CH634876A5

CH634876A5 - Immobilised, support-fixed, enzyme

Info

Publication number: CH634876A5
Application number: CH187576A
Authority: CH
Inventors: Joseph Levy; Murray Campbell Fusee
Original assignee: Uop Inc
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-02-16
Publication date: 1983-02-28
Also published as: NL7601580A; CA1058538A; DK145104B; CS209424B2; DD123346A5; DE2605797B2; EG11923A; FR2301533A1; IE42482L; ES445248A1; BE838684A; ATA116176A; YU37476A; AU1117376A; NO760511L; SE434064B; ZA76871B; PL102119B1; DE2605797A1; FR2301533B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym. The present invention relates to an immobilized carrier-fixed enzyme.

Es ist bekannt, dass Enzyme, die Proteinnatur haben und gewöhnlich wasserlöslich sind, biologische Katalysatoren sind, die dazu dienen, viele und unterschiedliche chemische Reaktionen zu regulieren, die in lebenden Organismen auftreten. Die Enzyme können auch isoliert und auf analytischen, medizinischen und industriellen Anwendungsgebieten verwendet werden. Beispielsweise finden sie in der Industrie Verwendung bei der Herstellung von Lebensmittelprodukten, wie Käse oder Brot, und ausserdem werden sie bei der Herstellung alkoholischer Getränke verwendet. Einige spezielle Anwendungen in der Industrie sind beispielsweise die Verwendung von Enzymen zur Auftrennung von Aminosäuren, bei der Modifizierung von Penicillin unter Bildung verschiedener Substrate derselben, die Verwendung verschiedener Proteasen bei der Käseherstellung, beim Zartmachen von Fleisch, für Detergenspräparate, bei der Lederherstellung und als Verdauungshilfen, die Verwendung von Carbo-hydrasen bei der Stärkehydrolyse, bei der Rohrzuckerinversion, bei der Glukoseisomerisierung usw., die Verwendung von Nucleasen bei der Gerucheinstellung oder die Verwendung von Oxidasen für die Oxidationsverhinderung und Farbeinstellung von Nahrungsmitteln. Diese Verwendungen sowie viele andere sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Enzymes that are protein in nature and are usually water-soluble are known to be biological catalysts that serve to regulate many and different chemical reactions that occur in living organisms. The enzymes can also be isolated and used in analytical, medical and industrial applications. For example, in industry they are used in the manufacture of food products such as cheese or bread, and they are also used in the manufacture of alcoholic beverages. Some specific applications in industry include the use of enzymes to separate amino acids, to modify penicillin to form various substrates thereof, to use different proteases in cheese making, to tenderize meat, for detergent preparations, in leather manufacture and as digestive aids , the use of carbohydrates in starch hydrolysis, cane sugar inversion, glucose isomerization, etc., the use of nucleases in odor control or the use of oxidases for the prevention of oxidation and color adjustment of foods. These uses, as well as many others, are described in detail in the literature.

Wie oben ausgeführt wurde, sind Enzyme, da sie gewöhnlich wasserlöslich und allgemein instabil und leicht deaktivierbar sind, auch schwierig aus den Lösungen, in welchen sie benützt werden, für eine nachfolgende Wiederverwendung zu isolieren, bzw. es ist schwierig, ihre kataly-tische Aktivität über relativ lange Zeiträume zu erhalten. Diese Schwierigkeiten führen natürlich zu erhöhten Kosten bei der Verwendung von Enzymen für gewerbliche Zwecke, da es nötig ist, dieses Enzym häufig zu ersetzen, wobei ein solcher Ersatz gewöhnlich mit jeder Anwendung erforderlich ist. Um den hohen Kosten eines Ersatzes oder Austausches entgegenzuwirken, wurde schon vorgeschlagen, die Enzyme vor ihrer Verwendung zu immobilisieren bzw. unlöslich zu machen. Durch eine Immobilisierung bzw. Trägerfixierung der Enzyme durch verschiedene Systeme, die nachfolgend im einzelnen noch erläutert werden, ist es möglich, die Enzyme relativ zu stabilisieren und daher die Wiederverwendung des Enzyms zu ermöglichen, das sonst einer Dealctivierung unterliegen oder in dem Reaktionsmedium verlorengehen würde. Solche immobilisierten bzw. trägerfixierten oder unlöslich gemachten Enzyme können in verschiedenen Reaktorsystemen verwendet werden, wie in gepackten Säulen, gerührten Behälterreaktoren usw., je nach der Natur des Substrates, das darin benützt wird. Im allgemeinen liefert die Immobilisierung der Enzyme eine günstigere oder breite Umgebunsstabilität, ein Minimum an Auslaufproblemen und Materialbehandlung sowie die Möglichkeit, die Aktivität des Enzyms selbst aufzubessern. As stated above, because enzymes are usually water-soluble and generally unstable and easily deactivated, enzymes are also difficult to isolate from the solutions in which they are used for subsequent reuse, or their catalytic activity is difficult over a relatively long period of time. These difficulties, of course, result in increased costs of using enzymes for commercial purposes since it is necessary to replace this enzyme frequently, which replacement is usually required with every application. In order to counteract the high costs of replacement or replacement, it has already been proposed to immobilize the enzymes or to make them insoluble before they are used. By immobilization or carrier fixation of the enzymes by various systems, which will be explained in detail below, it is possible to stabilize the enzymes relatively and therefore to enable the enzyme to be reused, which would otherwise be subject to dealctivation or would be lost in the reaction medium. Such immobilized or carrier-fixed or insolubilized enzymes can be used in various reactor systems, such as in packed columns, stirred tank reactors, etc., depending on the nature of the substrate used therein. In general, the immobilization of the enzymes provides a more favorable or broad environmental stability, a minimum of leakage problems and material treatment as well as the possibility to improve the activity of the enzyme itself.

Wie oben ausgeführt wurde, sind bereits verschiedene allgemeine Methoden sowie zahlreiche Modifikationen derselben beschrieben worden, durch welche die Irrmobilisie-rung von Enzymen erreicht werden kann. Eine allgemeine Methode besteht darin, das Enzym auf einer festen Oberfläche zu adsorbieren, beispielsweise Aminosäureacylase auf As stated above, various general methods and numerous modifications thereof have already been described, by means of which immobilization of enzymes can be achieved. A general method is to adsorb the enzyme onto a solid surface, for example amino acid acylase

5 5

10 10th

IS IS

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

00 00

65 65

3 3rd

634 876 634 876

einem Cellulosederivat wie DEAE-Cellulose; Papain oder Ribonuclease auf porösem Glas, Katalase auf Aktivkohle, Trypsin auf Quarzglas oder Cellulose und Chymotrypsin auf Kaolinit. Eine andere allgemeine Methode besteht darin, ein Enzym in einem Gelgitter einzuschliessen, indem man beispielsweise Glucoseoxidase, Urease oder Papain in ein Poly-acrylamidgel einschliesst, Acetylcholinesterase in ein Stärkegel oder ein Silicopolymer, Glutaminsäure-benztrauben-säuretransaminase in ein Polyamid-oder Celluloseacetatgel oder ähnliches. Eine weitere allgemeine Methode ist die Vernetzung mit Hilfe bifunktioneller Reagenzien und kann in Kombination mit jeder der oben erwähnten allgemeinen Immobilisierungsmethoden ausgeführt werden. Bei der Anwendung dieser Methode binden bifunktionelle oder polyfunktionelle Reagenzien, die eine intermolekulare Vernetzung induzieren können, kovalent die Enzyme aneinander sowie an den festen Träger. Diese Methode ist beispielsweise die Verwendung von Glutardialdehyd oder Bis-diazobenzidin-2.2'-disulfonsäure zur Bindung eines Enzyms wie Papin an einen festen Träger. Eine weitere Methode zur Immobilisierung eines Enzyms besteht in einer kovalenten Bindung, bei der Enzyme wie Glucoamylase, Trypsin, Papain, Pronase, Amylase, Glucoseoxidase, Pepsin. Rennin, Pilzprotease, Lactase usw. durch kovalente Bindung an ein polyineres Material gebunden werden, welches seinerseits an einen organischen oder anorganischen festen porösen Träger gebunden wird. Diese Methode kann auch mit den oben erwähnten Immobilisierungsverfahren kombiniert werden. a cellulose derivative such as DEAE cellulose; Papain or ribonuclease on porous glass, catalase on activated carbon, trypsin on quartz glass or cellulose and chymotrypsin on kaolinite. Another general method is to encapsulate an enzyme in a gel lattice by, for example, including glucose oxidase, urease or papain in a polyacrylamide gel, acetylcholinesterase in a starch gel or a silicopolymer, glutamic acid-pyruvic acid transaminase in a polyamide or cellulose acetate gel or the like . Another general method is cross-linking using bifunctional reagents and can be carried out in combination with any of the general immobilization methods mentioned above. When using this method, bifunctional or polyfunctional reagents that can induce intermolecular crosslinking covalently bind the enzymes to one another and to the solid support. This method is, for example, the use of glutardialdehyde or bis-diazobenzidine-2,2'-disulfonic acid to bind an enzyme such as papin to a solid support. Another method for immobilizing an enzyme is covalent binding, in which enzymes such as glucoamylase, trypsin, papain, pronase, amylase, glucose oxidase, pepsin. Rennin, fungal protease, lactase, etc. are bound by covalent binding to a polyiner material, which in turn is bound to an organic or inorganic solid porous carrier. This method can also be combined with the immobilization methods mentioned above.

