NL8000962A - Werkwijze voor de vervaardiging van microporeuze voorwerpen waarin een of meer werkzame middelen zijn opgesloten. - Google Patents

Description

-1-

803050/BZ/EB

t

Aanvraagster: E.N.I. ENTE NAZIONALE INDROCARBURI te Rome Italië Korte Aanduiding: Werkwijze voor de vervaardiging van microporeuze voorwerpen waarin een of meer werkzame middelen zijn opgesloten.

5 Door Aanvraagster worden als uitvinders genoemd: Paolo Pansolli,

Silvio Gulinelli, Luigi Ciceri en Franco Morisi.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de vervaardiging van microporeuze voorwerpen waarin een of meer werkzame middelen, en meer in het bijzonder biologisch werkzame midde-10 len zijn opgesloten.

Volgens de onderhavige werkwijze vermengt men een organische oplossing van een polymeermassa met het betreffende werkzame middel, of een oplossing of dispersie daarvan in een daarmee verenigbaar medium, dat mengbaar is met het organische oplosmiddel 15 voor de polymeermassa en brengt het geheel in een bepaalde vorm.

Uit het Italiaanse octrooischrift 836.482 is bekend dat het mogelijk is enzymen en enzymen-bevattende preparaten in vezelvormige polymeerstrukturen vast te leggen. Volgens de daarin beschreven werkwijze bereidt men eerst een emulsie van een oplossing 20 van het enzym in water en een oplossing van het polymeer in een oplosmiddel dat niet mengbaar is met water, waarna men de emulsie door een spindop in een coagulerend bad extrudeert onder vorming van een draad die de oorspronkelijk in de emulsie aanwezige enzym-oplossing bevat.

25 Op deze wijze verkrijgt men biologisch zeer werkzame katalysatoren waarvan de praktische toepassing echter beperkt wordt door de daaraan volgens de bovenbeschreven werkwijze gegeven vorm en de naar verhouding ingewikkelde bereiding.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een ver-30 beterde werkwijze voor de vervaardiging van microporeuze voorwerpen, waarin werkzame middelen van welke aard dan ook zijn in-gesloten, in het bijzonder biologisch werkzame middelen, in elke gewenste vorm, zodat de praktische toepassing, d.w.z. het gebruik bij commerciële uitvoering van de reakties waarbij dergelijke 35 middelen betrekken zijn, in generlei wijze wordt beperkt. Men verkrijgt bijvoorbeeld zeer doeltreffende biologische katalysatoren waarvan het gebruik bij de praktische toepassingen op geen 800 0 9 62 Γ -2- enkele wijze beperkt wordt omdat zij in allerlei vormen kunnen worden vervaardigd. -

Meer in het bijzonder verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze voor de vervaardiging van microporeuze 5 lichamen die een of meer werkzame bestanddelen bevatten, die uit de hierna volgende lijst kunnen worden gekozen, welke werkwijze als volgt wordt uitgevoerd: a) bereiding van een oplossing van een polymeermassa in een organisch oplosmiddel, 10 b) eventuele bereiding van een dispersie of oplossing van het betreffende werkzame middel in een daarmee verenigbaar medium, dat mengbaar is met het organische oplosmiddel van de polymeermassa, c) eventuele toevoeging aan het werkzame middel, of aan 15 het onder b) verkregen produkt, van een toevoegsel, waarvan de samenstelling en funktie hierna nog zal worden beschreven, d) vermenging van de opgeloste polymeermassa met het al of niet volgens b) opgeloste of gedispergeerde werk- 20 zame middel, dat al of niet het toevoegsel volgens trap c) bevat, e) vorming van het onder d) verkregen mengsel.

