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TW201605480A - 抗ｅｆｎａ４抗體－藥物結合物 - Google Patents

抗ｅｆｎａ４抗體－藥物結合物 Download PDF

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TW201605480A
TW201605480A TW103137279A TW103137279A TW201605480A TW 201605480 A TW201605480 A TW 201605480A TW 103137279 A TW103137279 A TW 103137279A TW 103137279 A TW103137279 A TW 103137279A TW 201605480 A TW201605480 A TW 201605480A
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antibody
drug conjugate
efna4
drug
seq
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TW103137279A
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馬克 埃薩克 達美林
希蘭 馬諾哈爾 卡恩德克
蒲嘉 薩普拉
亞利山德 約翰 斑寇維奇
史考特Ｊ 戴拉
Original Assignee
輝瑞大藥廠
史坦森特瑞斯公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供抗EFNA4抗體-藥物結合物以及製備及使用其之方法。

Description

抗EFNA4抗體-藥物結合物 相關申請案
本案主張2013年11月4日申請之美國臨時申請案第61/899,800號之優先權，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本案正經由EFS網電子提申且包括電子提交之呈.txt格式的序列表。該.txt文檔含有創建於2013年11月1日且具有56KB大小的名稱為「PC72005_Sequence_Listing.txt」之序列表。該.txt文檔中所含之序列表為說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於蝶素-A4配位體(ephrin-A4 ligand，EFNA4)抗體及抗體-藥物結合物。本發明進一步關於使用此等抗體及抗體-藥物結合物治療癌症的方法。
蝶素受體(EPH)，最大的受體酪胺酸激酶家族，為與蝶素配位體(EFN)結合的I型跨膜蛋白。EPH亞家族中之受體典型地具有單個激酶域及含有Cys富集域及2個纖維結合蛋白III型重複序列的胞外區。根據序列分析，蝶素配位體可分成兩類：蝶素-A配位體(EFNA)及三個蝶素-B配位體(EFNB)。雖然一些非GPI錨定蛋白係經由蝶素mRNA之替代性拼接而產生，諸如EFNA4，但EFNA配位體(亦即EFNA1、EFNA2、EFNA3、EFNA4、EFNA5、EFNA6)典型地經由糖基磷脂醯 肌醇(GPI)鍵聯而錨定於細胞表面。EFNB配位體(亦即EFNB1、EFNB2、EFNB3)含有跨膜域及具有保守性酪胺酸殘基及PDZ結合基元的短胞質區。雖然已報導一些交叉相互作用，但EFNA配位體優先與九種不同蝶素A受體(EPHA)(亦即EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9)中之任一者結合，而EFNB配位體優先與六種不同蝶素B受體(EPHB)(亦即EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6)中之任一者結合。
EFN-EPH信號傳導可為雙向的(影響表現配位體之細胞與表現受體之細胞)且調控寬範圍的生物活性，包括神經發育、細胞圖案化、血管生成，以及細胞遷移及侵襲。在癌症之背景下，已觀測到各種EPH及EFN之表現，且已報導各種功能(Hafner等人，Clinical Chemistry 50(3)：490-499,2004；Surawska等人，Cytokine & Growth Factor Reviews 15(6)：419-433,2004；Pasquale,E.B,Nature Reviews Cancer 10(3)：165-180,2010)。由於配位體-受體結合混雜以及功能重疊，因此已難以準確地定義各EFN及EPH之作用。雖然已探究治療性靶向EPH受體來治療癌症，但對靶向EFN配位體尚未採取任何較大程度的探究(Pasquale,E.B.,Nature Reviews Cancer 10(3)：165-180,2010)。
對於癌症仍明顯需要其他治療選項。為此，本發明提供靶向EFNA4陽性癌症的新穎抗體-藥物結合物。
本發明提供EFNA4抗體-藥物結合物及其用於偵測、預防及治療EFNA4相關病症的用途。本發明之EFNA4抗體-藥物結合物具有通式：Ab-(L-D)，其中Ab為結合至EFNA4的抗體，或其抗原結合片段，或其EFNA4結合片段；且L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物。所揭示之抗體-藥物結合物中的Ab可為任何EFNA4 結合抗體。在本發明之一些態樣中，Ab為嵌合、CDR移植、人類化或重組人類抗體，或其EFNA4結合片段。在本發明之一些態樣中，Ab為內化抗體及/或中和抗體。
本發明亦提供EFNA4抗體-藥物結合物及其用於偵測、預防及治療EFNA4相關病症的用途。本發明之EFNA4抗體-藥物結合物具有通式：Ab-(L-D)，其中Ab為結合至EFNA4的抗體，或其抗原結合片段，或其EFNA4結合片段；且L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為卡奇黴素(calicheamicin)。
在本發明之特定態樣中，Ab為huE22或hu47抗體，或與huE22或huE47競爭結合至人類EFNA4的抗體，及/或與huE22或huE47抗體結合至相同抗原決定基的抗體。舉例而言，Ab可與包含以下之抗體競爭結合至人類EFNA4及/或結合相同抗原決定基：(a)如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區；或(b)如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區。
在與huE22競爭結合至人類EFNA4及/或與huE22結合至相同抗原決定基的Ab當中，適用於製備本發明之EFNA4抗體-藥物結合物的代表性Ab包括包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體，其中該至少一個重鏈可變區包含三個由SEQ ID NO：15、19及23定義的CDR。其他Ab包括包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體，其中該至少一個輕鏈可變區包含三個以SEQ ID NO：29、33及35定義的CDR。其他Ab包括包含以下之抗體：(a)包含三個如SEQ ID NO：15、19及23所述之CDR的重鏈可變區；及(b)包含三個如SEQ ID NO：29、33及35所述之CDR的輕鏈可變區。
在本發明之其他EFNA4抗體-藥物結合物中，Ab包含胺基酸序列與SEQ ID NO：13至少90%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：27至少90%一致的輕鏈可變區，例如如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區。
在與huE47競爭結合至人類EFNA4及/或與huE47結合至相同抗原決定基的Ab當中，適用於製備本發明之EFNA4抗體-藥物結合物的代表性Ab包括包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體，其中該至少一個重鏈可變區包含三個由SEQ ID NO：41、45及49定義的CDR。其他Ab包括包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體，其中該至少一個輕鏈可變區包含三個以SEQ ID NO：55、59及61定義的CDR。其他Ab包括包含以下之抗體：(a)包含三個如SEQ ID NO：41、45及49所述之CDR的重鏈可變區；及(b)包含三個如SEQ ID NO：55、59及61所述之CDR的輕鏈可變區。
在本發明之其他EFNA4抗體-藥物結合物中，Ab包含胺基酸序列與SEQ ID NO：39至少90%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：53至少90%一致的輕鏈可變區，例如如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區。
在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包含含有IgG1重鏈恆定區、κ輕鏈恆定區、或IgG1重鏈恆定區與κ輕鏈恆定區的Ab。舉例而言，適用於本發明之EFNA4抗體-藥物結合物的Ab包括含有如SEQ ID NO：25所述之重鏈、如SEQ ID NO：37所述之輕鏈、或如SEQ ID NO：25所述之重鏈與如SEQ ID NO：37所述之輕鏈的抗體。其他實例包括包含如SEQ ID NO：51所述之重鏈、如SEQ ID NO：63所述之輕鏈、或如SEQ ID NO：51所述之重鏈與如SEQ ID NO：63所述之輕鏈的抗體。
在本發明之其他態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物包含具有如SEQ ID NO：13或39所述之重鏈可變區的抗體。在本發明之其他態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物包含具有如SEQ ID NO： 27或53所述之輕鏈可變區的抗體。
在本發明之特定態樣中，Ab為huE5或hu15抗體，或與huE5或huE15競爭結合至人類EFNA4的抗體，及/或與huE5或huE15抗體結合至相同抗原決定基的抗體。舉例而言，Ab可與包含以下之抗體競爭結合至人類EFNA4及/或結合相同抗原決定基：(a)如SEQ ID NO：5所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：7所述之輕鏈可變區；或(b)如SEQ ID NO：9所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：11所述之輕鏈可變區。
在本發明之另一態樣中，Ab為人類化抗體，諸如huE5、huE15、huE22或hu47抗體。
本文揭示之任一種EFNA4抗體-藥物結合物可使用包含4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)之連接子製備。
本文揭示之任一種EFNA4抗體藥物結合物可使用卡奇黴素藥物製備，卡奇黴素藥物包括卡奇黴素之N-乙醯基衍生物，諸如N-乙醯基-γ-卡奇黴素及N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
本文揭示之任一種EFNA4抗體-藥物結合物可具有1至12之藥物與抗體比率(DAR)。在本發明之一個特定態樣中，式Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物包含(a)包含如SEQ ID NO：25所述之重鏈及如SEQ ID NO：37所述之輕鏈的抗體或其抗原結合片段Ab；及(b)連接子-藥物部分L-D，其中L為連接子且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
在本發明之另一態樣中，式Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物包含(a)包含如SEQ ID NO：51所述之重鏈及如SEQ ID NO：63所述之輕鏈的抗體或其抗原結合片段Ab；及(b)連接子-藥物部分L-D，其中L為連接子且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
本發明提供包含複數種如本文所揭示之抗體-藥物結合物及視情況存在之醫藥載劑的組合物，其中該組合物具有1至12範圍內之平均DAR。在本發明之一個特定態樣中，組合物可具有3至5範圍內之平均DAR。在本發明之另一態樣中，組合物可具有3至4範圍內之平均DAR。在本發明之另一態樣中，組合物可具有4至5範圍內之平均DAR。在本發明之另一態樣中，組合物可具有約4之平均DAR。
本發明此外提供一種組合物，該組合物包含複數種如本文所揭示之抗體-藥物結合物及視情況存在之醫藥載劑，其中該組合物具有至少50%抗體-藥物結合物，該等抗體-藥物結合物具有3至5之DAR。在本發明之另一態樣中，組合物具有至少60%抗體-藥物結合物，該等抗體-藥物結合物具有3至5之DAR。在本發明之另一態樣中，組合物具有至少70%抗體-藥物結合物，該等抗體-藥物結合物具有3至5之DAR。在本發明之另一態樣中，組合物具有至少75%抗體-藥物結合物，該等抗體-藥物結合物具有3至5之DAR。在本發明之另一態樣中，組合物具有約70%至80%抗體-藥物結合物，該等抗體-藥物結合物具有3至5之DAR。
本發明此外提供具有通式：Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物，其中Ab為結合至EFNA4的抗體，或其抗原結合片段，或其EFNA4結合片段；且L-D為連接子-藥物部分，其中L為vc或mc，且D為藥物。
本發明此外提供具有通式：Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物，其中Ab為結合至EFNA4的抗體，或其抗原結合片段，或其EFNA4結合片段；且L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為0101或8261。
本發明此外提供製備本文所揭示EFNA4抗體-藥物結合物的方法。舉例而言，用於製備抗體-藥物結合物的方法可包括以下步驟： (a)將連接子與藥物部分連接；(b)使連接子-藥物部分與抗體結合；及(c)純化抗體-藥物結合物。
本發明之另一態樣包括對本文所揭示抗體-藥物結合物進行製造的方法、製備的方法、合成的方法、結合的方法及純化的方法；以及供本文所揭示抗體-藥物結合物製備、合成及結合用的中間物。
此外提供包含本文所揭示EFNA4抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在其他態樣中，提供治療EFNA相關病症的方法，其係藉由投與治療有效量之包含本文所揭示EFNA4抗體-藥物結合物的組合物。代表性EFNA相關病症包括過度增生性病症，諸如贅生性病症，諸如實體腫瘤(例如乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌等)及血液惡性疾病(例如白血病等)。亦提供所揭示EFNA4抗體-藥物結合物用於製造供治療個體之EFNA相關病症之藥劑的用途。亦提供用於治療EFNA相關病症之EFNA4抗體-藥物結合物。
在其他態樣中，本發明提供治療個體之EFNA相關病症的方法，其係藉由投與治療有效量之包含本文所揭示EFNA4抗體-藥物結合物及化學治療劑的組合物。
本發明之另一態樣包括用本文所揭示的抗體-藥物結合物治療患者之以EFNA4之過度表現為特徵之病症的方法。在其他態樣中，本發明提供用本文所揭示之抗體-藥物結合物治療患者之以EFNA4之過度表現為特徵之癌症的方法。
在其他態樣中，本發明提供使腫瘤細胞群中之腫瘤起始細胞減少的方法。舉例而言，該方法可包含使腫瘤細胞群(其中該群體包含腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞之外的腫瘤細胞)與EFNA4抗體-藥物結合物接觸；藉此減少腫瘤起始細胞於腫瘤細胞群中之頻率。接觸步驟可在活體外或活體內進行。
本發明之另一態樣包括本文所揭示之化合物及組合物的診斷及治療用途。
本發明之其他態樣包括製品，亦即套組，其包含本文所揭示之抗體-藥物結合物、容器及指示治療的藥品說明書或標籤。
藉由總體上回顧本申請案將瞭解本發明之此等及其他態樣。
圖1提供顯示胺基酸差異之人類EFNA4 a、b及c同功異型物序列之比對(SEQ ID NO：2至4)。
圖2提供EFNA4之基因排列及重鏈及輕鏈CDR序列(來源於VBASE2資料庫之分析)。
圖3A及3B分別提供huE22及huE47抗體之結合資料，以說明針對EFNA4之結合特異性。
圖4A及4B分別提供與抗體(X)結合之AcBut-CM及AcBut-CM之結構。
圖5提供對huE22-AcBut-CM之疏水性相互作用層析法(HIC)分析。
圖6提供在未結合抗體存在下、在TSKgel丁基-NPR上對經純化之huE22-AcBut-CM進行的UPLC-HIC分析。
圖7提供在聚集物及二聚物之存在下、在BEH200 SEC上對經純化之huE22-AcBut-CM進行的UPLC-SEC分析。
圖8提供在游離藥物存在下、在Zorbax 300SB-CN上對經純化之huE22-AcBut-CM進行的逆相分析。
圖9提供在iCE280上對經純化之huE22-AcBut-CM進行的cIEF分析以獲得DAR分佈概況。
圖10提供多次冷凍-解凍對huE22-AcBut-CM之穩定性的影響。
圖11顯示huE22-AcBut-CM對乳房-5(BR5)三重陰性乳癌(TNBC) PDX的功效。
圖12顯示huE22-AcBut-CM對乳房-13(BR13)TNBC PDX之功效。
圖13顯示huE22-AcBut-CM對乳房-22(BR22)PDX之功效。
圖14顯示huE22-AcBut-CM對乳房-31(BR31)TNBC PDX之功效。
圖15顯示huE22-AcBut-CM對卵巢-45(OV45)卵巢癌PDX的功效。
圖16顯示huE22-AcBut-CM對卵巢-55(OV55)卵巢癌PDX的功效。
圖17顯示huE22-AcBut-CM對卵巢-44(OV44)卵巢癌PDX的功效。
圖18顯示huE22-AcBut-CM對卵巢-63(OV63)卵巢癌PDX的功效。
圖19顯示huE15、huE22及huE47與微小管抑制劑(MTI)vc0101及mc8261之結合物對BR22 TNBC PDX的功效。
圖20顯示huE15、huE22及huE47與MTI vc0101之結合物對BR31 TNBC PDX的功效。
圖21顯示huE22-AcBut-CM(開口菱形)相對於對照物-AcBut-CM ADC(斜影線圓)對表現EFNA4之293T細胞之活體外細胞毒性。
圖22顯示對暴露於huE22-AcBut-CM之BR5 TNBC PDX腫瘤使用抗hIgG1抗體(斜影線圓)及抗γ-H2A.X抗體(開口菱形)的免疫組織化學分析。
圖23顯示經ESA+CD46+CD324+(斜影線圓)或ESA+CD46+CD324-(開口圓圈)細胞植入之小鼠的腫瘤生長曲線，該等細胞係自所解離之BR22 TNBC PDX腫瘤分離。
圖24顯示經ESA+CD46+CD324+(斜影線圓)或ESA+CD46+CD324-(開口圓圈)細胞植入之小鼠的腫瘤生長曲線，該等細胞係自所解離之BR31 TNBC PDX腫瘤分離。
圖25顯示EFNA4 mRNA在正常鄰近乳房、TNBC、非TNBC乳房中之表現(使用TCGA資料)。
圖26顯示乳癌腫瘤樣品中之EFNA4複本數(根據TCGA及METABRIC資料集)。
圖27顯示卵巢癌腫瘤樣品中之EFNA4複本數(根據TCGA及METABRIC資料集)。
圖28顯示肝細胞癌(HCC)腫瘤樣品中之EFNA4複本數(根據TCGA及METABRIC資料集)。
圖29顯示利用4m/m至6m/m之CM與huE22 Ab之比率所產生之經純化之huE22-AcBut-CM ADC之分析性HIC之比較。
圖30顯示利用4m/m至6m/m之CM與huE22 Ab之比率所產生之經純化之huE22-AcBut-CM ADC之分析性HIC之進一步比較。
本發明提供結合至蝶素-A配位體(或EFNA)(諸如EFNA4)的抗體-藥物結合物。本發明亦提供使用EFNA4抗體、連接子及藥物製備結合物的方法。本發明之抗體-藥物結合物適用於製備及製造組合物，諸如可用於診斷、預防及/或治療以EFNA4表現為特徵之過度增生性病症的藥劑。在本發明之一些態樣中，所揭示之抗體-藥物結合物可減少腫瘤起始細胞(TIC)之頻率，該等細胞包涵腫瘤不朽化細胞(TPC)及高度增生性腫瘤祖細胞(TProg)。
I. EFNA生理學
PCT國際公開案第WO2012/118547號描述蝶素受體(EPH)與蝶素配位體(EFN)接合(如同所有細胞表面受體-配位體相互作用)最終引起 細胞內信號傳導級聯之活化。雖然同一細胞表面上之分子之間可能發生受體-配位體相互作用(順式相互作用)，但一般認為順式相互作用不會觸發信號傳導級聯，或順式相互作用實際上可拮抗由反式相互作用(例如各別細胞上之受體與配位體之間的相互作用)所起始的信號傳導級聯。EPH-EFN反式相互作用之一個態樣為在受體-配位體接合時觸發兩種信號傳導級聯的能力：表現EPH之細胞中的正向信號傳導級聯，及表現EFN之細胞中的反向信號傳導級聯。兩種各別信號傳導級聯之活化可反映在動物胚胎發育中EPH及EFN已演變成相互協調的細胞分選及細胞定位過程。
EPH-EFN信號傳導頻繁地活化細胞信號傳導路徑，從而調控細胞骨架動力學且引起不同類型細胞之間黏著性及排斥性相互作用之調節。一般而言，相對於在成人組織中所觀測到之情況，在胚胎發生期間發現含量高得多的EPH及EFN蛋白，但成人中之持續低量表現可反映此等分子在正常組織(諸如具有明確構造的成人腸，其由分化細胞自其位於腺管中之組織幹細胞源遷移至其面向腸腔之絨毛表面之最後位置而產生)功能中的作用。由於EPH首先鑑定存在於肝細胞癌中且EPH及EFN表現在成人中典型地受到限制，因此EFN及/或EPH於人類癌症中之再活化可能與癌細胞之去分化及/或此等癌細胞侵入周圍正常組織中及自原發瘤位點遷移至遠端的能力有關。其他研究已提出EPH-EFN相互作用亦在血管新生中起作用。
與非淋巴組織中之EPH-EFN相互作用調控細胞相互作用(細胞之間藉由整合素及細胞骨架重排來產生黏著力或排斥力)的發現一致，發現於淋巴樣細胞上的EPH及EFN分子已顯示可介導細胞黏附於細胞外基質組分、趨化性及細胞遷移。舉例而言，EFNA1(其結合至EPHA2受體且包含例如如基因庫寄存號NM_004428中之胺基序列)與初級CD4及CD8 T細胞之接合已發現可刺激細胞遷移且增強趨化性。 如EFNA1，EFNA4表現於初級CD4 T細胞上，但由於EPH-EFN相互作用之混雜，因此不清楚EFNA4接合對此等細胞是否具有類似的作用。然而，已證明成熟的人類B淋巴細胞表現EFNA4且在活化時分泌EFNA4。此外，不同於任何其他的EFN或EPH分子，EFNA4亦一致地表現於慢性淋巴細胞性白血病(CLL)之B細胞上或由慢性淋巴細胞性白血病(CLL)之B細胞表現。有趣的是，藉由Q-PCR所量測之EFNA4同功異型物之表現可能與該病症之臨床表現相關。此外，相較於健康個體之B細胞，已知EFNA4表現增強之CLL患者的B細胞顯示較弱的跨內皮遷移潛力。顯然，EFNA4之接合使CLL細胞黏附至細胞外基質分子的能力降低且使其對CCL1的趨化性反應降低。總之，此等報導表明，EFNA4對B細胞及T細胞運輸的作用且當與上文論述之細胞內信號傳導資料組合檢視時，使得EFNA(尤其EFNA4)成為開發抗癌治療劑的極受人關注之標靶。
另外，EFNA4於多種癌症幹細胞群中之表現升高。隨著塊體腫瘤中之若干EPHA受體之伴隨性上調，此提高了EFNA4介導之配位體-受體相互作用可能觸發與腫瘤增殖、血管新生及/或腫瘤轉移相關之細胞信號傳導級聯的可能性。不希望受任何特定理論束縛，咸信本發明之EFNA4抗體及EFNA4抗體-藥物結合物至少部分地藉由降低或消除腫瘤起始細胞(TIC)頻率來起作用，從而以不同於傳統標準照護(SOC)治療方案(例如小紅莓(doxorubicin)及伊立替康)的方式或經由免疫治療性信號傳導或遞送能夠殺死EFNA4表現細胞之負載來中斷腫瘤傳播或存活。參見實例8及9。
代表性EFNA4蛋白異種同源物包括(但不限於)人類(NP_005218、NP_872631或NP_872632)、小鼠(NP_031936)、黑猩猩(XP_001153095、XP_001152971、XP_524893及XP_001152916)及大鼠(NP_001101162)。所轉錄之人類EFNA4基因包括來自染色體1之最小5817bp。
三種人類EFNA4 mRNA轉錄物變異型及所編碼之蛋白質顯示於表1中，其各自經由所轉錄之RNA之替代性拼接而產生：(1)1276個鹼基對變異體(NM_005227；EFNA4轉錄物變異體1；SEQ ID NO：1)，其編碼201個胺基酸前蛋白(NP_005218；EFNA4同功異型物a；SEQ ID NO：2)；(2)1110個鹼基對變異體(NM_182689；EFNA4轉錄物變異體2)，其編碼207個胺基酸前蛋白(NP_872631；EFNA4同功異型物b；SEQ ID NO：3)；及(3)1111個鹼基對變異體(NM_182690；EFNA4轉錄物變異體3)，其編碼193個胺基酸前蛋白(NP_872632；EFNA4同功異型物c；SEQ ID NO：4)。
應瞭解，人類EFNA4蛋白質各包括包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至25的所預測之信號或前導序列，其經剪去以提供蛋白質之成熟形式(亦即長度168-182 aa)。此信號肽使多肽靶向細胞表面/分泌路徑。術語「信號序列」，亦稱為信號肽、前導肽，係指位於蛋白質之N末端之約15至30個胺基酸之區段，其使得蛋白質能夠(通過細胞膜)分泌。當蛋白質分泌時，信號序列移除。由於mRNA之替代性拼接隨後對蛋白質編碼序列的影響，因此細胞以不同方式處理蛋白質同功異型物。同功異型物a藉由糖基磷脂醯肌醇(GPI)鍵聯經膜定位且錨定於細胞表面，而同功異型物b及c GPI錨定信號序列且因此預期由細胞分泌。人類EFNA4之三種蛋白質同功異型物之比對顯示於圖1中。如先前所說明，除非另外藉由直接引用說明或上下文需要，否則術語EFNA4應指人類EFNA4及免疫反應性等效物之同功異型物a。此外應瞭解，該術語亦可指EFNA4之原生或變異形式之衍生物或片段，其含有抗體或免疫反應性片段可特異性結合的抗原決定基。
II. EFNA4抗體-藥物結合物
本發明提供式Ab-(L-D)之抗體-藥物結合物，其中(a)Ab為結合至EFNA4的抗體，或其抗原結合片段；及(b)L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物。與為了抑制Eph受體信號傳導所開發之TKI相比，抗體-藥物結合物(ADC)(諸如抗EFNA4 ADC)可靶向特定表面分子及表現其之細胞，不論其信號傳導功能，只要該等分子有效地內化。亦提供製備及製造此等抗體-藥物結合物的方法，及其用於臨床應用中的用途。「抗體-藥物結合物」或「ADC」係指結合至EFNA4的抗體或其抗原結合片段(包括抗體衍生物)與如下文中進一步描述之藥物(諸如細胞毒性劑、細胞抑制劑及/或治療劑)之結合物。舉例而 言，細胞毒性劑可與如本文所述之抗EFNA4抗體連接或結合以便使細胞毒性劑靶向局部傳遞至腫瘤(例如表現EFNA4之腫瘤)。
如本文所用，術語「EFNA4」包括變異體、同功異型物、同源物、異種同源物及同種同源物。EFNA4在此項技術中亦已知為蝶素-A4、蝶素-A4配位體、EPH相關受體酪胺酸激酶配位體4；Eph相關激酶4、EFL4、EPLG4及LERK4之配位體。在本發明之一些態樣中，抗體及抗體-藥物結合物與來自除人類之外之物種的EFNA4交叉反應，諸如小鼠、大鼠或靈長類動物之EFNA4，以及EFNA4之不同形式(例如糖基化EFNA4)。在其他態樣中，抗體及抗體-藥物結合物對於人類EFNA4可具有完全特異性且可不展現物種間或其他類型的交叉反應性。除非上下文另外指明，否則如本文所用，術語EFNA4係指天然存在之人類EFNA4。因此，「EFNA4抗體」、「抗EFNA4抗體」、「蝶素-A4抗體」或「蝶素-A4配位體抗體」或其他類似名稱意謂與EFNA4型配位體或同功異型物或其片段或衍生物締合、結合或反應的任何抗體(如本文定義)。此外，「EFNA4抗體-藥物結合物」、「抗EFNA4抗體-藥物結合物」、「蝶素-A4抗體-藥物結合物」或「蝶素-A4配位體抗體-藥物結合物」意謂與EFNA4型配位體或同功異型物或其片段或衍生物締合、結合或反應的任何抗體-藥物結合物或ADC(如本文定義)。
「連接子(L)」描述抗體與藥物之直接或間接鍵聯。連接子與抗體之連接可以多種方式實現，諸如經由表面離胺酸、與氧化碳水化合物之還原性偶合，及經由鏈間二硫鍵還原所釋出的半胱胺酸殘基。此項技術中已知多種ADC鍵聯系統，包括基於腙、二硫化物及肽之鍵聯。
「藥物(D)」為具有生物活性或可偵測活性的任何物質，例如治療劑、可偵測標記、結合劑等，及活體內代謝為活性劑的前藥。術語藥物、負載及化合物可互換地使用。
「L-D」為經由藥物(D)與連接子(L)連接所產生的連接子-藥物部分。
除非本文另有指明，否則聯合本發明使用的其他科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所瞭解的含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言，聯合本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交之技術使用的命名法為此項技術中熟知且常用的命名法。
在本發明之特定態樣中，式Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物包括：(a)包括如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區的抗體(Ab)或其抗原結合片段；及(b)連接子-藥物部分L-D，其中L為連接子且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。在本發明之其他態樣中，式Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物包括(a)具有如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區的抗體(Ab)或其抗原結合片段；及(b)連接子-藥物部分(L-D)，其中L為連接子且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
在本發明之特定態樣中，式Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物包括：(a)包括如SEQ ID NO：25所述之重鏈及如SEQ ID NO：37所述之輕鏈的抗體(Ab)或其抗原結合片段；及(b)連接子-藥物部分L-D，其中L為連接子且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。在本發明之其他態樣中，式Ab-(L-D)之EFNA4抗體-藥物結合物包括(a)具有如SEQ ID NO：51所述之重鏈及如SEQ ID NO：63所述之輕鏈的抗 體(Ab)或其抗原結合片段；及(b)連接子-藥物部分(L-D)，其中L為連接子且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
本發明此外提供具有最佳化平均DAR及窄DAR分佈的抗體-藥物結合物。進一步參見下文章節IIC藥物中之說明。平均DAR及DAR分佈可對ADC之臨床功效有影響，尤其對ADC之效能與潛在毒性均有影響，且可對諸如ADC之穩定性及聚集之特性有明顯影響。
表示每個抗體所結合之藥物分子數目的DAR(藥物與抗體比率)或藥物負載率可為1至12。複數種抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由平均DAR表徵。DAR及平均DAR可藉由多種習知方式測定，諸如UV光譜法、質譜法、ELISA分析、放射性測量法、疏水性相互作用層析法(HIC)、電泳及HPLC。
DAR分佈提供可存在於ADC之組合物、批料及/或調配物中之不同ADC種類之百分比或分率(例如DAR 1至12)。ADC之組合物、批料及/或調配物中之DAR分佈可藉由此項技術中已知的方法(諸如毛細管等電聚焦(cIEF))測定。ADC之組合物、批料及/或調配物中之DAR分佈可具有高度非均勻混合物之特徵，其具有寬DAR分佈，通常含有寬範圍的ADC種類、具有DAR 1至12。ADC之組合物、批料及/或調配物中之DAR分佈可具有高度均勻混合物之特徵，其具有窄DAR分佈，通常含有窄範圍之ADC種類，其具有特定DAR，諸如DAR 3至5。
在本發明本發明之特定態樣中，本文所揭示之經改良的結合及純化條件使抗EFNA4 ADC具有約3至5範圍內、較佳約4之最佳化平均DAR，及窄DAR分佈，例如較小異質性，其中DAR為3至5之種類(其為最需要的)構成總抗EFNA4 ADC之至少60%，或至少70%，或約70%至80%，或較佳約75%至80%。參見圖9。
在本發明之特定態樣中，在結合及純化期間，清除具有高DAR (DAR>5)之ADC為有益的，該等ADC更具疏水性且顯示較快清除率，此可導致較高毒性及較低治療指數(TI)。在本發明之其他態樣中，清除具有低DAR(DAR<2)之ADC為有益的，低DAR對功效的貢獻很小，然而使得可與ADC競爭標靶抗原(諸如EFNA4)之未結合抗體之量增加且導致較低TI。在本發明之另一態樣中，清除具有高DAR(DAR>5)之ADC及具有低DAR(DAR<2)之ADC為有益的。
在本發明之特定態樣中，相較於較高比率，用於製備結合反應混合物之CM與huE22比率可為4-5：1，以產生具有最佳化DAR之抗EFNA4 ADC及清除較高DAR種類。
在本發明之其他態樣中，在添加連接子-藥物部分(AcBut-CM)期間進行大力攪拌及劇烈混合，例如如部分地藉由添加連接子-藥物部分至混合渦旋之中部中來達成，此有助於降低未結合抗體之量，從而比先前方法有改良。
在本發明之其他態樣中，相較於60-90分鐘，反應之培育時間可縮減為2-5分鐘，以提供低聚集物且增強抗EFNA4 ADC之穩定性。在本發明之另一態樣中，相較於9%，反應混合物中之乙醇(EtOH)之量可縮減成6-8%，以提供低聚集物且增強抗EFNA4 ADC之穩定性。
在本發明之特定態樣中，在純化期間，溶離梯度可經最佳化以提供抗EFNA4 ADC之窄DAR分佈。
在本發明之特定態樣中，經純化之抗EFNA4 ADC可不呈遞未結合之抗體(游離抗體)，參見圖6。在本發明之其他態樣中，經純化之抗EFNA4 ADC可為單體ADC，且聚集物及二聚物不存在，參見圖7。在本發明之其他態樣中，經純化之抗EFNA4 ADC可不呈遞游離藥物，參見圖8。在本發明之其他態樣中，經純化之抗EFNA4 ADC可為單體ADC且不呈遞游離藥物。
IIA. EFNA4抗體
為了製備本發明之EFNA4抗體-藥物結合物，抗體或其抗原結合片段可為特異性結合至EFNA4的任何抗體或其抗原結合片段。本發明抗體進一步揭示且表徵於PCT國際公開案第WO2012/118547號中，該案以全文引用的方式併入本文中。抗體或其抗原結合片段可經分離、純化或或衍生化，用於製備EFNA抗體-藥物結合物。
