MXPA05004224A - Polipeptidos de fusion de actriib, y sus usos. - Google Patents

Abstract

Se proveen metodos y composiciones para inhibir la actividad del factor 8 de crecimiento y diferenciacion in vivo e in vitro. Los metodos y las composiciones pueden ser usados para el diagnostico, prevencion y tratamiento de desordenes degenerativos de musculo, huesos u homeostasis de la glucosa.

Description

POLIPÉPTIDOS DE FUSIÓN DE ACTRIIB, Y SUS USOS.

Campo de la Invención El campo técnico se relaciona con inhibidores del factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF-8), incluyendo formas solubles de receptores de activina tipo II, y fragmentos de éstos, especialmente aquellos que inhiben la actividad del GDF-8 in vivo. El campo además se relaciona con métodos para el diagnóstico, prevención o tratamiento de desórdenes degenerativos de músculo o hueso, u homeóstasis de la glucosa Antecedentes de la Invención Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América con número de serie 60/421,041, presentada el 25 de octubre de 2002, la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. La familia del TGF-ß es un número de factores de crecimiento relacionados de manera estructural, la totalidad de los cuales poseen propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento que son fisiológicamente importantes (Kingsley et al, (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al, (1998) Curr. Topics Microbiol. ImmunoL, 228: 235-272). Estos factores incluyen proteínas morfogenéticas de hueso (BMP), activinas, inhibinas, sustancia de inhibición mulleriana, factor neurotrófico derivado de glial, y un todavía un creciente número de factores de crecimiento y diferenciación (GDF), tales como el GDF-8. Muchas de estas proteínas son altamente homologas. Por ejemplo, la BMP- 11 humana, también conocida como GDF- 11 es 90% idéntica al GDF-8 al nivel de aminoácidos (Gamer et al., (1999) Dev. Biol. 208, 222-232; http://www.ronmyrick.com Nakashima et al, (1999) Mech Dev., 80: 185-189). Se sabe que la mayoría de los miembros de familia del TGF-ß transducen sus señales a través de la formación de complejos heteroméricos de dos diferentes tipos de receptores de quinasa de serina/ treonina expresados en la superficie celular, esto es, receptores tipo I de aproximadamente 50-55 kDa. y receptores tipo II de más de 70 kDa. Los receptores tipo I no se unen a ligandos directamente; más bien ellos participan en la transducción de señal mediante asociación con los receptores tipo II, los cuales se unen a moléculas de ligando. El sistema de TGF-ß está altamente conservado a través del reino animal. (Para una revisión del sistema del TGF-ß, ver Massague (2000) Nature Rev. Mol. Cell Biol. 1 : 16-178; y Moustakas et al (200L> J. Cell Sci. 114:4359-4369). El receptor tipo II de activina ha sido descrito previamente en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,885,794. La activina fue purificada originalmente a partir de fluido folicular de ovario como una proteína que tiene un efecto estimulante en la producción de hormona estimulante del folículo en la glándula pituitaria. Cinco isoformas de receptor tipo II de activina han sido identificadas en células que responden a activina. Sobre la base de estudios in vitro, estos receptores pueden ser compartidos por miembros de la familia del TGF-ß (Attisano et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:1066-1073). La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que el receptor tipo II de la activina, denominado ActRIIB, puede unirse al factor 8 de crecimiento y diferenciación además de la activina. El GDF-8 está involucrado en la regulación de procesos biológicos críticos en el músculo esquelético y la osteogénesis. El GDF-8 es altamente expresado en el músculo esquelético en desarrollo y de adultos. Ratones transgénicos en los que se suprimió el GDF-8 se caracterizaron por una hiperplasia e hipertrofia marcadas del músculo esquelético (McPherron et al., (1997) Nature, 387: 83-90) y estructura ósea cortical alterada (Hamrick et al., (2000) Bone, 27: (3): 343-349. Son evidentes aumentos similares en la masa del músculo esquelético en mutaciones del GDF-8 que ocurren de manera natural en ganado (Ashmore et al., (1974) Growth, 38: 501-507: Swatland et al, (1994) J. Anim. Sci., 38: 752-757; McPherron et al, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 94: 12457-12461; y Kambadur et al, (1997) Genome Res., 7: 910-915). Estudios han indicado que la emaciación muscular asociada con infección por VIH está acompañada por un aumento en la expresión del GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al, (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 95: 14938-14943). El GDF-8 también ha sido implicado en la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, quinasa creatina) y la proliferación de células mioblasto (WO 00/43781). Además de sus propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas, el GDF-8 también puede estar involucrado en un gran número de otros procesos fisiológicos, incluyendo la homeostasis de la glucosa en el desarrollo de diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por traumas, tales como quemaduras o desbalance de nitrógeno, y desórdenes del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad) (Kim et al, (2001) BBRC, 281: 902-906). Un gran número de desórdenes en seres humano y animales están asociados con el tejido muscular funcionalmente dañado, por ejemplo, distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrópica (ALS), atrofia muscular, atrofia de órgano, debilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y síndromes de emaciación muscular causados por otras enfermedades y condiciones. Hasta la fecha, se han desarrollado muy pocas terapias efectivas o confiables para tratar estos desórdenes. Existe un gran número de condiciones asociadas con una pérdida de hueso, las cuales incluyen la osteoporosis y la osteoartritis, especialmente en mujeres de edad avanzada y/o posmenopáusicas. Además, los desórdenes y enfermedades óseas metabólicas incluyen baja masa ósea debido a terapia crónica de glucocorticoides, falla gonadal prematura, supresión de andrógeno, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nervosa. Las terapias que actualmente están disponibles para estas condiciones trabajan inhibiendo las reabsorción ósea. Sería una alternativa deseable para estas terapias una terapia que promueva la formación de hueso nuevo. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevas terapias que contribuyan a un aumento global de la masa muscular y/o la densidad ósea, especialmente en seres humanos. Es un objetivo de la presente invención el proveer métodos terapéuticos seguros y efectivos para desórdenes asociados con músculo y/o hueso. Es otro objeto de la invención el proveer métodos para aumentar la masa muscular y/o la densidad ósea en mamíferos. Es todavía otro objeto de la invención el proveer inhibidores del GDF-8 que sean seguros y efectivos in vivo. Todavía otro objetivo de la invención es el de proveer formas solubles de receptor tipo II de activina ActRIIB y/o fragmentos funcionales de éstas que sean estables in vivo y se unan a GDF-8 con alta especificidad y afinidad.

Objetivos adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción que continua, y en parte resultarán obvios a partir de la descripción, o pueden ser conocidos a partir de la puesta en práctica de la invención. Varios objetos, aspectos y ventajas de la invención serán susceptibles de realizar y obtener por medio de los elementos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones anexas.

Compendio de la Invención Se proveen aquí métodos para el tratamiento de desórdenes degenerativos de músculo y hueso. Los métodos también son útiles para aumentar la masa muscular y la densidad ósea en animales normales. También se proveen métodos para inhibir la actividad del GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa músculo esquelética y de la densidad ósea. Se proveen formas de ActRIIB solubles y estabilizadas, así como fragmentos de éstas que se unen a e inhiben el GDF-8 in vitro e in vivo. Las formas de ActRIIB solubles que se describen en la presente poseen propiedades farmacocinéticas que las hacen adecuadas como agentes terapéuticos. Otros aspectos proveen composiciones que contienen los polipéptidos de fusión de ActRIIB que actualmente se describen y sus usos en métodos de inhibición o neutralización de GDF-8, incluyendo métodos de tratamiento de los seres humanos o animales. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB descritos pueden ser usados para tratar o prevenir condiciones en las que es deseable un aumento en el tejido muscular o la densidad ósea. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de ActRIIB también pueden ser utilizados en terapias para reparar músculo dañado, por ejemplo, miocardio, diafragma, etc. Las enfermedades y desórdenes ejemplares incluyen desórdenes musculares y neuromusculares tales como la distrofia muscular (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrópica, atrofia muscular, atrofia de órgano, debilidad, síndrome del túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y otros síndromes de emaciación muscular; desórdenes del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), diabetes tipo 2; tolerancia dañada a la glucosa; síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X); resistencia a la insulina inducida por traumas, tales como quemaduras o desbalance de nitrógeno; y desórdenes degenerativos óseos tales como osteoartritis y osteoporosis.

Las formas de ActRIIB modificadas utilizadas en los métodos de la invención son polipéptidos de fusión de ActRIIB que comprenden (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la región constante de un anticuerpo. En ciertas modalidades, la primera secuencia de aminoácidos comprende la totalidad o parte de un dominio extracelular de ActRIIB humano, o es una mutación de dicha secuencia. La segunda secuencia puede ser derivada de la porción Fe de un anticuerpo, o es una mutación de tal secuencia. En modalidades adicionales, la segunda secuencia está ligada a la terminación C o a la terminación N de la primera secuencia de aminoácidos, con o sin estar ligada por una secuencia ligadora. También se proveen métodos terapéuticos para el tratamiento de desórdenes degenerativos de músculo y/o hueso. Las enfermedades y desórdenes ejemplares incluyen desórdenes musculares y neuromusculares (tales como la distrofia muscular), atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia, caquexia, desórdenes del tejido adiposo tales como la obesidad, diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por traumas (por ejemplo, quemaduras), y desórdenes degenerativos óseos tales como la osteoporosis. Además, los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente pueden ser utilizados como herramientas de diagnóstico para detectar cualitativa y cualtitativamente el GDF-8 o sus fragmentos en una muestra biológica. La presencia o cantidad de GDF-8 detectado puede ser correlacionada con una o más de las condiciones médicas que se han presentado en la lista anteriormente referida. También se provee un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido de fusión de ActRIIB utilizado en los métodos de la invención. Además se proveen vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico, células hospederas que comprenden dichos vectores de expresión, y métodos para la producción del ácido nucleico. Todavía otro aspecto provee un método para la identificación de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de desórdenes de músculo y hueso.

Se comprenderá que tanto la descripción general precedente como la descripción detallada que sigue son ejemplares y explicativas solamente y no son restrictivas de la invención, según se reivindica.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la unión de GDF-8 biotinado y BMP-11 a ActRIEB-Fc. La Figura 2 muestra los resultados de pruebas de gene reportero en las que se ha probado ActRIIB-Fc. La Figura 3 muestra resultados de un estudio farmacocinético en los que ratones C57B6/SCID utilizan un sola administración intravenosa (IV) o intraperitoneal (IP) de ActRIIB-Fc.

Breve Descripción de las Secuencias La siguiente tabla se provee como una referencia para las secuencias referidas esta descripción.