De werkzame middelen die volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding ingesloten kunnen worden zijn biologische 25 samenstellingen zoals enzymen of enzymcellen, antigenen, antilicha-men, antisera, hormomen en co'énzymen, die op de daarvoor in aanmerking komende wijze met macromoleculaire matrixen zijn verbonden, alsmede stoffen met een andere werkzaamheid of met een bijzonder gedrag, bijvoorbeeld complex-vormende middelen, kleurstoffen met 30 een geselekteerd molecuulgewicht en in het algemeen alle stoffen die niet teruggewonnen maar in dit geval wel kunnen worden teruggewonnen om opnieuw gebruikt te worden of na reaktivering opnieuw gebruikt kunnen worden. Hieraan moet worden toegevoegd dat het volgens de hierboven beschreven werkwijze ook mogelijk is lichamen 35 die volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding of op andere wijze reeds werkzame middelen bevatten opnieuw in te sluiten. Verder is het ook mogelijk andere, door fysische of chemische vereni- 800 0 962 -3- * ging van werkzame middelen met daarvoor in aanmerking komende substraten verkregen produkten in te sluiten. Op deze wijze is het bijvoorbeeld mogelijk het werkzame middel zeer goed te beschermen. Het werkzame middel kan eveneens als zodanig of na toevoeging van 5 geschikte inerte vulstoffen worden ingesloten. De werkwijze der uitvinding blijkt bijzonder doeltreffend te zijn voor de bereiding van biologische katalysatoren, ook in verband met de bovenbeschreven mogelijkheid een dergelijke katalysator in een groot aantal verschillende vormen te vervaardigen. Op deze wijze is het mogelijk 10 vezels, vezeltjes, cilindervormige lichamen van verschillende afmetingen, ellipsoïden, kogelvormige lichamen, poeders met uiteenlopende fijnheid te vervaardigen, waarbij de gewenste vorm afhankelijk is van de volgorde van de bij de eindbehandeling gevolgde trappen.

15 De vormgeving kan plaatsvinden door behandeling van het mengsel, bestaande uit de opgeloste polymeermassa en het werkzame middel of een dispersie daarvan, in een medium dat de polymeermassa niet oplost.

De coagulatie vindt plaats door het mengsel in het 20 medium te druppelen, waardoor men bijvoorbeeld bolvormige of ongeveer bolvormige lichamen verkrijgt, of door het mengsel direkt in het medium te voeren, waardoor vezels of dergelijke strukturen verkregen worden.

Een andere vormmethode is droge extrusie onder ver-25 damping van het oplosmiddel van het bovengenoemde mengsel, waardoor men een ononderbroken vezel krijgt die doorgesneden kan worden ter vorming van cilindervormige lichamen en dergelijke., met verschillende dwarsdoorsneden.

Volgens een andere vormmethode wordt het bovengenoem-30 de mengsel met of zonder drijfmiddel uit een onder druk staande houder gespoten, waardoor vezeltjes of poeders van verschillende fijnheid ontstaan.

De polymeermassa's, die men volgens de werkwijze der uitvinding kan gebruiken, zijn onder andere cellulosepolymeren, 35 veresterde of veretherde cellulosepolymeren, polyamiden, acryloni-trilpolymeren en copolymeren, butadieen en isopreen, acrylaten en methacrylaten, vinylesters, vinylchloriden, polymeren en copolymeren van vinylideenchloride, styreen, vinylbutyraat, gammamethylglu- 800 0 9 62 . *· -4- tomaat enz.

Cellulose-esters lenen zich in het bijzonder voor de werkwijze der onderhavige uitvinding:

Het middel, waarin het werkzame bestanddeel opgelost 5 of gedispergeerd wordt, als het niet mogelijk is met het werkzame middel zelf te werken, kiest men uit middelen die met het betreffende middel verenigbaar zijn, en met het oplosmiddel voor de polymeer-massa kunnen worden vermengd.

Men kan uit de volgende groepen van verbindingen kie-10 zen, waarbij degenen die de voorkeur verdienen tussen haakjes zijn geplaatst.

water, alkoholen (methanol, ethanol, propanol, butanol, tert. butanol, ethyleen glycol, glycerol), 15 ketonen (aceton, methylethylketon), ethers (dioxan, tetrahydrofuran, ethoxyethanol), esters (ethyl- en methylacetaat, propylacetaat, ethylformiaat enz.), zuren, (azijn, propion- en mierenzuur), 20 pyridine, acetonitril, cyclohexaan, dimethylforma- mide.

De oplosmiddelen voor de polymeermassa kunnen op hun beurt uit een groot aantal met de aard van de polymeermassa overeenkomende verbindingen gekozen worden.