「抗體」或「Ab」為經由位於免疫球蛋白分子之可變區中的至少一個抗原識別位點能夠識別且結合至特定標靶或抗原(諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，術語「抗體」可包涵任何類型的抗體，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、完整抗體之「抗原結合片段」(或部分)(諸如Fab、Fab'、F(ab)2、Fd、Fv、Fc等)(其保持特異性結合至指定抗原(例如EFNA4)的能力)、分離之互補決定區(CDR)、雙特異性抗體、雜結合抗體、其突變體、具有抗體或其抗原結合片段(例如域抗體)之融合蛋白、單鏈(ScFv)及單域抗體(例如鯊魚及駱駝科抗體)、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙scFv(參見例如Holliger及Hudson Hudson,2005,Nature Biotechnology 23(9)：1126-1136)、人類化抗體、嵌合抗體，及包括具有所需特異性之抗原識別位點之免疫球蛋白分子之之任何其他修飾組態，包括抗體之之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及共價修飾抗體。抗體可為鼠科、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人類化抗體)。在本發明之一些態樣中，所揭示EFNA4抗體-藥物結合物中之抗體或其抗原結合片段為嵌合、人類化或重組人類抗體，或其EFNA4結合片段。
「特異性結合」或「優先結合」(本文中可互換地使用)標靶或抗原(例如EFNA4蛋白質)的抗體、抗體-藥物結合物或多肽為此項技術中充分瞭解的術語，且測定此特異性或優選結合的方法在此項技術中亦熟知。若一種分子與特定細胞或物質的反應或結合比其與替代細胞或 物質的反應或結合更頻繁、更快速、持續時間更長及/或親和力更大，則稱該分子展現「特異性結合」或「優選結合」。若抗體與其結合至其他物質相比，結合的親和力、親合力更大、更容易及/或持續時間更大，則抗體「特異性結合」或「優先結合」標靶或抗原。舉例而言，特異性或優先結合至EFNA4抗原決定基的抗體為結合此抗原決定基之親和力、親合力比其結合至其他EFNA4抗原決定基或非EFNA4抗原決定基更大、更容易及/或持續時間更長的抗體。
如本文所用，術語「結合親和力」或「KD」意指特定抗原-抗體相互作用之平衡解離常數。KD為解離速率(亦稱為「離解速率」或「kd」)與結合速率或「締合速率」或「ka」的速率。因此，KD等於kd/ka且以莫耳濃度(M)表示。由此可知，KD愈小，結合親和力愈強。因此，1μM之KD表示結合親和力弱於1nM之KD。抗體之KD值可使用此項技術中已確立的方法測定。一種用於測定抗體之KD的方法為使用表面電漿共振，典型地使用生物感測系統，諸如Biacore®系統。
所揭示EFNA4抗體-藥物結合物之特異性結合係指抗體優選結合至具有多種不同抗原之非均勻樣品中的人類EFNA4抗原。典型地，若結合親和力為至少約10-7M或高於10-7M，諸如至少約10-8M或高於10-8M，包括至少約10-9M或高於10-9M、至少約10-11M或高於10-11M、或至少約10-12M或高於10-12M，則發生特異性結合。舉例而言，本發明抗體與人類EFNA4抗原的特異性結合包括至少約1×10-7M至約1×10-12M範圍內之結合，諸如約1×10-8M至約1×10-12M範圍內，或約1×10-8M至約1×10-11M範圍內，或約1×10-8M至約1×10-10M範圍內，或約1×10-9M至約1×10-10M範圍內之結合。特異性結合亦指抗體投與個體之後，EFNA4抗體或其抗原結合片段選擇性靶向表現EFNA4之細胞。
如本文所用，「抗原決定基」包括能夠特異性結合至免疫球蛋白 或T細胞受體或以其他方式與分子相互作用的任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由化學活性表面分子群(諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈)組成且通常具有特定的三維結構特徵以及特定電荷特徵。抗原決定基可呈『線性』或『構形』。在線性抗原決定基中，蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質之初級胺基酸序列線性存在。在構形抗原決定基中，相互作用點跨越蛋白質上之彼此分隔之胺基酸殘基而存在。抗原上之所要抗原決定基一經確定，便可產生針對該抗原決定基的抗體，例如使用本發明中所述的技術來產生。或者，在發現過程中，抗體之產生及表徵可闡明關於所要抗原決定基的資訊。根據此資訊，接著可競爭性篩選結合至相同抗原決定基的抗體。達成此舉的方法係進行交叉競爭研究以發現彼此競爭性結合的抗體，亦即競爭結合至抗原的抗體。根據交叉競爭而對抗體「分級」的高產量方法描述於PCT國際公開案第WO 03/48731號中。如本文所用，術語『分級』係指根據抗原結合特徵及彼此間競爭而將抗體分類的方法。
然而，特異性結合EFNA4的經分離抗體與其他抗原(諸如其他物種之EFNA4分子(亦即異種同源物))或與EFNA4之超過一種同功異型物具有交叉反應性。如本文所用，術語「經分離之抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合EFNA4的經分離抗體實質上不含特異性結合除EFNA4外之抗原的抗體)。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。亦瞭解，根據閱讀此定義，例如特異性或優先結合至第一標靶的抗體(或部分或抗原決定基)可或可不特異性或優先地結合至第二標靶。因而，「特異性結合」或「優選結合」未必需要(雖然其可包括)完全結合。通常，但非必定，提及結合意謂優選結合。
在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括競爭結合 至人類EFNA4及/或與具有(a)如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區；或(b)如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基的抗體。
如本文關於抗體所用的術語「競爭」意謂第一抗體或其抗原結合片段以足夠類似於第二抗體或其抗原結合片段之結合的方式結合至抗原決定基，以致與第一抗體在第二抗體不存在下之結合相比，第一抗體與其同源抗原決定基結合之結果在第二抗體存在下發生可偵測地降低。其中第二抗體與其抗原決定基在第一抗體存在下之結合亦發生可偵測之降低的替代方案可為但不必定為實情。亦即，第一抗體可抑制第二抗體結合至其抗原決定基，而該第二抗體不抑制第一抗體結合至其相應抗原決定基。然而，在各抗體可偵測地抑制其他抗體與其同源抗原決定基或配位體結合的情況下(不論結合的程度是否相同、較大或較小)，稱該等抗體彼此「交叉競爭」結合其相應抗原決定基。本發明包涵競爭與交叉競爭抗體。不論藉以發生此競爭或交叉競爭的機制(例如空間位阻、構型變化，或結合至共同抗原決定基，或其一部分)，熟習此項技術者會基於本文中所提供之教示內容瞭解，本發明包涵此等競爭及/或交叉競爭抗體且此等抗體可適用於本文所揭示之方法。
原生抗體或天然存在之抗體及原生免疫球蛋白典型地為約150,000道爾頓之雜四聚糖蛋白，其由兩條相同輕鏈(L)及兩條相同重鏈(H)組成。每條輕鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫鍵數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈中有變化。每條重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋鍵。每條重鏈在一端具有可變域(VH)，繼之為多個恆定域。每條輕鏈在一端具有可變域(VL)且在其另一端具有恆定域；輕鏈恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈可變 域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形式界面。術語「可變」係指在抗體當中，可變域之某些部分之序列廣泛不同的實情。
抗體及上述抗體域可描述為「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」，亦即具有任何長度之胺基酸鏈，較佳相對較短(例如10至100個胺基酸)。該鏈可呈線性或分支狀，其可包含經修飾之胺基酸，及/或可間雜有非胺基酸。該術語亦包涵經天然修飾或經干預修飾之胺基酸鏈；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合。該定義亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解多肽可以單鏈或所結合鏈形式存在。胺基酸在本文中可藉由IUPAC-IUB Biochemical所推薦之通常已知之其三字母符號或單字母符號提及。
抗體之「恆定區」係指抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區(單獨或組合)。嵌合及人類化EFNA4抗體之恆定區可來源於IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、其任何同型(例如IgG之IgG1、IgG2、IgG3，或IgG4同型)以及其子類及突變形式中之任一者之恆定區。免疫球蛋白視其重鏈之恆定區之抗體胺基酸序列而定，可歸於不同類別。存在五種主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於免疫球蛋白之不同類別的重鏈恆定區分別稱作α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之亞單元結構及三維組態已熟知。
恆定域不直接涉及抗體結合至抗原，但展現多種效應功能，諸如Fc受體(FcR)結合、抗體參與抗體依賴性細胞毒性、調理、補體依賴性細胞毒性之起始，及肥大細胞脫粒。如此項技術中所知，術語 「Fc區」用於界定免疫球蛋白重鏈之C末端區域。「Fc區」可為原生序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可不同，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基末端之延伸段。Fc區中之殘基編號為如Kabat之EU索引之編號。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區通常具有兩個恆定區：CH2及CH3。
如此項技術者中所用，「Fc受體」及「FcR」描述結合至抗體之Fc區的受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體的FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及替代拼接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制性受體」)，其具有類似的胺基酸序列，不同之處主要在於其胞質域。FcR回顧於Ravetch及Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92,1991；Capel等人，Immunomethods,4：25-34,1994及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.,126：330-41,1995。「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母親IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.,117：587-593(1976)；及Kim等人，European J.Immunol.,24：2429-2434(1994))。
在本發明之一些態樣中，所揭示EFNA4抗體-藥物結合物中之抗體或其抗原結合片段包括IgG1重鏈恆定區，例如如SEQ ID NO：25所述之huE22重鏈或如SEQ ID NO：51所述之huE47重鏈。在其他態樣中，所揭示EFNA4抗體-藥物結合物中之抗體或其抗原結合片段包括κ輕鏈恆定區，例如如SEQ ID NO：37所述之huE22輕鏈或如SEQ ID NO：63所述之huE47輕鏈。在本發明之特定態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物可包括IgG1重鏈恆定區及κ輕鏈恆定區，例如如SEQ ID NO：25所述之重鏈及如SEQ ID NO：37所述之輕鏈，或如SEQ ID NO：51所述 之重鏈及如SEQ ID NO：63所述之輕鏈作為另一實例。
抗體之「可變區」係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(單獨或組合)。如此項技術中所知，重鏈及輕鏈之可變區各由四個構架區(FR)組成，此等構架區經三個亦稱為高變區之互補決定區(CDR)連接。各鏈中之CDR經FR緊密固持在一起且與來自另一鏈之CDR一起促進抗體之抗原結合位點之形成。存在至少兩種用於確定CDR的技術：(1)根據交叉物種序列可變性的方法(亦即Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)根據抗原抗體複合物之結晶學研究的方法(Al-Lazikani等人，J.Molec.Biol.273：927-948(1997))。如本文所用，CDR可指藉由任一方法或藉由兩種方法之組合所定義的CDR。
可變域之CDR為根據Kabat、Chothia、Kabat與Chothia之積累、VBASE2、AbM、接點之定義、及/或此項技術中熟知之任何CDR測定方法或構形定義鑑定的可變區內的胺基酸殘基。抗體CDR可依最初由Kabat等人定義之高變區加以鑑定。參見例如Kabat等人，1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NIH,Washington D.C.。CDR之位置亦可依Chothia及其他文獻所述之結構性環結構加以鑑定。參見例如Chothia等人，Nature 342：877-883,(1989)。CDR位置亦可來源於VBASE2資料庫之分析。(參見例如Retter等人，Nucleic Acids Res.33(Database Issue)：D671-D674,2005及http：//www.vbase2.org/)。
CDR鑑定的其他方法包括「AbM定義」，其為Kabat與Chothia之間的折衷且使用Oxford Molecular之AbM抗體模型軟體(現為Accelrys®)或CDR之「接點定義」、根據所觀測之抗原接點獲得(闡述於MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262：732-745,(1996)中)。在另一方法(本文中稱為CDR之「構形定義」)中，CDR之位置可根據對抗原結合 產生焓作用的殘基加以鑑定。參見例如Makabe等人，Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166,2008。其他CDR界限定義可能不嚴格依循上述方法之一，儘管如此但仍與Kabat CDR之至少一部分重疊，雖然其根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現可縮短或延長。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法(包括方法之組合)定義的CDR。本文中所用的方法可利用根據此等方法中之任一者所定義的CDR。對於本文所述的EFNA4抗體-藥物結合物而言，CDR可根據Kabat、Chothia、延長、VBASE2、AbM、接點及/或構形定義中之任一者加以定義。
在本發明之其他態樣中，EFNA4抗體或其抗原結合片段包括抗體之一或多個CDR(諸如一、二、三、四、五或全部六個CDR)。
在本發明中，使用Kabat及Chothia方法獲得下表2中所述之CDR(SEQ ID NO：5至64)且經由分析VBASE2資料庫來獲得圖2中所述之CDR。因此，具有藉由所有此類命名法所定義之CDR的抗體明確地包括於本發明之範疇內。更廣泛而言，術語「可變區CDR胺基酸殘基」包括如使用上文所述之基於任何序列或結構之方法所鑑定的CDR中之胺基酸。
在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有huE22抗體之CDR的抗體或其抗原結合片段。舉例而言，EFNA4抗體-藥物結合物可包括含有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個重鏈可變區具有三個如SEQ ID NO：15、19及23所述之CDR。在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個輕鏈可變區具有三個如SEQ ID NO：29、33及35所述之CDR。本發明之EFNA4抗體-藥物結合物亦可包括含有以下之抗體或其抗原結合片段：(a)具有三個如SEQ ID NO：15、19及23所述之CDR的重鏈可變區；及(b)具有三個如SEQ ID NO：29、33及35所述之CDR的輕鏈可變區。
在本發明之其他態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有一或多個根據Chothia所定義或經由VBASE2資料庫之分析所得之huE22 CDR的抗體或其抗原結合片段。舉例而言，EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個重鏈可變區包括三個根據Chothia所定義之huE22 CDR(參見表2)或三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE22 CDR(參見圖2)。作為另一實例，EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個輕鏈可變區包括三個根據Chothia所定義之huE22 CDR(參見表2)或三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE22 CDR(參見圖2)。在本發明之一些態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有以下之抗體或其抗原結合片段：(a)重鏈可變區，具有三個根據Chothia所定義之huE22 CDR(參見表2)；及(b)輕鏈可變區，具有三個根據Chothia所定義之huE22 CDR(參見表2)。在本發明之一些態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有以下之抗體或其抗原結合片段，(a)重鏈可變區，包括三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE22 CDR(參見圖2)；及(b)輕鏈可變區，包括三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE22 CDR(參見圖2)。
在本發明之其他態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有huE47抗體之CDR的抗體或其抗原結合片段。舉例而言，EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個重鏈可變區包括三個如SEQ ID NO：41、45及49所述之CDR。在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區的抗 體或其抗原結合片段，其中該至少一個輕鏈可變區包括三個如SEQ ID NO：55、59及61所述之CDR。本發明之EFNA4抗體-藥物結合物亦可包括：(a)具有三個如SEQ ID NO：41、45及49所述之CDR的重鏈可變區；及(b)具有三個如SEQ ID NO：55、59及61所述之CDR的輕鏈可變區。
在本發明之其他態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有一或多個根據Chothia所定義或經由VBASE2資料庫之分析所得之huE47 CDR的抗體或其抗原結合片段。舉例而言，EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個重鏈可變區包括三個根據Chothia所定義之huE47 CDR(參見表2)或三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE47 CDR(參見圖2)。作為另一實例，EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中該至少一個輕鏈可變區包括三個根據Chothia所定義之huE47 CDR(參見表2)或三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE47 CDR(參見圖2)。在本發明之一些態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有以下之抗體或其抗原結合片段：(a)重鏈可變區，包括三個根據Chothia所定義之huE47 CDR(參見表2)；及(b)輕鏈可變區，包括三個根據Chothia所定義之huE47 CDR(參見表2)。在本發明之一些態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可包括具有以下之抗體或其抗原結合片段，(a)重鏈可變區，具有三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE47 CDR(參見圖2)；及(b)輕鏈可變區，具有三個經由VBASE2資料庫之分析所得之huE47 CDR(參見圖2)。
在本發明之一些態樣中，用於製備本發明之EFNA4抗體-藥物結合物的抗體為單株抗體。術語「單株抗體」或「mAb」係指獲自實質上均質抗體群體的抗體，亦即，除可少量存在之可能天然存在之突變 外，組成群體之個別抗體相同。單株抗體具有針對單一抗原性位點的高度特異性。此外，與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」指示自實質上均質之抗體群獲得之抗體的特徵，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，根據本發明使用的單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein,Nature 256：495-497,1975描述的融合瘤方法製備，或可藉由重組DNA方法(諸如美國專利第4,816,567號中所述)製備。單株抗體亦可自使用例如McCafferty等人，Nature 348：552-554,1990中所述之技術所產生的噬菌體文庫分離。
在本發明之一些態樣中，用於製備本發明之抗體-藥物結合物的抗體為單價抗體，亦即每個分子(例如IgG或Fab)具有一個抗原結合位點。在一些情況下，單價抗體可具有超過一個抗原結合位點，但結合位點來自不同抗原。在本發明之一些態樣中，本發明之抗體-藥物結合物中的抗體或其抗原結合片段可包括「二價抗體」，亦即每個分子(例如IgG)具有兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同的抗原特異性。或者，二價抗體可具雙特異性。「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能」抗體為具有兩個不同抗原結合位點的雜合抗體。雙特異性抗體之兩個抗原結合位點結合至可存在於相同或不同蛋白質標靶上的兩個不同抗原決定基。
術語「嵌合抗體」意指其中部分或全部可變區序列來源於一個物種且恆定區序列來源於另一物種的抗體，諸如其中可變區序列來源於小鼠抗體且恆定區序列來源於人類抗體的抗體。
如本文所用，「人類化」或「CDR移植」抗體係指非人類(例如鼠科)抗體形式，其為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab'、 F(ab')2或其他抗原結合子序列)。人類化抗體較佳為人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者之一或多個互補決定區(CDR)的殘基已經非人類物種(供者抗體)(諸如具有所要特異性、親和力及能力的小鼠、大鼠或兔)之一或多個CDR的殘基置換。
在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包括既未發現於受者抗體中、亦未發現於所輸入CDR或構架序列中、然經包括以進一步改進且最佳化抗體效能的殘基。一般而言，人類化抗體包括至少一個且典型兩個可變域中之實質上全部，其中全部或實質上全部的CDR區域對應於非人類免疫球蛋白之CDR區域且全部或實質上全部的FR區域為人類免疫球蛋白共同序列之FR區域。人類化抗體最佳亦包括免疫球蛋白恆定區或域(Fc)(典型地為人類免疫球蛋白之恆定區或域)之至少一部分。在本發明之一些態樣中，抗體具有如PCT國際公開案第WO 99/58572號中所述經修飾之Fc區。人類化抗體之其他形式具有相對於原始抗體可改變的一或多個CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，其亦稱為「來源於」原始抗體之一或多個CDR的一或多個CDR。
人類化基本上可依循Winter及同事之方法(Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332；323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988))，用經取代之嚙齒動物或突變型嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。亦參見美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,859,205號；其以全文引用的方式併入本文中。在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個可變區之構架區內的殘基經相應非人類殘基置換(參見例如美國專利第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第6,180,370號)。此外，人類化抗體可包括未發 現於受者抗體或供者抗體中的殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能(例如獲得所要親和力)。一般而言，人類化抗體包括至少一個且典型兩個可變域中之實質上全部，其中全部或實質上全部的高變區對應於非人類免疫球蛋白之高變區且全部或實質上全部的構架區為人類免疫球蛋白序列之FR構架區。人類化抗體視情況亦包括免疫球蛋白恆定區(Fc)(典型地為人類免疫球蛋白之恆定區)之至少一部分。欲知詳情，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；及Presta Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。因此，此等「人類化」抗體可包括其中實質上小於完整之人類可變域已經非人類物種之相應序列取代的抗體。實務上，人類化抗體典型地為其中一些CDR殘基及可能一些構架殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點之殘基取代的人類抗體。參見例如美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,859,205號。亦參見美國專利第6,180,370號及PCT國際公開案第WO 01/27160號，其中揭示人類化抗體及用於製備對預定抗原之親和力改良之人類化抗體的技術。
「重組人類抗體」或「完全人類抗體」係指胺基酸序列對應於人類所產生之抗體之胺基酸序列及/或已使用熟習此項技術者已知或本文所揭示之用於製備人類抗體之任一技術製備的彼等抗體。人類抗體之定義包括具有至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽的抗體。一個此實例為具有鼠科輕鏈及人類重鏈多肽的抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的各種技術製備。舉例而言，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人，Nature Biotechnology,14：309-314,(1996)；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162,(1998)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388,(1992)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597,(1991))。 人類抗體亦可如下製備：將將已以轉殖基因方式引入之人類免疫球蛋白基因座而非內源性基因座免疫接種至動物中，例如內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠。此方法描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號中。或者，人類抗體可由永生化人類B淋巴細胞製備，此等永生化人類B淋巴細胞產生針對靶抗原之抗體(此等B淋巴細胞可自個體中回收或經由cDNA之單個細胞選殖而回收，或可已活體外免疫)。參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁，(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95,(1991)；及美國專利第5,750,373號。
本發明之抗體可使用此項技術中熟知的技術製備，例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術或此等技術之組合或此項技術中易知的其他技術(參見例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50(1999)及Fellouse,F.A.，等人，J.MoI.Biol.,373(4)：924-40(2007))。其他規則可發現於Sambrook J.& Russell D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.(2002)；Harlow及Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；及Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,Wiley,John & Sons,Inc.(2003)。代表性方法亦描述於下文實例1至3中。
一般而言，產生融合瘤細胞株時，宿主動物免疫接種之途徑及時程通常係依據用於抗體刺激及產生的已確立技術及習知技術。預期任何哺乳動物個體(包括人類)或來自其的抗體產生細胞可經操縱以用 作產生哺乳動物(包括人類及融合瘤細胞株)的基礎。典型地，宿主動物腹膜內、肌內、經口、皮下、足底內及/或皮內接種適量的免疫原，包括如本文所述之免疫原。
融合瘤可使用Kohler,B.及Milstein,C.,Nature 256：495-497,1975或如Buck,D.W.，等人，In Vitro,18：377-381,1982修改之一般體細胞雜交技術、由淋巴細胞及永生化骨髓瘤細胞製備。可獲得的骨髓瘤細胞株(包括(但不限於)X63-Ag8.653及得自美國加利福尼亞聖地亞哥沙克研究所細胞分配中心(Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA)的彼等細胞株)可用於雜交。一般而言，該技術包括使用融合劑(諸如聚乙二醇)或藉由熟習此項技術者熟知的電學方式將骨髓瘤細胞與淋巴樣細胞融合。融合之後，自融合培養基中分離出細胞且在選擇性生長培養基(諸如次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)培養基)中生長以清除未雜交之親本細胞。可使用補充有血清或無血清的任一本文所述培養基培養分泌單株抗體的融合瘤。作為細胞融合技術之另一替代方式，可利用EBV永生化B細胞產生本發明之EFNA4單株抗體。需要時，將融合瘤擴增且次選殖，且藉由習知免疫分析程序(例如放射免疫分析、酶免疫分析或螢光免疫分析)分析上清液中的抗免疫原活性。可用作抗體源的融合瘤包涵產生對EFNA4具特異性之單株抗體或其一部分的親本融合瘤之所有衍生物、後代細胞。
產生此等抗體的融合瘤可使用已知程序活體外或活體內生長。單株抗體可在需要時藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如硫酸銨沈澱、凝膠電泳、透析、層析及超濾)、自培養基或體液中分離。非所要活性若存在，則可如下移除：例如使製劑流過附著於固相之由免疫原製成之吸附劑且使所要抗體自免疫原溶離或釋放。用含有標靶胺基酸序列之人類EFNA4或片段與在待免疫之物種中具有免疫原性之蛋白質(例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋 白酶抑制劑)之結合物免疫接種宿主動物可產生抗體群(例如單株抗體)，該結合物係使用雙官能或衍生化劑(例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺基丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R及R1為不同烷基)進行結合。
需要時，可對所關注之EFNA4抗體(單株或多株)定序且接著可將聚核苷酸序列選殖於載體中用於表現或繁殖。編碼所關注之抗體的序列可在宿主細胞中、在載體中維持且接著可將宿主細胞擴增且冷凍以備將來之用。在細胞培養物中產生重組單株抗體可經由此項技術中已知的方式、利用B細胞選殖抗體基因來進行。參見例如Tiller等人，J.Immunol.Methods 329：112-124,2008；美國專利第7,314,622號。
「宿主細胞」包括個別細胞或細胞培養物，其可為或已為供合併聚核苷酸插入序列之載體之接受者。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且後代由於天然、偶然或故意突變而與原始親本細胞可不必定完全相同(在形態上或在基因組DNA補體上)。宿主細胞包括活體內經本發明之聚核苷酸轉染的細胞。
術語「載體」意謂能夠遞送且較佳表現宿主細胞中之一或多種所關注之基因或序列的構築體。載體實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子型縮合劑結合的DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞，諸如生產者細胞。