*AA = Aminoácidos Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas de la Invención I. Definiciones El término "ActRIIB" se refiere a cualquier isoforma de receptor tipo II de activina o un fragmento de ésta que es capaz de unirse de manera específica a GDF-8. El término no está limitado a cualquier especie de origen particular, método de producción, y otras características del ActRIIB. El término incluye ActRIIB producido de manera recombinante o sus fragmentos, y particularmente, el dominio de unión del GDF-8 de ActRIIB humano. El término también abarca variantes alélicas y de empalme de ActRIIB, sus homólogos, y ortólogos y secuencias de éstos que contienen mutaciones introducidas (sustituciones, adiciones, o deleciones), por ejemplo, aquellas introducidas mediante técnicas recombinantes. El término "desorden degenerativo de músculo, hueso u homeostasis de la glucosa" se refiere a un gran número de desórdenes y enfermedades asociadas con el GDF-8 y/u otros miembros de la súper familia del TGF-ß, por ejemplo, la BMP-11. Ejemplos de tales desórdenes incluyen, pero no se limitan a, desórdenes y enfermedades metabólicas tales como la diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), y resistencia a la insulina inducida por trauma (por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrógeno); desórdenes del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad); desórdenes musculares y neuromusculares tales como la distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrópica (ALS); atrofia muscular; atrofia de órgano; debilidad; síndrome de túnel carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva; y sarcopenia, caquexia y otros síndromes de emaciación muscular. Otros ejemplos incluyen a la osteoporosis, especialmente en mujeres de edad avanzada y/o posmenopáusicas; osteoporosis inducida por glucocorticoides; osteopenia; osteoartritis, y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Todavía otros ejemplos incluyen a la pérdida de masa debida a terapia crónica de glucocorticoides, falla gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nervosa. El término "cantidad efectiva" se refiere a aquella cantidad del compuesto que resulta en el mejoramiento de los síntomas en un paciente o un resultado biológico deseado (por ejemplo, aumento de la masa músculo esquelética y/o la densidad ósea). Tal cantidad debe ser suficiente para reducir la actividad del GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa del músculo esquelético y la densidad ósea. La cantidad efectiva puede ser determinada como se describe en las secciones siguientes. El término "dominio de unión de GDF-8," cuando se utiliza en relación con ActRIIB, se refiere al dominio extracelular de ActRIIB o una parte de éste necesaria para unirse a GDF-8, esto es, una parte del dominio extracelular de ActRIIB responsable de la unión específica al GDF-8. El término "súper familia de TGF-ß" se refiere a una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados. Esta familia de factores de crecimiento relacionados se conoce bien en la técnica (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-46; y Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-72). La súper familia de TGF-ß incluye Proteínas Morfogenéticas de Hueso (BMP), activinas, inhibinas, sustancia de inhibición mulleríana, factor neurotrófico derivado de glial, y un todavía un creciente número de factores de crecimiento y diferenciación (GDF), tales como GDF-8 (miostatin). Muchas de estas proteínas están estructural y/o funcionalmente relacionadas con el GDF-8. Por ejemplo, la BMP-11, también conocida como GDF- 11 es 90% idéntica al GDF-8 al nivel de aminoácidos (Gamer et al, (1999) Dev. Biol. 208, 222-232; Nakashima et al., (1999) Mech Dev., 80: 185-189). El término "GDF-8" se refiere a un factor 8 de crecimiento y diferenciación, específico, y, en donde sea apropiado, deberá comprenderse que incluye cualquier factor que esté estructural o funcionalmente relacionados con el GDF-8, tal como la BMP-11 y otros factores que pertenecen a la súper familia del TGF-ß. El término se refiere a la forma precursora de GDF-8 de longitud completa y no procesada, así como también a los polipéptidos maduro y de propéptido que resultan de la separación pos-traduccional. El término también se refiere a cualesquiera fragmentos y variantes de GDF-8 que mantengan cuando menos algunas actividades biológicas asociadas con el GDF-8 maduro, según se describe aquí. La secuencia de aminoácidos de GDF-8 humano maduro se proporciona en la SEQ ID NO: 2. La presente invención se relaciona con el GDF-8 proveniente de todas las especies vertebradas, incluyendo, pero no limitándose a, seres humanos, bovinos, pollos, murino, ratas, porcinos, ovinos, pavos, mandriles y peces (para información de secuencias, ver, por ejemplo, McPherron et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 94: 12457-12461). El término "GDF-8 maduro" se refiere a la proteína que es segmentada del dominio con terminación carboxi de la proteína precursora del GDF-8. El GDF-8 maduro puede estar presente como un monómero, homodímero, o puede estar presente en un complejo latente de GDF-8. Dependiendo de las condiciones, el GDF-8 maduro puede establecer un equilibrio entre cualquiera o la totalidad de estos diferentes polipéptidos. En su forma biológicamente activa, el GDF-8 maduro también es referido como "GDF-8 activo." El término "propéptido de GDF-8" se refiere al polipéptido que es segmentado del dominio con terminación amino de la proteína precursora del GDF-8. El propéptido de GDF-8 es capaz de unirse al dominio de unión de propéptido en el GDF-8 maduro. El término "complejo latente de GDF-8" se refiere al complejo de proteínas formado entre el homodímero de GDF-8 maduro y el propéptido de GDF-8. Se cree que dos propéptidos de GDF-8 se asocian con las dos moléculas de GDF-8 maduro en el homodímero para formar un complejo tetramérico inactivo. El complejo latente puede incluir otros inhibidores de GDF-8 en lugar de o en adición a uno o ambos de los propéptidos de GDF-8. El término "actividad de GDF-8" se refiere a una o más actividades reguladoras fisiológicamente del crecimiento o morfogenéticas, asociadas con la proteína del GDF-8 activo. Por ejemplo, el GDF-8 activo es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético. El GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, quinasa creatina), estimular la proliferación de células mioblasto, y modular la diferenciación de los preadipocitos a adipocitos. Los procedimientos ejemplares para medir la actividad del GDF-8 in vivo y in vitro, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, pruebas de gene reportero (ver Ejemplo 6), o pruebas in vivo que involucran mediciones de músculo y/o parámetros óseos (ver Ejemplos 8, 9 y 10). El término "porción de Fe" se refiere al fragmento de terminación C de una inmunoglobulina generada mediante proteólisis con papayina, o un equivalente funcional derivado de éste. El término "porción de Fe" debe ser entendido como que abarca fragmentos de Fe producidos de manera recombinante, incluyendo aquellos derivados de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgM y cualquiera de las subclases de isotipos. El término "región constante de un anticuerpo" se refiere a una porción de terminación C de una inmunoglobulina, que comprende la porción Fe y secuencias adyacentes en tanto estas secuencias no incluyan regiones variables del anticuerpo, tales como regiones de determinación de complementariedad (CDR). La región constante de un anticuerpo es la misma en todos los anticuerpos de un isotipo particular.

Como se utiliza aquí, el término "hibridación bajo condiciones astringentes" se tiene la intención de que describa condiciones para la hibridación y lavados bajo los cuales secuencias de nucleótidos que son significativamente idénticas u homologas entre ellas permanezcan unidas complementariamente entre ellas mismas. Las condiciones son tales que secuencias cuando menos aproximadamente 70%, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 80%, y aún más preferiblemente cuando menos aproximadamente 85-90% idénticas permanecen unidas entre ellas. El porcentaje de identidad es determinado como se describe en Alschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Se conocen en la técnica las condiciones astringentes y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (eds. Ausubel et al., 1995) secciones 2, 4 y 6. Adicionalmente, condiciones astringentes son descritas en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Press, capítulos 7, 9 y 11. Un ejemplo de condiciones de hibridación astringentes es hibridación en 4X cloruro de sodio/ citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 65-70 °C o hibridación en 4X SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50 °C, seguido de uno o más lavados en IX SSC, a aproximadamente 65-70 °C. Cuando se usan membranas de nylon, por ejemplo, un ejemplo no limitativo adicional de condiciones de hibridación astringentes es hibridación en Nal^PC 0.25-0.5 M, 7% de SDS a aproximadamente 65 °C, seguido de uno o más lavados en NaH2P04 0.02 M, 1% de SDS a 65 °C. Ver, por ejemplo, Church et al., (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81: 1991-1995. Se comprenderá que pueden ser agregados reactivos adicionales a la hibridación y/o reguladores de lavado, por ejemplo, agentes de bloqueo (BSA o ADN de esperma de salmón), tensoactivos (SDS), agentes quelantes (EDTA), Ficoll, PVP, etc. El término "inhibidor," cuando se utiliza en relación con el GDF-8 o su actividad, incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de GDF-8. Tales inhibidores incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos de anti-sentido, ARN de doble cadena, y otras pequeñas moléculas, que inhiben el GDF-8. Se dice que tales inhibidores "inhiben," "neutralizan" o "reducen" la actividad biológica de proteína de GDF-8. Los términos "neutralizar," "neutralización" e "inhibidor" y sus equivalentes se refieren a una reducción en la actividad del GDF-8 por un inhibidor del GDF-8, con relación a la actividad del GDF-8 en la ausencia del mismo inhibidor. La reducción en la actividad es preferiblemente de cuando menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más alta. El término "aislado" se refiere a una molécula que está substancialmente libre de su medio ambiente natural. Por ejemplo, una proteína aislada está substancialmente libre de material celular u otras proteínas provenientes de la célula o de la fuente de tejido de la cual se deriva. El término se refiere a preparaciones en donde la proteína aislada es suficientemente pura para ser administrada como una composición terapéutica, o cuando menos 70% a 80% pura (peso/ peso), cuando menos 80-90% pura, 90-95% pura, o cuando menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% pura. El término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como tal, incluyendo a los seres humanos y animales domésticos y de granja, así como de zoológico, de deportes o mascotas tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. El término "interacción específica" o "que se une de manera específica" o similares, significa que dos moléculas forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. El término también es aplicable en donde, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epitopo particular, el cual es portado por un gran número de antígenos, en cuyo caso el anticuerpo que porta el dominio de unión a antígeno será capaz de unirse a los varios antígenos que portan el epitopo. De esta manera, un anticuerpo puede unirse de manera específica a, por ejemplo, BMP-11 y GDF-8 en tanto se una al epitopo, el cual es portado por ambos. La unión específica se caracteriza por una elevada afinidad y capacidad de baja a moderada. La unión no específica usualmente tiene una baja afinidad con una capacidad de moderada a alta. Típicamente, se considera a la unión específica cuando la constante de afinidad a es más alta que 106 M"1, o puede ser mayor de 108 M'1. Si es necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar de manera importante la unión específica variando las condiciones de unión. Se conocen tales condiciones en la técnica, y una persona capacitada en la técnica, utilizando técnicas rutinarias, puede seleccionar las condiciones apropiadas. Usualmente las condiciones son definidas en términos de la concentración del polipéptido de fusión de ActRIIB, fuerza iónica de la solución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de moléculas no relacionadas (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de leche), etc. En los Ejemplos 5 y 6 se establecen condiciones ejemplares. La frase "sustancialmente como se propone" significa que una secuencia de aminoácidos relevante es cuando menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia dada. A manera de ejemplo, tales secuencias pueden ser variantes derivadas de varías especies, o pueden ser derivadas de la secuencia dada mediante truncamiento, deleción, sustitución de aminoácidos o adición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante algoritmos de alineación estándar tales como, por ejemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrito en Altschul et al, (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410; el algoritmo de Needleman et al, (1970) J. Mol. Biol, 48: 444-453 o el algoritmo de Meyers et al, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17. El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al tratamiento profiláctico/ preventivo. Aquellos que requieren un tratamiento pueden incluir a individuos que ya tienen un desorden médico particular así como también a aquellos que finalmente pueden adquirir el desorden (esto es, aquellos de requieren de medidas preventivas, tales como, por ejemplo, mujeres post-menopáusicas con una historia familiar de osteoporosis, o pacientes obsesos con historia familiar de diabetes tipo 2 o de alguna manera con lecturas elevadas de azúcar en sangre).

