DE1227855B

DE1227855B - Verfahren zur Herstellung von Enzymkoerpern fuer die Durchfuehrung enzymatischer Reaktionen

Info

Publication number: DE1227855B
Application number: DEL36563A
Authority: DE
Inventors: Dr Fred Leuschner
Original assignee: Hermanni & Co; ICHTHYOL GES
Current assignee: Hermanni & Co; ICHTHYOL GES
Priority date: 1960-07-12
Filing date: 1960-07-12
Publication date: 1966-11-03
Also published as: GB953414A; BE606012A; FR1306640A; SE304235B; CH425697A; BR6130452D0

Description

Verfahren zur Herstellung von Enzymkörpern für die Durchführung enzymatischer Reaktionen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Enzymkörpern für die Durchführung enzymatischer Reaktionen. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Enzym oder enzymhaltigen Mikroorganismus in trockener, emulgierter oder gelöster Form einer Lösung eines semipermeablen Materials, wie Polyamid, Polyvinylacetat, Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Äthylcellulose, Kautschukchlorid oder Lipoide oder einer Lösung aus Gemischen dieser Stoffe, einverleibt und anschließend die entstandene Lösung, Emulsion oder Suspension unter Trocknung formt.
Bei der Verwendung von Enzymen oder enzymhaltigen Mikroorganismen ist, auch wenn die Enzyme oder Mikroorganismen als Kolloide vorliegen, die Trennung von Enzym oder enzymhaltigen Mikroorganismus und Substrat nach beendeter Reaktion schwierig und unwirtschaftlich. Es ist zwar bekannt, Enzyme an Trägerstoffen zu adsorbieren oder in die wäßrige stationäre Phase einer Zweiphasenkolonne aufzunehmen, wobei kontinuierliche Verfahrensweisen möglich sein sollen. Die Anwendung ist jedoch auf Einzelfälle beschränkt. Ein erheblicher Nachteil aller dieser Verfahren ist die teilweise Inaktivierung der Enzyme bei der Adsorption. Außerdem fehlt in beiden Fällen ein wirksamer Schutz vor enzyminaktivierenden Stoffen, wie Proteasen, die sehr leicht mit Parasiten in den Reaktionsansatz eingeschleppt werden können.
Schließlich können die locker am Träger haftenden Enzyme leicht von der mobilen Substratphase mitgerissen werden, so daß der Vorteil dieser Verfahren - die einwandfreie Trennung der Enzyme vom Substrat - nicht erreicht wird.
Es besteht also ein Bedürfnis, Enzyme oder enzymhaltige Mikroorganismen als feste Körper vorliegen zu haben, daß sie einfach und billig von dem Substrat abtrennbar sind.
Gemäß der Erfindung geschieht dies in neuartiger Weise dadurch, daß Enzymkörper für die Durchführung von enzymatischen Reaktionen hergestellt werden. Dabei bestehen diese Enzymkörper aus Enzymen bzw. enzymhaltigen Mikroorganismen, die in semipermeablem Material eingebettet sind, so daß das Substrat durch die semipermeable Membran hindurchdringen, mit dem Enzym oder enzymhaltigen Mikroorganismus in Kontakt treten und reagieren sowie anschließend wieder durch die semipermeable Membran austreten kann. Eine Trennung der entsprechenden Enzymkörper von der Substratfiüssigkeit ist sehr leicht möglich, so daß also eine einfache Wiedergewinnung der entsprechenden Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen sowie die mehrfache Anwendung derselben oder auch die aufeinanderfolgende Anwendung verschiedener Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen auf das gleiche Substrat möglich sind. Vor allem ist auch ein kontinuierlicher Einsatz in einfacher Weise erreichbar. Es kann ohne Schwierigkeiten erreicht werden, daß das Enzym oder der enzymhaltige Mikroorganismus in dem Enzymkörper eingeschlossen bleibt, indem man die Porenweite des Einbettungsmaterials geringer als den Durchmesser der eingebetteten Stoffe wählt. Es kann vorkommen, daß die Umsatzgeschwindigkeit durch die Einbettung des Enzymmaterials etwas verringert wird, so daß also auch die Ausbeute bei einzelnen Reaktionen sinkt. Die Gesamtausbeute ist aber trotzdem erheblich höher, da das Enzym jetzt mehrmals abgetrennt und wieder verwendet werden kann, was bisher nicht möglich war.