Die oben aufgezählten Methoden zur Immobilisierung von Enzymen besitzen alle einige Nachteile, die gegen ihre Verwendung in industriellen Verfahren sprechen. Wenn beispielsweise ein Enzym direkt auf der Oberfläche eines Trägers adsorbiert wird, sind die Bindungskräfte, die zwischen dem Enzym und dem Träger auftreten, oftmals recht schwach, obwohl einige Literaturstellen sagen, dass ein relativ stabiler Verbund dieses Typs erreicht wurde, wenn die Porengrösse des Trägers und der Drehungsdurchmesser (Spindurchmesser) des Enzyms in Wechselbeziehung zueinander gebracht werden. Die Porengrösse des Trägers kann jedoch einen Durchmesser von etwa 1000 A nicht überschreiten. Im Hinblick auf diese schwache Bindung wird das Enzym oftmals leicht in Gegenwart von Lösungen des zu behandelnden Substrates desorbiert. Ausserdem kann das Enzym teilweise oder sehr stark infolge des Fehlens einer Mobilität oder infolge.einer Wechselwirkung zwischen dem Träger und den aktiven Stellen des Enzyms deaktiviert werden. Ein anderes Verfahren, das angewendet werden kann, ist der Einschluss von Enzymen in Gelgitter, was durch Polymerisieren einer wässrigen Lösung oder Emulsion, die die monomere Form des Polymers und das Enzym enthält, oder durch Einarbeitung des Enzyms in das vorgeformte Polymer nach verschiedenen Methoden, oftmals in Gegenwart eines Vernetzungsmittels, erreicht werden kann. Obwohl diese Methode einer Trägerfixierung oder Immobilisierung von Enzymen einen Vorteil hat, indem die zur Erreichung des Einschlusses benützten Reaktionsbedingungen gewöhnlich so mild sind, dass oftmals nur eine geringe Änderung oder Deaktivierung des Enzyms eintritt, hat diese Methode auch Nachteile, da der Verbund schlechte mechanische Festigkeit hat, die bei einer Verwendung in Säulen mit kontinuierlichen Fliesssystemen zu einer Verdichtung führt, was seinerseits eine Verstopfung der Säule nach sich zieht. Solche Systeme haben auch ziemlich weite Veränderungen der Porengrösse und führen so üblicherweise zu Porengrössen, die gross genug sind, um den Verlust von Enzym zu erlauben. Ausserdem können einige Porengrössen auch so klein sein, dass grosse Diffusionshindernisse für den Transport des Substrats und Produktes zu einer Reaktionsverzögerung führen, und dies trifft besonders dann zu, wenn man ein Substrat mit hohem Molekulargewicht verwendet. Die Nachteile, die bei der Immobilisierung eines Enzyms durch intermolekulare Vernetzung auftreten, wie oben bereits erwähnt wurde, beruhen in der Regel auf dem Mobilitätsmangel mit daraus resultierender Deaktivierung infolge der Unfähigkeit des Enzyms, die für maximale Aktivität erforderliche natürliche Konfiguration einzunehmen, besonders wenn die aktive Stellung in die Bindung einbezogen ist. The above-mentioned methods for immobilizing enzymes all have some disadvantages that speak against their use in industrial processes. For example, when an enzyme is adsorbed directly onto the surface of a support, the binding forces that occur between the enzyme and the support are often quite weak, although some literature reports that a relatively stable bond of this type has been achieved when the pore size of the support and the rotation diameter (spin diameter) of the enzyme can be correlated. However, the pore size of the carrier cannot exceed a diameter of approximately 1000 Å. In view of this weak binding, the enzyme is often easily desorbed in the presence of solutions of the substrate to be treated. In addition, the enzyme can be partially or very strongly deactivated due to the lack of mobility or due to an interaction between the carrier and the active sites of the enzyme. Another method that can be used is the inclusion of enzymes in gel lattice, which is done by polymerizing an aqueous solution or emulsion containing the monomeric form of the polymer and the enzyme, or by incorporating the enzyme into the preformed polymer by various methods, often in the presence of a crosslinking agent. Although this method of carrier fixation or immobilization of enzymes has an advantage in that the reaction conditions used to achieve the inclusion are usually so mild that there is often only a slight change or deactivation of the enzyme, this method also has disadvantages because the composite has poor mechanical strength which, when used in columns with continuous flow systems, leads to compaction, which in turn clogs the column. Such systems also have fairly wide changes in pore size, typically leading to pore sizes large enough to allow enzyme loss. In addition, some pore sizes can also be so small that large diffusion obstacles to the transport of the substrate and product lead to a delay in reaction, and this is particularly true if a substrate with a high molecular weight is used. The disadvantages that arise when immobilizing an enzyme by intermolecular crosslinking, as already mentioned above, are usually due to the lack of mobility with the resulting deactivation due to the inability of the enzyme to adopt the natural configuration required for maximum activity, especially when the active one Position is included in the bond.

Methoden kovalenter Bindung erwiesen sich als breit anwendbar und können entweder als die einzige Immobilisierungsmethode oder als ein Bestandteil vieler der bereits beschriebenen Methoden, in denen Vernetzungsreaktionen angewendet werden, benützt werden. Diese Methode wird oftmals dazu verwendet, das Enzym sowie den Träger über ein bifunktionelles Brückenmolekül zu binden, in welchem die funktionellen Gruppen des Moleküls, wie beispielsweise y-Aminopropyltriäthoxysilan, in der Lage sind, mit funktionellen Resten zu reagieren, die sowohl in dem Enzym als auch in einem organischen oder anorganischen porösen Träger vorhanden sind. Eine grosse Vielzahl von Reagenzien und Trägern wurde auf diese Weise verwendet, und die Methode hat den Vorteil, dass sie in dem zusammengesetzten Produkt starke kovalente Bindungen und in vielen Fällen grosse Aktivität schafft. Die kovalente Bindung des Enzyms an den Träger muss über funktionelle Gruppen an dem Enzym erreicht werden, die ihrerseits nicht wesentlich für seine katalytische Aktivität sind, wie freie Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, phenolische Gruppen, Sulfhydrylgruppen usw. Diese funktionellen Gruppen reagieren auch mit einer grossen Vielzahl anderer funktioneller Gruppen, wie einer Aldehydgruppe, Isocyanatgruppe, Acyl-gruppe, Diazogruppe, Azidogruppe, Anhydridgruppe, aktivierten Estergruppe usw., um kovalente Bindungen zu bilden. Dessenungeachtet hat diese Methode oftmals auch zahlreiche Nachteile, da sie teure Reaktanten und Lösungsmittel einschliesst und sehr spezielle und kostspielige poröse Träger und umständliche mehrstufige Verfahren verwendet, die das Herstellungsverfahren für gewerbliche Zwecke unwirtschaftlich machen. Covalent bond methods have been found to be widely applicable and can be used either as the only immobilization method or as part of many of the previously described methods using crosslinking reactions. This method is often used to bind the enzyme as well as the support via a bifunctional bridge molecule in which the functional groups of the molecule, such as y-aminopropyltriethoxysilane, are able to react with functional residues that are both in the enzyme and are also present in an organic or inorganic porous carrier. A wide variety of reagents and carriers have been used in this way and the method has the advantage that it creates strong covalent bonds and in many cases great activity in the assembled product. The covalent binding of the enzyme to the support must be achieved via functional groups on the enzyme, which in turn are not essential for its catalytic activity, such as free amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, phenolic groups, sulfhydryl groups etc. These functional groups also react with a large one A variety of other functional groups such as an aldehyde group, isocyanate group, acyl group, diazo group, azido group, anhydride group, activated ester group, etc., to form covalent bonds. Nevertheless, this method often has numerous disadvantages as it includes expensive reactants and solvents and uses very special and expensive porous supports and cumbersome multi-step processes which make the manufacturing process uneconomical for commercial purposes.

Nach dem Stand der Technik gibt es daher viele Methoden zur Immobilisierung von Enzymen, doch erfüllen diese in verschiedenerlei Hinsicht nicht die Erfordernisse industrieller Anwendung. Wie nachfolgend noch im einzelnen diskutiert wird, nimmt keine der bekannten Zusammensetzungen diejenigen der vorliegenden Erfindung vorweg. Diese bestehen aus einem anorganischen porösen Träger, der ein polymeres Material natürlichen oder synthetischen Ursprungs enthält, das in aller Regel in situ aus einem Monomer oder Präpolymer gebildet wird, wobei dieses poly-mere Material in den Poren des Trägers eingeschlossen und teilweise adsorbiert ist und am Polymergerüst hängende, sich von dort aus erstreckende funktionelle Gruppen enthält. Das Enzym ist erfindungsgemäss teilweise an das Grundmaterial adsorbiert und auch kovalent an die aktiven Stellen an den Endabschnitten der am Polymergerüst hängenden Gruppen gebunden, so dass das Enzym Bewegungsfreiheit bekommt, welche es ihm erlaubt, seine maximale Aktivität auszuüben. Demgegenüber betrifft die US-PS 3.556.945 trägerfixierte Enzyme, bei denen das Enzym direkt an einem anorganischen Träger, wie Glas, adsorbiert ist. Die US-PS 3.519.538 befasst sich mit trägerfixierten Enzymen, bei denen die Enzyme chemisch über ein intermediäres Silankupplungs-mittel an einen anorganischen Träger gebunden sind. In ähnlicher Weise benützt auch die US-PS 3.783.101 eine Organosi-lanzusammensetzung als Bindemittel, wobei das Enzym kovalent an einen Glasträger mit Hilfe eines Silanbrücken-gliedes gebunden ist, der Siliciumanteil des Kupplungsmit- There are therefore many methods for immobilizing enzymes according to the prior art, but these do not meet the requirements of industrial application in various ways. As will be discussed in more detail below, none of the known compositions anticipate those of the present invention. These consist of an inorganic porous support which contains a polymeric material of natural or synthetic origin, which is usually formed in situ from a monomer or prepolymer, this polymeric material being enclosed in the pores of the support and partially adsorbed and on Contains functional groups hanging from the polymer structure and extending from there. According to the invention, the enzyme is partially adsorbed on the base material and also covalently bound to the active sites at the end sections of the groups attached to the polymer structure, so that the enzyme is given freedom of movement which allows it to exert its maximum activity. In contrast, US Pat. No. 3,556,945 relates to carrier-fixed enzymes in which the enzyme is adsorbed directly on an inorganic carrier, such as glass. US Pat. No. 3,519,538 deals with carrier-fixed enzymes in which the enzymes are chemically bound to an inorganic carrier via an intermediate silane coupling agent. Similarly, US Pat. No. 3,783,101 also uses an organosilane composition as a binder, the enzyme being covalently bound to a glass support with the aid of a silane link, the silicon portion of the coupling member being

