrakte [Ca 2 +].-respons.

2+ 1

Siden økningen i [Ca ]^ som finner sted ved TCR-stimulering skyldes økninger i inositolfosfater, ble evnen hos CD8/f til bevirkning av PIP2-hydrolyse undersøkt ved vurdering av forandringer i total mengde løselige inositolfosfater etter stimulering med 0KT8. Stimulering av CD8/f med 0KT8 resulter-te i dannelse av inositolfosfater i begge de kimær-eksprime-rende celler. I motsetning til dette ble ingen inositolfosfater bemerket med stimulering av villtype-CD8-proteinet i Jurkat CD8. Stimulering av TCR i Jurkat CD8 og CD8/f2 bevirket økninger i inositolfosfater, mens ingen slik økning ble observert i den TCR-manglende transfektant, JS-CD8/fl4, ved TCR-stimulering. Disse resultater er i overensstemmelse med kalsiumfluorimetridataene og bekrefter kimærenes evne til aktivering av fosfolipase C selv i fravær av endogene celleoverflate-TCR-kj eder.

Siden stimulering av T-cellereseptoren aktiverer en tyrosinkinasevei i tillegg til inositolfosfolipid-vei, var det viktig å bestemme hvorvidt kimærstimulering ville resultere i tyrosinkinase-aktivering. Western blot åpenbarer et lite antall tyrosin-fosforylerte proteiner som finnes i alle tre kloner før stimulering. Ved stimulering av Jurkat CD8 og JCD8/f2 med C305, (anti-Ti S), aktiveres tyrosinkinaseveien som vist ved induksjon av tyrosinfosforylering av en rekke proteiner. Som ventet, har C305 ingen effekt i den TCR-nega tive transfektant, J£-CD8/fl4. Stimulering av kimærene både på JCD8/f2 og J£-CD8/fl4 med 0KT8 resulterer i tilsynekomst av et mønster av tyrosin-fosforylerte bånd som ikke kan skjelnes fra det som sees med TCR-stimulering. I motsetning til dette resulterer ikke stimulering ved villtype-CD8 i Jurkat i induksjon av tyrosinfosfoproteiner. Således kan CD8/f-kimærene i fravær av Ti og CD3 y, 6 og e aktivere tyrosinkinase-veien på en måte som er analog til måten for en intakt TCR.

Siden JCD8/f2 uttrykker to skjelnbare former av f på sin overflate, endogen f og CD8/f-kimærene, som begge kunne stimu-leres uavhengig av hverandre, ble spesifisiteten av reseptor-bevirket f-fosforylering bestemt. Immunutfellinger av f som stammer fra de tre kloner, enten ikke-stimulert eller stimulert med C305 eller 0KT8, ble analysert ved western blotting med et anti-fosfotyrosinantistoff. En liten fraksjon av f-immunutfellingene ble blot-undersøkt med f-antiserum for regulering av forskjeller i proteininnhold mellom prøvene. Analyse av lysatet som stammer fra TCR-stimulerte Jurkat CD8-celler, åpenbarer et typisk mønster av f-fosforylering, idet mangfoldigheten av bånd på 16-21 kD mest sannsynlig representerer den varierende fosforyleringsgrad for de syv cytoplasma-tyrosinrester av f. I dette forsøk påvises en liten grad av konstitutiv f-fosforylering i Jurkat CD8; denne forøkes imidlertid ikke ved stimulering av villtype-CD8-proteinet. Mens fosforylering av f sees med stimulering av TCR i JCD8/f2, skjønt svakere enn det som sees hos C305-stimulert Jurkat CD8, er det ingen åpenbar bevirket fosforylering av kimærene. Omvendt resulterer stimulering av CD8/f-kimær-reseptoren både på JCD8/f2 og J£-CD7/fl4 utelukkende i en høy fosforyleringsgrad av kimærene, hvilket sees som et indusert bredt bånd på 34-39kD. Dette resultat viser at den reseptoraktiverte kinase som er ansvarlig for fosforylering av f, oppfatter sitt sub-strat kun i et stimulert reseptorkompleks.