Die in semipermeables Material eingebetteten und damit gesicherten Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen werden den üblichen Reaktionsansätzen hinzugefügt. Außer wäßrigen Lösungen ist auch die Anwendung organischer, mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittel möglich. In diesem Fall muß das semipermeable Material vorher ausgiebig gewässert werden. Außerdem muß das Lösungsmittel wassergesättigt sein.
Als semipermeables Material kann man irgendeine inerte Substanz verwenden, die das Enzym oder den enzymhaltigen Mikroorganismus einzubetten vermag, im Reaktionsmedium unlöslich ist, jedoch dem Enzym oder dem enzymhaltigen Mikroorganismus freien Durchtritt gestattet. Bewährt haben sich z. B. abgewandelte Naturstoffe, wie Cellulosenitrat, -acetat, Äthylcellulose und Kautschukhydrochlorid, oder Kunststoffe, wie Polyamid und Polyvinylacetat; auch Lipoide eignen sich. Um funktionell einwandfreie Einbettungssubstanzen zu erhalten, ist häufig die Mischung semipermeabler Stoffe notwendig, wie z. B.
Lipoid mit Cellulosenitrat. Diese Mischungen ermöglichen eine feinere Anpassung an die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Substrat und Enzym oder enzymhaltigen Mikroorganismus.
Die Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen werden trocken, emulgiert oder gelöst in das gelöste Einbettungsmaterial eingearbeitet. Dabei erhält man eine Suspension, Emulsion oder Lösung des einzubettenden Materials in der Lösung des Einbettungsmaterials. Der Ansatz wird darauf unter Beachtung der für das einzubettende Gut erforderlichen Vorsicht getrocknet und gegebenenfalls gehärtet. Während des Verfestigungsvorgangs erhält das Gemisch die gewünschte Form, beispielsweise durch Aufstreichen, Aufbürsten, Aufspritzen auf anderartiges Material, durch Eintauchen von Arbeitsgeräten zur Herstellung von Überzügen, durch Ausgießen oder Auswalzen zur Herstellung von Membranen, durch Zerstäubungstrocknung zur Herstellung von Hohlkugel oder durch Zerschneiden zur Herstellung von Lamellen oder Füllkörpern für Säulen.
Für die Einbettung der Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen in das semipermeable Einbettungsmaterial muß die Labilität der Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen berücksichtigt werden.
Enzyme oder enzymhaltige Mikroorganismen, die während der Einbettung in einem offenen System und/oder bei Zimmertemperatur inaktiviert werden, können bei tiefen Temperaturen, im Vakuum oder in einer inerten Gasphase verarbeitet werden.
Besonders bewährt hat sich die Suspendierung eines trockenen Mikropulvers im semipermeablen Material, das in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen ist. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bleibt die Enzym oder enzymhaltigen Mikroorganismus enthaltende Membran zurück. Auch in Wasser gelöste Enzyme können je nach den Eigenschaften des semipermeablen Einbettungsmaterials und -dessen Lösungsmittel eingeschlossen werden. In diesem Fall werden die gelösten Enzyme im gelösten semipermeablen Einbettungsmaterial fein emulgiert.
Die Trocknung, bei Kunststoffen auch die Härtung, muß so gelenkt werden, daß die wäßrige Phase - meist in Form winziger Tröpfchen - zurückbleibt Bei enzymhaltigen Mikroorganismen empfiehlt sich in der Regel eine vorausgehende Gefriertrocknung aus einer Gelatinelösung.
Die äußere Form der Enzymkörper kann den praktischen Erfordernissen angepaßt werden. Besonders geeignet sind Lamellen, Kugeln und Überzüge für Arbeitsgeräte, wie Walzen, Glasgefäße oder Konservendosen. In Reaktionssäulen bewähren sich Kugeln und poröses Material. Zum kontinuierlichen Betrieb in Säulen werden häufig Hohlkugeln (Mikroballons) herangezogen, sogenannte Enzymgranula.