II. Polipéptidos de Fusión de ActRIIB La presente descripción provee receptor tipo II de activina modificado ActRIIB que se une a GDF-8 e inhibe su actividad in vitro y/o IR vivo. En particular, los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente inhiben la actividad del GDF-8 asociada con la regulación negativa de la masa músculo esquelética y la densidad ósea. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención son solubles y poseen propiedades farmacocinéticas que los hacen adecuados para uso terapéutico, por ejemplo, alargada vida media en circulación y/o protección mejorada de la degradación proteolítica. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención comprenden (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la región constante de un anticuerpo. Las secuencias de ADN y de aminoácidos completas de una modalidad ilustrativa particular de la proteína de fusión de ActRIIB se establecen en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. La primera secuencia de aminoácidos es derivada de toda o una parte del dominio extracelular de ActRIIB y es capaz de unirse a GDF-8 de manera específica. En algunas modalidades, dicha porción del dominio extracelular de ActRIIB también se puede unir a BMP- 11 y/o activina, u otros factores de crecimiento. En ciertas modalidades, la primera secuencia de aminoácidos es idéntica a o es substancialmente como se establece en la SEQ ID NO: 3 desde aproximadamente el aminoácido (aa) 23 hasta aproximadamente el aminoácido 138 o desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta el aminoácido 144 de la SEQ ID NO: 1. La diferencia entre la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3 es que el aminoácido 64 de la SEQ ID NO: 1 es Ala, mientras que el correspondiente aminoácido 68 en la SEQ ID NO: 3 es Arg. Adicionalmente, otras variantes en la secuencia de ActRIIB son posibles, por ejemplo, el aminoácido 16 y el aminoácido 17 en la SEQ ID NO: 1 pueden ser sustituidos con Cys y Ala, respectivamente. En algunas otras modalidades, la primera secuencia de aminoácidos comprende cuando menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 aminoácidos contiguos de aproximadamente el aminoácido 23 y aproximadamente el aminoácido 138 de la SEQ ID NO: 3; o aproximadamente el aminoácido 19 y aproximadamente el aminoácido 144 de la SEQ ID NO: 1. Dicha secuencia puede estar truncada en tanto que la secuencia trunca sea capaz de unirse de manera específica al GDF-8. La unión al GDF-8 puede ser probada usando métodos que se conocen en la técnica o que se describen en los Ejemplos 5 y 6. La segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la región constante de un anticuerpo, particularmente la porción Fe, o es una mutación de dicha secuencia. En algunas modalidades, la segunda secuencia de aminoácidos es derivada de la porción Fe de una IgG. En modalidades relacionadas, la porción Fe es derivada de IgG que es IgGi, IgG4, u otro isotipo de IgG. En una modalidad particular, la segunda secuencia de aminoácidos comprende la porción Fe de IgGi humana, como se establece en la SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 148 a 378), en donde la porción Fe de IgGi humana ha sido modificada para reducir la función efectora de la porción Fe. Tales modificaciones incluyen el cambiar residuos aminoácido específicos que podrían alterar una función efectora tal como la unión del receptor Fe (Lund et al., (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 y Morgan et al., (1995) Immunology 86: 319-324), o cambiando la especie de la cual la región constante se derivó. Los anticuerpos pueden tener mutaciones en la región CH2 de la cadena pesada que reduzcan la fimción efectora, por ejemplo, la unión del receptor Fe y activación de complemento. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener mutaciones tales como aquellas descritas en las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 5,624,821 y 5,648,260. En la cadena pesada de IgGi o IgG2, por ejemplo, tales mutaciones pueden ser hechas en los residuos aminoácido correspondientes a los aminoácidos 234 y 237 en la secuencia de longitud completa de Igd o IgG2. Los anticuerpos también pueden tener mutaciones que estabilizan el enlace bisulfuro entre las dos cadenas pesadas de una inmunoglobulina, tales como mutaciones en la región de gozne de IgG4, como se describe en Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108. En ciertas modalidades, la segunda secuencia de aminoácidos está ligada a la terminación C o la terminación N de la primera secuencia de aminoácidos, con o sin estar ligada por una secuencia ligadora. La longitud y secuencia exactas del ligador y su orientación con relación a las secuencias ligadas pueden variar. El ligador puede ser, por ejemplo, (Gly-Ser)2 (SEQ ID NO: 5). El ligador puede comprender 2, 10, 20, 30 o más aminoácidos y se selecciona sobre la base de propiedades deseados tales como la solubilidad, longitud y separación estérica, inmunogeneicidad, etc. En ciertas modalidades, el ligador puede comprender una secuencia de un sitio de separación proteolítica, tal como el sitio de escisión de enteroquinasa Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 6) u otras secuencias funcionales útiles, por ejemplo, para purificación, detección o modificación de la proteína de fusión. Se comprenderá por alguien capacitado en la técnica que ciertos aminoácidos en una secuencia de cualquier proteína pueden ser sustituidos por otros aminoácidos sin afectar de manera adversa la actividad de la proteína. Se contempla, por lo tanto, que varios cambios puede hacerse en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención, o las secuencias de ADN que codifican para tales polipéptidos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica o de su utilidad. La actividad biológica del ActRIIB puede ser medida como se describe en los Ejemplos 6-10, Tales cambios pueden incluir, pero no se limitan a, deleciones, inserciones, truncamientos y sustituciones.

En ciertas modalidades pueden construirse fusiones adicionales de cualesquiera de los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención a secuencias de aminoácidos derivadas de otras proteínas. Las secuencias de fusión deseadas pueden ser derivadas de proteínas que tienen actividad biológica diferente de aquella de ActRIIB, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento y diferenciación, enzimas, hormonas, otros componentes de receptores, etc. También los polipéptidos de fusión de ActRIIB pueden ser químicamente acoplados, o conjugados, a otras proteínas y agentes farmacéuticos. Tales modificaciones pueden ser diseñadas para alterar la farmacocinética y/o biodistribución de la composición resultante. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención pueden ser glucosilados, asociados a PEG o unidos a otro polímero no-proteináceo. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se están describiendo pueden ser ligados a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilen glicol, propilen glicol, o polioxialquilenos, en la forma que se establece en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB son químicamente modificados mediante conjugación covalente a un polímero para incrementar su vida media circulatoria, por ejemplo. Polímeros ejemplares y los métodos para unirlos a péptidos también se describen en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 y 4,609,546. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención pueden ser modificados para que tenga un patrón de glucosilación alterado (esto es, alterado del patrón de glucosilación nativo u original). Como se emplea aquí, "alterado" significa que tiene una o más fracciones carbohidrato suprimidas, y/o que tiene uno o más sitios de glucosilación agregadas a la secuencia original. La adición de sitios de glucosilación a los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente puede ser llevada a cabo mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos para que contenga secuencia de consenso de sitio de glucosilación que se conocen bien en la técnica. Otros medios para aumentar el número de fracciones de hidrato de carbono es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a los residuos aminoácido. Estos métodos se describen en WO 87/05330, así como en Aplin et al, (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306. La remoción de cualquier fracción de carbohidrato presente en ActRIIB puede ser llevada a cabo de manera química o enzimática como se describe por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem.

Biophys. 259:52 y por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131 y por Thotakura et al, (1987) Meth. Enzymol, 138: 350. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención también pueden ser marcados con una etiqueta funcional o susceptible de ser detectada. Las etiquetas detectables incluyen radioetiquetas tales como 13 ? o 99Tc, las cuales pueden ser unidas a polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención usando química convencional que se conoce en el campo. Las etiquetas también incluyen etiquetas de enzima tales como peroxidasa de raíz fuerte o fosfatasa alcalina. Las etiquetas además incluyen fracciones químicas tales como biotina, la cual puede ser detectada a través de la unión a una fracción detectable análoga y específica, por ejemplo, avidina etiquetada. Alguien capacitado en la técnica reconocerá que los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención pueden ser usados para detectar, medir e inhibir proteínas que difieren del GDF-8 y la BMP-11, y activina. En la presente invención se describen ejemplos no limitantes de tales proteínas, por ejemplo, secuencias de GDF-8 derivadas de varias especies (ortólogos).

III. Ácidos Nucleicos, v Sistemas de Expresión y Clonación La presente descripción provee un ácido nucleico aislado que codifica para un ActRIIB soluble que puede ser usado en los métodos de la presente invención. El ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de codificación para cuando menos un polipéptido de fusión de ActRIIB de la invención como se ha descrito aquí. En ciertas modalidades, el ácido nucleico comprende la secuencia, o su derivado de la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 4. En ciertas otras modalidades, la secuencia de ácido nucleico es tal que codifica para las secuencias de aminoácidos desde aproximadamente el aminoácido 23 y aproximadamente el aminoácido 138 de la SEQ ID NO: 3 o desde aproximadamente el aminoácido 19 y aproximadamente el aminoácido 144 de la SEQ ID NO: 1.

