KR20130132824A - Actriia 결합제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

요약
본 개시는 기타 측면 중에서, ActRIIA에 결합하는 항체 및 이의 부분을 중화시키는 단계 그리고 상기 항체 및 이의 부분에 대한 용도를 포함한다.

Description

ACTRIIA 결합제 및 이의 용도{ACTRIIA BINDING AGENTS AND USES THEREOF}

관련된 출원

본 출원은 2010년 11월 8일에 제출된 미국 가출원 일련번호 제61/411,396호의 이익을 주장한다. 상기-언급된 출원의 모든 교시는 참조로서 본 명세서에 편입된다.

본 발명의 배경기술

액티빈 수용체, 유형 II A (ActRIIA 또는 ACVR2A)는 액티빈 단백질 그리고 TGF-베타 수퍼패밀리의 기타 구성원에 대한 고친화성 수용체이다. ActRIIA는 하나 이상의 SMAD 전사 인자, 특히 SMAD1, 2, 3 및 5의 인산화를 야기하는 신호를 변환시키는 것으로 일반적으로 생각된다. ActRIIA는 뼈 형성, 근육 형성, 적혈구 세포 형성, 종양 성장, 면역 기능 및 FSH와 같은 생식 호르몬의 생성을 포함하여, 광범위한 생물학적 과정의 조절을 시사하였다.

여포-자극 호르몬 (Follicle-stimulating hormone, FSH)은 뇌하수체 전엽에 의해 생성되고 생식세포의 발생 및 성숙을 포함하여, 생식선 기능을 조절한다. 뇌하수체로부터의 FSH 분비는 뇌하수체에서 기원하는 생식 호르몬 및 측분비(paracrine) 효과기와 협력하여 뇌로부터의 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)에 의해 조절된다. 액티빈은 뇌하수체 생식선자극으로부터의 FSH 분비를 증가시키는 이의 능력에 의해 독창적으로 식별되었고, 그리고 액티빈 수용체 유형 IIA (ActRIIA)를 통하여 부분적으로, 액티빈-매개 신호전달은 다수의 조절 수준에서의 작용을 통하여 FSH 분비를 촉진하는 것으로 현재 간주된다 (Gregory et al., 2004, Semin Reprod Med 22:253-267).

FSH 방출은 여성에서의 배란 및 남성에서의 정자 성숙을 위해 필수적이다. 여성에서, FSH는 난소에서 여포 과립막 세포 증식을 자극하고 여포 성숙 및 배란에 필수적인 호르몬인, 에스트로겐(estrogen)의 합성에 영향을 준다. 남성에서, FSH는 정자 세포의 성숙에 관여한다. 더욱 특정하게, 남성에서의 FSH 작용은 호르몬의 인식된 표적이며 정자 성숙 (정자 형성(spermatogenesis))의 과정을 지원하는 세르톨리 세포(Sertoli cell)에서 지시된다. 또한 FSH는 세포 성장의 중요한 매개자인 전립선에서도 생성된다.

이에 따라, FSH 방출의 저해제는 남성 및 여성 둘 모두에서 피임제로서 유용하다.

생식력에서의 기능에 더하여, FSH는 또한 여러 가지 질병 상태에서도 역할을 한다. 증가된 수준의 FSH 수용체은 호르몬-불감성 전립선 암과 연관된 가장 높은 수준을 갖는, 전립선 암과 연관된다. 전립선 암은 미국 남성에게서 가장 일반적인 암으로, 200,000 초과의 새로운 사례가 매년 진단되고, 2010년 동안 전립선 암으로 인해 대략적으로 30,000명이 사망한 것으로 추정된다 (Jemal A. et al. Cancer statistics, 2010. CA Cancer J Clin 60:277-300, 2010). 수술 또는 방사선 치료로 치료된 개체 중 대략적으로 40%에서 전립선 암이 재발할 것이다 (Walsh P C, Retik A B, Vaughan E D, eds. Campbell's Urology. 7th ed. Philadelphia, Pa.: WB Saunders Company; 1998). 재발한 전립선 암을 위한 가장 일반적인 치료는 고환적출술을 통한 고환의 테스토스테론의 억제, 에스트로겐 치료, 항안드로겐 투여, 및/또는 GnRH 작동/길항 치료이다. 주로 이는 2-3년 동안 차도를 보이며, 이의 시간 후 전립선 암은 거세 수준까지의 혈중 안드로겐 농도의 감소에도 불구하고 성장하는 능력이 발달하는 것을 의미하는, "호르몬 불감성"이 된다. 결과적으로, 전립선 암, 특히 호르몬-불감성 전립선 암을 치료하기 위해 개선된 조성물 및 방법이 필요시된다.

뇌하수체 종양 (선종)은 종양의 특정 위치에 따라서, 상이한 호르몬-생성 영역에 전형적으로 영향을 주는 비-암 종양이다. 뇌하수체 종양은 약 15%의 두개내 종양의 원인이며, 그리고 국부적 응축성 영향, 호르몬 과분비, 또는 치료-연관 내분비성 결핍증에서 기인하는 상당한 이환율(morbidity)과 연관된다 (Heaney A. P., et al.: Molecular Pathogenesis of Pituitary Tumors. In: Oxford Textbook of Endocrinology, Wass J. A. H. and Shalet S. M., (Eds.), Oxford University Press, Oxford, 2002). 대부분의 뇌하수체 선종은 양성이며 비교적 천천히 커진다. 하지만, 뇌하수체 종양은 하나 이상의 뇌하수체 호르몬의 과생성을 야기할 수 있다. FSH-분비 뇌하수체 종양은 다낭성 난소의 발달 및 상승된 에스트라디올(estradiol) 수준을 종종 야기한다. 결과적으로, 에스트라디올 수준에서의 증가는 자궁내막 암 및 전립선 암을 포함하여 건강상 위험에 기여한다. 결과적으로, FSH-분비 뇌하수체 종양과 연관된 증상을 치료하기 위해 개선된 조성물 및 방법이 필요시된다.

FSH 신호전달 경로는 다양한 종양 유형에서 종양 혈관신생과 연관되었다. Radu A, et al. N Engl J Med. 2010 Oct 21;363(17):1621-30. 이에 따라, FSH 분비를 저해하는 화합물은 다양한 치료에서 유용하다.

부분적으로, 본 개시는 FSH 생성을 저해하는 데에 사용될 수 있는 ActRIIA의 길항제(antagonist) 그리고 기타 용도를 제공한다.

본 발명의 요약

본 개시는 기타 측면 중에서, ActRIIA에 결합하고 ActRIIA- 또는 액티빈-매개 신호전달을 저해하는 항체 및 이의 단편을 제공한다. 이러한 단백질에 대한 다양한 용도가 본 명세서에 설명된다. 예를 들어, 항체는 근육 손실 또는 손상으로 특징되는 질병 또는 질환을 가진 환자에서 근육 질량 또는 제지방 체중을 증가시키는 데에, 병든 환자에서 FSH를 감소시키는 데에, 악액질, 특히 암 악액질을 치료하는 데에, 지방과다를 감소시켜 비만과 같은 장애를 치료하는 데에, 그리고 공지된 및 신규한 ActRIIA-결합제를 식별하기 위한 분석의 일부로서 사용될 수 있다.

본 개시는 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하나 이상의 ActRIIA 리간드, 가령 액티빈 A, 액티빈 B, GDF11, 미오스타틴, BMP7 및/또는 기타 공지된 ActRIIA 리간드의 결합을 임의로 저해하는 결합제, 가령 항체에 관한 것이다. 결합제는 ActRIIA와의 본 명세서에서 개시된 적어도 하나의 항체의 결합을 교차-차단하는 및/또는 상기 항체 중 적어도 하나에 의해 ActRIIA 결합으로부터 교차-차단되는 이들의 능력으로 특징될 수 있다. 특정한 구체예에서, 항-ActRIIA 항체 또는 이의 단편은 시험관내 세포주에서 ActRIIA-매개 신호전달을 저해할 수 있다. ActRIIA-매개 신호전달은 예를 들어, 항-ActRIIA 항체의 존재에서 ActRIIA 리간드 (가령, 액티빈 A, 액티빈 B, 미오스타틴 또는 GDF-11)와 ActRIIA를 발현하는 세포를 접촉시킴으로써 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 결합제 가령 중화 항체 또는 이의 단편은 리간드 결합에 중요한 다수의 잔기에서 ActRIIA의 세포외 도메인에 동시에 접촉시킴으로써 하나 이상의 ActRIIA 리간드와의 ActRIIA의 결합을 저해할 수 있다. 부분적으로, 본 개시는 하기로 구성된 그룹에서 선택된, 인간 ActRIIA의 세포외 도메인내 하나 이상의 아미노산을 접촉시키는 결합제, 가령 항체 및 이의 단편에 관한 것이다: (a) 서열번호: 16의 위치 13에 있는 페닐알라닌, (b) 서열번호: 16의 위치 14에 있는 페닐알라닌, (c) 서열번호: 16의 위치 15에 있는 아스파라긴, (d) 서열번호: 16의 위치 17에 있는 아스파라긴, (e) 서열번호: 16의 위치 21에 있는 아스파르테이트, (f) 서열번호: 16의 위치 22에 있는 아르기닌, (g) 서열번호: 16의 위치 23에 있는 트레오닌, (h) 서열번호: 16의 위치 29에 있는 글루타메이트, (i) 서열번호: 16의 위치 30에 있는 프롤린, (j) 서열번호: 16의 위치 31에 있는 시스테인, (k) 서열번호: 16의 위치 32에 있는 타이로신, (l) 서열번호: 16의 위치 33에 있는 글리신, (m) 서열번호: 16의 위치 34에 있는 아스파르테이트, (n) 서열번호: 16의 위치 36에 있는 아스파르테이트, (o) 서열번호: 16의 위치 37에 있는 리신, (p) 서열번호: 16의 위치 39에 있는 아르기닌, (q) 서열번호: 16의 위치 40에 있는 히스티딘, (r) 서열번호: 16의 위치 42에 있는 페닐알라닌, (s) 서열번호: 16의 위치 44에 있는 트레오닌, (t) 서열번호: 16의 위치 46에 있는 리신, (u) 서열번호: 16의 위치 55에 있는 발린, (v) 서열번호: 16의 위치 56에 있는 리신, (w) 서열번호: 16의 위치 57에 있는 글루타민, (x) 서열번호: 16의 위치 58에 있는 글리신, (y) 서열번호: 16의 위치 59에 있는 시스테인, (z) 서열번호: 16의 위치 60에 있는 트립토판, (aa) 서열번호: 16의 위치 61에 있는 류신, (bb) 서열번호: 16의 위치 62에 있는 아스파르테이트, (cc) 서열번호: 16의 위치 63에 있는 아스파르테이트, (dd) 서열번호: 16의 위치 64에 있는 이소류신, (ee) 서열번호: 16의 위치 65에 있는 아스파라긴, (ff) 서열번호: 16의 위치 66에 있는 시스테인, (gg) 서열번호: 16의 위치 76에 있는 리신, (hh) 서열번호: 16의 위치 80에 있는 글루타메이트, (ii) 서열번호: 16의 위치 81에 있는 발린, (jj) 서열번호: 16의 위치 83에 있는 페닐알라닌, 및 (kk) 서열번호: 16의 위치 85에 있는 시스테인.