25 Voorbeelden van dergelijke verbindingen zijn:

Aceton, methylisobutylketon, cyclohexanon, methylacetaat, methylcellulosolve, ethyllactaat, methyleen-chloride, propyleen-chloride, tetrachloorethaan, nitromethaan, chloorfenol, metacresol, azijnzuur, mierenzuur, dimethylformamide, dimethylsulfoxi-• 30 de, alkoholen, dioxaan, koolwaterstoffen, bijv. benzeen, tolueen, ketonen, esters, pyridine, chloroform, mengsels van ethanol en water, ethanol en CCl^, isopropanol en methylethylketon.

De bovengenoemde toevoegsels hebben tot taak het werkzame middel na mengen met de polymeermassa bijeen te houden of 35 te verknopen.

Toevoegsels die in het bijzonder in aanmerking komen zijn: 800 0 9 62 * > -δα) Polymeren met verschillende molekuulgewichten die niet in het oplosmiddel van de polymeermassa oplosbaar zijn: o.a. polyaminen b.v. polyethyleenimine, kationogene en anionogéne polyacrylamiden, polyamino-5 zuren b.v. polylysinen, gesulfoneerd polystyreén, poly- carbonzuren, polyvinylalkoholen, polyvinylpyrrolidon.

b) Polyfunktionele reagentia b.v. alifatische aldehyden, isocyanaten, thioisocyanaten enz.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voor-JO beelden nader toegelicht.

VOORBEELD I Beta-qalactooxvdase-bolletjes verkregen door insluiten van Saccharomyces lactis-cellen.

Men bereidt een 10 gew.$'s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in aceton (Carlo Erba) en voegt onder roeren aan 15 375 g van deze polymeeroplossing 154 g cellulaire pasta toe (droog gewicht 35,8 g) afkomstig uit 2 liter gefermenteerde Saccharomyces lactis.

Op deze wijze krijgt men een cellulaire dispersie, die vanuit een stalen houder door een capillaire buis met een diameter 20 van 0,4 mm met stikstof onder druk wordt geëxtrudeerd. De dunne geëx-trudeerde vezel verandert na een val van ongeveer 20 cm in een reeks van druppels die na vallen in een waterbad in de vorm van bolletjes coaguleren.

Op deze wijze verzamelt men ongeveer 800 g vochtige 25 bolletjes, die na drogen in een luchtstroom in totaal 73 g wegen.

Eén gram van de bolletjes wordt bij 25°C met 200 ml van een oplossing van watervrije lactose (4,75 gew.$), die 2 millimol MgSO^.Tf^O en 1 millimol EDTA in een 0,1 molaire fosfaatbuffer met pH:7 bevat, geincubeerd. Na een 2 uur durende reaktie is 80$ van de lactose om-30 gezet in glucose en galactose, zoals uit een analyse van de glucose volgens de glucosetest van Boehringer blijkt.

De met deze bolletjes uitgevoerde hydrolyse van lactose kan 20 maal worden herhaald zonder dat verlies aan werkzaamheid kan worden aangetoond.

35 VOORBEELD II Bolletjes van penicilline-acylase verkregen door in-sluiten van E.coli-cellen die van te voren met polyethyleenimine zijn behandeld.

Men suspendeert 20 g droge E.coli cellen die 1.10 80 0 0 9 62 -6- eenheden bevatten in 875 g water en behandelt 10 minuten onder roeren met 25 g van een 3,3 gew.$ oplossing van polyethyleenimine (Polysciences). Er ontstaan celmassa's die gemakkelijk bezinken.

Vervolgens wordt de celpasta in een kleine hoeveelheid 5 water (totaal 127 g) opnieuw gesuspendeerd en krachtig met 157 g van een 10 gew.j£’s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in aceton (Carlo Erba) geroerd. Volgens de in voorbeeld I beschreven werkwijze verkrijgt men 35 g bolletjes (droog gewicht). Een deel van deze bolletjes (5 g) wordt bij 37°C in 400 ml van een 6%1s oplossing jq van penicilline G (Squibb) in 0,02 molaire fosfaatbuffer met pH=8 geincubeerd. De aanvankelijke werkzaamheid bedraagt 60.000 eenheden (micromol per uur gehydrolyseerde penicilline G) en de totale hydrolyse bereikt men binnen ongeveer 4 uur. De bolletjes behouden na achtereenvolgens 20 maal gebruikt te zijn (hydrolyse) 60% van hun oorspronkelijke werkzaamheid.