La descripción también provee constructos en la forma de plásmidos, vectores, cartuchos de transcripción o expresión que comprenden cuando menos un ácido nucleico de la invención como se estableció anteriormente. La descripción también provee una célula hospedera, la cual comprende uno o más de los constructos como se definió anteriormente. Un ácido nucleico que codifica para uno cualquiera de los polipéptidos de fusión de ActRIIB, como se provee aquí, forma un aspecto de la presente invención, como lo es un método de producción del producto codificado. La producción de los polipéptidos de fusión de ActRIIB codificados puede ser lograda mediante la expresión de células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleico bajo condiciones apropiadas de cultivo. Enseguida a la expresión, un polipéptido de fusión de ActRIIB es aislado y/o purificado usando cualquier técnica adecuada, posteriormente utilizado como sea apropiado. En los Ejemplos 3 y 4 se presentan procedimientos ejemplares para la expresión y purificación. Polipéptidos de fusión de ActRIIB específicos y moléculas de ácido nucleico de codificación, así como vectores de acuerdo con la presente invención pueden ser obtenidos, aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su medio ambiente natural, en forma substancialmente pura u homogénea o, en el caso de un ácido nucleico, libre o substancialmente libre de ácido nucleico o genes de un origen distinto al de la secuencia de codificación de un polipéptido con la función requerida. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender ADN o ARN y pueden ser total o parcialmente sintéticos. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se establece aquí abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U es sustituida por T, a menos que el contexto lo requiera de otro modo. La invención también abarca secuencias que son cuando menos de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos de longitud y que hibridan bajo condiciones de hibridación astringentes al ácido nucleico que se establece en la SEQ ID NO: 4. Se conocen bien sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospederas. Las células hospederas incluyen bacterias, células de mamífero; y sistemas de levadura y baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster Chino, células HeLa, células de riñón de hámster bebe, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped bacteriano común es la E. coli. Para células adecuadas para la producción de polipéptidos de fusión de ActRIIB, ver Gene Expresión Systems, Academic Press, (Fernández et al., eds. 1 99). Cualquier línea celular compatible con la presente invención puede ser utilizada para producir los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente. Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados que conténgan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, secuencias de genes marcadores y otras secuencias que resulten apropiadas. Los vectores pueden ser plásmidos o virales, por ejemplo, fago o fagémido, según sea adecuado. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN dentro de células y expresión de gene, así como análisis de proteína, se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, (Ausubel et al., eds. 1992). De esta manera, un aspecto adicional de la presente invención provee una célula hospedera que comprende ácido nucleico como se describe en la presente. Adicionalmente, la invención provee un método que comprende la introducción de dicho ácido nucleico en una célula hospedera. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección y traducción mediada por liposoma y usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vacuna o, para células de insecto, baculovirus. Para células de bacteria, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación de cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófago. La introducción puede ser seguida por el hecho de hacer o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de células hospederas bajo condiciones apropiadas para la expresión del ácido nucleico.

IV. Métodos para la Identificación de Inhibidores Todavía otro aspecto de la invención provee un método para la identificación de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de desórdenes musculares y óseos. Se conocen bien en la técnica pruebas de tamizado apropiadas, por ejemplo, ensayos a base de ELISA. En tal prueba de tamizado, se forma una primera mezcla de unión combinando un polipéptido de fusión de ActRIIB de la invención y un ligando, por ejemplo, GDF-8, BMP-11, activina; y se mide la cantidad de la unión en la primera mezcla de unión (M0). También se forma una segunda mezcla de unión combinando un polipéptido de fusión de ActRIIB, el ligando y el compuesto o agente que va a ser tamizado, y se mide la cantidad de la unión en la segunda mezcla de unión (Mi). Posteriormente se comparan los montos de unión en las mezclas de unión primera y segunda, por ejemplo, calculando la relación Mi/Mo. El compuesto o agente es considerado como que es capaz de inhibir la señalización de célula mediada por ActRIIB si se observa una disminución en la unión en la segunda mezcla de unión en comparación con la primera mezcla de unión. La formulación y optimización de las mezclas de unión está dentro de los conocimientos ordinarios de la técnica, tales mezclas de unión también pueden contener reguladores y sales necesarias para mejorar o para optimizar la unión, y pruebas de control adicionales pueden ser incluidas en la prueba de tamizado de la invención. Los compuestos que se encontró que reducen la unión de polipéptido de fusión de ActRÜB-ligando en cuando menos aproximadamente 10% (esto es Mi/M0 < 0.9), preferiblemente más de aproximadamente 30%, pueden por lo tanto ser identificados y posteriormente, si se desea, tamizados de manera secundaria para determinar su capacidad de inhibir la actividad de GDF-8 en otras pruebas como el ensayo de unión de ActRIIB, y otras pruebas basadas en células in vivo como se describe en los Ejemplos 5-12.

V. Métodos de Tratamiento de Enfermedades v Otros Usos Los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente son solubles y poseen propiedades farmacocinéticas que los hacen adecuados como agentes terapéuticos, esto es, para prevenir, diagnosticar o tratar diversos desórdenes médicos en animales y, especialmente, en seres humanos. En ciertas modalidades, la vida media en circulación de los polipéptidos de fusión de ActRIIB sobrepasa los 5, 7, 10 o 14 días.

Los polipéptidos de fusión de ActRIEB se pueden utilizar para inhibir una o más de las actividades del GDF-8 asociadas con desórdenes de músculo y/o hueso. La inhibición de la actividad de GDF-8 puede ser medida en pruebas de gene reportero de pGL3(CAGA)12 como se describe en Thies et al, (Growth Factors (2001) 18: 251-259) o como se ilustra en el Ejemplo 6. Los desórdenes médicos siendo diagnosticados, tratados o prevenidos mediante los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente es un desorden muscular o neuromuscular; un desorden del tejido adiposo tal como la obesidad; diabetes tipo 2; tolerancia dañada a la glucosa, síndromes metabólicos (por ejemplo, síndrome X); resistencia a la insulina inducida por trauma tal como por quemadura o desequilibrio de nitrógeno; o enfermedades degenerativas óseas tales como la osteoporosis. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente también pueden ser utilizados en terapias para reparar músculo dañado, por ejemplo, miocardio, diafragma, etc. Enfermedades y desórdenes ejemplares incluyen además desórdenes musculares y neuromusculares tales como la distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne); esclerosis lateral amiotrópica (ALS), atrofia muscular; atrofia de órgano; debilidad; síndrome de túnel carpiano; enfermedad pulmonar obstructiva congestiva; y sarcopenia, caquexia y otros síndromes de emaciación muscular. Otros desórdenes médicos siendo diagnosticados, tratados o prevenidos mediante los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente son desórdenes asociados con una pérdida de hueso, los cuales incluyen la osteoporosis, especialmente en las personas de la tercera edad y/o mujeres postmenopáusicas, osteoporosis inducida por glucocorticoide, osteopenia, osteoartritis, y fracturas relacionadas con la osteoporosis. Otras enfermedades y desórdenes óseos metabólicos que son blanco incluyen la masa ósea baja debido a terapia crónica con glucocorticoides, falla gonadal prematura, supresión de andrógeno, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nervosa. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB son preferiblemente utilizados para prevenir, diagnosticar o tratar tales desórdenes médicos en mamíferos, especialmente en seres humanos. Las composiciones que comprenden los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, condición física y sexo del sujeto, así como también con la severidad de la condición médica en dicho sujeto. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de manera que los polipéptidos se proporcionen en una dosis desde 1 ug/kg hasta 20 mg/kg, 1 ug/kg hasta 10 mg/kg, 1 ug/kg hasta 1 mg/kg, 10 ug/kg hasta 1 mg/kg, 10 µg/kg hasta 100 µ a , 100 µg kg hasta 1 mg/kg, y 500 ug/kg hasta 1 mg/kg, o como se describe en los Ejemplos 10 y 11. Las composiciones se pueden proporcionar como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes para la longitud de tiempo más larga después de la dosis. También puede ser utilizada la infusión continua después de la dosis de bolo. La especificación para los polipéptidos de la unidad de dosis de la invención está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, así como de las limitaciones inherentes en la técnica de la formulación de combinados de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. La toxicidad y la eficacia terapéutica pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren las composiciones que presentan grandes índices terapéuticos. Pueden utilizarse los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células y estudios en animales, en la formulación de un intervalo de dosis para uso en seres humanos.

La dosificación de tales compuestos recae preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulatorias que incluyen la ED50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. La dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos de células. Una dosis puede ser formulada en modelos de animal para lograr un intervalo de concentración de plasma circulatoria que incluya el IC50 (esto es, la concentración del terapéutico que logra una inhibición media-máxima de los síntomas) según se determina en un cultivo de células. Los niveles de plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser monitoreados mediante un bioensayo adecuado. Los ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la trascripción, ensayos de unión de GDF-8, ensayos de quinasa creatina, ensayos basados en la diferenciación de pre-adipocitos, ensayos basados en la absorción de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos. Como un aspecto adicional de la invención, los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la presente invención pueden ser utilizados para detectar la presencia de proteínas que pertenecen a la súper familia del TGF-ß, tal como la BMP-11 y el GDF-8 in vivo o in vitro. Mediante la correlación de la presencia o nivel de estas proteínas con una condición médica, alguien capacitado en la técnica puede diagnosticar la condición médica asociada. Las condiciones médicas que pueden ser diagnosticadas mediante los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se están describiendo en la presente se establecieron anteriormente. Tales métodos de detección se conocen bien en la técnica e incluyen la prueba de ELISA, radioinmunoensayo, inmunomanchado, western blot, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, y otras técnicas comparables. Los polipéptidos pueden ser proveídos además en un equipo de diagnóstico que incorpore una o más de estas técnicas para detectar una proteína (por ejemplo, GDF-8). Dicho equipo puede contener otros componentes, empaque, instrucciones u otros materiales para ayudar a la detección de la proteína y el uso del equipo. En donde se tiene la intención de que los polipéptidos de fusión de ActRIIB se utilicen para propósitos de diagnóstico, puede ser deseable modificarlos, por ejemplo con un grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador susceptible de detección (tal como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima). Si se desea, los polipéptidos de fusión de ActRIIB pueden ser marcados utilizando técnicas convencionales. Las etiquetas adecuadas incluyen fluoroforos, cromóforos, átomos radiactivos, reactivos densos de electrón, enzimas, y ligandos que tengan socios de unión específica. Las enzimas son típicamente detectadas mediante su actividad. Por ejemplo la peroxidasa de raíz fuerte usualmente puede ser detectada por su capacidad de convertir a la tetrametilbencidina (TMB) a un pigmento azul, susceptible de ser cuantificado con un espectrofotómetro. Otras etiquetas adecuadas pueden incluir la biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de receptor-ligando que se conocen en la técnica. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente claras para aquellos capacitados en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

VI. Composiciones Farmacéuticas v Métodos de Administración La presente invención provee composiciones adecuadas para su administración a pacientes. Las composiciones típicamente comprenden uno o más de los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí, la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos y de retardación de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica el uso de tales medios y agentes para substancias farmacéuticamente activas. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar incluidas en un contenedor, paquete o despachador conjuntamente con instrucciones para su administración. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los métodos para llevar a cabo la administración se conocen por aquellos con conocimientos normales en la técnica. La administración puede, por ejemplo, ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidades, subcutánea o transdérmica. También puede ser posible obtener composiciones que puedan ser tópica u oralmente administradas. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea típicamente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como el alcohol de bencilo o parabenos de metilo; antioxidantes tales como el ácido ascórbico o el bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminotetraacético; reguladores tales como los acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad tales como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. Tales preparaciones pueden estar encerradas en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución de salmuera fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor1 1* EL (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina regulada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe fluir al grado de que exista un fácil manejo con la jeringa. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador debe ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares), así como mezclas adecuadas de éstos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como la lecitina, mediante la conservación del tamaflo de partícula requerida en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos o anti-hongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como el manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede fomentarse mediante la inclusión en la composición de una agente que demore la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Por ejemplo, pueden estar encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para propósitos de administración terapéutica oral, los polipéptidos de fusión de ActRIIB pueden estar incorporados con excipientes y utilizados en forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un ligador tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como ácido algínico, Primogel^, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o SterotesMR; un glidant tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja. Para la administración por inhalación, los anticuerpos pueden ser liberados en forma de un rocío en aerosol desde un recipiente o despachador a presión que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Por ejemplo, en el caso de ActRIIB, las composiciones pueden ser capaces de transmisión a través de membranas mucosas (por ejemplo, intestino, boca, o pulmones) vía la ruta mediada por el receptor de FcRn (patente de los Estados Unidos de América No. 6,030,613). La administración transmucosal puede ser llevada a cabo, por ejemplo, a través del uso de pastillas, aspersiones nasales, inhaladores o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación agentes de penetración apropiados para la barrera que va a ser penetrada. Dichos agentes de penetración generalmente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB que se describen en la presente pueden estar preparados con portadores que protegerán al compuesto en contra de la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para aquellos capacitados en la técnica serán claros los métodos para la preparación de tales formulaciones. También pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptables a las suspensiones liposomales que contengan los polipéptidos de fusión de ActRIIB que actualmente se describen. Estas pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos que se conocen por aquellos capacitados en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos de América número 4,552,811.