ActRIIA-결합 항체, 또는 이의 단편내 다수의 잔기는 ActRIIA 신호전달을 중화시키는 목적을 위해 ActRIIA의 세포외 도메인내 영역을 접촉시키는 데에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 예증된 바와 같이, VH내 고보존 잔기는 가변적인 잔기를 나타내기 위한 기준점(reference point)으로서 기여할 수 있는 두 개의 시스테인을 포함한다. 특정 측면에서, 본 개시는 하기로 구성된 VH 잔기의 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결합제, 가령 항체 및 이의 단편에 관한 것이다: (a) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 -20에 있는 발린, (b) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +4에 있는 글리신, (c) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +5에 있는 타이로신, (d) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +9에 있는 세린, (e) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +10에 있는 글리신, (f) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +11에 있는 타이로신, (g) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +12에 있는 타이로신, (h) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +32에 있는 타이로신, (i) 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +37에 있는 아스파라긴, (j) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +4에 있는 알라닌, (k) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +5에 있는 타이로신, (l) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +6에 있는 아르기닌, (m) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +7에 있는 아스파라긴, (n) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +8에 있는 아스파르테이트, (o) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +10에 있는 아르기닌, (p) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +12에 있는 알라닌, (q) 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +13에 있는 타이로신; 및 (r) 전술한 것 중 어느 하나의 보존적 치환.

또한 VL내 고보존 잔기도 가변적인 잔기를 나타내기 위한 기준점으로서 기여할 수 있는 두 개의 시스테인을 포함한다. 특정 측면에서, 본 개시는 하기로 구성된 VL 잔기의 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결합제에 관한 것이다: (a) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +5에 있는 아스파르테이트, (b) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +7에 있는 세린, (c) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +9에 있는 아스파라긴, (d) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +10에 있는 페닐알라닌, (e) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +27에 있는 타이로신, (f) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +28에 있는 페닐알라닌, (g) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +30에 있는 세린, (h) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +31에 있는 아르기닌, (i) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +32에 있는 류신, (j) 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +34에 있는 세린, (k) 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 -21에 있는 세린, (l) 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +3에 있는 글리신, (m) 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +4에 있는 아스파라긴, (n) 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +5에 있는 트레오닌, (o) 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +6에 있는 류신, (p) 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +8에 있는 트립토판, 및 (q) 전술한 것 중 어느 하나의 보존적 치환.

ActRIIA에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9에서 선택된 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는, 이로 구성된, 또는 이로 본질적으로 구성된 결합제, 가령 항체 및 이의 단편, 그리고 전술한 것 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드가 본 명세서에서 제공된다. ActRIIA에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터의 적어도 두 개의 CDR 서열을 포함하는, 이로 구성된, 또는 이로 본질적으로 구성된 결합제, 가령 항체 및 이의 단편, 그리고 전술한 것 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드가 본 명세서에서 또한 제공된다. 또 다른 구체예에서, ActRIIA에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터의 적어도 세 개의 CDR 서열을 포함하는, 이로 구성된, 또는 이로 본질적으로 구성된 결합제, 가령 항체 및 이의 단편, 그리고 전술한 것 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 구체예는 ActRIIA에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터의 적어도 네 개의 CDR 서열을 포함하는, 이로 구성된, 또는 이로 본질적으로 구성된 결합제, 가령 항체 및 이의 단편, 그리고 전술한 것 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 구체예는 ActRIIA에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터의 적어도 다섯 개의 CDR 서열을 포함하는, 이로 구성된, 또는 이로 본질적으로 구성된 결합제, 가령 항체 및 이의 단편, 그리고 전술한 것 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 구체예서, ActRIIA에 특이적으로 결합하고 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터의 적어도 여섯 개의 CDR 서열을 포함하는, 이로 구성된, 또는 이로 본질적으로 구성된 결합제, 가령 항체 및 이의 단편, 그리고 전술한 것 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드가 제공된다.

추가로 본 개시는 CDR 세개, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 결합제, 가령 항체 및 이의 단편에 관한 것이며, 여기서 CDR-H1은 서열번호: 4와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호: 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 그리고 CDR-H3은 서열번호: 6과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

특정한 구체예에서, 본 개시는 서열번호: 12와 적어도 80% 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함한 중쇄를 포함하는 결합제, 가령 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 13과 적어도 80% 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함한 경쇄를 포함하는 결합제, 가령 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함한 결합제, 가령 항체 및 이의 단편에 관한 것이며, 여기서 중쇄는 서열번호: 12와 적어도 80% 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함하고 경쇄는 서열번호: 13과 적어도 80% 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 개시는 ActRIIA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 발생시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 생존가능한, 동형의 ActRIIA-결핍 쥐를 ActRIIA로부터 유래된 항원 폴리펩티드로 면역화하는 단계를 포함한다.

추가로 본 발명은 암, 상승된 FSH, 및 불충분한 제지방 체중, 또는 비만을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 바람직하지 않은 ActRIIA- 또는 액티빈-매개 신호전달을 갖는 환자에서의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 ActRIIA 결합제, 가령 항체 또는 이의 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

특정 측면에서, 본 개시는 ActRIIA-연관 질환, 가령 신경근 장애 (가령, 근이영양증 및 근위축증), 울혈성 폐쇄성 폐질환 또는 폐기종 (및 근육 소모와 연관됨), 근육 소모 증후군, 근육감소증, 악액질, 지방 조직 장애 (가령, 비만), 제 2형 당뇨병, 및 골 퇴행성 질병 (가령, 골다공증)을 치료할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 ActRIIA-결합제는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 기존의 암 요법과 조합하여, 전립선 암에서 FSH를 감소시키거나, 또는 암 악액질에서 근육을 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 이에 따라, ActRIIA와 결합하는 항체 및 이의 단편은 병든 환자의 전립선 암 또는 암 악액질의 치료, 예방, 또는 관리를 위한 조합 요법에서 사용될 수 있다. 실시예에서 나타난 바와 같이, ActRIIA를 결합시키는, 액티빈 A 및/또는 액티빈 B를 저해하는 항체는 FSH 수준을 감소시키고, 근육을 증가시키고, 지방을 감소시키고 그리고 악액질을 완화시키는 데에 생체 내에서 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 ActRIIA 결합제, 가령 항체 또는 이의 단편을 포함한 제약학적 조성물을 제공하며, 여기서 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체 중 하나 이상이 있을 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 항체 또는 이의 단편은 FC, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 또는 트랜스페린 중 적어도 하나와 접합될 수 있다.

본 발명의 이들 및 기타 측면은 다음 상세한 설명 및 첨부된 도면에 대한 참조에 따라 명확해질 것이다. 본 명세서에서 개시된 모든 참조문헌은 각각이 개별적으로 편입된 것처럼 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 Ab-14E1 (서열번호: 12)의 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열을 도시한다. 하이라이트 표시된 두 개의 아미노산이 포함되어 J 단편 (밑줄 친)을 완성할 수 있다.

도2는 Ab-14E1 (서열번호: 13)의 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 도시한다.

도 3은 Ab-14E1 (서열번호: 14)의 VH를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 하이라이트 표시된 여섯 개의 뉴클레오티드가 포함되어 J 단편을 완성할 수 있다. 두 개의 대안적인, 활성 N-말단 서열이 "최초(original)" 및 "최종(final)"으로서 나타난다.

도 4는 Ab-14E1 (서열번호: 15)의 VL을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 도시한다.

도 5는 x-선 결정학 분석에 의해 결정된 바와 같이, 고-친화성 결합으로 인간 ActRIIA 세포외 도메인 (ECD)을 접촉시키는 14E1 Fab VH 서열내 특이성-결정 잔기(specificity-determining residue) (별표시와 함께, 하이라이트 표시된, SDR)를 도시한다. VH내 두 개의 시스테인에 넘버링되어 있고, CDR 서열에 밑줄이 쳐져있다.

도 6은 인간 ActRIIA ECD (서열번호: 16)의 아미노산 서열을 도시하며 결정학 분석에 의해 결정된 바와 같이, 고-친화성 결합으로 14E1 Fab VH에 의해 접촉된 잔기 (별표시와 함께, 하이라이트 표시됨)를 식별한다.