術語「表現控制序列」意謂導引核酸轉錄的核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子，或增強子。表現控制序列可操作地連接至待轉錄之核酸序列。
或者，聚核苷酸序列可用於基因操縱以使抗體「人類化」或改良抗體之親和力或其他特徵。舉例而言，恆定區可經工程改造以幾乎 更類似於人類恆定區，從而當抗體用於人類之臨床試驗及治療時，避免免疫反應。可能需要在基因上操縱抗體序列，以獲得針對EFNA4之較大親和力及抑制EFNA4之較大功效。
存在四個通用步驟可用於使單株抗體達成人類化：(1)確定起始抗體輕鏈及重鏈可變域之核苷酸及預測胺基酸序列；(2)設計人類化抗體，亦即確定在人類化過程中使用的抗體構架區；(3)實際人類化方法/技術及(4)人類化抗體之轉染及表現。參見例如美國專利第4,816,567號、第5,807,715號、第5,866,692號、第6,331,415號、第5,530,101號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,585,089號及第6,180,370號。
人類化抗體可使用多種方法中之任一者製備，包括鑲飾、互補決定區(CDR)之移植、縮簡CDR之移植、特異性決定區(SDR)之移植，及弗蘭肯斯坦氏組裝(Frankenstein assembly)，如下文所述。人類化抗體亦包括CDR中已引入一或多個變化的超人類化抗體。舉例而言，可用人類殘基取代CDR中之非人類殘基。此等通用方法可與標準突變誘發及合成技術組合以產生具有任何所要序列之抗EFNA4抗體。
鑲飾係基於藉由用人類胺基酸序列對抗體之溶劑可及外部進行表面重塑來減少嚙齒動物或其他非人類抗體中之潛在免疫原性胺基酸序列的概念。因此，對於人類細胞而言，鑲飾抗體之外來性似乎比未經修飾之非人類抗體弱。參見Padlan(1991)Mol.Immunol.28：489-98。非人類抗體如下鑲飾：鑑定非人類抗體中之所暴露外部構架區殘基，該等殘基在相同位置上不同於人類抗體之構架區中之彼等殘基，及用人類抗體中典型佔據此等相同位置之胺基酸置換所鑑定之殘基。
CDR之移植係藉由供者抗體(例如非人類抗體)之CDR置換受者抗體(例如人類抗體或具有所要構架殘基之其他抗體)之一或多個CDR來進行。受者抗體可根據候選受者抗體與供者抗體之間在構架殘基上的 相似性來選擇。舉例而言，根據弗蘭肯斯坦氏方法，人類構架區經鑑定與相關非人類抗體之各構架區具有實質性序列同源性，且將非人類抗體之CDR移植於不同人類構架區之複合物上。亦適用於製備本發明抗體的一種相關方法描述於美國專利申請公開案第2003/0040606號中。
縮簡CDR之移植為一種相關方法。縮簡CDR包括特異性決定殘基及鄰近胺基酸，包括輕鏈之位置27d至34、50至55及89至96以及重鏈之位置31至35b、50至58及95至101處的彼等物((Kabat等人(1987)之編號約定)。參見(Padlan等人，(1995)FASEB J.9：133-9)。特異性決定殘基(SDR)移植之前提條件為抗體結合位點之結合特異性及親和力由各互補決定區(CDR)內之最高度可變殘基決定。根據CDR內各位置上存在之胺基酸殘基之結構相異性，可利用抗體-抗原複合物之三維結構分析與可利用胺基酸序列資料之分析組合來建立序列可變性之模型。SDR經鑑定為由接觸殘基組成的最低免疫原性多肽序列。參見Padlan等人，(1995)FASEB J.9：133-139。
一般而言，選擇人類受體構架之基本在於，其實質上類似於供者抗體之構架區，或其最類似於可變區亞家族之共同序列。移植之後，可對供者及/或受者序列進行其他變化以使抗體結合、官能基、密碼子使用、表現量等最佳化，包括將非人類殘基引入構架區中。參見例如PCT國際公開案第WO 91/09967號。
將CDR移植至重鏈可變構架區上時，有用的構架序列可來源於DP-21(VH7)、DP-54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP-48(VH3-13)、DP-75、DP-8(VH1-2)、DP-25、VI-2b及VI-3(VH1-03)、DP-15及V1-8(VH1-08)、DP-14及V1-18(VH1-18)、DP-5及V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-10、DA-6及YAC-7(VH1-69)、DP-88(VH1-e)、DP-3及DA-8 (VH1-f)。將CDR移植至輕鏈可變構架區上時，有用的構架序列可來源於DPK24亞群IV生殖系純系、Will亞群(DPK23、DPK22、DPK20、DPK21)，或VκI亞群生殖系純系(DPK9、DPK1、O2、DPK7)。
抗原結合片段或抗體片段可藉由抗體之蛋白水解或其他降解方式、藉由如上文所述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成來產生。抗體之多肽(尤其至多約50個胺基酸之較短多肽)宜藉由化學合成製備。化學合成方法在此項技術中已知且可市購。舉例而言，抗體或抗體片段可藉由自動化多肽合成儀、使用固相方法產生。亦參見美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第6,331,415號。
在本發明之其他態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物包括具有以下之抗體或其抗原結合片段：huE5、huE15、huE22或huE47重鏈及/或輕鏈可變區，或實質上類似於huE5、huE15、huE22或huE47重鏈或輕鏈可變區的可變區。
如針對多肽所應用，術語「實質上一致」或「實質上相似」意謂兩個胺基酸序列當最佳比對時(諸如根據程式GAP或BESTFIT，使用隨程式所提供之預設空隙權數)共有至少70%、75%或80%序列一致、較佳至少90%或95%序列一致且更佳至少97%、98%或99%序列一致。在一些實質上相似的胺基酸序列中，不一致的殘基位置不同之處在於保守性胺基酸取代。
實質上相似多肽亦包括經保守性取代之變異體，其中一或多個殘基已經功能上相似殘基保守性取代。保守性取代之實例包括用一個非極性(疏水性)殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一殘基；用一個極性(親水性)殘基取代另一殘基，諸如精胺酸與離胺酸之間、麩醯胺酸與天冬醯胺酸之間、甘胺酸與絲胺酸之間；用一個鹼性殘基(諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸)取代另一殘基；或用一個酸性殘基(諸如天冬胺酸或麩胺酸)取代另一殘基。
兩種蛋白質實質上相同的另一指標為，其共有整體三維結構，或為生物學功能等效物。
在本發明之一些態樣中，結合至EFNA4之抗體-藥物結合物包括包括具有以下之抗體或其抗原結合片段：如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：39中之任一者所述之重鏈可變區及/或如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：53中之任一者所述之輕鏈可變區。舉例而言，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可包括：具有胺基酸序列與SEQ ID NO：13至少90%一致之重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：27至少90%一致之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段；或具有如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段。作為另一實例，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可包括：具有胺基酸序列與SEQ ID NO：39至少90%一致之重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：53至少90%一致之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段；或具有如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及胺基酸序列如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段。
為了表現本發明之EFNA4抗體，編碼VH及VL區域之DNA片段首先可使用任一種上述方法獲得。如此項技術中所知，「聚核苷酸」、「核酸/核苷酸」及「寡核苷酸」在本文中可互換使用，且包括具有任何長度之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合物形式、其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中的任何受質。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可執行已知或未知的任何功能。以下為聚核苷酸之非限制實例：基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核糖酶、DNA、cDNA、基因組DNA、重組性聚核苷酸、分支鏈聚核苷酸、質體、載體、任何序列之 分離DNA、任何序列之分離RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可為天然存在、合成、重組之聚核苷酸或其任何組合。聚核苷酸可包括經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在鏈組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後進一步修飾，諸如與標記組分結合。其他修飾類型包括例如「帽」(一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代)；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之彼等修飾；含有側接部分之彼等修飾，諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)；具有插入劑(例如吖啶、補骨脂素等)之彼等修飾；含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之彼等修飾；含有烷基化劑之彼等修飾；具有經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等)的彼等修飾，以及聚核苷酸之未經修飾形式。此外，通常存在於糖中之任一羥基可置換為例如膦酸酯基、磷酸酯基，藉由標準保護基保護，或經活化而以製備與其他核苷酸之其他鍵聯，或可與固體載體結合。5'及3'末端OH可經磷酸化或經胺或1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生化為標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中通常已知之核糖或去氧核醣之類似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵聯可經替代連接基團置換。此等替代連接基團包括(但不限於)其中磷酸酯置換為P(O)S(「硫醇酯」)、P(S)S(「二硫醇酯」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)，其中各R或R'獨立地為H或經取代或未經取代之烷基(1-20個C)，其視情況含有醚(-O-)鍵 聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基。聚核苷酸中並非所有鍵聯均需為相同的。前述說明適用於本文中提及的所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
編碼抗EFNA4抗體重鏈及輕鏈可變區的代表性DNA如SEQ ID NO：6(huE5 VH DNA)、SEQ ID NO：8(huE5 VL DNA)、SEQ ID NO：10(huE15 VH DNA)、SEQ ID NO：12(huE15 VL DNA)、SEQ ID NO：14(huE22 VH DNA)、SEQ ID NO：28(huE22 VL DNA)、SEQ ID NO：40(huE47 VH DNA)及SEQ ID NO：54(huE47 VL DNA)所述。編碼抗EFNA抗體重鏈及輕鏈之代表性DNA如SEQ ID NO：26(huE22 HC)、SEQ ID NO：28(huE22 LC)、SEQ ID NO：52(huE47 HC)及SEQ ID NO：64(huE47 LC)所述。參見下文中表2。huE5及huE15抗體之CDR在表2中藉由下劃線指示。huE22及huE47抗體之CDR在表2(根據Kabat或Chothia定義)中或在圖2(經由VBASE2資料庫之分析獲得)中以各別序列及序列標識符描述。
亦可使用熟習此項技術者已知的標準方法將各種修飾(例如突變、取代、缺失及/或添加)引入huE5、huE15、huE22及huE47 DNA序列中。舉例而言，突變誘發可使用標準方法進行，諸如PCR介導之突變誘發(其中將突變核苷酸併入PCR引子中，使得PCR產物含有所要突變)或定點誘突變誘發。
因此，根據本申請案之揭示內容，熟悉此項技術者容易識別DNA實質上相似之huE5、huE15、huE22及huE47 DNA之序列。術語「實質上相似」或「實質上序列相似」當關於核酸或其片段時，意謂當與另一核酸(或其互補股)就適當核苷酸插入或缺失進行最佳比對時，至少約85%、較佳至少約90%且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%核苷酸鹼基存在核苷酸序列一致性，如藉由序列一致性之任何熟知算法(諸如FASTA、BLAST或Gap)所量測。
術語「序列一致百分比」在核酸序列之上下文中意謂兩個序列當根據最大一致性比對時相同的殘基。序列一致性比較長度可為至少約九個核苷酸、通常至少約18個核苷酸、更通常至少約24個核苷酸、典型至少約28個核苷酸、更典型至少約32個核苷酸且較佳至少約36、48或48個以上核苷酸之延伸段。此項技術中已知許多可用於量測核苷酸序列一致性的不同算法。舉例而言，聚核苷酸序列可使用FASTA、Gap或Bestfit加以比較，FASTA、Gap或Bestfit為Wisconsin套裝軟體10.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin。FASTA(包括例如程式FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與搜尋序列之間最佳重疊區域之比對及序列一致性百分比(Pearson,Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson,Methods MoI.Biol.132：185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson,J.MoI.Biol.276：71-84(1998)，該等文獻以全文引用的方式併入本文中)。除非另外說明，否則使用特定程式或算法之預設參數。舉例而言，核酸序列之間的序列一致百分比可使用FASTA及其預設參數(字長為6及計分矩陣使用NOPAM因數)或使用Gap及其預設參數(如GCG 6.1版中所提供)測定，GCG 6.1版以全文引用的方式併入本文中。
兩個核酸序列實質上一致之另一指標為，核酸所編碼之蛋白質實質上相同，共有整體三維結構，或為生物學功能等效物。此等術語進一步定義於下文中。若相應蛋白質實質上相同，則在嚴格條件下彼此不雜交之核酸分子仍實質上相同。舉例而言，當兩個核苷酸序列包含如藉由遺傳密碼所允許之保守取代變異體時，此可能發生。
保守取代變異體為具有簡併密碼子取代之核酸序列，其中一或多個所選(或所有)密碼子經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代。參見Batzer等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：5081；Ohtsuka等人，(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；及Rossolini等人，(1994)Mol.Cell Probes 8：91-98。
舉例而言，可進行的一種取代類型為改變抗體中之一或多個半胱胺酸，其與另一殘基(諸如(不限於)丙胺酸或絲胺酸)可具化學反應性。舉例而言，可存在非典型半胱胺酸之取代。抗體之可變域之CDR或構架區中或恆定區中可進行取代。作為另一實例，半胱胺酸可具典型性。
抗體亦可經修飾，例如重鏈及/或輕鏈之可變域中經修飾，例如以改變抗體之結合特性。舉例而言，可在一或多個CDR區域中產生突變以提高或降低抗體針對EFNA4之KD、提高或降低koff，或改變抗體之結合特異性。定點誘變技術在此項技術中已熟知。參見例如Sambrook等人及Ausubel等人，同上。
修飾或突變亦可在構架區或恆定區中產生以延長EFNA4抗體之半衰期。參見例如PCT國際公開案第WO 00/09560號。亦可在構架區或恆定區中產生突變以改變抗體之免疫原性、提供共價或非共價結合至另一分子的位點，或改變諸如補體固定、FcR結合及抗體依賴性細胞介導細胞毒性之特性。根據本發明，單一抗體可在可變域之任一或多個CDR或構架區中或在恆定區中具有突變。
在已知為「生殖系」之方法中，VH及VL序列中之某些胺基酸可經突變以與天然存在於生殖系VH及VL序列中之彼等胺基酸匹配。特定而言，VH及VL序列中之構架區之胺基酸序列可經突變以匹配生殖系序列，從而在投與抗體時降低免疫原性之風險。如本文所用，術語「生殖系」係指抗體基因及基因區段之經由生殖細胞自親本繼代至後代之核苷酸序列及胺基酸序列。此生殖系序列不同於編碼成熟B細胞中之抗體的核苷酸序列，該等核苷酸序列在B細胞成熟過程中已藉由再組合及超突變事件改變。「利用」特定生殖系的抗體具有與該生殖系核苷酸序列或與其所指定之胺基酸序列比對最接近的核苷酸或胺基 酸序列。相較於生殖系序列，此等抗體突變頻繁。人類VH及VL基因之生殖系DNA序列在此項技術中已知(參見例如「Vbase」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat,E.A.，等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公告號91-3242；Tomlinson等人，J.Mol.Biol.227：776-798,1992；及Cox等人，Eur.J.Immunol.24：827-836,1994。
可產生之另一類型的胺基酸取代為移除抗體中之潛在蛋白水解位點。此等位點可存在於抗體之可變域之CDR或構架區中或恆定區中。半胱胺酸殘基之取代及蛋白水解位點之移除可降低抗體產物之異質性之風險且從而提高其均質性。另一類型之胺基酸取代為清除天冬醯胺酸-甘胺酸對，其藉由改變一或兩個殘基來形成潛在脫醯胺位點。在另一實例中，本發明之EFNA4抗體之重鏈之C末端離胺酸可裂解。在本發明之各種態樣中，EFNA4抗體之重鏈及輕鏈可視情況包括信號序列。
編碼本發明之VH及VL區段之DNA片段一經獲得，則藉由標準重組DNA技術進一步操縱此等DNA片段，例如將可變區基因轉變為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一種蛋白質之另一DNA片段，諸如抗體恆定區或柔性連接子。如本上下文中所用，術語「可操作地連接」欲意謂兩個DNA片段經連接以使得兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列保持同框。
編碼VH區域之經分離DNA可藉由使編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子來轉變為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.，等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及人類服務部，NIH公告號91-3242)且包涵此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增而獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知存在於不同個體中之各種對偶基因或異型中的任一者，諸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。此等異型代表IgG1恆定區中之天然存在之胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因而言，可將編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。CH1重鏈恆定區可來源於任一重鏈基因。
編碼VL區之經分離DNA可藉由使編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子而轉變為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見例如Kabat,E.A.，等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公告號91-3242)且包涵此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增而獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區可為已知存在於不同個體中之多種對偶基因中的任一者，諸如Inv(1)、Inv(2)及Inv(3)。λ恆定區可來源於三種λ基因中之任一者。
為了產生scFv基因，使編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼柔性連接子之另一片段，使得VH及VL序列可以連續單鏈蛋白質形式表現，其中VL區與VH區藉由柔性連接子連接(參見例如Bird等人，1988,Science 242：423-426；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348：552-554)。若僅使用單一VH及VL，則單鏈抗體可為單價的；若使用兩個VH及VL，則為二價的；若使用超過兩個VH及VL，則為多價的。可產生特異性結合至EFNA4及另一分子的雙特異性或多價抗體。
在本發明之另一態樣中，可製備融合抗體或免疫黏附素，其包括連接至另一多肽之本發明EFNA4抗體之全部或一部分。在另一態樣中，EFNA4抗體中僅可變域連接至多肽。在另一態樣中，EFNA4抗體之VH域連接至第一多肽，而EFNA4抗體之VL域連接至第二多肽，該第二多肽與第一多肽以使得VH與VL域可彼此間相互作用而形成抗原結合位點的方式結合。在另一態樣中，VH域與VL域經連接子分隔，使得VH與VL域可彼此間相互作用。接著使VH-連接子-VL抗體連接至所關注之多肽。另外，可產生其中兩種(或多種)單鏈抗體彼此間連接的融合抗體。若想要在單一多肽鏈上產生二價或多價抗體，或若想要產生雙特異性抗體，則此為有用的。
可使用編碼EFNA4抗體之核酸分子製備其他經修飾之抗體。舉例而言，「κ抗體」(Ill等人，Protein Eng.10：949-57,1997)、「微型抗體」(Martin等人，EMBO J.,13：5303-9,1994)、「雙功能抗體」(Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448,1993)或「傑紐辛抗體(Janusins)」(Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659,1991及Traunecker等人，Int.J.Cancer(增刊)7：51-52,1992)可使用標準分子生物技術、依循說明書之教示內容來製備。
雙特異性抗體或抗原結合片段可藉由多種方法製備，包括融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321,1990；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553,1992。另外，雙特異性抗體可以「雙功能抗體」或「傑紐辛抗體」形式形成。在本發明之一些態樣中，雙特異性抗體結合至EFNA4之兩個不同抗原決定基。在其他態樣中，上述經修飾之抗體係使用本文所提供之EFNA4抗體中的一或多個可變域或CDR區製備。
用於製備抗體-藥物結合物時，本文所述的EFNA4抗體可為實質 上純的，亦即至少50%純(亦即不含污染物)，更佳至少90%純，更佳至少95%純，然更佳至少98%純，且最佳至少99%純。
表2提供本發明之人類化抗EFNA4抗體之胺基酸(蛋白質)序列及相關核酸(DNA)序列。如根據Kabat所定義之huE5 VH、huE5 VL、huE15 VH及huE15 VL之CDR加有下劃線。如根據Kabat及Chothia所定義之huE22 VH、huE22 VL、huE47 VH及huE47 VL之CDR係以各別序列描述。
II.B. 連接子
本發明之抗EFNA4抗體-藥物結合物可使用使藥物與抗EFNA4抗體連接或結合的連接子製備。在本發明之特定態樣中，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物中之連接子包括(但不限於)4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)。
連接分子可為穩定的(不可裂解)或可水解的(可裂解)，藉此在進入細胞之後將其釋放。藥物藉以與抗體裂解的主要機制包括在溶酶體(腙、縮醛及順式烏頭酸酯樣醯胺)之酸性pH下水解、藉由溶酶體酶(組織蛋白酶及其他溶酶體酶)裂解肽、及二硫化物還原。由於此等裂解機制不同，因此藥物與抗體連接之機制亦廣泛不同且可使用任何適合的連接子。
適合結合程序之實例依賴於醯肼及其他親核劑與天然存在於抗體上之碳水化合物氧化所產生之醛的結合。含腙結合物可經製備而引入提供所要藥物釋放特性的羰基。結合物亦可利用在一端具有二硫化物、在中部具有烷基鏈且在另一端具有肼衍生物的連接子製備。蒽環黴素(anthracycline)為可使用此技術與抗體結合之細胞毒素之一實 例。
含有除腙之外之官能基的連接子具有在溶酶體之酸性環境中裂解的潛力。舉例而言，結合物可利用含有細胞內可裂解之除腙之外之位點的硫醇反應性連接子(諸如酯、醯胺及縮醛/縮酮)製備。喜樹鹼為可使用此等連接子結合的一種細胞毒性劑。亦可使用縮酮，其由5員至7員環酮組成且其中一個氧連接至細胞毒性劑且另一連接至連接子用於抗體連接。蒽環黴素亦為供此等連接子使用之適合細胞毒素之一實例。
一類pH敏感性連接子之另一實例為順式烏頭酸酯，其具有與醯胺鍵連接之羧酸。羧酸加速酸性溶酶體中之醯胺水解。亦可使用經由若干其他類型結構達成相似類型之水解加速速率的連接子。類美登素(maytansinoids)為可經由在C-9連接之連接子結合的細胞毒素之一實例。
用於藥物結合物的另一種潛在釋放方法為藉由溶酶體酶使肽發生酶促水解。在一個實例中，肽經由醯胺鍵與對胺基苯甲醇連接，接著在苯甲醇與細胞毒性劑之間產生胺基甲酸酯或碳酸酯。肽裂解導致胺基甲酸胺基苯甲酯或碳酸胺基苯甲酯發生潰陷或自毀滅。經此策略例示的細胞毒性劑包括蒽環黴素、紫杉烷、絲裂黴素C及奧利斯坦叮(auristatins)。在一個實例中，苯酚亦可藉由連接子而非胺基甲酸酯之潰陷來釋放。在另一變化形式中，利用二硫化物還原來起始胺基甲酸對巰基苯甲酯或碳酸對巰基苯甲酯之潰陷。
與抗體結合之許多細胞毒性劑在水中之溶解性即使有，亦很小，且由於結合物之聚集而會限制結合物之藥物負載。一種克服此問題的方法為將增溶基團添加至連接子中。可使用經由由PEG及二肽組成之連接子所製備的結合物，連接子包括利用PEG二酸、硫醇酸或順丁烯二醯亞胺酸連接至抗體的彼等物、二肽間隔子，及連接至蒽環黴 素或多卡米辛(duocarmycin)類似物之胺的醯胺鍵。另一實例為使用含有PEG之連接子所製備的結合物，該連接子之二硫化物鍵結至細胞毒性劑且醯胺鍵結至抗體。合併PEG基團的方法可有益於克服聚集及藥物負載之限制。
在本發明之一些態樣中，用於製備本發明之抗體-藥物結合物的連接子包括具有下式之連接子：(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)=Q-Sp)
其中Alk1及Alk2獨立地為一鍵或分支鏈或無支鏈(C1-C10)伸烷基鏈；Sp1為一鍵、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR'-、-N(CH2CH2)2N-或-X-Ar'-Y-(CH2)n-Z，其中X，Y及Z為獨立地一鍵、-NR'-、-S-或-O-，限制條件為若n=0，則Y及Z中至少一者必須為一鍵且Ar'為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，其視情況經一個、兩個或三個以下基團取代：(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR'，限制條件為若Alk'為一鍵，則Sp1為一鍵；n為整數0至5；R'為分支鏈或無支鏈(C1-C5)鏈，其視情況經一或兩個以下基團取代：-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、(C1-C3)二烷基胺基或(C1-C3)三烷基銨-A-，其中A-為醫藥學上可接受之成鹽陰離子；Ar為1,2-伸苯基、1,3-伸苯基或1,4-伸苯基，視情況經一個、兩個或三個以下基團取代：(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR'，其中n及R'如上文中定義或1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或 2,7-亞萘基或
其中各亞萘基或啡噻嗪視情況經一個、兩個、三個或四個以下基團取代：(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'或-S(CH2)nCONHR'，其中n及R'如上文定義，限制條件為若Ar為啡噻嗪，則Sp1為僅連接至氮之一鍵；Sp2為一鍵、-S-或-O-，限制條件為若Alk2為一鍵，則Sp2為一鍵，Z1為H、(C1-C5)烷基或視情況經一個、兩個或三個以下基團取代之苯基：(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-ONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR'，其中n及R'如上文定義；Sp為直鏈或分支鏈二價或三價(C1-C18)基團、二價或三價芳基或雜芳基、二價或三價(C3-C18)環烷基或雜環烷基、二價或三價芳基-或雜芳基-芳基(C1-C18)基團、二價或三價環烷基-或雜環烷基-烷基(C1-C18)基團、或二價或三價(C2-C18)不飽和烷基，其中雜芳基較佳為呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基咔唑基、胺基香豆素基或啡嗪基，且其中若Sp為三價基，則Sp可另外經低碳(C1-C5)二烷基胺基、低碳(C1-C5)烷氧基、羥基或低碳(C1-C5)烷硫基取代；及Q為=NHNCO-、=NHNCS-、=NHNCONH-、=NHNCSNH-或=NHO-。
較佳地，Alk1為分支鏈或無支鏈(C1-C10)伸烷基鏈；Sp'為一鍵、- S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR'，其中R'如上文中定義，限制條件為若Alk'為一鍵，則Sp1為一鍵；Ar為1,2-、1,3-或1,4-伸苯基，視情況經一個、兩個或三個以下基團取代：(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR'，其中n及R'如上文中所定義，或Ar為1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亞萘基，各視情況經一個、兩個、三個或四個以下基團取代：(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR'。
Z1為(C1-C5)烷基，或視情況經一個、兩個或三個以下基團取代之苯基：(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、鹵素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR'；Alk2與Sp2合起來為一鍵；且Sp及Q如上文剛剛定義。
以全文引用的方式併入本文中的美國專利第5,773,001號揭示由卡奇黴素製備之可結合親核性藥物(尤其醯肼及相關親核劑)使用的連接子。此等連接子特別適用於當藥物與連接子之間形成的鍵聯可水解時獲得較佳活性的彼等情況。此等連接子含有兩個官能基，包括(1)用於與抗體反應的基團(例如羧酸)，及(2)用於與藥物反應的羰基(例如醛或酮)。羰基可與藥物上之醯肼基團反應而形成腙鍵聯。此鍵聯可裂解、可水解，從而在結合至靶細胞之後，允許治療劑自結合物中釋放。在本發明之一些態樣中，所用可水解連接子為4-(4-乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)。在本發明之其他態樣中，抗體-藥物結合物可使用(3-乙醯基苯基)乙酸(AcPAc)或4-巰基-4-甲基-戊酸(醯胺)作為連接分 子來製備。
可使用N-羥基丁二醯亞胺(OSu)酯或其他類似活化酯產生活化的可水解連接子-藥物部分。其他適合活化酯之實例包括NHS(N-羥基丁二醯亞胺)、磺基-NHS(磺化NHS)、PFP(五氟苯基)、TFP(四氟苯基)及DNP(二硝基苯基)。
在本發明之一些態樣中，抗體-藥物結合物係由卡奇黴素或其衍生物、AcBut連接子及本發明之抗EFNA4抗體反應而製備。參見例如美國專利第5,773,001號。AcBut連接子產生在循環中實質上穩定的結合物，在37℃、在活體外人類血漿中分析時，每天釋放的卡奇黴素估計為2%。結合物在酸性溶酶體中釋放卡奇黴素。
在本發明之一些態樣中，AcBut-CM部分可使用此項技術中所述的方法及製程產生，諸如PCT國際公開案第WO 08/147765號及美國專利第8,273,862號，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
在本發明之一些態樣中，AcBut-CM部分可使用如美國臨時申請案第61/899,682號中所述之經改良之合成方法產生，該申請案以全文引用的方式併入本文中。用於合成連接子中間物(化合物10)的方法描述如下：
在流程1中，使化合物1與化合物2在2-甲基四氫呋喃(2-MeTHF)及氟化四丁基銨(Bu4NF)中反應。