Puede ser ventajoso el formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para una fácil administración y para uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéuticamente requerido. Ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de fusión de ActRIEB, tales como los ácidos nucleicos descritos anteriormente, pueden ser introducidos a una célula dentro de un tejido u órgano, o un organismo de manera que los polipéptidos codificados puedan ser expresados entonces. La metodología puede ser útil, por ejemplo, en la evaluación de los efectos de los polipéptidos de fusión de ActRIIB en tejidos y órganos de individuos. En ciertas modalidades, ácido nucleico que codifica para un polipéptido de fusión de ActRIIB es ligado a una secuencia de control de expresión específica de tejido, por ejemplo, secuencia promotora específica de músculo tal como el promotor de miosin o el promotor de desmin, los elementos mej oradores específicos de músculo tal como el mej orador de quinasa creatina de músculo. Aquellos capacitados en la técnica reconocerán que pueden insertarse secuencias de polinucleótidos específicas en vectores virales o de plásmido que pueden ser inyectadas en un mamífero en forma sistémica, o local. También pueden cosecharse células hospederas, y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de fusión de ActRIIB puede ser transfectado en tales células ex vivo para re-implantación subsecuente usando métodos que se conocen en la técnica. También pueden transfectarse ácidos nucleicos en un embrión unicelular para crear un animal transgénico como se describe en Gene Expression Systems, Academic Press (Fernández et al. Eds. 1999). La descripción es comprendida de manera más completa a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de esta descripción, la totalidad de las cuales se incorporan por medio de la presente como referencia en su totalidad. Las modalidades dentro de la descripción proveen una ilustración de las modalidades de la invención y no deben ser interpretadas como limitantes del alcance de la invención. El técnico capacitado en la materia reconocerá que muchas otras modalidades están abarcadas por la invención reivindicada y que se tiene la intención de que la descripción y los ejemplos sean considerados como ejemplares solamente, con el alcance y espíritu verdaderos de la invención siendo indicados por las siguientes reivindicaciones. Los siguientes ejemplos ilustran algunas modalidades y aspectos de la invención. Alguien con conocimientos normales en la técnica reconocerá que otras numerosas modificaciones y variantes pueden ser llevadas a cabo sin alterar el espíritu o alcance de la presente invención. Tales modiñcaciones y variantes están abarcadas dentro del alcance de la invención. Los ejemplos no limitan de forma alguna la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 : Purificación del GDF-8 Medio acondicionado proveniente de una línea celular seleccionada que expresa proteína de GDF-8 humano y recombinante (GDF-8 maduro y propéptido de GDF-8) se acidificó a un pH de 6.5 y se aplicó a una columna de intercambio amónico POROSMR HQ de 80 x 50 mm, en tandeo, a una columna de intercambio catiónico POROSMR SP de 80 x 50 mm (PerSeptive Biosystems, Foster City, CA). El flujo a través de ésta se ajustó a pH 5.0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico POROSMR SP de 75 x 20 mm (PerSeptive Biosystems) y se eluyó con un gradiente de TFA/ acetonitrilo. Las fracciones que contenían el complejo de GDF-8 latente, como se confirmó mediante SDS-PAGE, se acumularon, acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) a un pH 2-3, posteriormente se llevaron hasta 200 mi con TFA al 1% para bajar la viscosidad. El acumulado se aplicó posteriormente a una columna de C5 de 250 x 21.2 mm (Phenomenex, Torrance, CA) precedida por una columna guard de 60 x 21.2 mm (Phenomenex) y se eluyó con un gradiente de TFA/ acetonitrilo, para separar el GDF-8 maduro del propéptido de GDF-8. Las fracciones acumuladas que contenían GDF-8 maduro se concentraron mediante liofilización para eliminar el acetonitrilo y se agregaron 20 mi de TFA al 0.1%. La muestra se aplicó entonces a una columna de C5 de 250 x 10 mm (Phenomenex) calentada a 60 °C para ayudar en la separación. Esto se repitió hasta que ya no pudo lograrse separación adicional. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro se acumularon entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40% y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSepMR S-3000 de 600 x 21.2 (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro y purificado y el propéptido de GDF-8 se acumularon por separado y se concentraron para uso en experimentos subsecuentes. En el análisis SDS-PAGE, el GDF-8 maduro y purificado emigró como una banda ancha a 25 kDa bajo condiciones no reductoras y 13 kDa bajo condiciones reductoras. Bajo condiciones no reductoras, el propéptido de BMP-11 emigró a alrededor de los 35 kDa. Se ha reportado un perfil de SDS-PAGE similar para GDF-8 de murino McPherron et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, U.S.A. (1997) 94: 12457-12461), y refleja la naturaleza dimérica de la proteína madura. El propéptido de GDF-8 emigró a aproximadamente 35 kDa en SDS-PAGE reductor. El dímero de BMP- 11 maduro activo se purificó a partir del medio acondicionado de una línea celular que expresaba BMP- 11 humana recombinante en una manera similar. El medio acondicionado se cargó en una columna TALONMR de 10 mi (Clontech, Palo Alto, CA). La proteína unida se eluyó con Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 1 M, imidazol 500 mM. Las fracciones que contenían el complejo de BMP- 11 se acumularon y acidificaron con ácido triíluroacético al 10% a un pH de 3. El complejo de BMP-11 se aplicó a una columna Júpiter C4 de 250 x 4.6 mm (Phenomenex) la cual fue calentada a 60 °C para una mejor separación de la BMP- 11 madura y el propéptido de BMP-11. La BMP-11 se eluyó con un gradiente de TEA acetonitrilo. Las fracciones que contenían la BMP- 11 fueron concentradas mediante liofilización para eliminar el acetonitrilo.

Ejemplo 2: Características del GDF-8 Humano Recombinante Purificado Se mezclaron 50 ug de cada uno de GDF-8 maduro purificado y propéptido de GDF-8 purificado y se dializaron en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0 y se sometieron a cromatografía en una columna de exclusión por tamaño S-3000 de 300 x 7.8 mm de BioSepMR (Phenomenex). El peso molecular del complejo de GDF-8 maduro/ propéptido se determinó a partir del tiempo de elusión, usando estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sometidos a cromatografía en la misma columna. Cuando se incubó propéptido de GDF-8 purificado, con GDF-8 maduro purificado, a un pH neutro, las dos proteínas parecieron formar un complejo, como se indicaba por el perfil de exclusión por tamaño. El pico de la proteína primaria que eluyó a los 12.7 minutos tenía un peso molecular estimado de 78 kDa a partir de los estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories) sometidos a cromatografía en la misma columna. El tamaño del complejo era más consistente con un dímero del GDF-8 maduro asociándose con dos monómeros de propéptido. Para confirmar esta afirmación, se incubó una preparación que contenía tanto GDF-8 maduro como propéptido de GDF-8, con o sin 3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida clorhidrato de 1 -etilo 100 mM (EDC, Pierce Chemical, Rockford, IL) durante 1 hora a temperatura ambiente, acidificado con HC1 a un pH de 2-3, y concentrado con un concentrador Amicon Micron- 10 (Millipore, Bedford, MA) para SDS-PAGE, usando un gel de acrilamida al 10% regulado con tricina. Las proteínas fueron visualizadas mediante teñido de azul de CoomassieMR de SDS-PAGE.

Ejemplo 3: Expresión de ActRIIB-Fc en Células CHO Se utilizó un ADNc de ActRUB humano de longitud completa para clonación por PCR del dominio extracelular (excluyendo la secuencia de codificación del péptido señal). Los cebadores utilizados fueron flanqueados por sitios Spel (5') y Notl (3'). Siguiendo la amplificación por PCR, este fragmento de PCR se clonó en los sitios Spel/ Notl del plásmido de expresión pHTop-HBML/EKFc. El marco de lectura abierto codifica: melitin líder de miel de abeja (aminoácidos 1 a 21 de la SEQ ID NO: 3); dominio extracelular de ActRIIB humano (aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO: 3); sitio de separación de enteroquinasa (DDDK, SEQ ID NO: 6); y fragmento Fe de IgGi humana (aminoácidos 148 a 378 de la SEQ ID NO: 3). Como resultado de la inserción del sitio Spel, hubo una adición de Thr-22 en la secuencia. Una línea celular estable de CHO transfectada para expresar el ActRIIB-Fc anteriormente mencionado se obtuvo mediante transfección de lipofectina del vector pHTop-HBML conteniendo el constructo de ActRIIB-Fc en células CHO/A2. Se seleccionaron en metotrexato 01 uM células transfectadas. El análisis Western blot de medio acondicionado se utilizó para identificar las clonas de expresión más elevada. El vector pHTop se derivó de pED (Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) mediante la remoción de la mayoría del promotor tardío adeno principal e insertando seis repeticiones del operador tet como se describe en Gossen et al. (1992) Proc. Nati. Acad Sci. U.S.A. , 89: 5547-5551.

La línea celular CHO/A2 se derivó de células DUKX BU de CHO (Urlaub et al, (1980) Proc. Nati. Acad. Sel U.S.A., 77: 4216-4220 mediante integración estable de un activador transcripcional, una proteína de fusión entre el represor de tet fusionado al dominio transcripcional VP16 de virus de herpes (Gossen et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89: 5547-5551).

Ejemplo 4: Purificación de ActRIIB-Fc Se purificó materia prima concentrada procedente de medio acondicionado mediante rProtein A Sephadex Fast FlowMR (XK26/4.5 cm, 23.8 mi; Pharmacia, Piscataway, NJ) a una pureza del 99% según se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño como se indica a continuación. Medio acondicionado congelado se descongeló en un baño de agua a 37 °C y se filtró a través de filtros de 0.22 um. Cuatro partes de la solución filtrada se mezclaron con una parte de regulador de carga Protein A (Na2S04 0.65 M, citrato de sodio 20 rriM, ácido bórico 20 mM, Na2HP04 20 mM, pH 9.0) y se corrió sobre la columna de Protein A a temperatura ambiente. El ActRIIB-Fc se eluyó de la columna usando regulador de elusión de Protein A (NaCl 0.15 M, ácido cítrico 20 mM, pH 2.5) con gradiente o escalamiento a pH de alrededor de 4-5, y el pico se recolectó y neutralizó a pH 7.0 mediante la adición de regulador de neutralización al 25% (Na2HP04 0.05 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2). Las fracciones fueron evaluadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño y SDS-PAGE, y posteriormente se acumularon y almacenaron a 4 °C. La proteína purificada se formuló en PBS mediante una columna de desalación G-25 (XK50/13.4 cm, 236 mi, Pharmacia) SephadexMR, y posteriormente se filtró a través de un filtro de 0.22 µp? y se almacenó a 4 °C.