도 7은 결정학 분석에 의해 결정된 바와 같이, 고-친화성 결합으로 인간 ActRIIA ECD를 접촉시키는 14E1 Fab VL 서열내 특이성-결정 잔기 (별표시와 함께, 하이라이트 표시된, SDR)를 도시한다. VL내 두 개의 시스테인에 넘버링되어 있고, CDR 서열에 밑줄이 쳐져있다.

도 8은 인간 ActRIIA ECD의 아미노산 서열을 도시하며 결정학 분석에 의해 결정된 바와 같이, 고-친화성 결합으로 14E1 Fab VL에 의해 접촉된 잔기 (별표시와 함께, 하이라이트 표시됨)를 식별한다.

도 9는 BIACORE™-기반 분석에 의해 결정된 바와 같이 Ab-14E1에 결합한 ActRIIA-Fc의 동역학을 도시한다. A. Ab-14E1은 공유결합으로 고정화된 항-mFC IgG로 칩(chip) 상에 포획되었고 그 다음 상이한 농도에서 ActRIIA-Fc에 노출되었다. B. 비선형 회귀에 의한 분석은 계산되는 해리도 상수 (k_d, 10^-6 초^-1)가 정확하게 측정되기에는 너무 느렸기 때문에 근사치인, 12 pM의 K_D로 산출하였다. RU, 상대적 유닛(relative unit)

도 10은 상이한 ActRIIA 리간드와의 ActRIIA-Fc의 결합을 차단하는 Ab-14E1의 능력을 도시한다. A. BIACORE™-기반 측정에서, ActRIIA-Fc는 포획된 Ab-14E1에 결합하도록 우선 허용되었고 그 다음 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, BMP-10, GDF-3, GDF-8, 또는 GDF-11 (각각 20 nM에서)에 노출되었다. B. 거의 평탄한 반응 프로파일로 명시된 바와 같이, ActRIIA-Fc와의 이들 리간드의 결합은 Ab-14E1에 의해 대부분 완전하게 저해되었다.

도 11은 상이한 ActRIIA 리간드와의 ActRIIA-Fc의 결합을 차단하는 Ab-14E1의 능력을 입증하기 위한 역상 단백질 입체형태(reversed protein configuration)의 용도를 도시한다. A. BIACORE™-기반 측정에서, 포획된 ActRIIA-Fc는 Ab-14E1를 결합시키도록 허용되었고 그 다음 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, BMP-10, GDF-3, GDF-8, 또는 GDF-11 (각각 20 nM에서)에 노출되었다. B. 도 10에서와 같이, ActRIIA-Fc와의 리간드 결합은 Ab-14E1에 의해 대부분 완전하게 저해되었다.

도 12는 Ab-14E1과의 ActRIIA-Fc의 결합을 경쟁적으로 저해하는 ActRIIA 리간드의 능력을 도시한다. A. BIACORE™-기반 측정에서, 포획된 Ab-14E1은 여러 가지 농도의 주어진 리간드 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, BMP-10, 또는 GDF-11)로 사전혼합된 고정된 농도의ActRIIA-Fc(50 nM)를 함유한 용액에 노출되었다. B. 검사된 가장 높은 농도 (100 nM)에서 액티빈 A (나타남) 및 BMP-10은 Ab-14E1과의 ActRIIA-Fc의 결합을 95% 저해한 반면에, 이 농도에서 기타 리간드는 더 낮은 정도의 저해를 나타내었다.

도 13은 세포-기반 분석에서 액티빈 A-매개 신호전달을 중화시키는 Ab-14E1 의 능력을 도시한다. A204 세포에서, 보고 유전자 발현에서의 액티빈 A의 효과가 주로 ActRIIA에 의해 매개되는 경우, Ab-14E1은 57.1 ng/ml의 IC₅₀의 농도-의존 방식으로 액티빈 A-자극 유전자 발현을 저해하였다.

도 14는 난소적출된 (OVX) 또는 모의-수술된 쥐에서 여포-자극 호르몬 (FSH)의 혈청 수준 상의 Ab-14E1의 효과를 도시한다. 평균 ± SEM; **, OVX + 비히클에 비해 p < 0.01. Ab-14E1을 이용한 처리는 OVX 쥐에서 FSH 수준을 50% 초과 감소시켰다.

도 15는 암 악액질-유사 증후군에 굴복한 인히빈(inhibin)-결핍 수컷 쥐의 체중에서 Ab-14E1의 효과를 도시한다. 투여 및 무게 측정의 병행은 0일에 시작하였고 동물이 사망할 때까지 계속 하였다; 80일 동안의 결과가 나타난다. Ab-14E1을 이용한 처리는 비히클과 비교하여 향상된 무게 프로파일에 의해 증명된 바와 같은 종양-의존 악액질을 완화시켰다.

도 16은 정상 쥐의 체중 증가에서 Ab-14E1의 효과를 도시한다. *, 상응하는 연구일에서 비히클에 비해 p < 0.05. 대조군과 비교하여, Ab-14E1로 처리된 쥐는 연구 과정 내내 상당히 더 큰 무게 증가를 나타내었다.

도 17은 전신 NMR에 의해 측정된 바와 같은 연구 종점에서의 정상 쥐 제지방 질량에서 Ab-14E1의 효과를 도시한다. ***, 비히클에 비해 p < 0.001. 처리 4주 후, Ab-14E1로 처리된 쥐는 대조군에 비해 제지방 질량을 두 배보다 더 많이 늘렸다.

본 발명의 상세한 설명

1. 개요

형질전환 성장인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리는 일반적인 서열 요소 및 구조적 모티프(motif)를 공유하는 다양한 성장인자를 함유한다. 이들 단백질은 척추동물 및 무척추동물 둘 모두에서 매우 다양한 세포 유형에 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 알려져있다. 슈퍼패밀리의 구성원은 배아발달 동안 패턴 형성 및 조직 규격에서 중요한 기능을 수행하고 지방생성, 근육생성, 연골형성, 심장발생, 조혈, 신경발생, 및 상피세포 분화를 포함하여, 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다. TGF-베타 패밀리의 구성원의 활성도를 조작함으로써, 유기체에서 상당한 생리학적 변화를 일으키는 것이 종종 가능하다. 예를 들어, 피에드몬테세(Piedmontese) 및 벨기에 블루(Belgian Blue) 소 품종은 GDF8 (마이오스타틴이라고도 불림) 유전자에서 기능소실 돌연변이(loss-of-function mutation)를 수반하며, 상기 돌연변이는 근육 질량에서 뚜렷한 증가를 야기한다. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. 추가적으로, 인간에서, GDF8의 불활성 대립형질은 증가된 근육 질량 및, 전하는 바에 따르면, 이례적인 힘과 연관된다. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.

액티빈은 TGF-베타 슈퍼패밀리에 속하는 이합체 폴립펩티드 성장 인자이다. 액티빈에는 밀접하게 연관된 두 개의 β 서브유닛 (β_Aβ_A, β_Bβ_B, 및 β_Aβ_B)의 호모/헤테로이합체인 세 가지 주요한 액티빈 형태 (A, B, 및 AB)가 있다. 또한 인간 게놈은 간에서 우선적으로 발현되는 액티빈 C 및 액티빈 E를 인코딩한다. TGF-베타 슈퍼패밀리에서, 액티빈은 난소 세포 및 태반 세포에서 호르몬 생성을 자극하고, 뉴런세포의 생존을 지원하고, 세포 유형에 따라 양성적으로 또는 음성적으로 세포-주기 과정에 영향을 주고, 그리고 양서류 배아에서 적어도 중배엽 분화를 유도할 수 있는 유일무이하고 다기능적인 인자이다 (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. 55:953-963). 게다가, 자극된 인간 단구성 백혈병 세포로부터 단리된 적혈구 분화 인자 (erythroid differentiation factor, EDF)는 액티빈 A와 동일한 것으로 밝혀졌다 (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). 액티빈 A가 골수에서 적혈구 생성의 천연, 양성 조절자로서 작용한다는 것이 제시되었다. 여러 가지 조직에서, 액티빈 신호전달은 이의 관련된 헤테로이합체인, 인히빈에 의해 길항작용된다. 예를 들어, 뇌하수체로부터 여포-자극 호르몬 (FSH)의 방출 동안에, 액티빈은 FSH 분비 및 합성을 촉진하는 반면에, 인히빈은 FSH 분비 및 합성을 방지한다. 액티빈 생물활성도를 조절 및/또는 액티빈에 결합할 수 있는 기타 단백질은 폴리스타틴 (follistatin (FS)), 폴리스타틴-관련 단백질 (FSRP), α₂-마크로글로불린(macroglobulin), 세르베러스(Cerberus), 및 엔도글린(endoglin)을 포함한다.

액티빈 신호는 리간드 자극으로 다운스트림(downstream) Smad 단백질을 인산화하고 활성화하는 유형 I 및 유형 II 세린/ 트레오닌 키나아제 수용체의 이형 복합체에 의해 매개된다 (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178). 이들 유형 I 및 유형 II 수용체는 막관통 단백질이며, 이는 시스테인-풍부 영역을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 예상되는 세린/트레오닌 특이성을 가진 세포질 도메인으로 구성된다. 유형 I 수용체는 신호전달을 위해 필수적이며; 그리고 유형 II 수용체는 리간드 결합을 위해 그리고 유형 I 수용체의 발현을 위해 요구된다. 유형 I 및 II 액티빈 수용체는 리간드 결합 후 안정한 복합체를 형성하며, 이는 유형 II 수용체에 의한 유형 I의 인산화를 야기한다.

유형 II 수용체와 관련된 두 가지, ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈 A, B, AB, C 및 E를 위한 유형 II 수용체로서 식별되었다 (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). 액티빈 외에도, ActRIIA 및ActRIIB는 BMP7, Nodal, BMP9, BMP10, GDF8, 및 GDF11을 포함하여, 여러 가지 기타 TGF-β 패밀리 단백질과 생화학적으로 상호작용할 수 있다 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4는 액티빈, 특히 액티빈 A를 위한 일차 유형 I 수용체이고, ALK-7은 또한 액티빈, 특히 액티빈 B를 위한 수용체로서 기여할 수 있다.