Stimulering av CD8/f resulterer i sen-T-celleaktiverings-forhold

T-celleaktivering er et resultat av avgivelse av resep-torformidlede signaler til kjernen hvor de virker ved bevirkning av ekspresjon av spesifikke gener. Ett slikt gen koder for aktiveringsantigenet CD69, hvis overflateekspresjon bevirkes innen timer etter T-cellereseptorstimulering og viser seg å være avhengig av aktivering av proteinkinase C (Testi et al., J. Immunol., 142:1854-1860). Skjønt man ikke helt skjønner funksjonen av CD69 ved T-celleaktivering, tilveiebringer den en markør for distale signaloverførings-forhold. Strømnings-cytometri åpenbarer en meget liten grad av basal CD69-ekspresjon på ikke-stimulerte celler. Maksimale nivåer induseres på alle celler med forbolmyristat-acetat, PMA, en aktivator for proteinkinase. Stimulering av TCR resulterer i induksjon av CD69 på Jurkat CD8 og JCD8/f2, men ikke på den TCR-negative klon, J6-CD8/fl4. Videre induserer stimulering av celler med OKT8 CD69 på begge celler som uttrykker CD8/f-kimærene. Skjønt en minimal grad av CD69-induksjon viser seg ved stimulering av villtype-CD8-protein, er ikke dette nivå høyere enn det som observeres ved stimulering av Jurkat CD8 med et MHC-antistoff w6/32 klasse I.

Kanskje er det mest vanlig anvendte kriterium for vurdering av sen-aktiveringsforhold dannelsen av lymfokinet inter-leukin-2 (IL-2) (Smith (1986) Science, 240:1169-1176). IL-2-genet er stramt regulert, hvilket fordrer integrering av en rekke signaler for dets transkripsjon, noe som gjør det til en verdifull distal markør for vurdering av signalisering gjennomCD8/f-kimærene. Stimulering av Jurkat CD8 og JCD8/f2-celler med TCR-antistoffer i nærvær av PMA resulterer i dannelse av IL-2.

JCD8/f2- og Jurkat CD8-celler ble stimulert med det angitte mAb eller inomycin (1 jum) i nærvær av PMA (10 ng/ml) .

IL-2-utsondring ble bestemt ved evnen hos dyrkningssupernatan-ter av stimulerte celler til understøttelse av veksten av de IL-2-avhengige CTLL-2.20-celler. Siden PMA alene ikke bevir-ker noen IL-2-dannelse i Jurkat, og likevel har en liten

direkte effekt på levedyktigheten av CTLL 2.20-celler, ble verdier oppnådd med PMA alene trukket fra hver responsverdi, hvilket ga tallene som er vist nedenfor. Data fra to uavhengige forsøk er vist.

Et vesentlig forhold er at mens behandling med 0KT8 på Jurkat CD8 ikke induserer noen IL-2, resulterer liknende behandling av JCD8/f i nivåer av utsondret IL-2 som er tilsva-rende høyere enn de som dannes i denne celle ved TCR-stimulering. JS-CD8/fl4 svarte svakere på alle forsøksstimuli ved denne analyse, men dataene var kvalitativt like ved at denne celle reproduserbart utsondret IL-2 som svar på 0KT8, men ikke på C305. Disse data bekrefter at i tillegg til tidlige sig-naltransduksjonsforhold, finner det sted senere aktiveringsforhold ved stimulering av CD8/f-kimærene, og dette viser således dens evne til kopling til de aktuelle signaltransduk-sjonsveier på en fysiologisk måte.