添加二水合氯化鈣於水中之溶液，且攪拌之後移除下層水相。 向上層有機相中添加甲醇及3當量NaOH水溶液。攪拌反應混合物，直至觀測到中間物酯3完全消耗。將反應物冷卻至15℃且添加2-甲基四氫呋喃，隨後添加水。緩慢添加濃HCl，使反應物維持15至30℃之範圍。自有機層產生酸4。
在流程2中，將化合物4隨適合有機溶劑(諸如四氫呋喃(THF))及唑活化劑(諸如羰基二咪唑(CDI))一起饋入，形成中間物5。可使用其他唑活化劑，例如硫羰基二咪唑；羰基雙吡唑，其中各吡唑視情況經一個至三個(C1-C6)烷基取代；羰基雙-1,2,3-三唑；羰基雙苯并三唑；及羰基雙-1,2,4-三唑，藉此形成類似於化合物5、但包含除咪唑基之外之不同唑部分的中間物化合物。使中間物5與肼、較佳含水肼源(諸如單水合肼)反應，產生中間物6。中間物6描述於PCT國際公開案第WO 08/147765號中，該案以全文引用的方式併入本文中。
在流程3中，使中間物6與中間物7在惰性(非反應性)溶劑(諸如甲醇(MeOH))中、視情況在酸性催化劑(諸如乙酸(HOAc))存在下反應，產生中間物8。
流程4
在流程4中，藉由使用強酸、視情況在受熱下使中間物8脫除保護基，諸如在受熱下使用三氟乙酸(TFA)脫除保護基，形成中間物9。可使用其他強酸(例如硫酸)替代三氟乙酸。
在流程5中，使中間物9轉化為連接子中間物10。中間物9可如此項技術中所述(諸如美國專利8,273,862，該專利以全文引用的方式併入本文中)轉化為連接子中間物10。然而，如流程5中所描繪，較佳使中間物9與三級胺鹼(諸如三乙胺(TEA))反應及與三甲基乙醯氯(PivCl)在惰性溶劑(諸如四氫呋喃)存在下反應。隨後引入N-羥基丁二醯亞胺(OSu)，得到連接子中間物10。
由於本文所述的方法避免使用二氯甲烷及為此所採取的安全措施且提供連接子中間物10之較佳產量，因此用於合成本文所述之連接子中間物10的方法相較於PCT國際公開案第WO 08/147765號及美國專利第8,273,862號中所述的彼等方法提供改良。
合成連接子中間物10之後，可如先前技術(例如美國專利第8,273,862號)中所述，使連接子中間物10與卡奇黴素分子結合。然而，連接子中間物10較佳與卡奇黴素在碳化二亞胺存在下合併，從而 提高所得卡奇黴素衍生物之產量。可使用之碳化二亞胺之實例包括(但不限於)1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)；N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)；N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC)；N-環己基-N'-(2-嗎啉基乙基)碳化二亞胺；N-環己基-N'-[2-(4-甲基嗎啉-4-鎓-4-基)乙基]碳化二亞胺甲苯磺酸鹽；N-環己基-N'-[4-(二乙基甲基銨基)環己基]碳化二亞胺甲苯磺酸鹽；N,N'-雙(2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊烷-4-基)甲基]碳化二亞胺；及N-苯甲基-N'-異丙基碳化二亞胺。
連接子中間物10與卡奇黴素結合所產生的卡奇黴素衍生物可經純化且分離，隨後與單株抗體(例如抗EFNA4抗體)反應。純化及分離可如先前美國專利第8,273,862號中所述進行。或者，純化可藉由使用逆相高效液相層析純化方案進行。用於純化10之逆相高效液相層析純化方案可包含用包含水性及有機混合物之相溶離，該相的pH範圍為約4至約6。舉例而言，由55% 20mM乙酸鈉(pH 5)及45%乙腈組成的移動相為水性/有機移動相，其可用於逆相高效液相層析純化。利用逆相高效液相層析純化方案進行純化，隨後可使用固相萃取方案。
在本發明之其他態樣中，連接子可為二肽連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、苯丙胺酸-離胺酸(phe-lys)連接子，或順丁烯二醯亞胺基己酸-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苯甲氧基羰基(vc)連接子。在另一態樣中，連接子為磺基丁二醯亞胺基-4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸酯(smcc)。磺基-smcc結合係經由順丁烯二醯亞胺基團與氫硫基(硫醇，-SH)反應而發生，而其磺基-NHS酯對於一級胺具有反應性(如離胺酸及蛋白質或肽N末端中所發現)。此外，連接子可為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。
適用於結合放射性同位素的代表性連接子包括二伸乙基三胺五乙酸酯(DTPA)-異硫氰酸酯、丁二醯亞胺基6-肼菸酸酯鹽酸鹽(SHNH)，及六甲基伸丙基胺肟(HMPAO)(Bakker等人，(1990)J.Nucl. Med.31：1501-1509；Chattopadhyay等人，(2001)Nucl.Med.Biol.28：741-744；Dewanjee等人，(1994)J.Nucl.Med.35：1054-63；Krenning等人，(1989)Lancet 1：242-244；Sagiuchi等人，(2001)Ann.Nucl.Med.15：267-270)；美國專利第6,024,938號)。或者，靶分子可經衍生化以使得放射性同位素可直接與其結合(Yoo等人，(1997)J.Nucl.Med.38：294-300)。碘化方法在此項技術中亦已知，且代表性方案可見於例如Krenning等人，(1989)Lancet 1：242-244及Bakker等人，(1990)J.Nucl.Med.31：1501-1509。
II.C. 藥物
適用於製備所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物之藥物為具有生物活性或可偵測活性的任何物質，例如治療劑、可偵測標記、結合劑等，及活體內代謝為活性劑的前藥。藥物亦可為藥物衍生物，其中藥物已經官能化以允許與本發明抗體結合。根據所揭示方法，藥物用於製備式Ab-(L-D)之抗體-藥物結合物，其中(a)Ab為結合至EFNA4的抗體，或其抗原結合片段；及(b)L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物。表示每個抗體所結合之藥物(D)分子數目的藥物與抗體比率(DAR)或藥物負載率可為DAR 1至12。因此，在本發明之態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物可具有DAR 1、DAR 2、DAR 3、DAR 4、DAR 5、DAR 6、DAR 7、DAR 8、DAR 9、DAR 10、DAR 11或DAR 12。因此，在本發明之態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物可包括1個藥物分子，或2個藥物分子，或3個藥物分子，或4個藥物分子，或5個藥物分子，或6個藥物分子，或7個藥物分子，或8個藥物分子，或9個藥物分子，或10個藥物分子，或11個藥物分子，或12個藥物分子。DAR可藉由多種習知方式測定，諸如UV光譜法、質譜法、ELISA分析、放射性測量法、疏水性相互作用層析法(HIC)、電泳及HPLC。
式Ab-(L-D)之抗體-藥物結合物(ADC)之組合物、批料及/或調配物可包括複數種抗體與不同數目個藥物分子(DAR 1至12)之結合物。
在本發明之特定態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由約1至約12範圍內之平均DAR表徵，例如約2至約4範圍內之平均DAR，或約3至約5範圍內之平均DAR，或約4至約6範圍內之平均DAR，或約5至約7範圍內之平均DAR，或約6至約8範圍內之平均DAR，或約7至約9範圍內之平均DAR，或約8至約10範圍內之平均DAR，或約9至約11範圍內之平均DAR。在一些態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可具有約1之平均DAR，或約2之平均DAR，約3之平均DAR，或約4之平均DAR，或約5之平均DAR，或約6之平均DAR，或約7之平均DAR，或約8之平均DAR，或約9之平均DAR，或約10之平均DAR，或約11之平均DAR。如平均DAR之上述範圍內所用，術語「約」意謂+/- 0.5%。
此外，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由平均DAR之較佳範圍表徵，例如約3至約5範圍內之平均DAR、約3至約4範圍內之平均DAR，或約4至約5範圍內之平均DAR。此外，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由平均DAR之較佳範圍表徵，例如約3至約5範圍內之平均DAR、約3至約4範圍內之平均DAR，或約4至約5範圍內之平均DAR。
在本發明之一些態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：約3.0之平均DAR，或3.0之平均DAR，或3.1之平均DAR，或3.2之平均DAR，或3.3之平均DAR，或3.4之平均DAR，或3.5之平均DAR，或3.6之平均DAR，或3.7之平均DAR，或3.8之平均DAR，或3.9之平均DAR。在本發明之另一態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：約4.0之平均DAR，或4.0之平均DAR，或4.1之平均DAR，或4.2之平均DAR，或 4.3之平均DAR，或4.4之平均DAR，或4.5之平均DAR，或4.6之平均DAR，或4.7之平均DAR，或4.8之平均DAR，或4.9之平均DAR，或5.0之平均DAR。
在本發明之另一態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：12或小於12之平均DAR，11或小於11之平均DAR，10或小於10之平均DAR，9或小於9之平均DAR，8或小於8之平均DAR，7或小於7之平均DAR，6或小於6之平均DAR，5或小於5之平均DAR，4或小於4之平均DAR，3或小於3之平均DAR，2或小於2之平均DAR，或1或小於1之平均DAR。
在本發明之其他態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：11.5或小於11.5之平均DAR，10.5或小於10.5之平均DAR，9.5或小於9.5之平均DAR，8.5或小於8.5之平均DAR，7.5或小於7.5之平均DAR，6.5或小於6.5之平均DAR，5.5或小於5.5之平均DAR，4.5或小於4.5之平均DAR，3.5或小於3.5之平均DAR，2.5或小於2.5之平均DAR，1.5或小於1.5之平均DAR。
式Ab-(L-D)之ADC之組合物、批料及/或調配物可藉由DAR分佈表徵。DAR分佈提供可存在於ADC之組合物、批料及/或調配物中之不同ADC種類之百分比或分率(例如DAR 1至12)。ADC之組合物、批料及/或調配物中之DAR分佈可藉由此項技術中已知的方法(諸如毛細管等電聚焦(cIEF))測定。
在本發明之一個態樣中，式Ab-(L-D)之ADC之組合物、批料及/或調配物中之DAR分佈可具有ADC之高度非均勻混合物之特徵，其具有寬DAR分佈，通常含有寬範圍的ADC種類、具有DAR 1至12。
在本發明之另一態樣中，ADC之組合物、批料及/或調配物中之DAR分佈可具有高度均勻混合物之特徵，其具有窄DAR分佈，通常含有窄範圍之ADC種類，具有特定DAR，諸如DAR 3至5。
在本發明之特定態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物之特徵可為具有至少50%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少55%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少60%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少65%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少70%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少75%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少80%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少85%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少90%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或至少95%之DAR 3至5抗體-藥物結合物。
在本發明之另一態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物之特徵可為具有50%至60%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或60%至70%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或70%至80%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或80%至90%之DAR 3至5抗體-藥物結合物，或90%至100%之DAR 3至5抗體-藥物結合物。在本發明之另一態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物之特徵可為具有約50%或約55%或約60%或約65%或約70%或約75%或約80%或約85%或約90%或約95%或約100%之DAR 3至5抗體-藥物結合物。
舉例而言，治療劑為對癌細胞或活化免疫細胞發揮細胞毒性、細胞抑制性及/或免疫調節性作用的藥劑。治療劑之實例包括細胞毒性劑、化學治療劑、細胞抑制劑及免疫調節劑。化學治療劑為適用於治療癌症之化合物。
治療劑為可用於治療或預防有需要之個體之病症的組合物。適用於本發明之治療劑包括抗癌劑，亦即對表現EFNA4之細胞具有抗癌活性的藥劑，諸如來自以下之癌細胞：乳癌，諸如三重陰性乳癌(TNBC)；卵巢癌；結腸直腸癌；白血病，諸如慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；肝癌，諸如肝細胞癌(HCC)；及肺癌，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC)。
代表性治療劑包括細胞毒素、細胞毒性劑及細胞抑制劑。細胞毒性作用係指耗乏、清除及/或殺死靶細胞。細胞毒性劑係指對細胞具有細胞毒性及/或細胞抑制作用的藥劑。細胞抑制作用係指抑制細胞增殖。細胞抑制劑係指對細胞具有細胞抑制作用、從而抑制細胞之特定亞群之生長及/或擴增的藥劑。
其他代表性治療劑包括放射性同位素、化學治療劑、免疫調節劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促細胞凋亡劑及細胞溶解酶(例如核糖核酸酶)。藥劑亦可包括治療性核酸，諸如編碼免疫調節劑、抗血管生成劑、抗增殖劑或促細胞凋亡劑之基因。此等藥物描述語相互間不排斥，且因此可使用一或多個上述術語描述治療劑。舉例而言，所選放射性同位素亦為細胞毒素。治療劑可以上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物形式製備。一般而言，具有放射性同位素作為藥物的結合物稱為放射性免疫結合物且具有化學治療劑作為藥物的結合物稱為化學免疫結合物。
細胞毒性劑之實例包括(但不限於)蒽環黴素、奧利斯坦叮、CC-1065、海兔毒素、多卡米辛(duocarmycin)、烯二炔、格爾德黴素(geldanamycin)、美登素、嘌呤黴素(puromycin)、紫杉烷、長春花生物鹼、SN-38、吐布辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)，及其立體異構體、同電子排列體、類似物或衍生物。亦可使用植物毒素、其他生物活性蛋白質、酶(亦即ADEPT)、放射性同位素、光敏劑(亦即用於光動力學療法)。
蒽環黴素來源於細菌鏈黴菌屬(Strepomyces)且已用於治療多種癌症，諸如白血病、淋巴瘤、乳癌、子宮癌、卵巢癌及肺癌。例示性蒽環黴素包括(但不限於)道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)(亦即阿黴素(adriamycin))、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、伐柔比星(valrubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone)。
海兔毒素及其肽類似物及衍生物奧利斯坦叮為已顯示具有抗癌及抗真菌活性的高強效抗有絲分裂劑。參見例如美國專利第5,663,149號及Pettit等人，Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965,(1998)。例示性海兔毒素及奧利斯坦叮包括(但不限於)海兔毒素10、奧利斯坦叮E、奧利斯坦叮EB(AEB)、奧利斯坦叮EFP(AEFP)、MMAD(單甲基奧利斯坦叮D或單甲基海兔毒素10)、MMAF(單甲基奧利斯坦叮F或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-海兔毒素異白胺酸-海兔毒素脯胺酸-苯丙胺酸)、MMAE(單甲基奧利斯坦叮E或N-甲基纈胺酸-纈胺酸-海兔毒素異白胺酸-海兔毒素脯胺酸-降麻黃鹼)、5-苯甲醯基戊酸-AE酯(AEVB)及其他新穎化合物。
在本發明之一些態樣中，本文中使用PCT國際公開案第WO 2013/072813號(該案以全文引用的方式併入本文中)中所述的奧利斯坦叮及製備彼等奧利斯坦叮的方法。
舉例而言，奧利斯坦叮0101(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)具有以下結構：
另外，奧利斯坦叮8261(2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺)具有以下結構：
多卡米辛及CC-1065為具有細胞毒性效能的DNA烷基化劑。參見Boger及Johnson,PNAS 92：3642-3649,1995。例示性海兔毒素及奧利斯坦叮包括(但不限於)(+)-多卡米辛A及(+)-多卡米辛SA，及(+)-CC-1065。
烯二炔為一類抗腫瘤細菌產物，其特徵為九員環及十員環或存在共軛參鍵-雙鍵-參鍵之環系統。例示性烯二炔包括(但不限於)卡奇黴素、艾斯帕米辛(esperamicin)及達米辛(dynemicin)。卡奇黴素為烯二炔抗生素，其最初作為土壤生物棘孢小單孢菌亞種卡奇黴菌(Micromonospora echinospora ssp.calichensis)之天然產物分離(Zein等人，Science 27；240(4856)：1198-1201,1988)；其產生雙股DNA斷裂且隨後誘導靶細胞之細胞凋亡(Zein等人，Science 27；240(4856)：1198-1201,1988；Nicolaou等人，Chem.Biol.Sep；1(1)：57-66,1994；Prokop等人，Oncogene 22：9107-9120,2003)。
在本發明之一些態樣中，細胞毒性劑為抗生素，諸如卡奇黴素，亦稱為LL-E33288複合物，例如β-卡奇黴素、γ-卡奇黴素或N-乙醯基-γ-卡奇黴素(γ-卡奇黴素(γ1))。適用於本發明之卡奇黴素實例揭示於例如美國專利第4,671,958號、第4,970,198號、第5,053,394號、第5,037,651號、第5,079,233號及第5,108,912號中，該等專利以全文引用的方式併入本文中。此等化合物含有二甲基三硫化物，二甲基三硫化物可與適當硫醇反應而形成二硫化物，同時引入諸如醯肼之官能基或適用於卡奇黴素與抗EFNA4抗體結合的其他官能基。亦可使用卡奇黴素之二硫化物類似物，例如美國專利第5,606,040號及第5,770,710 號中所述的類似物，該等專利以全文引用的方式併入本文中。在本發明之一些態樣中，二硫化物類似物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(下文中為「CM」)。
格爾德黴素為結合至Hsp90(熱休克蛋白90)且已用作抗癌藥的苯醌安沙黴素(ansamycin)抗生素。例示性格爾德黴素包括(但不限於)17-AAG(17-N-烯丙基胺基-17-去甲氧格爾德黴素)及17-DMAG(17-二甲基胺基乙基胺基-17-去甲氧格爾德黴素)。
美登素或其衍生物類美登素藉由在有絲分裂期間抑制微小管形成來抑制細胞增殖，此抑制係經由抑制微管蛋白聚合來達成。參見Remillard等人，Science 189：1002-1005,1975。例示性美登素及類美登素包括(但不限於)莫坦辛(mertansine)(DM1)及其衍生物以及胺沙托辛(ansamitocin)。
紫杉烷為充當抗微管蛋白劑或有絲分裂抑制劑之二萜。例示性紫杉烷包括(但不限於)太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如TAXOL®)及歐洲紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®)。
長春花生物鹼亦為抗微管蛋白劑。例示性長春花生物鹼包括(但不限於)長春新鹼、長春鹼、長春地辛及長春瑞賓。
在本發明之一些態樣中，藥劑為免疫調節劑。免疫調節劑實例包括(但不限於)甘昔洛韋(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、沃羅泊林(voclosporin)、環孢素(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、環磷醯胺、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸酯(mycophenolgate mofetil)、甲胺喋呤(methotrextrate)、糖皮質激素及其類似物、細胞激素、黃嘌呤、幹細胞生長因子、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、造血因子、介白素(例如介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、群落刺激因子(例如粒細胞群落刺激因子(G-CSF)及粒細胞巨噬 細胞群落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)、幹細胞生長因子(表示為「S1因子」)、紅血球生成素及血小板生成素，或其組合。
適用於本發明之免疫調節劑亦包括阻斷激素對腫瘤之作用的抗激素及抑制細胞激素產生、下調自抗原表現或遮蔽MHC抗原的免疫抑制劑。代表性抗激素包括抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、拉洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奧納斯通(onapnstone)及托瑞米芬(toremifene)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及抗腎上腺藥劑。代表性免疫抑制劑包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶、硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、溴隱亭(bromocryptine)、達那唑(danazol)、達普松(dapsone)、戊二醛、針對MHC抗原及MHC片段之抗個體基因型抗體、環孢菌素A、類固醇(諸如糖皮質類固醇)、細胞激素或細胞激素受體拮抗劑(例如抗干擾素抗體、抗IL10抗體、抗TNFα抗體、抗IL2抗體)、鏈球菌激酶、TGFβ、雷帕黴素、T細胞受體、T細胞受體片段及T細胞受體抗體。
在本發明之一些態樣中，藥物為治療性蛋白質，包括(但不限於)毒素、激素、酶及生長因子。
毒素蛋白質(或多肽)之實例包括(但不限於)白喉(diphtheria)(例如白喉A鏈)、綠膿桿菌(Pseudomonas)外毒素及內毒素、蓖麻素(ricin)(例如蓖麻素A鏈)、相思豆毒素(abrin)(例如相思豆毒素A鏈)、莫迪素(modeccin)(例如莫迪素A鏈)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨(dianthin)蛋白質、核糖核酸酶(RNase)、去氧核糖核酸酶I、葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素-A、商 陸屬(pokeweed)抗病毒蛋白、白樹素(gelonin)、白喉菌素毒素、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、黴菌毒素(tricothecenes)、抑制劑胱胺酸結(ICK)肽(例如賽拉毒素(ceratotoxins))，及芋螺毒素(conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
激素實例包括(但不限於)雌激素、雄激素、孕激素及皮質類固醇。
在本發明之一些態樣中，細胞毒性劑可使用脂質體或生物相容性聚合物製備。如本文所述之抗EFNA4抗體可與生物相容性聚合物結合以延長血清半衰期及提高生物活性，及/或延長活體內半衰期。生物相容性聚合物之實例包括水溶性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或其衍生物；及含有兩性離子的生物相容性聚合物(例如含有磷醯膽鹼之聚合物)。
在本發明之一些態樣中，藥物為寡核苷酸，諸如反義寡核苷酸。
適用於本發明之其他藥物包括抑制血管形成的抗血管生成劑，例如法呢基轉移酶(farnesyltransferase)抑制劑、COX-2抑制劑、VEGF抑制劑、bFGF抑制劑、類固醇硫酸酯酶抑制劑(例如2-甲氧基雌二醇雙胺基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE)、介白素-24、凝血栓蛋白(thrombospondin)、金屬脊椎蛋白(metallospondin)、I類干擾素、介白素12、魚精蛋白(protamine)、血管抑制素、層黏連蛋白(laminin)、內皮抑制素(endostatin)及促乳素(prolactin)片段。
抗增殖劑及促細胞凋亡劑包括PPAR-γ活化劑(例如環戊烯酮前列 腺素(cyPG))、類視色素、三萜(例如環阿烷(cycloartane)、羽扇豆烷(lupane)、烏斯烷(ursane)、齊墩果烷(oleanane)、木栓烷(friedelane)、大馬樹烷(dammarane)、葫蘆素(cucurbitacin)及類檸檬苦素(limonoid)三萜類)、EGF受體抑制劑(例如HER4)、雷帕黴素、CALCITRIOL®(1,25-二羥基膽鈣化醇(維生素D))、芳香酶抑制劑(FEMARA®(來曲唑(letrozone)))、端粒酶抑制劑、鐵螯合劑(例如3-胺基吡啶-2-甲醛硫半卡巴腙(3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone)(曲阿平(Triapine)))、凋亡素(apoptin)(來自小雞貧血病病毒之病毒蛋白質3-VP3)、Bcl-2及Bcl-X(L)之抑制劑、TNF-α、FAS配位體、TNF相關細胞凋亡誘導配位體(TRAIL/Apo2L)、TNF-α/FAS配位體/TNF相關細胞凋亡誘導配位體(TRAIL/Apo2L)信號傳導之活化劑，及PI3K-Akt存活路徑信號傳導之抑制劑(例如UCN-01及格爾德黴素)。
代表性化學治療劑包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechiorethamine)、二氯甲二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfarnide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛 莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷諾莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如克拉斯米辛(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、奧斯拉米辛(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；葉酸類似物，諸如傣諾特呤(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)、5-EU；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素物質，諸如胺魯米特(arninoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉 酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophospharnide glycoside)；胺基乙醯丙酸(arninolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；2-乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2'-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)、環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多西他賽(docetaxel)(TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞賓(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aininopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT- 11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；艾斯帕米辛(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine)；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
可根據本發明使用的其他治療劑包括用於光動力學療法的光敏劑，諸如美國公開案第20020197262號及美國專利第5,952,329號，該等文獻以全文引用的方式併入本文中；用於熱療法的雌性顆粒，諸如美國公開案第20030032995號，該案以全文引用的方式併入本文中；結合劑，諸如肽、配位體、細胞黏附配位體等，及可轉化為更具活性之細胞毒性游離藥物的前藥，諸如含磷酸酯前藥、含硫代磷酸酯前藥、含硫酸酯前藥、含肽前藥、含β-內醯胺前藥、經取代之含苯氧基乙醯胺前藥或經取代之含苯乙醯胺前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿嘧啶前藥。
在使用抗EFNA4抗體的診斷方法中，藥物可用於活體外或活體內偵測表現EFNA4之細胞之存在的可偵測標記。活體內可偵測的放射性同位素，諸如可使用閃爍照相術、磁共振成像或超音波偵測的彼等標記，可用於臨床診斷應用中。有用的閃爍照相標記包括正電子發射體及γ-發射體。用於磁性源成像的代表性對比劑為順磁性或超順磁性離子(例如鐵、銅、錳、鉻、鉺、銪、鏑、鈥及釓)、氧化鐵顆粒及水溶性對比劑。在超音波偵測中，可將氣體或液體截留於多孔無機顆粒中，作為微泡對比劑釋放。在活體外偵測中，有用的可偵測標記包括螢光團、可偵測抗原決定基或結合劑，及放射性標記。
因此，在本發明之一些態樣中，藥物為成像劑(例如螢光團或PET(正電子發射斷層攝影法)標記、SPECT(單光子發射電腦化斷層攝影法)標記)或MRI(磁共振成像)標記)。
術語「標記」當在本文中使用時係指與抗體直接或間接結合以便產生「標記」抗體的可偵測化合物或組合物。標記自身可為可偵測 的(例如放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記情況下，可催化可偵測之受質化合物或組合物之化學變化。可充當可偵測標記之放射性核素包括例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212及Pd-109。標記亦可為不可偵測實體，諸如毒素。
螢光團實例包括(但不限於)異硫氰酸螢光素(FITC)(例如5-FITC)、螢光素亞醯胺化物(FAM)(例如5-FAM)、伊紅、羧基螢光素、赤蘚紅、Alexa Fluor®(例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明(TAMRA)(例如5-TAMRA)、四甲基若丹明(TMR)及磺基若丹明(SR)(例如SR101)。
治療性或診斷性放射性同位素或其他標記(例如PET或SPECT標記)可併入藥劑中以便與如本文所述之抗EFNA4抗體結合。同位素可直接結合至抗體，例如在存在於抗體中之半胱胺酸殘基處結合至抗體，或可利用螯合劑介導抗體與放射性同位素之結合。適於放射療法之放射性同位素包括(但不限於)α-發射體、β-發射體及奧格電子(auger electrons)。在診斷應用中，有用的放射性同位素包括正電子發射體及γ-發射體。本發明之抗EFNA4抗體可進一步發生碘化，例如在抗體之酪胺酸殘基上發生碘化，以促進抗體之偵測或治療性作用。
放射性同位素或其他標記之實例包括(但不限於)3H、11C、13N、14C、15N、15O、35S、18F、32P、33P、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Se、76Br、77Br、86Y、89Zr、90Y、94Tc、95Ru、97Ru、99Tc、103Ru、105Rh、105Ru、107Hg、109Pd、111Ag、111In、113In、121Te、122Te、123I、124I、125I、125Te、126I、131I、131In、133I、142Pr、143Pr、153Pb、153Sm、161Tb、165Tm、166Dy、166H、167Tm、168Tm、169Yb、177Lu、186Re、188Re、189Re、197Pt、198Au、 199Au、201Tl、203Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、224Ac及225Ac。
II.D. 製備EFNA4抗體-藥物結合物之方法
亦提供製備本發明之抗體-藥物結合物的方法。舉例而言，用於製備如本文所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物的方法可包括：(a)將連接子與藥物部分連接；(b)使連接子-藥物部分與抗體結合；及(c)純化抗體-藥物結合物。