VOORBEELD III Penicilline-ocylose bolletjes verkregen door insluiten van E. coli cellen die van te voren behandeld zijn met polyethyleenimine en glutaaroldehyde.

Men suspendeert 20 g droge E.coli cellen die 1.10 20 eenheden bevatten in 400 g water en behandelt 10 minuten onder roeren met 25 g van een 3,3 gew.^'s oplossing van polyethyleenimine (Polysciences, Ine.) en 5 g van een 25%'s oplossing van glutaaralde-hyde (Merck).

De na bezinken verzamelde cellen worden krachtig met 25 157 g van een 10$'s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in aceton (Carlo Erba) geroerd.

Men vormt bolletjes volgens de werkwijze beschreven in de voorgaande voorbeelden en men verkrijgt 40 g droge bolletjes (droog gewicht), waarvan een gedeelte (5 g) gebruikt wordt voor het 30 bepalen van de werkzaamheid onder dezelfde omstandigheden als in voorbeeld II. De gevonden werkzaamheid bedraagt 50.000 eenheden en de hydrolyse is na iets meer dan 4 uur voltooid. In tegenstelling tot de bolletjes die zonder glutaaroldehyde bereid zijn, behouden de bolletjes van dit voorbeeld hun werkzaamheid ongewijzigd. 35 VOORBEELD IV Glucose-isomerase bolletjes verkregen door insluiting van Arthrobacter sp. cellen die van te voren met polyacrylamide (Prodefloc A/1S behandeld zijn.

Aan 10 liter van een cultuur van Arthrobacter sp.

800 0 9 62 t -7- cellen die het glucose-isomerase-enzym bevatten voegt men na beëindiging van de fermentatie 500 g van een 0,3$'s oplossing van Pro-derfloc A/1S toe* Men roert de gesuspendeerde cellen 20 minuten en laat bezinken. Men verzamelt de celpasta (droog gewicht 150 g) 5 en suspendeert opnieuw in water totdat een totaal gewicht van 600 g verkregen is en vermengt onder krachtig roeren met 1500 g van een 10$*s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in aceton (Carlo Erba). Volgens de in het voorgaande beschreven werkwijze vormt men bolletjes. Een gram van deze bolletjes incubeert men bij 10 60°C in 100 ml van een 50 gew,$'s oplossing van glucose die 5.10“^ mol MgSO^.Zf^Q, 10"^ mol CoClg en 0,1 mol en een pH van 7 bevat. Polarimetrisch wordt een werkzaamheid van 100 internationale eenheden gemeten (micromol fructose die in één minuut gevormd wordt) met een opbrengst ontplooide werkzaamheid/ingesloten werkzaamheid 15 van 56$. De bolletjes verliezen na een kontinu gebruik gedurende twee achtereenvolgende dagen onder de vermelde proefomstandigheden hun werkzaamheid niet.

VOORBEELD V Glucose-isomerase bolletjes verkregen door insluiting van het opgeloste enzym no behandeling met polyethy-20 leenimine en glutaaraldehyde.

Men bereidt een enzymoplossing door 2 g glucose-isome-rase-poeder (Godo Shusei) in 8 g water op te lossen. Aan deze oplossing voegt men onder roeren 4 g van een 3,3$‘s oplossing van polyethyleenimine (Polysciences, Ine.) en 4 g van een 2,5$'s op-25 lossing van glutaaraldehyde (Merck) toe. Dit enzympreparaat vermengt men bij kamertemperatuur met 100 g van een 10$'s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in aceton (Carlo Erba). Volgens de in de voorgaande voorbeelden beschreven werkwijze vormt men bolletjes, waarvan het gewicht na drogen aan de lucht 12 g bedraagt. Een deel 30 van deze bolletjes (2 g) incubeert men bij 60°C met 100 ml van een 50 gew.$’s glucose-oplossing, die 5.10”^ mol MgSO^^HgO, 10"^ mol C0CI2 en 0,1 mol en een pH van 7 bevat om de werkzaamheid te bepalen, die 500 internationale eenheden bedraagt. De opbrengst is 30-40$.

35 VOORBEELD VI Cilindervormige cellulose-acetaat voorwerpen waarin polyethyleenimine als complexvormend middel is inge-sloten.

