MXPA06006670A

MXPA06006670A - Xilanasas expresadas microbialmente y su uso como aditivos de forraje y otros usos.

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Publication number: MXPA06006670A
Application number: MXPA06006670A
Authority: MX
Inventors: Michael Bauer; Michael Richard Bedford; Derrick Allen Pulliam
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2007-03-21
Also published as: TW200530262A; CN1981036A; AU2004324514A8; US7662415B2; EP1771554A4; CA2548723A1; US20080187627A1; WO2006083240A3; US7291493B2; WO2006083240A2; BRPI0417821A; EP1771554A2; US20050208178A1; AU2004324514A1; AR047157A1

Abstract

La presente invencion se relaciona con secuencias que codifican para xilanasas optimizadas por codon y la expresion de xilanasas en microbios y levaduras. La invencion se relaciona ademas con el uso de copias multiples del constructo o plasmido recombinate de expresion de xilanasa para altos niveles de expresion de proteina. La invencion tambien se relaciona con el uso de las xilanasas para forrajes o alimentos. La invencion tambien se relaciona con metodos de expresion de enzimas para incrementar la termotolerancia expresandolas en organismos que glicosilan proteinas en comparacion con la expresion de la misma enzima sin la glicosilacion. Ademas, la invencion se relaciona con metodo para preparar forrajes, aditivos enzimaticos para forrajes, y los metodos para reducir la relacion de conversion del forraje o incrementar la ganancia de peso de los animales.

Description

XILANASAS EXPRESADAS MICROBI LMENTE Y SU USO COMO ADITIVOS DE FORRAJE Y OTROS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con secuencias que codifican para la xilanasa optimizadas en el codón y la expresión de xilanasas en microbios y levaduras. La invención se relaciona además con el uso de copias múltiples del constructo o plásmido recombinante de expresión de xilanasa para altos niveles de expresión de la proteína. La invención también se relaciona con el uso de las xilanasas como aditivos de forrajes o alimentos. La invención también se relaciona con métodos de expresión de enzimas para incrementar la termotolerancia expresándolas en organismos que glicosilan proteínas en comparación con la expresión de la misma enzima sin la glicosilación. Además, la invención se relaciona con métodos para preparar forrajes, aditivos enzimáticos para forrajes, y métodos para reducir la relación de conversión de forraje o incrementar la ganancia en peso de los animales. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polisacáridos no almidonados (NSP) han sido implicados en la variabilidad de la calidad nutricional de cereales para pollos, asociadas con cambios en la viscosidad de la ingesta (Bedford, M.R. & H.L. Classen (1993) "An in Ref: 173439 vitro Assay for Prediction of Broiler Intestinal Viscosity and Growth When Fed Rye-Based Diets in the Presence of Exogeneous Enzymes" Poult. Sci . 72, 137-143). Los arabinoxilanos son los NSP principales del trigo y varios productos de enzima xilanasa comercialmente disponibles, producidos a partir de Trichoderma, Humicola y Aspergillus spp que han mostrado reducir la viscosidad de la ingesta y usualmente mejorar el valor nutritivo de las dietas. Los xilanos son polisacáridos lineales formados de D-xilopiranosas beta-1, -ligadas. En cereales, los xilanos frecuentemente contienen cadenas laterales de L-arabinofuranosido alfa-1, 2, alfa-1, 3, o alfa-1, 2 y alfa-1, 3 ligado. Esos xilanos sustituidos son conocidos comúnmente como arabinoxilanos. Las xilanasas (por ejemplo, la endo-1,4-beta-xilanasa, EC 3.2.2.8) hidroliza enlaces beta-1, 4-xilosídico internos en el xilano para producir xilo-oligómeros de peso molecular más pequeño . Las xilanasas pueden ser usadas, por ejemplo, en composiciones de forrajes para animales las cuales son ricas en arabinoxilanos y glucoxilanos, en aplicaciones de horneado, bebidas y pulpa y papel, por ejemplo para mejorar la capacidad de blanqueado _de las pulpas. Cuando se agregan a forrajes (por ejemplo, para animales monogástrieos, incluyendo aves de corral o cerdos) que contienen cereales (por ejemplo, cebada, trigo, maíz, centeno, tritical o avena) o subproductos de cereal, una enzima semicelulósica mejora la degradación de las paredes celulares de la planta, lo cual conduce a un mejor uso de los nutrientes de la planta por el animal. Esto conduce a una mejor tasa de crecimiento y conversión del forraje. También, la viscosidad de los forrajes que contienen xilano puede ser reducida. En muchas de las aplicaciones prácticas, las condiciones físicas (por ejemplo, temperatura y pH) impiden el uso de las xilanasas; las xilanasas deben ser activas a las condiciones de temperatura y pH del proceso en el cual sean usadas. La formulación de forrajes comerciales usando una granulación, extrusión o expansión, con frecuencia contienen pasos que implican altas temperaturas (70-180°C) . Las enzimas agregadas al proceso de formulación deberán resistir esas condiciones. Por otro lado, la temperatura correspondiente en el intestino de los animales es de aproximadamente 40°C. De este modo, las xilanasas ideales para composiciones de forraje deberán resistir las temperaturas extremas mencionadas anteriormente . En aplicaciones de bloqueo, la aplicación de xilanasa no es tan simple como agregar un paso de tratamiento de la xilanasa. Debido a que el proceso de blanqueo, y aún la secuencia de pasos usados en el proceso de blanqueo varía en los diferentes molinos de pulpa, existe de este modo una necesidad continua de encontrar nuevas xilanasas activas a diferentes condiciones de temperatura y pH. La mayoría de las xilanasas comerciales diseñadas para aplicaciones en forrajes no son muy termotolerantes, especialmente cuando se usan condiciones de pH neutro o alcalino. En la práctica, las xilanasas generalmente son ineficientes o inactivas a temperaturas mayores de 60°C y con frecuencia esas enzimas trabajan bajo condiciones acidas. Generalmente, existen diferencias en las características físicas de las xilanasas de hongos y bacterias (para una revisión, véase Wong et al., Microbiol. Rev. 52:305-317 (1988)). Típicamente, las xilanasas micóticas tienen una temperatura óptima de aproximadamente 50 °C y un pH óptimo más bajo que aquellas de origen bacteriano. Las xilanasas de origen bacteriano generalmente tienen una temperatura óptima en el intervalo de 50 a 70 °C. Han sido identificadas y caracterizadas numerosas xilanasas de microorganismos micóticos y bacterianos (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,437,992; Coughlin, M. P. , Biely, P. et al . ; "Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma resei Cellulases and Other Hydrolases" , Espoo 1993, P. Souminen and T. Reinikainen eds., Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135 (1993) y W003/16654) . En particular, han sido identificadas tres xilanasas específicas (XYL-I, XYL-II y XYL-III) en T. reesei . (Tenkanen et al., Enzyme Microb. Technol. 14:566 (1992); Torronen, et al., Bio/Technology 10:1461 (1992); y Xu, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718 (1998)). Aunque han sido descritas numerosas xilanasas en la literatura aún existe la necesidad de identificar xilanasas novedosas que sean efectivas en aplicaciones como aquellas relacionadas con el procesamiento de forrajes y granos para animales, biocombustibles, limpieza, cuidado de telas, productos químicos, procesamiento de plantas y deslignificación y abril1antamiento de pulpa y papel .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen las secuencias de las SEQ ID Nos: 1, 3, 5 ó 7, y casetes de expresión, vectores y células anfitrionas recombinantes que comprenden esas secuencias . La invención también proporciona métodos para preparar una xilanasa termotolerante, que comprende los pasos de: expresión en una célula anfitriona microbiana de un cásete de expresión que comprende un promotor ligado operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica para una xilanasa la cual retiene al menos 40% de la actividad después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica mayor de 400U/mg a un pH menor de pH 5.0 y mayor de pH 1.5 La invención proporciona además un método para preparar una xilanasa termotolerante donde la xilanasa es glicosilada. La invención también proporciona una xilanasa termotolerante aislada producida por esos métodos. La invención también proporciona aditivos enzimáticos para forrajes y forrajes para animales que comprenden una xilanasa termotolerante . La invención proporciona además métodos para preparar un forraje para animales granulado que comprende una xilanasa termotolerante y forrajes para animales granulados producidos por esos métodos . También, la invención proporciona métodos para hacer disminuir la relación de conversión de forraje e incrementar la ganancia de peso de un animal, que comprende los pasos de alimentar a un animal con forraje para animal que comprende la xilanasa termotolerante en una cantidad efectiva para hacer disminuir la conversión del forraj e en el animal . También proporciona métodos para mejorar la energía metabolizable aparente del forraje animales, que comprende el paso de formular el forraje para animales con una o más xilanasas termotolerantes en una cantidad efectiva para mejorar la energía metabolizable aparente del forraje. La invención también proporciona un método para mejorar el valor nutritivo de forraje para animales o alimento para humanos que comprende el paso de agregar una xilanasa termotolerante durante la preparación del forraje para animales o el alimento para humanos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es el mapa del vector del plásmido pBCS12771. La Figura 2 es el mapa del vector del plásmido pBCS12772. La Figura 3 es el mapa del vector del plásmido pSY12773. La Figura 4 es una gráfica de la tasa de producción de gas para enzimas xilanasas seleccionadas durante 18 h de fermentación. Cada punto representa la media de seis observaciones . La Figura 5 es una gráfica de la actividad enzimática de xilanasa PP6002 expresada por Pichia, comparada con el pH. La Figura 6 es una gráfica de la tolerancia térmica de la zilanasa PP6002 Quantm® . La Figura 7 es una gráfica que compara la termoestablidad o termotolerancia de varias xilanasas. BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es una secuencia nucleotídica de la región que codifica para la xilanasa de la PP6002 (sin el sitio de escisión de proteasa kex 2 o el sitio de restricción de Aval) . Codones optimizados para la expresión en Pichia. La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la región que codifica para la xilanasa de la P60002 (también la misma que la BD6002 sin la señal de secreción) . La SEQ ID NO: 3 es la secuencia nucleotídica de la región que codifica para la xilanasa de la PP6016 (sin el sitio_ de escisión de proteasa kex 2 o el sitio de restricción Aval) . Codones optimizados para la expresión de Pichia . La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la región que codifica para la xilanasa de la PP6016 (también la misma secuencia de aminoácidos que la BD6016 sin la señal de secreción) . La SEQ ID NO: 5 es la secuencia nucleotídica de la región que codifica para la xilanasa de la PP6407 (sin el sitio de escisión de proteasa kex 2 o el sitio de restricción de Aval) . Codones optimizados para la expresión en Pichia . La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de la región que codifica para la xilanasa de la PP6407 (también la misma secuencia de aminoácidos que la BD6407 sin la señal de secreción) . La SEQ ID NO: 7 es la secuencia nucleotídica de la región que codifica para la xilanasa de la PP7436 (sin el sitio de escisión de proteasa kex 2 o el sitio de restricción de Aval) . Codones optimizados para la expresión en Pichia . La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de la región que codifica para la xilanasa de la PP7436 (también la misma secuencia de aminoácidos que la BD7436 sin la señal de secreción) . La SEQ ID NO: 9 es la secuencia nucleotídica de la PP6002 que comprende un sitio de restricción de Aval, un sitio de escisión de proteasa kex2 y una xilanasa optimizada en el codon de Pichia . La SEQ ID NO: 10 es la secuencia nucleotídica de la PP6016 que comprende un sitio de restricción de Aval, un sitio de escisión de proteasa kex2 y una xilanasa optimizada en el codon de Pichia . La SEQ ID NO: 11 es la secuencia nucleotídica de la PP6407 que comprende un sitio de restricción de Aval, un sitio de escisión de proteasa kex2 y una xilanasa optimizada en el codon de Pichia . La SEQ ID NO: 12 es la secuencia nucleotídica de la PP7436 que comprende un sitio de restricción de Aval, un sitio de escisión de proteasa kex2 y una xilanasa optimizada en el codon de Pichia . La SEQ ID NO: 13 es la secuencia nucleotídica de la xilanasa XylAlA (también llamada BD6002 sin la señal de secreción) . La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de la XylAlA (también llamada BD6002) sin la secuencia señal de secreción original. La SEQ ID NO: 15 es la secuencia nucleotídica de la xilanasa XylAlB que carece de una región que codifica para la secuencia de la señal de secreción (la secuencia de longitud completa también es conocida como BD7436) . La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de la xilanasa XylAlB (BD7436) que carece de la señal de secreción original . La SEQ ID NO: 17 es la secuencia nucleotídica de la xilanasa XylAlC que carece de aún región que codifique para la secuencia de la señal de secreción (la secuencia de longitud completa también es conocida como BD2230) . La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la xilanasa XylAlC (BD2230) que carece de una región de la secuencia de la señal de secreción. La SEQ ID NO: 19 es la secuencia nucleotídica de la xilanasa XylAID que carece de una región que codifique para la secuencia de la señal de secreción (la secuencia de señal completa también es conocida como BD6016) . La SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos de la xilanasa XylAID (BD6016) que carece de una región de la secuencia de la señal de secreción. La SEQ ID NO: 21 es la secuencia nucleotídica de la xilanasa XylAlE que carece de una región que codifique para la secuencia de la señal de secreción (la secuencia de señal completa también es conocida como BD6407) . La SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de la xilanasa XylAlE (BD6407) que carece de una región de la secuencia de la señal de secreción. La SEQ ID NO: 23 es la secuencia nucleotídica del cebador 1.