액티빈 신호전달 경로의 저해제는 근육 손실, 초과 FSH, 비만, 뼈 손실, 다발성 골수종 및 유방암을 포함한 다양한 종양, 및 빈혈을 포함하여, 다양한 질환의 치료를 위해 제안되었다. 아는 바로는, ActRIIA에 결합하고 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원으로 신호전달을 억제하는 항체가 발생되지 않았다. ActRIIA가 거의 20년 동안 알려져있었지만, ActRIIA 녹아웃 동물의 보고된 치사율과 결부되는, 인간, 쥣과 그리고 기타 척추동물의 ActRIIA 서열 간의 고 보존은 중화 항-ActRIIA 항체의 생성을 방지하여왔다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, ActRIIA 신호전달을 중화시키는 항-ActRIIA 항체가 생성될 수 있고, 그리고 본 개시는 폭넓은 구조적 및 기능적 특징을 제공하여 광범위한 중화 항-ActRIIA 항체 및 이의 단편을 접근가능하게 할 수 있다.

본 명세서에서 나타난 바와 같이, 중화 항-ActRIIA 항체는 암 및 악액질의 치료를 포함하여, 여러 가지 지시에서 그리고 병든 환자내 FSH 수준을 감소시키는 데에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 해당 분야에서, 본 발명의 맥락 내에서 그리고 각 용어가 사용된 특정 맥락에서, 이들의 일반적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 하기에서 또는 본 명세서의 다른 곳에서 논의되어, 본 발명의 조성물 및 방법을 설명하고 이들을 어떻게 만들고 사용하는 지에 대해 실시자에게 추가적인 안내를 제공한다. 용어의 임의의 용도의 범위 또는 의미는 용어가 사용된 특정 맥락으로부터 명확해질 것이다.

"약" 그리고 "대략적으로"는 측정의 성질 또는 정확성을 고려해볼때 측정된 양에 대해 허용가능한 정도의 오차를 일반적으로 의미할 것이다. 전형적으로, 예시적인 정도의 에러는 주어진 값 또는 범위 값의 20 퍼센트 (%) 내에, 바람직하게는 10% 내에, 그리고 더욱 바람직하게는 5% 내에 있다. 대안적으로, 그리고 생물학적 시스템에서 특정하게, 용어 "약" 그리고 "대략적으로"는 주어진 값의 10배 내에, 바람직하게는 5배 내에 그리고 더욱 바람직하게는 2배 내에 있는 값을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 주어진 수량은 달리 명시되지 않는 한, 근사치이며, 이는 용어 "약" 그리고 "대략적으로"가 명확히 명시되지 않는 경우 추론될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 방법은 하나 이상의 돌연변이 (서열 변이체)에 대한 야생형 서열을 포함하여, 서열을 서로 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 비교는 가령, 해당 분야에서 잘 공지된 서열 배열 프로그램 및/또는 알고리즘 (몇 가지 예를 들자면, BLAST, FASTA 및 MEGALIGN)을 이용한, 중합체 서열의 배열을 전형적으로 포함한다. 통상의 기술자는 돌연변이가 잔기 삽입 또는 결실을 함유하는 이러한 배열에서, 서열 배열은 삽입된 또는 결실된 잔기를 함유하지 않는 중합체 서열 내에 "갭(gap)" (전형적으로 대시(dash), 또는 "A"로 나타냄)을 도입할 것이라는 점을 쉽게 이해할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, BLAST는 비교에 대해 디폴트(default) 알고리즘이 될 수 있을 것이다.

모든 문법적 형태 및 철자 변화에서 "상동하는(Homologous)"은 동일한 종의 유기체내 슈퍼패밀리로부터의 단백질, 그리고 상이한 종의 유기체로부터의 상동 단백질을 포함하여, "공동의 진화적 기원"을 지닌 두 단백질 간의 관계를 나타낸다. 이러한 단백질 (및 이들의 핵산 인코딩)은 퍼센트 동일성에 대해 관계없이, 이들의 서열 유사성에 의해 또는 특정 잔기 또는 모티프 및 보존된 위치의 존재에 의해 반영된 바와 같은, 서열 상동을 갖는다.

모든 문법적 형태에서 용어 "서열 유사성"은 공동의 진화적 기원을 공유할 수도 있고 또는 공유하지 않을 수도 있는 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 관련성의 정도를 나타낸다.

하지만, 일반적인 사용에서 그리고 본 출원에서, 용어 "상동하는"은 "매우"와 같은 부사로 수식될 때, 서열 유사성을 나타낼 수 있고 그리고 공동의 진화적 기원에 대해 관련될 수도 있고 관련되지 않을 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "ActRIIA"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체 유형 IIA (ActRIIA) 단백질의 패밀리 및 이러한 ActRIIA 단백질로부터 유래된 변이체를 나타낸다. 본 명세서에서 ActRIIA에 대한 참조는 현재 식별된 형태 중 어느 하나에 대한 참조라는 것으로 이해된다. ActRIIA 패밀리의 구성원은 일반적으로 막관통 단백질이며, 이는 시스테인-풍부 영역을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 예상되는 세린/트레오닌 키나아제 활성도를 가진 세포질 도메인으로 구성된다.

인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열은 다음과 같으며, 여기서 밑줄 친 서열은 문헌에 보고된 성숙 세포외 도메인과 상응하고, 상기 도메인 내에서 에피토프(epitope)는 중화 항-ActRIIA 항체 및 기타 ActRIIA 결합제에 의해 표적된다.

MGAAAKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL

(서열번호: 1)

인간 ActRIIA 전구체 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 같다 (Genbank 항목 NM_001616의 뉴클레오티드 164-1705):

GTTGGCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCATTTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTTGAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGCATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA

(서열번호: 2)

2. ActRIIA 결합제

본 발명은 부분적으로, 전장 ActRIIA에도 결합하는 항체에 의해 인식된 에피토프를 함유한 ActRIIA 단백질의 영역, 및 이들 에피토프를 만들고 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 ActRIIA 또는 ActRIIA의 부분에 특이적으로 결합하는 결합제 (가령 항체), 및 이러한 결합제를 사용하기 위한 방법을 제공한다. 결합제는 하나 이상의 리간드(들)과의 인간 ActRIIA의 결합을 차단하거나 손상시키는 데에 그리고 이의 생물학적 활성도를 방해하는 데에 유용하다.

ActRIIA의 오솔로그(ortholog) 간의 고도의 서열 동일성이 있다는 점이 해당 분야에서 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있다. 인간 ActRIIA의 쥣과 오솔로그는성숙 494-아미노산 단백질내 오직 두 개의 치환에 의해 차이가 나는 것으로 설명된 반면에 (NCBI Ref. Seq.: NP_031422), 랫트 (rat) 오솔로그는 오직 세 개의 치환에 의해 차이가 나는 것으로 설명되었다 (NCBI Ref. Seq.: NP_113759). 이에 따라, 인간 ActRIIA에 결합하는 약제는 결합제의 인식 부위, 가령, 에피토프와 같은 항체 결합 부위가 매우 보존된 경우에 그리고 특히 인간 서열과 거의 또는 완벽하게 동일한 경우에 쥣과 ActRIIA 또는 랫트 ActRIIA에 결합하는 것으로 예상될 것이다. 따라서, 용어 "ActRIIA에 특이적 결합"이 사용될 때, 종 간의 서열이 보존되는 경우 다수 종의 ActRIIA에 결합하는 것을 포함하는 것이 이해된다.

본 발명에 따른 결합제의 예시는 항체 14E1 (Ab-14E1)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, Ab-14E1은 서열번호: 14 및 15에서 나타난 뉴클레오티드에 의해 발현되는 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 결합제는 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 전형적으로 항체, 또는 이의 단편이다. 항체는 완전 항체 분자 (전장 중쇄 및/또는 경쇄를 가진 다클론성, 단일클론성, 키메라성, 또는 인간화 버전을 포함)를 포함하거나, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 F(ab')₂, Fab, Fab', Fv, Fc, 및 Fd 단편을 포함하고, 그리고 단일-도메인 항체, 단쇄 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR 및 bis-scFv 내로 편입될 수 있다 (가령, Hollinger 및 Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1 126-1136을 참고). 또한 항체-유사 폴리펩티드는 피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 포함하여, 미국 특허 제 6,703,199호 [Research Corp Technologies에 양도된 "Artificial Antibody Polypeptides"]에 개시된다. 단쇄 폴리펩티드인, 기타 항체-유사 폴리펩티드는 미국 특허 공개공보 2005/0238646에서 개시된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 등일 수 있다. 결합제의 이들 유형 각각에서, 결합제는 일반적으로, 본 명세서에 개시된 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 삽입하여 대안적인 ActRIIA 결합제를 생성할 것으로 예상된다.

본 발명에 따른 항체는 임의의 면역글로불린 종류, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgG2/4 하이브리드(hybrid)를 포함), IgE, IgM, IgD, 또는 IgA에 속할 수 있다. 상기 항체는 동물, 예를 들어, 새 (가령, 닭) 및 쥐, 랫트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 양, 염소, 낙타, 인간, 또는 기타 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류로부터 얻거나 유래될 수 있다. 항체는 내재화 항체일 수 있다.