80 0 0 9 62 —8-

Men lost 15 g cellulose-acetoat (Fluka) op in 85 g aceton (Carlo Erba zuiver reagens). Aan de polymeeroplossing voegt men langzaam onder roeren 15 g van een 33 gew.$*s oplossing van polyethyleeniminehydrochloride (Polysciences, Ine.)in water en 5 5 g van een 1$'s oplossing van glutaaraldehyde (Merck) toe. Men plaatst het mengsel in een stalen cilinder waarop een stikstoffles is aangebracht en die aan de onderzijde is voorzien van een spindop die in een waterbad ondergedompeld is. Onder stikstofdruk komt het mengsel uit de spindop te voorschijn en coaguleert zodat een on-10 onderbroken draad ontstaat die met een snij-inrichting in monsters van 1-2 cm lengte gesneden wordt. Een gram van deze cilindertjes brengt men 4 uur in aanraking met een koperoplossing met een concentratie van 18r 3 delen per millioen (ppm) die men bereidt door oplossen van CuSO^.öf-^O in gedestilleerd water. Men meet met een 15 atoomabsorptiespectrofotometer (Varian-Techtron 1200) met koperge-halte (1,1 ppm) in de oplossing die mei de cilindertjes behandeld is. Na wassen van de cilindertjes met 50 ml 1 N HC1 vindt men 17 ppm koper.

Men brengt de cilindertjes 4 uur in aanraking met de 20 bovengenoemde koperoplossing, waarna men het kopergehalte in de oplossing opnieuw meet en op 1,2 ppm vaststelt. Deze volgorde herhaalt men 10 maal waaruit blijkt dat de cilinders hun complexvormende werking met koper niet verliezen.

VOORBEELD VII Invertosevezeltjes verkregen door insluiten van het 25 enzym in een oplossing waaraan polyvinvlpvrrolidon is toegevoegd.

Men roert een oplossing van 50 g invertase (B.D.H.) na toevoeging van 10 g polyvinylpyrrolidon (K30, Fluka) krachtig met 333 g van een 15/2* s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in 30 aceton (Carlo Erba). De samenstelling wordt vanuit een autoclaaf onder stikstofdruk (50 atmosfeer) door een mondstuk van 500 micron geSxtrudeerd, waarbij men een droog poeder van het vezeltjestype met een deeltjesgrootte van 160-1600 micron verzamelt. Men heeft de werkzaamheid van het invertase-enzym in de vezeltjes met een 35 oplossing van 20$ saccharose in een 0,1 molaix fosfaatbuffer met pH=4 bij 25°C gemeten. De werkzaamheid in milligrammen geïnverteerde saccharose per minuut en per gram vezeltjes bedraagt 8-50 afhankelijk van de afmeting van de vezeltjes.

VOORBEELD VIII Vezels van hydroxypirimidinehydrolase en N-carba- 800 0 9 62 \ -9- moyl-D-qminozuurhydrolase verkregen door insluiting van Aqrobacterium radiobacter cellen waaraan polyethyleenimine is toegevoegd.

Men suspendeert 4 g droge Agrobacterium radiobacter 5 cellen in 100 g water en behandelt onder roeren met 2 g van een 3$'s oplossing van polyethyleenimine (Polysciences, Inc.). Na 10 minuten roeren worden de bezonken cellen verzameld en in 25 g water gesuspendeerd. Men roert de suspensie krachtig met 20 g van een 2D%' s oplossing van cellulose-acetaat (Fluka) in aceton (Carlo Erba). De 10 samenstelling wordt in een stalen cilinder gebracht waarop een stik-stoffles is bevestigd/in de bodem van een nonovezelspindop (diameter 1 mm) is voorzien. Met een doserende pomp wordt het mengsel door de spindop in de vorm van een ononderbroken vezel geëxtrudeerd, die men door het laten verdampen van aceton tijdens een val van 4 meter in 15 de lucht laat drogen. De gehele draad met een droog gewicht van 8 g incubeert men bij 40°C onder stikstofatmosfeer in een 0,1 molair fos-faatbuffer (pH = 8) die 4 g DL-fenylhydantoïne bevat, voor de bepaling van de werkzaamheid van de twee enzymen. Na een 20 uur durende reaktie is hydantoine volledig in D(-)fenylglycine omgezet, 20 zoals blijkt uit de analyse met een aminozuuranalysator. Dezelfde draad gebruikt men 10 maal voor hetzelfde aantal hydrolyses, waarbij 30# van de oorspronkelijke werkzaamheid verloren gaat.