La SEQ ID NO: 24 es la secuencia nucleotídica del cebador 2. La SEQ ID NO: 25 es la secuencia nucleotídica del cebador 3. La SEQ ID NO: 26 es la secuencia nucleotídica del cebador 4. La SEQ ID NO: 27 es la secuencia nucleotídica del cebador 5. La SEQ ID NO: 28 es la secuencia nucleotídica del cebador 6. La SEQ ID NO: 29 es la secuencia nucleotídica del cebador 7. La SEQ ID NO: 30 es la secuencia nucleotídica del cebador 8. La SEQ ID NO: 31 es la secuencia nucleotídica del cebador 9. La SEQ ID NO: 32 es la secuencia nucleotídica del cebador 10. La SEQ ID NO: 33 es la secuencia nucleotídica del plásmido pBC12771. La SEQ ID NO: 34 es la secuencia nucleotídica del plásmido PBC12772; La SEQ ID NO: 35 es la secuencia nucleotídica del plásmido pSYN12773. La SEQ ID NO: 36 es la secuencia nucleotídica que codifica para el sitio de escisión de proteasa kex 2. La SEQ ID NO: 37 es la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de proteasa kex 2. La SEQ ID NO: 38 es la secuencia nucleotídica que codifica para la señal de secreción pre-pro-peptídica del "factor de acoplamiento a de Saccharomyces cerevisiae . La SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos del péptido señal de secreción pre-pro-peptídica del factor de acoplamiento a de Saccharomyces cerevisiae .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de una xilanasa o xilanasas, así como con mutantes y variantes de las mismas, como un aditivo para forrajes para animales y con productos alimenticios que contienen una xilanasa. La invención también se relaciona con un método para mejorar la relación de conversión del forraje y/o la energía metabolizable aparente de productos alimenticios usando una xilanasa o xilanasas . La invención produce un método para mejorar el valor nutritivo del forraje para animales. En este método, el forraje es formulado con una o más xilanasas, como por ejemplo, XylAlA, XylAlB, XylAlC, XylAID, y XylAlE, (SEQ ID NOS: 13-22 ,. respectivamente) , para el propósito de mejorar el uso de los nutrientes del forraje. El forraje comprende cualquier grano de cereal puesto que todos contienen xilanos, pero en particular trigo, centeno, tritical, arroz o maíz, a una tasa de inclusión de menos del 1.0%, de manera más particular, menos del 0.1% p/p. Las enzimas son agregadas al forraje usando una tasa de inclusión de entre 1 y lOOOOU/kg. Las enzimas pueden ser agregadas al forraje antes de o después del procesamiento del forraje, el cual abarca el granulado, expansión y extrusión a través de otros métodos existentes, o agregada simplemente al forraje (mezcla no procesada) . La adición de una o más de esas enzimas da como resultado un incremento en la energía metabolizable aparente (AME) y/o una disminución en la relación de conversión de forraje (FCR) en comparación con dietas no suplementadas. La invención también proporciona métodos para preparar y usar una molécula de ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica para una xilanasa. La xilanasa puede ser termotolerante, pero no necesariamente es termotolerante. En consecuencia, la invención también se relaciona con métodos para preparar y usar una molécula de ácido nucleico que codifica para una xilanasa termotolerante. Una xilanasa termotolerante incluye aquellas que retienen al menos 40% de actividad después de 30 minutos a aproximadamente 60 °C y que tiene una actividad específica alta, es decir, de al menos aproximadamente 200 U/mg a 37°C y pH ácido, por ejemplo, pH 5.3. En otra modalidad la xilanasa retiene al menos 40% de su actividad después de 30 minutos a 70°C, o retiene al menos 40% de su actividad después de 30 minutos a 80°C, o retiene al menos 40% de su actividad después de 30 minutos a 80°C. El método expresa la xilanasa que es una xilanasa termotolerante en ausencia de glicosilación. De manera alternativa, el método abarca la expresión de una xilanasa termotolerante que es glicosilada por el anfitrión. La invención también proporciona métodos para preparar xilanasas, incluyendo xilanasas termotolerantes . El método comprende expresar en una célula anfitriona microbiana un cásete de expresión que comprende un promotor ligado operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica para una xilanasa. La célula anfitriona microbiana puede ser una célula procariótica, como una célula bacteriana (por ejemplo, Escherichia, Pseudomonas, Lactobacillus, y Bacillus) , levaduras (por ejemplo Saccharomyces , Schizo saccharomyces , Pichia o Hansenula) o una célula micótica (por ejemplo Aspergillus o Trichoderma) . En particular, la célula anfitriona es Pichia pastoris . La célula microbiana empleada para preparar la xilanasa recombinante puede producir una forma glicosilada de la xilanasa recombinante. La invención también proporciona el método para preparar una xilanasa termotolerante donde la xilanasa es codificada por la secuencia nucleotídica de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5 ó 7. Además, la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido de fusión que comprende la xilanasa. La proteína de fusión puede comprender además un péptido señal de secreción ligado operativamente a la xilanasa. La invención comprende además un polinucleótido que codifica para la xilanasa ligada operativamente a al menos una secuencia reguladora, como un promotor, un mejorador, un intrón, una secuencia de terminación, o cualquier combinación de las mismas, y opcionalmente, con un segundo polínucleótído que codifica para una secuencia señal, que dirige la enzima codificada por el primer polinucleótido a un lugar celular particular por ejemplo, un lugar extracelular. Los promotores pueden ser promotores constitutivos o promotores inducibles (condicionales) . Como se describe aquí, se empleó la mutagénesis de un polinucleótido padre que codifica para una xilanasa para preparar ADN variantes (sintéticos) que codifican para una xilanasa que tiene propiedades mejoradas en relación a la xilanasa codificada por el polinucleótido padre. En una modalidad, las enzimas xilanasas son separadas por su actividad mejorada a pH ácido o básico, estabilidad intestinal mejorada, o nivel de expresión mejorado en organismos anfitriones. En otra modalidad, se combinaron las mutaciones en un número de ADN variantes para preparar un polinucleótido sintético que codifica para una xilanasa con mejor termotolerancia y estabilidad gástrica y que tiene una actividad específica similar o mayor en relación a la xilanasa codificada por el polinucleótido padre. Un polinucleótido padre puede ser obtenido de cualquier fuente incluyendo ácido nucleico de plantas, bacterias u hongos, y puede ser empleado cualquier método para preparar un polinucleótido sintético de la invención a partir de un polinucleótido padre seleccionado, por ejemplo, mutagénesis combinada, mutagénesis recursiva y/o transferencia de ADN. De este modo, en una modalidad de la invención, la xilanasa termotolerante tiene una o más sustituciones de aminoácidos en relación a una xilanasa correspondiente, sustituciones las cuales están asociadas con la retención de la actividad a temperaturas iguales o mayores de 60°C. En otra modalidad, la xilanasa termotolerante tiene una actividad de al menos el 40% a aproximadamente 60°C durante 30 minutos, o una actividad de al menos el 40% de aproximadamente 65°C durante 30 minutos, o una actividad de al menos el 35% a 70°C durante 30 minutos, y la cual tiene una actividad específica de al menos 400 U/mg, de manera más preferible de al menos 600 U/mg, y/o al menos 800 U/mg, a 37°C y pH ácido, por ejemplo, pH menor de 6.0 o al menos pH 4.0 y pH mayor de 1.5. Una unidad de xilanasa (XU) es la cantidad de enzima que libera 1 µmol de extremo reductores (equivalentes de xilosa) por minuto de WAXY (arabinoxilano de trigo) a 37°C, pH 5.3, bajo condiciones estándar. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una enzima termotolerante debido a la glicosilación que comprende el paso de expresar la enzima en Pichia pastoris . En una modalidad particular, la enzima es una xilanasa . En una modalidad de la invención, es una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5 ó 7. La invención también proporciona un cásete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5 ó 7. El cásete de expresión puede comprender además un sitio de escisión proteolítica como el sitio de escisión de la proteasa KEX2. En una modalidad más particular, el cásete de expresión es codificado por la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NOS: 9, 10, 11 ó 12. El cásete de expresión puede comprender además una secuencia nucleotídica aislada que codifique para un péptido señal de secreción, como la señal de secreción pre pro peptídica del factor del acoplamiento de Saccharomyces cerevisiae. El cásete de expresión puede comprender además al menos una molécula de ácido nucleico que codifique para una xilanasa de la invención ligada operativamente a un promotor. La invención también proporciona células anfitrionas recombinantes que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5 ó 7. La célula anfitriona recombinante puede ser una célula de bacteria, levadura u hongo. En particular, la célula anfitriona es una célula de Escherichia, Pseudomonas, Lactobacillus, Bacillus, Saccharomyces, Schizo saccharomyces, Pichia, Hansenula, Aspergllus o Trichoderma . En particular, la célula anfitriona es Pichia pastoris . En una modalidad más particular, la célula anfitriona comprende el vector pBC12771, pBC12772 o pSYN12773. En particular la célula anfitriona es Pichia pastoris que comprende el vector pSYN12773. También son proporcionados por la invención vectores que comprenden el cásete de expresión o polinucleótido de la invención, y células microbianas transformadas que comprenden el polinucleótido, cásete de expresión o vector de la invención. Un vector de la invención puede codificar para más de un polipéptido, incluyendo más de una xilanasa o puede codificar para un polipéptido de fusión que comprende a la xilanasa de la invención y una célula microbiana transformada puede comprender uno o más vectores de la invención. Las células transformadas de la invención son útiles para preparar la xilanasa recombinante de la invención. En consecuencia, la invención proporciona xilanasa aislada de las células microbianas transformadas de la invención, así como una enzima preparada sintéticamente. En particular, los vectores comprenden los plásmidos diseñados pBC12771 (SEQ ID NO: 33), pBC12772 (SEQ ID NO: 34), pBC12773 (SEQ ID NO: 35) . La invención también proporciona una xilanasa termotolerante aislada producida por el método de la invención. Además, la xilanasa termotolerante aislada está glicosilada. Además, son proporcionados por la invención métodos para la formulación de xilanasas, formulaciones de xilanasa o mezclas de enzimas formuladas. Los aditivos para forrajes que comprenden la xilanasa termotolerante comprenden una xilanasa termotolerante de la invención. Las formulaciones de aditivos para forrajes comprenden además un compuesto estabilizador, como pero sin limitarse al sorbital . La xilanasa recombinante o formulaciones de la misma pueden ser agregados como un suplemento a alimentos o forraje para animales o a componentes de alimentos y forraje antes de, durante o después del procesamiento del alimento o forraje. Preferiblemente, la xilanasa recombinante de la invención es agregada a una mezcla de componentes del forraje antes de y/o durante el acondicionamiento con calor (por ejemplo, vapor) en un molino de granulación. De este modo, la invención incluye métodos para producir y usar una xilanasa. Además, puesto que una xilanasa de la invención puede sobrevivir al paso de acondicionamiento con calor encontrado en un molino de granulación comercial durante la formulación del forraje, la invención proporciona un método para producir un forraje para animales-, por ejemplo, granulos de forraje a granel duros que comprenden la xilanasa. Para producir el forraje, la xilanasa formulada puede ser mezclada con los componentes del forraje, la mezcla acondicionada con vapor en un molino de granulación de modo que al menos el 50% de la actividad enzimática previa al tratamiento con calor se retenga, y el forraje extruído a través de una matriz de granulación. En otra modalidad, más del 70% de la actividad de la enzima es recuperada después de la granulación a 85°C, de manera más particular, más del 90% de la actividad enzimática es recuperada después de la granulación a 85°C. En una modalidad particular, al menos 80% de la actividad enzimática previa al tratamiento es recuperada después de la granulación a 90°C. La xilanasa puede de este modo ser usada como suplemento en forraje para animales por sí misma, además con vitaminas, minerales, otras enzimas para forrajes, coproductos agrícolas (por ejemplo, productos de calidad media de trigo o harina de gluten de maíz) o en combinación con estos. La enzima también puede ser agregada a dietas mezcladas, es decir, dietas que no han sido pasadas a través de un granulador. Algunos beneficios de usar xilanasas en forrajes se producen durante el proceso de elaboración del forraje, por ejemplo, durante el tratamiento con calor cuando las temperaturas fluctuarían de 75 a 95°C como en la granulación tradicional (la expansión será a 105-125°C) . Esos tratamientos pueden hacer disminuir la viscosidad del forraje en el intestino del animal. Véase Silversides and Bedford, Poultry, Sci. 78:1184-1190 (1999). Las enzimas xilanasas que no son termotolerantes son con frecuencia aplicadas después de la granulación, generalmente vía el rocío de una solución de enzima sobre el forraje granulado. Algunos de los problemas asociados con los métodos de rocío son que únicamente un bajo porcentaje de los granulos entran en contacto con la enzima, la enzima solo está presente sobre la superficie de los granulos recubiertos, y los molinos de forraje necesitan invertir en y operar maquinaria de rocío compleja. En contraste, una xilanasa termotolerante de la invención, la cual puede ser agregada antes de la granulación, facilitando por lo tanto la producción de un forraje con una distribución mejorada de la enzima. Además, el forraje que comprende una xilanasa termotolerante de la invención puede tener una vida de anaquel más prolongada que el forraje rociado con xilanasa, puesto que el proceso de rocío introduce humedad, la cual puede soportar el crecimiento de hongos y bacterias durante el almacenamiento. Las xilanasas actuales que no son termotolerantes pueden ser producidas para sobrevivir a temperaturas de procesamiento altas recubriéndolas con una capa de cera para mantener la humedad fuera. Este proceso es caro, sin embargo, reduce la eficacia del producto en dietas granuladas o dietas mezcladas a baja temperatura puesto que el recubrimiento de cera hace lenta la liberación de la enzima una vez introducida en el intestino del animal . La invención proporciona de este modo un método para preparar forraje para animales que comprende proporcionar una mezcla que comprende uno o más componentes de forraje y una preparación que comprende una xilanasa de la invención, como una xilanasa termotolerante, y tratar la mezcla bajo condiciones apropiadas de temperatura y humedad para hidrolizar el xilano que esté presente en la mezcla. También se proporcionar un forraje para animales preparado por ese método. Los forrajes para animales incluyen, pero no se limitan a, forrajes para aves de corral, forrajes para cerdos, o forrajes para rumiantes. Se proporciona además un método para preparar una composición que contiene xilanasa para una formulación de forraje que comprende combinar una solución líquida que comprende la xilanasa termotolerante de la invención y harina, por ejemplo, harina de soya, para producir una mezcla, y secar la mezcla para producir una composición seca. El secado de la mezcla puede ser efectuado por métodos usados de manera rutinaria a la técnica, incluyendo pero sin limitarse a la liofilización y/o calentamiento. La invención proporciona además un método en el cual una mezcla que comprende componentes de forraje para animales y una preparación que comprende la xilanasa de la invención es tratada con calor de modo que se produzca una mezcla de forraje para animales tratada con calor. También se proporciona el forraje para animales tratado con calor preparado por el método. La preparación de xilanasa puede ser una preparación líquida o sólida. En una modalidad, una solución líquida que comprende la xilanasa de la invención es combinada con harina de soya para producir una mezcla y la mezcla es entonces liofilizada. La mezcla también puede comprender al menos una vitamina, minerales, una enzima diferente a la xilanasa, un ácido orgánico, un producto probiótico, un aceite esencial o un coproducto del procesamiento de granos. El forraje tratado con calor puede ser procesado adicionalmente, por ejemplo, extruyendo el forraje tratado con calor a través de un molino de granulación para producir forraje para animales granulado. También se proporciona una composición de forraje para animales que comprende la xilanasa de la invención, y un aditivo enzimático para forraje, o un aditivo para alimentos que comprende una xilanasa. La invención proporciona además un forraje granulado para animales. En una modalidad, el forraje granulado para animales es acondicionado con vapor en un molino de granulación a aproximadamente 85 °C de modo que más del 70% de la actividad enzimática previa al tratamiento con calor se retenga, y el forraje extruído a través de una matriz de granulación. El otra modalidad, el forraje granulado para animales es acondicionado con vapor en un molino de granulación a aproximadamente 90°C de modo que al menos el 80% de la actividad enzimática previa al tratamiento con calor se retenga, y el forraje extruído a través de una matriz de granulación. También se proporciona un método para hacer disminuir la relación de conversión del forraje e incrementar la ganancia de peso de un animal, que comprende el paso de alimentar a un animal con un forraje que comprende una xilanasa termotolerante de la invención en una cantidad efectiva para hacer disminuir la relación de conversión del forraje en el animal e incrementar la ganancia de peso del animal . La invención proporciona un método para mejorar el valor nutritivo del forraje para animales o alimento para humanos . El método comprende el paso de agregar la xilanasa de la invención durante la preparación del forraje para animales o el alimento para humanos. También se proporciona un método para preparar alimento para humanos que comprende proporcionar una mezcla de un componente de un alimento y una preparación que comprende la xilanasa de la invención, y tratar la mezcla bajo condiciones apropiadas de temperatura y humedad para facilitar la hidrólisis del xilano. La invención también proporciona un método para mejorar la energía metabolizable aparente (AME) del forraje para animales, que comprende el paso de formular el forraje para animales con una o más xilanasas termotolerantes de la invención con el forraje para animales en una cantidad efectiva para mejorar la energía metabolizable aparente del forraj e . Los animales dentro del alcance de la invención incluyen animales poligástricos, por ejemplo, carneros, así como animales monogástricos incluyendo pero sin limitarse a, cerdos, aves de corral, (por ejemplo, pollos, pavos, gansos, patos, faisanes, burogallos, codornices y avestruces), equinos, ovinos, caprinos, caninos y felinos, así como peces y crustáceos. Además, están incluidos en el alcance de la invención animales rumiantes como vacas . Los niveles de xilanasa en el forraje o alimento son agregados a una tasa de inclusión de entre aproximadamente 1 a 10000 U/kg, de manera más particular de 50 a 5000 U/kg, o 2000 a 3200 U/kg. La enzima xilanasa, así como las mezclas de enzimas descritas anteriormente, pueden en principio ser agregadas a todos los productos alimenticios. Los ejemplos adecuados o preferidos son aquellos que cumplen con las disposiciones de las legislaciones para productos alimenticios, como forraje completo, forraje suplementario y forraje mineral. La invención es un método para mejorar el valor nutritivo de forraje para animales. En este método, el forraje es formulado con una o más de las enzimas, por ejemplo, XylAlA, XylAlB, XylAlC, XylAID, y XylAlE, para los propósitos de mejorar el uso de los nutrientes del forraje. El forraje puede estar compuesto de cualesquier granos de cereal puesto que todos contienen xilanos, pero en particular, trigo, centeno, tritical, arroz o maíz, a una tasa de inclusión de menos del 1.0%, de manera más particular, de menos del 0.1% p/p. Las enzimas son agregadas a este forraje usando una tasa de inclusión de entre 1 y 10000 U/kg. Las enzimas pueden ser agregadas al forraje antes de o después del procesamiento del forraje, el cual abarca la granulación, expansión y extrusión aunque existan otros métodos, o simplemente agregadas a forraje (mezcla no procesado) . La adición de una o más de esas enzimas da como resultado un incremento en la energía metabolizable aparente (AME) y/o una disminución en la relación de conversión del forraje (FCR) en comparación con dietas no suplementadas, pero también en comparación con dietas suplementadas con las xilanasas estándar comerciales actuales. La dosis de enzima está en el intervalo de 0.01 a 10000 ppm o de manera alternativa en el intervalo de 20 a 1000 ppm. La actividad del producto de la enzima xilanasa se establece normalmente en unidades (U) . El producto enzimático, solo o en una mezcla, es mezclado con el lote de forraje en las relaciones apropiadas en peso. En relación con esto, es importante que las sustancias activas en el forraje se distribuyan uniformemente . Los productos de forraje que contienen una enzima xilanasa pueden ser empleados para alimentar todo ganado bovino, pero de manera particularmente ventajosa para alimentar ganado agrícola usado para la producción de productos alimenticios, en particular pollos para asar, pavos , cerdo y ganado vacuno . La adición del producto enzimático o de la mezcla a productos de forraje da una considerable mejora en el uso de los mismos y, en relación con esto, una mejora en el crecimiento del ganado. El uso del mismo como aditivo para productos de forraje tiene, en comparación con los aditivos que tienen actividad antibiótica, la mayor ventaja de que coexiste riesgo de desarrollo de resistencia con el uso durante un periodo prolongado . Otros Usos Las xilanasas de la presente invención pueden ser usadas en cualquier aplicación para la cual sean usadas otras xilanasas, como pero sin limitarse a, procesamiento de granos, biocombustible, cuidado de telas, productos químicos, procesamiento de plantas y deslinificación y abri11antamiento de pulpa y papel .

Plásmidos Recombinantes y Células Anfitrionas de la Invención La invención preferiblemente proporciona un cásete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico (promotora) capaz de dirigir la expresión de un polinucleótido que codifica para una xilanasa ya sea in vi tro o in vivo. Los métodos para preparar y/o identificar una xilanasa incluyen la mutagénesis, por ejemplo, mutagénesis recursiva y/o selección o separación, por ejemplo, por xilanasas que tienen actividad a temperaturas mayores de 60°C. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones de la secuencia nucleotídica son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel, 1985; Kunkel et al., 1987; Patente Estadounidense No. 4,873,192; Walter and Gaastra, 1983 y las referencias citadas allí; y Arnold et al., 1996.