在一個實例中，式Ab(L-D)之抗體-藥物結合物可如下製備：(a)將連接子-藥物部分(例如AcBut-CM)添加至抗EFNA4抗體或其抗原結合片段中，其中抗體濃度範圍可為1mg/mL至25mg/mL且連接子-藥物部分與抗EFNA4抗體之莫耳比範圍為約1-15：1；(b)在具有約7至9範圍內之pH之非親核性、蛋白質相容性緩衝溶液中培育連接子-藥物部分及抗EFNA4抗體以產生單體抗體-藥物結合物，其中溶液進一步包含(i)適合有機共溶劑，及(ii)具有至少一個C6-C18羧酸或其鹽之添加劑，且其中該培育係在約0℃至約45℃範圍內之溫度下進行約1分鐘至約24小時範圍內之時段；及(c)對步驟(b)中所製備之結合物進行層析分離方法以將具有DAR 1至12且提供低於10%之低結合分率(LCF)之抗體-藥物結合物與未結合之抗EFNA4抗體、連接子-藥物部分及聚集結合物分離。
在本發明之一些態樣中，將連接子-藥物部分添加至抗EFNA4抗體中，其中抗體具有約0.01至約1mg/mL之濃度，或其中抗體具有約1至約2mg/ml之濃度，或其中抗體具有約2至約3mg/ml之濃度，或其中抗體具有約3至約4mg/ml之濃度，或其中抗體具有約4至約5mg/ml之濃度，或其中抗體具有約5至約6mg/ml，或其中抗體具有約6至約7mg/ml之濃度，或其中抗體具有約7至約8mg/ml之濃度，或其中抗體具有約8至約9mg/ml之濃度，或其中抗體具有約9至約10mg/ml之濃 度，或其中抗體具有約10至約11mg/ml之濃度，或其中抗體具有約11至約12mg/ml之濃度，或其中抗體具有約12至約13mg/ml之濃度，或其中抗體具有約13至約14mg/ml之濃度，或其中抗體具有約14至約15mg/ml之濃度，或其中抗體具有約15至約16mg/ml之濃度，或其中抗體具有約16至約17mg/ml之濃度，或其中抗體具有約17至約18mg/ml之濃度，或其中抗體具有約18至約19mg/ml之濃度，或其中抗體具有約19至約20mg/ml之濃度，或其中抗體具有約20至約21mg/ml之濃度，或其中抗體具有約21至約22mg/ml之濃度，或其中抗體具有約22至約23mg/ml之濃度，或其中抗體具有約23至約24mg/ml之濃度，或其中抗體具有約24至約25mg/ml之濃度，或其中抗體具有約10mg/ml之濃度，或其中抗體具有小於10mg/ml之濃度。如抗體之上述範圍內所用，術語「約」意謂+/- 0.5mg/mL。
在本發明之一些態樣中，將連接子-藥物部分添加至抗EFNA4抗體中，其中連接子-藥物部分相對於抗EFNA4抗體具有2-3：1之莫耳比，或3-4：1之莫耳比，或4-5：1之莫耳比，或5-6：1之莫耳比，或6-7：1之莫耳比，或7-8：1之莫耳比，或8-9：1之莫耳比，或9-10：1之莫耳比，或10-11：1之莫耳比，或11-12：1之莫耳比，或12-13：1之莫耳比，或13-14：1之莫耳比，或14-15：1之莫耳比。在本發明之一些態樣中，連接子-藥物部分係以約4-4.5：1之莫耳比添加至抗EFNA4抗體中，從而減少非所需的較高DAR抗體-藥物結合物。舉例而言，連接子-藥物部分係以4-4.5：1之莫耳比添加至抗EFNA4抗體中。亦可利用連接子-藥物部分相對於抗體之其他範圍來減少未結合的抗體、低DAR及高DAR抗體-藥物結合物。
在本發明之一些態樣中，將連接子-藥物部分添加至抗EFNA4抗體中，其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約2%至約3%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約3%至約4%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量 之約4%至約5%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約5%至約6%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約6%至約7%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約7%至約8%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約8%至約9%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約9%至約10%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約10%至約11%。如連接子-藥物部分相對於抗體之上述範圍(5，以重量計)內所用，術語「約」意謂+/- 0.5%。
在本發明之一些態樣中，將連接子-藥物部分添加至抗EFNA4抗體中，其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約2%至約3%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約3%至約4%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約4%至約5%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約5%至約6%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約6%至約7%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約7%至約8%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約8%至約9%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約9%至約10%，或其中藥物為抗EFNA4抗體重量之約10%至約11%。
在本發明之一些態樣中，上述步驟(b)(ii)中所述之培育係在約0℃至約5℃範圍內之溫度下，或在約0℃至約4℃範圍內之溫度下，或在約5℃至約10℃範圍內之溫度下，或在約10℃至約15℃範圍內之溫度下，或在約15℃至約20℃範圍內之溫度下，或在約20℃至約25℃範圍內之溫度下，或在約25℃至約30℃範圍內之溫度下，或在約30℃至約35℃範圍內之溫度下，或在約35℃至約40℃範圍內之溫度下，或在約40℃至約45℃範圍內之溫度下進行。如上述溫度範圍內所用，術語「約」意謂+/-1℃。
在本發明之一些態樣中，上述步驟(b)(ii)中所述的培育允許進行足以完成至少約50%結合反應的時間，例如完成至少約60%、完成至少約70%、完成至少約80%、完成至少約90%、完成至少約95%或完 成至少約99%結合反應的時間。因此，反應可進行至少約1分鐘至約5分鐘。只要結合物聚集保持在可接受的程度，則較長時間亦為可允許的。在本發明之一些態樣中，反應大部分完成為約1分鐘，此短時間比先前方法有改良。
在本發明之一些態樣中，在上述步驟(c)中，對上述步驟(b)之抗體結合物進行層析分離方法，以選擇抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物，其具有約1至約12範圍內之平均DAR，例如約2至約4範圍內之平均DAR，或約3至約5範圍內之平均DAR，或約4至約6範圍內之平均DAR，或約5至約7範圍內之平均DAR，或約6至約8範圍內之平均DAR，或約7至約9範圍內之平均DAR，或約8至約10範圍內之平均DAR，或約9至約11範圍內之平均DAR。在一些態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可具有約1之平均DAR，或約2之平均DAR，約3之平均DAR，或約4之平均DAR，或約5之平均DAR，或約6之平均DAR，或約7之平均DAR，或約8之平均DAR，或約9之平均DAR，或約10之平均DAR，或約11之平均DAR。如平均DAR之上述範圍內所用，術語「約」意謂+/- 0.5%。
在一些態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可具有約3至約5範圍內之平均DAR，約3至約4範圍內之平均DAR，或約4至約5範圍內之平均DAR。
在一些態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可具有3至5範圍內之平均DAR，3至4範圍內之平均DAR，或4至5範圍內之平均DAR。
在一些態樣中，抗體-藥物結合物具有約3.0之平均DAR，或3.0之平均DAR，或3.1之平均DAR，或3.2之平均DAR，或3.3之平均DAR，或3.4之平均DAR，或3.5之平均DAR，或3.6之平均DAR，或3.7之平均DAR，或3.8之平均DAR，或3.9之平均DAR。在本發明之另一態樣 中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：約4.0之平均DAR，或4.0之平均DAR，或4之平均DAR，或4.1之平均DAR，或4.2之平均DAR，或4.3之平均DAR，或4.4之平均DAR，或4.5之平均DAR，或4.6之平均DAR，或4.7之平均DAR，或4.8之平均DAR，或4.9之平均DAR，或5.0之平均DAR。
在本發明之另一態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：12或小於12之平均DAR，11或小於11之平均DAR，10或小於10之平均DAR，9或小於9之平均DAR，8或小於8之平均DAR，7或小於7之平均DAR，6或小於6之平均DAR，5或小於5之平均DAR，4或小於4之平均DAR，3或小於3之平均DAR，2或小於2之平均DAR，或1或小於1之平均DAR。
在本發明之其他態樣中，抗體-藥物結合物之組合物、批料及/或調配物可藉由以下表徵：11.5或小於11.5之平均DAR，10.5或小於10.5之平均DAR，9.5或小於9.5之平均DAR，8.5或小於8.5之平均DAR，7.5或小於7.5之平均DAR，6.5或小於6.5之平均DAR，5.5或小於5.5之平均DAR，4.5或小於4.5之平均DAR，3.5或小於3.5之平均DAR，2.5或小於2.5之平均DAR，1.5或小於1.5之平均DAR。
在本發明之一些態樣中，在上述步驟(c)中，對上述步驟(b)之抗體結合物進行層析分離方法以選擇抗體-藥物結合物，其藥物負載率在約2wt%至約10wt%範圍內，例如藥物負載率在約2wt%至約4wt%範圍內，或藥物負載率在約3wt%至約5wt%範圍內，或藥物負載率在約4wt%至約6wt%範圍內，或藥物負載率在約5wt%至約7wt%範圍內，或藥物負載率在約6wt%至約8wt%範圍內，或藥物負載率在約7wt%至約9wt%範圍內，或藥物負載率在約8wt%至約10wt%範圍內。如藥物負載率之上述範圍內所用，術語「約」意謂+/- 0.5%。
在本發明之一些態樣中，在上述步驟(c)中，對上述步驟(b)之抗 體-藥物結合物進行層析分離以選擇抗體-藥物結合物，其具有低於約10%之低結合分率(LCF)，例如小於10%，或小於約9%，或小於9%，或小於約8%，或小於8%，或小於約7%，或小於7%，或小於約6%，或小於6%，或小於約5%，或小於5%，或小於約4%，或小於4%，或小於約3%，或小於3%，或小於約2%，或小於2%，或小於約1%，或小於1%，或0%。在本發明之一些態樣中，預期LCF高於0%，但低於10%為合乎需要的。在LCF之上述說明中，術語「約」意謂指定百分率之+/- 0.5%。在本發明之一些態樣中，在添加連接子-藥物部分期間進行大力攪拌及劇烈混合，例如如部分地藉由添加連接子-藥物部分至混合渦旋之中部中來達成，此有助於達成低的未結合分率，從而比先前方法有改良。
在本發明之背景下，單體抗體-藥物結合物係指單一抗體與任何數目個藥物分子連接或結合而抗體無明顯聚集。具有未結合或結合明顯不足之抗體之指定群體中的抗體百分率稱為低結合分率(LCF)。與聚集形式相反，結合物之單體形式具有顯著的治療價值，且最小化LCF及實質上減少聚集使得抗體起始物質以治療上有意義之方式得到利用，其係藉由防止LCF與更高結合分率(HCF)競爭。
許多藥物(包括卡奇黴素)之疏水性質可引起抗體-藥物結合物聚集。為製備藥物結合物較高(降低之LCF)且聚集減少之單體抗體-藥物結合物，結合反應可在非親核性、蛋白質相容性緩衝溶液中進行，該緩衝溶液含有(i)乙醇作為共溶劑；及(ii)具有至少一個C6-C18羧酸或其鹽之添加劑。亦可使用其他蛋白質相容性有機共溶劑，諸如乙二醇、丙二醇、DMF及DMSO。利用一些或所有有機共溶劑將藥物轉移至結合混合物中。有用的C6-C18羧酸包括癸酸、辛酸或辛酸，或其鹽。在本發明之一個態樣中，羧酸為癸酸，或相應鹽，諸如癸酸鈉。具有至少一個C6-C18羧酸或其鹽之添加劑之典型量的範圍為20mM至100 mM，諸如30mM至90mM，或約40mM至80mM，或約40mM至50mM。C6-C18羧酸或其鹽之濃度可提高至150-300mM且共溶劑降低至1%至10%。使用N-羥基丁二醯亞胺(OSu)酯或其他類似活化酯製備抗體-藥物結合物的有用緩衝劑包括磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES緩衝劑)。用於結合反應的緩衝溶液應實質上缺少游離胺及親核劑。作為另一方法，結合反應可在含有第三丁醇、但無其他添加劑的非親核性、蛋白質相容性緩衝溶液中進行。參見例如美國專利第5,712,374號及第5,714,586號，該等專利以全文引用的方式併入本文中。其他結合方法及含卡奇黴素結合物描述於美國專利第5,739,116號及第5,877,296號中，該等專利以全文引用的方式併入本文中。
用於形成結合物的最佳反應條件可依據反應變數(諸如溫度、pH、連接子-卡奇黴素部分輸入量及添加劑濃度)之變化憑經驗判定。適於其他藥物結合之條件可由熟習此項技術者無需過度實驗來判定。
用於製備抗體-藥物結合物的其他方法已描述於多個公開案中。舉例而言，經由離胺酸側鏈胺或經由半胱胺酸硫氫基藉由還原欲發生結合反應之鏈間二硫鍵而活化，可在抗體中進行化學修飾。參見例如Tanaka等人，FEBS Letters 579：2092-2096,2005及Gentle等人，Bioconjugate Chem.15：658-663,2004。在抗體之特定位點根據在所定義化學計量下之特定藥物結合進行工程改造的反應性半胱胺酸殘基亦已描述。參見例如Junutula等人，Nature Biotechnology,26：925-932,2008。使用含醯基供體麩醯胺酸標記或在轉麩醯胺酸酶存在下藉由多肽工程改造而產生反應性(亦即能夠形成共價鍵作為醯基供體)之內源性麩醯胺酸與胺之結合(例如具有或連接至反應性胺之細胞毒性劑)亦描述於PCT國際公開案第WO 2012/059882號中。
為進一步提高每個抗體-藥物結合物中之藥物分子數目，藥物可 與聚乙二醇(PEG)結合，包括直鏈或分支鏈聚乙二醇聚合物及單體。PEG單體具有式：-(CH2CH2O)-。藥物及/或肽類似物可直接結合至PEG，或間接結合至PEG，亦即經由適當間隔基團，諸如糖。PEG-抗體-藥物組合物亦可包括其他親脂性及/或親水性部分以促進藥物穩定性及活體內遞送至靶點。用於製備含PEG組合物的代表性方法可發現於美國專利第6,461,603號、第6,309,633號及第5,648,095號以及其他文獻中。
舉例而言，為了提高卡奇黴素在抗體-卡奇黴素結合物中的量，使抗體與PEG結合，隨後與卡奇黴素結合，例如使用PEG-SPA、PEG-SBA或PEG-雙順丁烯二醯亞胺。使用PEG所製備的抗體-藥物結合物針對靶抗原之結合親和力可能降低，但因藥物負載增加而仍有效。
結合之後，在上述步驟(c)之層析分離中，可藉由習知方法將結合物與未結合的反應物及/或結合物之聚集形式分離。此可包括諸如以下方法：尺寸排阻層析法(SEC)、超濾/滲濾、離子交換層析(IEC)、層析聚焦(CF)HPLC、FPLC或Sephacryl S-200層析。層析分離亦可藉由疏水性相互作用層析(HIC)來達成，相較於SEC，HIC提供一些優勢包括：(1)能夠有效地降低LCF含量以及聚集物；(2)適應較大反應體積；及(3)產物之稀釋度最小。適合的HIC介質包括苯基瓊脂糖6速流層析介質、丁基瓊脂糖4速流層析介質、辛基瓊脂糖4速流層析介質、Toyopearl Ether-650M層析介質、大量製備性甲基HIC介質或大量製備性第三丁基HIC介質。
在本發明之一些態樣中，層析分離係使用丁基瓊脂糖4速流層析介質進行。當使用如實例6中所述之定製梯度時，結合至管柱之較高DAR物質得以移除，比先前方法有改良。
在一些態樣中，純化方法可包括細胞離心移除步驟、視情況存在之蛋白質A親和力捕捉步驟、隨後為一或兩個正交層析研磨步驟、 病毒過濾步驟，及切向流過濾步驟用於濃縮及調配。
典型的抗EFNA4-ActBut-CM抗體-藥物結合物製劑主要含有(約95%)所結合抗體，每莫耳抗體含有3-5莫耳CM，例如每莫耳抗體3-4莫耳CM，或每莫耳抗體4-5莫耳CM。在活體內研究中，利用藥物負載之此莫耳範圍所製備的EFNA4抗體-藥物結合物功效高，毒性最小。
EFNA4-ActBut-CM抗體-藥物結合物已以實驗室規模(10-200mg)可再現地製備。用pg CM/mg單株抗體表示的DAR或藥物負載係藉由將CM濃度(μg/mL)除以抗體濃度(mg/mL)來確定。此等值係藉由量測結合物溶液在280nm(抗體)及310nm(卡奇黴素)之吸光度來測定。重要的是注意此值為平均藥物負載且實際藥物負載為以平均藥物負載值為中心的準高斯分佈(quasi-gaussian distribution)，亦即一些抗體負載高於平均值且一些抗體負載低於平均值。相較於已知抗體-卡奇黴素結合物(例如CMC-676及CMC-544)，DAR分佈極窄，且3至5種DAR物質(其為最需要的)佔總物質之約75%。未結合抗體(低結合分率或LCF)可使用分析性HIC-HPLC(疏水性相互作用高效液相層析)量測。此值為抗體上之CM分佈之量度且通常不影響CM給藥量。可使用ELISA量測的未結合CM係指不與抗體結合且依據總CM之百分比表示的CM量。藥物負載分析無法區分未結合之CM與所結合之CM。使用藥物負載分析時，未結合之CM之量為偵測不到的或為可忽略的，且因此此等分析有效地量測所結合之CM之量。
分析方法可用於分析人類化EFNA4-AcBut-CM抗體-藥物結合物之釋放及穩定性測試。可評估結合物之身分(IEF)、濃度(總蛋白及總CM負載)、純度(未結合之CM、低結合抗體、聚集物含量及還原SDS-PAGE)及免疫親和性(抗原結合ELISA)。可使用熟習此項技術者已知的其他分析。使用此等分析可在工業製造中維持不同批次的一致性。
III. 用於表徵EFNA抗體-藥物結合物之功能分析
本發明進一步揭示表徵EFNA4抗體-藥物結合物活性(包括EFNA結合活性、結合至細胞表面上所呈遞之EFNA4抗原後的細胞內化及在個體中靶向表現EFNA4之細胞)的活體外及活體內分析。在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物之特徵為抗體或其抗原結合片段之中和或耗乏態樣。在本發明之一些態樣中，相較於替代藥物之功效缺乏，EFNA4抗體-藥物結合物之特徵為特定藥物之功效出乎意料。在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體-藥物結合物之特徵優於作用方式與藥物相同的標準照護治療劑。
用於偵測EFNA4抗體-藥物結合物結合至EFNA4抗原或其他EFNA抗原的技術在此項技術中已知，包括例如BIACORE®分析。其他代表性技術包括離心、親和性層析及其他免疫化學方法。參見例如Manson(1992)Immunochemical Protocols,Humana Press,Totowa,N.J.,United States of America；Ishikawa(1999)Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay,Elsevier,Amsterdam/New York。抗原結合分析可使用經分離之EFNA4抗原或表現EFNA4之細胞進行。
EFNA4抗體-藥物結合物之結合特異性可根據結合抗原決定基之定義(亦即鑑定參與抗原結合的殘基，包括不相鄰殘基)及/或影響抗原結合之殘基之定義進一步描述。
EFNA4抗體-藥物結合物被表現EFNA之細胞內化可藉由觀測抗體或結合物隨時間結合至表現EFNA之細胞表面之量來分析。所選EFNA配位體或其同功異型物可以可溶性形式存在，且至少一些EFNA4可與細胞表面保持結合，藉此允許本文所揭示之抗體內化。因此，本發明之抗EFNA4抗體-藥物結合物可被表現EFNA4之細胞內化。舉例而言，結合至腫瘤起始細胞之表面上之EFNA4的抗EFNA4抗體-藥物結合物可被腫瘤起始細胞內化。
EFNA4抗體之內化可使用功能分析加以評估，其中將細胞與EFNA4抗體及結合至肥皂草素(saporin)毒素之二次抗體Fab片段一起培育。接著藉由任何適合方法量測細胞存活率，其中細胞性細胞毒性指示抗體內化。參見實例5。
在本發明之一些態樣中，所揭示EFNA4抗體-藥物結合物中之抗體或其抗原結合片段為在最廣泛意義上使用的「拮抗劑」，亦即部分或完全阻斷、抑制或中和本文所揭示之原生標靶之生物活性或其轉錄或轉譯的任何分子。如本文中相對於本發明抗體之生物活性所用，術語「抑制」或「中和」意謂抗體實質上拮抗、阻止、防止、限制、減緩、中斷、清除、中止、減少或逆轉例如正被抑制者(包括(但不限於)生物活性)之進展或嚴重程度的能力。舉例而言，在本發明之一些態樣中，抗EFNA4抗體-藥物結合物在抗體-藥物結合物內化後促進細胞殺死。
更特定而言，術語中和抗體或中和拮抗劑係指一種抗體或拮抗劑，其結合至EFNA配位體或與EFNA配位體相互作用且防止配位體結合或締合至其結合搭配物(例如EPHA受體)、藉此中斷生物反應，否則分子相互作用會產生該生物反應。對於EFNA4而言，中和抗體或拮抗劑較佳使EFNA4結合至EPHA4的能力減弱至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或大於99%。應瞭解，此減弱之活性可直接使用此項技術認可之技藝量測或可根據此減少對EPHA4受體活性之影響來量測。
在本發明之其他態樣中，本發明之抗EFNA4抗體-藥物結合物可為耗乏性抗體。術語耗乏性抗體係指一種抗體，其結合至細胞表面上或附近之EFNA4或與其結合且誘導、促進或引起細胞死亡或清除(例如藉由補體依賴性細胞毒性或抗體依賴細胞介導性細胞毒性)。耗乏性抗體較佳能夠移除、清除或殺死所定義細胞群中之至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%腫瘤不朽化細胞。
功能分析亦包括用於評估抗體-藥物結合物之抗癌活性(例如摧毀現有癌細胞或延遲或阻止癌細胞生長的能力)的方法。本發明之抗體-藥物結合物所靶向的癌症包括個體中任何組織之原發性腫瘤與轉移性腫瘤及癌瘤，包括癌瘤及造血惡性疾病，諸如白血病及淋巴瘤。
具有生長抑制活性的EFNA4抗體-藥物結合物可清除表現EFNA之細胞或阻止或減少表現EFNA之癌細胞增殖。用於快速活體外評估細胞生長抑制之代表性方法描述於Jones等人，(2001)J.Immunol.Methods 254：85-98中。
EFNA4抗體-藥物結合物亦可包括誘導細胞死亡的能力，例如以核DNA降解、核變性及縮合、膜完整性喪失及吞噬作用為特徵的程式化細胞死亡。評估細胞的代表性分析描述於Hoves等人，(2003)Methods 31：127-34；Peng等人，(2002)Chin.Med.Sci.J.17：17-21；Yasuhara等人，(2003)J.Histochem.Cytochem.51：873-885。
舉例而言，為評估EFNA4抗體-藥物結合物活體外之細胞毒性，將表現EFNA4之癌細胞及對照細胞分別在EFNA4抗體-藥物結合物及游離藥物之存在下培養。各種藥劑之細胞毒性係以ED50(ng/ml)報導，ED50為藥物以結合物或游離藥物形式給與之量，相對於未處理對照物，此量引起細胞培養物減少50%。藥物暴露之後，使用活體染料(MTS)測定培養物中之細胞數目。
為了評估EFNA4抗體-藥物結合物在活體內之細胞毒性，藉由皮下注射各種癌細胞而在NOD/SCID小鼠中製備腫瘤。EFNA4抗體-藥物結合物及對照化合物可投與具有腫瘤之小鼠，例如藉由腹膜內注射，每週兩次，歷時兩週(q4dx4)。可量測的治療結果包括腫瘤細胞生長之抑制。參見實例8。
此外，本發明提供可經由多種機制耗乏、靜默、中和、清除或抑制腫瘤細胞(包括腫瘤起始細胞(TIC))及/或相關瘤形成之生長、繁殖或存活的EFNA4抗體-藥物結合物，該等機制包括促效或拮抗所選路徑或清除特定細胞，此視例如抗EFNA4抗體或給藥及遞送方法而定。參見實例9。
如本文所用，術語腫瘤起始細胞(TIC)包涵腫瘤不朽化細胞(TPC；亦即癌症幹細胞或CSC)與高度增殖性腫瘤祖細胞(TProg)，其合起來通常包括塊體腫瘤或腫塊之獨特子群(亦即0.1-40%)。為了本發明起見，術語腫瘤不朽化細胞與癌症幹細胞為等效語且在本文中可互換使用。反之，TPC不同於TProg之處在於，其可完全囊括腫瘤內現有之腫瘤細胞之組成且具有無限的自更新能力，如根據少量經分離細胞之串行移植(經由小鼠之兩個或兩個以上繼代)所證明。如本文所用，術語「腫瘤起始細胞」亦指不具有腫瘤本身特徵之各種血液惡性疾病之癌症幹細胞。
本發明提供靶向腫瘤起始細胞(TIC)、尤其腫瘤不朽化細胞(TPC)之EFNA4抗體-藥物結合物，藉此促進贅生性病症及過度增生性病症之治療、管理或預防。更特定而言，特定腫瘤細胞子群表現EFNA4且可修改形態決定因子信號傳導之定域配位，此對癌症幹細胞自更新及細胞存活具有重要作用。因此，EFNA4抗體-藥物結合物在投與個體時可用於降低TIC之頻率。腫瘤起始細胞頻率之降低可作為以下結果而發生：a)清除、耗乏、致敏、靜默或抑制腫瘤起始細胞；b)控制腫瘤起始細胞之生長、擴增或復發；c)中斷腫瘤起始細胞之起始、繁殖、維持或增殖；或d)以其他方式阻礙致瘤細胞之存活、再生及/或轉移。在本發明之一些態樣中，腫瘤起始細胞頻率之降低係作為一或多種生理性路徑之改變的結果發生。路徑之改變，不論藉由減少或清除腫瘤起始細胞或藉由修改其潛在性(例如誘導分化、小生境破壞)或 以其他方式干擾其對腫瘤環境或其他細胞發揮作用的能力，又藉由抑制腫瘤發生、腫瘤維持及/或轉移及復發而允許更有效地治療EFNA4相關病症。
可用於評估腫瘤起始細胞頻率之此降低之方法之一為活體外或活體內有限稀釋分析，較佳隨後使用泊松分佈(Poisson distribution)統計資料進行計數或評估預定義確定事件(諸如能夠活體內產生腫瘤與否)之頻率。亦可經由熟知的流式細胞測定術或免疫組織化學方式測定頻率值之降低。關於所有上述方法，參見例如Dylla等人，PLoS ONE 3(6)：e2428,20082及Hoey等人，Cell Stem Cell 5：168-177,2009，各文獻以全文引用的方式併入本文中。可用於計算腫瘤起始細胞頻率之與本發明相容的其他方法包括可量化流式細胞測定技術及免疫組織化學染色程序。代表性方法描述於實例9中。
接著可使用任一種上述方法、根據本文之教示內容對藉由所揭示EFNA4抗體-藥物結合物所提供之TIC(或其中TPC)頻率降低進行量化。在一些情況下，本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可使TIC頻率降低10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%(藉由多種上述機制來達成，包括清除、誘導分化、小生境破壞、靜默等)。在本發明之其他態樣中，TIC頻率之降低可為約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在本發明之某些態樣中，所揭示化合物可使TIC頻率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應瞭解，TIC頻率之任何降低可引起致瘤性、瘤形成之持久性、復發及侵襲性出現相應降低。
大量證據支持腫瘤生長、抗治療性及病症復發受TPC控制的假定。TPC頻率作為病症分級及/或腫瘤內分化度之結果，可因腫瘤類型而異或因腫瘤類型相同之患者而異。TPC可使用一組細胞表面標記加以鑑定及富集，此等細胞表面標記在患有某些類型癌症之患者中的表現通常重疊。TPC最佳根據其在串行移植時起始腫瘤代功能能力加以 定義，而非致瘤(NTG)細胞缺乏此能力。根據獨特腫瘤起始能力富集的實體腫瘤細胞首先鑑定於乳癌中；然而，乳癌包括一系列惡性疾病。迄今，科學界尚不能將特定TPC身分與特定病症亞型關聯，此可能為各群組間與各群組內結果差異的根本原因且亦可能提高臨床轉變失敗的可能性。
本發明提供改良TPC富集之新細胞表面製造者之組合。在特定態樣中，本發明提供促進三重陰性乳癌(TNBC)TPC富集之新細胞表面製造者之組合。本發明此外提供對作為TNBC中之新穎TPC相關治療標靶的EFNA4進行鑑定；EFNA4在TNBC中的表現量明顯高於其他乳癌亞型及正常組織。
可評估EFNA4抗體-藥物結合物在各種動物中的藥物動力學且與未結合之卡奇黴素在各種動物中之藥物動力學進行比較。舉例而言，此可在單一靜脈內快速投與雌性NOD/SCID小鼠、雄性史泊格多利大白鼠(Sprague Dawley rats)及雌性食蟹猴之後進行。EFNA4抗體-藥物結合物之藥物動力學的特徵一般為清除率低、分佈體積小及在不同物種中之表觀終末半衰期長。未結合之卡奇黴素衍生物之血清濃度預期低於量化限值。在單劑量毒性範圍研究中，此等結合物之毒性概況預期類似於其他抗體-卡奇黴素結合物在類似劑量下所得之毒性概況。
「誘導細胞凋亡」之抗體為誘導程式化細胞死亡之抗體，如根據磷脂結合蛋白V之結合、DNA之片段化、細胞皺縮、內質網之擴張、細胞片段化及/或膜微脂粒(稱為細胞凋亡體)之形成所確定。細胞為腫瘤細胞，例如乳房、卵巢、結腸直腸、肝臟及肺。可利用多種方法評估與細胞凋亡相關的細胞事件。舉例而言，磷脂醯絲胺酸(PS)移位可根據磷脂結合蛋白結合來量測；DNA片段化可經由DNA序列梯加以評估；且隨同DNA片段化一起的核/染色質縮合可根據亞二倍體細胞之任何增加來評估。
如本文所用，「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指細胞介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)識別靶細胞上之所結合抗體，隨後促使靶細胞溶解。所關注之分子之ADCC活性可使用活體外ADCC分析加以評估，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之分析。適用於此等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。或者或另外，所關注之分子之ADCC活性可在活體內評估，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，PNAS(USA),95：652-656(1998)中所揭示之動物模型。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指標靶在補體存在下溶解。補體活化路徑始於補體系統之第一組分(C1q)結合至分子(例如抗體)與同源抗原之複合物。為了評估補體活化，可進行CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,202：163-171(1997)中所述。
「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能的白血球。該等細胞可表現FcγRIII且執行抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括(但不限於)周邊血液單核細胞(PBMC)、天然殺手(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜伊紅血球及嗜中性白血球，其中PBMC及NK細胞為較佳。具有ADCC活性之抗體典型地具有IgG1或IgG3同型。此等ADCC介導性抗體亦可藉由將非ADCC抗體之可變區或可變區片段工程改造為IgG1或IgG3同型恆定區來製備。
IV. EFNA抗體-藥物結合物之用途
本發明之抗體及抗體藥物結合物適用於多種應用中，包括(但不限於)治療性治療方法及診斷性治療方法。
IV.A.活體外應用
本發明提供使用EFNA4抗體-藥物結合物的活體外方法。舉例而言，所揭示之抗體可單獨使用或與細胞毒性劑或特異性結合EFNA陽性癌細胞以耗乏細胞樣品中之此等細胞的其他藥物組合使用。亦提供經由使表現EFNA之細胞與EFNA4抗體-藥物結合物接觸來誘導細胞凋亡及/或抑制細胞增殖的方法。代表性活體外方法描述於上文「用於表徵EFNA4抗體-藥物結合物之功能分析」標題下。
本發明之EFNA4抗體-藥物結合物根據其特異性結合EFNA4抗原的能力，亦用於活體外偵測EFNA陽性細胞。偵測表現EFNA之細胞的方法可包括：製備具有細胞之生物樣品；(b)使EFNA4抗體-藥物結合物與生物樣品活體外接觸，其中該藥物為可偵測標記；及(c)偵測EFNA4抗體-藥物結合物之結合。
本文所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物亦適用於降低腫瘤樣品中之腫瘤起始細胞頻率。舉例而言，方法可包括使腫瘤細胞群(其中該群包含腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞之外的腫瘤細胞)在活體外與EFNA4抗體-藥物結合物接觸的步驟；藉此降低細胞群中之腫瘤起始細胞百分率。如本文所用，術語「腫瘤起始細胞」亦指不具有腫瘤本身特徵之各種血液惡性疾病之癌症幹細胞。代表性腫瘤樣品包括含有腫瘤細胞的任何生物或臨床樣品，例如組織樣品、活組織檢查樣品、血液樣品、血漿、唾液、尿、精液等。代表性方法描述於實例9中。
IV.B.治療性應用
EFNA4相關病症包括(但不限於)乳癌，諸如三重陰性乳癌(TNBC)；卵巢癌；結腸直腸癌；白血病，諸如慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；肝癌，諸如肝細胞癌(HCC)；及肺癌，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC)。
如本文所用，片語「有效量」、「有效劑量」係指達成任一種或多種有益或所要治療結果所必需之藥物、化合物或醫藥組合物的量。 在預防性用途中，有益或所要結果包括消除或降低病症風險、減輕病症嚴重程度或延遲病症發作，包括病症之生物化學、組織學及/或行為症狀、在病症發展期間呈現之其併發症及中間病理學表型。在治療性用途中，有益或所要結果包括諸如以下之臨床結果：各種EFNA4相關病症之一或多種症狀之發生率降低或改善、治療病症所需之其他藥物劑量降低、另一藥物作用增強，及/或患者之EFNA4相關病症之進展延遲。
在一個態樣中，本發明提供治療個體之與EFNA4表現相關之病症的方法。本發明亦提供如本文所述之抗體-藥物結合物或醫藥組合物，其用於治療個體之與EFNA4表現相關之病症的方法中。本發明此外提供如本文所述之抗體-藥物結合物或醫藥組合物的用途，係用於製造供治療個體之與EFNA4表現相關之病症的藥劑。
在本發明之一些態樣中，治療個體之與EFNA4表現相關之病症的方法包括向有需要之個體投與有效量之具有如本文所述之EFNA4抗體-藥物結合物的組合物(例如醫藥組合物)。與EFNA4表現相關之病症包括(但不限於)異常EFNA4表現、改變或異常之EFNA4表現、EFNA4過度表現，及增生性病症(例如癌症)。