5 5

1(1 1 (1st

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

634 876 634 876

4 4th

tels an den Träger gebunden ist, während der organische Anteil des Kupplungsmittels an das Enzym gebunden ist, und die Zusammensetzung ein Metalloxid auf der Oberfläche des Trägers zwischen dem Träger und dem Silciumanteil des Kupplungsmittels enthält. In der US-PS 3.821.083 ist der inerte Träger mit einem Präpolymer, wie Polyacrolein, überzogen, an das ein Enzym gebunden ist. Nach den meisten Beispielen in dieser Patentschrift ist es jedoch erforderlich, zunächst die Zusammensetzung sauer zu hydrolysieren, tied to the carrier while the organic portion of the coupling agent is attached to the enzyme and the composition contains a metal oxide on the surface of the carrier between the carrier and the silicon portion of the coupling agent. In US Pat. No. 3,821,083, the inert carrier is coated with a prepolymer, such as polyacrolein, to which an enzyme is bound. According to most of the examples in this patent specification, however, it is first necessary to hydrolyze the composition acidically,

bevor das Enzym auf dem Polymer abgelagert wird. Ein anderer Stand der Technik, die US-PS 3.705.084, beschreibt einen makroporösen Enzymreaktor, worin ein Enzym auf der Polymeroberfläche eines makroporösen Reaktorkernes adsorbiert und danach an seiner Stelle vernetzt wird. Durch Vernetzung der Enzyme auf der Polymeroberfläche nach ihrer Adsorption wird das Enzym teilweise weiter immobilisiert und kann nicht frei wie in seinem natürlichen Zustand als Katalysator wirken. Die Vernetzung von Enzymen vernetzt sie im Effekt miteinander und verhindert dadurch gewöhnlich eine freie Bewegung des Enzyms und vermindert die Mobilität des Enzyms, welche ein notwendiges Erfordernis für maximale Aktivität ist. before the enzyme is deposited on the polymer. Another prior art, US Pat. No. 3,705,084, describes a macroporous enzyme reactor in which an enzyme is adsorbed on the polymer surface of a macroporous reactor core and then crosslinked in its place. By cross-linking the enzymes on the polymer surface after their adsorption, the enzyme is partially immobilized further and cannot act freely as a catalyst in its natural state. The cross-linking of enzymes effectively cross-links them, thereby usually preventing free movement of the enzyme and reducing the mobility of the enzyme, which is a necessary requirement for maximum activity.

Die Erfindung betrifft nun neue Zusammensetzungen, die trägerfixiertes immobilisiertes Enzym umfassen. Dieses Enzympräparat enthält ein kombiniertes organisch-anorganisches Grundmaterial, welches seinerseits aus einem anorganischen porösen Trägermaterial besteht, das ein organisches Polymermaterial enthält, welches in den Poren des Trägermaterials teilweise absorbiert und eingeschlossen ist und in situ aus einem Monomer, einem hydrolysierten Polymer oder einem Präpolymer synthetisch oder natürlichen Ursprungs durch Umsetzung mit einem geeignete reaktive Reste enthaltenden bifunktionellen Monomer gebildet werden kann. Das erfindungsgemässe immobilisierte trägerfixierte Enzym ist dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem kombinierten organisch-anorganischen Grundmate-rial aus einem anorganischen porösen Träger mit einem in dessen Poren teilweise adsorbierten und eingeschlossenen organischen Polymermaterial, wobei das Polymermaterial funktionelle Gruppen enthält, und einem an das Grundmaterial teilweise adsorbierten und kovalent an die funktionellen Gruppen des organischen Polymermaterials in dessen Endbereich gebundenen Enzym besteht. Das Enzym ist kovalent an diese funktionellen Gruppen gebunden und ausserdem teilweise an dem organisch-anorganischen Grundmaterial adsorbiert. The invention now relates to new compositions comprising carrier-immobilized enzyme. This enzyme preparation contains a combined organic-inorganic base material, which in turn consists of an inorganic porous carrier material which contains an organic polymer material which is partially absorbed and enclosed in the pores of the carrier material and synthetic in situ from a monomer, a hydrolyzed polymer or a prepolymer or of natural origin can be formed by reaction with a suitable bifunctional monomer containing reactive radicals. The immobilized carrier-fixed enzyme according to the invention is characterized in that it consists of a combined organic-inorganic base material made of an inorganic porous support with an organic polymer material partially enclosed and adsorbed in its pores, the polymer material containing functional groups, and one partially on the base material enzyme adsorbed and covalently bound to the functional groups of the organic polymer material in its end region. The enzyme is covalently bound to these functional groups and also partially adsorbed on the organic-inorganic base material.

Eine spezielle Ausführungsform dieser Erfindung betrifft einen immobilisierten Enzymverbund, der ein organischanorganisches Grundmaterial aus einem porösen Kiesel-säure-Tonerdeträger mit niedrigem Schüttgewicht und mit relativ grosser Oberfläche, das auch anorganische Zusatzstoffe enthalten kann, sowie ein in situ hergestelltes Tetraäthy-lenpentamin-GIutaraldehyd-Polymermaterial, das in den Poren des Kieselsäure-Tonerdeträgers teilweise adsorbiert und eingeschlossen ist, und schliesslich Glucoamylase als Enzym umfasst, welche kovalent und die an dem Polymermaterial hängenden Glutaraldehydgruppen im Endbereich dieser Gruppen gebunden und ausserdem teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert ist. A special embodiment of this invention relates to an immobilized enzyme composite which comprises an organic-inorganic base material made of a porous silica-alumina carrier with a low bulk density and a relatively large surface area, which can also contain inorganic additives, and a tetraethylene-pentamine-glutaraldehyde polymer material produced in situ which is partially adsorbed and trapped in the pores of the silica-alumina carrier, and finally comprises glucoamylase as an enzyme which is covalently bound and the glutaraldehyde groups attached to the polymer material in the end region of these groups and is also partially adsorbed on the base material.

Andere Zielsetzungen und Ausführungsformen finden sich in der nun folgenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung. Other objects and embodiments can be found in the following detailed description of the present invention.

Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen, die immobilisierte Enzyme nach dem Stand der Technik enthalten, In contrast to the compositions containing immobilized enzymes according to the prior art,

können die Zusammensetzungen nach der Erfindung unter Verwendung relativ billiger Reaktanten sowie unter Benützung einfacherer Stufen in dem Verfahren zu Herstellung der Zusammensetzung gewonnen werden. Ausserdem ist beispielsweise die mechanische Festigkeit und die Stabilität der Enzymverbundpräparate nach der vorliegenden Erfindung grösser als diejenige, die immobilierte Enzyme nach dem Stand der Technik besassen. Daher ist leicht ersichtlich, dass die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung wirtschaftliche Vorteile besitzen, die sie für industrielle Anwendung brauchbar machen. The compositions of the invention can be obtained using relatively inexpensive reactants as well as using simpler steps in the process for preparing the composition. In addition, for example, the mechanical strength and the stability of the enzyme composite preparations according to the present invention are greater than those which had immobilized enzymes according to the prior art. Therefore, it is readily apparent that the compositions of the present invention have economic advantages that make them useful for industrial use.

Die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung kann in relativ einfacher Weise hergestellt werden. Bei der bevorzugten Herstellungsmethode wird das anorganische poröse Trägermaterial mit einer Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines Präpolymers behandelt, wonach die nichtadsorbierte Lösung in an sich bekannter Weise entfernt wird, wie durch Ablaufenlassen. Es können auch andere billige organische Lösungsmittel, wie Aceton, Tetrahydrofuran oder dergleichen, als Träger für die oben erwähnten Monomere oder Polymere verwendet werden. Nach der Entfernung der nichtadsorbierten Lösungen wird dann der feuchte poröse Träger mit einem relativ grossen Überschuss, bezogen auf die adsorbierte, erstgenannte Substanz, z.B. von 5 bis 20 Mol-"o, eines zweiten bifunktionellen Monomers behandelt, in welchem die reaktiven Gruppen vorzugsweise durch eine Kette mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind, wobei dieses zweite bifunktionelle Monomer ebenfalls vorzugsweise in einer wässrigen Lösung zugegeben wird. Dabei bildet sich ein polymeres Grundmaterial, das in den Poren des Trägers teilweise adsorbiert und eingeschlossen ist und von dem aus sich am Polymergrundgerüst hängende Reste des zweiten Monomers erstrecken. Diese Reste enthalten funktionelle Gruppen infolge der Tatsache, dass eine überschüssige Menge des zweiten bifunktionellen Monomers bei der Behandlung des Trägers verwendet wurde. Die unumgesetzten funktionellen Gruppen sind dann für kovalente Bindungen an das Enzym verfügbar, das dem resultierenden organisch-anorganischen Grundmaterial zugesetzt wird, und zwar wiederum gewöhnlich in einer wässrigen Lösung. Nach Entfernung der unumgesetzten Materialien, wie beispielsweise Waschen, ist das Enzym nicht nur kovalent an die am Polymer hängenden funktionellen Gruppen in dessen Endbereich gebunden, sondern ist teilweise auch an das Grundmaterial adsorbiert. Es ist daher leicht ersichtlich, dass das gesamte Immobilisierungsverfahren in einfacherer und billiger Weise unter Benützung wässriger bzw. billiger Lösungsmittel durchgeführt werden kann, wobei das Verfahren über einen Temperaturbereich durchgeführt werden kann, der von unterhalb Umgebungstemperatur (etwa 5°C) bis zu erhöhten Temperaturen von etwa 60°C liegt, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (etwa 20 bis 25°C). Dieses Verfahren weist nur wenige Stufen auf und gestattet ausserdem eine leichte Entfernung der überschüssigen Reaktionspartner und der fertigen Zusammensetzung. The composition of the present invention can be made in a relatively simple manner. In the preferred method of preparation, the inorganic porous support material is treated with a solution, preferably an aqueous solution, a bi- or polyfunctional monomer, a polymer hydrolyzate or a prepolymer, after which the non-adsorbed solution is removed in a manner known per se, such as by draining. Other inexpensive organic solvents such as acetone, tetrahydrofuran or the like can also be used as carriers for the above-mentioned monomers or polymers. After removal of the non-adsorbed solutions, the moist porous carrier is then covered with a relatively large excess, based on the adsorbed first-mentioned substance, e.g. from 5 to 20 mol% of a second bifunctional monomer, in which the reactive groups are preferably separated from one another by a chain having 4 to 10 carbon atoms, this second bifunctional monomer likewise preferably being added in an aqueous solution a polymeric base material which is partially adsorbed and trapped in the pores of the support and from which residues of the second monomer extend attached to the polymer backbone and which contain functional groups due to the fact that an excessive amount of the second bifunctional monomer is used in the treatment of the The unreacted functional groups are then available for covalent attachment to the enzyme which is added to the resulting organic-inorganic base material, again usually in an aqueous solution, after removal of the unreacted materials, such as washing the enzyme is not only covalently bound to the functional groups attached to the polymer in its end region, but is also partially adsorbed on the base material. It is therefore readily apparent that the entire immobilization process can be carried out in a simpler and cheaper manner using aqueous or cheap solvents, the process being able to be carried out over a temperature range which ranges from below ambient temperature (approximately 5 ° C.) to elevated temperatures of about 60 ° C, preferably at ambient temperature (about 20 to 25 ° C). This process has only a few stages and also allows the excess reactants and the finished composition to be removed easily.