CD4- f-KIMÆRER

Konstruksjon av CD4-zeta-kimærer

Plasmid pGEM3zeta bærer den humane zeta-cDNA og ble vennligst tilveiebrakt av Dr. R.D. Klausner og Dr. S.J. Frank. Plasmidet pBS.L3T4 bærer den humane CD4-CDNA, og ble vennlig tilveiebrakt av Dr. D. Littman og Dr. N. Landau. Et BamHi-Apal-restriksjonsfragment (ca. 0,64 kb) som omfattet hele den humane zetakjede-kodingssekvens fra rest 7 i det ekstracellulære (EXT) område, ble fjernet fra pGEM3zeta og subklonet iBamHI- og Apal-restriksjonssetene på polylinkeren av pBluescript II SK (+) (pSK er en fagemid-basert kloningsvektor fra Stratagene, CA), hvilket ga pSK.zeta. Deretter ble et BamHI-restriksjonsfragment som omfattet hele CD4-kodingssekvensen (ca. 1,8 kb), fjernet fra pBS.L3T4 og subklonet i BamHI-setet på pSK.zeta, hvilket ga pSK.CD4.zeta.

Enkeltkjedet DNA ble fremstilt fra pSK.CD4.zeta (Stratagene pBluescript II-protokoll) og anvendt som templat for oligonukleotid-formidlet retningsbestemt mutagenese (M. Zoller og M. Smith, Nucleic Acids Res. [1982] 10:6487-6500) for dannelse av CD4-zetakimærer med de ønskede sammenføyninger beskrevet nedenfor. CD4-Zeta-fusjoner 1, 2 og 3 ble deretter sekvensert via Sanger-dideoksynukleotid-teknikken (F. Sanger, S. Nicklen og A.R. Coulson, PNAS [1977] 74:5463-5467), fjernet som EcoRI-Apal-restriksjonsfragmenter og klonet i polylinkeren i ekspresjonsvektor pIK.1.1 eller pIK.l.l.Neo på identiske steder.

Et EcoRI-BamHI-restriksjonsfragment (ca. 1,8 kb) omfattende hele kodingsregionen for CD4 ble fjernet fra pSK.CD4.-zeta og subklonet mellom EcoRI- og Bglll-setene på pIK.1.1-eller pIK.1.1.Neo-polylinkeren.

Plasmidet pUCRNeoG (Hudziak et al., Cell [1982] 31:137-146) bærer neomycin-genet under transkripsjonen kontroll av Rous Sarcoma-viruset (RSV) 3' LTR. RSV-neo-kassetten ble fjernet fra PURcNeoG som et HincII-restriksjonsfragment (ca.2,3 kb) og subklonet mellom de to Sspl-seter på pIK.1.1, hvorved man fikk dannet pIK.l.l.Neo.

pIK.1.1 er en pattedyrs-ekspresjonsvektor konstruert ved fire suksessive kassettinnskudd i pMF2, som dannes ved innfø-ring av den syntetiske polylinker 5'-Hindlll-Sphl-EcoRI-Aatll-BglI-XhoI-3'i Kpnl- og Sacl-seter på pSKII (Stratagene), med tap av Kpnl- og SacI-setene. For det første innføres et

BamHI-Xbal-fragment inneholdende SV40 T-antigen-polyadenyle-ringssetet (nukleotider 2770-2533 i SV40, Reddy et al., Science [1978] 200:494-502) og Nhel-Sali-fragmentet inneholdende SV40-replikasjons-begynnelsespunktet (nukleotidene 5725-5578 i SV40) ved tredels-ligering mellom Bglll- og Xhol-setene, med tap av Bglll-, BamHI-, Xbal-, Nhel-, Sali- og Xhol-setene. Disse BamHI-Xbal- og Nhel-Sali-fragmenter syntetiseres ved PCR med pSV2Neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Gen. [1982] 1:327-341) som templat under anvendelse av henholdsvis oligonukleotid-primerparene

5'-CGAATTCGGTCGACCGCAAAAGCCTAGGCCTCC-3', som innbefattet BamHI-, Xbal-, Nhel- og Sall-setene i sine respektive ender. For det annet innføres et SphI-EcoRI-fragment inneholdende skjøte-akseptoren for det humane al-globin-gen - andre-ekson

(nukleotider +143 - +251) mellom SphI- og EcoRI-setene. Dette SphI-EcoRI-fragment syntetiseres ved PCR med p7rSVaHP (Treisman et al., PNAS [1983] 80:7428-7432) som templat under anvendelse av oligonukleotid-primerpar 5'-GTCTATAGCATGCTCCCCTGCTCCGACCCG-3' og 5'-GGTACCGAATTCTCCTGCGGGGAGAAGCAG-3', som innbefattet