在本發明之一個態樣中，病症為癌症，包括(但不限於)間皮瘤、肝膽管(肝臟及膽管)、肝細胞癌、原發性或繼發性CNS腫瘤、原發性或繼發性腦腫瘤、肺癌(NSCLC及SCLC)、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛區癌、胃癌、胃腸道(胃、結腸直腸及十二指腸)、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱 癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)之贅生物、原發性CNS淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質癌、膽囊癌、多發性骨髓瘤、膽管癌、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤，或本文所揭示之一或多種癌症之組合。
在本發明之特定態樣中，適於使用抗EFNA4抗體-藥物結合物靶向的癌症包括表現EFNA4之原發性及轉移性癌症，諸如乳癌，包括三重陰性乳癌(TNBC)；卵巢癌；結腸直腸癌；白血病，諸如慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；肝癌，諸如肝細胞癌(HCC)；及肺癌，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC)。在本發明之一些態樣中，提供一種抑制患有表現EFNA4之腫瘤之個體中之腫瘤生長或進展的方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之具有如本文所述之EFNA4抗體-藥物結合物的組合物。在本發明之其他態樣中，提供一種抑制個體中之表現EFNA4之癌細胞轉移的方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之具有如本文所述之EFNA4抗體-藥物結合物的組合物。在本發明之其他態樣中，提供一種誘導個體中之表現EFNA4之腫瘤消退的方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之具有如本文所述之EFNA4抗體-藥物結合物的組合物。在其他態樣中，本發明提供如本文所述之抗體-藥物結合物或醫藥組合物，用於如上文所述之方法中。在其他態樣中，本發明提供如本文所述之抗體-藥物結合物或醫藥組合物用於製造供上述方法中所用之藥劑的用途。
因此，待用本發明之EFNA4抗體-藥物結合物治療的患者可根據生物標記表現加以選擇，生物標記表現包括(但不限於)塊體腫瘤樣品之mRNA(qPCR)及EFNA4抗原之表現升高，從而根據富集之標靶表現、而非腫瘤來源或組織學來選出患者群。可量測標靶表現與細胞染 色數目及細胞染色強度的關係。舉例而言，EFNA4之高度表現之分類包括藉由免疫組織化學染色所測試、大於30%(亦即40%、50%或60%)細胞對EFNA4呈陽性級別為3+(依1至4之量表)的彼等患者，而EFNA4之中度表現可包括大於20%細胞之細胞染色為1+至2+的彼等患者。亦可如本文所述、藉由偵測腫瘤起始細胞(TIC)上之EFNA表現來量測標靶表現。
EFNA4於TNBC中之表現具有特異性，原因在於此表現高於其他乳癌亞型及正常組織。一般而言，EFNA4表現量較低的腫瘤展現密連蛋白(較低的TNBC分子標記)，表明該分類法在患者選擇策略中的潛在轉譯相關性。本發明提供：選擇EFNA4表現增強之患者且用本文所揭示之EFNA4 ADC治療患者。此外，為了確定EFNA4過度表現之遺傳基礎，可使乳癌、卵巢癌及肝細胞癌中的EFNA4複本數增加與mRNA含量關聯且用於患者選擇策略中。本發明此外提供：選擇EFNA4複本數增加之患者且用本文所揭示之EFNA4 ADC治療患者。本發明此外提供：選擇EFNA4之mRNA含量增加的患者且用本文所揭示之EFNA4 ADC治療患者。
亦可使用除EFNA4表現之外之生物標記進行患者選擇，包括例如根據多藥抗藥性(MDR)表徵腫瘤。將近50%人類癌症對化學療法具有完全抗性或僅短暫地作出反應，隨後常用抗癌藥對其不再產生影響。此現象稱為MDR且內在地由一些腫瘤類型表現，而其他在暴露於化學療法治療之後獲得MDR。藥物射流泵P-醣蛋白介導與細胞毒性化學療法相關之大部分MDR。可對存在於癌症患者腫瘤試樣中之MDR機制進行表型及功能分析以便將特定MDR機制與特定腫瘤類型之化學療法抗性關聯。
本發明提出，TNBC TPC明顯富集於ESA+CD46+CD324+細胞中，而非CD324對應物中。本發明此外提供ESA及/或CD46及/或CD324用 作選擇患者之標記及用本文所揭示之EFNA4 ADC治療患者的用途。本發明此外提供ESA及/或CD46及/或CD324用作選擇TNBC患者之標記及用本文所揭示之EFNA4 ADC治療患者的用途。
癌症生長或異常增殖係指表明細胞內變化為更高級癌症形式或病症狀態的諸多指標中之任一者。癌細胞或非贅生增生性病症細胞生長之抑制可藉由此項技術中已知的方法分析，諸如腫瘤生長延遲及轉移抑制。量測癌症生長抑制之其他指標包括癌細胞存活率之降低、腫瘤體積或形態之降低(例如，如使用電腦化斷層攝影術(CT)、聲波學或其他成像方法測定)、腫瘤脈管系統之破壞、延遲性過敏皮試之效能改良、溶胞性T淋巴細胞活性之增強，及腫瘤特異性抗原含量之降低。
相較於對照或基線量測結果，所揭示治療方法之所要結果為通常可量化的度量值。如本文所用，相對術語，諸如「改良」、「增加」或「減少」表示數值相對於對照值而言，諸如起始本文所述療法之前對同一個體之量測，或在本文所述療法不存在下對對照個體(或多個對照個體)之量測。代表性對照個體為罹患與所治療之個體相同形式之過度增生性病症的個體，其年齡與所治療之個體相同(以確保所治療個體與對照個體之病症分級類似)。
作為治療之反應的變化或改善通常具有統計顯著性。如本文所用，術語「顯著性」或「顯著」係指兩個或兩個以上實體之間存在非隨機關聯之機率統計分析。為了確定關係是否「顯著」或具有「顯著性」，資料之統計學處理可為「p值」。低於使用者所定義之截止點的彼等p值視為顯著。小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005或小於0.001之p值可視為顯著。
如上文在標題「III.用於表徵EFNA抗體-藥物結合物之功能分析」下所述，本發明亦提供靶向腫瘤起始細胞的方法。更特定而言， 本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可耗乏、靜默、中和、清除或抑制腫瘤細胞(包括腫瘤起始細胞)之生長、繁殖或存活。
因此，本文所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物亦適用於降低腫瘤樣品中之腫瘤起始細胞頻率。舉例而言，方法可包括使腫瘤細胞群(其中該群包含腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞之外的腫瘤細胞)與EFNA4抗體-藥物結合物接觸的步驟；藉此降低細胞群中之腫瘤起始細胞百分率。如本文所用，術語「腫瘤起始細胞」亦指不具有腫瘤本身特徵之各種血液惡性疾病之癌症幹細胞。接觸步驟可活體外進行，其中該腫瘤細胞群包含於生物樣品中，如上文所述。或者，接觸步驟可在活體內進行，如將EFNA4抗體-藥物結合物投與個體之後所發生。
IV.C.活體內偵測及診斷
在另一態樣中，提供一種偵測、診斷及/或監測與EFNA4表現相關之病症的方法。舉例而言，如本文所述之EFNA4抗體可用可偵測部分(諸如成像劑及酶-受質標記)標記。如本文所述之抗體亦可用於活體內診斷分析，諸如活體內成像(例如PET或SPECT)，或染色試劑。
將EFNA4抗體-藥物結合物(其中藥物為可偵測標記)投與個體之後，且在經歷足以進行結合之時間之後，抗體所結合之表現EFNA4之細胞之生物分佈可為可見的。所揭示之診斷方法可治療方法組合使用。另外，可投與本發明之EFNA4抗體-藥物結合物用於偵測及治療之雙重目的。
代表性非侵入偵測方法包括閃爍照相術(例如SPECT(單光子發射電腦化斷層攝影法)、PET(正電子發射斷層攝影法)、γ相機成像及線性掃描)、磁共振成像(例如常規磁共振成像、磁化轉移成像(MTI)、質子磁共振光譜學(MRS)、擴散加權成像(DWI)及功能MR成像(fMRI))及超音波。
IV.D.調配物
本發明此外提供包括本文所揭示之任一種EFNA4抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。此外，組合物可包括超過一種EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物(例如識別EFNA4之不同抗原決定基之EFNA4抗體之混合物)。其他例示性組合物包括識別相同抗原決定基之超過一種EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物，或結合至EFNA4(例如人類EFNA4)之不同抗原決定基的不同種之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物。
本發明所用的組合物此外可包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy，第21版，2005,Lippincott Williams and Wilkins,K.E.Hoover編)，呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對於接受者而言為無毒的，且可包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁基或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指分子或大分子之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。醫藥學上可接受之賦形劑進一步描述 於本文中。
可利用EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之各種調配物投藥。在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可以純淨物形式投與。EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之賦形劑可存在於各種調配物中。醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中已知，且為促進藥理學有效物質投與的相對惰性物質。舉例而言，賦形劑可提供形態或稠度，或充當稀釋劑。適合賦形劑包括(但不限於)穩定劑、濕潤劑及乳化劑、改變滲透壓之鹽、囊封劑、緩衝劑及皮膚穿透增強劑。用於非經腸及經腸遞送藥物的賦形劑以及調配物闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing,2000中。
在本發明之一些態樣中，此等藥劑調配成藉由注射投與(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌內注射等)。因此，此等藥劑可與醫藥學上可接受之媒劑合併，諸如生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及其類似物。特定給藥方案(亦即劑量、時序及重複次數)將視特定個體及該個體的病史而定。
根據本發明使用之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之治療性調配物係藉由將具有所要純度之抗體與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版，Mack Publishing,2005)混合而製備成凍乾調配物或水溶液形式供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對於接受者而言為無毒的，且可包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二 酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之脂質體係藉由此項技術中已知的方法製備，諸如以下文獻中所述之方法：Eppstein，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692,1985；Hwang，等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030-4034,1980；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號。循環時間延長的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。特別適用的脂質體可藉由逆相蒸發法、使用包括磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體係經由規定孔徑之過濾器擠出，以產生具有所要直徑的脂質體。
活性成分亦可截留於藉由例如團聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，截留於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或截留於微乳液中。此等技術揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版，Mack Publishing,2005。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第 3,773,919號)、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸鹽(leuprolide acetate)組成的可注射微球體)、蔗糖乙酸酯異丁酸酯及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用於活體內投藥的調配物必須無菌。此容易藉由例如無菌過濾膜過濾達成。治療性EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物組合物通常置放於具有無菌接取孔之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶。
根據本發明之組合物可呈單位劑型，諸如錠劑、藥丸、膠囊、散劑、顆粒、溶液或懸浮液，或栓劑，用於經口、非經腸或直腸投與，或藉由吸入或吹入投與。
製備諸如錠劑之固體組合物時，將主要活性成分與醫藥載劑混合，例如習知製錠成分，諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠，及其他醫藥稀釋劑，例如水，從而形成含有本發明化合物或其醫藥學上可接受之無毒鹽之均勻混合物的固體預調配組合物。當稱此等預調配組合物為均勻時，意謂活性成分均勻地分散於整個組合物中，使得組合物容易再分成同等有效的單位劑型，諸如錠劑、藥丸及膠囊。接著將此固體預調配組合物再分成含有0.1至約500mg本發明活性成分之上述類型之單位劑型。新穎組合物之錠劑或藥丸可包覆包衣或以其他方式混配，以提供具有作用時間延長之優點的劑型。舉例而言，錠劑或藥丸可包括內部劑量及外部劑量組分，後者呈覆蓋於前者上之被膜形式。兩種可藉由腸衣分隔，腸衣用來抵抗崩解於胃中且允許內部組分完整傳遞至十二指腸中或延遲釋放。此等腸衣或包衣中可使用多種材料，此等材料包括多種聚合酸，及聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇及纖維素乙酸酯之材料之混合物。
適合的表面活性劑尤其包括非離子型劑，諸如聚氧乙烯去水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他去水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑之組合物宜包括0.05與5%之間(且可在0.1與2.5%之間)的表面活性劑。應瞭解，必要時可添加其他成分，例如甘露糖醇或醫藥學上可接受之其他媒劑。
適合乳液可使用市售脂肪乳液製備，諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。可將活性成分溶於預混合的乳液組合物中，或可將其溶於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中且在與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合時形成乳液。應瞭解，可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳液張力。適合乳液典型地含有至多20%油，例如5%與20%之間的油。脂肪乳液可包括0.1μm與1.0μm之間、尤其0.1μm與0.5μm之間的脂肪滴，且具有5.5至8.0範圍內之pH。
乳液組合物可為藉由將EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物與INTRALIPIDTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合而製備的彼等物。
用於吸入或吹入的組合物包括存於醫藥學上可接受之水性或有機溶劑中的溶液及懸浮液，或其混合物，及散劑。液體或固體組合物可含有如上文所述之適合的醫藥學上可接受之賦形劑。在本發明之一些態樣中，組合物係藉由經口或鼻呼吸途徑投與以達成局部或全身性作用。組合物、較佳存於醫藥學上可接受之無菌溶劑中之組合物，可使用氣體霧化。霧化溶液可直接自霧化裝置呼吸或可將霧化裝置附接至面罩、塞條或間歇性正壓呼吸機。溶液、懸浮液或散劑組合物可自以適當方式遞送調配物之裝置、較佳經口或鼻投與。
本發明亦提供用於本發明方法中的套組。本發明之套組包括如 本文所述之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物及根據本文所述之任一種本發明方法使用的說明書。一般而言，此等說明書包括EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物用於上述治療性治療的投藥說明。
關於如本文所述之EFNA4抗體或EFNA4抗體結合物之使用的說明書通常包括關於劑量、給藥時程及針對指定療法之投藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、批量包裝(例如多劑量包裝)或亞單位劑量。本發明套組中所提供典型地為標籤或藥品說明書(例如包括於套組中之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁性或光學儲存碟上攜帶之說明書)亦可接受。
本發明套組存於適合包裝中。適合包裝包括(但不限於)小瓶、瓶、罐、撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋與特定裝置(諸如吸入器、鼻投藥裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵))組合使用的包裝。套組可具有無菌接取孔(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。容器亦可具有無菌接取孔(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物。容器可進一步包括第二醫藥活性劑。
套組視情況可提供其他組分，諸如緩衝液，及說明性資訊。通常，套組包括容器及附於容器上或與容器結合的標籤或藥品說明書。
IV.E.劑量及投藥
在活體外及活體內應用中，EFNA4抗體-藥物結合物係以有效劑量提供或投與。在臨床背景下，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接地達成預防性或治療性治療的量。有效劑量可以一或多次投藥投與。藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或可不聯合另一種藥物、化合物或醫藥組合物達成。因此，「有效劑量」可在投與一或多種治療劑之背景下考慮，且單一藥劑若聯合一或多種其 他藥劑可達成或達成所要結果，可考慮以有效量給與。使用所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物偵測EFNA陽性細胞時，向個體投與可偵測量之本發明組合物，亦即結合物劑量使得可活體外或活體內測定結合物之存在。
舉例而言，當投與患有癌症之個體時，有效量包括足以引發抗癌活性的量，包括將癌細胞溶胞、抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞發生細胞凋亡、減少癌細胞抗原、延遲腫瘤生長及/或抑制轉移。腫瘤縮小已充分認可為臨床上替代之功效標記。另一種充分認可之功效標記為無進展存活。EFNA4抗體-藥物結合物之關鍵功效參數通常顯示至少25%改良，諸如中值存活率、腫瘤進展時間及總體反應率之改良。
EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可經由任何適合途徑投與個體。熟習此項技術者應瞭解，本文所述實例不欲具有限制性，而是說明可利用之技術。因此，在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體或EFNA4抗體結合物係根據已知方法投與個體，諸如靜脈內投藥，例如作為丸劑，或藉由在一段時期內連續輸注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、顱內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內，經由吹入、鞘內、經口、吸入或局部途徑。投藥可為全身性的例如靜脈內投藥，或局部性的。用於液體調配物的市售霧化器(包括噴射霧化器及超音波霧化器)適用於投藥。液體調配物可直接霧化且凍乾粉末可在復原之後霧化。或者，EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可使用氟烴調配物及定量吸入器霧化，或以凍乾及研磨粉末形式吸入。
在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物係經由位點特異性或靶向局部遞送技術投與。位點特異性或靶向局部遞送技術之實例包括EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之各種可植入儲槽源或局部遞送導管，諸如輸注導管、留置導管或針管、合成移植物、外膜套、分流器及血管內支架或其他可植入裝置、位點特異 性載體、直接注射或直接施藥。參見例如PCT國際公開案第WO 2000/53211號及美國專利第5,981,568號。
如本文所述之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可使用任何適合方法投與，包括注射(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌內等)。EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物亦可經由吸入投與，如本文所述。一般而言，投與EFNA4抗體及EFNA4抗體-藥物結合物時，初始候選劑量可為約2mg/kg。為了本發明起見，典型日劑量的範圍可為約3μg/kg至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或大於100mg/kg中之任一者，此視上述因素而定。舉例而言，可使用約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg及約25mg/kg之劑量。重複投與多日或更長時間時，視病症而定，持續治療直至症狀達成所要抑制或直至達成足夠治療水準，例如抑制或延遲腫瘤生長/進展或癌細胞轉移。例示性給藥方案包括投與約2mg/kg初始劑量，隨後為每週約1mg/kg維持劑量之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物，或隨後為每隔一週約1mg/kg之維持劑量。其他例示性給藥方案包括投與遞增劑量(例如初始劑量為1mg/kg且逐漸增加至每週或更長時段一或多個較高劑量)。亦可使用其他給藥方案，此視從業者希望達成之藥物動力學衰減模式而定。舉例而言，在本發明之一些態樣中，涵蓋一週一至四次之給藥。在其他態樣中，涵蓋一月一次或隔月或每三個月一次給藥，以及每週、每兩週及每三週給藥。此療法之進展容易利用習知技術及分析加以監測。給藥方案(包括所用EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物)可隨時間改變。
為了本發明起見，EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之適當劑量將視以下而定：所用EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物(或其組合物)、所治療之症狀類型及嚴重程度、投與藥劑是否用於治療目的、先前療法、患者臨床歷史及對藥劑之反應、所投藥劑在患者中之 清除率及主治醫師之判斷。臨床醫師可投與EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物直至達到完成所要結果及超過所要結果的劑量。劑量及/或頻率可在治療過程中改變，但亦可保持恆定。經驗性考慮，諸如半衰期，通常將有助於確定劑量。舉例而言，與人類免疫系統相容的抗體，諸如人類化抗體或完全人類抗體，可用於延長抗體半衰期及阻止宿主免疫系統攻擊抗體。投藥頻率可在治療過程中確定及調節，且通常(但不必定)根據症狀之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲，例如腫瘤生長抑制或延遲等。或者，EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之持續連續釋放型調配物可為適當的。用於達成持續釋放的各種調配物及裝置在此項技術中已知。
在本發明之一些態樣中，EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物對於已一或多次投與EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之個體而言可憑經驗確定。向個體給與遞增劑量之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物。為了評估功效，可依據病症之指標。
根據本發明方法投與EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可為連續的或間歇的，此視例如以下因素而定：接受者之生理性病症、投藥目的是否為治療或預防，及熟練從業者已知的其他因素。投與EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可在預選時段期間為基本上連續的或可為一系列間隔劑量。
IV.F.組合療法
在本發明之一些態樣中，本文所述方法進一步包括用其他治療形式治療個體的步驟。在一些態樣中，其他治療形式為另一抗癌療法，包括(但不限於)化學療法、輻射、手術、激素療法及/或其他免疫療法。
所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物可作為初始療法投與，或用於治療對習知療法無反應的病症。另外，EFNA4抗體-藥物結合物可與 其他療法(例如手術切除、輻射、其他抗癌藥物等)組合使用，藉此引發相加或強化治療作用及/或降低一些抗癌劑之肝細胞毒性。本發明之EFNA4抗體-藥物結合物可與其他藥劑共投與或共調配，或經調配而可與其他藥劑以任何次序連續投與。
適用於組合療法的代表性藥劑包括上文在子標題「藥物」下描述為適用於製備EFNA4抗體-藥物結合物之任一種藥物。本發明之EFNA4抗體-藥物結合物亦可與其他治療性抗體及抗體-藥物結合物組合使用，包括除所揭示之抗EFNA抗體之外的抗EFNA抗體，以及靶向不同抗原的抗體及結合物。可單獨使用或作為抗體-藥物結合物使用的代表性抗體包括抗5T4抗體(例如A1、A2及A3)、抗-CD19抗體、抗CD20抗體(例如RITUXAN®、ZEVALIN®、BEXXAR®)、抗CD22抗體、抗CD33抗體(例如MYLOTARG®)、抗CD33抗體-藥物結合物、抗路易斯Y抗體(例如Hu3S193、Mthu3S193、AGmthu3S193)、抗HER-2抗體(例如HERCEPTIN®(曲妥珠單抗(trastuzumab))、MDX-210、OMNITARG.RTM.(帕妥珠單抗(pertuzumab)、rhuMAb 2C4))、抗CD52抗體(例如CAMPATH®)、抗EGFR抗體(例如ERBITUX®(西妥昔單抗(cetuximab))、ABX-EGF(盤尼圖單抗(panitumumab))、抗VEGF抗體(例如AVASTIN®(貝伐株單抗(bevacizumab)))、抗DNA/組蛋白複合物抗體(例如ch-TNT-1/b)、抗CEA抗體(例如CEA-Cide、YMB-1003)hLM609、抗CD47抗體(例如6H9)、抗VEGFR2(或含有激酶插入域之受體KDR)抗體(例如IMC-1C11)、抗Ep-CAM抗體(例如ING-1)、抗FAP抗體(例如西羅珠單抗(sibrotuzumab))、抗DR4抗體(例如TRAIL-R)、抗孕激素受體抗體(例如2C5)、抗CA19.9抗體(例如GIVAREX®)及抗纖維蛋白抗體(例如MH-1)。
所揭示之EFNA4抗體-藥物結合物亦可連同作為治療方案一部分之細胞毒性劑之一或多種組合一起投與。適用於此目的之細胞毒性製 劑包括CHOPP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)；CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼松)；COP(環磷醯胺、長春新鹼、潑尼松)；CAP-BOP(環磷醯胺、小紅莓、丙卡巴肼、博萊黴素、長春新鹼及潑尼松)；m-BACOD(甲胺喋呤、博萊黴素、小紅莓、環磷醯胺、長春新鹼、地塞米松及亞葉酸)；ProMACE-MOPP(潑尼松、甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、依託泊苷、亞葉酸、二氯甲二乙胺、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(潑尼松、甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、依託泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博萊黴素及長春新鹼)；MACOP-B(甲胺喋呤、小紅莓、環磷醯胺、長春新鹼、潑尼松、博萊黴素及亞葉酸)；MOPP(二氯甲二乙胺、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)；ABVD(阿黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼及達卡巴嗪)；MOPP(二氯甲二乙胺、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)與ABV(阿黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼)交替；MOPP(二氯甲二乙胺、長春新鹼、潑尼松及丙卡巴肼)與ABVD(阿黴素/小紅莓、博萊黴素、長春鹼及達卡巴嗪)交替；ChIVPP(苯丁酸氮芥、長春鹼、丙卡巴肼、潑尼松)；IMVP-16(異環磷醯胺、甲胺喋呤、依託泊苷)；MIME(丙咪腙(methyl-gag)、異環磷醯胺、甲胺喋呤、依託泊苷)；DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷及順鉑)；ESHAP(依託泊苷、甲潑尼龍、HD阿糖胞苷及順鉑)；CEPP(B)(環磷醯胺、依託泊苷、丙卡巴肼、潑尼松及博萊黴素)；CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷及潑尼松)；及CVP-1(環磷醯胺、長春新鹼及潑尼松)；DHAP(順鉑、高劑量阿糖胞苷及地塞米松)；CAP(環磷醯胺、小紅莓、順鉑)；PV(順鉑、長春鹼或長春地辛)；CE(卡鉑、依託泊苷)；EP(依託泊苷、順鉑)；MVP(絲裂黴素、長春鹼或長春地辛、順鉑)；PFL(順鉑、5-氟尿嘧啶、亞葉酸)；IM(異環磷醯胺、絲裂黴素)；IE(異環磷醯胺、依託泊苷)；IP(異環磷醯胺、順鉑)；MIP(絲 裂黴素、異環磷醯胺、順鉑)；ICE(異環磷醯胺、卡鉑、依託泊苷)；PIE(順鉑、異環磷醯胺、依託泊苷)；長春瑞賓及順鉑；卡鉑及太平洋紫杉醇；CAV(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼)；CAE(環磷醯胺、小紅莓、依託泊苷)；CAVE(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼、依託泊苷)；EP(依託泊苷、順鉑)；及CMCcV(環磷醯胺、甲胺喋呤、洛莫司汀、長春新鹼)。
EFNA4抗體-藥物結合物可與全身性抗癌藥物組合使用，諸如帕土匹龍(epithilones)(BMS-247550、Epo-906)、紫杉烷之重調配物(Abraxane，Xyotax)、微管蛋白抑制劑(MST-997、TTI-237)，或與所靶向之細胞毒素(諸如CMD-193及SGN-15)組合使用。其他有用的抗癌劑包括TAXOTERE®、TARCEVA®、GEMZAR®(吉西他濱)、5-FU、AVASTIN®、ERBITUX®、TROVAX®、馬安那莫單抗(anatumomab mafenatox)、來曲唑(letrazole)、歐洲紫杉醇及蒽環黴素。
在組合療法中，EFNA4抗體-藥物結合物及/或一或多種其他治療劑或診斷劑係在適於執行指定療法或診斷的任何時間範圍內投與。因此，單一藥劑可實質上同時投與(亦即作為單一調配物或在數分鐘或數小時內)或以任何次序連續投與。舉例而言，單一藥劑療法可在彼此間約1年內投與，諸如在約10、8、6、4或2個月內，或在4、3、2或1週內，或在約5、4、3、2或1天內。EFNA4抗體-藥物結合物與第二治療劑組合投與較佳引起比任一者單獨投與更大的作用。
在本發明之一些態樣中，其他治療形式包括投與一或多種除如本文所述之EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物之外的治療劑。治療劑包括(但不限於)第二抗體(例如抗VEGF抗體、抗HER2抗體、抗CD25抗體及/或抗CD20抗體)、血管生成抑制劑、細胞毒性劑、消炎劑(例如太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、順鉑、小紅莓、潑尼松、絲裂黴素、孕酮、他莫昔芬或氟尿嘧啶)。