A. ADN y Células Anfitrionas para Transformación Los vectores, plásmidos, cósmicos, YAC (cromosomas artificiales de levadura) , BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y moléculas de ácido nucleico aisladas para usarse en la transformación de células comprenderán en general las moléculas de ácido nucleico que codifican para la xilanasa, así como otras moléculas de ácido nucleico como ADNc, el gen o genes que uno desee introducir en las células . Esos constructores o plásmidos recombinantes de ácido nucleico pueden comprender además moléculas de ácido nucleico como_ promotores, mejoradotes, polienlazantes, o aún genes reguladores cuando se desee . Una de las moléculas de ácido nucleico o genes elegidos para la introducción con frecuencia codificarán para una proteína la cual será expresada en las células (recombinantes) transformadas resultantes, de modo que resultará en un rasgo separable o seleccionable y/o que impartirá un fenotipo mejorado a la célula transformada. Sin embargo, este no puede ser siempre el caso, y la presente invención también abarca células transformadas que incorporan transgenes no expresados . Las moléculas de ácido nucleico aisladas útiles para la introducción en células comprenden las que han sido derivadas o aisladas de cualquier fuente, que pueda ser caracterizada posteriormente como estructura, tamaño y/o función, alterada químicamente e introducida posteriormente en células. Un ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada "derivada" de una fuente sería una secuencia de ácido nucleico que sea identificada como un fragmento útil dentro de un organismo dado, y que sea entonces sintetizada químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de esa molécula" de ácido nucleico "aislada" de .una" fuente sería una secuencia de ácido nucleico útil que sea escindida o removida de su fuente por medios químicos, por ejemplo, por el uso de endonucleasas de restricción, de modo que pueda ser manipulada adicionalmente, por ejemplo, amplificada, para usarse en la invención, por la metodología de ingeniería genética. Esa molécula de ácido nucleico es comúnmente conocida como "recombinante" . Por lo tanto las moléculas de ácido nucleico útiles comprenden moléculas de ácido nucleico completamente sintéticas, moléculas de ácido nucleico semisintéticas, moléculas de ácido nucleico aisladas de fuentes biológicas, y moléculas de ácido nucleico derivadas de ARN introducido. De manera general, la molécula de ácido nucleico introducida originalmente no reside en el fenotipo que es receptor de la molécula de ácido nucleico, pero está dentro del alcance de la invención aislar un gen de un genotipo dado, e introducir posteriormente copias múltiples del gen en el mismo genotipo, por ejemplo, para aumentar la producción de un producto genético dado. La molécula de acido nucleico introducida comprende, pero no se limita a, moléculas de ácido nucleico aisladas de genes como aquellos de bacterias, levaduras, hongos o virus. La molécula de ácido nucleico introducida incluye genes modificados o sintéticos, porciones de genes, genes quiméricos, incluyendo genes del mismo o un genotipo diferente.- El término "gen quimérico" o "molécula de ácido nucleico quimérica" se define como un gen o secuencia o segmento de molécula de ácido nucleico que comprende al menos dos secuencias o segmentos de ácido nucleico de especies que no combinan ácidos nucleicos bajo condiciones naturales, o secuencias o segmentos de ácido nucleico los cuales son colocados o enlazados en una forma que no ocurrirá normalmente en el genoma nativo de la célula no transformada. La molécula de ácido nucleico introducida usada para la transformación aquí es circular o lineal, de doble hebra o de una sola hebra. Generalmente, la molécula de ácido nucleico aislada está en forma de ADN quimérico, como ADN plasmídico, de modo que también contiene regiones codificadoras flanqueadas por secuencias reguladoras las cuales promueven la expresión del ADN recombinante presente en la célula transformada. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste de un promotor que es activo en una célula que se derivó de un agente diferente al de la célula, o puede utilizar un promotor ya presente en la célula que es el objetivo de la transformación. Generalmente, la molécula de ácido nucleico introducida será relativamente pequeña, es decir, de menos de aproximadamente 30 kb para minimizar cualquier susceptibilidad a degradación física, química o enzimática que se sepa se incremente cuando el tamaño de la molécula de ácido nucleico se incremente. El número de proteínas, transcriptos de ARN o mezclas de los mismos, que es introducida en las células es comúnmente preseleccionada y definida, por ejemplo, de uno hasta aproximadamente 5-10 de modo que puedan formarse aquellos productos del ADN introducido . La selección de un vector de expresión apropiado dependerá de las células anfitrionas. Típicamente un vector de expresión comprende (1) elementos de una molécula de ácido nucleico procariótico que codifican para un origen de replicación bacteriana y un gen de resistencia a antibióticos para proporcionar la amplificación y selección del vector de expresión en un anfitrión bacteriano; (2) moléculas de ácido nucleico que controlan el inicio de la transcripción como un promotor; (3) moléculas de ácido nucleico que controlan el procesamiento de transcriptos como intrones, secuencias de terminación de la transcripción/poliadenilación; y (4) una molécula de ácido nucleico o gen de interés que está ligado operativamente a la molécula de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción. En una modalidad, el gen de la xilanasa y los elementos operables no se replicarían de manera autónoma en una célula anfitriona. El vector expresado usado puede ser capaz de replicarse de manera autónoma en el anfitrión anterior o capaz de integrarse al cromosoma, que contiene originalmente un promotor en un sitio que permite la transcripción del gen de xilasa enlazado. Si son usados procariotes como bacterias como anfitrión, el vector de expresión para la xilanasa es preferiblemente incapaz de replicarse de manera autónoma en el microorganismo y que comprende un promotor, una secuencia de unión ribosomal, el gen novedoso de xilanasa, y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector también puede contener un gen para regular el promotor. Los vectores de expresión de levadura u hongo pueden comprender un origen de replicación, un promotor y un mejorador adecuados, y también cualesquier otros sitios de unión ribosomal necesarios, sitios de poliadenilación, sitios donadores y receptores de empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcritas flanqueadas 5' . Los vectores adecuados incluyen a manera de ejemplo: para bacterias, pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene), pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); para células eucarióticas: pXTl, pSG5 (Stratagene) pSVK3 , pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia) . Esos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, al pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemical Uppsala, Suecia) y GEMÍ (Promega Bistec, Madison, Wis., EUA) . Sin embargo, puede ser usado cualquier otro plásmido o vector en tanto sean replicables y viables en el anfitrión. Como ejemplos representativos de los anfitriones apropiados pueden ser mencionados: células bacterianas, como E. coli , Streptomyces, Bacillus subtilis; y varias especies dentro de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium y Staphylococcus, aunque también pueden ser empleados otros como materia de elección; células micóticas pertenecientes a los géneros Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium etc., como levaduras pertenecientes a los géneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces , Trichosporon, Schwanniomyces , Pichia y similares. La construcción de vectores que puedan ser empleados en conjunto con la presente invención será conocida por aquellos expertos en la técnica a la luz de la presente descripción (véase, por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 1989; Gelvin et al., Plant Molecular Biology, 1990) . El cásete de expresión de la invención puede contener uno o una pluralidad de sitios de restricción que permitan la colocación del polinucleótido que codifica para una xilanasa bajo la regulación de una secuencia reguladora. El cásete de expresión también puede contener una señal de terminación ligada operativamente al polinucleótido así como secuencias reguladoras requeridas para la traducción apropiada del polinucleótido. El cásete de expresión que contiene polinucleótido de la invención puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de los otros componentes. La expresión del polinucleótido en el cásete de expresión puede ser bajo el control de un promotor constituido, promotor inducible, promotor regulador, promotor viral o promotor sintético. El cásete de expresión puede incluir en la dirección 5' -3' de la transcripción, una región de. inicio transcripcional y transnacional, el polinucleótido de la invención y una región de terminación transcripcional y transnacional funcional in vivo y/o in vi tro . La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio transcripcional, puede ser nativa con el polinucleótido, o puede ser derivada de otra fuente. Las secuencias reguladoras pueden localizarse corriente arriba (secuencias 5' no codificadoras) , dentro (intrón) o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora, e influenciar la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, y/o traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, mejoradotes, promotores, sitios de unión de represor, secuencias líderes de la traducción, intrones, y secuencias señal de poliadenilación. Ellas pueden incluir secuencias naturales y sintéticas así como secuencias que puedan ser una" combinación de secuencias sintéticas y naturales. El vector, usado en la presente" invención también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

B. Secuencias Reguladoras Un promotor es una secuencia nucleotldica que controla la expresión de una secuencia codificadora proporcionando el reconocimiento por la ARN polimerasa y otros factores requeridos para la transcripción apropiada. Un promotor incluye un promotor mínimo, que consiste únicamente de todos los elementos básales necesarios para el inicio de la transcripción, como una casilla de ATA y/o iniciador que es una secuencia corta de ADN comprendida de una casilla de TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de inicio de la transcripción, a la cual se agregaron elementos reguladores para el control de la expresión. Un promotor puede ser derivado totalmente de un gen nativo, o puede estar compuesto de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o aún estar comprendido de segmentos de ADN sintético. Un promotor puede contener secuencias de ADN que estén implicadas en la unión de factores proteicos que controlen la efectividad del inicio de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo . El promotor también puede incluir un promotor mínimo más un elemento o elementos reguladores capaces de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional . Este tipo de secuencia promotora contiene elementos proximales y más distales, los últimos elementos son con frecuencia referidos como mejoradores. Los ejemplos representativos de promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores que se sabe controlan la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. Los promotores bacterianos particulares incluyen el lac o trp de E. Coli , el fago lambda PL, lacl, lacZ, T3 , T7, gpt, y promotores lamda PR. Cualquier promotor que pueda expresarse en anfitriones de levadura pueden ser usados como el promotor. Los ejemplos de los mismos incluyen promotores de genes de hexocinasa y similares en la vía glicolítica, y promotores como el promotor gal 1, el promotor gal 10, el promotor de la proteína de choque térmico, el promotor MFa-I y el promotor CUP 1. Puede ser usado cualquier promotor capaz de expresarse en hongos filamentosos. Los ejemplos son un promotor altamente inducido por almidón o celulosa, por ejemplo, un promotor para la glucoamilasa o a-amilasa del género Aspergillus o celulasa (celobiohidrasa) del género Trichoderma, un promotor para enzimas en la vía glicolítica, como la fosfoglicerato cinasa (pgk) y la glicerilaldehído de 3-fosfato deshidrogenasa (gpd), etc. Los dos métodos principales para el control de la expresión son conocidos, viz : sobreexpresión y subexpresión. La sobreexpresión puede ser lograda mediante la inserción de más de una copia extra del gen seleccionado. Para la subexpresión existen dos métodos principales los cuales son comúnmente referidos en la técnica como "desregulación antisentido" y "desregulación sentido" . Generalmente esos procesos son referidos como "silenciamiento genético" . Ambos de esos métodos conducen a la inhibición de la expresión del gen blanco u objetivo. Se conocen varios promotores inducibles en la técnica. Muchos promotores son descritos en una revisión de Gatz (Current Opinión in Biotech. 7(2): 168-172 (1996) (véase también Gatz, Annual Rey. Plant. Physiol y Plant Mol. Biol. 48:89-108 (1997)). Los ejemplos incluyen el sistema represor de tetraciclina, sistema represor de Lac, sistema inducible con cobre, sistema inducible con salicilato (como el sistema PR la) , sistemas inducibles con glucocorticoide (Aoyama T. et al., Plant Journal 11 (3) : 605-612, 1997) y ecdisoma. También se incluyen el sistema inducible con bencen sulfonamida (Patente Estadounidense No. 5,364,780), sistemas inducibles con alcohol (WO 97/06269 y WO 97/06268) y promotores de glutation S-transferasa. La expresión regulada de una proteína de replicación virar transaccional quimérica puede ser regulada además por otras estrategias genéticas. Por ejemplo, la activación genética mediada por Cre como es descrito por Odell et al., (Molecular and General Genetics 223:369-378 1990) . De este modo, un fragmento de ADN que contiene una secuencia reguladora 3' unida por sitios lox entre el promotor y la secuencia que codifica para la proteína de replicación que bloquea la expresión de un gen de replicación quimérico del promotor puede ser removido por escisión mediada por Cre y dar como resultado el gen de replicación transeccional . En este caso, el gen quimérico Cre, el gen de replicación transeccional quimérico, o ambos pueden estar bajo el control de promotores específicos o inducibles por el desarrollo . Una estrategia genética alternativa es el uso del gen supresor de ARNt. Por ejemplo, la expresión regulada del gen supresor de ARNt puede controlar condicionalmente la expresión de una secuencia que codifique para una proteína de replicación transeccional que contenga un codón de terminación apropiado como es descrito por Ulmasov et al . , Plant Mol. Biol. 35 (4) :417-424 , 1997. Nuevamente, el gen supresor de ARNt quimérico, el gen de replicación transaccional quimérico, o ambos pueden estar bajo el control de promotores específicos o inducibles por el desarrollo.

Además de uso de un promotor en particular, otros tipos de elementos pueden influenciar la expresión de transgenes. En particular, los intrones han demostrado el potencial para aumentar la expresión de transgen. Otros elementos incluyen aquellos que pueden ser regulados por agentes endógenos o exógenos, por ejemplo, proteínas de dedos de zinc, por ejemplo Patente Estadounidense No. 5,789,538, WO 99/48909; WO 99/45132; WO 98/53060; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 00/23464; WO 95/19431; y WO 98/54311. Un mejorador es una secuencia de ADN que puede estimular a la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel la especificidad tisular de un promotor particular. Un mejorador es capaz de operar en ambas orientaciones (5' a 3' y 3' -5' en relación al gen de las secuencias codificadores de interés) , y es capaz de funcionar aun cuando se mueva corriente arriba corriente abajo del promotor. Ambos mejoradotes u otros elementos del promotor corriente abajo se unen a proteínas y unión de ADN específicas de la secuencia que median sus efectos. Los vectores para usarse de acuerdo con la presente invención pueden ser construidos para incluir un elemento mejorador. Los constructos de la invención también incluirán el gen de interés junto con una secuencia de ADN del extremo 3' que actúe como una señal para terminar la transcripción y permita la poliadenilación de la ARNm resultante. Puesto que" la secuencia "de ADN entra al sitio de inicio de la trascripción y el inicio de la secuencia codificadora, es decir la secuencia líder no traducida, puede tener influencias sobre la expresión del gen, también puede desearse emplear una secuencia líder particular. Se contemplo que la secuencia líder preferida incluya aquellas que incluyan secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen unido, es decir, para incluir una secuencia líder de consenso preferido que puede incrementar o mantener la estabilidad del ARNm y prevenir el inicio inapropiado de la traducción. La elección de esas secuencias será conocida por aquellos expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.

C. Genes Marcadores Para mejorar la capacidad para identificar transformantes, puede desearse emplear un gen marcador seleccionable o separable como, o además de, el gen expresable de interés. Los "Genes marcadores" son genes que imparten un fenotipo distinto a células que expresan el gen marcador y de este modo permiten que células transformadas sean distinguidas de células que no tienen el marcador. Esos genes pueden codificar para un marcador seleccionable o separable, dependiendo si el marcador confiere un rasgo que uno pueda seleccionar por medios químicos, es decir, a través del uso de un agente selectivo (por ejemplo, un antibiótico o similar) , o si es simplemente un rasgo que uno puede identificar a través de observaciones o pruebas, es decir, por separación. Por supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores adecuados son conocidos en la técnica que pueden ser empleados en la práctica de la invención. Incluidos dentro de los términos genes marcadores seleccionables o separables también se encuentran genes que codifican para un "marcador secretable" cuya secreción puede ser detectada como medios para identificar o seleccionar células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores los cuales codifican para un antígeno secretable que puede ser identificado por la interacción del anticuerpo, o un a una enzima secretable las cuales pueden ser detectadas por su actividad catalítica. Las proteínas secretables caen en número de clases, incluyendo proteínas pequeñas, difundibles, detectables, por ejemplo, por ELISA y enzimas activas pequeñas detectables en solución extracelular. Los marcadores seleccionables para usarse en procariotes incluyen un gen de resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. Los marcadores separables que pueden ser empleados, incluyen, pero no se limitan a, un gen de b-glucouronidasa o uidA (GUS) el cual codifica para una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos; un gen de beta-lactamasa (Sutcliffe, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75 (8) :3737-3741, 1978), el cual codifica para una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (Por ejemplo, PADAC, una cefalosporina chromogénica) ; un gen xíIE (Zukowsky et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:1101, 1983) que codifica para una catechol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen alfa-amilasa (lkuta et al., Bio-technology 8 (3) : 241-242 , 1990); un gen de tirosinasa (Katz et al., J General Microbiol. 129 (Pt .9) : 2703-14,1983); que codifica para una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa para formar un compuesto fácilmente detectable melanina; un gen de beta-galactosidosa el cual codifica para una enzima para la cual existen sustratos cromogénicos; existen sustratos cromogénicos; un gen de luciferasa (lux) (Ow et al., Science 234:856-859, 1986), el cual permite la detección de bioluminiscencia; o aún un gen de alcorina (Prasher et al., Biochem Biophys Res Común. 126 (3) : 1259-68, 1985), el cual puede ser empleado la detección de bioluminiscencia sensible al calcio, o un gen de proteína fluorescente verde (Niedz et al., Plant Cell Reports 14 (7) :403-406, 1995). El marcador seleccionable también puede ser un marcador seleccionable negativo como tal, pero no se limita a, la transformación del gel o del organismo que sea de un genotipo ura3 y usando el sistema ura3 +/-5F0A, +/-uracil o en el medio.

Transformación El cásete de expresión, o un constructo o plásmido recombinante del vector que contiene el cásete de expresión, puede ser insertado en una célula. El cásete de expresión o plásmido recombinante o constructo de vector puede ser llevado episomalmente, o integrado al genoma de la célula, por ejemplo, derivados del SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, y seudorabia. Sin embargo, puede ser usado cualquier vector en tanto sea replicable y viable en el anfitrión. Esta disponible una variedad de técnicas y son conocidas por aquellos expertos en la técnica para la introducción de constructos en un anfitrión celular. La transformación de las células microbianas puede ser lograda a través del uso de polietileno glicol, cloruro de calcio, infección viral, DEAE dextran, infección de fago, electroporaciones y otros métodos conocidos en la técnica. La transformación de hongos, en particular Pichia, puede ser efectuada de acuerdo a los "Protocolos para Pichia" , en Methods Mol. Biol, Higgins, David Rand Cregg, James M. ; Eds (Humana, Totowa, N.J.) (1998) . La introducción del vector recombinante en levaduras puede ser efectuada por métodos que incluyen la electroporación, el uso de esferoplastos, acetato de litio y similares. Puede ser usado cualquier método capaz de introducir ADN en células de animales: por ejemplo, electroporación, fosfato de calcio, lipofección y similares.