Es ist nicht erforderlich, daß die Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen in reiner Form eingebettet werden. Auch unreine Präparate können benutzt werden. Die unreinen Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen werden häufig im wäßrigen Milieu durch unerwünschte Begleitenzyme (z. B.
Proteasen) in kurzer Zeit inaktiviert. In eingebetteter Form werden verunreinigte Enzyme oder enzymhaltige Mikroorganismen jedoch vielfach langsamer zerstört. Die Einbettung führt außerdem zu einem fast vollkommenen Schutz vor inaktivierenden Parasiten im Reaktionsansatz. Die Enzymkörper können durch Zusätze, wie lonenaustauscher, Redoxsub- stanzen oder Kunststoffhärter bzw. -modifizierungsmittel, verbessert werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Enzymkörper besitzen gute Lagerfähigkeit. Sie ermöglichen die kontinuierlich oder im Schichtverfahren durchgeführte Umsetzung von Substraten auf biologischem Wege bei langer Verwendbarkeit und rascher Abtrennbarkeit der Enzyme oder enzymhaltigen Mikroorganismen. Man kann daher ein Substrat durch aufeinanderfolgende Kontaktierung mit verschiedenen eingebetteten Enzymen oder enzymhaltigen Mikroorganismen auch stufenweise umsetzen.
Die erfindungsgemäß hergestellten Enzymkörper lassen sich beispielsweise für synthetische und analytische Arbeiten oder zur Abwässerreinigung benutzen.
Fermentgranula (Mikroballons) in geeigneter Größe sind für Injektionszwecke brauchbar, wie im Tierversuch gefunden werden konnte.
Beispiel 1 Gewinnung von l-Alanin durch Transaminierung im System 1-Glutaminsäure- Brenztraubensäure mit Enzymlamellen l-Glutaminsäure + Brenztraubensäure = l-Alanin + o;-Ketoglutarsäure 10 g Glutaminsäure - Brenztraubensäure - Transaminase (Trockenpulver aus Schafherz nach K r e b s) werden fein gepulvert und in 6000g einer wasserfreien Cellulosenitratlösung suspendiert. Diese Lösung besteht aus 2,1 0/o Cellulosenitrat, 52,8 0/o Diäthyläther, 14,101, absolutem Äthylalkohol, 20,9 0/o Aceton, 6,40/o Amylalkohol und 3,7 01o Äthylenglykoläthyläther (alle Angaben in Gewichtsprozent). Die Mischung wird auf einer horizontalen, 4 m2 großen Glasfläche ausgegossen und in einer feuchtigkeitsarmen Atmosphäre bei 22"C 75 Minuten getrocknet. Daraufhin wird die Membran 12 Stunden gewässert und in Lamellen von 1 cm2 zerschnitten. Die Membrandicke beträgt 0,2 bis 0,3 mm, die Porenweite 5 mp.
Die Enzymlamellen werden zu 201 eines Reaktionsansatzes gegeben, der 0,05molar an Natriumpyruvat und 0,05molar an Natriumglutamat (l-Form) und auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und gepuffert ist.
Dieser Ansatz wird 5 bis 6 Stunden bei 25° C inkubiert und daraufhin bei Verwendung der alten Lamellen erneuert. Der gleiche Wechsel wird 28 Tage vorgenommen. Aus der wäßrigen, kolloidfreien Reaktionsfiüssigkeit wird l-Alanin durch gleichförmige multiplikative Verteilung nach 1 a n t z e n abgetrennt. Ausbeute 1550 g l-Alanin.
Zum Vergleich werden die Ergebnisse angeführt, die bei der bisher üblichen Anwendung der Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase in kolloidaler Lösung erzielt werden. Das Enzym ist in diesem Fall nur einmal verwendbar. Aus einem 20-l-Ansatz können im Mittel 30 g l-Alanin gewonnen werden.
Bei der 28tägigen Anwendung der Enzymlamellen ist somit die Ausbeute etwa fünfzigmal größer. Im einzelnen zeigt die Wiederverwendbarkeit das folgende Beispiel: Beispiel 2 Rückgewinnung von Glutaminsäure - Brenztraubensäure - Transaminase aus »Enzymlamellen« Die Enzymlamellen wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt.