Viele der anorganischen Träger, die im Stand der Technik beschrieben sind, sind Materialien mit gleichförmiger Porengrösse, wie Glas, Tonerde usw., mit einem Porendurchmesser von 500 bis 700 Â für etwa 96% des Materials und mit einem maximalen Porendurchmesser von 1000 Â, einer spezifischen Oberfläche von 40 bis 70 m2/g und Teilchengrössen von 0,177 bis 0,42 mm. Ausserdem können diese Träger mit Metalloxiden wie Zirkonoxid oder Titandioxid überzogen sein, um grössere Stabilität zu erreichen. Im Gegensatz zu diesen bekannten Trägern sollen die anorganischen porösen Träger, die hier benützt werden, Porendurchmesser im Bereich von 100 Â bis zu 55000 Â besitzen, wobei 25 bis 60% des porösen Trägermaterials Poren mit Durchmessern oberhalb 20000 Â besitzen, und die spezifische Oberfläche soll im Bereich von 150 bis 200 m:/g liegen. Die Teilchengrösse kann s Many of the inorganic supports described in the prior art are uniform pore size materials such as glass, alumina, etc. with a pore diameter of 500 to 700 Â for about 96% of the material and with a maximum pore diameter of 1000 Â one specific surface area from 40 to 70 m2 / g and particle sizes from 0.177 to 0.42 mm. In addition, these supports can be coated with metal oxides such as zirconium oxide or titanium dioxide in order to achieve greater stability. In contrast to these known supports, the inorganic porous supports which are used here are said to have pore diameters in the range from 100 zu to 55,000,, with 25 to 60% of the porous support material having pores with diameters above 20,000,, and the specific surface area in the range from 150 to 200 m: / g. The particle size can s

10 10th

IS IS

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

634 876 634 876

auch über einen weiten Bereich von 0,84 bis 2 mm bis zu einem feinen Pulver schwanken, wobei diese Teilchengrösse von dem speziellen System abhängt, in welchem sie verwendet werden. Die porösen Trägermaterialien können auch mit verschiedenen Oxiden des oben beschriebenen Typs überzogen werden, oder sie können darin eingelagert verschiedene andere anorganische Materialien enthalten, wie Borphosphat usw. wobei diese anorganischen Materialien dem Trägermaterial spezielle Eigenschaften verleihen. Eine besonders brauchbare Form von Trägermaterial besteht aus einem Keramikkörper mit der hier bevorzugten Porosität, oder er kann honigwabenartig aufgebaut sein mit verbindenden Makrokanälen im gesamten Körper, wobei solche Materialien allgemein als Monolithe bekannt sind und mit verschiedenen Arten poröser Tonerde, Zirkonoxid usw. beschichtet sein können. Die Verwendung solcher Trägertypen hat den besonderen Vorteil, dass sie den freien Fluss selbst hochviskoser Substrate gestattet, die oftmals industriellen enzymkatalysierten Reaktionen unterzogen werden. also vary over a wide range from 0.84 to 2 mm to a fine powder, this particle size depending on the particular system in which they are used. The porous support materials can also be coated with various oxides of the type described above, or they can contain various other inorganic materials, such as boron phosphate etc., embedded therein, these inorganic materials imparting special properties to the support material. A particularly useful form of carrier material consists of a ceramic body with the preferred porosity, or it can be honeycomb-like with connecting macrochannels throughout the body, such materials being generally known as monoliths and being coated with various types of porous alumina, zirconium oxide, etc. . The use of such carrier types has the particular advantage that it allows the free flow of even highly viscous substrates, which are often subjected to industrial enzyme-catalyzed reactions.

Die anorganischen porösen Trägermaterialien, die als eine Komponente des kombinierten organisch-anorganischen Grundmaterials verwendet werden, sind beispielsweise Metalloxide, wie Tonerde und besonders y-Tonerde, Kieselsäure, Zirkonoxid oder Gemische der Metalloxide, wie Kie-selsäure-Tonerde, Kieselsäure-Zirkonoxid, Kieselsäure-Magnesia, Kieselsäure-Zirkonoxid-Tonerde usw., oder y-Tonerde, die andere anorganische Verbindungen wie Borphosphat usw. enthält, Keramikkörper usw. sowie Kombinationen der obigen Materialien und eines der Materialien, die als Überzug für ein anderes Material dienen kann, welches selbst den Träger darstellt. The inorganic porous support materials which are used as a component of the combined organic-inorganic base material are, for example, metal oxides, such as alumina and especially y-alumina, silica, zirconia or mixtures of the metal oxides, such as silica-alumina, silica-zirconia, silica -Magnesia, silica-zirconia-alumina, etc., or y-alumina, which contains other inorganic compounds such as boron phosphate, etc., ceramic bodies, etc., as well as combinations of the above materials and one of the materials which can serve as a coating for another material which itself represents the carrier.

Die Polymermaterialien, die insbesondere in situ in solcher Weise gebildet werden, dass das Polymermaterial in den Poren des anorganischen Trägers des oben beschriebenen Typs teilweise adsorbiert und teilweise eingeschlossen ist, können nach den oben beschriebenen allgemeinen Methoden hergestellt werden, indem beispielsweise zunächst eine Lösung mit 2 bis 25'}o eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines Präpolymers auf den Träger adsorbiert wird, wobei das Monomer oder Polymer ursprünglich synthetisch oder natürlich vorkommend ist und vorzugsweise in Wasser oder anderen Lösungsmitteln löslich ist, welch letztere gegenüber den anschliessend verwendeten Rektionen inert sind. Wie oben ausgeführt wurde, kann nun ein zweites bifunktionelles Monomer in ähnlicher Weise zugesetzt werden, um durch Umsetzung mit dem auf dem anorganischen Träger adsorbierten ursprünglichen Zusatzstoff ein polymeres organisch-anorganisches Grundmaterial zu bilden. Die funktionellen Gruppen, die auf dem bifunktionellen Monomer vorliegen, umfassen beispielsweise bekannte reaktive Reste, wie Amino-, Hydroxyl-, Carboxy-, Thiol-, Carbonylreste und ähnliche. Wie bereits oben ausgeführt wurde, sind die reaktiven Gruppen der bifunktionellen Verbindungen vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise durch Ketten voneinander getrennt, die 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten. Die reaktiven Reste sind in der Lage, sich kovalent mit den Stoffen der ersten Imprägnierung und anschliessend, nach dem Auswaschen unumge-setzter Materialien, mit dem Enzym zu verbinden, das in ter anschliessenden Stufe zugegeben wird, wobei das Enzym dann kovalent an die funktionelle Gruppe im Endbereich der funktionellen Kette gebunden ist und gleichzeitig auch an das Grundmaterial teilweise adsorbiert ist. Durch Zugabe des Enzyms zu dieser Zusammensetzung bildet sich ein relativ stabiles trägerfixiertes Enzym, das hohe Aktivität und hohe Stabilität besitzt. Ausserdem besitzt die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung auch sehr vielseitige Verwendbarkeit zusätzlich zu den anderen oben aufgezählten The polymer materials, which are in particular formed in situ in such a way that the polymer material is partially adsorbed and partially enclosed in the pores of the inorganic carrier of the type described above, can be prepared by the general methods described above, for example by firstly using a solution with 2 to 25 '} o of a bi- or polyfunctional monomer, a polymer hydrolyzate or a prepolymer is adsorbed onto the support, the monomer or polymer being originally synthetic or naturally occurring and preferably being soluble in water or other solvents, the latter being used over the ones subsequently used Rections are inert. As stated above, a second bifunctional monomer can now be added in a similar manner to form a polymeric organic-inorganic base material by reaction with the original additive adsorbed on the inorganic support. The functional groups present on the bifunctional monomer include, for example, known reactive groups such as amino, hydroxyl, carboxy, thiol, carbonyl and the like. As stated above, the reactive groups of the bifunctional compounds are preferably, but not necessarily, separated from one another by chains containing 4 to 10 carbon atoms. The reactive residues are able to covalently combine with the substances of the first impregnation and then, after washing out unreacted materials, with the enzyme which is added in the subsequent step, the enzyme then covalently to the functional group is bound in the end region of the functional chain and at the same time is partially adsorbed on the base material. By adding the enzyme to this composition, a relatively stable carrier-fixed enzyme is formed which has high activity and high stability. In addition, the composition of the present invention is also very versatile in addition to the others listed above

Vorteilen, da man sie verwenden kann, um trägerfixierte Enzyme in Abwesenheit eines anorganischen Trägers, der in sauren oder alkalischen Medien löslich ist, herzustellen. Wie nachfolgend im einzelnen aufgeführt wird, behalten je nach den verwendeten Reaktionspartnern die trägerfixierten Enzyme gewöhnlich ihre Stabilität in solchen Medien, wenn sie in Kombination mit dem anorganischen Träger nach den bekannten Verfahren hergestellt wird. Durch diese Eigenschaften ist es möglich, die Verwendungen dieser trägerfixierten Enzyme auszuweiten. Advantages in that they can be used to produce carrier-fixed enzymes in the absence of an inorganic carrier that is soluble in acidic or alkaline media. As will be detailed below, depending on the reactants used, the carrier-fixed enzymes usually retain their stability in such media when they are produced in combination with the inorganic carrier by the known processes. These properties make it possible to extend the uses of these carrier-fixed enzymes.