Enzima Recombinante Para la preparación de xilanasa recombinante, después de la transformación de una cepa anfitriona adecuada y el crecimiento de la cepa anfitriona a una densidad celular apropiada, por ejemplo, un anfitrión bacteriano o de levadura, puede inducirse un promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura por inducción química) y las células cultivadas durante un periodo adicional para producir enzima recombinante. Las células son entonces cosechadas típicamente por centrifugación, perturbadas por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante obtenido para su purificación adicional . De manera alternativa, la proteína recombinante puede ser producida como fusión para una péptido señal que facilite la exportación de la proteína recombinante de la célula anfitrión. En esta situación las células son cosechadas por centrifugación y el sobrenadante es conservado . La proteína recombinante puede entonces ser purificado del sobrenadante. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser perturbadas por cualquier método conveniente, incluyendo un ciclo de congelamiento-descongelamiento, sofocación, perturbación mecánica, o uso de agentes usantes celulares, esos métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La enzima puede' ser recuperada y purificada de cultivo celular recombinantes por métodos que incluyen la precipitación con sulfato de amonio o etano, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfacelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lecitina. Pueden ser usados los pasos de repliegue de proteínas, cuando se necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede ser empleada la cromatografía de líquidos de . alto desempeño (CLAD) para los pasos de purificación finales . Las enzimas de la presente invención pueden ser un producto procedimientos sintéticos químicos, o producidas en la técnica recombinantes de un anfitrión microbiano (por ejemplo, por células de bacterias, levaduras, y hongos en cultivo) . Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, la enzima de la presente invención puede ser o no modificada covalentemente vía glicosilación. En células eucarióticas, la glicosilación de proteínas secretadas sirve para modular el pliegue de la proteína, _ estabilidad conformacional y termoestabilidad, y resistencia a la proteólisi-s . Dada una aplicación específica del uso de la xilanasa, una versión glicosilada de la enzima puede ser preferible sobre una forma no glicosilada. Por ejemplo, el uso de una xilanasa glicosilada en forraje para animales ayuda a proteger la enzima contra la desnaturalización térmica durante el granulado del forraje y contra la inactivación proteolítica cuando pase a través del estómago del animal, ayudando a liberar la enzima activa al tracto intestinal y en sitio de acción. Para aplicaciones de procesamiento de alimentos donde se desee actividad enzimática únicamente durante el procesamiento y no en el producto final se prefiere una xilanasa no glicosilada, termolábil , y proteolíticamente susceptible. Produciendo la xilanasa de esta invención en varios anfitriones microbianos, se alteran tanto la termotolerancia como la susceptibilidad a la degradación proteolítica. Las enzimas de esta invención pueden ser empleadas para cualquier propósito en el cual esa actividad enzimática sea necesaria o deseada. En una modalidad preferida, la enzima es empleada para catalizar la hidrólisis de xilano en forraje para animales. En otra modalidad preferida, la enzima es empleada para catalizar la hidrólisis del xilano en alimentos.

Composiciones de Xilanasa Generalmente, las composiciones de xilanasa son líquidas o secas. Las composiciones líquidas no necesitan contener nada más que la enzima xilanasa, preferiblemente en una forma altamente modificada. Sin embargo, puede ser agregado un estabilizador un glicerol, sorbitol o mono propilen glicol . La composición líquida también puede comprender otros aditivos como sales, azúcar, preservativos, agentes para ajustar el pH y proteínas. Las composiciones líquidas típicas son acuosas o suspensiones en base de aceite . Las composiciones líquidas pueden ser agregadas a un alimento o forraje antes o después de una granulación opcional de los mismos. Las composiciones hechas pueden ser composiciones secadas por congelamiento secadas por rocío, caso en el cual la composición no necesita contener nada más que la enzima en forma seca. Las composiciones secas pueden ser granulos los cuales pueden ser mezclados fácilmente con, por ejemplo, componentes de alimentos o forrajes de manera más preferible, formar un componente de una premezcla. El tamaño de partícula de los granulos de enzima preferiblemente es compatible con los granulos componentes de la mezcla. Esto proporciona medios seguros y convenientes para incorporar enzimas en, por ejemplo, alimento o forraje par animales procesado. Por ejemplo, una formulación de enzima xilanasa estable puede ser preparada congelando una mezcla de solución de enzima líquida con un agente leudante como la harina de soya molida y liofilizando entonces la mezcla. La reducción en la humedad y las interacciones de unión de la xilanasa con el agente leudante protege a la enzima de los factores ambientales externos como las temperaturas extremas experimentadas durante la elaboración del forraje compuesto. Las formulaciones secas pueden mejorar aún más la estabilidad minimizando la actividad de enzimas proteolíticas potenciales que puedan estar presentes como subproductos en la mezcla de fermentación líquida para elaborar la enzima objetivo. La mezcla de enzimas-harina de soya seca resultante de la presente invención puede resistir altos extremos de temperatura. Esta mezcla enzimática formulada puede ser usada como suplemento para forrajes para usarse en la producción de aves de corral y cerdos . Una vez obtenida una preparación de enzima seca, se preparan granulados por aglomeración usando técnicas de aglomeración en un mezclador de alto corte durante el cual un material de carga o la enzima se conglomeran para formar granulos . Los granulos de absorción son preparados teniendo núcleos del portador para absorber/ser recubierto por la enzima. Los materiales de carga típicos son sales como el sulfato disódico. Las cargas incluyen al caolín, talco, silicato de magnesio y aluminio y fibras de celulosa.

Opcionalmente, también se incluyen aglutinantes como las dextrinas en los granulos de aglomeración. Los materiales de soporte típicos incluyen al almidón, por ejemplo, en forma de mandioca, maíz, papa, arroz y trigo. También pueden ser usadas sales. Opcionalmente, los granulos son recubiertos con una mezcla de recubrimiento. Esa mezcla comprende esa mezcla de recubrimiento, preferiblemente agentes de recubrimiento hidrofóbicos, como aceite de palma hidrogenado y cebo de res, y si se desea otros aditivos como el carbonato de calcio o caolín. Adicionalmente, las composiciones de xilanasa pueden contener otros sustituyentes como agentes colorantes, compuestos aromáticos, estabilizadores, vitaminas, minerales, otras enzimas que mejoren alimentos o forrajes y similares. Esto es en particular para las llamadas premezclas. Un "aditivo para alimento o forrajes" es un compuesto esencialmente puro o una composición multicomponente que se pretende sirva para ser adecuada para ser agregada a un alimento o forraje. En particular es una sustancia que se pretende que al ser usada se convierta en un componente de un producto alimenticio o forrajero o afecte cualesquier característica de un producto alimenticio o forrajero. De este modo, debe comprenderse que un aditivo de xilanasa significa una xilanasa, la cual no es un constituyente natural de las sustancias principales del forraje o alimento o no está presente en su concentración natural en ellas, por ejemplo, la xilanasa es agregada al forraje separada a las sustancias del forraje, sola o en combinación con otros aditivos para forrajes. Un aditivo típico comprende usualmente no más compuestos como vitaminas, minerales o enzimas que mejoren forrajes corte y/o o excipientes adecuados . Un aditivo de xilanasa "listo para usarse" se define aquí como un aditivo que no es producido forraje para animales o en el alimento procesado. Un aditivo de xilanasa listo para usarse debe ser alimentado a humanos o animales directamente, de manera preferible, directamente después de mezclar con otros constituyentes del forraje o alimento, un aditivo para forraje de acuerdo a este aspecto de la presente invención es combinado con otros componentes del forraje para producir el forraj e . Esos otros componentes del forraj e • incluyen uno o más de otros componentes enzimáticos (preferiblemente termoestable) , aditivos vitamínicos para forrajes, aditivos minerales para forrajes y aditivos de aminoácidos para forrajes. El aditivo para forrajes resultante (combinado) concluye la posibilidad de varios tipos de compuestos puede entonces ser mezclado en una cantidad apropiada con los otros componentes del forraje como suplementos de cereales y proteínas para formar un forraje para animales . El procesamiento de esos componentes en un forraje para animales puede ser efectuado usando cualquiera de los aparatos de procesamiento actualmente usados como una máquina granuladora doble, un granulador de vapor como un expansor o un extrusor. De manera similar, un aditivo para alimentos de acuerdo a este aspecto de la presente invención es combinado con otros componentes del alimento para producir los alimentos procesados. Esos otros componentes del alimento incluyen uno o más de otros implementos enzimáticos (en particular termoestables) , aditivos vitamínicos para alimentos aditivos minerales para alimentos. El aditivo para alimentos resultante (combinado) , que incluye posiblemente varios tipos de compuestos puede entonces ser mezclados en una cantidad apropiada con los otros componentes del alimento como proteína de alimentos y plantas para formar un producto alimenticio procesado. El procesamiento de esos componentes en un producto alimenticio procesado puede ser efectuado usando cualquiera de los aparatos de procesamiento actualmente usados. En otra modalidad, las composiciones de xilanasa de la invención comprenden adicionalmente una cantidad efectiva de una o más enzimas mejoradotas de alimentos, en particular enzimas mejoradotas de forrajes o alimentos del grupo seleccionado que consiste de alpha-galactosidasas, beta-galactosidasas, en particular lactasas, otras xilanasas beta-glucanasas, en particular endo-beta-l,4-glucanasas y endo-beta-1, 3 (4) -glucanasas, celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular arabinogalactano endo-l,4-beta-galactosidasas y arabinogalactan endo-1, 3-beta-galactosidasas, endoglucanasas, en particular endo-1, 2-beta-glucanase, endo-l,3-alfa-glucanas, y endo-1, 3-beta-glucanasa, enzimas degradantes o pectina, en particular, pectinasas, pectinesterasas, pectin leasas, poligacacturonasas, arabinasas, ramnogalacturonasas, ramnogalacturonan acetil esterasas, remnogalacturonan-alfa-ramnosidasa, pectatoliasas, y alfa-galacturonisidasas, manasas, beta-manosidasas, manan acetil esterasas, xilan acetil esterasas, proteasas, xilanasas, arabinoxilanasas y enzimas lipolíticas como las lipasas, fosfolipasas, fitasas y cutinasas. El aditivo para forrajes para animales de la invención es suplementado al animal antes o simultáneamente con la dieta. Preferiblemente, el aditivo para forrajes para animales de la invención es suplementado al animal simultáneamente con la dieta. Una cantidad efectiva de xilanasa en un alimento o forraje de aproximadamente 1 a 10,000 U/kg; de manera más particular de aproximadamente 50 a 5,000 U/kg, de manera más particular de aproximadamente 500 a 4,000 U/kg o de aproximadamente 250 a 3200 U/kg.

También dentro del alcance de esta invención está el uso de la xilanasa para procesar y elaborar alimentos para humanos y forrajes para animales. Los granos y harinas destinadas para alimentos humanos pueden ser tratadas enzimáticamente con xilanasa para reducir el contenido de xilano del material. Los niveles reducidos de xilano mejoran la calidad del alimento incrementando la disponibilidad de nutrientes de minerales esenciales como el hierro, calcio y zinc. Además de incrementar la calidad nutricional del alimento, la xilanasa usada durante el procesamiento del alimento puede mejorar la efici'encia total del método de producción del alimento. Durante la elaboración del alimento la xilanasa está activa durante la elaboración y procesamiento únicamente, y no está activa en el producto alimenticio final. Este aspecto es relevante por ejemplo en la elaboración y horneado de masa. De manera similar, los granos de forrajes para animales como la harina de soya tostada o harina de cánola pueden ser procesados con xilanasa antes de elaborar el forraje compuesto. La remoción de factores antinutritivos en componentes de forrajes para animales antes de la elaboración del forraje compuesto produce una calidad nutricional más alta e ingredientes de forrajes para animales más valiosos. En este método de procesamiento la xilanasa es activa durante la elaboración del forraje, y puede o no ser activa en el tracto digestivo del animal tras la ingestión del forraje tratado. Además de usar xilanasa como adyuvante del procesamiento de alimentos, el alcance de esta invención abarca el uso de la xilanasa como un adyuvante digestivo suplementario humano. La xilanasa en forma de tabletas puede ser ingerida al momento del consumo del alimento para liberar la enzima activa al tractogastrointestinal del receptor. Las ganancias nutricionales para el consumidor se experimentarían in vivo y pueden ser tomadas con alimentos que no puedan ser tratados con una xilanasa durante el procesamiento del alimento. También dentro del alcance de la invención está el uso de una xilanasa de la invención durante la preparación de preparaciones o aditivos para alimentos o forrajes, es decir, que la xilanasa es activa durante la elaboración únicamente y no es activa en el producto alimenticio o forrajero final. Este aspecto es particularmente relevante, por ejemplo, en la elaboración y horneo de masa y la producción de otros productos basados en cereales listos para comer. La xilanasa también puede ser usada de manera ventajosa en monogástricos así como en poligástricos, especialmente carneros jóvenes. Las dietas para peces y crustáceos también pueden ser suplementadas con xilanasa para mejorar aun más la relación de conversión del forraje. El forraje de acuerdo a la presente invención también puede ser proporcionado a animales como aves de corral, por ejemplo, pavos, gansos, patos, así como cerdos, equinos, bovino, ovino, caprinos, caninos y felinos, así como peces y crustáceos. Sin embargo, se prefiere de manera particular, que el forraj e sea proporcionado a cerdos o a aves de corral , incluyendo, pero sin limitarse a, pollos para asar, gallinas, en particular gallinas ponedoras, pavos y patos.

Composiciones de Forraje y Métodos de Uso La xilanasa (formulada como se describió anteriormente) de la invención actual puede ser combinada con otros ingredientes para obtener como resultado composiciones de forraje novedosas con ventajas particulares. Las xilanasas de la presente invención son tan activas que pueden ser usadas para crear formulaciones de forrajes para animales novedosas que permitan una eficiencia de conversión superior del forraje y una ganancia en peso mejorada en relación a dietas normales. Específicamente, el forraje para animales de la invención comprende la combinación de una xilanasa de la presente invención en combinación con ingredientes de forrajes para animales para formar un forraje que tenga un contenido de xilano intacto sustancialmente menor. En una modalidad preferida, las composiciones de forraje de la invención comprenden ingredientes de forrajes típicos, micronutrientes, vitaminas, etc. y una cantidad efectiva de xilanasa termoestable donde las cantidades de xilanasa se encuentran aproximadamente entre los niveles de 1-10,000 unidades de xilanasa por kg de forraje; de manera más particular entre los niveles de 50-5,000 unidades de xilanasa por kg de forraj e . También, dentro del alcance de la invención están los métodos para mejorar las ganancias de peso, y las relaciones de conversión de forraje (FCR) asociadas con la producción de animales de granja. Una xilanasa de la presente invención permite ganancias de peso y FCR mejoradas. Específicamente el método de la presente invención es para mejorar las FCR, o la ganancia de peso alimentando una dieta a un animal que comprende una xilanasa de la presente invención. El forraje para animales de la presente invención puede ser usado en animales monogástricos o poligástricos . El forraje para animales de la presente invención puede ser alimentado a aves de corral o cerdos, o carneros, o animales de compañía como perros, gatos, o cabellos. El forraje para animales también puede ser usado en rumiantes, como vacas. La invención será descrita mejor por los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

EJEMPLO 1 Constructor de Expresión XylAlA pBSC12771 (pPIC9 que alberga al Gen de Xilanasa XylAlA Sintético) . Se construyó un gen sintético que codifica para la secuencia de aminoácidos de xilanasa XyllAlA en Entelechon (Regensburg, Alemania) utilizando los codones preferidos de Pichia pastoris y se designó como PP6002 (para la versión del codón optimizado de Pichia pastoris de XylAlA" (SEQ ID NO: 1) . La secuencia del gen sintético se diseñó para incluir la señal de escisión de proteasa KEX2 (Glu-Lys-Arg) (SEQ ID NO: 37 y la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 36) en la parte frontal de la secuencia que codifica para el péptido maduro. El gen sintético fue proporcionado en el vector pPIC9 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y fue designado como pBSC12771 por Syngenta Quality Control (Figura 1 y SEQ ID NO: 33) . Esta estrategia de clonación produjo una proteína de fusión en la cual se fusionó la señal de secreción prepropept ídica del factor de acoplamiento a de Saccharomyces cerevisiae (secuencias nucleotídicas y de aminoácidos, SEQ ID NOS: 38 y 39, respectivamente) en el marco la N-terminal de la secuencia del gen PP6002. El péptido de fusión codificado por este gen es secretado de la célula después de la producción. Durante el proceso de secreción, la porción del péptido del factor a de la proteína de fusión es escindida por la proteasa Kex2 y la xilanasa XylAlA es liberada hacia el ambiente extracelular. Esto facilita el aislamiento y purificación de la enzima XylAlA. El gen PP6002 en este constructo o plásmido recombinante está bajo el control del promotor de alcohol oxidasa-1 (A0X1) P . pas tori s que es inducible con metanol. El gen sintético fue confirmado usando los cebadores del secuenciamiento 5A0X y 3A0X específicos del plásmido proporcionados por el fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Después de la confirmación de la secuencia, el plásmido pBSC12771 fue transformado en células E . col i TOP10 químicamente competentes como se describió anteriormente y se preparó un patrón de glicerol usando los métodos descritos por Sambrook J, Russel DW . 2001. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3ra Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) .