10 g Enzymlamellen mit 5 g Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase wurden in einem Gemisch aus 52,8 0/o Diäthyläther, 14,1 0/o absolutem Alkohol, 20,9 °/o Aceton, 6,4 0/o Amylalkohol und 3,74/O Äthylenglykoläthyläther (alle Angaben in Gewichtsprozent) gelöst und daraufhin bei 10 bis 150C0 g abzentrifugiert. Das klare Überstehende wurde dekantiert. Der Bodenkörper wurde erneut in den oben angeführten Lösungsmittelgemisch aufgenommen, kräftig geschüttelt und dann zentrifugiert.
Nach einer dritten Waschung wurde der Bodenkörper in Aceton suspendiert, abgesaugt, mit Diäthyläther gewaschen und dann über Phosphorpentoxyd getrocknet und gewogen. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte gemäß Beispiel 1. Der Verlust an Enzymaktivität beträgt nach dieser Behandlung 0,82 g (Mittel aus drei Versuchen). Dies sind 16,40/» der Einwaage (5 g Fermentpulver in Enzymlamellen).
Werden 5 g Fermentpulver ohne Einschluß in Enzymlamellen in der gleichen Weise behandelt, dann beträgt der Verlust 0,68 g (drei Versuche). Dies entspricht 13,6 % der Einwaage.
Um die Anwendbarkeit der Enzymkörper bei wasserlöslichem und auch hochmolekularem Substrat darzustellen, wurden folgende Beispiele erprobt: Beispiel 3 Enzymatische Spaltung von Stärke Enzympräparat Takamine Special Diastase HT Concentrate wird in der oben beschriebenen Weise eingeschlossen.
Enzymansatz 50 mg Diastase in Partikelform, 100 mg lösliche Stärke Erg. B. 6 in 10 ml 10molarem Phosphatpuffer (pH 7,0). Inkubationszeit: 4 Stunden bei 37"C. Die freigesetzte Glucose wird nach F i s c h e r und D ö r f e l (Z. physiol. Chemie, 297 164 [1954]) bestimmt.
Von der Glucosebestimmung werden die Enzympartikeln abzentrifugiert und in zwei weiteren Ansätzen benutzt. Die Einzelergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt worden (Mittelwerte aus fünf Untersuchungen).
Die beiden nachfolgenden Ansätze zeigen fast unveränderte hydrolytische Eigenschaften.
Stärkeumsatz in Prozent der eingesetzten Menge bei 4stündiger Inkubation Kontrolle (Enzympartikeln).................... <0,1% (Stärke)............................ <1,0% Enzympartikeln mit Stärke 1. Ansatz .......................... 16,2% 2. Ansatz .......................... 14,8% 3. Ansatz .......................... 12,3% Beispiel 4 Enzymatischer Abbau von Methylbutyrat durch Lipase aus Schweinepankreas Enzympräparat 10 g Lipase aus Schweinepankreas (Mann Researoh Lab., New York) in Form eines Mikropulves werden in 500 mi einer Cellulosenitratlösung suspendiert und sprühgetrocknet. Die Cellulosenitratlösung besteht aus 2,1% Cellulosenitrat, 52,8% Duäthyläther, 14,1% absoluten Äthylalkohol, 20,9% Aceton, 6,4% Amylalkohol und 3,70/» Äthylenglykoläthyläther (alle Angaben in Gewichtsprozent). Die mittlere Partikelgröße beträgt 1 bis 5 p. Höchsttemperatur bei der Sprühtrocknung 40"C. Nach dreimaligem Waschen in destilliertem Wasser (unverzüglich nach der Sprühtrocknung) und Abzentrifugieren sind die Partikeln gebrauchsfertig.
Enzymansatz Partikeln, die eine Enzymmenge von 50 mg Lipase enthalten, werden in 7 mol einer frisch bereiteten Lösung, die 0,4 m Glykokoll, 0,1 n-NaOH und 10/o Methylbutyrat enthält, suspendiert. Außerdem werden Ansätze mit einem Fünftel, einem Zehntel und einem Zwanzigstel Enzymgehalt geprüft. Die Gefäße mit dem Enzymansatz werden mit einer Kappe verschlossen und 5 Stunden bei 40°C im Wasserbad gehalten. Die Enzympartikeln werden nach Abschluß der Inkubation durch Zentrifugieren zurückgewonnen und in zwei gleichen Ansätzen erneut verwendet.
Die Bestimmung der Enzymaktivität durch Titration mit 0,05 n-HCl und Bromthymolblau als Indikator erfolgt nach G 1 i c k (Z. f. physiol. Chemie, 223 252 [1934]).
Aus der folgenden Tabelle ist zu entnehmen, daß die Enzympartikeln Lipaseaktivität besitzen und mehrfach benutzt werden können.