Ejemplo S: Propiedades de Unión de BMP-11 y GDF-8 Purificado en la Prueba de Unión de ActRIIB-Fc El complejo latente de GDF-8 fue biotinado en una proporción de 20 moles de Sulfo-NHS-Biotin de EZ-link (Pierce, Rockford, Illinois, No. de Catálogo 21217) por 1 mol del complejo de GDF-8 por 2 horas en hielo, inactivado con TFA a. 0.5%, y sometido a cromatografía en una columna C4 Júpiter de 250 x 4.6 mm (Phenomenex) para separar el GDF-8 maduro del propéptido del GDF-8. Las fracciones de GDF-8 maduro biotinado eluídas con un gradiente de TFA/ acetonitrilo fueron acumuladas, concentradas y cuantificadas mediante un equipo Assay Reagent Kit de proteína de MicroBCA1^ (Pierce, Rockford, IL, No. de Catálogo 23235). Se preparó BMP-11 madura biotinada a partir de complejo latente de BMP-11 en la misma forma que se describió anteriormente. ActRIIB-Fc recombinante, preparada como se describió en los Ejemplos 3 y 4, se recubrió en placas de ensayo de fondo plano de 96 pozos (Costar, NY, No. de Catálogo 3590) a 1 µ^??? en regulador de carbonato de sodio 0.2 M durante toda la noche a 4 °C. Las placas fueron entonces bloqueadas con 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se lavaron siguiendo el protocolo ELISA estándar. Se agregaron alícuotas de 100 µ? de GDF-S o BMP-11 biotinada a varias concentraciones a la placa de ELISA bloqueada, se incubó por 1 h, se lavó. Se detectó la cantidad de GDF-8 o BMP- 11 unida mediante estreptavidina-peroxidasa de raíz fuerte (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA., No. de Catálogo 13047E) seguido de la adición de TMB (KPL, Gaithersburg, MD, No. de Catálogo 50-76-04). Se hicieron mediciones colorimétrícas a 450 nM en un lector de microplacas de Molecular Devices. Como se muestra en la Figura 1, el GDF-8 y la BMP- 11 biotinados se unieron a ActRIIB-Fc, con una ED50 de 15 ng/ml y 40 ng ml, respectivamente.

Ejemplo 6: Actividad Inhibidora de ActRIIB-Fc en la Prueba de Gene Reportero Para demostrar la actividad de ActRIIB-Fc, se desarrolló un ensayo de gene reportero (RGA) utilizando una secuencia del vector reportero, pGL3(CAGA)i2 acoplado a luciferasa. Se reportó previamente que la secuencia CAGA era una secuencia que respondía a TGF-ß dentro del promotor del gene inducido por TGF-ß, PAI-1 (Denner et al, (1998) EMBOJ. 17: 3091-3100). Un vector reportero que contiene 12 cajas CAGA se hizo utilizando el plásmido reportero básico, pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI). La caja TATA y el sitio de iniciación de transcripción proveniente del promotor tardío principal de adenovirus (-35/+ 10) se insertó entre los sitios BglII y HindIIL Se recocieron oligonucleótidos que contenían 12 repeticiones de las cajas CAGA AGCCAGACA, y se clonaron en el sitio Xhol. La línea celular de rabdomiosarcoma humano, A204 (ATCC HTB-82), se transfectó de manera transitoria con pGL3(CAGA)i2 usando reactivo de transfección FuGENE1^ 6 (Boehrínger Manheim, Alemania). Enseguida a la transfección, las células se cultivaron en placas de 48 pozos en medio 5 A de McCoy complementado con glutamina 2 nM, 100 U/ml de estreptomicina, 100 µg/ml, de penicilina y suero de ternera fetal al 10% durante 16 horas. Las células fueron entonces tratadas con o sin 10 ng ml de GDF-8 y varias concentraciones de ActRIIB-Fc en medio 5A de McCoy con glutamina, estreptomicina, penicilina y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino durante 6 horas a 37 °C. Se cuantificó la luciferasa en las células tratadas utilizando el Luciferase Assay System (Fromega). Dos lotes de ActRIIB purificados de manera independiente mostraron un IC50 de desde 0.07 hasta 0.1 nM en la prueba de gene reportero antes mencionada (Figura 2).

Ejemplo 7: Farmacocinética Se evaluó la farmacocinética (PK) de ActRIIB-Fc en ratones C57B6/SCID (The Jackson Laboratoiy, Bar Harbor, ME) a una dosis de 1 mg kg como una administración intravenosa (IV) o intraperitoneal (IP) sencilla. ActRIIB-Fc producido y purificado como se describió en los Ejemplos 3 y 4, se radiomarcó usando el método de iodogen (Protein Pharmacokinetics and Metabolism, Plenum Press, New York, NY (Ferraiolo et al, eds. 1992)). Los animales recibieron una mezcla de ActRIIB-Fc sin marcar y marcado con 125I a la dosis de la lista anterior y se determinaron concentraciones de suero sobre la base de radioactividad de 125I en el suero y la actividad específica de la dosis inyectada. La Figura 3 muestra la concentración de suero basada en las cuentas precipitadas por TCA versus tiempo para ActRIIB-Fc administrado ya sea IV o EP. La absorción a partir de la inyección IP fue completa, y la biodisponibilidad fue cercana al 100% dentro de las primeras 180 horas después de la inyección; la distribución de volumen inicial concordó con el volumen de plasma de ratón (50 ml/kg); la concentración de suero pico fue de 11 µg/ml (IP, a las 6 horas después de la inyección) y 19.4 µg/ml (IV); la vida media durante la fase de eliminación terminal fue de aproximadamente 5 días.

Ejemplo 8: Efecto In Vivo del ActRIIB-Fc Con el objeto de determinar si el ActRIIB-Fc aumenta la masa muscular en ratones adultos, se llevó a cabo un estudio in vivo con ratones hembra C57B6/SCID de siete semanas de edad (The Jackson Laboratory). Los ratones fueron pesados y distribuidos de manera uniforme con respecto al peso corporal en grupos de ocho. Durante un estudio de cuatro semanas, cada grupo recibió una inyección semanal intraperitoneal de lo siguiente: ActRIIB-Fc (60 mg kg, 3 mg/kg, o 60 µg kg), anticuerpo JA16 de anti-GDF-8 monoclonal de ratón (60 mg/kg), o regulador PBS (control de vehículo). El JA 16 se escogió porque este anticuerpo es específico para el GDF-8, y demostró que inhibe la actividad hiporeguladora de músculo del GDF-8 in vivo, en un estudio separado (publicación de patente de los Estados Unidos de América No. 20030138422). Los animales fueron evaluados en cuanto a la ganancia de masa corporal magra sometiéndolos a análisis dexascan antes y después del periodo de tratamiento. La masa muscular se evaluó mediante la disección y el pesado del gemelo interno y cuadríceps. El cojín de grasa peri-uterino también se retiró y se pesó. También fue medido el peso del bazo y timo. Los resultados de este estudio indicaron que el ActRIIB-Fc inhibió de manera importante la actividad del GDF-8 in vivo resultando en aumentos importantes en la masa muscular. Como se anticipó, los ratones a los que se administró JA 16 presentaron pesos corporales y del músculo esquelético ligeramente mayores y tuvieron un aumento estadísticamente importante (p = 0.0S) en peso del cuadríceps (Tabla 4). Los tratamientos con 60 y 3 mg/kg de ActRIIB-Fc fueron sorpresiva e importantemente más efectivos en comparación con el anticuerpo JAI 6. Los grupos a los que se administraron 60 mg/kg de ActRIIB-Fc y 3 mg/kg de ActRIIB-Fc tuvieron pesos corporales que aumentaron aproximadamente tres y dos veces, respectivamente según se compara con los controles (Tabla 1). Estos incrementos se observaron primero después de una dosis. Los pesos del músculo cuadríceps, como peso absoluto, aumentaron en los ratones a los que se administraron 60 y 3 mg/kg de ActRIIB-Fc (Tabla 3). Los músculos del gemelo interno, como peso absoluto, aumentaron en los ratones a los que se administraron 60 mg/kg de JAI 6 y 60 o 3 mg/kg de ActRIIB-Fc (Tabla 3). Como un porcentaje del peso corporal, los pesos del músculo cuadríceps aumentaron en los mismos tres grupos de tratamiento en comparación con los controles (Tabla 4). También, como un porcentaje del peso corporal, el peso del gemelo interno aumentó en los ratones tratados con 60 mg/kg de ActRIIB-Fc (Tabla 4).

Tabla 1: Pesos Corporales Finales * = Diferencia de Grupo a p = 0.05 en comparación a los controles ** = Diferencia de Grupo a p = 0.01 en comparación a los controles Tabla 4: Pesos de Órgano como Porcentaje del Peso Corporal * = Diferencia de Grupo a p = 0.05 en comparación a los controles ** = Diferencia de Grupo a p = 0.01 en comparación a los controles Ejemplo 9: Efecto Dependiente de la Dosis del ActRIIB-Fc en Masa Muscular Para investigar adicionalmente el efecto del ActRIIB-Fc en la masa muscular de ratones adultos se llevó a cabo un estudio con ratones hembra C57B6/SCED de siete semanas de edad (The Jackson Laboratory). Los ratones fueron pesados y distribuidos de manera uniforme con respecto al peso corporal en cuatro grupos de seis (6 ratones SCID, 6 ratones C57, y dos grupos de control de 6 ratones cada uno). Cada grupo recibió una inyección semanal intraperitoneal de 60 mg/kg de ActRIIB-Fc o regulador de PBS (vehículo de control) durante de una a cuatro semanas. En el día 28 del estudio, los animales fueron evaluados en cuanto a su masa muscular mediante la disección y el pesado del gemelo interno y el cuadríceps. Los resultados de este estudio indicaron que el ActRIIB-Fc inhibió de manera importante la actividad del GDF-8 in vivo resultando en masa muscular aumentada aún después de una sola administración de ActRIIB según se compara con el control de vehículo. Los pesos de músculo del cuadríceps, como peso absoluto, aumentaron tanto en los ratones C57 como SCID en 21% a 60% (Tabla 5). De manera similar, la masa del músculo del gemelo interno, como peso absoluto, aumentó en de 31 a 51% (Tabla 5).