Construcción del Intermediario pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXXT. El vector de expresión de copias múltiples de levadura pA0815 (invitrogen, Carlsbad, CA) fue usado para producir multímeros del c sete de expresión PP6002. Para producir el vector de expresión por multimerización pA0815, se construyó una serie de vectores intermedios . El vector original pBSC12771 fue linealizado por digestión con BamHI . El sitio de restricción de BamHI fue entonces llenado nuevamente usando polimerasa T4 (NEB, Beverly, MA) . El sitio de BamHI llenado nuevamente fue entonces ligado sobre sí mismo usando ligasa rápida T4 (NEB, Beverly MA) . Cualquier vector original no modificado, restante, fue removido por una segunda digestión con BamHI . El ADN digerido con BamHI, rellenado, y religado fue transformado en células E. coli TOP10 químicamente competentes y seleccionado sobre LBamp?0o durante la noche a 37°C. Las colonias aisladas individuales se hicieron crecer en medios selectivos y el ADN fue purificado por los métodos descritos por Qiagen (equipo de purificación Qiagen mini-prep, Valencia, CA) . La eliminación del sitio de BamHI fue confirmada por digestión por restricción con BamHI . El vector modificado fue digerido con pPIC9mod-PP6002 y fue usado como molde o patrón para la PCR. Se usaron un termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y ADNc Polimerasa Advantage (Clontech, Palo Alto, CA) para amplificar el ADN blanco usando los oligos y parámetros de termociclaje siguientes: Cebador 1: 5 ' -AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAAC-3' (SEQ ID NO: 23) Cebador 2: 5' -CATTAGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3" (SEQ ID NO: 24) Tabla 1. Parámetros del termociclador Paso Temp(C) Tiempo Ciclos 1 94 5 min 1 2 94 30 seg 25 3 65 30 seg 4 72 30 seg 5 72 5 min 6 4 5 5 mmiinn ;hasta aproximadamente 24 hrs Los cebadores 1 y 2 fueron diseñados para amplificarse del extremo 5' del promotor AOX1 al extremo 3' del terminados de la transcripción AOXl, incluyendo el ORF de alfa-factor de la secreción-xilanasa. También, esos cebadores fueron diseñados para incorporar un sitio de Bg/II sobre el extremo 5' del producto y un sitio de Bamñl sobre el extremo 3' del producto para la multi erización posterior del cásete de expresión. El producto de la PCR resultante fue clonado directamente en el vector activado con topoisomerasa-I pCR4Blunt-T0P0 por métodos descritos por Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Este vector fue designado como pCR4-Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT . Los cebadores del secuenciamiento SP6, T7 y específico del gen confirmaron la fidelidad de la amplificación y codificación. Construcción del vector de expresión pBSC12772 (pA0815_lx PP6002) Se diseñaron oligonucleótidos (véanse los cebadores 3 y 4 más adelante) para amplificar el ORF que contiene el factor de acoplamiento de Saccharomyces cerevi siae y PP6002 de pBSAC12771 por PCR. Se usaron un termociclador GeneAmp" PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y Polimerasa pfuUltra Hotstart (Statagene, La Jolla, CA) para amplificar el ADN blanco. Cebador 3: 5' -GGGGCCGGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAATT TTT-3' (SEQ ID NO: 25) Cebador 4: 5' -GCCGGGGAATTCCGCGGCCGCCTATTACCAGACAGT AACATTTGA-3' (SEQ ID NO: 26) Los sitios incorporaron sitios de EcoRI sobre los extremos del producto de la PCR permitiendo la inserción posterior del producto en el vector receptor pA0815. La amplificación por reacciones de termociclaje se efectuó usando los siguientes parámetros : Tabla 2. Parámetros del termociclo Paso Temp(C) Tiempo Ciclos 1 94 5 min ' 1 2 94 30 seg 25 3 65 30 seg 4 72 1 min 72 7 min 1 4 5 min hasta aproximadamente 24 hrs El producto de la PCR f e digerido con EcoRI . La reacción de restricción fue separada por electroforesis a través de un gel de TAE al 0.8% y se purificó un fragmento de 0.8 kb por métodos descritos por Qiagen (Equipo de extracción Qiaquick Gel; Qiagen, Valencia, CA) . En una reacción de digestión por restricción paralela, el vector de expresión de copias múltiples de Pichia pastoris de pA0815 (Invitrogen; Carlsbad, CA) fue digerido con EcoRT y sus extremos cohesivos fueron desfosforilados por tratamiento con fosfatasa de intestino de carnero (New England Biolabs, Berverly, MA) . El fragmento del vector fue separado por electroforesis a través de un gel de TAE al 0.8% y purificado sobre gel como anteriormente. El fragmento de la PCR digerido con Ecol y purificado con gel fue ligado directamente en el pA0815 linealizado, desfosforilado usando ADN ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs; Beverly, MA) . La reacción de ligación fue transformada en células de E. coli TOP10 químicamente competentes y propagado sobre placas de LB que contenían ampicilina (100 µg/mL) . Las colonias aisladas individuales se hicieron crecer en el medio selectivo y el ADN fue purificado por métodos descritos por Qiagen (equipo de purificación Qiagen mini-prep, Valencia, CA) . La orientación y secuencia del gen fueron confirmadas usando cebadores del secuenciamiento 5A0X y 3A0X específicos del plásmido proporcionados por el fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Después de la confirmación de la secuencia, el plásmido pA0815_lx PP6002 fue transformado en células de E. coli TOP10 químicamente competentes y se preparó un patrón de glicerol usando los métodos descritos por Sambrook, et al . , 2001. El constructo pA0815_lx PP6002 fue sometido a control de calidad de Syngenta Biotechnology, Inc. Quality Control y fue designado pBSC12772 (Véase la Figura 2 y la SEQ ID NO: 34) .

Multimerización del Cásete de Expresión de PP6002.

El cásete de expresión (5AOX-PP6002-3AOXTT) fue removido de pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT por una doble digestión con Bg/II y BamII (New England Biolabs; Beverly, MA) y el fragmento de 2.1 kb fue purificado sobre gel. En una reacción separada, el pBSC12772 fue digerido con BamHI y sus extremos cohesivos desfosforilados por tratamiento con CIP como se describió anteriormente. El pBS12772 digerido con BamHI, tratado con CIP fue sometido a electroforesis a través de un gel de TAE al 0.8% y purificado sobre gel. El fragmento' de expresión de BamHT-Bg/II purificado sobre gel fue ligado en el vector pBSC12772 linealizado con BamHI tratado con CIP usando ADN ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs; Beverly, MA) y transformado en células de E. coli TOP10 químicamente competentes (Invitrogen; Carlsbad, CA) . Las células transformadas fueron propagadas sobre placas de LB que contenían ampicilina (100 µg/mL) y las placas se incubaron a 37°C durante la noche. Las colonias aisladas individuales se hicieron crecer en medios selectivos y el ADN fue preparado por los métodos descritos por Qiagen (Valencia, CA) . El constructo de xilanasa de dos copias fue confirmado por análisis de restricción y el análisis de la secuencia de ADN en las unión es usando cebadores específicos del vector. El vector pA0815 resultante que contiene dos copias del PP6002 fue designado como pA0815_2x PP6002.

Construcción de pSYN12773 (pA0815_3x PP6002) . Se construyó un coñstructo o plásmido recombinante que contiene tres copias del cásete de expresión de XylAlA sintética digiriendo el pA0815_2x PP6002 con BamHI y tratando con CIP los extremos cohesivos. El fragmento del cásete de expresión purificado de la reacción de doble digestión con BamHI-Bg/II pCR4Blunt_5AOX-PP6002-3AOXTT fue ligado en el vector pA0815_2x PP6002 digerido con BamHI, tratado con CIP usando ADN ligasa de T4 (Quick LIgation Kit, New England Biolabs; Beverly, MA) y transformado posteriormente en células de E. coli TOP10 químicamente competentes como se describió anteriormente. Las células transformadas fueron incubadas sobre placas de LB que contenían ampicilina (100 µg/mL) y las placas incubadas a 37°C durante la noche. Las colonias aisladas individuales se hicieron crecer en medios selectivos y el ADN fue preparado por los métodos descritos por Qiagen (Valencia, CA) . El constructo o plásmido recombinante de expresión de 3x copias fue confirmado por análisis de fragmento de restricción. Además, la secuencia nucleotídica completa de pA0815_3x PP6002 fue confirmada por el Control de Calidad de Syngenta Biotechnology. El constructo pA0815_3x PP6002 fue designado como pSYN12773 (véase la Figura 3 y la SEQ ID NO: 35) por el Control de Calidad de Syngenta.

EJEMPLO 2 Preparación de ADN de pSYN12773 para la Transformación de P. pastoris . Un cultivo de 50 mL de caldo TB suplementado con ampicilina (100 µg/mL) fue inoculado en el patrón de glicerol de células E. coli TOP10 que alojan el pSYN12773, y se hicieron crecer durante la noche a 37°C. El ADN fue purificado del cultivo por los métodos descritos por Qiagen (Protocolo del Qiaprep Midiprep, Qiagen, Valencia, CA) . El ADN plasmídico aislado fue digerido durante la noche con endonucleasa Bg/ll (New England Biolabs, Beverly, MA) . La mezcla de digestión fue sometida a electroforesis a través de un gel de agarosa con Tris Acetato EDTA (TAE) al 0.8% y el fragmento de 10.4 kb correspondiente al cásete de integración de XylAlA purificado por métodos descritos por Qiagen (protocolo de purificación en gel QiaQuick, Valencia, CA) . Una porción del fragmento purificado fue sometida a electroforesis a través de un gel de TAE al 0.8% para confirmar la digestión completa y su digestión relativa. Además, una porción del fragmento purificado fue transformado fue transformada en células E. coli DH5a químicamente competentes para confirmar que ningún plásmido residual circulado alberga el marcador de ampicilina contaminado en la muestra. Toda la mezcla de transformación fue propagada sobre una placa de LBjppioo incubada a 37°C durante 16 horas. No crecieron colonias sobre la placa.

EJEMPLO 3 Construcción del Anfitrión para la Expresión de XylAlA de P. pastoris Preparación de Células de P. pastoris GS115 para la Transformación. Todas las manipulaciones microbiológicas fueron conducidas en una campana de flujo laminar usando técnicas asépticas . Las células de levadura de Pichia pastoris GS115 (Invitrogen, Carlsbad, CA) fueron preparadas rayando las células sobre placas de agarosa con YPD . Después de crecer durante la noche a 30 °C, una sola colonia de levadura de la placa de agarosa con YPD fue transferida a 5 ml de caldo YPD y se hizo crecer a 30 °C durante la noche . Una porción de este "cultivo sembrado" fue usado para inocular un matraz con deflectores de 2 litros , estéril , que contenía 500 mL de caldo YPD . Este cultivo se hizo crecer con agitación vigorosa durante la noche a 30 °C a una densidad óptica de DOsoo = 1 . 5 . Las células fueron cosechadas por centrifugación a 4000Xg, 4°C, 5 minutos y resuspendidas en 80 mL de agua destilada doblemente estéril (sdd) . Diez mililitros de amortiguador de Te 10X (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0.1 mM) , pH 7.5 fueron agregados a la suspensión seguidos por 10 L de acetato de litio 1M (LiAc) . La suspensión celular fue incubada a 30°C con agitación suave.

Después de 45 minutos de incubación, se agregaron 2.5 mL de ditiotreitol 1 M (DTT) y la suspensión celular se volvió a incubar a 30°C durante 15 minutos adicionales. Las células fueron entonces lavadas en una serie de lavados con agua y finalmente se resuspendieron en 5 mL de sorbitol 1M enfriado con hielo.

Transformación del ADN de pSYN12773 en Pichia pastoris GS115 . El ADN purificado (100 ng) del cásete de expresión XylAlA del plásmido pSYN12773 digerido con BglII fue mezclado con 80 µL de células de Pichia pastoris GS115 tratadas con LiAc/sorbitol en una cubeta de electroporación de 0.2 cm (Gene Pulser Cuvettes, BioRad, Hercules, CA) y se incubó sobre hielo durante 5 minutos. La -cubeta de electroporación fue colocada en un instrumento BioRad Gene Pulser II e impulsada usando los parámetros de 1.5 kV, 25 µF, y 200 O. Se agregó sorbitol (0.5 mL) enfriado en hielo a la mezcla de electroporación la cual fue entonces cultivadas sobre placas de agar con medios mínimos-dextrosa (MD) , deficientes en histidina. La cepa GS115 de P. pastoris es un auxótrofo de histidina y es inútil para crecer en ausencia de histidina, pero los transformantes estables que contienen el gen his4 sobre el cásete de expresión de XylAlA se reestablecen a la prototrofía de la histidina y son capaces de crecer en medios libres de histidina. El crecimiento a 30°C durante 3 días produjo un número de transformantes prototróficos a la histidina. Las células GS115 lavadas con LiAc/Sorbitol sometidas a electroforesis en ausencia de ADN transformantes fueron colocadas sobre placas de agar con MD y MD/histidina como controles. Las células GS115 sin ADN transformante presente durante la electroporación no generaron colonias capaces de crecer sobre placas de MD que carecen de histidina. Identificación de Transformantes de P. pastoris que Producen Xilanasa. De los transformantes primarios sobre las placas de MD, se retiraron 256 colonias individuales, prototróficas para his+ y se cultivaron en réplicas sobre la placa maestra con MD. Esas colonias fueron posteriormente cultivadas en réplicas de placas de agar en medios mínimos con 1.0% de metanol (MM) , deficientes en histidina, que contenían 0.1% de Azo-arabinoxilano de tigo {abrev. AzoWAXY; Megazyme, County Wicklow, Irlanda) . Después de 16 horas de incubación a 30°C, las zonas claras que rodean las colonias sobre la placa MM AzoWAXY identificaron 92 transformantes que producen actividad de xilanasa. Se inocularon veinticuatro (24) de los 92 clones que expresan xilanasa en 3 mL de caldo de inducción de BMMY en bloque de pozos profundos, de 24 posiciones, y los clones se expresaron durante 5 días. Después de la inducción, los sobrenadantes fueron analizados por el ensayo de actividad de xilanasa y ELISA. Ocho (8) transformantes produjeron xilanasa a niveles putativamente mayores que los que producen los controles. Los niveles de expresión para esos 8 transformantes fueron investigados adicionalmente en matraces de agitación de 50 mL. Después de 5 días de inducción, los eventos 5501, 5517 y 5520 dieron mejoras significativamente estadísticas en el rendimiento y productividad.

Preparación de Patrones de Glicerol para el Almacenamiento a Largo Plazo de P. pastoris que Alberga transformantes de pSYN12273. Se prepararon patrones congelados de glicerol inoculando 7 mL de medios MD líquidos estériles en un tubo de vidrio de 16x150 mm, tapado, con cada uno de los 8 clones putativos positivos con alta expresión de xilanasa de la- placa maestra de MD. Esos se hicieron crecer durante la noche a 30°C en una rueda de cultivo giratoria. Se mezcló un mililitro (lmL) de glicerol estéril en cada cultivo para producir una mezcla al 15% (v/v) de glicerol a cultivo. Cada cultivo fue dividido en alícuotas en criofrascos estériles y almacenado a -80°C.

Caracterización del Anfitrión de Expresión de P. pastoris de XylAlA Selección por el Fenotipo MutS . Para identificar los clones MutS, los clones positivos a la xilanasa fueron rayados sobre placas de agar de medios mínimos que contenían 1.0% de metanol (MM) , deficientes en histidina, al lado de un control positivo de MutS (GS115 que alberga pPIC9-secHSA; Invitrogen, Carlsbad, VA) y un control de Mut+ (GS115 que alberga pPIC3-ßGal; Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las placas fueron incubadas a 30°C durante 4 días y se registró el crecimiento sobre MM. Treinta y nueve (39) de los 92 eventos de xyn+ 92+ originales identificados anteriormente exhibieron un crecimiento lento sobre medios MM en comparación con los controles. De esos treinta y nueve eventos, ocho han sido identificados previamente como de alta expresión por actividad y ELISA.

Tamiz de Hibridación Preliminar para el Cásete de Expresión XylAlA. Se condujo una serie de experimentos de hibridación. En el tamiz de hibridación preliminar, el ADN genómico fue preparado usando técnicas estándar (Miles JD, Busser K, Stalder C, and Higgins DR (1998) Isolation of nucleic acids, en Pichia Protocols, vol. 103 (Higgins DR & Cregg JM, eds.), Humana Press, Totowa, NJ, PP. 73-80) para los ocho eventos putativos con expresión alta. Dos microgramos de ADN genómico fueron digeridos usando endonucleasa de restricción BglII . Las digestiones se efectuaron a través de un gel de agarosa 0.8% y se transformaron entonces bidireccionalmente sobre dos membranas de nitrocelulosa generando manchas por duplicado. Se prepararon sondas de hibridación de ADN específicas para PP6002 COS , PP6002 para el gen de ampicilina {cAmp- 04) . Las sondas de xilanasa y amp fueron generadas por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos para el gen (véanse los cebadores 5 y 6 para PP6002 y cebadores 7 y 8 para amp) . Cebador 5: 5' -GCATCTACTGACTACTGGCAG-3 ' (SEQ ID NO: 27) Cebador 6: 5 ' -CCAGACAGTAACATTTGAATAACC -3' (SEQ ID NO: 28) Cebador 7: 5 ' -GGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT-3 (SEQ ID NO: 29) Cebador 8: 5 • -TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC-3 ' SEQ ID NO:30) Los productos fueron purificados sobre gel y marcados radioactivamente con [32P] -dCTP usando el sistema de marcación Rediprime-II (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Después de una hibridación rigurosa con la sonda de [32P] dCTP-amp en amortiguador de hibridación a 65°C, la primera mancha no mostró ninguna banda de hibridación, con la excepción del control positivo pSYN12773 digerido con Bgll . Este experimento indicó que el gen de la ampicilina no se integró al genoma de P. pastoris en ninguno de esos eventos. La mancha duplicada fue sondeada con [32P] dCTP-PP6O02 usando los métodos altamente rigurosos previamente descritos y produjo una sola banda de aproximadamente 10.4 kb para los eventos 5517 y 5520, indicando que las tres copias del gen de xilanasa se habían integrado exitosamente en esos eventos .

Tamiz de Hibridación Detallado para el Evento 5520.

En apoyo del tamiz de hibridación preliminar, se efectuaron digestiones de restricción adicionales del ADN genómico del evento 5220. Se digirieron dos microgramos del ADN genómico del evento 5520 con endonucleasas de restricción BamHI, Bg/Il, ECORI x Notl PstI, PvuII y Xhol x Notl . Las digestiones se hicieron correr a través de un gel de agarosa al 0.8% y entonces se transfirieron bidireccionalmente sobre membranas de nitrocelulosa generando manchas por duplicado. Se prepararon sondas de hibridación de ADN específicas para el cXyl4-01 CDS ass-PP6O02 y los genes de la columna vertebral del vector ( cAmp- 04 y oCOLE-10) . Las sondas de xilanasa y columna vertebral fueron generadas por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos para el gen (cebadores 3 y 6 para cXyl4-01 y los cebadores 9 y 10 siguientes para la columna vertebral) . Cebador 9: 5 ' -GCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGA-3 ' (SEQ ID NO: 31) Cebador 10: 5 ' -GGGAACACTCAAAAATAACAGTTAT-3 ' (SEQ ID NO: 32) Los productos fueron purificados sobre gel y marcados radioactivamente con [32P] -dCTP usando el sistema de marcación Rediprime-II (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Después de una hibridación rigurosa con la sonda de [3P] dCTP- Columna Vertebral en amortiguador de hibridación PerfectHybm Plus (Sigma Chemical Co., St . Louis MO) a 65°C, la primera mancha no mostró ninguna banda de hibridación, con la excepción del control positivo pSYN12773 digerido con Bgll . Este experimento indicó que la columna vertebral del vector no se integró al genoma de P. pastoris en el evento 5520. La mancha duplicada fue sondeada con [32P] dCTP-cXyl4-02 usando los métodos altamente rigurosos previamente descritos y produjo una sola banda de aproximadamente 10.4 kb en la muestra digerida con Bg/II, indicando que tres copias del gen de xilanasa se habían integrado exitosamente en el evento 5520. Las muestras digeridas con BamHI, EcoRI x Notl , PstI, PvuII y Xhol x Notl produjeron bandas con el perfil de migración esperado para la integración en el sitio de AOXI de P. pastoris . En resumen, todas las caracterizaciones del evento de expresión de PP6002 de P. pastoris 5520 por electroinmunotransferencia Southern y las características de crecimiento sobre medios mínimos que contenían metanol demuestran que el evento muestra un fenotipo His+, Muts, que contiene tres copias del cásete de expresión de PP6002 insertadas en el sitio de AOXI, y no contiene el gen de resistencia a la ampicilina u otros componentes de la columna vertebral del vector.