Titrierwerte (ml n/20-HCl, Mittelwerte aus drei Bestimmungen)

Enzymverdünnung

1 5 10 20

Kontrolle .... 11,16 11,36 11,26 11,51

1. Ansatz .... # 2,96 # 1,62 # 0,61 # 0,22

2. Ansatz .... # 2,18 # 1,51 # 0,62 # 0,29

3. Ansatz .... # 2,31 # 1,48 # 0,52 # 0,31

Beispiel 5 Enzymatischer Abbau von Keratin (Wolle) durch Trypsin 10g Trypsin 1 : 80 (Mann Research Lab., New York) als Mikropulver werden in der vorher beschriebenen Weise in 500 ml Cellulosenitratlösung suspendiert und sprühgetrocknet. Die Partikeln werden sofort nach der Sprühtrocknung gewaschen.

Enzymansatz Die Bestimmung erfolgt nach Go d d a T d und Micha-elis (J. biol. Chem., 106 605 {1934]) mit nativer Schafwolle, die durch Ätherextraktion vom Fett befreit und mehrfach gewaschen wird. 1 g Wolle wird in 100 ml Bicarbonatpuffer (pH 8,5) für 24 Stunden bei 37oC mit 1 g Trypsin (in Enzympartikeln) inkubiert. Zur Kontrolle werden Enzympartikel und Wolle getrennt untersucht.
Nach der Inkubation wird das Protein mit Sulfon salicylsäure ausgefällt und der Stickstoffgehalt im Überstehenden nach K j e l d a h l bestimmt.
Ergebnisse In der folgenden Tabelle sind -die Spaltungsraten in Milligramm N pro Ansatz zusammengestellt worden.
Daraus ist zu ersehen, daß die oben beschriebenen Enzympartikeln Keratin (Wolle) zu hydrolysieren vermögen.
Stickstoffgehalt in Milligramm pro Ansatz nach 24stündiger Inkubation von Trypsin in Partikelform in einer Keratinsuspension (Mittelwerte aus fünf Untersuchungen) Keratin (Wolle) ohne Enzympartikeln <0,2 mg Trypsin (Enzympartikeln) ......... <0,2 mg Keratin und Trypsin (Enzympartikeln) 6,4 mg Beispiel 6 Trennung von d,l-Tryptophan durch Spaltung von Acetyl-d,l-Tryptophan mit Aspergillus oryzae Als Beispiel für eine Reaktion mit einem enzymhaltigen Mikroorganismus wird Acetyl-d,l-Tryptophan einer asymmetrischen Hydrolyse durch Aspergillus oryzae unterworfen. l-Tryptophan und Acetyl-d-Tryptophan werden dann getrennt. Aspergillus oryzae ist in Cellulosenitrat eingebettet.
Aspergillus oryzae (Ahlburg-Cohn) Nr. 4814 wird in der üblichen Weise auf einem homogenisierten Nährmedium aus Glucose, Pepton, Glyzerin und Nährbouillon gezüchtet. Der gesamte Ansatz wird bei 40°C sprühgetrocknet und das Trockenpulver, das einen Feuchtigkeitsgehalt von 2 bis 50/» hat, in Cellulosenitrat nach Beispiel 1 eingearbeitet.
Die Celluloselamellen, die 15 g Aspergillus-oryzae-Sprühpulver enthalten, werden zu 400 ml eines Reaktionsansatzes gegeben, der 0,1 Mol Acetyl-d,l-Tryptophan enthält und auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und gepuffert ist. Der Ansatz wird 48 Stunden bei 37°C gehalten und daraufhin bei Verwendung der alten Lamellen erneuert. Der gleiche Wechsel kann mehr als zehnmal vorgenommen werden. Aus der wäßrigen Reaktionsflüssigkeit werden l-Tryptophan und Acetyl-d-Tryptophan in der üblichen Weise (J. P. Greenstein und M. Winitz Chemistry of the Amino Acids, New York 1961, S. 2343) gewonnen. Bei zehnmaliger Verwendung der Aspergillusoryzae-Lamellen werden 0,38 Mol l-Tryptophan erhalten. Wird Aspergillus in der bekannten Weise zur Trennung benutzt, dann ist nur eine einmalige Verwendung möglich. Die Ausbeute beträgt dann 0,046 Mol l-Tryptophan.