Tabla 5: Aumento en Masa Muscular Después de 1 o Más Dosis de ActRIIB Ejemplo 10: Papel del GDF-8 in vivo en Hueso trabecular La inhibición del GDF-8 aumenta la masa muscular. La carga mecánica aumentada, ya sea debido a la actividad muscular aumentada o el peso muscular incrementado, está asociada con masa ósea y densidad ósea incrementadas. Por lo tanto, ratones a los que se les había suprimido (KO) el GDF-8 fueron evaluados en cuanto a la microarquitectura y masa ósea alterada. Una evaluación inicial de ratones adultos mostró que la densidad ósea en la espina vertebral de los ratones KO era casi el doble más alta que aquella de ratones de tipo silvestre. Este aumento excedió por mucho lo que se podría haber esperado que fuese solo debido a la masa muscular aumentada en los ratones a los que se les suprimió GDF-8.

La imageneologia por microtomografía de alta definición (µCT40), Scanco Medical Switzerland) se utilizó para evaluar la fracción de volumen óseo trabecular y la microarquitectura en la quinta vértebra lumbar y la femoral distal y en la geometría de hueso cortical en la diafisis media femoral de ratones KO y de tipo silvestre (WT) de GDF-8. Los especímenes fueron tomados de carnadas de control y KO de GDF-8 de 9-10 meses de edad (cuatro ratones de cada genotipo y sexo). El cuerpo vertebral completo y el fémur fueron escaneados usando tomografía computarízada a una resolución de 12 µ??. Regiones de interés abarcando el hueso trabecular del cuerpo vertebral o el hueso trabecular de la metafisis femoral distal (esto es, espojosa secundaria) fueron identificadas usando un algoritmo de modelado semi-automatizado. Los siguientes parámetros fueron computados usando evaluaciones directas en tres dimensiones: fracción de volumen de hueso (%), espesor trabecular (µ??), separación (µ??) y número (1/mm). Además, la densidad de conectividad, un indicador de que también está unida la red trabecular, se evaluó así como también los parámetros de hueso cortical en la región de la diafisis media en el fémur, incluyendo el área total, área de hueso, y espesor cortical. Tanto los ratones KO macho como los ratones KO hembra tuvieron densidad ósea trabecular dramáticamente incrementada en el cuerpo vertebral en comparación con los ratones WT (n=4, +93% y +70%, respectivamente, pO.0001). Esta densidad ósea trabecular incrementada se acompañó por un aumento del 14% en el espesor trabecular (p = 0.03), un aumento del 38% en el número trabecular (p = 0.0002), y una disminución del 10% en la separación trabecular ( p = 0.009). El efecto combinado de estos cambios en la arquitectura y la densidad resultó en un aumento de 3.4 y 1.7 veces en la conectividad en los ratones KO machos y hembras, respectivamente, en comparación con ratones WT (p<9.9991). Además, una medida gruesa del nivel de mineralización del hueso trabecular indicó que el contenido de minerales promedio de los trabéculos era 8% más alto en los ratones KO con relación a los controles (pO.001). Existe un indicio de que el efecto es más grande en ratones macho que en ratones hembra, pero el tamaño de la muestra es demasiado pequeña para sacar conclusiones definitivas. En la Tabla 6 se muestran las características del hueso trabecular vertebral evaluado mediante tomografía microcomputarizada de alta definición.

En contraste a las observaciones en la columna vertebral, los ratones KO machos y hembras tuvieron densidad ósea trabecular más baja en el fémur distal que los ratones WT (n = 4, p = 0.05 para un efecto de genotipo global) (Tabla 7). Esta disminución en la densidad ósea fue mucho más pronunciada en ratones KO hembra que en ratones KO macho. Los ratones KO de GDF-8 tuvieron espesor trabecular similar que sus iguales WT, pero tenían menos trabéculos y separación trabecular aumentada en comparación con ratones de control. Sin embargo, aunque el espesor cortical en la diálisis media femoral era similar en ratones KO de GDF-8 machos y en ratones de control, fue aproximadamente 10% mayor en los ratones hembra KO de GDF-8 que en ratones WT (n = 4, p = 0.04) (ver Tabla 8). No hubo diferencias en el área ósea cortical o fracción de área ósea entre los dos genotipos.

Tabla 6: Características de Hueso Trabecular Vertebral (Media ± SEM) Tabla 7: Características de Hueso Trabecular en Metafísis Femoral Distal (Media ± SEM) Tabla 8: Características de Hueso Cortical en la Diafísis Media Femoral (Media ± SEM) Machos WT Machos KO Hembras WT Hembras KO Área Ósea (mm2) 5.1 ± 1.8 2.9 ± 1.7 11.9 ± 7.0 5.4 ± 3.1 Espesor Cortical (µ?t?) 68 ± 1.2 68 ± 2.7 73 ± 7 63 ± 9 Área ósea/ Área Total (%) 353 ± 16 472 ± 90 296 ± 73 464 ± 98 Ejemplo 11: Tratamiento de Desórdenes Degenerativos de Músculo y Óseos Los inhibidores de GDF-8 tales como, por ejemplo, los polipéptidos de fusión de ActRIIB, son útiles para tratamientos dirigidos a masa muscular incrementada, y también para la prevención y tratamiento de la osteoporosis. Además la inhibición de la GDF-8 puede ser útil en otras instancias en donde se desea el efecto anabólico óseo, tal como el aumento en la curación del hueso (esto es, en la reparación de fracturas, fusión de la columna vertebral, etc.). Los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención son utilizados para tratar un sujeto en el surgimiento de une enfermedad o que tiene ya establecida una enfermedad degenerativa muscular u ósea. La eficacia del ActRIIB-Fc para el tratamiento de desórdenes óseos, por ejemplo, osteoporosis, se confirmó usando modelos bien establecidos de osteoporosis. Por ejemplo, ratones a los que se les extirparon los ovarios han sido utilizados para probar la eficacia de nuevos tratamientos con fármacos para la osteoporosis (Alexander et al, (2001) J. Bone Min. Res. 16: 1665-1673; y Anderson et al., (2001) J. Edocrinol. 170: 529-537). De manera similar a los seres humanos, estos roedores presentan una rápida pérdida de hueso enseguida a la extirpación de los ovarios, especialmente en hueso canceloso. Las evaluaciones resultantes están basadas en la densidad mineral ósea, marcadores bioquímicos de rotación ósea en suero y orina, fuerza ósea, e histología/ histomorfometría. En un estudio, ratones hembra normales y/o comprometidos inmunológicamente fueron sometidos a la extirpación de los ovarios a las 12-16 semanas de edad y se dejó que perdieran peso durante de cuatro a seis semanas. Enseguida al período de pérdida de hueso, se llevó a cabo el tratamiento con ActRIIB-Fc (inyección IP) o vehículo durante de una a seis semanas. El protocolo de tratamiento podía variar, con pruebas de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales, o quincenales). Se anticipaba que los ratones (o ratas) sin tratamiento y con ovarios extirpados perderían aproximadamente 10-30% de densidad ósea con relación a ratones macho intactos de la misma edad (esto es, sin ovarios extirpados). Se anticipaba que los ratones tratados con ActRIIB-Fc tendrían 10 a 50% más masa ósea y densidad ósea que aquellos ratones que recibieron tratamiento con vehículo, y más aún que este aumento en densidad ósea estaría asociado con fuerza ósea aumentada, particularmente en regiones con mayor proporción de hueso canceloso en comparación con hueso cortical.

El objetivo de otro estudio es el de determinar que el ActRIIB-Fc es efectivo en la prevención de la declinación de la masa ósea, microarquitectura y fortaleza asociadas con la deficiencia de estrógenos. De esta manera, el estudio tenia un diseño similar al uno que se describió anteriormente, excepto porque el tratamiento con anticuerpo de ActRIIB-Fc sería iniciado inmediatamente después de la extirpación de los ovarios, más que después del periodo de pérdida de hueso. Se anticipaba que los ratones tratados con ActRIIB-Fc perderían significativamente menos masa ósea después de la extirpación de los ovarios que los ratones tratados con vehículo. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB también son utilizados para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipa que los polipéptidos de fusión de ActRIIB serían administrados como una inyección subcutánea tan frecuentemente como una vez por día y de manera tan infrecuente como una vez por mes. La duración del tratamiento podría variar de desde un mes hasta varios años. Para probar la eficacia clínica del ActRIIB-Fc en humanos, se identificaron mujeres posmenopáusicas con baja masa ósea mediante pruebas de densidad ósea y se asignaron aleatoriamente a un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo de placebo y de uno a tres grupos recibieron anticuerpo (diferentes dosis). Los individuos fueron seguidos prospectivamente por de uno a tres años para evaluar los cambios en los marcadores bioquímicos de rotación ósea, cambios en densidad mineral ósea, y la ocurrencia de fracturas por fragilidad. Se anticipaba que los individuos que recibieron tratamiento presentarían un aumento en la densidad mineral ósea en el fémur proximal y la espina dorsal lumbar de 2-30% con relación a la base de referencia, y tendrían una incidencia disminuida de fracturas por fragilidad. Se anticipaba que los marcadores bioquímicos de la formación de hueso aumentarían. Los polipéptidos se administraron como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administró como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosis era preferiblemente de aproximadamente 1 µg/kg y 20 mg/kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y del avance de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se seleccionó por un médico clínico tratante, de los siguientes intervalos: 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 µg/kg a 10 mg/kg, 1 ug/kg a 1 mg/kg, 10 ug/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 µg kg, 100 µg/kg a 1 mg/kg, y 500 µg/kg a 1 mg/kg. En la Tabla 9 se resumen regímenes de tratamiento ejemplares, así como los resultados. Regímenes alternativos incluyen: (1) 1 x IC5o, o una dosis inicial de 40 µg/kg y 0.5 x IC50, o 20 µg kg, 2 semanas más tarde; (2) dosis inicial de 10 x IC50, y 5 x IC502 semanas más tarde; o 100 x IC50, y 50 x IC502 semanas más tarde.

Tabla 9: Ejemplos de Casos Clínicos Ejemplo 12: Tratamiento de Desórdenes Metabólicos Los inhibidores de GDF-8 tales como, por ejemplo, los polipéptidos de fusión de ActRIIB, son útiles para tratamientos de desórdenes metabólicos tales como la diabetes tipo 2, tolerancia dañada a la glucosa, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X), resistencia a la insulina inducida por traumas (por ejemplo, quemaduras o desbalance de nitrógeno), y desórdenes del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad). En los métodos de la invención, los polipéptidos de fusión de ActRIIB de la invención son utilizados para tratar un sujeto en el surgimiento de una enfermedad o que tiene establecida una enfermedad metabólica.