SphI- og EcoRI-setene i sine respektive ender. For det tredje innføres den syntetiske polylinker 5'-EcoRI-Bglll-Apal-Aatll-3' mellom EcoRI- og Aatll-setene. For det fjerde innføres et HindIII-SacI-fragment inneholdende CMV IE-enhancer/promoteren (nukleotider -674 - -19, Boshart et al., Cell [1985] 41:521-530) og et SacI-SphI-fragment inneholdende CMV IE-første-ekson/skjøt-donoren (nukleotider -19 - +170) ved tredels-ligering mellom Hindlll- og Sphl-setene. HindIII-SacI-fragmentet fremstilles ved PCR med pUCH.CMV (M. Calos, Stanford Univ.) som templat under anvendelse av oligonukleotid-primerne

5'-CGCCAAGCTTGGCCATTGCATACGGT-3 ' og

5'-GAGGTCTAGACGGTTCACTAAACGAGCTCT-3', som innbefattet Hindlll-og Sacl-seter i sine respektive ender. SacI-SphI-fragmentet syntetiseres kjemisk.

RESULTATER

Utforming av CD4-zeta-kimærer

Det humane CD4-molekyl er for tiden den eneste godt karakteriserte høyaffinitets-reseptor for HIV, og bindes til gpl20-delen av HIV-kapselglykoproteinet, gpl60. Det fullt utviklede CD4-molekyl omfatter et ekstracellulært (EXT) område (restene 1-371 av det fullt utviklede CD4-protein) for fire tandem-lg-liknende V-regioner (V1-V4), et transmembran-(TM)-område på 24 aminosyrer (24 AA)(restene 372-395 av det fullt utviklede CD4-protein), og et 38 AA cytoplasma-(CYT)-område (restene 396-433 av det fullt utviklede CD4-protein). Muta-sjonsanalyse har vist at determinantene for høyaffinitetsbin-ding av gpl20 ligger innenfor de første 106 AA i CD4, VI.

Det fullt utviklede zeta-molekyl omfatter et 10 AA EXT-område, et 20 AA TM-område og et 112 AA CYT-område.

Tre kimære CD4-zetareseptorer (Fl, F2 og F3) ble konstruert fra ekstracellulær- (EC) og cytoplasma-(CYT)-områdene for henholdsvis CD4 og zeta. Transmembran-(TM)-områdene i disse CD4-zeta-reseptorer stammer fra zeta (Fl, F2) eller CD4 (F3). F2 og F3 har alle de fire V-områder.

Spesifikt:

F2 holder tilbake CD4 EXT-området omfattende alle de fire V-regioner (restene 1-370 av det fullt utviklede CD4-protein), TM-området av zetakjeden (restene 8-30 av den fullt utviklede zetakjede) og CYT-området av zeta (restene 31-142 av den fullt utviklede zetakjede).

F3 holder tilbake CD4 EXT-området omfattende alle de fire V-områder (restene 1-371 av det fullt utviklede CD4-protein), TM-området av CD4 (restene 372-395 av den fullt utviklede CD4-kjede) og CYT-området av zeta (restene 31-142 av den fullt utviklede zetakjede).

Fl holder tilbake bare VI og V2 av CD4 EXT-området (restene1-180 av det fullt utviklede CD4-protein), TM-området av zeta (restene 8-30 av den fullt utviklede zetakjede) og cytoplasma- (CYT) -området av zeta (restene 31-142 av den fullt utviklede zetakjede).

Overgangsekspresjon av CD4-zeta-reseptorer

Kimære reseptorer Fl, F2 og F3 og det naturlige CD4-gen ble innført i en ekspresjonsvektor pIK.1.1 som styrer transkripsjonen via CMV-promotor/forøkeren (se nedenfor for ytterligere beskrivelse). For vurdering av den strukturelle helhet og celleoverflatenivåer av ekspresjon av disse kimære reseptorer, ble det anvendt et meget effektiv overgangsekspresjons-system. Det ble innført konstruksjoner ved elektroporering i den humane embryo-nyrecellelinje 293, cellene ble høstet 24 timer senere og deretter ananysert ved FACS under anvendelse av et FITC-koplet MAb spesifikt for Vl-området av CD4, 0KT4A. Det fremgår av cellesorteringen at skjønt liknende høye nivåer av overflate-F2 og -F3 påvises ved 0KT4A, er nivået av Fl påvist ved dette antistoff i den samme overgangsanalyse særde-les lavt.