Spezielle Beispiele bi- oder polyfunktioneller Monomere, von Polymerhydrolysaten oder Präpolymeren, die anfangs auf dem anorganischen Träger adsorbiert werden können, sind etwa wasserlösliche Polyamine, wie Äthylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetramin, Tetraäthylenpentamin, Pentaäthylenhexamin, Hexamethylendiamin, Polyät-hylenimin usw., wasserunlösliche Polyamine, wie Methylen-dicyclohexylamin, Methylendianilin usw., natürliche und synthetische teilhydrolysierte Polymere und Präpolymere wie Nylon, Kollagen, Polyacrolein, Polymaleinsäureanhydrid, Alginsäure, Kaseinhydrolysat, Gelatine usw. Einige spezielle Beispiele bifunktioneller Zwischenmaterialien, die zu den oben aufgezählten Produkten zugesetzt werden können, um ein organisch-anorganisches Grundmaterial zu produzieren, und die die oben aufgeführten notwendigen Eigenschaften besitzen, sind Glutardialdehyd, Adipovlchlorid, Sebacoylch-lorid, Toluoldiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat usw. Wenn ein Polyäthylenamin des oben beschriebenen Typs mit Glutardialdehyd in Abwesenheit eines anorganischen porösen Trägers umgesetzt wird, bekommt man üblicherweise ein in wässriger Säure lösliches Material, während bei Umsetzung von Polyäthylenamin mit einem Diisocyanat oder Acylhalogenid ein wasserunlösliches Produkt erhalten wird. Wenn umgekehrt ein Reaktionskomplex ohne den anorganischen Träger freie Carboxylgruppen enthält, bekommt man normalerweise einen alkalisch löslichen Komplex. Infolge des grossen Überschusses an intermediären bifunktionellen Molekülen mit Abstandshalterfunktion, die verwendet werden, enthält das Polymergrundmaterial, das gebildet wird, daran hängende Gruppen, die die Abstands-haltermoleküle umfassen, wobei sich diese Moleküle von dem Grundmaterial aus erstrecken und reaktive Reste haben, die in ihren Endbereichen vorliegen und in der Lage sind, mit dem Enzym zu reagieren und dieses über kovalente Bindungen an die Abstandshaltermoleküle zu binden. Ausserdem wird das Enzym konkurrierend auch teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert, wenn es zugegeben wird, Specific examples of bifunctional or polyfunctional monomers, of polymer hydrolyzates or prepolymers which can initially be adsorbed onto the inorganic support are, for example, water-soluble polyamines, such as ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, hexamethylenediamine, polyethylenesoluble imine, etc. such as methylene dicyclohexylamine, methylene dianiline, etc., natural and synthetic partially hydrolyzed polymers and prepolymers such as nylon, collagen, polyacrolein, polymaleic anhydride, alginic acid, casein hydrolyzate, gelatin, etc. Some specific examples of bifunctional intermediates that can be added to the products listed above To produce organic-inorganic base material, and which have the necessary properties listed above, are glutardialdehyde, adipovl chloride, sebacoyl chloride, toluene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, etc. When a polyethylene amine of the above Written type is reacted with glutardialdehyde in the absence of an inorganic porous carrier, you usually get a material soluble in aqueous acid, while a water-insoluble product is obtained when polyethyleneamine is reacted with a diisocyanate or acyl halide. Conversely, if a reaction complex without the inorganic carrier contains free carboxyl groups, an alkali-soluble complex is normally obtained. Due to the large excess of intermediate bifunctional molecules with spacer function that are used, the polymer base material that is formed contains pendant groups that comprise the spacer molecules, these molecules extending from the base material and having reactive residues that are in their end regions are present and are able to react with the enzyme and bind it to the spacer molecules via covalent bonds. In addition, the enzyme is also partially competitively adsorbed on the base material when it is added,

nachdem die unumgesetzten Reagenzien durch Waschen von dem organisch-anorganischen Grundmaterial entfernt wurden. Bindung des Enzyms lediglich an das organische Grundmaterial beeinflusst gewöh: dich nicht die Abhängigkeit der Löslichkeit des Aggregate von dem pH-Wert der Lösung, doch wenn der anorganische Träger entsprechend den obigen Angaben eingeschlossen wird, zeigt die Gesamt-zusamn.ensetzung bzw. das trägerfixierte Enzym hohe Stabilität über einen relativ weiten pH-Bereich von 3 bis 9, wobei die Stab ilität natürlich auch eine Funktion der optimalen pH-Eigt nschaften des verwendeten speziellen Enzyms und des verwendeten anorganischen ; rägers ist. Daraus ist leicht ersichtlich, dass ein geeignetes organisch-anorganisches Grundmaterial, das in vielen Situationen anwendbar ist, mit dem Trägermaterial gebildet wird, indem man irgendeine der oben beschriebenen Materialtypcn, die dem Fachmann bekannt sind, adsorbiert und dar n mit irgendeinem bifunktionellen Molekül, das dem Fachmann ebenfalls bekannt ist und zweckmässige funktionelle Reste enthält, behandelt, um es mit dem ursprünglichen Zusatzstoff umzusetzen, vorausgesetzt, dass ein genügend grosser Überschuss des bifunktio- after the unreacted reagents are removed from the organic-inorganic base material by washing. Binding of the enzyme to the organic base material usually does not affect the dependence of the solubility of the aggregate on the pH of the solution, but if the inorganic carrier is included according to the above information, the total composition or the carrier-fixed shows Enzyme high stability over a relatively wide pH range of 3 to 9, the stability of course also a function of the optimal pH properties of the special enzyme and the inorganic used; is porter. It is readily apparent from this that a suitable organic-inorganic base material, which is applicable in many situations, is formed with the carrier material by adsorbing any of the types of material described above, which are known to the person skilled in the art, and with any bifunctional molecule which is also known to the person skilled in the art and contains appropriate functional residues, treated in order to react it with the original additive, provided that a sufficiently large excess of the bifunctional

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

634876 634876

6 6

nellen Moleküls verwendet wird, um an dem Polymer hängende Gruppen zu liefern, die in der Lage sind, anschliessend mit dem zu immobilisierenden Enzym zu reagieren. Durch Benützung dieser funktionellen, an dem Polymer hängenden Gruppen als Bindungsstellen für die Enzyme bekommen die Enzyme gewöhnlich eine grössere Mobilität, so dass die kata-lytische Aktivität des Enzyms über eine relativ längere Zeit auf einem hohen Stand beliebt, als dies möglich ist, wenn das Enzym nach irgendwelchen anderen Methoden immobilisiert wurde, wie durch Einschluss in ein Gelgitter, Adsorption auf einer festen Oberfläche oder Vernetzung des Enzyms mit Hilfe bifunktioneller Reagenzien. Selbstverständlich ergeben jedoch nicht alle Rezepturen gleichwertige Ergebnisse hinsichtlich der Stabilität oder Aktivität. nelle molecule is used to provide groups attached to the polymer, which are then able to react with the enzyme to be immobilized. By using these functional groups attached to the polymer as binding sites for the enzymes, the enzymes usually get greater mobility, so that the catalytic activity of the enzyme is popular at a high level for a relatively longer time than is possible if that Enzyme was immobilized by any other method, such as by inclusion in a gel grid, adsorption on a solid surface, or cross-linking of the enzyme using bifunctional reagents. Of course, not all formulations give equivalent results in terms of stability or activity.

Beispiele von Enzymen, die durch eine kovalente Bindungsreaktion immobilisiert werden können und die eine Aminogruppe enthalten, welche mit einem Aldehydrest oder Isocyanatrest der an dem Polymer hängenden Gruppe reagieren kann, während das Polymermaterial in den Poren eines porösen Trägermaterials eingeschlossen und teilweise adsorbiert ist, sind beispielsweise Trypsin, Papain, Hexokinase, ß-Galactosidase, Ficin, Bromelain, Milchsäuredehy-drogenase, Glucoamylase, Chymotrypsin, Pronase, Acylase, Invertase, Amylase, Glucoseoxidase, Pepsin, Rennin, Pilz-protease usw. Im allgemeinen kann jedes Enzym verwendet werden, dessen aktive Stelle nicht in die kovalente Bindung eingeschlossen ist. Obwohl die obige Diskussion um am Polymermaterial hängende Gruppen kreiste, die als einen funktionellen Rest eine Aldehyd- oder Isocyanatgruppe enthalten, liegt es auch innerhalb des Erfindungsgedankens, Examples of enzymes which can be immobilized by a covalent binding reaction and which contain an amino group which can react with an aldehyde residue or isocyanate residue of the group attached to the polymer while the polymer material is enclosed in the pores of a porous support material and are partially adsorbed Trypsin, papain, hexokinase, β-galactosidase, ficin, bromelain, lactic acid dehydrogenase, glucoamylase, chymotrypsin, pronase, acylase, invertase, amylase, glucose oxidase, pepsin, rennin, fungal protease, etc. In general, any enzyme can be used, of which any enzyme can be used active site is not included in the covalent bond. Although the above discussion centered around groups attached to the polymer material that contain an aldehyde or isocyanate group as a functional residue, it is also within the scope of the invention,

dass die am Polymer hängende Gruppe andere funktionelle Reste enthalten kann, die mit Carboxy-, Sulfhydryl- oder anderen Resten, die gewöhnlich in Enzymen vorhanden sind, reagieren kann. Die kovalente Bindung von Enzymen, die diese anderen Reste enthalten, mit anderen am Polymer hängenden Gruppen erfolgt jedoch nicht notwendigerweise mit äquivalenten Ergebnissen und kann auch erheblich grössere Kosten bei der Herstellung der Zwischenprodukte ein-schliessen. Die obige Auflistung der porösen festen Träger, Monomere, Hydrolysate, Polymere und Enzyme ist lediglich repräsentativ für die verschiedenen Verbindungsklassen, die verwendet werden können. that the polymer-attached group may contain other functional groups that can react with carboxy, sulfhydryl, or other groups that are usually present in enzymes. However, the covalent binding of enzymes which contain these other residues to other groups attached to the polymer does not necessarily take place with equivalent results and can also involve considerably greater costs in the production of the intermediate products. The above listing of porous solid carriers, monomers, hydrolyzates, polymers and enzymes is only representative of the various classes of compounds that can be used.