Beispiel 7 Kontinuierliche Trennung von d,l-Methionin durch Spaltung von Acetyl-d,l-Methionin an einer Enzymsäule mit Aminosäureacylase I Acetyl-d,l-Methionin wird im kontinuierlichen Verfahren einer asymmetrischen Hydrolyse durch ein Enzym aus Schweineniere, das in Cellulosenitrat eingebettet ist, unterworfen. Daraufhin trennt man l-Methionin und Acetyl-d-Methionin.
1 g Aminosäureacylase I (Aceton-Trockenpulver aus Schweineniere) wird wie im Beispiel 1 behandelt, in einer Cellulosenitratlösung aufgenommen und zu einer 1 mm dicken Membran ausgegossen. Daraus werden mit einer Schneidemaschine unregelmäßig gestaltete Teilchen von etwa 1 bis 2 mm Durchmesser hergestellt, die man in eine Glassäule füllt (Durchmesser 2,5 cm, Länge 25 cm), wie sie für die Verteilungschromatographie gebraucht wird. Die Säule wird 6 Stunden mit eiskaltem Wasser gewaschen (Durchlauf etwa 50 ml/Std.) und anschließend mit einer 0,07molaren Lösung von Acetyl-d,l-Methionin beschickt, deren pH-Wert 7,4 beträgt. Der Durchlauf beträgt 50 ml/Std. l-Methionin und ungespaltenes Acetyl-d-Methionin werden durch gleichförmige multiplikative Verteilung nach J a n t z e n im Lösungsmittelgemisch n/10-HCl-Essigsäureäthylester aufgetrennt. l-Methionin bleibt dabei in der wäßrigen Phase. Diese Lösung wird im Vakuum eingeengt und l-Methionin mit absolutem Äthylalkohol gefällt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Wasser-Äthylalkohol.
Diese Enzymsäule wird 28 Tage zur kontinuierlichen Razemattrennung benutzt. Es werden 140 g l-Methionin gewonnen. Wird die gleiche Enzymmenge in der bekannten Weise zur Trennung benutzt, dann beträgt die Ausbeute im einmaligen 24stündigen Ansatz 15 g l-Methionin.
Beispiel 8 Enzymatischer Abbau von Äd-Glucose in frischem Eiweiß aus Hühnerei Um die gewerblichen Eigenschaften von Hühnereiweiß zu verbessern, wird die störende ß-d-Glucose durch ein Enzymsystem, das in Cellulosenitrat eingebettet ist, in d-d-Gluconsäurelacton umgewandelt.
Nach der Umsetzung werden die Enzyme vollständig wiedergewonnen und können mehrfach erneut verwendet werden. Das Hühnereiweiß wird annähernd glucosefrei und kann weiterverarbeitet werden.
10 g rohe Glucoseoxydase und 1 g partiell gereinigte Meerrettich-Peroxydase werden wie im Beispiel 1 in eine Cellulosenitratlösung aufgenommen und zu einer etwa 0,3 mm dicken Membran ausgegossen. Die mittlere Porenweite beträgt 7 mµ. Diese Membran wird in etwa 1 cm2 große Lamellen zerschnitten, die für 5 Stunden bei 25° C mit 2 kg Hühnereiweiß unter leichtem Rühren inkubiert werden. Nach Beendigung der Umsetzung ist die Glucosekonzentration unter 2 mg/%. Die Enzymlamellen lassen sich leicht vom Eiweiß abtrennen und in wenigstens sechs bis acht weiteren Ansätzen weiter verwenden.
Ohne diese Fixierung in Lamellen kann das Enzymsystem üblicherweise nicht zurückgewonnen werden.
Beispiel 9 Enzymatischer Schutz der Mayonnaise vor oxydativen Prozessen Das 02- und glucoseverbrauchende Enzymsystem Glucoseoxydase-Katalase verhindert in Mayonnaise, solange sie in luftdichten Konservendosen aufbewahrt wird, Geruchs- und Geschmacksverluste und die Bildung von Peroxyden. Die Konservendosen werden mit einer Polyurethanfolie ausgekleidet, in die das Enzymsystem eingebettet ist.