항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 예를 들어, 항체의 단백질분해성 가수분해, 예를 들어 기존의 방법에 따른 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해로 얻을 수 있다. 예로서, 항체 단편은 펩신을 이용한 항체의 효소적 절단에 의해 생성되어 F(ab')₂로 불리는 5S 단편을 제공할 수 있다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단되어 3.5S Fab 1가 단편을 생성할 수 있다. 임의로, 절단 반응은 이황화 연결의 절단에서 기인하는 설피드릴 기의 차단기(blocking group)를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 파파인을 이용한 효소적 절단은 직접적으로 1가 Fab 단편 두 개 및 Fc 단편을 생성한다. 이들 방법은 예를 들어, Goldenberg, 미국 특허 제4,331,647호, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology 1 :422 (Academic Press 1967)에 의해; 및 Andrews, S. M. and Titus, J. A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J. E., et al., eds), John Wiley & Sons, New York (2003), pages 2.8.1-2.8.10 및 2.10A.1-2.10A.5에 의해 설명된다. 단편이 완전 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 절단 항체를 위한 기타 방법, 가령 중쇄를 분리하여 1가 경-중쇄 단편 (Fd)을 형성하는 단계, 단편의 추가 절단 단계, 또는 기타 효소적, 화학적, 또는 유전적 기술이 또한 사용될 수 있다.

또한 항체 단편은 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 구성되는 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "FV" 단편, 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자를 포함하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 펩티드 연결자 (scFv 단백질)에 의해 연결된다.

항체 단편의 또 다른 형태는 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 펩티드이다. CDR (또한 용어 "최소 인식 유닛", 또는 "초가변 영역")은 관심 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조함으로써 얻을 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 이용함으로써 제조되어 주형으로서 항체-생성 세포의 mRNA를 사용하여 가변 영역을 합성한다 (예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies. Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); 및 Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)을 참고).

따라서, 한 가지 구체예에서, 결합제는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 결합제는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR을 포함할 수 있다. 결합제는 본 명세서에서 설명된 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함할 수 있다. 가변 영역 도메인은　임의의 크기 또는 아미노산 조성의 것일 수 있고　인간　ActRIIA에　결합하는 것을 책임지는　적어도 하나의　CDR　서열,　예를 들어　CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3,　및/또는　본 명세서에서 특정하게 설명된　경쇄　CDR　을 일반적으로 포함할 것이고, 그리고 이들은　하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 또는 이와의 프레임 내에 있다. 일반적인 용어에서, 가변 (V) 영역 도메인은 면역글로불린 중쇄 (VH) 및/또는 경쇄 (VL) 가변 도메인의 임의의 적합한 정렬일 수 있다. 따라서, 예를 들어, V 영역 도메인은 단합체일 수 있고 VH 또는 VL 도메인일 수 있으며, 상기 V 영역 도메인은 하기 설명된 바와 같이 1 x 10^-7 M과 적어도 동일하거나 더 적은 친화도로 인간 ActRIIA을 독립적으로 결합시킬 수 있다. 대안적으로, V 영역은 이합체일 수 있고 VH-VH, VH-VL, 또는 VL-VL 이합체를 함유할 수 있다. V 영역 이합체는 비-공유결합으로 연관될 수 있는 적어도 하나의 VH 및 적어도 하나의 VL 사슬을 포함한다 (이하 FV로 나타남). 바람직하다면, 사슬은 각각 직접적으로, 예를 들어 두개의 가변 도메인 간의 이황화 결합을 통해, 또는 연결자, 예를 들어 펩티드 연결자를 통하여, 공유결합으로 커플링되어 단쇄 Fv (scFV)를 형성할 수 있다.

가변 영역 도메인은 임의의 자연 발생(naturally occurring) 가변 도메인 또는 이의 조작된 버전일 수 있다. 조작된 버전은 재조합 DNA 조작 기술을 이용하여 만들어진 가변 영역 도메인을 의미한다. 이러한 조작된 버전은 예를 들어, 특이 항체의 아미노산 서열에서 또는 이에 대한 삽입, 결실, 또는 변형에 의해 특이 항체 가변 영역으로부터 만들어진 것들을 포함한다. 특정한 예시는 일차 항체로부터 적어도 하나의 CDR 및 임의로 하나 이상의 프레임워크 아미노산을 함유하는 조작된 가변 영역 도메인 및 이차 항체로부터의 가변 영역 도메인의 나머지를 포함한다.

가변 영역 도메인은 C-말단 아미노산에서 적어도 하나의 기타 항체 도메인 또는 이의 단편에 공유결합으로 부착될 수있다. 따라서, 예를 들어, 가변 영역 도메인에 존재하는 VH 도메인은 면역글로불린 CH1 도메인, 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게, VL 도메인은 CK 도메인 또는 이의 단편에 결합될 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 항체는 Fab 단편일 수 있으며 여기서 항원 결합 도메인은 연관 VH 및 VL 도메인의 C-말단에서 CH1 및 CK 도메인과 각각 공유결합으로 연결된 연관 VH 및 VL 도메인을 함유한다. CH1 도메인은 추가 아미노산으로 연장되어, 예를 들어 Fab 단편에서 발견된 바와 같은 힌지(hinge) 영역 또는 힌지 영역 도메인의 부분을 제공하거나, 또는 추가 도메인, 가령 항체 CH2 및 CH3 도메인을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 설명된 바와 같이, 결합제는 이들 CDR 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 CDR은 공지된 항체 프레임워크 영역 (IgGl, IgG2 등) 내로 편입되거나 또는 적합한 비히클에 접합되어 이들의 반감기를 향상시킬 수 있다. 적합한 비히클은 Fc, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 알부민, 트랜스페린 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 및 기타 적합한 비히클은 해당 분야에서 공지된다. 이러한 접합된 CDR 펩티드는 단합체, 이합체, 사합체, 또는 기타 형태일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 하나 이상의 특정 위치에서, 예를 들어 결합제의 아미노 말단에서 결합된다.

특정한 구체예에서, 결합제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한 되지 않는, 하나 이상의 수용성 중합체 부착을 포함한다. 가령, 미국 출원 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 및 제 4,179,337호를 참고한다. 특정한 구체예에서, 유도체 결합제는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 기타 탄수화물-기반 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (가령, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올 중 하나 이상, 그리고 이러한 중합체의 혼합물을 포함한다. 특정한 구체예에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 하나 이상의 곁사슬에 무작위로 부착된다. 특정한 구체예에서, PEG는 결합제, 가령 항체에 대한 치료력을 개선시키는 것으로 작용할 수 있다. 이러한 특정 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,133,426호에서 논의되며, 이는 어떠한 목적에 대하여 참조로서 본 명세서에 편입된다.

본 발명에 따른 항체는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 그리고 해당 분야에서 공지된 기존의 면역화 및 세포 융합 절차에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체는 여러 가지 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 특이 항원에 결합하는 단일클론 항체는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 얻을 수 있다 (예를 들어, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1 :2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); 미국 특허 제RE 32,011호, 제4,902,614호, 제4,543,439호, 및 제4,411,993호; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980); 및 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)을 참고). 항체 단편은 임의의 적합한 표준 기술, 가령 단백질 분해를 사용하여, 또는 임의로, 단백질 분해 (예를 들어, 파파인 또는 펩신을 이용함) 다음에 이황화 결합 및 알킬화의 약간의 감소에 의해 그것으로부터 유도될 수 있다. 대안적으로, 이러한 단편은 또한 본 명세서에서 설명된 바와 같은 재조합 유전 조작 기술에 의해 생성될 수 있다.

단일클론 항체는 해당 분야에서 공지된 및 본 명세서에서 설명된 방법에 따라서, 서열번호: 1의 인간 ActRIIA, 또는 이의 단편을 포함한 면역원을 가진, 동물, 예를 들어, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 바람직하게는 쥐, 바람직하게는 ActRIIA-결핍 쥐에 주사함으로써 얻을 수 있다. ActRIIA-결핍 쥐 (즉 Acvr2^-/- 녹아웃 쥐)는 상당히 감소된 생존력 및 기타 결함을 가지고 있기 때문에, 충분하게 건강하고 올바르게 사육된 쥐를 얻기 위해 보살핌이 필요시 될 것이다. 특이 항체 생성의 존재는 초기 주사 후 및/또는 추가 주사(booster injection) 후 혈청 샘플을 얻음으로써 그리고 해당 분야에서 공지된 및 본 명세서에서 설명된 여러 가지 면역탐지 방법 중 어느 하나를 사용하여 인간 ActRIIA 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 탐지함으로써 모니터링 될 수 있다. 바람직한 항체를 생성하는 동물로부터, 비장 또는 림프절로부터 가장 일반적인 세포인, 림프 세포가 제거되어 B-림프구를 얻는다. 그 다음 B 림프구는 약물-감작 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 것 그리고 기타 바람직한 특성을 임의로 갖는 것 (가령, 내생 Ig 유전자 산물, 가령, P3X63-Ag 8.653 (ATCC 번호 CRL 1580); NSO, SP20의 발현에 대한 불능)과 융합되어 불멸의 진핵 세포주인 하이브리도마(hybridoma)를 생성한다. 림프 (가령, 비장) 세포 및 골수종 세포는 막 융팝-촉진제, 가령 폴리에틸렌 글리콜 또는 비이온성 세제를 이용하여 몇 분 동안 결합될 수 있고 그 다음 하이브리도마 세포의 성장을 지원하지만 비융합된 골수종 세포는 지원하지 않는 선택 배지 상에 낮은 밀도로 도말될 수 있다. 바람직한 선택 배지는 HAT (하이포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin), 티미딘(thymidine))이다. 주로 약 1 내지 2 주의 충분한 시간 후, 세포 군집이 관찰된다. 단일 군집은 단리되고, 세포에 의해 생성된 항체는 해당 분야에서 공지된 및 본 명세서에서 설명된 다양한 면역분석 중 어느 하나를 이용하여, 인간 ActRIIA에 결합하는 활성도를 위해 검사될 수 있다. 하이브리도마는 (가령, 제한된 희석 클로닝에 의해 또는 연한 한천 플라크 단리에 의해) 클로닝되고 ActRIIA에 특이적인 항체를 생성하는 양성 클론이 선택되고 배양된다. 하이브리도마 배양액으로부터의 단일클론 항체는 하이브리도마 배양액의 상청액으로부터 단리될 수 있다. 쥣과 단일클론 항체의 생성을 위한 대안적인 방법은 동계 쥐, 예를 들어 단일클론 항체를 함유한 복수액의 형성을 촉진하기 위해 처리된 (가령, 프리스탄-프라이밍된(pristane-primed)) 쥐의 복막강 내로 하이브리도마 세포를 주사하는 것이다. 단일클론 항체는 다양한 잘 확립된 기술에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술은 단백질-A 세파로스(Sepharos)를 이용한 친화 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, Coligan의 pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)를 참고). 단일클론 항체는 리간드 선택이 항체의 특정한 특성 (가령, 중쇄 또는 경쇄 이소타입, 결합 특이성 등)에 기반한 적절한 리간드를 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 고형 지지체에 고정된, 적합한 리간드의 예시는 단백질 A, 단백질 G, 항-불변 영역 (경쇄 또는 중쇄) 항체, 항-이디오타입 항체, 및 ActRIIa 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.