Die Herstellung der Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung erfolgt bevorzugt ansatzweise, wie bereits im einzelnen beschrieben wurde, obwohl das fertige immobilisierte Enzym gegebenenfalls auch in kontinuierlicher Betriebsweise hergestellt werden kann. Wenn ein kontinuierliches Verfahren angewendet wird, wird vorzugsweise eine Menge des porösen festen Trägermaterials in eine geeignete Apparatur, gewöhnlich eine Säule, gegeben. Das poröse feste Trägermaterial kann in irgendeiner erwünschten Form vorliegen, wie als Pulver, Pellets, Monolithe und dergleichen, und wird in die Säule eingeführt, wonach eine vorzugsweise wässrige Lösung, beispielsweise eines polyfunktionellen Amins, in Berührung mit dem porösen Träger gebracht wird, bis letzterer mit der Aminlösung gesättigt ist, und den Über-schuss lässt man dann ablaufen. Ein Abstandshalter- oder intermediäres bifunktionelles Molekül, wie Glutardialdehyd, wird dann in Berührung mit dem gesättigten Träger gebracht. Die Bildung des polymeren Grundmaterials erfolgt somit vorzugsweise in einem wässrigen System, wobei die Umsetzung während einer Zeit erfolgt, die im Bereich von 1 bis 10 Stunden liegen kann, gewöhnlich aber von kurzer Dauer ist. Nach Entfernung des überschüssigen bifunktionellen Monomers durch Ablaufenlassen und Auswaschen wasserlöslicher und unumgesetzter Materialien, was im Falle eines Polya-mins vorzugsweise mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 4 erfolgt, wird im allgemeinen eine wässrige Lösung des Enzyms in Kontakt mit dem Träger gebracht oder durch die Säule im Kreislauf geführt, und diese Stufe bewirkt eine kovalente Bindung des Enzyms an die endständigen Gruppen, z.B. Aldehydgruppen, der an dem Polymer hängenden Moleküle mit funktionellen Resten, welche sich von dem Grundmaterial aus erstrecken. Dies geschieht normalerweise solange, bis es keine weitere physikalische Adsorption und/oder kovalente Bindung des Enzyms an das organisch-anorganische Grundmaterial und die daran hängenden Moleküle mehr gibt. Das überschüssige Enzym wird vorzugsweise in dem Auslauf nach Ablaufenlassen und Waschen der Säule zurückgewonnen. Die Säule ist jetzt normalerweise fertig für die Verwendung in chemischen Reaktionen, worin die katalytische Wirkung des Enzyms auftritt. Die Verfahren werden meistens in Zeit-, Temperatur- und Konzentrationsparametern durchgeführt, wie sie oben im Zusammenhang mit dem Ansatzverfahren beschrieben wurden, und führen zu vergleichbaren immobilisierten Enzymkomplexen. Es liegt auch innerhalb des Erfindungsgedankens, dass mit geeigneten Modifikationen des pH-Werts und der Temperatur, die für den Fachmann auf der Hand liegen, das Verfahren für eine grosse Vielzahl anorganischer poröser Träger, polymerbildender Reaktanten und Enzyme angewendet werden kann. The compositions according to the present invention are preferably prepared in batches, as has already been described in detail, although the finished immobilized enzyme can optionally also be prepared in a continuous mode of operation. If a continuous process is used, an amount of the porous solid support material is preferably placed in a suitable apparatus, usually a column. The porous solid support material may be in any desired form, such as powder, pellets, monoliths and the like, and is introduced into the column, after which a preferably aqueous solution, for example a polyfunctional amine, is brought into contact with the porous support until the latter is saturated with the amine solution, and the excess is then allowed to run off. A spacer or intermediate bifunctional molecule, such as glutardialdehyde, is then brought into contact with the saturated support. The formation of the polymeric base material is thus preferably carried out in an aqueous system, the reaction taking place during a time which can be in the range from 1 to 10 hours, but is usually of short duration. After removal of the excess bifunctional monomer by draining and washing out water-soluble and unreacted materials, which in the case of a polyamine is preferably carried out with a buffer solution with a pH of about 4, an aqueous solution of the enzyme is generally brought into contact with the support or circulated through the column, and this step effects a covalent binding of the enzyme to the terminal groups, e.g. Aldehyde groups, the molecules attached to the polymer with functional residues extending from the base material. This usually happens until there is no further physical adsorption and / or covalent binding of the enzyme to the organic-inorganic base material and the molecules attached to it. The excess enzyme is preferably recovered in the outlet after draining and washing the column. The column is now normally ready for use in chemical reactions where the enzyme's catalytic action occurs. The processes are mostly carried out in time, temperature and concentration parameters, as described above in connection with the batch process, and lead to comparable immobilized enzyme complexes. It is also within the spirit of the invention that with suitable modifications of pH and temperature that are obvious to the person skilled in the art, the method can be used for a large variety of inorganic porous carriers, polymer-forming reactants and enzymes.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. The following examples serve to further explain the invention.

Beispiel 1 example 1

In diesem Beispiel wurden 2 g einer porösen Kieselsäure-Tonerdemasse mit darin eingelagertem Borphosphat, mit einer Teilchengrösse von 0,177 bis 0,42 mm, mit einem Porendurchmesser im Bereich von 100 bis 55 000 Â und mit einer spezifischen Oberfläche von 150 bis 200 m:/g als der anorganische Träger für die neue Zusammensetzung nach der Erfindung verwendet. Dieser Träger wurde bei einer Temperatur von etwa 260°C calciniert, um darin enthaltene adsorbierte Feuchtigkeit zu entfernen. Danach wurde der Träger mit 55 ml einer 4%-igen wässrigen Lösung von Tetraäthylenpentamin bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde im Vakuum behandelt, um die Eindringung der Lösung in die Poren des Trägers zu erleichtern. Die überschüssige nichtad-sorbierte Lösung wurde dann abgegossen, wobei etwas 25% des Tetraäthylenpentamins in den Poren des Trägers adsorbiert waren. Danach wurde der feuchte Träger mit 25 ml einer 5%-igen wässrigen Lösung von Glutardialdehyd bei Umgebungstemperatur behandelt, und es fand eine fast unmittelbare Reaktion unter Bildung eines unlöslichen Reaktionsproduktes auf der Oberfläche und in den Poren des Trägers statt. Die überschüssige Glutardialdehydlösung wurde dann abgegossen und der organisch-anorganische Komplex gewaschen, um unumgesetzte und unadsorbierte Reaktanten zu entfernen, wobei das Waschen zunächst mit Wasser und dann mit einer 0,02-molaren Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 4,2 erfolgte und das Waschen bei einer Temperatur von 45°C durchgeführt wurde. Danach wurde eine Enzymlösung mit einem Gehalt von etwa 200 mg Glucoamylase je 25 ml Wasser zugesetzt, und man Hess diese Lösung mit der Zusammensetzung bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde reagieren. Am Ende dieser 1 -stündigen Periode wurde die überschüssige Glucoamylaselösung abgegossen, und das trägerfixierte Enzym wurde mit Wasser gewaschen, um ungebundenes und/oder unadsorbiertes Enzym zu entfernen. Die Zusammensetzung wurde dann 24 Stunden mit einer Acetatpufferlösung, ähnlich der oben beschriebenen, ausgelaugt. Die Menge an adsorbiertem und/oder kovalent gebundenem Enzym wurde durch Dumas-Mikrogaschroma-tographieanalysen vor und nach der Zugabe des Enzyms bestimmt. Die Aktivität des trägerfixierten Enzyms wurde In this example, 2 g of a porous silica-alumina mass with boron phosphate embedded therein, with a particle size of 0.177 to 0.42 mm, with a pore diameter in the range from 100 to 55 000 Â and with a specific surface area of 150 to 200 m: / g used as the inorganic carrier for the new composition according to the invention. This support was calcined at a temperature of about 260 ° C to remove adsorbed moisture contained therein. Thereafter, the support was treated with 55 ml of a 4% aqueous solution of tetraethylene pentamine at ambient temperature for 1 hour in vacuo to facilitate penetration of the solution into the pores of the support. The excess non-adsorbed solution was then poured off, with some 25% of the tetraethylene pentamine adsorbed in the pores of the support. Thereafter, the wet carrier was treated with 25 ml of a 5% aqueous solution of glutardialdehyde at ambient temperature, and an almost immediate reaction took place to form an insoluble reaction product on the surface and in the pores of the carrier. The excess glutardialdehyde solution was then poured off and the organic-inorganic complex washed to remove unreacted and unadsorbed reactants, washing first with water and then with a 0.02 molar acetate buffer solution with a pH of 4.2 and that Washing was carried out at a temperature of 45 ° C. An enzyme solution containing about 200 mg of glucoamylase per 25 ml of water was then added, and this solution was reacted with the composition at ambient temperature for 1 hour. At the end of this 1 hour period, the excess glucoamylase solution was poured off and the carrier-fixed enzyme was washed with water to remove unbound and / or unadsorbed enzyme. The composition was then leached with an acetate buffer solution similar to that described above for 24 hours. The amount of adsorbed and / or covalently bound enzyme was determined by Dumas micro gas chromatographic analysis before and after the addition of the enzyme. The activity of the carrier-fixed enzyme was