EJEMPLO 4 Preparación del Banco de Células Maestras de PP6002 de P. pastoris Del patrón congelado con glicerol con MD del evento 5520, se produjo un banco de células maestras; aquí posteriormente nombrado SY?12773. Bajo condiciones asépticas, una muestra del patrón congelado con glicerol SY?12773 fue revivida inoculando sobre una placa de MD incubada a 30°C hasta la aparición de colonias . Se retiró una sola colonia de la placa de MD y se inoculó en un tubo de cultivo que contenía 5 mL de medio líquido MD. El tubo fue incubado durante la noche sobre una rueda giratoria a 30°C. Al siguiente día, el cultivo iniciador de SYN12773 fue inoculado en un matraz con deflectores de 2.8 L, que contenía 350 mL de medio YPD. El cultivo se hizo crecer a 30 °C en un agitador a 250 rpm hasta que se alcanzó una ODSOo=2.0-3.0, 3. OxlO7 células. Bajo condiciones asépticas, se agregaron 150 mL de glicerol estéril a los 350 mL de cultivo YPD dando como resultado una relación de 30% (v/v) de glicerol a YPD. Se transfirieron alícuotas (1.0 mL) de cultivo a 243 tubos criogénicos de polipropileno de 2.0 mL estériles con tapas roscadas y aditamentos de sellado de sello anular (Fisher Science, Cat No. 056698) . Los 243 criofráseos fueron colocados en 3 criocajas y almacenados a -80°C.

Pureza del Banco de Células Maestras de Xilanasa de P. pastoris . Una muestra de un microlitro de uno de los frascos en el banco de células maestras fue inoculada sobre una placa de agar YPD. La placa fue incubada durante la noche a 30°C para generar colonias individuales. Esas colonias fueron examinadas visualmente y se encontró que tenían una morfología de colonia homogénea que fue idéntica a la de la cepa de P. pastoris GS115 original. Se tomó una sola colonia de la placa de YPD y se pasó a una placa de agar de MD y MM AzoWAXY y se hizo crecer a 30°C hasta la aparición de colonias individuales . Las colonias resultantes pudieron crecer sobre ambos agares con MD y MM que carecen de histidina, indicando que al igual que el evento con SYN12773, pero a diferencia de la cepa GS115 original, todas tuvieron un fenotipo His+. Además, todas las colonias crecieron lentamente sobre el agar con MM que contenía metanol como una fuente de carbono, indicando que al igual que con el evento con SYN12773, pero a diferencia de la cepa GS115, ellas tuvieron un fenotipo Muts que se esperaba de los mµtantes de AOX1. Adicionalmente, todas las colonias de la placa MM AzoWAXY produjeron zonas limpias indicando la expresión de xilanasa activa. Los resultados de esos análisis indican que el MCB descrito aquí es puro y no está contaminado con otros microbios .

Estabilidad genética del clon de xilanasa de P. pastoris . La estabilidad genética del cásete de expresión de PP6002 de copias múltiples en el caso del SYN12773 fue probada conduciendo 20 experimentos de cultivo en placa consecutivo sobre agar MD. Las células de uno de los frascos criogénicos de MCB fueron revividas inoculando sobre una placa de agar de MD y creciendo hasta por 48 horas a 30 °C (placa 1) . De la placa 1, se tomó una sola colonia y se cultivo nuevamente sobre una segunda placa de MD. El ciclo de tomar una sola colonia y volverla a cultivar fue conducido 20 veces consecutivo. El ADN genómico fue purificado de una sola colonia de las placas 1 y 20, y se usó para el análisis de electroinmunotransferencia Southern. Los perfiles de hibridación fueron comparados entre las generaciones 1 y 20. El análisis Southern fue efectuado como se describió anteriormente y no se observaron diferencias entre las generaciones 1 y 20. Se prepararon cultivos líquidos de una sola colonia de las placas 1 y 20 para el análisis de expresión de proteína. Tres colonias individuales de cada una de esas placas fueron usadas para inocular 50 ml de medios BMGY. Las células se hicieron crecer durante la noche a 30°C, se centrifugaron y resuspendieron en 50 ml de BMMY. Los cultivos fueron incubados a 30°C durante 5 días con la adición de metanol (MeOH) cada día hasta una concentración final de 1.0% (v/v) . Al final del periodo de fermentación, el sobrenadante claro fue analizado por la actividad de xilanasa. Los clones de ambas placas produjeron xilanasa activa a niveles estadísticamente indistinguibles (p<0.05) entre los cultivos de la misma placa así como entre los cultivos de las placas 1 y 20. Los análisis del ADN genómico por análisis Southern y por la expresión de proteína para las células de las placas 1 y 20 demuestran la estabilidad del cásete de expresión de PP6002 integrado en el genoma de Pichia pastoris GS115 y la expresión del gen de xilanasa dentro de ésta.

EJEMPLO 5 Determinación de la Actividad de la Xilanasa La actividad "enzimática fue determinada usando arabinoxilano de trigo como sustrato y midiendo la liberación de los extremos reductores por reacción de los extremos reductores con cualquiera de ácido 3 , 5-dinitrosalicílico (DNS) o ácido 2, 2' -bicinconínico (BCA) . El sustrato fue preparado como una solución al 1.4% p/p del arabinoxilano de trigo (Megazyme P-WAXYM) en amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 5.30 que contenía azida de sodio al 0.02%. El reactivo de DNS consistió de 0.5% p/p, 15% -de tartrato de sodio y potasio, y 1.6% p/p de hidróxido de sodio. Esta solución fue estable y fue almacenada durante hasta 3 meses a temperatura ambiente. El reactivo de BCA fue preparado combinando 50 partes de reactivo A con una parte de reactivo B (los reactivos A y B fueron de Pierce, números de producto 23223 y 23224, respectivamente) . Esos reactivos fueron combinados no más de cuatro horas antes de su uso. En el ensayo con DNS, se combinaron 500 microlitros de sustrato con 200 microlitros de muestra de enzima. Después de la incubación a la temperatura deseada durante el periodo de tiempo deseado, se agregaron 700 microlitros del reactivo de DNS. El contenido fue mezclado y colocado a 100°C durante 10 minutos. El contenido se dejó enfriar y entonces se transfirió a cubetas y se midió la absorbancia a 540 nm en relación a concentraciones conocidas de xilosa. La elección de la dilución de enzima, tiempo de incubación y temperatura de incubación podría variar según el experto en la técnica. En el ensayo con BCA, se combinaron 200 microlitros de sustrato con 80 microlitros de muestra de enzima. Después de la incubación a la temperatura deseada durante el periodo de tiempo deseado, se agregaron 2.80 mililitros de reactivo de BCA. El contenido fue mezclado y colocado a 80 °C durante 35 minutos. El contenido se dejó enfriar y entonces se transfirió a cubetas y se midió la absorbancia a 560 nm en relación a concentraciones conocidas de xilosa. La elección de la dilución de enzima, tiempo de incubación y temperatura de incubación podría variar según el experto en la técnica. La actividad enzimática fue determinada de acuerdo con el procedimiento de Miller G.L. (1959) Anal . Chem . 31 426-428.

EJEMPLO 6 Ensayos con Pollos Se usaron dietas de aves de corral estándar que contenía trigo, centeno y harina de soya como los ingredientes principales. Una dieta ejemplar se expone en la Tabla 3. Se uso la xilanasa XylAlA producida en P. pastoris recombinante? . Seis (6) réplicas de seis pollos por cada dieta se hicieron crecer hasta los 21 días de edad, y los pesos finales se determinaron sustrayendo el peso de los pollos de un día de edad. Se conservaron los registros de la cantidad de forraje consumido por cada gallinero de pollos, y se determinó un consumo de forraje promedio. La xilanasa XylAlA fue formulada liofilizando la preparación de enzimas activa y reconstituyendo entonces con agua en el sitio de ensayo. Esta formulación fue agregada directamente a las dietas. Se usó Avizyme 1300 de acuerdo a un estándar comercial a dosis similares a las de la xilanasa XylAlA.

Tabla 3 3.2 Formulación de la Dieta Ingrediente Inicial Centeno 20.00% Trigo-Forraje 37.49% Harina de soya 48 33.65% Aceite de soya 5.31% Sal 0.39% DL Metionina 0.22% Lisina HCl 0.04% Cal 1.13% Fosfato dicálcico 1.28% VIT/MIN 0.49% Proteína cruda % 22.88 ME de aves de corral kcal/kg 3,000.00 DE cerdos Kcal 3,487.48 Calcio % 0.85 Fosfato % 0.67 Fosfato disponible % 0.40 Grasa % 6.46 Fibra % 2.52 Met % 0.56 Cys % 0.39 Me + Cys % 0.95 Lys % 1.25 His % 0.56 Tryp % 0.28 Thr % 0.84 Arg % 1.52 Iso % 0.95 Leu % 1.69 Phe % 1.07 Tyr % 0.75 Val % 1.05 Gly % 0.93 Ser % 1.07 Phe + Tyr % 1.82 Na % 0.18 Cl % 0.29 K % 0.96 ácido linoleico % 2.54 Na + K-Cl 241.72 DUA 396.57 Azufre % 0.22 Magnesio 0.16 Betaína 0.47 Colina 1,378.97 ME de aves de corral MJ/kg 12.55 Soya total 0.35 La Tabla 4 ilustra el efecto de la inclusión en la dieta de xilanasa XylAlA en el desempeño del crecimiento de aves de corral, representado por las relaciones de conversión de forraje (FCR) . La relación de conversión de forraje (FCR) se refiere a la cantidad de forraje consumido dividida por la ganancia de peso neta del pollo. Una relación menor indica que un pollo ganó más peso por unidad de forraje consumido. Una relación menor indica que un pollo utilizó de manera más eficiente el forraje que lo que consumió. Las dietas de control (sin suplementación enzimática) claramente mostraron un desempeño más pobre que la adición de la dosis aún más baja de cualquier enzima. La FCR del control mejoró en concierto con el incremento de la dosis de enzima, de 1.671 hasta un óptimo de 1,449 a una tasa de inclusión de 400 unidades de xilanasa XylAlA. Aunque ambas xilanasas mejoraron el desempeño a un incremento de la dosis, está claro que la xilanasa XylAlA fue superior a la de la Avizyme 1300 como lo muestra el término estadísticamente significativo para la enzima. De este modo, el uso de esta xilanasa XylAlA de la invención para suplementar esos forrajes reducen la cantidad de forraje requerido para producir cada unidad de peso de pollo para asar en comparación con la dieta no suple entada y dietas que contienen el estándar comercial.

Tabla 4. Datos de Estudios de Alimentación de Pollos EJEMPLO 7 Termoestabilidad de la Enzima Xilanasa Producida en Diferentes Anfitriones La proteína xilanasa, BD6002 (también llamada XylAlA, SEQ ID NO: 14), fue expresada en los anfitriones Escherichia coli , Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, y Pseudomonas fluorescens. La enzima se obtuvo purificada y la actividad residual a 85 °C fue medida para determinar si había una diferencia en la termoestabilidad de la xilanasa debido a la expresión en diferentes anfitriones. Esos anfitriones difieren en la capacidad para glicosilar la proteína expresada.

Ensayo de Xilanasa Residual Este procedimiento de ensayo es específico para la actividad de endo-1, 4-beta-D-xilanasa. Tras la incubación de Azo-Arabinoxilano de Trigo con endo-xilanasa, el sustrato es despolimerizado por un endomecanismo para producir fragmentos secos de bajo peso molecular, los cuales permanecen en solución tras la adición de espíritus industriales metilados (IMS) o etanol al 95% en la mezcla de reacción. El material de alto peso molecular es removido por centrifugación, y es medido el color del sobrenadante . La endo-xilanasa en la solución de ensayo es determinada con referencia a una Curva Estándar. Cada enzima tiene su propia Curva Estándar. La misma enzima producida en diferentes anfitriones tendrá diferentes Curvas Estándar. Soluciones A. Acido cítrico 0.1 M. Disolver 21.02 g de monohidrato de ácido cítrico (EM Sciences CX1725-1) en 900 mL de agua desmineralizada en un vaso de precipitados de vidrio con agitación. Al transferir la solución a un matraz volumétrico de ÍL y aforar a ÍL con agua desmineralizada. Esterilizar por filtración y almacenar a temperatura ambiente . B. fosfato de sodio 0.2 M, dibásico Disolver 53.6 g de heptahidrato dibásico de fosfato de sodio (Sigma S9390) en 900 mL de agua desmineralizada en un vaso de precipitados de vidrio con agitación. Transferir la solución a un matraz volumétrico de ÍL y aforar a ÍL con agua desmineralizada. Esterilizar por filtración y almacenar a temperatura ambiente . C. Amortiguador de citrato y fosfato 50 mM pH 5.4 (abreviado 50CPB54) Combinar 22.2 mL de ácido cítrico 0.1 M (§3.A) con 27.8 mL de fosfato de sodio 0.2M en un matraz volumétrico de 100 mL. Aforado a 100 mL con agua desmineralizada. D. arabinoxilano de trigo al 1% p/v en amortiguador de citrato y fosfato 50 mM, pH 5.4 Agregar "90 ml de amortiguador 50CPB54 en un vaso de precipitado de 200 ml con barra agitadora. Cubrir el vaso de precipitados con una hoja delgada de aluminio. El vaso de precipitados y su contenido son colocados sobre un agitador de placa caliente y el agua es llevada hasta ebullición con agitación vigorosa. La hoja delgada de aluminio removida cuidadosamente, el sustrato pulverizado es agregado (1.000 g) , y la hoja delgada de aluminio es reemplazada. La solución se deja agitar durante 10 min mientras ebulle y se interrumpe el calentamiento. La solución es agitada hasta que ha sido enfriada a temperatura ambiente, sin que se observen grumos de sustrato. La solución es transferida a un matraz volumétrico de 100 ml con tapón. Se agrega azida de sodio (2% p/v, 1 mL) al matraz volumétrico. Los lados del vaso de precipitados son lavados dos veces con una pequeña cantidad (3-4 ml) de 50CPB54 para remover el sustrato residual . Los lavados son combinados con el contenido en el matraz volumétrico. El volumen es ajustado a 100 ml con 50CPB54 y es insertado el tapón. El matraz es agitado vigorosamente . Esta solución de sustrato deberá ser almacenada a 4°C entre usos. Bajo esas condiciones y excluyendo la contaminación, el sustrato es estable durante al menos varios meses .

Ensayo A. colocar tubos de vidrio de 16x100 mm en el portatubos de ensaye en baños de agua a 37°C. B. Agregar 500 uL de WAXY al 1% p/v a cada tubo y equilibrar a 37°C durante al menos 5 minutos. C. colocar 600 µL + muestra a una dilución apropiada en un tubo de Eppendorf de 1.5 mL y colocar en baño de agua a 37°C durante al menos 5 minutos. Típicamente, es deseable llegar a ~ 0. lU/mL después de la dilución para dar una señal dentro del intervalo lineal para este ensayo. D. Iniciar la reacción agregando 500 uL de muestra al sustrato en tubos de vidrio. Agitar vorticialmente de inmediato e iniciar el temporizador. E. Incubar exactamente durante 10 minutos a 37°C. F. Agregar 2.5 mL de etanol al 95% con pipeteo repetido y agitar vorticialmente de inmediato . Transferir el tubo a un portatubos de ensayo a temperatura ambiente . G. Dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente y entonces agitar vorticialmente de nuevo. H. Centrifugar 10 minutos a 1000 g, 22 °C en tubo de Eppendorf 5810R con aceleración y frenado a velocidad máxima. I . Remover el sobrenadante a cubetas de poliestireno de 1.5 mL. J. Medir la absorbancia as 590 nm. Los resultados de los ensayos de la actividad residual de la xilanasa BD6002 se exponen en la Tabla 5. Los resultados muestran que la xilanasa BD6002 expresada en Pichia pastoris tuvo la mayor cantidad de actividad residual después de 30 minutos a 85 °C. Se espera que la diferencia en la termotolerancia se debiera a la diferencia en la glicosilación de la proteína expresada en diferentes organismos anfitriones. Se sabe que los anfitriones procarióticos, como las cepas de E. coli y Pseudomonas no glicosilan proteínas.

Tabla 5. Actividad Residual a 85°C de BD6002 Producida en Diferentes Anfitriones EJEMPLO 8 Efectos de la adición de la enzima xilanasa sobre la producción acumulativa de gas en fluido Ruminal Este ejemplo ilustra la diferencia de enzimas xilanasas adicionales agregadas a forraje para rumiantes medida como la diferencia en la producción de gas cuando se incubó con fluido ruminal. El objetivo de este experimento es evaluar el efecto de la suplementación con xilanasa sobre la degradación ruminal con heno de alfalfa. Sobre la base de los resultados de la actividad de la endoglucanasa y las recomendaciones del fabricante, se eligieron 2 y 3 niveles de dosis para las enzimas. Por otro lado, se aplicaron cuatro productos comerciales a razón de 1.0 mg/g de heno de alfalfa con DM. Se trituró un gramo de DM de heno de alfalfa durante 10 seg usando un molino de muestras Knifetec 1095 (Foss Tecator, Hóganás, Suecia) y se pesó en botellas de fermentación (capacidad de 125 ml) . Todas las enzimas fueron resuspendidas agregando 10 ml de H20, y se agregó el volumen apropiado de cada enzima a las botellas correspondientes en seis réplicas.