For påvisnings av om hvorvidt Fl var tilstede i membranen og for fastlegging av strukturen av de kimære proteiner, ble det utført immunutfeining av radiomerkede proteiner. 20 timer etter elektroporering av 293 celler med enten Fl, F2 eller F3, ble cellene puls-merket med<35>S-metionin i 4 timer, lysert i 1% NP40 og underkastet immunutfelling enten med 0KT4A (Orto) eller et kanin-antiserum frembrakt mot et cytoplasmapeptid av muse-zeta (levert fra R. Klausner, NIH). Nivået av radiomer-ket Fl i forhold til enten F2 eller F3 er betydelig høyere når antizeta-antiserum i stedet for 0KT4A anvendes som immunutfel-ningsmiddel. Disse resultater tyder på at Fl-reseptoren kanskje ikke viser den nødvendige topologi for effektiv binding av VI-spesifikke MAb'er.

Fl og F2 danner disulfidbundne homodimerer;

F3 er en monomer

Naturlig zeta finnes som en disulfidbundet homodimer eller som en heterodimer hvor zetakjeden er knyttet til et alternativt skjøtet produkt av det samme gen, Eta. Fl og F2 har begge TM-området av zeta og skulle derfor ha potensiale til å danne en homodimer (og eventuelt en heterodimer med naturlig zeta) via membran-proksimalcysteinresten (stilling 11 på den fullt utviklede zetakjede). I motsetning til dette stammer TM-området på F3 fra CD4 og ville derfor ventes å gi den naturlige monomere tilstand av det naturlige CD4-molekyl til F3-reseptoren.

For bestemmelse av om hvorvidt disse reseptorer danner kovalente binding, ble immunutfellinger av radiomerkede 293-celler som var blitt elektroporert med hver av konstruksjonene under vurdering, analysert under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Både under reduserende og ikke-reduserende betingelser immunutfelles et enkelt protein på ca. 70 kd ved OKT4A fra 293 celler elektroporert med F3. Som ventet, gir CD4 også opphav til et enkelt protein på ca. 60 kd både under reduserende og ikke-reduserende betingelser. I motstning til dette gir Fl og F2 opphav til proteiner på henholdsvis ca. 70 og 150 kd under ikke-reduserende betingelser, ca. det dobbelte av det som sees under reduserende betingelser (henholdsvis ca. 35 og 70 kd). Disse resultater viser at Fl og F2, likesom naturlig zeta, finnes som disulfidbundne homodimerer, mensF3finnes som en monomer, og likeså naturlig CD4. Disse data utelukker imidlertid ikke F3's evne til å danne en ikke-kovalent sammenknyttet dimer.

Innføring av CD4-zetareseptorer i en human T-cellelinje

De kimære reseptorgener Fl, F2 og F3 og det naturlige

CD4-gen ble innført i et derivat av pIK.1.1 som bar en selek-tiv markør, pIK.l.lNeo. Hver konstruksjon ble stabilt innført via elektroporering i den humane T-celle-leukemilinje, Jurkat, og uavhengige Jurkat-kloner oppnådd ved begrensningsfortynning og utvelgelse til G418. Celleoverflate-ekspresjon av den kimære reseptor ble bedømt ved FACS-analyse av Jurkat-kloner under anvendelse av FITC-koplet OKT4A. Skjønt naturlige Jurkat-celler uttrykker et lavt nivå av CD4 på celleoverflaten, ble transfektanter som uttrykte høye nivåer av F2 og F3, lett identifisert på grunn av de betydelig høyere nivåer av fluorescens observert i forhold til ikke-transfekterte celler. På liknende måte ble stabile kloner som uttrykte høye nivåer av CD4, også identifisert. I motsetning til dette viste ingen av klonene isolert fra celler elektroporert med Fl-reseptor-konstruksjonen, nivåer av 0KT4A-spesifikk fluorescens høyere enn det som sees med naturlige Jurkat-celler (se ovenfor).