La eñcacia de los polipéptidos de fusión de ActRIIB para el tratamiento de desórdenes metabólicos, por ejemplo, diabetes tipo 2 y/u obesidad, se confirmó usando modelos bien establecidos de murino de obesidad, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2, incluyendo ob/ob, db/db y razas que portaban la mutación amarilla letal. La resistencia a la insulina también puede ser inducida mediante alimentación alta en grasa o en calorías de ciertas razas de ratones, incluyendo C57BL/6J. De manera similar a los seres humanos, estos roedores desarrollaron resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia y deterioro de la homeostasis de la glucosa resultando en hiperglucemia. Las evaluaciones resultantes están basadas en mediciones de suero de glucosa, insulina y lípidos. Las mediciones de sensibilidad mejorada a la insulina pueden ser determinadas por pruebas de resistencia a la insulina y pruebas de tolerancia a la glucosa. Las técnicas más sensibles incluirían el uso de pinzas euglicémicas-hiperínsulinémicas para evaluar mejoras en controles glucémicos y de sensibilidad a la insulina. Además, las técnicas de pinza permitirían una evaluación cuantitativa del papel de los tejidos de depósito de glucosa principales (músculo, adiposo, e hígado), en control glucémico mejorado. En un estudio, se llevó a cabo el tratamiento con un polipéptido de fusión de ActRIIB tal como el que se establece en la SEQ ID NO: 3 (inyección IP) o vehículo durante de una semana a seis meses. El protocolo de tratamiento podía variar, con pruebas de diferentes dosis y regímenes de tratamiento (por ejemplo, inyecciones diarias, semanales o quincenales). Se anticipaba que los ratones tratados con el polipéptido de fusión tendrían absorción de glucosa mayor, glucólisis incrementada y síntesis de glucógeno, ácidos grasos libres bajos y tríglicéridos en el suero, en comparación con ratones que recibían tratamiento con placebo. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB también son utilizados para prevenir y/o reducir la severidad y/o los síntomas de la enfermedad. Se anticipaba que los polipéptidos de fusión de ActRIIB serían administrados como una inyección subcutánea con tanta frecuencia como una vez por día y de manera tan poco frecuente como una vez por mes. La duración del tratamiento podría variar entre un mes y varios años. Para probar la eficacia clínica de los polipéptidos de fusión de ActRIIB en humanos, se identificaron sujetos que padecían o estaban en riesgo de diabetes tipo 2 y se asignaron aleatoriamente a un grupo de tratamiento. Los grupos de tratamiento incluyen un grupo de placebo y de uno a tres grupos recibieron polipéptidos de fusión de ActRIIB (diferentes dosis). Los individuos fueron seguidos prospectivamente por de 1 mes a 3 años para evaluar los cambios en el metabolismo de glucosa. Se anticipaba que los individuos que recibieron tratamiento presentarían una mejora. Los polipéptidos de fusión de ActRIIB se administraron como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición. Cuando se administró como el único compuesto activo o en combinación con otro compuesto o composición, la dosis era preferiblemente de aproximadamente 1 µg kg a 20 mg kg, dependiendo de la severidad de los síntomas y del avance de la enfermedad. La dosis efectiva apropiada se seleccionó por un médico clínico tratante, de los siguientes intervalos: 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 µg/kg a 10 mg/kg, 1 µg/kg a 1 mg/kg, 10 g/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 µg/kg, 100 µg/kg a 1 mg/kg, y 500 µg/kg a 1 mg/kg. En la Tabla 7 se resumen regímenes de tratamiento, así como los resultados. Tabla 7: Ejemplos de Casos Clínicos

Claims (43)

1. Reivindicaciones 1. Un método para el tratamiento o prevención de cuando menos un desorden degenerativo de músculo, hueso, u homeostasis de la glucosa, el cual comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica a un mamífero,
2. S en donde la composición comprende un polipéptido de fusión de ActRIIB que comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción Fe de un anticuerpo; y permitiendo que la composición inhiba la actividad del GDF-8. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el mamífero es un ser humano. 0
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere del tratamiento o prevención de un desorden seleccionado de cuando menos uno de un desorden muscular, desorden neuromuscular, y desorden degenerativo óseo.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es 5 administrada a un mamífero que requiere del tratamiento o prevención de un desorden seleccionado de cuando menos uno de distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne, atrofia muscular, atrofia de órgano, síndrome del túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, síndrome de emaciación muscular, y esclerosis lateral amiotrópica. 0
5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere de tratamiento o prevención de distrofia muscular de Duchenne.
6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere de tratamiento o prevención de un desorden 5 seleccionado de obesidad y desorden de tejido adiposo.
7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere de tratamiento o prevención de un desorden seleccionado de síndrome X, tolerancia dañada a la glucosa, resistencia a la insulina inducida por trauma, y diabetes tipo 2.
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere de tratamiento o prevención de cuando menos una de diabetes tipo 2 y obesidad.
9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere de tratamiento o prevención de un desorden seleccionado de cuando menos una de osteoartritis y osteoporosis.
10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica es administrada a un mamífero que requiere de la reparación de músculo dañado.
11. 11. El método de la reivindicación 9, en donde el músculo dañado es músculo del miocardio o del diafragma.
12. 12. El método de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de fusión de ActRIIB es administrado a una cantidad efectiva seleccionada de 1 µg kg a 20 mg/kg, 1 µg a 10 mg/kg, 1 ug/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 g/kg, 100 µg kg a 1 mg/kg, y 500 µg/kg a 1 mg/kg.
13. 13. El método de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de fusión de ActRIIB comprende los aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO: 3.
14. 14. El método de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de fusión de ActRIIB comprende los aminoácidos 19 a 144 de la SEQ ID NO: 1.
15. 15. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de fusión de ActRIIB comprende una secuencia seleccionada de (a) el fragmento Fe de IgG, (b) el fragmento Fe de IgGi, (c) el fragmento Fe de IgG4, y (d) los aminoácidos 148 a 378 de la SEQ ID NO: 3.
16. 16. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia del polipéptido de fusión de ActRIIB se establece en la SEQ ID NO: 3.
17. 17. El método de la reivindicación 1, en donde la vida media en circulación de los polipéptidos de fusión de ActRIIB sobrepasa los 5 días.
18. 18. Una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
19. 19. Un ácido nucleico asilado que codifica para la proteina de fusión de la reivindicación 18.
20. 20. El ácido nucleico de la reivindicación 19, en donde dicho ácido nucleico se establece en la SEQ ID NO: 4.
21. 21. Un vector de expresión, el cual comprende el ácido nucleico de la reivindicación 19.
22. 22. Una célula hospedera que comprende el vector de la reivindicación 21.
23. 23. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión es codiñcada por un ácido nucleico que híbrida la secuencia de la SEQ ID NO: 4 bajo condiciones de hibridación astringentes.
24. 24. Un método para la identificación de inhibidores del GDF-8, el cual comprende las etapas de: (a) preparar una primera mezcla de unión que comprende el polipéptido de fusión de ActRIIB de la reivindicación 18 y GDF-8; (b) medir la cantidad de la unión entre el polipéptido de fusión de ActRIIB y el GDF-8 en la primera mezcla; (c) preparar una segunda mezcla de unión que comprende el polipéptido de fusión de ActRIIB, el GDF-8, un compuesto de prueba; y (d) medir la cantidad de la unión entre el polipéptido de fusión de ActRIIB y el GDF-8 en la segunda mezcla de unión.
25. 25. Un método para inhibir la actividad del GDF-8, el cual comprende la puesta en contacto del GDF-8 con una composición, en donde la composición comprende un polipéptido de fusión de ActRIIB que comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción Fe de un anticuerpo, y permitiendo que la composición inhiba la actividad del GDF-8.
26. 26. Un método para aumentar la fuerza muscular, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de fusión de ActRIIB a un mamífero, por medio de lo cual se aumenta la fuerza muscular, en donde el polipéptido de fusión de ActRIIB comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción Fe de un anticuerpo.
27. 27. Un método para aumentar la densidad ósea trabecular, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de fusión de S ActRIIB a un mamífero, por medio de lo cual se aumenta la densidad ósea trabecular, en donde el polipéptido de fusión de ActRIIB comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción Fe de un anticuerpo.
28. 28. Un método para aumentar la tolerancia a la glucosa, el cual comprende la 0 administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de fusión de ActRIIB a un mamífero, por medio de lo cual se aumenta la tolerancia a la glucosa, en donde el polipéptido de fusión de ActRIIB comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción Fe de un anticuerpo. 5
29. 29. El uso de un polipéptido de fusión de ActRIIB para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de cuando menos un desorden muscular, óseo o de homeostasis de glucosa en un mamífero, en donde el polipéptido de fusión de ActRIIB comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción 0 Fe de un anticuerpo.
30. 30. El uso de la reivindicación 29, en donde el mamífero es un ser humano.
31. 31. El uso de la reivindicación 29, en donde el desorden es un desorden neuromuscular.
32. 32. El uso de la reivindicación 29, en donde el desorden es distrofia muscular, 5 distrofia muscular de Duchenne, atrofia muscular, atrofia de órgano, síndrome del túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, síndrome de emaciación muscular, o esclerosis lateral amiotrópica.
33. 33. El uso de la reivindicación 29, en donde el desorden es obesidad o un desorden de tejido adiposo.
34. 34. El uso de la reivindicación 29, en donde el desorden es síndrome X, tolerancia dañada a la glucosa, resistencia a la insulina inducida por trauma, o diabetes tipo 2.
35. 35. El uso de la reivindicación 29, en donde el desorden es osteoartritis u osteoporosis.
36. 36. El uso de un polipéptido de fusión de ActRIIB para la preparación de un medicamento para cuando menos uno de: (a) reparación de daño muscular, (b) aumento de fuerza muscular, (c) aumento de la densidad ósea trabecular, y (d) aumento de la tolerancia a la glucosa, en donde el polipéptido de fusión de ActRIIB comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos derivada del dominio extracelular de ActRIIB y (b) una segunda secuencia de aminoácidos derivada de la porción Fe de un anticuerpo.
37. 37. El uso de la reivindicación 36, en donde el músculo dañado de (a) es músculo del miocardio o diafragma.
38. 38. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde el polipéptido de fusión de ActRIIB es administrado al mamífero a una dosis efectiva seleccionada de 1 µg/kg a 20 mg kg, 1 g a 10 mg/kg, 1 µg kg a 1 mg kg, 10 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 µg kg, 100 µg kg a 1 mg/kg, y 500 µg/kg a 1 mg/kg.
39. 39. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión de ActRIIB comprende los aminoácidos 23 a 138 de la SEQ ID NO: 3.
40. 40. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde la primera secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión de ActRIIB comprende los aminoácidos 19 a 144 de la SEQ ID NO: 1.
41. 41. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde la segunda secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión de ActRIIB comprende (a) el fragmento Fe de IgG, (b) el fragmento Fe de IgGi, (c) el fragmento Fe de IgG4, o (d) los aminoácidos 148 a 378 de la SEQ ID NO: 3.
42. 42. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión de ActRIIB es (a) como se establece en la SEQ ID NO: 3, o (b) codificada por un ácido nucleico que híbrida la secuencia de la SEQ ID NO: 4 bajo condiciones de hibridación astringentes.
43. 43. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde la vida media en circulación del polipéptido de fusión de ActRIIB sobrepasa los 5 días.