본 발명의 결합제는 상기 결합제가 결합 특이성을 보유한다면, 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 그러므로, 결합제 구조에 대한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들은 보존적이거나 또는 비-보존적인 아미노산 치환을 포함할 수 있고 그리고 그것은 결합제의 ActRIIA 결합 능력을 파괴하지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 생물학적 시스템내 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 편입된다. 이들은 펩티드모방체 및 기타 역상되거나 도치된 형태의 아미노산 모이어티(moiety)를 포함한다. 또한 보존적 아미노산 치환은 기준 잔기를 이용한 천연 아미노산 잔기의 치환을 수반하여 그 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향을 거의 주지 않도록 할 수 있다.

보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에서 나타난다. 이러한 치환이 생물학적 활성도에서의 변화를 야기한다면, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 종류에 관하여 하기 추가 설명된 바와 같은, 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고 그리고 산물이 선별된다.

보존적 치환

최초 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg; Asn; Gln; Lys	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	Ile; 노르류신; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Tyr; Trp; Leu; Val; Ile; Ala	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser; Val	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Phe; Trp; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Leu; Ile; 노르류신; Met; Phe; Ala	Leu

항체의 생물학적 특성에서 실질적인 변형이 (a) 치환 부분내 폴리펩티드 백본(backbone)의 구조, 예를 들어 편평하거나 나선의 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 곁사슬을 유지하는 것에 대한 치환의 효과에서 상당하게 차이가 나는 치환을 선택함으로써 성취된다. 자연 발생 잔기는 공동 곁-사슬 특성에 기반하여 그룹으로 나뉜다:

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, 노르류신;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 방향성(chain orientation)에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 상이한 물리적 특성 (가령, 크기, 극성, 소수성, 전하)을 가진 또 다른 종류로부터 한 가지 종류의 아미노산 또는 아미노산 모방체의 구성원의 교환을 수반할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 비-인간 항체와 상동하는 인간 항체의 영역 내로, 또는 분자의 비상동하는 영역 내로 도입될 수 있다.

게다가, 해당 분야의 통상의 기술자는 바람직한 아미노산 잔기 각각에서 단일 아미노산 치환을 함유한 검사 변이체를 만들어 낼 수 있다. 이후 상기 변이체는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 활성도 분석을 이용하여 선별될 수 있다. 이러한 변이체는 적합한 변이체에 대한 정보를 수집하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기로의 변화가 파괴된, 바람직하지 않게 환원된, 또는 부적절한 활성도를 야기하는 것을 발견한다면, 이러한 변화를 가진 변이체는 회피될 수 있다. 다시 말해, 이러한 정례적인 실험으로부터 수집된 정보에 기반하여, 해당 분야의 통상의 기술자는 추가적 치환이 단독으로 또는 기타 돌연변이와 조합하여 회피되어야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.

통상의 기술자는 잘 공지된 기술을 이용하여 본 명세서에서 제시된 바와 같은 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정한 구체예에서, 해당 분야의 통상의 기술자는 활성도에 대해 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적함으로써 활성도를 파괴하지 않고 변화될 수 있는 분자의 적합한 부분을 식별할 수 있다. 특정한 구체예에서, 통상의 기술자는 유사한 폴리펩티드 중에서 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 식별할 수 있다. 특정한 구체예에서, 생물학적 활성도에 대해 또는 구조에 대해 중요한 것일 수 있는 부분 조차도 생물학적 활성도를 파괴하지 않으면서 또는 폴리펩티드 구조에 악영향을 주지 않으면서 보존적 아미노산 치환의 대상이 될 수 있다.

추가적으로, 해당 분야의 통상의 기술자는 유사한 폴리펩티드에서 활성도 또는 구조에 대해 중요한 잔기를 식별하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 고려하여, 통상의 기술자는 유사한 단백질에서 활성도 또는 구조에 대해 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질내 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 이러한 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

본 개시는 인간 ActRIIA의 세포외 도메인 (ECD)과 복합된 단일클론 Ab-14E1 Fab 단편의 x-선 크로마토그래피 분석의 결과를 포함한다. 실시예에서 상세설명된 바와 같이, 분석은 Ab-14E1 VH (서열번호: 12) 에서 17개 아미노산 잔기 및 Ab-14E1 VL (서열번호: 13)에서 16개 잔기를 식별하였고, 상기 잔기들은 인간 ActRIIA ECD에서 아미노산과 접촉을 일으키고, 따라서 특이성-결정 잔기 (SDR)로 간주될 수 있다 (Padlan et al., FASEB J 9:133-139 (1995)). 대부분의 이들 SDR은 CDR 내로 무리를 이룬다. SDR이 두 개 더, 즉시 CDR에 인접하여 위치되며 첫 번째는 CDR-H1 옆에 그리고 일차 보존된 시스테인 (C₁)으로부터 +4 잔기에 바람직하게 위치된 글리신이다. 변이체는 서열번호: 12내 C₁로부터 +3 또는 +5 잔기에 위치된 글리신을 포함하는 것으로 간주된다. 이러한 SDR의 두 번째는 CDR-L2 옆에 그리고 C₁으로부터 +26 잔기에 바람직하게 위치된 타이로신이고, 변이체는 서열번호: 13내 C₁으로부터 +24, +25, +27, 또는 +28 잔기에 위치된 타이로신으로 간주된다. 최종적으로, 두 개의 추가적인 ("부수체(satellite)") SDR은 CDR 외부에 잘 위치되며, 첫 번째는 서열번호: 12내 C₁으로부터 -20 잔기에 바람직하게 위치된 발린이고, 그리고 두 번째는 서열번호: 13내 이차 보존된 시스테인 (C₂)로부터 -21 잔기에 바람직하게 위치된 세린이다. 변이체는 서열번호: 12내 C₁로부터 -18, -19, -21, 또는 -22 잔기에 위치된 발린을 포함하거나 또는 서열번호: 13내 C₂ 로부터 -19, -20, -22, 또는 -23 잔기에 위치된 세린을 포함하는 것으로 생각된다. 오직 보존적 돌연변이만이, 만약 그렇다면, CDR내 33 SDR 위치 및 비-SDR 위치에서 용인될 것이라는 점이 예상된다. 변이체는 특히, 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 상응하는 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 지닌 것으로 간주된다. SDR 및 CDR 외부의 프레임워크 영역에서, 비-보존적 돌연변이가 용인될 것이라는 점이 예상되고, 그리고 변이체는 서열번호: 12 및 13의 상응하는 부분과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 지닌 것으로 간주된다.

다수의 과학 공개공보는 이차 구조의 예측에 전념하였다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas MoI. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 및 Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979)를 참고. 게다가, 컴퓨터 프로그램은 이차 구조 예측을 돕는 데에 현재 이용가능하다. 이차 구조 예측의 한 가지 방법은 상동 모형화에 기반한다. 예를 들어, 30% 초과의 서열 동일성, 또는 40% 초과의 서열유사성을 지닌 두 개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 위상(topology)을 갖는다. 최근에 증가한 단백질 구조적 데이터베이스 (PDB)가 폴리펩티드 또는 단백질의 구조 내에서 잠재적인 접힘 횟수를 포함하여, 이차 구조의 향상된 예측가능성을 제공하였다. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(l):244-247 (1999)을 참고. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질에서 제한된 숫자의 접힘이 있고, 그리고 구조의 임계수가 일단 결정되면, 구조 예측이 극적으로 더욱 정확해질 것이라는 점이 제시되었다 (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)).

이차 구조 예측의 추가적인 방법은 "스레딩(threading)" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "프로파일 분석(profile analysis)" (Bowie et al., Science, 253:164- 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), 및 "진화적 연관(evolutionary linkage)" (상기, Holm (1999), 및 상기, Brenner (1997)를 참고)을 포함한다.

일부 단백질, 가령 항체는 숙주 세포로부터 발현 및 분비 동안에 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 이들 변형의 유형 및 정도는 단백질 그리고 배양 조건을 나타내는 데에 이용된 숙주 세포주에 종종 의존한다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 또는 트립토판 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변이를 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다아제의 작용 (Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995에서 설명된 바와 같음)으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기 (가령 리신 또는 아르기닌)의 손실이다. 일단 단백질이 발현되고 가공되면, 이들은 '성숙' 형태에 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 DNA의 발현에서 기인하는 성숙 항체를 포함하는 것으로 이해된다.