FACS-analyse av over 100 Jurkat-kloner viste at F3-reseptoren har potensial til å uttrykkes stabilt i Jurkatceller ved betydelig høyere nivåer (opp til 50 ganger) enn F2-reseptoren. Zeta-TM-området antas å inngå i montasje og celleoverflate-ekspresjon av TCR-komplekset. Det er derfor mulig at celle-overf late-ekspres jon av reseptorene som bærer zeta-TM-området, er begrenset ved tilgjengeligheten av "fastsittende" TCR-kjeder (Ti, CD3). Irving og Weiss, Cell (1991) 64:891-901, viste at en CD8-zetareseptor hvor TM-området av zeta var erstattet med TM-området av CD8, uttrykkes i Jurkat-celler uavhengig av TCR-komplekset. Sannsynligvis blir F3-reseptoren likeledes frakoplet fra de fastsittende TCR-kjeder ved CD4 TM-området, og derfor er den ikke utsatt for den antatte tvang på overflate-ekspresjonsnivåer som F2-reseptoren er utsatt for.

Induksjon av CD69-ekspresjon ved stimulering av naturlige

og kimære reseptorer

CD69 (Leu-23) er et tidlig human aktiveringsantigen som finnes på T-, B- og NK-lymfocytter. CD69 påvises på celleoverflaten av T-lymfocytter innen 2 timer etter stimulering av CD3/TCR og når et maksimumsnivå etter 18-24 timer. CD69 er derfor det første påvisbare celleoverflateprotein som induseres som svar på CD3/TCR-formidlede signaler og representerer en pålitelig markør av T-celleaktivering. De kimære CD4-zeta-reseptorers evne til spesifikk formidling av CD69-induksjon i Jurkat-T-cellelinjen, og utvalgte representative Jurkat-kloner som uttrykker enten F2, F3 eller CD4 for funksjonell analyse, ble undersøkt.

Monoklonale antistoffer som er spesifikke for Ti a/S-eller CD3-kjedene, kan etterlikne effekten av antigen og tjene som agonister under stimulering av signaltransduksjon og T-celleaktiveringsforhold. Celler ble stimulert med immobili-serte MAb'er spesifikke for (a) Jurkat-Ti S-kjeden, (C305), (b) CD3 e-kjeden (0KT3) og (c) Vl-området av CD4 (OKT4A). W6/32 oppfatter en ikke-variabel determinant av humane HLA-antigener klasse I, og ble anvendt i noen forsøk som negativ kontroll. CD69-ekspresjon ble analysert ved FACS-analyse ca.

18 timer etter stimulering, under anvendelse av FITC-koplet anti-Leu 23 MAb. Resultatene var som følger. Ikke-stimulerte celler viser et meget lavt nivå av basal CD69-ekspresjon, men ved stimulering med en farmakologisk aktivator av proteinkinase C, forbolmyristat-acetat (PMA) bevirkes maksimal ekspresjon. Stimulering av naturlig Ti med C305 MAb, eller av naturlig CD3 med 0KT3 Mab, resulterer også i induksjon til CD69-markøren. Imidlertid gir stimulering ved hjelp av 0KT4A opphav til et høyt nivå av CD69-ekspresjon bare for de transfektanter som uttrykker en kimær CD4-zetareseptor. For en rekke transfektanter, spesielt F3-avledede, er nivået for CD69-induksjon observert ved stimulering likt det som sees med

PMA.

Stimulering av villtype-CD4 med 0KT4A resulterer i liten eller ingen induksjon av CD69 ved analyse i en rekke Jurkat CD4-transfektanter. Likeledes hadde ikke behandling av transfektanter med klasse 1-antistoffet, W6/32, noen betydelig virkning i denne analyse.