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

7 7

634 876 634 876

dann an Hand der Glucosemenge bestimmt, die unter Verwendung einer 30'Vigen verdünnten Stärkelösung als Substrat bei pH 4,2 und 60°C und unter Verwendung des VVorthington's Glucostatverfahrens zur Analyse der Glucose gebildet wurde, wobei letzteres Verfahren als das zuverlässigere Verfahren zur Bestimmung der Brauchbarkeit des trägerfixierten Enzyms angesehen wird. Eine Aktivität von 2S Einheiten 'Gramm Träger mit einer Enzymbeladung von 29 mg/g Träger wurde nach diesem Verfahren erhalten (eine Einheit bedeutet die Produktion von 1 g Glucose/Std bei 60°C gemäss den Testbestimmungen). Es sei bemerkt, dass trotz der bekannten Löslichkeit bei pH 4,2 des trägerfixierten Enzyms bei Herstellung in Abwesenheit eines anorganischen Trägers während der Auslaugung mit einer Pufferlösung von pH 4,2 ein vernachlässigbarer Enzymverlust aus dem kombinierten anorganisch-organischen Komplex auftrat. Dies wurde durch Analyse des Auslaufs aus der Behandlung demonstriert. then determined from the amount of glucose formed using a 30'Vigen dilute starch solution as a substrate at pH 4.2 and 60 ° C and using VVorthington's glucostat method to analyze glucose, the latter method being the more reliable method to determine the Usability of the carrier-fixed enzyme is considered. An activity of 2S units' grams of carrier with an enzyme loading of 29 mg / g carrier was obtained by this method (one unit means the production of 1 g glucose / hour at 60 ° C according to the test determinations). It should be noted that despite the known solubility at pH 4.2 of the carrier-fixed enzyme when prepared in the absence of an inorganic carrier, there was negligible loss of enzyme from the combined inorganic-organic complex during leaching with a pH 4.2 buffer solution. This was demonstrated by analyzing the treatment effluent.

Beispiel 2 Example 2

In diesem Beispiel wurde das Verfahren des Beispiels 1 mit der Änderung wiederholt, dass der anorganische poröse Träger eine Teilchengrösse von 0,59 bis 2 mm besass. Die Kieselsäure-Tonerdemasse mit einem Gehalt an darin eingelagertem Borphosphat wurde mit Tetraäthylenpentamin, Glutardialdehyd und Glucoamvlase in ähnlicher Weise wie oben behandelt. Man erhielt einen aktiven immobilisierten Enzymkomplex, jedoch mit verminderter Aktivität, wahrscheinlich wegen eines Diffusionsproblems durch die grössere Teilchengrösse der Masse. In this example, the procedure of Example 1 was repeated with the change that the inorganic porous support had a particle size of 0.59 to 2 mm. The silica-alumina mass containing boron phosphate therein was treated with tetraethylene pentamine, glutardialdehyde and glucoamvlase in a similar manner as above. An active immobilized enzyme complex was obtained, but with reduced activity, probably due to a diffusion problem due to the larger particle size of the mass.

Beispiel 3 Example 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden 2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse, die die gleichen physikalischen Eigenschaften der Teilchengrösse, des Porendurchmessers und der Oberfläche wie in Beispiel 1 besass, mit einer Aceton-lösung von Tetraäthylenpentamin behandelt, und anschliessend erfolgte die Behandlung mit einer Tolyldiisocyanatlö-sung auch in Aceton statt der wässrigen Lösung von Glutardialdehyd. Nach dem Abgiessen der überschüssigen Diiso-cyanatlösung und nach Waschen mit Wasser wurde der orga-nisch-anorganische Komplex weiter mit einer wässrigen Glu-coamylaselösung behandelt. Wie in Beispiel 1. umfasste das fertige Produkt einen aktiven, vollständig unlöslichen Enzymkomplex. In a manner similar to that in Example 1, 2 g of a silica clay having the same physical properties of particle size, pore diameter and surface area as in Example 1 was treated with an acetone solution of tetraethylene pentamine, followed by treatment with a Tolyl diisocyanate solution also in acetone instead of the aqueous solution of glutardialdehyde. After pouring off the excess diisocyanate solution and after washing with water, the organic-inorganic complex was treated further with an aqueous glu-coamylase solution. As in Example 1, the finished product comprised an active, completely insoluble enzyme complex.

Beispiel 4 Example 4

Um zu erläutern, dass verschiedene Konzentrationen von Lösungen verwendet werden können, um das erwünschte Produkt herzustellen, wurde das obige Beispiel 1 mit der Änderung wiederholt, dass höher konzentrierte Lösungen der verschiedenen Reagenzien verwendet wurden. Beispielsweise wurden 2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse von 0,59 bis 2 mm Teilchengrösse mit 25 ml einer 20° o-igen Tetraäthylen-pentaminlösung behandelt, und nach dem Abgiessen wurden 50 ml einer 25" «-igen Glutardialdehydlösung zugesetzt. To illustrate that different concentrations of solutions can be used to produce the desired product, Example 1 above was repeated with the change that more concentrated solutions of the various reagents were used. For example, 2 g of a silica-alumina mass with a particle size of 0.59 to 2 mm was treated with 25 ml of a 20% strength tetraethylene pentamine solution, and after pouring off, 50 ml of a 25 "strength glutardialdehyde solution were added.

Dieser Komplex wurde nach dem Waschen dann mit einer wässrigen Lösung von Glucoamvlase behandelt, um ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym herzustellen, das eine Aktivität von etwa 12 Einheiten/Gramm, bezogen auf den Glucostattest, besass. This complex was then washed with an aqueous solution of glucoamvlase after washing to produce an immobilized carrier-fixed enzyme which had an activity of about 12 units / gram based on the glucostate test.

Beispiel 5 Example 5

Zu 2 g einer Kieselsäure-Tonerdemasse mit einer Teilchengrösse von 0,59 bis 2 mm wurden 25 ml einer 5%-igen wässrigen, teilhydrolysierten Kollagenlösung zugegeben, die anstelle des Tetraäthylenpentamins verwendet wurde. Nach dem Abgiessen und Behandeln mit Glutardialdehyd wurde das organisch-anorganische Grundmaterial gewaschen und dann mit einer Glucoamylaselösung behandelt. Die fertige Zusammensetzung wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 durch Dekantieren, Waschen, Auslaugen mit einer gepufferten Lösung (pH 4,2) behandelt, um ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym zu ergeben, das eine Aktivität von etwa 10 Einheiten/Gramm besass. To 2 g of a silica-alumina mass with a particle size of 0.59 to 2 mm, 25 ml of a 5% aqueous, partially hydrolyzed collagen solution was added, which was used instead of the tetraethylene pentamine. After pouring and treating with glutardialdehyde, the organic-inorganic base material was washed and then treated with a glucoamylase solution. The final composition was treated in a manner similar to Example 1 by decanting, washing, leaching with a buffered solution (pH 4.2) to give an immobilized carrier-fixed enzyme which had an activity of about 10 units / gram.

Beispiel 6 Example 6

In diesem Beispiel wurde eine Kieselsäure-Tonerdemasse mit einer Teilchengrösse von 0,59 bis 2 mm, einem Porendurchmesser im Bereich von etwa 100 bis etwa 55 000 Â und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 m:g/g durch Zugabe von Tetraäthylenpentamin in einer 1%-igen teilhydrolysierten wässrigen Kollagenlösung behandelt, wobei das Kollagen als zusätzliches Bindemittel benützt wurde. Nach dem Ablaufenlassen und Umsetzen mit Glutardialdehyd wurde das organisch-anorganische Grundmaterial dann mit einer Glucoamylaselösung nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 behandelt, um ein aktives trägerfixiertes Enzym herzustellen. In this example, a silica-alumina mass with a particle size of 0.59 to 2 mm, a pore diameter in the range of about 100 to about 55,000 Â and with a surface area of about 150 to 200 m: g / g by adding tetraethylene pentamine in treated with a 1% partially hydrolyzed aqueous collagen solution, the collagen being used as an additional binder. After draining and reacting with glutardialdehyde, the organic-inorganic base material was then treated with a glucoamylase solution according to the general procedure of Example 1 to produce an active carrier-fixed enzyme.

Beispiel 7 Example 7

Um zu erläutern, dass verschiedene Enzyme bei der Herstellung der erwünschten Zusammensetzungen verwendet werden können, wurde eine Kieselsäure-Tonerdemasse, die darin eingelagert Borphosphat enthielt, mit einer Tetraäthy-lenpentaminlösung behandelt, dekantiert und gewaschen, und dann wurde eine Glutardialdehydlösung zugesetzt, und die resultierende Zusammensetzung wurde nun mit einer wässrigen Lactaselösung behandelt. Dies ergab ein aktives trägerfixiertes Enzym. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um Enzyme, wie Proteasen, Glucoseisome-rasen und Glucoseoxidasen, zu binden und aktive trägerfixierte Enzyme zu bekommen. To illustrate that various enzymes can be used in making the desired compositions, a silica-alumina composition containing boron phosphate was treated with a tetraethylene pentamine solution, decanted and washed, and then a glutardialdehyde solution was added, and the resulting one Composition was now treated with an aqueous lactase solution. This resulted in an active carrier-fixed enzyme. Similar methods can be used to bind enzymes such as proteases, glucose isomerases and glucose oxidases and to obtain active carrier-fixed enzymes.