특정한 구체예에서, 결합제의 변이체는 글리코실화 변이체를 포함하며, 여기서 모 (parent) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 글리코실화 부위의 개수 및/또는 유형이 변화되었다. 특정한 구체예에서, 변이체는 천연 단백질보다 더 많은 수의 또는 더 적은 수의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에 의해 특징되며, 여기서 X 로 명시된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이 서열을 형성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결 탄수화물 사슬의 추가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안적으로, 이 서열을 제거하는 치환은 존재하는 N-연결 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. N-연결 탄수화물 사슬의 재정열이 또한 제공되며, 여기서 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위 (전형적으로, 자연 발생한 것들)는 제거되고 하나 이상의 새로운 N-연결 부위가 형성된다. 추가적인 바람직한 항체 변이체는 시스테인 변이체를 포함하며, 여기서 하나 이상의 시스테인 잔기는 모 아미노산 서열과 비교하여 또 다른 아미노산(가령, 세린)으로부터 삭제되거나 또는 상기 아미노산에 대해 치환된다. 시스테인 변이체는 항체가 생물학적으로 활성인 입체형태로, 가령 불용성 봉입체의 단리 후 재접힘되어야할 때 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로, 천연 단백질보다 더 적은 시스테인 잔기를 가지고, 전형적으로, 짝수 개를 가져 짝이 없는 시스테인에서 기인하는 상호작용을 최소화한다.

아미노산 치환 (보존적이거나 또는 비-보존적인 것에 상관 없이)은 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이러한 치환이 바람직한 시간에서 결정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 아미노산 치환은 ActRIIA에 대한 항체의 중요한 잔기를 식별하는 데에, 또는 본 명세서에서 설명된 ActRIIA에 대한 항체의 친화도를 증가시키거나 감소시키는 데에 이용될 수 있다.

특정한 구체예 따라서, 바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하는 것에 대한 결합 친화도를 변화시키고, (4) 결합 친화도를 변화시키고, 및/또는 (4) 이러한 폴리펩티드에서 생리화학적이거나 기능적인 특성을 부여하거나 변형시키는 것들이다. 특정한 구체예 따라서, 단일 또는 다수의 아미노산 서열 (특정한 구체예에서, 보존적 아미노산 서열)은 자연적으로-발생한 서열에서 (특정한 구체예에서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 일부에서) 만들어질 수 있다. 특정한 구체예에서, 전형적으로 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시킬 수 없다 (가령, 대체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 부수거나, 또는 모 서열의 특징이 되는 이차 구조의 기타 유형을 방해하는 경향이 있으면 안됨). 해당 분야에서-인식된 폴리펩티드 이차 및 삼차 구조의 예시는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et al. Nature 354:105 (1991)에서 설명되며, 이들 각각은 참조로서 본 명세서에 편입된다.

특정한 구체예에서, 본 발명의 결합제는 중합체, 지질, 또는 기타 모이어티와 화학적으로 결합될 수 있다.

결합제는 생체적합 프레임워크 구조내로 편입된, 본 명세서에서 설명된 CDR 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 한 가지 예시에서, 생체적합 프레임워크 구조는 구조적으로 안정한 구조 지지체, 또는 프레임워크, 또는 스캐폴드(scaffold)를 형성하는 데에 충분한 폴리펩티드 또는 이의 부분을 포함하며, 이는 국소 표면 영역내 항원에 결합하는 하나 이상의 아미노산 서열 (가령, CDR, 가변 영역 등)을 나타낼 수 있다. 이러한 구조는 자연 발생 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "접힘" (구조적 모티프)일 수 있거나, 또는 자연 발생 폴리펩티드 또는 접힘에 대하여, 하나 이상의 변형, 가령 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 가질 수 있다. 이들 스캐폴드는 임의의 종 (또는 하나 이상의 종), 가령 인간, 기타 포유류, 기타 척추동물, 무척추동물, 식물, 박테리아, 또는 바이러스의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다.

전형적으로, 생체적합 프레임워크 구조는 면역글로불린 도메인 외에 단백질 스캐폴드 또는 골격(skeleton)에 기반한다. 예를 들어, 피브로넥틴, 안키린(ankyrin), 리포칼린(lipocalin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostain), 사이토크롬 b(cytochrome b), CP1 징크 핑커(CP1 zinc finger), PST1, 꼬인 나선(coiled coil), LAC1-Dl, Z 도메인 및 텐드라미새트(tendramisat) 도메인에 기반한 것들이 사용될 수 있다 (가령, Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469를 참고).

바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합제는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있는 인간화 항체를 포함하는 것으로 이해될 것이다 (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36(l):35-42, 2005; Dall'Acqua W F, et al., Methods 36(l):43-60, 2005; 및 Clark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000).

또한 본 발명의 항체는 인간 단일클론 항체일 수 있다. 인간 단일클론 항체는 많은 기술에 의해 발생될 수 있으며, 상기 기술은 해당 분야의 통상의 기술자에게 익숙해질 것이다. 이러한 방법은 인간 말초 혈액 세포 (가령, B 림프구를 함유함)의 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus, EBV) 형질전환, 인간 B 세포의 시험관내 면역화, 삽입된 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 면역화된 형질전환 쥐로부터의 비장 세포의 융합, 인간 면역글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터 단리, 또는 해당분야에서 공지된 바와 같은 및 본 명세서의 개시에 기반한 기타 절차를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 인간 단일클론 항체는 항원 시험(antigenic challenge)에 대하여 항원 특이적 인간 항체를 생성하기 위해 조작된 형질전환 쥐로부터 얻을 수 있다. 형질전환 쥐로부터 인간 항체를 얻기 위한 방법이 예를 들어, Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994; 미국 출원 제5,877,397호; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y Acad. Sci. 764:525-35에 의해 설명된다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자자리의 요소는 내생 중쇄 및 경쇄 유전자자리의 표적된 분열을 함유한 배아 줄기세포주로부터 유래된 쥐 스트레인(strain) 내로 도입된다 (또한 Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)을 참고). 예를 들어, 인간 면역글로불린 전이유전자는 소형-유전자 구조체(mini-gene construct), 또는 효모 인공 염색체 상에서의 전이유전자자리(translocus)일 수 있으며, 이는 쥐 림프구 조직에서 B 세포-특이적 DNA 재정렬 및 초돌연변이를 겪는다. 인간 단일클론 항체는 형질전환 쥐를 면역화시킴으로써 얻을 수 있으며, 여기서 이후 상기 쥐는 ActRIIA에 대해 특이적인 인간 항체를 생성할 수 있다. 면역화된 형질전환 쥐의 림프구 세포는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 인간 항체-분비 하이브리도마를 생성하는 데에 이용될 수 있다. 또한 인간 항체를 함유한 다클론 혈청은 면역화된 동물의 혈액으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 인간 항체를 발생시키기 위한 또 다른 방법은 EBV 형질전환으로 인간 말초혈액 세포를 불명화시키는 단계를 포함한다. 가령, 미국 특허 제4,464,456호를 참고. ActRIIA에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 이러한 불멸화된 B 세포주 (또는 림프아구성(lymphoblastoid) 세포주)는 본 명세서에서 제공된 바와 같은 면역탐지 방법, 가령 ELISA에 의해 식별될 수 있고, 그 다음 표준 클로닝 기술에 의해 단리될 수 있다. 항-ActRIIA 항체를 생성하는 림프아구성 세포주의 안정도는 형질전환된 세포주를 쥣과의 골수종과 융합함으로써 개선되어 해당 분야에서 공지된 방법에 따른 쥐-인간 하이브리드 세포주를 생성할 수 있다 (가령, Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)를 참고). 인간 단일클론 항체를 발생시키 위한 또 다른 방법은 시험관내 면역화이며, 이는 인간 ActRIIA로 인간 비장의 B 세포를 프라이밍하고, 그 다음 헤테로하이브리드 융합 파트너로 프라임된 B 세포를 융합하는 단계를 포함한다. 가령, Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95를 참고.

특정 구체예에서, 항-인간 ActRIIA 항체를 생성하는 B 세포가 선택되고 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 해당 분야에서 공지 (WO 92/02551; 미국 특허 제5,627,052호; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996))된 및 본 명세서에서 설명된 분자 생물학 기술에 따라 B 세포로부터 클로닝된다. 면역화된 동물로부터의 B 세포는 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 세포를 선택함으로써 비장, 림프절, 또는 말초 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 또한 B 세포는 인간으로부터, 예를 들어 말초 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 바람직한 특이성을 가진 항체를 생성하는 단일 B 세포를 탐지하기 위한 방법은 해당 분야에서, 예를 들어, 플라크 형성, 형광-활성화된 세포 분류, 시험관내 자극 다음에 특이 항체의 탐지 등으로 잘 공지된다. 특이 항체-생성 B 세포의 선택을 위한 방법은 예를 들어, 인간 ActRIIA를 함유한 연한 한천내 B 세포의 단일 세포 현탁액을 제조하는 단계를 포함한다. B 세포에 의해 생성된 특이 항체와 항원과의 결합은 면역침전물로서 가시적일 수 있는 복합체의 형성을 야기한다. 바람직한 항체를 생성하는 B세포가 선택된 후, 특이 항체 유전자는 해당 분야에서 공지된 및 본 명세서에서 설명된 방법에 따라 DNA 또는 mRNA를 단리 및 증폭시킴으로써 클로닝될 수 있다.