5 g eines penicillinfreien, lyophilisierten Stammes von Penicillium notatum (nach C. E. C o u t h a r d, R. Michaelis, W. F. Short, G. Sykes, G. E. H. Shrinshire, A. F. B. Standfast, J. H. Birkinshaw und H. Raistrick, Biochem. J., 39 24, 1945) vermischt mit 0,5 g partiell gereinigter Meerrettich-Katalase nach H. Theorell, Arkiv. Kemi Mineral. Geol., 16A, Nr. 2, 1942, werden in 200 ml einer Lösung zur Herstellung von Polyurethanfolien (100 Teile Desmophen 1100, einem verzweigten Polyester aus Adipinsäure, Triol und Butylenglykol, und 30 Teilen Desmodur L, einer 75 0/0eigen Lösung von Polyurethanen in Äthylacetat, Bayer-Kunststoffe, 2. Auflage, Leverkusen 1959) aufgenommen. Mit diesem Gemisch wird eine 1000-ml-Dose aus Glas ausgekleidet. Die Härtung des Films benötigt etwa 24 Stunden bei Zimmertemperatur.
800 bis 1000 ml schwach saure Mayonnaise können in dieser verschlossenen Dose 5 Monate ohne die sonst bekannten Zersetzungserscheinungen aufbewahrt werden.
Beis-piel 10 Kontinuierliche Spaltung von Saccharose durch Invertase, die in Polyvinylalkohol eingebettet ist Saccharose wird im kontinuierlichen Verfahren der Hydrolyse in Glucose und Fructose durch das Enzym Invertase, das in Polyvinylalkohol eingebettet ist, unterworfen.
2 g partiell gereinigte Invertase werden in 200 ml einer 10 obigen wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (Mowiol N 70-88) aufgenommen und zu einer etwa 1 mm dicken Membran nach bekannten Verfahren verarbeitet. Daraus werden mit einer Schneidemaschine unregelmäßig gestaltete Teilchen von 1 bis 2 mm Größe hergestellt und in eine Säule gefüllt, wie sie im Beispiel 2 beschrieben worden ist. Diese Säule wird bei Zimmertemperatur mit einer 0,20/,eigen Lösung von Saccharose in wäßrigem n-Butanol beschickt. Der Durchfluß beträgt 40 ml/Std.
Diese Enzymsäule wurde 16 Tage ohne Unterbrechung mit Saccharoselösung beschickt. Im Durchlauf konnten nur Spuren Saccharose wiedergefunden werden. Die Ausbeute an Glucose betrug 670/» der Theorie.
Beispiel 11 Im Beispiel 1 wird die Cellulosenitratlösung durch einen Zusatz von 1,5 °/o Rizinusöl ergänzt. Dieser Lipoidzusatz zur Membran verbessert offenbar die semipermeablen Eigenschaften. Die Alaninausbeute wird dabei um im Mittel 70/0 gesteigert. Ein Nachteil dieser Lipoid- Cellulosenitrat-Membran ist die etwas größere Anfälligkeit gegen bakterielle Zersetzung beim langdauernden Gebrauch.
Beispiel 12 Im Beispiel 7 wurde die Cellulosenitratlösung durch eine 2 0/»ige Lösung von Kautschuk-Hydrochlorid in Benzol ersetzt und daraus eine 1 mm dicke Membran mit Filterpapier als Trägermaterial durch Eintauchen hergestellt. - Diese Membran wurde wie im Beispiel 2 weiterverarbeitet und in eine Säule gefüllt. Der Durchlauf betrug 5 ml/Std. Diese Enzymsäule wurde 10 Tage zur kontinuierlichen Racemattrennung benutzt. Es wurden 26 g l-Methionin gewonnen. Der Vorteil dieser Säule ist eine große Widerstandsfähigkeit gegen bakterielle Zerstörung.

Claims

Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von Enzymkörpern für die Durchführung enzymatischer Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Enzym oder enzymhaltigenMikroorganismus in trockener, emulgierter oder gelöster Form einer Lösung eines semipermeablen Materials, wie Polyamid, Polyvinylacetat, Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Äthylcellulose, Kautschukchlorid oder Lipoide oder einer Lösung aus Gemischen dieser Stoffe, einverleibt und anschließend die entstandene Lösung, Emulsion oder Suspension unter Trocknung formt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung des semipermeablen Materials noch Ionenaustauscher, Redoxsubstanzen oder Kunststoffhärter bzw. Modifizierungsmittel zugesetzt werden.