Disse resultater bekrefter og utvider arbeidet av Irving og Weiss (1991) som ovenfor, som innbefatter den kimære CD8-zetareseptor, og viser at kimære CD4-reseptorer som har cytoplasma-zeta-restfunksjon, virker effektivt ved starting av T-celleaktiveringsforhold. Spesifikt formidler kimære CD4-zeta-reseptorer som bærer CD4 TM-området (F3), T-celleaktivering mer effektivt (i det minste med hensyn til CD69-induksjon) enn de som bærer zeta-TM-området (F2), til tross for at sistnevnte holder tilbake den homodimere form av naturlig zeta. Det er mulig at denne forskjell i effektivitet skyldes de betydelig høyere nivåer av kimær reseptor som er tilstede på celleoverflaten av Jurkat-kloner som uttrykker F3 sammenliknet med F2, og/eller den mulighet at "fråkopling" av reseptoren fra TCR-komplekset i det minste forsterker signaliseringen via denne spesielle vei.

F3 er forskjellig fra F2 og naturlig zeta på den måte at det ikke finnes i form av en kovalent homodimer. Den kimære CD8-zeta-reseptor beskrevet av Irving og Weiss (1991), som ovenfor, finnes som en disulfid-sammenbundet dimer (likesom naturlig CD8), idet således den dimere form av naturlig zeta bevares, til tross for fravær av zeta-TM-området. I motsetning til CD8-zeta, er F3-reseptoren beskrevet her ikke i stand til å danne en disulfid-sammenbundet homodimer som vist ovenfor. Disse data viser derfor at kovalent dimerisering av den kimære reseptor ikke er vesentlig for igangsetting av T-celleaktivering ifølge måling ved CD69-induksjon.

Etter prosessen for påvisning av IL-2-ekspresjon, hovedsakelig som beskrevet ovenfor for CD8-f-kimærene, ble IL-2-sekresjon også observert som svar på anti-CD4-antistoff ved Jurkat-celler som uttrykker CD4- f-kimærene.

Det fremgår av ovenstående resultater at man kan tilveiebringe aktivering av forskjellige signaliseringsveier i en vertscelle ved tilveiebringelse av ekspresjon av et kimært protein, som kan tjene som et overflatemembranprotein, hvor det ekstracellulære område er knyttet til en aktuell ligand, mens cytoplasma-området, som ikke er naturlig knyttet til det ekstracellulære område, kan tilveiebringe aktivering av den ønskede vei. På denne måte kan celler transformeres for anvendelse for spesifikke formål, hvor celler vil bli aktivert til en spesiell vei ved en unaturlig ligand. Dette kan eksem-plifiseres ved anvendelse av CD4 som det ekstracellulære område, hvor binding av et HIV-protein kan resultere i aktivering av en T-celle som kan stimulere cytotoksisk aktivitet under ødeleggelse av infiserte celler. Likeledes kan andre celler modifiseres slik at de blir mer effektive ved sykdoms-behandling, eller til immuneffekter og liknende.

Alle publikasjoner og patentsøknader nevnt i denne beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse i det samme omfang som om hver individuell publikasjon eller patent-søknad var spesifikt og individuelt angitt å være medtatt som referanse.

Idet oppfinnelsen nå er beskrevet fullstendig, vil det være åpenbart for en vanlig fagmann på området at mange forandringer og modifikasjoner kan gjøres ved denne uten at man avviker fra de tilknyttede kravs prinsipp eller ramme.

Claims (23)

1. Kimær DNA-sekvens som koder for et membranbundet protein,karakterisert vedat DNA-sekvensen omfatter i leseramme: en sekvens som koder for en signalsekvens, en sekvens som koder for et ekstracellulært bindingsområde for et overflatemembranprotein som bindes spesifikt til i det minste en ligand, hvor nevnte ligand er et protein på over-flaten av en celle eller et viralt protein, en sekvens som koder for et transmembranområde, og en sekvens som koder for et cytoplasmatisk område av et protein istand til å overføre et signal hvor nevnte cytoplasmatiske område er en eta- eller zetakjede av en T-celle reseptor eller gammakjeden til Fc£Rl-reseptoren, hvor nevnte ekstracellulære område og cytoplasmatiske område ikke naturlig er knyttet sammen og nevnte cytoplasmatiske område ikke naturlig er knyttet til et ekstracellulært ligand-bindingsområde og når nevnte kimære DNA-sekvens uttrykkes som et membranbundet protein i en valgt vert under betingelser egnet for ekspresjon, fører binding av en ligand til det ekstracellulære området til transmisjon av et signal til det cytoplasmatiske området resulterende i aktivering av en signal-reaksjonsvei i nevnte vert.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at cytoplasmaområdet er zeta-kjeden.