Versuch 1 Trial 1

In diesem Versuch enthielt eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm 14,2 g eines aktiven trägerfixierten Enzyms, das aus Gucoamylase hergestellt worden war, In this experiment, a column with an inner diameter of 20 mm contained 14.2 g of an active carrier-fixed enzyme, which had been prepared from gucoamylase,

welche an einen porösen Kieselsäure-Tonerdeträger mit 0,59 bis 2 mm Teilchengrösse mit darin eingelagertem Borphosphat gebunden war, wobei das trägerfixierte Enzym in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war. Die Säule wurde kontinuierlich während 30 Tagen bei einer Temperatur von 45°C verwendet, um eine wässrige 30%-ige verdünnte Stärkelösung zu hydrolysieren, die auf pH 4,2 gepuffert worden war. Der Auslauf wurde hinsichtlich der Gluco-seproduktion unter Verwendung des Worthington-Glucostat-verfahrens analysiert. Es wurde gefunden, dass es während dieses Zeitraumes keinen erkennbaren Verlust an Enzymaktivität gab und dass der Prozentsatz der Umwandlung von Stärke in Glucose bei dieser Temperatur und bei einer Fliessgeschwindigkeit von etwa 150 ml/h 62% betrug. which was bound to a porous silica-alumina carrier with a particle size of 0.59 to 2 mm with boron phosphate embedded therein, the enzyme fixed to the carrier having been prepared in a similar manner as in Example 1. The column was used continuously for 30 days at a temperature of 45 ° C to hydrolyze an aqueous 30% dilute starch solution which had been buffered to pH 4.2. The effluent was analyzed for glucose production using the Worthington glucostat method. It was found that there was no discernible loss of enzyme activity during this period and that the percent conversion of starch to glucose was 62% at this temperature and at a flow rate of about 150 ml / h.

Beispiel 8 Example 8

Um die Tatsache zu erläutern, dass verschiedene Substrate oder Träger benützt werden können, um die erwünschten Zusammensetzungen herzustellen, wurde ein mit Tonerde überzogener Monolith, der aus einem honigwabenartigen Keramikkörper mit verbindenden Makrokanälen bestand, in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, d.h. der Monolith wurde mit Lösungen von Tetraäthylenpentamin, Glutardialdehyd und einem Glucoamylaseenzym behandelt, wobei die Behandlung mit einem Stufenverfahren erfolgte, das das oben beschriebene Dekantieren, Waschen und Auslaugen umfasste. Der ursprüngliche Keramikmonolith besass ein Trockengewicht von 256 g, wovon 13% aus Tonerdeüberzug bestanden. To illustrate the fact that various substrates or supports can be used to make the desired compositions, an alumina-coated monolith consisting of a honeycomb ceramic body with connecting macrochannels was treated in a manner similar to that of Example 1, i.e. the monolith was treated with solutions of tetraethylene pentamine, glutardialdehyde and a glucoamylase enzyme, the treatment being carried out by a step procedure which included decanting, washing and leaching as described above. The original ceramic monolith had a dry weight of 256 g, 13% of which consisted of an alumina coating.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

634876 634876

8 8th

Versuch 2 Trial 2

Das fertige immobilisierte trägerfixierte Enzym wurde zu einer Säule in einer Glasröhre mit einem Innendurchmesser von 70 mm gemacht, um-koritinuierlich mit Hilfe einer geeigneten Pumpapparatur in einem temperaturkontrollierten Behälter arbeiten zu können, wobei der Behälter auf einer Temperatur von 45°C gehalten wurde. Während einer 40-tägigen Periode kontinuierlicher Benutzung für die Hydrolyse einer 30%-igen gepufferten verdünnten Stärkelösung fand man, dass nur etwa 3% der ursprünglichen Aktivität des trägerfixierten Enzyms verlorengingen, während eine Fliessgeschwindigkeit von etwa 85 ml/h aufrechterhalten wurde. Ausserdem wurde gefunden, dass während der 40-tägigen Periode etwa 80% der Stärke in Glucose umgewandelt wurden. Um die Eigenschaften des Systems weiter zu studieren, wurden anschliessend Veränderungen der Fliessgeschwindigkeit vorgenommen, wobei gefunden wurde, dass es bei einer Fliessgeschwindigkeit von etwa 38 ml/h möglich war, eine Umwandlung im Bereich von 92 bis 93% der Stärke in Glucose zu bekommen. Die relativ lange Zeit, während der dieses Enzym verwendet wurde, um Stärke in Glucose umzuwandeln, ohne dass ein wesentlicher Verlust an Enzymaktivität entweder durch Desorption oder Deaktivierung auftrat, zeigte die lange Lebensdauer des Katalysators. The finished immobilized carrier-fixed enzyme was made into a column in a glass tube with an inside diameter of 70 mm in order to be able to work continuously in a temperature-controlled container with the aid of a suitable pump apparatus, the container being kept at a temperature of 45 ° C. During a 40 day period of continuous use for the hydrolysis of a 30% buffered dilute starch solution, it was found that only about 3% of the original activity of the carrier-fixed enzyme was lost while maintaining a flow rate of about 85 ml / h. It was also found that approximately 80% of the starch was converted to glucose during the 40 day period. To further study the properties of the system, changes were then made to the flow rate, and it was found that it was possible at a flow rate of about 38 ml / h to convert from 92 to 93% of the starch to glucose. The relatively long time this enzyme was used to convert starch to glucose without a significant loss of enzyme activity from either desorption or deactivation demonstrated the long life of the catalyst.

Beispiel 9 Example 9

s In diesem Beispiel wurde ein Monolithtyp von trägerfixiertem Enzym in einer Säule ähnlich wie in Beispiel 8 hergestellt, wobei die Änderung darin bestand, dass das Enzym, das zur Herstellung des Komplexes verwendet wurde, Lac-tase statt Glucoamylase war. s In this example, a monolith type of support-fixed enzyme was prepared in a column similar to that in Example 8, the change being that the enzyme used to prepare the complex was Lac-tase instead of Glucoamylase.

10 10th

Versuch 3 Trial 3

Das trägerfixierte Enzym wurde hinsichtlich der Stabilität unter kontinuierlichem FIuss geprüft, wobei die Temperatur während 29 Tagen auf 37°C gehalten wurde. Es wurde wie-i5 derum gefunden, dass kein merklicher Verlust an Aktivität des immobilisierten trägerfixierten Enzyms eintrat. Dieses immobilisierte Enzym wurde bei der Behandlung einer 5%-igen Lactoselösung verwendet, die auf pH 4,2 gepuffert worden war, wobei die Lactoselösung der Säule mit einer 20 Geschwindigkeit von 54 ml/h zugeführt wurde. Während der 29-tägigen Periode wurde gefunden, dass es eine etwa 35%-ige Umwandlung von Lactose in Glucose und Galactose ergab. The carrier-fixed enzyme was tested for stability under continuous flow, the temperature being kept at 37 ° C. for 29 days. It was again found that there was no appreciable loss of activity in the immobilized carrier-fixed enzyme. This immobilized enzyme was used in the treatment of a 5% lactose solution which had been buffered to pH 4.2, the lactose solution being fed to the column at a rate of 54 ml / h. During the 29 day period it was found that there was approximately 35% conversion of lactose to glucose and galactose.

B B

Claims

634876

1. Immobilized carrier-fixed enzyme, characterized in that it consists of a combined organic-inorganic base material made of an inorganic porous support with an organic polymer material partially enclosed and adsorbed in its pores, the polymer material containing functional groups, and one partially attached to the base material enzyme adsorbed and covalently bound to the functional groups of the organic polymer material in its end region.

2. Immobilized carrier-fixed enzyme according to claim 1, characterized in that the partially adsorbed and enclosed in the pores organic polymer material is one which is formed by polymerization in the pores of the carrier itself, the functional groups mentioned being favorable for the enzyme .

2nd

PATENT CLAIMS

3. Immobilized carrier-fixed enzyme according to claim 1 or 2, characterized in that the inorganic porous carrier material is y-alumina or silica-alumina, in particular silica-alumina containing borophosphate, or a honeycomb-like ceramic body coated with porous alumina with connecting macro-channels.

4. Immobilized carrier-fixed enzyme according to one of claims 1 to 3, characterized in that the organic polymer material is the reaction product of polyethylene imine with glutardialdehyde, of tetraethylene pentamine with glutardialdehyde. of tetraethylene pentamine with tolylene diisocyanate, of pentaethylene hexamine with glutardialdehyde or a mixture of tetraethylene pentamine and of partially hydrolyzed collagen with glutardialdehyde.

5. Immobilized carrier-fixed enzyme according to one of claims 1 to 4, characterized in that the enzyme is glucoamylase, lactase, fungal protease, glucose isomerase and / or glucose oxidase for non-medicinal purposes.

6. Immobilized carrier-fixed enzyme according to one of claims 1 to 5, characterized in that its inorganic porous carrier material has a surface area in the range from 150 to 200 m- / g and a pore diameter in the range from 100 to 55000 Å, with 25 to 60% of the porous carrier material has a diameter above 20,000 À.

7. A method for producing an immobilized carrier-fixed enzyme according to claim 1, characterized in that the inorganic carrier material is treated with a solution of a bi- or polyfunctional monomer, a polymer hydrolyzate or a prepolymer, the non-adsorbed solution is removed, which thus impregnated The carrier material is treated with excess amounts of a bifunctional monomer in solution, the excess referring to the molar amounts of the first-mentioned monomer, hydrolyzate or prepolymer contained in the impregnated carrier material, and is selected such that functional groups on the organic polymer material which is formed also contribute to the covalent reaction the enzyme remains

that an enzyme solution is then added to the combined organic-inorganic base material obtained and the unreacted materials are removed.

8. The method according to claim 7, characterized in that aqueous solutions are used as a solution of the bifunctional or polyfunctional monomer, the polymer hydrolyzate or the prepolymer, as a solution of the bifunctional monomer and as an enzyme solution.

9. The method according to claim 7, characterized in that one uses organic solvents, in particular acetone or tetrahydrofuran, for the bi- or polyfunctional monomer, the polymer hydrolyzate or prepolymer.

10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that the second bifunctional monomer used is one having reactive groups which are separated from one another by a chain of 4 to 10 carbon atoms.