Las enzimas fueron aplicadas 20 h antes de la inoculación con fluido ruminal. Tres horas después, se agregaron 40 ml de medio amortiguador anaeróbico, preparado de acuerdo a lo expuesto por Goering y Van Soest (1970) y se ajustó a pH 6.0 usando ácido trans-aconítico 1M (Sigma Chemicals) , y las botellas se almacenaron a 20°C durante la noche. El fluido ruminal fue obtenido 4 h antes de la alimentación (1100 h) de una vaca lechera lactante alimentada con una dieta TMR compuesta de silage de cebada, heno de alfalfa cortada, granos de maíz laminados, y concentrado para la lactación inicial . El fluido ruminal colado fue transportado al laboratorio en recipientes precalentados, sellados y almacenados a 39°C en un baño de agua. El inoculo fue distribuido (10 ml por botella) en botellas de cultivo que habían sido calentadas a 39°C en un incubador y lavadas con C02 libre de oxígeno . Las botellas fueron entonces selladas con un tapón de caucho de butilo de 14 mm más una tapa ondulada de aluminio inmediatamente después de cargar y se incubó durante 18 h. También se incubaron controles negativos (fluido ruminal más amortiguador solo y fluido ruminal más amortiguador y producto enzimático) . Esos controles fueron usados para corregir la liberación de gas y los residuos de fermentación resultantes directamente del inoculo. Esos tratamientos y controles fueron incluidos en seis réplicas. El gas de la parte superior producido por la fermentación del sustrato fue medido a las 2, 6, y 18 h después de la inoculación insertando una aguja calibre 23 (0.6 mm) unida a un transductor de presión (tipo T443A, Bailey and Mackey, Birmingham, RU) conectado a un dispositivo de representación visual (Data Track, Christchurch, RU) . El transductor fue entonces removido dejando la aguja en su lugar para permitir la ventilación. Los valores de presión, corregidos por la cantidad de OM del sustrato incubada y para la liberación de gas de controles negativos, fueron usados para generar estimaciones de volumen usando la ecuación cuadrática (volumen de gas = 0.18 + 3.697 x presión de gas + 0.0824 x presión de gas2) reportada por Mauricio et al. Anim. Feed Sci. Technol. 79:321-330 (1999). Tras la remoción, las botellas fueron colocadas en el refrigerador a 4°C para detener la fermentación, y se filtró a través de un papel filtro de café comercial con aplicación de vacío. La degradación de DM aparente (DMD) fue determinada secando los residuos a 100°C durante 24 h y la degradación de OM (OMD) fue determinada por la diferencia después de obtener las cenizas y el residuo seco a 500°C durante la noche. Los resultados de los ensayos se exponen a continuación en las Tablas 6 y 7. Esos resultados demuestran que las xilanasas difieren en su reactividad en fluido ruminal .

Tabla 6. Efectos de la adición de enzima xilanasa sobre la producción acumulativa de gas (mL/g OM) sobre heno de alfalfa durante 18 h de incubación con fluido ruminal. 1 Categoría relativa de acuerdo a la producción acumulativa de gas medida a las 18 h de la incubación. a' b' c Diferente del control dentro de las columnas a P < 0 . 001 , P < 0 . 01 , y P < 0 . 05 , respectivamente .

Tabla 7 . Efectos de la adición de enzima xilanasa sobre la capacidad de degradación aparente de DM (DMD) , OM (OMD) , y factor de partición de la fermentación (PF) sobre heno de alfalfa 18 h después de la incubación con fluido ruminal .

Tratamiento Actividad DMD, Categoría2 OMD, % Categoría2 PF3 Categoría2 agregada % de xilanasa1 Control - 41.1 14 39.3 14 2.36 4 BD2230 874 44.2b 5 42.5a 5 2.24 10 BD2236 666 45.9a 3 44.3a 3 2.22 11 BD2248 755 43.7b 6 42.3a 6 2.36 4 BD6002 1695 42.1 10 40.6 10 2.22 11 BD6004 787 43.4° 7 41.2- 9 2.19c 13 BD6405 582 40.8 15 38.9 15 2.12b 14 BD6407 543 41.5 12 39.8 12 2.33 6 BD6890 1050 47.5a 1 45.7a 1 2.99a 1 BD7150 988 41.7 11 39.8 12 2.38 3 BD7182 596 41.5 12 40.1 11 2.31 8 A 54.5 42.3 9 41.5C 7 2.32 7 B - 43.4C 7 41.5C 7 2.10a 15 C 213 44.6a 4 42.9a 4 2.27 9 D 15.1 46.3a 2 44.4a 2 2.41 2 DEM 0.6 0.5 0.04 1 La actividad de la xilanasa fue expresada como nanomoles de glucosa liberados por minuto. 2 Categoría relativa de acuerdo a DMD, OMD, y FE. 3 Factor de partición = mg de OM degradados/mL de gas producido. a,b,c Diferen e del control dentro de las columnas a P < 0.001, P < 0.01, y P < 0.05, respectivamente.

EJEMPLO 9. Caracterización de la enzima Purificación del material del artículo de prueba (TAM) (sin separación de los isoformos) . Preparación de la columna de afinidad de xilanasa: Se resuspendió xilanasa liofilizada, aproximadamente 10 mg de BD6002 producida Pichi pastoris (rXylPP6002, lote XvI-BD6002-PB206) en 1.25 L de agua destilada y se llevó a 5 mis con NaHC03 0.1 M, pH 8.3. Esta solución fue dializada contra 4 1 de NaHC03 0.1 M durante 5.5 h a 4°C y entonces se agregó a affigel-10 lavado con agua destilada (Bio-Rad) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se vertió affigel-10 acoplado a xilanasa en una columna de 2 ml . Antisuero de cabra: Los anticuerpos para la xilanasa fueron generados a partir de proteína xilanasa purificada BD7346 y preparados en cabras (American Alpine) . La cabra fue inyectada con 500 µg de xilanasa en adyuvante de Freund completo, se dejó reposar durante 3 semanas y entonces se inyectó con 500 µg de xilanasa en adyuvante de Freund incompleto. Las cabras fueron sangradas a los 10 días después de cada inyección.

Purificación por inmunoafinidad en los anticuerpos de xilanasa La columna de afinidad de xilanasa fue preeluida con 1 mL de glicina-HCl 0.1 M pH 2.5 seguida por equilibrio en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.3 (PBS). Se aplicaron 5 mis de suero anti-xilanasa de cabra a la columna por gravedad la columna fue entonces lavada con PBS hasta que se alcanzó un valor basal. Los anticuerpos de xilanasa unidos fueron eluídos usando 1 mL de glicina-HCl 0.1 M pH 2.5, seguida por PBS . Se recolectaron fracciones de dos ml . Se registró la absorbancia a 280 nm por cada fracción. Los anticuerpos recuperados fueron dializados contra NaHC03 0.1M pH 8.3.

Preparación de la columna de afinidad de anti- xilanasa de cabra Se agregó antixilanasa de cabra (-13 mg) a affigel- 10 lavado con agua (Bio-Rad) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El affigel-10 acoplado al anticuerpo de xilanasa fue vertido a una columna de 2 ml .

Purifación por inmunoafinidad de la xilanasa La columna de afinidad de anticuerpo de xilanasa - fue preeluída con un ml de glicina-HCl 0.1M pH 2.5 seguida por equilibrio en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.3 (PBS) . Se suspendió un gramo de xilanasa de Pichia liofilizada (XYL-PP6002-PD064) en 5 ml de dH20 más 5 mis de PBS y se mezcló durante 30 min a 4°C. Toda la suspensión fue aplicada a la columna por gravedad y la solución no unida fue recolectada (flujo pasante) . La columna fue entonces lavada con PBS hasta que se alcanzó un valor basal . La xilanasa unida fue eludía usando un ml de glicina-HCl 0.1M, pH 2.5 seguida por PBS . Se colectaron fracciones de dos ml . Se registró la absorbancia a 280 mm para cada fracción. Las fracciones que contenían proteína (A280 > 0.09) fueron reunidas. El flujo pasante se hizo repetir varias veces sobre la columna hasta que no se recuperó más xilanasa.

EJEMPLO 10. Concentración de proteina de la enzima purificada Se usaron dos métodos diferentes para medir la concentración de la xilanasa de Pichia purificada (XYL-PP6002-PD064) . Primero se usó un ensayo de proteína BCA (Pierce Chemicals) , con albúmina de suero bovino (BSA) como una proteína de referencia. Dos condiciones diferentes (37 °C, 30 minutos, a temperatura ambiente durante 2 horas) dan resultados muy similares. Se estimó que la concentración de proteína era de 0.403 mg/ml (véanse más adelante las Tablas 8 y 9) .

Tabla 8 37°C, 30 minutos Tabla 9 Temperatura ambiente, 2 horas El segundo método consiste de medir la intensidad en pixeles del ensayo de proteina en SDS-PAGE y teñida con el tinte específico para la proteína anaranjado SYPRO (Invitrogen) . Puesto que la xilanasa producida por Pi chi a contiene isoformos múltiples además de la proteína nativa de 20 kD, todas las bandas fueron seleccionadas para la cuantificación de los pixeles. La concentración de la enzima se comparó con la anhidrasa carbónica estándar que migra a aproximadamente 33 kDa. La concentración en la muestra de xilanasa purificada es de aproximadamente 0.125 mg/mL.

Tabla 10 Xilanasa PD064 de PP6002 Todas las Intensidad Ajustado Promedio Concentración bandas de pixeles Carril (media) seleccionado 1 136.7 18.7 20.55 125 microgramos / L 2 140.4 22.4 fondo 118 EJEMPLO 11. Actividad Específica de la Enzima Purificada La muestra purificada de anticuerpo fue ensayada por su actividad específica sobre arabinoxilano de trigo. Se diluyó una alícuota hasta aproximadamente 1000 veces y se ensayó con el protocolo de DNS . El protocolo describe un método para medir los extremos reductores producidos mediante la hidrólisis de carbohidratos, especialmente xilanos y glucanos. El ensayo se basó en la reacción de los extremos reductores con ácido dinitrosalicílico (DNS) . El ensayo con DNS tiene varias ventajas sobre otros ensayos con azúcares reductores, como el de Somogyi-Nelson, incluyendo un límite de detección más bajo, un tiempo de análisis relativamente más rápido, y el uso de reactivos menos tóxicos (es decir, el arseniato de sodio usado en el protocolo de Somogyi-Nelson) . El método presentado aquí se basa en un protocolo de Miller G.L. (1959) Anal. Chem. 31 426-428.

Reactivos Usar agua de 18 mO para la preparación de todos los reactivos y soluciones de prueba. Hidróxido de sodio 0.4 M. Disolver 16.0 g de hidróxido de sodio anhidro (Fisher S318) en 900 mL de agua con agitación en un vaso de precipitados de 1 L.

Transferir a un matraz volumétrico de 1 L, y ajustar el volumen a 1 L con agua. Etiquetar y almacenar a 4°C durante más de 90 días.

Reactivo de DNS. Disolver 5.0 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico (Sigma D0550) y 150 g de tetrahidrato de tartrato de sodio y potasio (Fisher S387) en 900 ml de Hidróxido de Sodio 0.4 M. Transferir a un matraz volumétrico de 1 L y ajustar el volumen a 1 L con hidróxido de sodio 0.4 M. Filtrar a través de un filtro de 0.2 µm. Almacenar a temperatura ambiente. Nota: este reactivo es de un color amari11o-anaranj ado .

Amortiguador de Acetato de Sodio a 200 mM, pH 5.30 (2x SAB) . Disolver 27.2 g de trihidrato de acetato de sodio (Fisher S209-3) en 900 mL de agua con agitación en un vaso de precipitados de 1 L. Ajustar el pH a 5.30 _+ 0.05 con ácido acético glacial (Fisher A38) y transferir a un matraz volumétrico de 1 L. Agregar 20 ml de azida de sodio al 2% p/v en agua y ajustar el volumen a 1 L. Filtrar a través de un filtro de 0.2 µm. Marcar y almacenar a 4°C. La solución es estable durante varios meses .

Azida de Sodio al 2% p/v en agua. Disolver 2.00 g de azida de sodio (Sigma S8032) en 90 mL de agua en un vaso de precipitados de vidrio con agitación. Transferir a un matraz volumétrico de 100 ml . Lavar el vaso de precipitados con agua y combinar en un matraz volumétrico. Llevar a un volumen de 100 ml con agua .

Amortiguador de Acetato de Sodio 100 mM, pH 5.30 (lx SAB) . Agregar 500 mL de 2x SAB a un matraz volumétrico de 1 L. Ajustar el volumen a 1 L con agua. Marcar y almacenar a 4°C. La solución es estable durante varios meses.

Solución de Sustrato: arabinoxilano de trigo al 1.40% p/v en un lx SAB. Pesar exactamente 1.40 g de arabinoxilano de trigo (Megazyme P-WAXYM) en un vaso de precipitados pyrex seco de 120 ml . Mojar la muestra con 8 mL de etanol al 95%. Agregar una barra agitadora magnética seguida por 50 mL de 2x SAB y 30 mL de agua. Cubrir y colocar inmediatamente la suspensión sobre una placa agitadora magnética con agitación vigorosa durante la noche hasta disolver. Transferir a un matraz volumétrico de 100 mL . Lavar el vaso de precipitados con - 10 mL de agua y combinar con el contenido del matraz volumétrico. Ajustar el volumen a 100 mL con agua. Marcar y almacenar a 4°C. La solución es estable durante varios meses.

Solución Patrón Concentrada de Xilosa, 10.0 mg/mL de D(+) xilosa en lx SAB Disolver 250.0 mg de D(+) xilosa (Sigma X1500) en 20 mL de lx SAB en un vaso precipitados de vidrio de 50 ml con agitación. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 25 mL. Lavar el vaso de precipitados con 4 ml de lx SAB y combinar en el matraz volumétrico. Ajustar el volumen a 25 mL con lx SAB.

Solución Patrón de Trabajo de Xilosa, 1.00 mg/mL D(+) xilosa en lx SAB Agregar 10.0 mL de Solución Patrón Concentrada de Xilosa a un matraz volumétrico de 100 mL. Agregar lx SAB hasta 100 ml .

Estándares de Xilosa Usar la siguiente tabla para preparar las diluciones apropiadas de los Estándares de Xilosa en conos de 15 mL donde la solución A = solución patrón de trabajo de xilosa y la solución B = Ix SAB. Deberá ser usado un pipeteador de desplazamiento positivo para transferir las soluciones A y B. Los estándares de xilosa deberán ser almacenados a 4°C entre usos.

Tabla 11 Xilosa Volumen de Volumen de Volumen A B total (µmol) (µL) (µL) (µL) 0 0 500 500 0.20 75 425 500 0.40 150 350 500 0.60 225 275 500 0.80 300 200 500 1.00 375 125 500 1.20 450 50 500 1.33 500 0 500 Pueden ser preparadas alícuotas más grandes de Estándares de Xilosa y almacenadas a 4°C durante hasta 90 días .

Preparación de la Muestra Para aquellos novatos con el ensayo con DNS para la Medición de la Actividad de la Xilanasa, se preparó un solo frasco de control de xilanasa como se describe más adelante.

Para el estudio cruzado entre laboratorios, se prepararon cinco frascos de xilanasa control como se describe más adelante. Nota: Únicamente deberá ser usado material de vidrio para preparar las soluciones de xilanasa puesto que el material de plástico ha mostrado unirse a la xilanasa y hacer disminuir la actividad.

Xilansa Control (incluyendo para el estudio cruzado) Registrar el peso del sólido contenido en el frasco (de la etiqueta) . Agregar 10.0 g +• 0.100 g de agua a un frasco de la xilanasa control (lote XYL-PP6002-PD014R) y registrar el peso. Cada frasco de Xilanasa Control contiene 100 mg + 1.0 mg de sólido. Agitar vorticialmente de manera suave hasta disolver completamente.

Solución de Trabajo de Xilanasa Control Puesto que se encontraron tasas de dilución muy altas en este ensayo, los detalles para la preparación de la muestra son muy importantes . Todas las diluciones se hicieron usando lx SAB Para la determinación de la actividad específica, hacer diluciones por cada frasco de Xilanasa Control como se describe a continuación. Para la dilución inicial, pesar - 0.100 g de xilanasa control en un tubo de vidrio de 16 x 100 mm y se registra el peso. Agregar - 10 ml de lx SAB y registrar el peso, generando una dilución 1:100 (véase la tabla de dilución más adelante) .

La segunda dilución en serie se hace pesando ~ 100 g de la dilución 1:100 en un tubo de vidrio de 16x 100 mm y se registra el peso. Agregar ~ 10 ml de IX SAB y registrar el peso, generando una dilución 1:10,000 (véase la tabla de dilución más adelante) .

Tabla 12.

Preparación de muestras de xilanasa liquidas Las muestras de xilanasa líquidas son usadas sin modificación como una solución patrón para preparar la solución de xilanasa de trabajo como se describe más adelante.

Preparación de las muestras de xilanasa sólidas (por ejemplo, secadas por congelamiento) Agregar 1.00 mL de agua a 100 mg de muestra de xilanasa sólida. Agitar vorticialmente de manera suave hasta disolver completamente.

Solución de Xilanasa de Trabajo para muestras de Xilanasa líquidas o sólidas. Debido a que se esperan niveles de expresión variables en muestras no estándar, la tasa de dilución apropiada puede variar entre muestras. Preparar la dilución inicial (1:100) como se describió anteriormente para la solución de xilanasa de control de trabajo. Si se desea la dilución es de entre 1:100 y 1:10000, entonces preparar una dilución de trabajo final y registrar los pesos de la muestra y el Ix SAB para la dilución. Si se desea la dilución es mayor de 1:10000, entonces se prepara primero una dilución 1:10000 como se describió anteriormente para la solución de xilanasa de trabajo. Entonces, se prepara una dilución de trabajo final pesando como anteriormente para la xilanasa control .