800 0 9 62

Claims (10)

1. Werkwijze voor de vervaardiging van macroporeuze voorwerpen waarin een of meer werkzame bestanddelen zijn ingesloten, met het kenmerk, dat men een organische oplossing van 5 een polymeermassa vermengt met het betreffende werkzame middel, of met een oplossing of een dispersie daarvan in een daarmee verenigbaar medium, dat mengbaar is met het organische oplosmiddel voor de polymeermassa en vervolgens het geheel in de gewenste vorm brengt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1,met het ken- 10. e r k, dat men a) een oplossing van de polymeermassa in een organisch oplosmiddel bereidt, b) eventueel een dispersie of oplossing van het betreffende werkzame middel in een daarmee verenigbaar medium, dat 15 mengbaar is met het organische oplosmiddel van de polymeermassa bereidt, c) eventueel aan de werkzame middelen, of aan het onder b) verkregen produkt, een toevoegsel bestaande uiti 1. polymeren met verschillende molekuulgewichten 20 die niet oplosbaar zijn in het oplosmiddel van de polymeermassa, 2. polyfunktionele reagentia bestaande uit een alifatisch aldehyde, een isocyanaat of een thioisocyanaat, toevoegt, 25 d) opgeloste polymeermassa met het al of niet volgens b) opgeloste of gedispergeerde werkzame bestanddeel met of zonder het toevoegsel van trap c) vermengt, e) onmiddellijk uit het volgens de voorgaande trap verkregen mengsel voorwerpen vormt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het ken merk, dat de trap e) uitgevoerd wordt door het laten coaguleren van het mengsel van trap d) in een medium dat geen oplosmiddel voor de polymeermassa is.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- 35. e r k, dat de coagulatie uitgevoerd wordt door het mengsel in het medium te druppelen. 80 0 0 9 62 -11- . '>

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met h et ken merk , dat de coagulatie uitgevoerd wordt door het mengsel direkt in het medium te laten stromen. ó. Werkwijze volgens conclusie 2, met het k e n- 5 merk, dat trap e) uitgevoerd wordt door droge extrusie van het mengsel van trap d).

7. Werkwijze volgens conclusie 2, met het ken merk, dat trap e) uitgevoerd wordt door het mengsel van trap d) uit een onder druk staande ruimte te spuiten.

8. Werkwijze volgens conclusie 2, pi e t het ken merk, dat het werkzame bestanddeel bestaat uit enzymen, enzym-cellen, antigenen, antilichamen, antisera, hormomen of coënzymen, verbonden met een macromoleculaire massa, complexvormend middel of kleurstof.

9. Werkwijze volgens conclusie 2, met het ken merk, dat de polymeermassa bestaat uit cellulosepolymeren, ver-esterde of veretherde alkylpolymeren, polyamide), polymeren of co-polymeren van acrylonitril, butadieen, isopropeen, acrylaten, metacrylaten, vinylesters, vinylchloriden, vinylideenchloride, 20 styreen, vinylbutyraat of gamma-methyl glutamaat.

10. Werkwijze volgens conclusie 2, met het ken merk, dat het oplosmiddel voor de polymeermassa bestaat uit aceton, methylisobutylketon, cyclohexanon, methylacetaat, methyl-cellosolve-acetaat, methylcellosolve, ethyllactaat, methyleenchlo-25 ride, propyleenchloride, tetrachloorethaan, nitromethaan, chloor- fenol, metacresol, azijnzuur, mierenzuur, dimethylformamide, dimethyl-sulfoxide, alkoholen, dioxan, koolwaterstoffen, ketonen, esters, pyridine, chloroform, mengsels van ethanol en water, ethanol en CCl^ of isopropanol en methylethylketon.

11. Werkwijze volgens conclusie 2, met het ken merk, dat het medium van trap b) bestaat uit een alkohol, keton, ether, ester, zuur, pyridine, acetonitril, cyclohexaan of dimethyl-formamide. 800 0 9 62