在本發明之一些態樣中，可存在超過一種EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物。可存在至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同或五種以上EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物。一般而言，彼等EFNA4抗體或EFNA4抗體-藥物結合物可具有彼此間無不利影響的互補活性。舉例而言，可使用一或多種以下EFNA4抗體：針對EFNA4上之一種抗原決定基的第一EFNA4抗體及針對EFNA4上之不同抗原決定基的第二EFNA4抗體。
所揭示之組合療法可引起協同治療性作用，亦即作用大於其個別作用或治療性結果之總和。可量測的治療性結果描述於本文中。舉例而言，協同治療性作用可為單一藥劑所引起之治療性作用或指定組合中之單一藥劑所引起之治療性作用之總和之至少約兩倍大的作用，或至少約五倍大，或至少約十倍大，或至少約二十倍大，或至少約五十倍大，或至少約一百倍大。協同治療性作用亦可觀測為治療性作用比單一藥劑所引起之治療性作用或指定組合中之單一藥劑所引起之治療性作用之總和增加至少10%，或至少20%，或至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少100%，或大於100%。協同作用亦為當其組合使用時允許治療劑劑量降低的作用。
除非另外說明，否則如實施方式中通篇所用，術語「約」意謂繼術語「約」後之值之值+/- 1%。
實例
以下實例僅為說明性目的而提供，且不希望以任何方式限制本發明之範疇。實際上，熟習此項技術者根據上述說明將顯而易知除本文所示及所述內容之外的本發明各種修飾且該等修飾屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
實例1 產生抗EFNA4抗體
如國際公開案第WO2012/118547號中所述，藉由接種過度表現EFNA4之hEFNA4-ECD-Fc、hEFNA4-ECD-His、全細胞BALB/c 3T3細胞或如本文所述製備之血漿製劑(ECD胞外域)來產生EFNA4鼠科抗體。免疫原皆使用市售起始物質(例如重組人類蝶素-A4 Fc嵌合體，CF R & D systems #369-EA-200)及/或熟習此項技術者熟知的技術製備。
EFNA4鼠科抗體係藉雌性小鼠(Balb/c，CD-I，FVB)經EFNA4抗原之各種製劑免疫而產生。免疫原包括Fc構築體或經His標記之人類EFNA4、自107個過度表現EFNA4 293之細胞提取的膜部分，或表面上過度表現人類EFNA4之完整3T3細胞。小鼠皆經由足墊注射途徑免疫。使用經等體積TITERMAX或礬佐劑乳化的10μg EFNA4免疫原或1×106個細胞或細胞等效物進行免疫接種。免疫接種小鼠無痛處死之後，將引流淋巴結(膝後彎及腹股溝，若放大)剖開且用作抗體產生細胞之來源。藉由使用組織研磨器機械破碎淋巴結來釋放淋巴細胞。
使用兩種融合方案之一。第一次電融合使用Genetronic裝置進行，隨後接種及篩選多株融合瘤，隨後次選殖，產生單株融合瘤。第二次電融合使用BTX儀器進行，隨後為融合瘤文庫之批量生長及融合瘤之單一細胞沈積，隨後篩選純系。
Genetronic裝置融合方案：融合如下進行：將B細胞之單一細胞懸浮液與購自(ATCC CRL-1580；Kearney等人，J.Immunol.123：1548-1550(1979))之非分泌P3x63Ag8.653骨髓瘤細胞以1：1比率混合。藉由800g離心將細胞混合物輕緩地離心。完全移除上清液之後，用2-4mL鏈黴蛋白酶溶液處理細胞不超過2分鐘。使用型號ECM2001融合產生器(Genetronic,Inc.)進行電融合。將細胞以2×104個/孔接種於平底微量滴定盤中，隨後在HAT培養基(Sigma,CRL P-7185)中培育兩週。接 著藉由ELISA及FACS篩選個別孔中之抗人類EFNA4單株IgG抗體。
來自經轉染之293細胞之經純化重組EFNA4 His融合蛋白於碳酸鹽緩衝液中以每孔100ng塗佈ELISA微量滴定盤。滴定盤在4℃培育隔夜，隨後用每孔200μl含有3% BSA之PBS/Tween(0.05%)阻斷。將來自融合瘤盤之上清液添加至各孔中且在周圍溫度下培育1至2小時。盤用PBS/Tween洗滌，接著和山羊抗小鼠IgG特異性Fc片段與辣根過氧化酶(HRP)之結合物(Jackson ImmunoResearch))一起在室溫下培育一小時。洗滌之後，盤用TMB受質(Thermo Scientific 34028)顯色且藉由分光光度計在OD 450分析。
藉由有限稀釋或單一細胞FACS分選對陽性孔中之EFNA4分泌性融合瘤進行再篩選及次選殖。使用有限稀釋接種對所選抗原陽性孔進行次選殖。目測檢查盤中單一群落生長之存在，接著藉由上述抗原特異性ELISA及如下文所述之FACS驗證法來篩選來自單一群落孔之上清液。擴增所得純系群且在冷凍介質(90% FBS、10% DMSO)中低溫保存且在液氮中儲存。來自EFNA4免疫小鼠的此融合體產生鼠科單株抗體，此等單株抗體使用上述ELISA方案對EFNA4具有反應性。
BTX儀器融合方案：藉由電融合將B細胞之單一細胞懸浮液與非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤細胞以1：1比率融合。使用Hybrimune系統型號47-0300(BTX Harvard Apparatus)進行電融合。所融合細胞再懸浮於補充有偶氮絲胺酸之融合瘤選擇培養基(Sigma #A9666)(DMEM(Cellgro cat#15-017-CM)培養基)中，該培養基含有15%胎兒純系I血清(Hyclone)、10% BM Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM丙酮酸鈉、4mM L-麩胺醯胺、100 IU青黴素-鏈黴素、50μM 2-巰基乙醇及100μM次黃嘌呤)；接著於每個燒瓶90ml選擇培養基中接種於四個T225燒瓶中。接著將燒瓶置放於含有5% CO2及95%空氣的37℃增濕恆溫箱中維持6至7天。
生長6至7天時，使用Aria I細胞分選儀將文庫以每孔1個細胞接種於48個Falcon U型底96孔盤中。簡言之，將含有15%胎兒純系I血清(Hyclone)、10% BM-Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM丙酮酸鈉、4mM L-麩胺醯胺、100 IU青黴素-鏈黴素、50μM 2-巰基乙醇及100μM次黃嘌呤的培養基以每孔200ul接種於48個Falcon U型底96孔盤中。使用Aria I細胞分選儀每孔置放1個活融合瘤細胞且培養10至11天且藉由FACS或ELISA分析上清液中對EFNA4具有反應性的抗體。
使用類似於上述的ELISA分析，根據鼠科EFNA4特異性篩選分泌小鼠免疫球蛋白地生長陽性融合瘤孔。簡言之，96孔盤(VWR，610744)在4℃用含有1μg/mL鼠科EFNA4-His之碳酸鈉緩衝液塗鋪隔夜。洗滌各盤且用2% FCS-PBS在37℃阻斷一小時且立即使用或在4℃下維持。未稀釋的融合瘤上清液在室溫下、在盤上培育一小時。洗滌各盤且在室溫下用經HRP標記之山羊抗小鼠IgG(於1% BSA-PBS中1：10,000稀釋)探測一小時。各盤接著與如上文所述之受質溶液一起培育且在OD 450讀取。以高親和力結合人類EFNA4之例示性鼠科抗體E2、E5、E8、E15、E22、E31、E47、E60、E73、E76、E91及E105之胺基酸序列及相關核酸序列(CDR加有下劃線)提供於國際公開案第WO2012/118547號中。
本發明之各種鼠科抗EFNA4抗體之結合特徵顯示於表3中。抗體展現奈莫耳濃度範圍內之相對較高親和力且結合至EFNA4蛋白質上之三個不同分區及抗原決定基。大部分抗EFNA4抗體僅與其中二硫鍵完整(NR)的抗原反應，而E22及E91與非還原及還原之抗原(NR/R)均反應。E22及E91分別識別序列QRFTPFSLGFE(SEQ ID NO：137)及RLLRGDAVVE(SEQ ID NO：138)。此外，E5、E15、E91及E105與小鼠EFNA4交叉反應且所有抗體均與高度相似的食蟹猴EFNA4交叉反 應。亦提供抗體中和(亦即阻斷受體配位體相互作用，特定而言，EFNA4-EphA2)及/或內化的能力，以及殺死細胞的能力。
B Biacore親和力；F ForteBIO內部比較；ND：未測定
實例2 抗EFNA4抗體之人類化
如國際公開案第WO2012/118547號中進一步所述，使用互補決定區(CDR)移植對實例1之四種鼠科抗體進行人類化。根據相對於人類功能生殖系基因的序列及結構相似性來選擇人類重鏈及輕鏈構架。藉由對小鼠典型CDR結構與具有相同典型結構之人類候選CDR進行比較來評估結構相似性，如Chothia等人(同上)中所述。
更特定而言，使用計算機輔助CDR移植方法(Abysis資料庫，UCL Business Pic.)及標準分子工程技術對鼠科抗體E5、E15、E22及E47進行人類化，分別產生人類化抗體E5、E15、E22及E47，下文中稱為huE5、huE15、huE22及huE47。可變區之人類構架區係根據其與小鼠構架序列及其典型結構之最高序列同源性來選擇。為了分析起見，胺基酸於各CDR域之分配係根據Kabat等人之編號法進行。製備若干人類化抗體變異體以便產生最佳人類化抗體，人類化抗體通常保 留來自小鼠融合瘤之抗原結合互補決定區(CDR)與人類構架區之結合。huE15、huE22及huE47 mAb結合至EFNA4抗原的親和力與其鼠科對應物相似且huE5結合的親和力稍微較低，如使用Biacore系統所量測。
使用此項技術認可之技術進行分子工程程序。根據製造商方案(Trizol® Plus RNA純化系統，Life Technologies)自融合瘤提取總mRNA。包括三十二個特定5'前導序列引子之引子混合物(設計成靶向完整的小鼠譜系)與3'小鼠Cγ1引子組合使用，以對抗體重鏈可變區進行擴增及定序。類似地，為擴增各Vk小鼠家族所設計之三十二個5'Vk前導序列引子混合物與對小鼠κ恆定區具有特異性之單一反向引子組合使用，以對κ輕鏈進行擴增及定序。利用逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，自100ng總RNA擴增VH及VL轉錄物。
對各融合瘤運作總共八次RT-PCR反應：四次針對Vκ輕鏈且四次針對Vγ重鏈(γ1)。使用QIAGEN單步RT-PCR套組進行擴增(Qiagen,Inc.)。所提取之PCR產物使用特定V區引子直接定序。使用IMGT分析核苷酸序列，以鑑定具有最高序列同源性的生殖系V、D及J基因成員。對所得序列與Ig V區及J區之已知生殖系DNA序列進行比較，已知生殖系DNA序列係經由VBASE2資料庫(Retter等人，同上)之分析及藉由VH及VL基因與小鼠生殖系資料庫之比對而獲得。
根據核苷酸序列資訊，獲得關於E5、E15、E22及E47之重鏈及輕鏈之V、D及J基因區段的資料。根據序列資料，設計對抗體之Ig VH及VK鏈之前導序列具有特異性的新引子群，用於選殖重組單株抗體。隨後，對V-(D)-J序列與小鼠Ig生殖系序列進行比對。
鑑定E5、E15、E22及E47之重鏈及輕鏈基因且結果總結於下表4中。
表4
將獲自所有四種純系之重鏈及輕鏈序列與人類功能可變區序列進行比對且根據同源性及典型結構進行檢查。重鏈及輕鏈分析結果分別顯示於下文表5及表6中。
生殖系選擇及CDR移植方法似乎可提供通常保留其結合特徵之抗體，大部分構築體中很少需要插入鼠科殘基。然而，在huE15中，重鏈殘基68自Thr(T)回復突變為Lys(K)以改良抗體特徵。
huE5、huE15、huE22及huE47之胺基酸序列及相關核酸序列如上顯示於上述表2中。huE5、huE15、huE22及huE47之VH區胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：39中，相應核酸序列闡述於SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：40中。huE5、huE15、huE22及huE47之κVL區胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：53中，相應核酸序列闡述於SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：54中。
實例3 人類化抗EFNA4抗體之表現
使用此項技術認可之技術及國際公開案第WO2012/118547號中所述之技術表現及分離抗EFNA4抗體huE5、huE15、huE22及huE47。為此，將兩個重鏈之人類化可變DNA合成片段(Integrated DNA Technologies)選殖於人類IgG1表現載體中。將可變輕鏈片段選殖於人類C-κ表現載體中。藉由將重鏈及輕鏈共轉染至CHO細胞中來表現抗體。
更特定而言，為了產生抗體，將鼠科及人類化可變基因PCR產物定向選殖於人類免疫球蛋白表現載體中。Ig基因特異性PCR中所用的全部引子包括限制性位點(對於IgH而言為Agel及Xhol，對於IgK而言為Xmal及Dralll，其允許定向選殖於分別含有人類IgG1及IGK恆定區的表現載體中)。簡言之，使用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen,Inc.)純化PCR產物，隨後分別用Agel及Xhol(IgH)、Xmal及Dralll(IgK)消化。將經消化之PCR產物在連接於表現載體中之前進行純化。以10μL總體積進行連接反應，總體積含有200U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5μL經消化及純化之基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA。使用3μL連接產物、在42℃經由熱衝擊將勝任大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)轉型且接種於胺苄西林(ampicillin)盤(100μg/mL)上。接著將VH區之Agel-EcoRI片段插入pEE6.4HuIgG1表現載體之相同位點中，而將合成Xmal-Dralll Vκ插入序列選殖於相應pEE12.4Hu-κ表現載體之Xmal-Dralll位點中。
藉由使用293fectin將適當質體轉染於HEK 293細胞中來產生人類化抗體產生細胞。使用QIAprep Spin管柱(Qiagen)純化質體DNA。人類胚腎(HEK)293T(ATCC編號CRL-1 1268)細胞於補充有10%熱不活化FCS、100μg/mL鏈黴素、100μg/mL青黴素G(全部得自Life Technologies)之杜貝科氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中、於150mm盤(Falcon,Becton Dickinson)中、在標準條件下培養。
為了短暫轉染，使細胞生長至80%匯合。將等量的IgH及相應IgL鏈載體DNA(12.5μg各載體DNA)添加至1.5mL Opti-MEM與含50μL HEK 293轉染試劑之1.5mL opti-MEM的混合物中。混合物在室溫下培育30分鐘且均勻地分佈於培養盤中。轉染之後第三天收穫上清液，用20mL補充有10% FBS之新鮮DMEM置換，且在轉染之後第6天再次收穫上清液。藉由800xg離心10分鐘將培養物上清液中的細胞碎片清除且在4℃儲存。使用蛋白質G珠粒(GE Healthcare)純化重組嵌合及人類化抗體。
實例4 抗EFNA4抗體之結合特性
如國際公開案第WO2012/118547號中所述，本發明之E15、E22及E47抗體之結合特徵顯示於表7中。
使用ELISA測定其他特性，以分析抗EFNA4抗體huE22及huE47對蝶素-A4(EFNA4)以及同源家族成員蝶素-A1(EFNA1)及蝶素-A3(EFNA3)的結合特異性。藉由對在4℃塗佈於BioOne Microlon(Greiner)盤上隔夜之含於PBS中之蝶素-A1-His、蝶素-A3-huFc、蝶素-A4-huFc及蝶素-A5-huFc(全部得自R & D)進行定向ELISA來測定抗體結合。經生物素標記之huE22及huE47在盤上、在室溫下培育2.5小時且在干擾性人類IgG信號不存在下使用抗生蛋白鏈菌素HRP顯現來 自經生物素標記之抗體的信號。圖3A中所示資料顯示huE22結合至EFNA4，但不結合至EFNA1、EFNA3或EFNA5。圖3B中所示之資料顯示huE47結合至EFNA4，但不結合至EFNA1或EFNA3。
藉由流式細胞術評估表現EFNA4之細胞上之人類化抗EFNA4抗體huE22及huE47之結合。使用TrpLE Express(GIBCO目錄號12604-021)解離黏附細胞，用細胞培養基中和且計數。細胞以每孔每100μL培養基5x10e5個細胞接種於U型底96孔盤(BD Falcon目錄號#353077)中。培養盤在4℃以300xg離心5分鐘且丟棄上清液。所有試劑在冰上保持用於以下步驟。將各離心塊再懸浮於100μL含有10μg/mL人類化抗EFNA4一次抗體(huE22或huE47)或陰性對照抗體之3% BSA/PBS中。培養盤在冰上培育30分鐘。將培養盤離心且細胞離心塊用200μL 3% BSA/PBS洗滌。將各細胞離心塊再懸浮於100μL已於3% BSA/PBS中1：50稀釋之R-藻紅素(PE)與山羊抗人類IgG Fc片段結合物(Jackson ImmunoResearch，目錄號#109-115-098)中。培養盤在冰上培育30分鐘。將培養盤離心且細胞離心塊用200μL 3% BSA/PBS洗滌。將各離心塊再懸浮於100μL 3% BSA/PBS中且轉移至含有250μL 3% BSA/PBS之5mL聚碳酸酯管(BD Falcon目錄號#352054)中。每個樣品使用5μL 7AAD(B-D Pharmingen目錄號#51-68981E)作為存活力染料、藉由流式細胞術分析樣品。
以上文針對HEK293T親本細胞及HEK293T-EFNA4細胞所述之方式量測抗體結合，該等HEK293T親本細胞表現EFNA4之量極低，且該等HEK293T-EFNA4細胞為HEK293T經實現人類EFNA4高度表現之載體穩定轉染的細胞。表8顯示抗體結合至表現EFNA4之細胞株之平均通道螢光(MCF)。huE22及huE47抗體藉由強烈結合至過度表現HEK293T-EFNA4之細胞、而非HEK293T親本細胞而顯示針對EFNA4標靶之特異性。
分析表現內源性EFNA4之癌細胞株：乳癌細胞株BT-483、HCC202及MX-1、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞株MEC1及套細胞淋巴瘤(MCL)細胞株Z138。表9中所示之MCF值顯示抗EFNA4抗體huE22及huE47能夠結合具有抗原之內源性表現的各種癌細胞株。
實例5 抗EFNA4抗體之內化及活體外細胞毒性
在功能分析中評估huE22之內化，其中將細胞與一次抗體及與肥皂草素毒素結合之二次抗體(抗原結合片段Fab)一起培育。將細胞接種於96孔盤中，培育隔夜，接著暴露於huE22或人類IgG1對照抗體之劑量反應四天，各抗體具有與肥皂草素結合之抗人類Fab片段(Advanced Targeting Systems目錄號IT-51)，二次抗體：一次抗體之莫耳比為1.5：1。接著使用MTS分析(Promega目錄號G5430)量測細胞存活率且經由GraphPad Prism軟體、利用邏輯非線性回歸法計算相對於未處理細胞將細胞存活率抑制50%的一次抗體濃度(IC50)。
當一次抗體(諸如huE22)內化至靶細胞中且攜載肥皂草素與Fab片 段之結合物進入細胞時，達成細胞毒性。如表10中所示，huE22賦予HEK293T-EFNA4細胞之經肥皂草素介導之細胞毒性特異性為HEK293T親本細胞的約60倍，而對照一次抗體對任一細胞株均未賦予顯著細胞毒性。HEK293T親本細胞低量表現EFNA4可能導致huE22產生低於對照抗體的IC50值。此等結果顯示huE22抗體以標靶依賴性方式內化至細胞中。
實例6 抗EFNA4-AcBut-CM抗體-藥物結合物之結合及純化 A.結合
在本發明中，使抗EFNA4抗體huE22及huE47與如圖4A中所示之AcBut-N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(AcBut-CM)OSu酯結合，以產生如圖4B中所示之huE22-AcBut-CM ADC及huE47-AcBut-CM ADC，其中X可為任何抗體，諸如huE22及huE47。使AcBut-CM與抗EFNA4抗體經由離胺酸殘基結合，以產生藥物與抗體比率(DAR)分佈窄的抗EFNA4-AcBut-CM ADC，其中約70%至80% ADC具有3與5之間之DAR，及約3至5範圍內之平均DAR。
用於產生huE22-AcBut-CM之結合反應混合物包括10mg/mL或小於10mg/mL之純化huE22抗體及AcBut-CM OSu酯，其莫耳比為4-4.5：1。在添加AcBut-CM至混合渦旋物中期間進行高速攪拌。反應物pH為8.3且其他反應組分濃度如下：180mM HEPES緩衝液、41mM癸酸鈉及8%(v/v)乙醇。反應物在33℃進行5分鐘。完成結合反應之後，在混合下，用1.3體積之1M K2HPO4(調節至pH 8.5)緩慢稀釋反應混 合物。使用類似反應混合物產生huE47-AcBut-CM ADC。
B.純化
為了純化，將如上稀釋的反應混合物分兩批裝載於丁基瓊脂糖-4速流HIC管柱(GE Healthcare)上，該管柱預先經五個管柱體積(cv)之0.52M磷酸鉀緩衝液pH 8.5平衡，如圖5中所示(頂線280nm及底線310nm)。裝載於管柱上之蛋白質為每毫升柱床體積3.5mg。通過樣品負載之流量為每分鐘15ml且通過層析之洗滌段及溶離段的流量為每分鐘22ml。此改良之梯度移除結合至管柱之較高DAR ADC。
在裝載期間未結合的溶離份主要為反應試劑及大部分未結合抗體，將此等反應試劑及大部分未結合抗體丟棄。接著用0.3cv之0.52M磷酸鉀緩衝液pH 8.5洗滌管柱，以移除任何剩餘試劑。使用1cv 0.52M至0.4M磷酸鉀緩衝液(pH 8.5)之分步梯度溶離任何鬆散接合之未結合抗體以及負載量較低之抗EFNA4-AcBut-CM(若存在)。接著使用1cv 0.4M至5mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.5)之分步梯度溶離主要溶離份，接近梯度結束時得到具有DAR 3至5之huE22-AcBut-CM。若存在具有較高DAR之huE22-AcBut-CM結合物，則溶離份使用2cv 5mM磷酸鉀緩衝液(pH 8.5)之梯度溶離，接著用純去離子水溶離。去離子水溶離之後保持結合之具有較高DAR的任何huE22-AcBut-CM結合物係使用2cv含有10mM氫氧化鈉之20%乙醇溶離。
使用毛細管等電聚焦(cIEF；iCE280，ProteinSimple)純化的各批huE22-ActBut-CM ADC具有窄DAR分佈，其中約70%至80%、較佳約75%至80% ADC具有DAR 3至5。舉例而言，圖9顯示經純化之各批huE22-ActBut-CM ADC具有窄DAR分佈，其中約78% ADC具有DAR 3至5。藉由UV光譜法在280nm及310nm量測吸光度來測定DAR。
此外，經純化之各批huE22-ActBut-CM ADC具有約3至約5範圍內之平均DAR。舉例而言，經純化之各批huE22-ActBut-CM ADC具有約 4之平均DAR，且更特定而言，平均DAR為約4.6。
經改良之此結合及純化方法產生DAR小於6且在一些態樣中在3至5範圍內的ADC。此外，該等方法產生較窄的負載分佈，例如產物內較小之異質性。結合及純化方法之改良進一步包括：1)將AcBut-CM與huE22比率降低至4-4.5：1，以產生具有較低DAR之ADC；2)在AcBut-CM添加至huE22中期間進行高速攪拌，以產生未結合抗體(游離抗體)量較低的ADC；3)相較於60-90分鐘，將培育時間減少至2-5分鐘，以降低聚集物；及4)將乙醇量減少至6-8%，以降低聚集物。
兩批料之純化混合峰相對於調配緩衝液透析兩次以有利於在冷凍狀態下儲存。調配緩衝液組成為20mM Tris、7.5%蔗糖、0.01%聚山梨醇酯80、10mM NaCl(pH 8.0)。使用以下表徵經純化之huE22-AcBut-CM ADC：- 根據未結合抗體之存在進行的疏水性相互作用層析(HIC；TSKgel丁基-NPR,Tosoh Bioscience,LLC)，如圖6中所示，偵測到經純化之huE22-AcBut-CM中無游離抗體；- 針對聚集物及二聚物之存在進行的尺寸排阻層析(SEC；Acquity UPLC BEH200 SEC,Waters)，如圖7中所示，存在100%單體，未偵測到聚集物或二聚物；- 針對游離藥物之存在進行的逆相高效液相層析(HPLC-RP；Zorbax 300SB-CN,Agilent)，如圖8中所示，經純化之huE22-AcBut-CM中未偵測到游離藥物；及- 針對藥物分佈概況進行的毛細管等電聚焦(cIEF；iCE280,ProteinSimple)，如圖9中所示，3至5之所要窄DAR分佈為約78%，僅存在痕量DAR 7及較高種類且未偵測到DAR 1及未結合(DAR 0)種類。
使用類似純化方法產生huE47-AcBut-CM ADC。下文圖10及表11顯示冷凍-解凍循環對經純化之huE22-AcBut-CM抗體-藥物結合物之穩 定性的影響。經多次冷凍-解凍，未觀測到發生顯著變化。
圖29顯示利用4m/m及6m/m(頂線280nm及底線310nm)之CM與huE22 Ab比率所產生之經純化ADC(2mg)之分析性HIC之比較。4m/m之CM與huE22 Ab比率產生具有4.3之平均DAR的ADC(頂圖)且6m/m之CM與huE22 Ab比率產生具有5.2之平均DAR的ADC(底圖)。使用4m/m產生的ADC具有較高產量之所要ADC，其特徵為低疏水性單體；及較低產量之非所要ADC，其特徵為高疏水性聚集物。圖30顯示利用4m/m(頂線)及6m/m(底線)之CM與huE22 Ab比率所產生之經純化之ADC的另一分析性HIC。特定而言，使用6m/m(5.2 DAR製劑)所產生之ADC具有高疏水性種類及聚集物之增加之存在，其在4m/m(4.3 DAR製劑)所產生之ADC中為較低的。
實例7 抗EFNA4-AcBut-CM ADC之活體外結合及細胞毒性 A. 結合分析
使用BIAcore 2000(GE Healthcare)、使用與組胺酸標記融合以促進純化之重組EFNA4胞外域、藉由表面電漿共振(SPR)測定huE22針對人類及食蟹猴EFNA4蛋白質之結合常數。結果表示huE22對人類EFNA4與食蟹猴EFNA4均具有高親和力，參見表12。食蟹猴EFNA4蛋白質序列與人類EFNA4蛋白質序列高度同源，其總體上98%一致且胞外域98%一致。相反，未偵測到huE22結合至大鼠抗原，且在各別研究中未偵測到結合至小鼠抗原。huE22不結合至大鼠或小鼠EFNA4可 藉由所定義huE22抗原決定基內之大鼠及小鼠EFNA4序列之非守恆殘基解釋。
huE22-AcBut-CM ADC對於人類及食蟹猴EFNA4之結合常數係在與huE22相同的結合研究中測定。如表12中所示，ADC及未結合之mAb(huE22)對於人類與食蟹猴抗原的結合常數類似。
分析huE22及huE22-AcBut-CM ADC之細胞結合及內化。使用HEK293T親本細胞(EFNA4陰性)及HEK293T-EFNA4(經工程改造以高量表現人類EFNA4)。huE22及huE22-AcBut-CM ADC顯示特異性結合至表現EFNA4抗原之細胞。此外，未結合之huE22及huE22-AcBut-CM ADC展現與HEK293T-EFNA4細胞的結合類似，且任一抗體均不結合至HEK293T親本細胞，參見表13。連同表12(上文)中之SPR結果，此等資料表示生物結合方法不改變huE22之結合特徵。
A.細胞毒性分析
一旦huE22-AcBut-CM ADC內化至細胞中，則卡奇黴素釋放引起細胞毒性。內化抗體典型地運輸至溶酶體區室用於降解。使用直接細胞毒性分析來分析huE22-AcBut-CM之細胞毒性反應。將過度表現 HEK293T-EFNA4之細胞及HEK293T親本(EFNA4陰性)細胞以每孔每180μL細胞培養基500個細胞接種於透明平底組織培養盤(BD Falcon目錄號353072)中。細胞在5% CO2恆溫箱中、在37℃培育隔夜。次日，依10點濃度曲線(始於1μg/mL，在細胞培養基中半對數稀釋，一式三份)，向細胞中添加huE22-AcBut-CM及陰性非結合對照hIgG1-AcBut-CM ADC。培養盤在37℃、5% CO2恆溫箱中培育96小時。接著利用MTS分析(Promega CellTiter 96水性非放射性細胞增殖分析，目錄號#G5430)、根據製造商說明書量測細胞存活率。向各孔中添加40μL之組合MTS試劑。培養盤在37℃、5% CO2恆溫箱中培育1.5小時。經由GraphPad Prism軟體、利用邏輯非線性回歸法計算相對於未處理細胞將細胞存活率抑制50%的濃度(IC50)，如表14中所示。圖21顯示暴露於各種濃度之huE22-AcBut-CM(開口菱形)或hIgG-AcBut對照ADC(斜影線圓圈)之HEK293T-EFNA4細胞，且量測細胞存活率且相對於未處理細胞之存活率校正。
如表14及圖21中所示，huE22-AcBut-CM活體外引起針對表現EFNA4標靶之細胞的劑量依賴性細胞毒性反應且以標靶及濃度依賴性方式抑制細胞生長。當HEK293T-EFNA4細胞暴露於huE22-AcBut-CM時，濃度1ng/ml之ADC將細胞生長抑制50%(IC50)；相反，對照ADC之活性小於其150分之一。資料顯示huE22-AcBut-CM之強效及特異性細胞毒性活性。對照ADC及huE22-AcBut-CM ADC未引起針對缺少EFNA4表現之HEK293T親本細胞的細胞毒性，由此顯示特異性及抗原依賴性。
實例8 抗EFNA4抗體-藥物結合物之活體內功效
此外評估根據實例6中所述之結合及純化方法製備之抗EFNA4 huE22-AcBut-CM及huE47-AcBut-CM對人類腫瘤患者源異種移植物(PDX)之活體內生長的影響。根據HIPAA規定，獲得人類個體保護機構審查委員會(Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects)批准後，自臨床場所獲得原發腫瘤切除樣品。
標靶EFNA4在各模型中之表現係以兩種方式量測：使用mRNA萃取物的逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)及使用蛋白質萃取物的ELISA。表15顯示該組腫瘤模型中之EFNA4之經校正mRNA及蛋白質含量。在所測試之所有模型中均偵測到EFNA4，換言之，兩個量測值均超過腫瘤模型MDA-MB-231之彼等值。
ND=未測定。
腫瘤片段於Hypothermasol(Biolife Solutions)中、在冰上儲存及裝運且嵌埋於含有生長因子之專有混合物之基質膠(BD)中且在切除24小時內皮下植入雌性NOD/SCID小鼠之乳房脂肪墊中。監測小鼠每日健康狀態且初始藉由目測檢查監測腫瘤生長，每週兩次。一旦腫瘤可 觸知，則開始量測腫瘤體積以追蹤腫瘤生長且估算細胞倍增時間。使用方程式V=(A*B2)/2估算腫瘤體積，其中A為長軸且B為短軸。當腫瘤達到500mm3至1,500mm3之體積時，收穫其用於研究及再移植。視細胞株而定，可利用機械解離及/或化學解離來分離個別細胞用於繼代。將活細胞以每個動物10,000至50,000個細胞接種至未處理動物中。
在功效研究中，收穫來自繼代研究的腫瘤且細胞於單一細胞懸浮液中解離。使用錐蟲藍排除法(Trypan blue exclusion)對製劑中的活細胞進行計數且每個小鼠接種10,000至50,000個存於基質膠中之細胞。為說明PDX之差異化生長速率，至少逾25%動物在隨機分組時開始出現最小腫瘤體積差異。初始腫瘤生長，隨後可觸知，一旦腫瘤體積達到約30mm3，即開始量測。一旦具有腫瘤之小鼠群組達到140-180mm3(各組小鼠數範圍為6至10)，則根據腫瘤尺寸對研究進行隨機分組。藉由腹膜內注射給與動物各種劑量水準的ADC，每週兩次，歷時兩週(Q4dx4)；1.5mg/kg小紅莓(最大耐受劑量)，每週一次，歷時兩週(Q7dx2)；或5mg/kg順鉑，每週一次，歷時兩週。跟蹤研究組，直至個別小鼠或整組腫瘤量測值達到1200mm3，此時根據IACUC指示處死。在所選劑量研究中，在2或6小時、36小時及72小時進行藥物動力學下頜下放血。將體積10μL血液移入90μL HBS-P(GE Healthcare)中。樣品在分析之前，在-80℃儲存。每次腫瘤量測均提供腫瘤體積±標準平均誤差(SEM)。GT=由於腫瘤尺寸大而終止之群組。ND=留待使用SEM進行顯著量測之動物不足。所有研究包括PBS媒劑及對照抗體-藥物結合物，該對照抗體-藥物結合物具有與相同連接子結合之非結合hIgG1抗體-所分析之負載且具有類似藥物與抗體比率(DAR)及DAR分佈。
A. 乳癌
表16至20及圖11至14提供的資料顯示huE22-AcBut-CM及huE47-AcBut-CM在各種三重陰性乳癌(TNBC)PDX腫瘤模型中的功效。所得結果出人意料，原因在於，相較於與卡奇黴素(DNA損傷劑)具有類似作用機制之小紅莓標準照護(SOC)療法，huE22-ActBut-CM在所有TNBC PDX模型中顯示優良的功效。
表16及圖11顯示huE22-AcBut-CM對乳房-5(BR5)三重陰性乳癌(TNBC)PDX的功效。使用0.27mg/kg huE22-AcBut-CM達成超過80天持續消退，且低達0.036mg/kg之劑量水準引起抗腫瘤活性。相反，對照ADC、小紅莓標準照護法(SOC)均不影響腫瘤生長。
表17及圖12顯示huE22-AcBut-CM及huE47-AcBut-CM在乳房-13(BR13)TNBC PDX中之功效。對於huE22-AcBut-CM而言，0.27mg/kg劑量水準產生消退歷時90天，隨後腫瘤再生長。此外，0.09mg/kg劑量水準延遲腫瘤生長約40天。相反，對照ADC、小紅莓SOC均不影響腫瘤生長。
表18及圖13顯示huE22-AcBut-CM及huE47-AcBut-CM在乳房-22(BR22)PDX(TNBC之較弱敏感性腫瘤模型)中之功效。對於huE22-AcBut-CM而言，0.27mg/kg劑量水準延遲腫瘤生長約40天，但不產生任何完全消退。此外，低於0.27mg/kg之劑量水準的影響最小。對照 ADC、小紅莓SOC均不影響腫瘤生長。
圖19顯示huE15、huE22及huE47與各種微小管抑制劑(MTI)之結合物在BR22 PDX(諸如vc0101及mc8261)中之功效。資料顯示MTI ADC對腫瘤生長的影響不明顯。因此，出人意料的是，huE22-AcBut-CM及huE47-AcBut-CM在相同BR22 PDX模型中顯示增強之功效。
表19及圖14顯示huE22-AcBut-CM在乳房-31(BR31)TNBC PDX中之功效。0.27mg/kg劑量水準產生約120天之消退，隨後一些動物中之腫瘤再生長。0.09mg/kg劑量水準使腫瘤消退約50天，隨後腫瘤再生長。相反，對照ADC、小紅莓SOC均不影響腫瘤生長。
圖20顯示huE15、huE22及huE47與MTI vc0101之結合物在BR31 PDX中的功效。資料顯示MTI ADC對腫瘤生長的影響不明顯。因此，出人意料的是，huE22-AcBut-CM及huE47-AcBut-CM在相同BR22 PDX模型中顯示增強之功效。