Vista general del procedimiento de determinación de la actividad especifica. Para la determinación exacta de la actividad específica usando el ensayo con DMS para la medición de la actividad de la xilanasa, se requiere que cada solución de xilanasa de trabajo sea aprobada por triplicado. Para este protocolo de ensayo, los datos son tomados a los 0 y 15 minutos. Nótese que únicamente una sola réplica al tiempo 0 puede ser suficiente cuando se hagan muchas muestras . En este caso, se generaron cuatro puntos de datos para cada solución de xilanasa de trabajo. También, se recomienda que sean incluidos estándares de xilosa al menos por duplicado.

Nota: También se consideró el estándar de 0 µg/mL de xilosa como el blanco de reactivo, es decir, que esta muestra representa el fondo producido por la solución de sustrato sola. La siguiente tabla pretende mostrar como se derivaron las reacciones de las muestras, estándares y control: Tabla 13 Calibración del pipeteador Medir y registrar la masa de cinco alícuotas de 0.2 mL de lx SAB proporcionado a un vaso de precipitados parado en una balanza analítica usando un P-1000. La hoja de cálculo calcula la masa promedio de una alícuota de 0.2 mL de IX SAB. Usar este pipeteador P-1000 calibrado para conducir el protocolo.

Procedimiento de Determinación de la Actividad Especifica • Distribuir alícuotas de 500 µL de solución de sustrato en tubos de vidrio de 13 x 100 mm usando un distribuidor de desplazamiento positivo con una punta de un pipeteador de repetición de 5 ml.

Recordar: cada enzima es probada con tres replicas por cada punto en el tiempo (0 y 15 minutos; por lo tanto, se requieren 6 alícuotas de sustrato por cada solución de xilanasa de trabajo) . • Colocar los tubos que contienen la solución de sustrato en baño de agua a 37°C durante al menos 5 minutos. • Tomar alícuotas de 5 mL de cada solución de xilanasa de trabajo para ser probadas en un tubo de vidrio de 16 x 100 mm y equilibrar en un baño de agua a 37°C durante al menos 5 minutos. • Tomar alícuotas de 500 µL de cada estándar de xilosa en tubos de Eppendorf en 1.5 mL y equilibrar en un baño de agua a 37°C durante al menos 5 minutos. • Para las muestras del punto del tiempo 0, agregar 700 µL del reactivo de DNS a esos tubos usando un pipeteador de desplazamiento positivo con una punta de 5 mL. • Iniciar la reacción agregando 200 µL de solución de xilanasa de trabajo a una alícuota de solución de sustrato con una punta de pipeteador de repetición de 5 mL: Mezclar la solución agitando vorticialmente y regresar al baño de agua a 37°C. • Después del- inicio de todas las reacciones enzimáticas, agregar 200 µL de estándares de xilosa a tubos marcados apropiadamente que contengan solución de sustrato. • A los 15 minutos, agregar 700 µL de reactivo de DNS a los tubos marcados apropiadamente, usando un pipeteador de desplazamiento positivo con una punta de 5 µL y remover el baño de agua. Agitar vorticialmente o de manera vigorosa. • Después de terminar todas las reacciones enzimáticas, agregar 700 µL de reactivo de DNS a cada alícuota de estándar de xilosa en solución de sustrato y remover las muestras del baño y agitar vorticialmente de manera vigorosa . • Colocar los tubos en un baño de agua en ebullición vigorosa o en un baño de aceite exactamente durante 10 minutos. Nota : es esencial que el baño esté exactamente a 100 °C y que la incubación sea exactamente durante 10 minutos . • Remover los tubos del baño de agua en ebullición y colocar en un baño de agua a temperatura ambiente . Permitir enfriar a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos . • Transferir al menos 1 ml del contenido a cubetas de poliestireno de 1.5 mL y medir la absorbancia a 540 nm.

Cálculo de la Actividad Específica Introducir las absorbancias para los estándares y las muestras en las células apropiadas en la hoja de cálculo incluida. La hoja de cálculo genera automáticamente una curva estándar de xilosa traficando las lecturas de absorbancia (D?5 0) contra la concentración de xilosa (µmol/ensayo) . Esta curva estándar es usada entonces para convertir las absorbancias de la muestra en actividad específica usando la siguiente ecuación ordenada al origen de DF (DOs4nmuestra(7-DOfi4nBlanco de Reactivo') ordenada al origeiji la actividad = (t2-t?)'Vs * pendiente (DOfi4nmuestrat?-DOfi4nBlanco de Reactivo') pendiente » DF (DOfianmuestrare-DOfianmuestraH = (M?)Vs 1 pendiente [=] µmoles equivalentes de xilosa/min/g de la enzima original [=] Unidades/g de muestra de enzima no diluida original donde DF= factor de dilución (calculado para la Primera, Segunda y Diluciones Adicionales) t2= segundo punto en el tiempo (por ejemplo, 15 minutos) ?= primer punto en el tiempo (por ejemplo, 0 minutos) Vs = peso de la muestra (por ejemplo 0.2 g) Los resultados de tres experimentos independientes conducidos durante tres diferentes días son reportados en la Tabla 14. La actividad para la PD064 de material TAm también se reportó para comparar las dos fracciones. Tabla 14.

La fórmula usada es : Actividad (Unidades/g) = (factor de dilución/tiempo x peso de la muestra) x (DOismin-DOomin/) pendiente La actividad promedio de la enzima purificada es de 259 unidades por gramo de solución de enzima y existe muy poca variación entre los experimentos . El lote no purificado mostró una actividad más de 10 veces mayor debido a que su concentración es mucho mayor (10 mg/mL contra 0.400 mg/mL en la muestra purificada de acuerdo a lo medido por el método BCA) . Cuando se corrige para la concentración de enzima, la actividad por gramos de material seco es ahora de 650 U por mg de sólido en la fracción purificada, contra 373 U de sólido en la muestra de TAM.

EJEMPLO 12. Condiciones de reacción óptimas Se midió la actividad de la Xilanasa Quantum sobre un intervalo amplio de valores de pH para determinar el pH óptimo, pero también si la enzima presenta actividad significativa bajo condiciones acidas de pH 2 a 3 que emiten las condiciones del tracto digestivo de un animal monogástrico . La Xilanasa Quantum® PP6002 de lote PD064 (10 mg/mL) fue diluida en 1:9187 y se sometió a un intervalo de condiciones de pH .de 1.5 a 9. Ambas condiciones de reacción del sustrato de arabinoxilano de trigo fueron preparadas en los componentes del amortiguador indicados a continuación en la Tabla 15. Tabla 15 El patrón de enzima (10 mg/mL) fue diluido en la solución amortiguadora de pH y agregado al sustrato también preparado en el mismo amortiguador. Todas las reacciones se condujeron a 37°C durante 15 min usando el protocolo de DNS: Se estableció una cubra de calibración para xilosa (en Acetato de Na 0.1 M, pH 5.3) con una pendiente de 0.8582, también corregida. ara una ordenada al origen con un valor de 0 (R2=0.9982). Los resultados son de dos experimentos y representan el promedio de 3 lecturas de absorbancia, corregidas a la absorbancia del t= 0 min (el DNSD se agregó justo antes de la reacción) . Entonces se registró la actividad de la Xilanasa Quantum® como un porcentaje del valor correspondiente a la actividad máxima, observada aquí a pH=5.5. A pH mayor la actividad y se vuelve marginal a pH 9.0 (aproximadamente 5% de la actividad a pH 6.0) . Existe actividad residual a pH ácido, pero únicamente del 11% a pH = 3.0, y ninguna pH más bajo (1.5; 2; 2.5). Los resultados se dan en la Figura 5.

EJEMPLO 13. Tolerancia térmica Tolerancia térmica de la enzima por ELISA y actividad La actividad de la Xilanasa Quantum fue medida después del tratamiento térmico de 37 a 99°C con un incremento de cinco grados. Las soluciones de enzima de 10 mg/mL fueron preparadas en NaOAc 0.1 M, pH 5.3 y diluidas hasta 1:100. Muestras de 1 mL de enzima diluida 1:100 fueron calentadas, entonces diluidas adicionalmente a 1:10,000 y ensayadas por su actividad usando el protocolo de DNS. Se determinó una curva de calibración para xilosa. Los resultados se muestran en la Figura 6 como un porcentaje de la actividad a 37°C. Ellas son el promedio de dos experimentos efectuados en dos días diferentes. Los resultados se dan en la Figura 6. El PP6002 muestra una actividad del 100% hasta 55°C cuando comienza a disminuir. Entonces su actividad permanece por enzima del 80% hasta 65°C, cuando cae aún más hasta aproximadamente 45% a 80°. Por encima de esa temperatura la actividad permanece en el mismo nivel. Esto indica claramente que el PP6002 muestra una alta especificidad aún a temperaturas más altas .

Comparación de la tolerancia al calor de la proteína pura con otras xilanasas por actividad La actividad de la xilanasa Quantum fue comparada con la actividad de Thermomyces lanuginosus (Megazyme®) producida por E. coli BD6002. Se prepararon soluciones de enzima de 10 mg/mL en NaOAc 0.1 M pH 5.3 y se diluyeron a varios niveles, de modo que las mediciones de absorbancia estuvieran en un intervalo similar a la temperatura de control de 37°C.

Las temperaturas ensayadas estuvieron en el intervalo de 37°C a 95°C. Se determinó una curva de calibración para xilosa. Los resultados se muestran en la Figura 7 como un porcentaje de la actividad a 37°C. Como se observó anteriormente, PP6002 muestra alguna actividad específica fuerte aún a alta temperatura, y muestra una actividad de más del 40% a 95°C. La BD6002 de E. coli mostró una actividad del 100% hasta 55°C. Por encima de esa temperatura cae abruptamente hasta que no es detectada actividad en o por encima de 75°C. Una enzima comercial.de Trichoderma Longibrachiatum (Megazyme Internacional) tampoco muestra termotolerancia. Su actividad cayó abruptamente por encima de 55°C, hasta no tener actividad por encima de 65°C. Esos resultados demuestran la propiedad termotolerante de la Xilanasa Quantum (5), cuando se produjo en Pichia pastoris, y una posibilidad de que esté relacionada con sus isoformos, algunos son modificaciones de glicosilación. Véase la Figura 7 para los resultados . Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a modalidades específicas de la misma, se apreciará que son posibles numerosas variaciones, modificaciones y modalidades adicionales, y en consecuencia, todas esas variaciones, modificaciones y modalidades son consideradas dentro del alcance de la presente invención.

Las numerosas patentes, solicitudes y referencias discutidas o citadas dentro de esta especificación, se incorporan todas como referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad ' lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque tiene la secuencia de las SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7. 2. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 3.. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además un sitio de escisión proteolítica. 4. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el sitio de escisión proteolítica es un sitio de escisión de proteasa KEX2. 5. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es codificado por la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NOS: 9, 10, 11 ó 12. 6. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además una secuencia nucleotídica aislada que codifica para un péptido señal de secreción. 7. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende al menos una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, ligado operativamente a un promotor. 8. Un vector, caracterizado porque comprende al menos un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 2. 9. El vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende el plásmido designado como PBCS12771 (SEQ ID NO: 33), pBCS12772 (SERQ ID NO:34) o pSYN12773 (SEQ ID NO: 35) . 10. Una célula anfitriona recombinante, caracterizada porque comprende al menos una molécula de ácido recombinante de conformidad con la reivindicación 1. 11. La célula anfitriona recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la célula anfitriona es una célula de bacteria, levadura u hongo . 12. La célula anfitriona recombinante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula de bacteria, levadura u hongo es una célula de Kluyveromyces , saccharomyces , Shizosaccharomyces , Trichosporon, Schwanniomyces , Pichia, Hansuela, Eschericia, Psudomonas, Lactobacillus , Bacillus, Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillium. 13. La célula anfitriona recombinante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula anfitriona es Pichia pastoris. 14. La célula anfitriona recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 9. 15. Un método para preparar una xilanasa termotolerante, caracterizado porque comprende los pasos de: a) expresar en una célula anfitriona microbiana un cásete de expresión que comprende un promotor ligado operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica para una xilanasa la cual retiene una actividad de al menos el 40% después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica mayor de 400 U/mg a pH menor de pH 5.0 y mayor de pH 1.5. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la xilanasa retiene al menos 40% de la actividad después de 30 minutos a 70°C. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la xilanasa retiene al menos 40% de la actividad después de 30 minutos a 80°C. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la xilanasa retiene al menos 40% de la actividad después de 30 minutos a 85°C. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la xilanasa es una xilanasa termotolerante en ausencia de glicosilación. 20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la xilanasa es termotolerante cuando es glicosada por la célula anfitriona. 21. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además el paso de aislar la xilanasa termotolerante . 22. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula anfitriona es una célula de bacteria, levadura u hongo. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula anfitriona es una célula de Kluveromyces , Saccharomyces, Shizosaccharomyces , Trichosporon, Schwanniomyces , Pichia o Hansuela. 24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula anfitriona es Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha o Schizosaccharomyces pombe . 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula anfitriona es Pichia pastoris. 26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula anfitriona es Escherichia, Pseudomonas, Lactobacilus o Bacillus . 27. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula anfitriona es una célula de Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillíum. 28. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la xilanasa es codificada por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 29. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido de fusión que comprende a la xilanasa. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polipéptido de fusión comprende una secuencia señal de secreción que está ligada operativamente a la xilanasa. 31. Una xilanasa termotolerante aislada, caracterizada porque es preparada y aislada por el método de conformidad con la reivindicación 21. 32. La xilanasa de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la xilanasa está glicosilada. 33. Un aditivo enzimático para forrajes, caracterizado porque comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31. 34. Un método para preparar forraje para animales, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar una mezcla que comprende los componentes del forraje para animales y una preparación que comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31, y b) calentar la mezcla a una temperatura mayor de 75-90°C para producir una mezcla de forraje para animales tratada con calor. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la preparación que contiene xilanasa es una preparación líquida. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la preparación que contiene xilanasa es una preparación sólida. 37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la mezcla en a) comprende además al menos una vitamina, mineral u otra enzima diferente a la xilanasa termotolerante, un ácido orgánico, un producto probiótico, un aceite esencial o un coproducto del procesamiento de granos . 38. Una mezcla de forraje para animales tratada con calor, caracterizada porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 34. 39. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque comprende además el paso de extruir una mezcla tratada con calor a través de un molino de granulación para producir forraje para animales granulado. 40. Un forraje para animales granulado, caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 39. 41. El forraje para animales granulados de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la mezcla es acondicionada con vapor en un molino de granulación a aproximadamente 85°C, de modo que más del 70% de la actividad enzimática previa al tratamiento con calor se retenga, y el forraje extruído a través de una matriz de granulación. 42. El forraje para animales granulado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la mezcla es acondicionada con vapor en un molino de granulación a aproximadamente 85°C, de modo que más del 90% de la actividad enzimática previa al tratamiento con calor se retenga, y el forraje extruído a través de una matriz de granulación. 43. El forraje para animales granulado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la mezcla es acondicionada con vapor en un molino de granulación a aproximadamente 90°C, de modo que más del 80% de la actividad enzimática previa al tratamiento con calor se retenga, y el forraje extruído a través de una matriz de granulación. 44. Una composición de forraje para animales, caracterizada porque comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31. 45. El forraje de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el grano es trigo, centeno, tritical, arroz o maíz. 46. El forraje de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque se agregan una o más enzimas xilanasas al forraje usando una tasa de inclusión de entre aproximadamente 1 y 10,000 U/kg. 47. El forraje de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque se agregan una o más enzimas xilanasas al forraje usando una tasa de inclusión de entre aproximadamente 50 y 5,000 U/kg. 48. El forraje de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque se agregan una p más enzimas xilanasas al forraje usando una tasa de inclusión de entre aproximadamente 200 y 3,200 U/kg. 49. Un método para preparar una composición que contiene xilanasa termotolerante para una formulación de forraje, caracterizado porque comprende los pasos de: a) combinar una solución líquida que comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31 y harina de soya para producir una mezcla; y b) liofilizar la mezcla para producir una composición liofilizada que contiene xilanasa termotolerante. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque comprende además el paso de combinar la composición liofilizada con otros componentes de forraje para producir una mezcla adicional . 51. Una composición liofilizada, caracterizada porque es preparada por el método de conformidad con la reivindicación 50. 52. Un método para preparar una composición que contiene xilanasa para una formulación de forraje, caracterizado porque comprende los pasos de: a) combinar una solución líquida que comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31 y harina para producir una mezcla; b) y secar la mezcla para producir una composición seca. 53. Un método para hacer disminuir la relación de conversión del forraje e incrementar la ganancia de peso de un animal, caracterizado porque comprende los pasos de: alimentar a un animal con un forraje que comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31 en una cantidad efectiva para hacer disminuir la relación de conversión de forraje en el animal. 54. Un método para mejorar la energía metabolizable aparente del forraje para animales, caracterizado porque comprende el paso de formular el forraje para animales con una o más xilanasas termotólerantes de conformidad con la reivindicación 31 al forraje para animales en una cantidad efectiva para mejorar la energía metabolizable aparente del forraje. 55. Un método para mejorar el valor nutritivo de un forraje para animales o alimento para humanos, caracterizado porque comprende el paso de agregarla xilanasa' termotolerante de conformidad con la reivindicación 31 durante la preparación del forraje para animales o alimentos para humanos . 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porgue comprende además el paso de tratar la mezcla bajo las condiciones apropiadas de temperatura y humedad para facilitar la hidrólisis de xilano. 57. Un método para preparar forraje para animales, caracterizado porque comprende los pasos de a) proporcionar una mezcla que comprende uno o más componentes del forraje y una preparación que comprende la xilanasa termotolerante de conformidad con la reivindicación 31; y b) tratar la mezcla bajo condiciones apropiadas de temperatura y humedad para hidrolizar el xilano que está presente en la mezcla. 58. Un forraje para anímales, caracterizado porque se prepara por el método de conformidad con la reivindicación 57. 59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 57, caracterizado porque el forraje es forraje para aves de corral . 60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 57, caracterizado porque el forraje es forraje para cerdos . 61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 57, caracterizado porque el forraje es forraje para rumiantes.