3. DNA-sekvens ifølge krav 2,karakterisertved at det ekstracellullær"e området er den tunge kjede av et lg, i seg selv eller i forbindelse med en lett kjede, eller avkuttede deler derav.

4. DNA-sekvens ifølge krav 2,karakterisertved at det ekstracellullære området er CD8.

5. DNA-sekvens ifølge krav 2,karakterisertved at det ekstracellullære området er CD4.

6. DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisertved at transmembranområdet er naturlig knyttet til cytoplasmaområdet .

7. Ekspresjonskassett,karakterisert vedat den omfatter en transkripsjons-startregion, en DNA-sekvens ifølge krav 1 under transkripsjonen regulering av transkripsjonsstartregionen, og en transkripsjons-avslutningsregion.

8. Ekspresjonskassett ifølge krav 8,karakterisert vedat transkripsjonsstartregionen er funksjonell i en pattedyr-vert.

9. Celle,karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 1.

10. Celle ifølge krav 9,karakterisert vedat cytoplasmaområdet er CD3-zetakjeden.

11. Celle ifølge krav 10,karakterisert vedat det ekstracellulære området er den tung kjede av et lg, i seg selv eller knyttet til en lett kjede, eller avkuttede deler derav.

12. Celle ifølge krav 10,karakterisert vedat det ekstracellulære området er CD8.

13. Celle ifølge krav 10,karakterisert vedat det ekstracellulære området er CD4.

14. Celle ifølge krav 9,karakterisert vedat transkripsjonsstartregionen er funksjonell i en pattedyrcelle og at cellen er en pattedyrcelle.

15. Celle ifølge krav 14,karakterisert vedat pattedyrcellen er en human celle.

16. Pattedyrcelle,karakterisert vedat den som overflatemembranprotein omfatter et protein som kodes for av en DNA-sekvens ifølge krav 1.

17. Pattedyrcelle ifølge krav 16,karakterisertved at det ekstracellulære området er bundet til et andre protein under avgrensning av et bindingssete.

18. Pattedyrcelle,karakterisert vedat den som overflatemembranprotein omfatter et protein som er kodet for av DNA-sekvensen ifølge krav 3, hvor cellen er en cytotoksisk T-lymfocytt.

19. Pattedyrcelle,karakterisert vedat den som overflatemembranprotein omfatter et protein som er kodet for av en DNA-sekvens ifølge krav 5, hvor cellen er en cytotoksisk T-lymfocytt.

20. Pattedyrcelle,karakterisert vedat den som overflatemembranprotein omfatter et protein som er kodet for av en DNA-sekvens ifølge krav 3, hvor cellen er hovedsakelig fri for overflate-ekspresjon av minst én av klasse I-eller klasse II-MHC.

21. Pattedyrcelle,karakterisert vedat den som overflatemembranprotein omfatter et protein som er kodet for av en DNA-sekvens ifølge krav 5, hvor cellen er hovedsakelig fri for overflate-ekspresjon av minst én av klasse I-eller klasse II-MHC.

22. Anvendelse av celle ifølge kravene 9-15 og 16-21, for aktivering ved hjelp av en sekundær budbringer-vei, hvor cellene bringes i kontakt med en ligand som bindes til det ekstraellulære området og overfører et signal til cytoplasma-området, hvorved den sekundære bundbringer-vei aktiveres.

23. Retrovirus-RNA- eller DNA-konstruksjon,karakterisert vedat den omfatter en ekspresjonskassett ifølge krav 8.