圖20顯示huE22-AcBut-CM在乳房-56(BR56)TNBC PDX中之功效。相反，對照ADC、小紅莓SOC均不影響腫瘤生長。
B.卵巢癌
表21及圖15顯示huE22-AcBut-CM在卵巢-45(OV45)卵巢癌PDX中的功效。使用0.27mg/kg達成持續消退超過75天。在0.09mg/kg劑量水準下亦達成消退，其中一些動物中之腫瘤在50天之後再生長。0.036劑量水準延遲腫瘤生長約25天。相反，對照ADC不影響腫瘤生長。
表22及圖16顯示huE22-AcBut-CM在卵巢-55(OV55)卵巢癌PDX中的功效。在0.27mg/kg及0.09mg/kg劑量水準下達成腫瘤消退，0.036劑量水準使腫瘤生長產生一些延遲。對照ADC不影響腫瘤生長。
表23及圖17顯示huE22-AcBut-CM在卵巢-44(OV44)卵巢癌PDX(卵巢癌之較弱敏感性腫瘤模型)中的功效。0.27mg/kg劑量水準使腫瘤生長延遲約50天，但未使腫瘤消退。低於0.27mg/kg之劑量水準的影響最小。對照ADC不影響腫瘤生長。
表24及圖18顯示huE22-AcBut-CM在卵巢-63(OV63)卵巢癌PDX(卵巢癌之較弱敏感性模型)中的功效。在0.27mg/kg下達成短暫腫瘤消退且在0.036mg/kg及0.09mg/kg下達成腫瘤生長延遲。
表25顯示huE22-AcBut-CM在卵巢-39(OV39)卵巢癌PDX中的功效。
C. 小細胞肺癌(SCLC)及結腸直腸癌
用小細胞肺癌(SCLC)模型LU80及LU86 PDX及結腸直腸癌(CRC)模型CR5 PDX進行若干其他功效研究，資料顯示於表26至28中。所得結果出人意料，原因在於，相較於與卡奇黴素(DNA損傷劑)具有類似作用機制之小紅莓標準照護(SOC)療法，huE22-ActBut-CM在SCLC及CRC PDX模型中顯示優良的功效。
使用huE22-AcBut-CM進行之所有活體內功效研究的結果總結於表29及表30中。總之，huE22-AcBut-CM在TNBC(非密連蛋白較低低)、卵巢癌、SCLC及結腸直腸癌之模型中強烈抑制腫瘤生長。在所測試之所有情況下(TNBC及SCLC)，huE22-AcBut-CM優於標準照護化學療法(SOC)。腫瘤消退定義為平均腫瘤體積相對於首次給藥時之尺寸減小。
在乳房及卵巢模型中，腫瘤消退定義為給藥之後的平均腫瘤體積減小。TGI=腫瘤生長抑制。% TGI=[1-(經治療之平均腫瘤體積)/(使用媒劑之平均腫瘤體積)]。在腫瘤消退的情況下，進展時間(TTP)確定為首次給藥與平均腫瘤體積在消退之後明顯增大(再生長)之間的天數。若在實驗過程中，腫瘤未再生長，則TTP為首次給藥與實驗結束之間的天數。如上文所述，所有動物給與huE22-AcBut-CM ADC，每週兩次，歷時4個循環；給與1.5mg/kg小紅莓，每週一次，歷時2個循環；給與5mg/kg順鉑，每週一次，歷時2個循環。ADC劑量水準係根據抗體含量，以mg/kg列出。在所有研究中，均腹膜內對動物給藥，但其中144580為靜脈內給藥。
NL=正常樣。CL=低密連蛋白。ND=未測定。
MMMT=惡性混合型穆勒腫瘤(Mullerian tumor)；ND=未測定；NA=不適用。
實例9 腫瘤起始細胞(TIC)之減少
為確定抗EFNA4抗體-藥物結合物療法是否減少腫瘤中之腫瘤起始細胞(TIC)頻率，用抗EFNA4抗體-藥物結合物huE22-AcBut-CM或對照hIgG抗體-藥物結合物對照物-AcBut-CM預處理腫瘤，接著在有限稀釋分析中將來自經預處理之所解離腫瘤的人類腫瘤活細胞植入未處理動物中。初始處理後第12天(對於BR22)及第21天(對於BR13)，收穫來自經huE22-AcBut-CM或對照物-AcBut-CM處理之有腫瘤小鼠的腫瘤。根據腫瘤在huE22-AcBut-CM暴露後開始消退的時間來選擇收穫 連續移植物的日期。解離腫瘤且用抗人類ESA、抗小鼠CD45及抗小鼠H2Kd抗體染色。將每個處理組三個腫瘤組合，且藉由流式細胞術分選人類腫瘤活細胞(ESA+)。
對於BR22而言，將自經對照物-AcBut-CM處理之腫瘤中分選出的400個、100個、50個或20個腫瘤細胞注入各組八隻小鼠，且將自經huE22-AcBut-CM處理之腫瘤中分選出的390個、90個、40個或18個腫瘤細胞注入各組八隻小鼠。對於BR13而言，將自經對照物-AcBut-CM處理之腫瘤中分選出的400個、100個、60個或20個腫瘤細胞注入各組10隻小鼠，且將自經huE22-AcBut-CM處理之腫瘤中分選出的380個、160個、50個或25個腫瘤細胞注入各組10隻小鼠。
每週及注射後第21週量測接受者小鼠中之腫瘤，接受者小鼠中大於200mm3之腫瘤評為陽性。使用泊松分佈統計資料，經由L-Calc軟體(Stemcell Technologies,Vancouver,BC)，在移植後第21週利用具有及不具有腫瘤之接受者之所注射細胞劑量來計算每個群體中之TIC頻率。對於BR22與BR13 PDX而言，資料顯示抗腫瘤功效(利用TIC頻率之第二終點)，其不依賴於標準腫瘤體積量測值。資料進一步顯示huE22-AcBut-CM靶向更具侵襲性/致瘤性的TIC(或CSC)。
自經對照物-AcBut-CM處理之55個細胞中出現1個TIC至經huE22-AcBut-CM處理之147個細胞中出現1個TIC，BR22經處理腫瘤中的TIC數目減少了約3分之一(p=0.019，在雙尾檢驗中)，如表31中所示。
類似地，自經對照物-AcBut-CM處理之75個細胞出現1個TIC至經huE22-AcBut-CM處理之270個細胞中出現1個TIC，BR13經處理腫瘤中的TIC數目減少了約2.6分之一(p=0.0007)，如表32中所示。總之，注射經huE22-AcBut-CM處理之腫瘤細胞的小鼠產生的腫瘤一致地小於注射類似數目個經對照物-AcBut-CM處理之腫瘤細胞的小鼠，表明huE22-AcBut-CM處理使腫瘤起始細胞(TIC)減少。
實例10 總huE22-AcBut-CM在血漿中之活體外穩定性
利用酶聯免疫吸附分析(ELISA)方法確定藥物動力學研究中給與ADC之小鼠血漿樣品中之總ADC及總抗體的量化。亦利用ELISA與液相層析串聯質譜(LC-MS/MS)方法對大鼠及猴探究性毒理學研究中及活體外血漿ADC穩定性研究中之總ADC、總抗體及未結合負載進行量化。
根據實例6中所述之結合及純化方法製備之huE22-AcBut-CM的活體外穩定性係藉由ELISA量測史泊格多利大白鼠及食蟹猴血漿中之總ADC及總抗體來測定。huE22-AcBut-CM於小鼠、大鼠、猴及人類血漿中、在1μg/mL及50μg/mL之濃度下、在37℃培育長達168個小時， 且利用ELISA測定總ADC及總抗體(人類血漿除外)，參見表33及34。
huE22-AcBut-CM於大鼠、小鼠及猴血漿中在37℃培育168個小時之後剩餘之總抗體平均(n=3)量類似於緩衝液對照物，且在兩種培育濃度下，所有種類均為類似的。huE22-AcBut-CM於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)w/1%牛血清白蛋白(BSA)中在37℃培育168個小時之後剩餘的平均(n=3)總ADC及總抗體量對於1μg/mL培育而言，分別為94.5%及90.5%，且對於50μg/mL培育而言，分別為88.3%及98.6%，表明在生物學溫度下，血漿中之總ADC存在最小的熱降解。
由於ELISA對於含有人類IgG之人類血漿中之人類IgG存在偵測侷限性，因此無法根據總ADC培育來測定人類血漿中之總抗體濃度。huE22-AcBut-CM於大鼠、小鼠、猴及人類血漿中在37℃培育168個小時之後剩餘之總ADC平均量類似於緩衝液對照物，且在兩種培育濃度下，所有種類均為類似的。NC=未計算；SD=標準差。
實例11 作用機制
分析huE22-AcBut-CM之作用機制顯示其與卡奇黴素之作用機制一致。磷酸化組蛋白變異體H2A.X(γ H2A.X)為已確立之DNA損傷生物標記。為驗證分析，用未結合之AcBut-CM處理癌細胞株且離散焦點中之細胞核中之γ H2A.X標記明顯，其為典型染色模式。活體外與活體內huE22-AcBut-CM處理使得靶細胞中之DNA雙股斷裂，此與卡奇黴素ADC之預期作用機制一致。
使HEK293T-EFNA4或HEK293T親本細胞暴露於0.3μg/mL huE22-AcBut-CM、對照ADC或未結合之huE22四個小時。洗滌細胞，用4%三聚甲醛固定，用1% Triton-X100使其通透化，與抗組蛋白γ H2A.X(Millipore #05-636)一起培育1小時，洗滌且與結合AlexaFluor488之二次抗體及與DAPI核酸染料一起培育30分鐘，接著洗滌且用固定介質及蓋片保護。使用Zeiss LSM510共焦顯微鏡目測細胞且分析其中的γ H2A.X DNA損傷生物標記及DNA含量。
暴露於huE22-AcBut-CM之後，HEK293T-EFNA4細胞展現指示DNA損傷的離散γ H2A.X焦點；相反，用對照ADC或未結合之huE22處理後，未觀測到焦點(影像未顯示)。此外，huE22-AcBut-CM未誘導標靶陰性HEK293T細胞中產生焦點。因此，huE22-AcBut-CM以標靶依賴性及卡奇黴素依賴性方式產生DNA損傷，此與ADC之預期作用機制一致。
在活體內藥效學研究中獲得類似結果。向含有表現EFNA4之BR5 TNBC PDX腫瘤的小鼠中投與一劑量之1mg/kg huE22-AcBut-CM，且在24、48及96小時之後收穫腫瘤。腫瘤於福馬林中固定且嵌埋入石蠟(FFPE)中。切片用2.4μg/mL抗huIgG(Cell Signaling #3443-1)及1.8mg/mL抗γ-H2A.X(Cell Signaling 2577S)染色且載片於Aperio AT2上掃描。在數位影像分析中，對健康活組織區域進行分類，而壞死區域及無關組織加以清除。根據使用者定義之參數(例如膜hIgG染色或細胞內γ H2A.X染色)對活區域內之個別細胞進行評分，且報導活區域中之標記陽性細胞百分率。
如圖22中所示，使用抗hIgG1抗體(斜列影線圓圈)進行的免疫組織化學顯示，在給藥後24小時，幾乎每個腫瘤細胞之質膜上均出現染色，且約一半的腫瘤細胞在96小時出現染色。此外，如圖22中所示，使用抗γ-H2A.X抗體(開口菱形)進行的免疫組織化學揭示腫瘤細胞中之核染色；如所預期，抗γ-H2A.X染色峰時落後於細胞結合峰時，原因在於ADC內化及負載釋放發生於卡奇黴素產生DNA損傷之前。虛線指示每組之中位值。活體外研究與活體內研究共同顯示抗EFNA4-AcBut-CM ADC之預期作用機制。
卡奇黴素產生之DNA損傷誘導細胞凋亡，最終導致細胞死亡(Zein等人，1988；Nicolaou等人，1994；Prokop等人，2003)。藉由磷脂 結合蛋白V染色來評估huE22-AcBut-CM處理後的細胞凋亡，磷脂結合蛋白V藉由結合至細胞表面上之磷脂醯絲胺酸而為細胞凋亡細胞的標記(Koopman等人，1994)。用huE22-AcBut-CM、對照ADC或huE22 mAb處理HEK293T-EFNA4或親本HEK293T，接著用磷脂結合蛋白V及存活力染料7AAD染色。用huE22-AcBut-CM處理HEK293T-EFNA4細胞使得細胞凋亡細胞之含量實質上提高，而處理親本HEK293T細胞則不會，參見表35。對照ADC、huE22 mAb均不會誘導細胞凋亡至顯著的程度。因此，huE22-AcBut-CM以標靶依賴性方式及卡奇黴素依賴性方式誘導靶細胞發生細胞凋亡。
實例12 TNBC TPC之富集
建立含有19種PDX乳房腫瘤的PDX腫瘤庫。根據患者病理學報導、腫瘤組織病理學及使用PAM-50(+)組之微陣列子叢集，證明此等PDX腫瘤模型中13個來源於具有TNBC之患者；其中三者表徵為低密連蛋白(CL)亞型。收穫PDX乳房腫瘤，於單一細胞懸浮液中解離且藉由流式細胞術、使用嚴格的雙峰區分閘選法進行分析。此外，分別根據CD46、CD324、CD24及CD34表現來分析人類ESA+腫瘤細胞。
在仔細地對關鍵性細胞表面標記CD24(被認為可區分乳癌中之腫 瘤不朽化細胞(亦即癌症幹細胞))進行表型剖析後，顯然，來源於具有TNBC之患者之PDX腫瘤中的所有細胞均一地表現抗原，且因此鑑定此亞型之乳癌中之TPC的效用很小。藉由流式細胞術對數百種細胞表面抗原進行的表型剖析可鑑定出BR22及BR31 PDX腫瘤中存在許多不均勻表現之抗原，包括CD46及CD324。
藉由FACS自BR22 PDX腫瘤中分離出預期的TPC(亦即ESA+CD46+CD324+細胞)且在植入之前藉由流式細胞術再分析。類似地解離及分析子代腫瘤，以證明反映親本腫瘤之細胞異質性。植入50個ESA+CD46+CD324+(斜影線圓圈)或ESA+CD46+CD324-(開口圓圈)細胞之個別小鼠的腫瘤生長曲線分別如圖23及圖24中所示，此等細胞係自所解離之BR22及BR31 PDX乳房腫瘤中分離而得。利用此等標記促進不表現或表現CD46及/或CD324之單一細胞分離及移植入免疫受損小鼠中，此說明僅ESA+CD46+CD324+細胞，而非其CD324-對應物，能夠有效地使腫瘤不朽化，從而複製其親本腫瘤之表型異質性。
完全非均質的腫瘤有效地始於少至50個所植入細胞，而CD324-子群內之TPC頻率係在所預期假陽性期望值之誤差內，此期望值係利用BD FACSAria上所分離之細胞之1%細胞雜質分佈所產生，參見表36。
CD324+細胞子群中1：71之TPC頻率顯示每隻移植100個CD324+細胞之小鼠產生平均1.4個功能TPC，而1%分選誤差率在所分離之CD324-細胞中產生平均0.014% CD324+細胞污染頻率，其換算為1.4%(0.2-2.7%範圍)之假陽性頻率。
此外，使用分別自各種亞型之許多PDX乳房腫瘤模型(包括密連蛋白低TNBC及非密連蛋白低TNBC)及管腔B亞型乳癌模型所分離之ESA+CD46+CD324+ TPC及ESA+CD46+CD324- NTG細胞，用Illumina HiSeq 2000平台(100×100bp末端配對定序)進行全轉錄體定序。亦使用獲自正常組織(諸如心臟、肝臟、腎臟、肺、結腸、皮膚、胰臟及卵巢)進行全轉錄體定序。使用標準技術校正所有樣品之所得fpkm(每一百萬每千鹼基之片段數)，接著過濾，以聚焦於編碼位於細胞表面上之所註記蛋白質之基因。使用經過濾之此資料集作為輸入值，利用Bioconductor內之DESeq2套裝，以及其經調整之p-值來鑑定TPC中表現與NTG細胞及正常組織有差異之基因，值得注意的是，相對於NTG細胞及正常組織，TPC中的EFNA4明顯升高，甚至在根據假發現率調整p-值之後亦如此。
實例13 TNBC TPC中之EFNA4表現升高
為進一步證明TNBC TPC之富集，使用自各種亞型之許多PDX乳房腫瘤模型(包括密連蛋白低TNBC及非密連蛋白低TNBC)及管腔B亞型乳癌模型所分離之ESA+CD46+CD324+ TPC及ESA+CD46+CD324- NTG細胞，用Illumina HiSeq 2000平台(100×100bp末端配對定序)進行全轉錄體定序。
亦使用獲自一組正常組織(諸如心臟、肝臟、腎臟、肺、結腸、 皮膚、胰臟及卵巢)進行全轉錄體定序。使用標準技術校正所有樣品之所得FPKM(每一百萬每千鹼基之片段數)，接著過濾，以聚焦於編碼位於細胞表面上之所註記蛋白質之基因。使用經過濾之此資料集作為輸入值，利用Bioconductor內之DESeq2套裝，以及其經調整之p-值來鑑定TPC中表現與NTG細胞及正常組織有差異之基因，值得注意的是，相對於NTG細胞及正常組織，TPC中的EFNA4明顯升高，甚至在根據假發現率調整p-值之後亦如此。
另外，在包涵各種亞型的19個PDX乳房腫瘤(實例12中所述)中，藉由微陣列法評估EFNA4 mRNA於PDX乳房腫瘤塊或正常生命器官中的表現。EFNA4 mRNA表現升高，平均為所評估之正常乳房或任何其他正常組織的2.6倍高。
此外，使用可利用的癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)研究網(Weinstein JN等人，Nature Genetics 45：1113-1120,2013)資料，評估正常相鄰乳房、TNBC及非TNBC乳房腫瘤中之EFNA4 mRNA之表現。相對於其他乳癌亞型，非密連蛋白低亞型之TNBC中的EFNA4表現通常較高。將PAM(50)+基因標記應用於由292患者之原發腫瘤試樣所產生之TCGA資料時，TNBC腫瘤(n=95)中之EFNA4表現升高相較於正常相鄰乳房(n=108)及非TNBC亞型乳房腫瘤(n=197)仍為明顯的，如圖25中所示。水平線表示中位值。
分析乳癌及卵巢癌過度表現EFNA4的遺傳基礎。利用TCGA及METABRIC(Curtis,C等人，Nature；486(7403)：346-352,2012年4月18日)資料集，圖26顯示乳房腫瘤樣品中之EFNA4複本數且圖27顯示卵巢瘤樣品中之EFNA4複本數。白盒代表第25至第75百分位數，誤差條界定第10至第90百分位數，且個別點低於第10或高於第90百分位數。正常複本數(n=2)由虛線顯示。
在一些乳房腫瘤中，EFNA4過度表現可為複本數增加之後果， 參見圖26。在TCGA乳癌資料集中，25.5%腫瘤樣品中之EFNA4複本數增加顯著(n2.5)，而複本數實質上下降的腫瘤樣品無。TNBC樣品亞群中之EFNA4複本數增加成比例發生。在METABRIC乳癌資料集中觀測到相同傾向(n2.5，14.3%腫瘤樣品)。此外，EFNA4 mRNA含量與DNA複本數之間存在強相關性(r=0.48；p<0.0001)。資料表明乳癌(尤其TNBC)過度表現EFNA4存在潛在的遺傳基礎。
為確定升高之EFNA4基因表現是否轉變為蛋白質增加，藉由傳統的免疫接種及融合瘤方法產生一組單株抗體，且鑑定夾心ELISA對。分析來自17個正常器官、49個原發性乳房腫瘤試樣及9個TNBC PDX腫瘤模型的組織蛋白溶胞物，使人注意到不僅TNBC中之EFNA4蛋白質含量較正常組織及其他乳癌亞型升高，而且TNBC之非密連蛋白低子類中之表現高於密連蛋白低亞群。此等結果證明，即使在塊狀腫瘤層面，升高之EFNA4基因表現轉變為EFNA4蛋白質之有意義增加。
在卵巢癌中，觀測到TCGA樣品之實質部分(22.2%)中存在EFNA4複本數增加(n2.5)，而複本數顯著下降之情況不存在，參見圖27。EFNA4 mRNA含量與DNA複本數之間存在強相關性(r=0.32；p<0.0001)，此類似於對乳癌之觀測結果。此觀測結果與乳癌資料共同表明腫瘤過度表現EFNA4存在潛在的遺傳基礎。
除乳癌及卵巢癌之外，肝癌展現高頻率之EFNA4複本數增加。依據3個資料集：Pfizer-ACRG(n=310)，Pfizer-Samsung(n=272)及TCGA(n=212)，圖28顯示肝細胞癌(HCC)腫瘤樣品中之EFNA4複本數。每個樣品由三角形表示，且水平線表示中位值。正常複本數(n=2)由虛線顯示。三個資料集皆一致地顯示，存在頻繁的EFNA4複本數增加，但不存在顯著的複本數下降；ACRG、Samsung及TCGA資料集中具有n2.5之樣品分別為68.4%、37.5%及29.7%。在3個獨立資料集 中，肝癌中之EFNA4 mRNA含量與DNA複本數之間存在強相關性：TCGA相關係數=0.50(p為約0)；ACRG係數=0.56(p為約0)及Samsung係數=0.38(p=3E-09)。HCC中之EFNA4增加不集中於一點且反而可在染色體區域Chr1q21-1q22之擴增背景下發生，此情況亦包括ELK4、MDM4及PARP1。值得注意的是，在HCC資料集中，EFNA4 mRNA表現量與複本數強烈相關，此表明EFNA4增加之腫瘤對於抗EFNA4 ADC療法可具有更強反應。
實例14 蝶素-A4之結合特性
進一步分析結合至Eph受體之蝶素-A4之特性。由於抗EFNA4抗體結合至蝶素-A4，而配位體與其Eph受體接合，因此測定此兩個大分子之間的親和力。使用可測定最相關受體的BIAcore 2000(GE Healthcare)、藉由表面電漿共振直接比較市售Eph受體與蝶素-A4之親和力。使用抗人類抗體捕捉套組將重組Eph受體固定於CM5生物感測芯片上。在每輪抗原注射之前，利用2分鐘接觸時間及5μL/min流量將濃度為2μg/mL之Eph受體捕捉於表面上。在150-260個反應單位下，所捕捉之抗體負載相對於基線為恆定的。受體捕捉及1分鐘基線之後，使單體人類蝶素-A4以400、241、145、87、53、32、19及12nM之濃度流過表面歷時2分鐘結合期，隨後為在10μL/min流量下之2分鐘解離期。每輪循環之後，使用10μL/min之3M MgCl2、經由30秒接觸時間使抗人類捕捉表面再生。
藉由初始計算平衡狀態下之反應平均值(Req)來處理Biacore資料。接著對Req相對於濃度(M)作圖，且利用穩態親和力擬合來計算親和力及理論Rmax。在所有情況下，利用至少5個不同分析物濃度進行此計算。所有資料分析步驟均用BiaEvaluation軟體3.1(GE Healthcare)完成。
來自結合至Eph受體之蝶素-A4之原始資料及Req相對於濃度曲線(未圖示)確定親和力最高之受體為EphA2且親和力最低之受體為EphA10。表37顯示根據結合至蝶素-A4所測試之九種Eph受體(按親和力降低之次序)。資料顯示Eph受體對蝶素-A4之親和力皆低於本文所揭示的抗EFNA4抗體。
<110> 美商輝瑞大藥廠 馬克 達美林
<120> 抗EFNA4抗體-藥物結合物
<130> PC72005
<160> 138
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 59
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 61
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列
<400> 62
<210> 63
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 63
<210> 64
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核苷酸序列
<400> 64
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 西班牙小鼠
<400> 65
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<211> 8
<212> PRT
<213> 西班牙小鼠
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<211> 8
<212> PRT
<213> 西班牙小鼠
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<212> PRT
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<211> 8
<212> PRT
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<211> 8
<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 137
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138

Claims (62)

  1. 一種抗體-藥物結合物，其具有下式：Ab-(L-D)，其中：(a)Ab為結合至EFNA4的抗體或其抗原結合片段；及(b)L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為卡奇黴素(calicheamicin)。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該Ab為嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體或重組人類抗體。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該Ab為內化抗體及/或中和抗體。
  4. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該Ab與包含以下之抗體競爭結合至人類EFNA4，及/或與包含以下之抗體結合相同抗原決定基：(a)如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區；或(b)如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區。
  5. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區，其中該至少一個重鏈可變區包含三個如SEQ ID NO：15、19及23所述之CDR。
  6. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區，其中該至少一個輕鏈可變區包含三個如SEQ ID NO：29、33及35所述之CDR。
  7. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含： (a)重鏈可變區，其包含三個如SEQ ID NO：15、19及23所述之CDR；及(b)輕鏈可變區，其包含三個如SEQ ID NO：29、33及35所述之CDR。
  8. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含胺基酸序列與SEQ ID NO：13至少90%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：27至少90%一致的輕鏈可變區。
  9. 如請求項8之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：13所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：27所述之輕鏈可變區。
  10. 如請求項9之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含IgG1重鏈恆定區。
  11. 如請求項10之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：25所述之重鏈。
  12. 如請求項9之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含κ輕鏈恆定區。
  13. 如請求項12之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：37所述之輕鏈。
  14. 如請求項9之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：25所述之重鏈及如SEQ ID NO：37所述之輕鏈。
  15. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區，其中該至少一個重鏈可變區包含三個如SEQ ID NO：41、45及49所述之CDR。
  16. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區，其中該至少一個輕鏈可變區包含三個如SEQ ID NO：55、59及61所述之CDR。
  17. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含：(a)重鏈可變區，其包含三個如SEQ ID NO：41、45及49所述 之CDR；及(b)輕鏈可變區，其包含三個如SEQ ID NO：55、59及61所述之CDR。
  18. 如請求項5之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含胺基酸序列與SEQ ID NO：39至少90%一致的重鏈可變區及胺基酸序列與SEQ ID NO：53至少90%一致的輕鏈可變區。
  19. 如請求項18之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：39所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：53所述之輕鏈可變區。
  20. 如請求項19之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含IgG1重鏈恆定區。
  21. 如請求項20之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：51所述之重鏈。
  22. 如請求項19之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含κ輕鏈恆定區。
  23. 如請求項22之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：63所述之輕鏈。
  24. 如請求項19之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：51所述之重鏈及如SEQ ID NO：63所述之輕鏈。
  25. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：13或39所述之重鏈可變區。
  26. 如請求項4之抗體-藥物結合物，其中該Ab包含如SEQ ID NO：27或53所述之輕鏈可變區。
  27. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該藥物為卡奇黴素之N-乙醯基衍生物。
  28. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素。
  29. 如請求項28之抗體-藥物結合物，其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇 黴素二甲基醯肼(CM)。
  30. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中該連接子包含4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)。
  31. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其具有DAR 1至12。
  32. 一種抗體-藥物結合物，其具有下式：Ab-(L-D)，其中：(a)Ab為抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：25所述之重鏈及如SEQ ID NO：37所述之輕鏈；及(b)L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
  33. 一種抗體-藥物結合物，其具有下式：Ab-(L-D)，其中：(a)Ab為抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：51所述之重鏈及如SEQ ID NO：63所述之輕鏈；及(b)L-D為連接子-藥物部分，其中L為連接子，且D為藥物，其中該連接子為4-(4'乙醯基苯氧基)丁酸(AcBut)，且其中該藥物為N-乙醯基-γ-卡奇黴素二甲基醯肼(CM)。
  34. 一種組合物，其包含複數種如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物及視情況存在之醫藥載劑，其中該組合物具有1至12範圍內之平均DAR。
  35. 如請求項34之組合物，其中該組合物具有3至5範圍內之平均DAR。
  36. 如請求項35之組合物，其中該組合物具有3至4範圍內之平均 DAR。
  37. 如請求項36之組合物，其中該組合物具有4至5範圍內之平均DAR。
  38. 如請求項34至37中任一項之組合物，其中該組合物具有約4之平均DAR。
  39. 一種組合物，其包含複數種如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物及視情況存在之醫藥載劑，其中該組合物具有至少50%之具有DAR 3至5之抗體-藥物結合物。
  40. 如請求項39之組合物，其中該組合物具有至少60%之具有DAR 3至5之抗體-藥物結合物。
  41. 如請求項40之組合物，其中該組合物具有至少70%之具有DAR 3至5之抗體-藥物結合物。
  42. 如請求項41之組合物，其中該組合物具有至少75%之具有DAR 3至5之抗體-藥物結合物。
  43. 如請求項41或42之組合物，其中該組合物具有約70%至80%之具有DAR 3至5之抗體-藥物結合物。
  44. 一種製備如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物的方法，該方法包含：(a)使連接子連接至藥物部分；(b)使連接子-藥物部分與抗體結合；及(c)純化該抗體-藥物結合物。
  45. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  46. 一種如請求項1至33中任一項之抗體-藥物結合物的用途，其係用於製造供治療個體之EFNA相關病症之藥劑。
  47. 如請求項46之用途，其中該EFNA相關病症為過度增生性病症。
  48. 如請求項47之用途，其中該過度增生性病症為贅生性病症。
  49. 如請求項48之用途，其中該贅生性病症包含實體腫瘤。
  50. 如請求項49之用途，其中該贅生性病症為乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝癌或肺癌。
  51. 如請求項48之用途，其中該贅生性病症包含血液惡性疾病。
  52. 如請求項51之用途，其中該血液惡性疾病為白血病。
  53. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其係用於治療個體之EFNA相關病症。
  54. 如請求項53之供使用之抗體-藥物結合物，其中該EFNA相關病症為過度增生性病症。
  55. 如請求項54之供使用之抗體-藥物結合物，其中該過度增生性病症為贅生性病症。
  56. 如請求項55之供使用之抗體-藥物結合物，其中該贅生性病症包含實體腫瘤。
  57. 如請求項56之供使用之抗體-藥物結合物，其中該贅生性病症為乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝癌或肺癌。
  58. 如請求項55之供使用之抗體-藥物結合物，其中該贅生性病症包含血液惡性疾病。
  59. 如請求項58之供使用之抗體-藥物結合物，其中該血液惡性疾病為白血病。
  60. 一種EFNA4抗體-藥物結合物用於製造供減少腫瘤細胞群中之腫瘤起始細胞之藥劑的用途，其中該群包含腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞之外的腫瘤細胞，且其中該藥劑係用於與腫瘤細胞群接觸，從而使該腫瘤細胞群中之腫瘤起始細胞的頻率降低。
  61. 如請求項60之用途，其中該接觸係在活體內進行。
  62. 如請求項60之用途，其中該接觸係在活體外進行。
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