추가적으로, 해당 분야의 통상의 기술자는 적합한 결합제가 이들 항체의 부분, 가령 본 명세서에서 특정하게 개시된 바와 같이, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 하나 이상을 포함한다는 점을 인식할 것이다. 결합제가 비-치환된 CDR의 결합 특이성을 보유한다면, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 영역 중 적어도 하나는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있다. CDR은 변경되어 길이 또한 증가시키거나 감소시킬 수 있고, 따라서 치환, 삽입 및 결실로서 특징이 되는 변화가 모두 고려된다. 결합제의 비-CDR 부분은 비-단백질 분자일 수 있으며, 여기서 결합제는 본 명세서에서 개시된 항체와 ActRIIA의 결합을 교차-차단하고 및/또는 ActRIIA를 중화시킨다. 결합제의 비-CDR 부분은 아미노산으로 구성될 수있으며, 여기서 결합제는 재조합 결합 단백질 또는 합성 펩티드이고, 상기 재조합 결합 단백질은 본 명세서에서 개시된 항체와 ActRIIA의 결합을 교차-차단하고 및/또는 ActRIIA를 중화시킨다. 결합제의 비-CDR 부분은 아미노산으로 구성될 수 있으며, 여기서 결합제는 재조합 결합 단백질이고, 상기 재조합 결합 단백질은 항체 Ab-14E1에 의해 나타나는 것과 같은 인간 ActRIIA 펩티드 에피토프 경쟁 결합 분석 (아래에서 설명됨)에서 인간 ActRIIA 펩티드에 대해 유사한 결합 패턴을 나타내고, 및/또는 ActRIIA를 중화시킨다.

한 가지 구체예에서, 통상의 기술자는 라이브러리가 인간 항체 경쇄로 구성된 라이브러리 선별에서 '베이트(bait)'로서 항체 중쇄를 이용하여 상보적인 인간 경쇄를 식별할 수 있으며, 여기서 재구성된 항체는 ActRIIA에 결합하는 것으로 고려된다. 이 구체예에서, 중쇄는 ActRIIA에 특이적인 항체로부터 유래된 것이고 쥐, 키메라, 또는 인간화된 것이다.

항체가 상기 설명된 바와 같이, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 중 하나 이상을 포함하는 경우, 상기 항체는 DNA 서열을 위한 DNA 코딩을 함유하는 숙주 세포로부터 발현에 의해 얻을 수 있다. CDR 서열 각각을 위한 DNA 코딩은 CDR의 아미노산 서열에 기반하여 결정될 수 있고 적절한 것으로서, 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 위치-지정 돌연변이 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 이용하여 임의의 바람직한 항체 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 DNA 서열과 함께 합성될 수 있다. 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역을 위한 DNA 코딩은 유전 서열 데이터베이스, 가령 GenBank.RTM으로부터 해당 분야의 통상의 기술자에게 널리 이용가능하다.

일단 합성되면, 본 발명의 항체 및 이의 단편을 인코딩하는 DNA는 핵산 절제, 결찰, 형질전환, 및 임의의 수의 공지된 발현 벡터를 사용한 형질감염을 위한 임의의 다양한 잘-공지된 절차에 따라서 전파되고 발현될 수 있다. 따라서, 특정한 구체예에서, 항체 단편의 발현은 원핵 숙주, 가령 대장균(Escherichia coli)에서 바람직할 수 있다 (가령, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515를 참고). 기타 특정한 구체예에서 항체 또는 이의 단편의 발현은 효모 (가령, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 동물 세포 (포유류 세포를 포함) 또는 식물 세포를 포함한 진핵 숙주세포에서 바람직할 수 있다. 적합한 동물 세포의 예시는 골수종 (가령 쥐 NSO 계), COS, CHO, 또는 하이브리도마 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물 세포의 예시는 담배, 옥수수, 대두, 및 벼 세포를 포함한다.

항체 가변 및/또는 불변 영역을 인코딩하는 DNA를 함유한 1회 이상의 복제가능한 발현 벡터가 제조되고 적절한 세포주, 예를 들어, 비-생성 골수종 세포주, 가령 쥐 NSO 계 또는 박테리아, 가령 E. coli를 형질전환하는 데에 이용될 수 있으며, 여기서 항체의 생성이 일어날 것이다. 효과적인 전사 및 번역을 얻기 위해서, 각 벡터내 DNA 서열은 적절한 조절 서열, 특히 가변 도메인 서열과 작동가능하게 연결된(operatively linked) 전구체 및 선구 서열을 포함해야한다. 이러한 방식으로 항체를 생성하기 위한 특정한 방법은 일반적으로 잘 공지되고 일상적으로 사용된다. 예를 들어, 기본 분자 생물학 절차는 Maniatis et al.에 의해 설명된다 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; 또한 Maniatis et al, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)을 참고). DNA 서열결정(sequencing)은 Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977)) 및 Amersham International plc 서열결정 안내서에서 설명된 바와 같이 수행될 수 있고, 그리고 위치 지정 돌연변이는 해당 분야에서 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있다 (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); Anglian Biotechnology Ltd 안내서). 추가적으로, 수많은 공개공보는 DNA 조작에 의해 항체의 제조에 적합한 기술, 발현 벡터의 형성, 및 적절한 세포의 형질전환과 배양을 설명한다 (Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York).

상기 언급된 CDR 중 하나 이상을 함유한 본 발명에 따른 항체의 친화도를 개선시키는 것이 바람직한 경우, CDR (Yang et al., J. MoI. Biol., 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(shuffling) (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), E. coli.의 돌연변이 스트레인의 용도 (Low et al., J. MoI. Biol., 250, 350-368, 1996), DNA 셔플링 (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(phage display) (Thompson et al., J. MoI. Biol., 256, 7-88, 1996) 및 성 PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 유지하는 것을 포함한 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 개선된 항체를 얻을 수 있다. 친화도 성숙의 이들 방법 모두 Vaughan et al.에 의해 논의된다 (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

본 발명의 항체를 얻기 위한 추가적인 방법은 파지 디스플레이에 의한 것이다. 가령, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280을 참고. 인간 또는 쥣과의 면역글로불린 가변-영역 유전자의 조합 라이브러리는 선별되어 ActRIIA 또는 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 Ig 단편 (Fab, Fv, sFv, 또는 이의 다합체)을 선택할 수 있는 파지 벡터에서 형성될 수 있다. 가령, 미국 특허 제5,223,409호; Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting- Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌을 참고. 예를 들어, Ig 가변 영역 단편을 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한 라이브러리는 파지 피복 단백질을 인코딩하는 서열과의 프레임에서, 필라멘트성 바이러스파지, 가령 M 13 또는 이의 변이체의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 융합 단백질은 경쇄 가변-영역 도메인 및/또는 중쇄 가변-영역 도메인과의 피복 단백질의 융합일 수 있다. 특정한 구체예에 따라서, 면역글로불린 Fab 단편은 파지 입자 상에서 또한 나타날 수 있다 (가령, 미국 특허 제5,698,426호를 참고).

또한 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브러리는 람다 파지에서, 예를 들어, 람다 ImmunoZap TM (H) 및 람다 ImmunoZap TM (L) 벡터를 사용하여 제조될 수 있다 (Stratagene, La Jolla, Calif.). 간략하게, mRNA는 B 세포 모집단으로부터 단리되고 람다 ImmunoZap(H) 및 람다 ImmunoZap(L) 벡터내 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브러리를 만드는 데에 사용된다. 이들 벡터는 개별적으로 선별되거나 또는 공동-발현되어 Fab 단편 또는 항체를 형성할 수 있다 (상기, Huse et al. 참고; 또한 상기, Sastry et al. 참고). 양성 플라크는 나중에 E.coli로부터의 단일클론 항체 단편의 고 수준 발현을 허용하는 비-용해성 플라스미드로 전환될 수 있다.

하이브리도마의 한 가지 구체예에서, 관심의 단일클론 항체를 발현하는 유전자의 가변 영역은 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭된다. 이들 프라이머는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 합성될 수 있거나, 또는 상업적으로 이용가능한 원천으로부터 구매될 수 있다 (가령, 특히 VHa, VHb, VHc, VHd, CHI, VL 및 CL 영역에 대한 프라이머를 포함한 쥐 및 인간 가변 영역에 대한 프라이머를 판매하는 Stratagene (La Jolla, Calif.)을 참고). 이들 프라이머는 중쇄 또는 경쇄를 증폭시키는 데에 사용될 수 있으며, 이후 벡터, 가령 ImmunoZAP TM H 또는 ImmunoZAP TM (Stratagene)내로 각각 삽입될 수 있다. 이 후 이들 벡터는 E. coli, 효모, 또는 발현을 위한 포유류-기반 시스템 내로 도입될 수 있다. VH 및 VL 도메인의 융합을 함유한 대량의 단쇄 단백질이 이들 방법을 이용하여 생성될 수 있다 (Bird et al., Science 242:423-426, 1988을 참고).

임의의 상기-설명된 면역화 및 기타 기술을 이용하여 본 발명에 따라 항체를 생성하는 세포가 일단 얻어지면, 특이 항체 유전자는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 표준 절차에 따라 이로부터 DNA 또는 mRNA를 단리 및 증폭시킴으로써 클로닝될 수 있다. 이로부터 생성된 항체는 서열화될 수 있고 그리고 식별된 CDR 및 CDR를 위한 DNA 코딩이 이전에 설명된 바와 같이 조작되어 본 발명에 따른 기타 항체를 발생시킬 수 있다.

바람직하게, 결합제는 ActRIIA에 특이적으로 결합한다. 모든 결합제 및 결합 분석과 마찬가지로, 해당 분야의 통상의 기술자는 결합제가 치료학적으로 유효하고 적합해지기 위해 탐지가능하게 결합해서는 안 되는 다양한 모이어티가 포괄적이고 열거하는 것이 불가능하다는 점을 인식한다. 그러므로, 본 명세서에서 개시된 결합제에 대하여, 용어 "특이적으로 결합"은 관련없는 대조군 단백질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도를 갖는, ActRIIA, 바람직하게는 인간 ActRIIA에 결합하는 결합제의 능력을 나타낸다. 바람직하게, 대조군 단백질은 암탉 난백 리소자임이다. 바람직하게, 결합제는 대조군 단백질에 대한 친화도 보다 적어도 50, 100, 250, 500, 1000, 또는 10,000배 더 큰 친화도를 갖는 ActRIIA에 결합한다. 결합제는 1 x 10^-7 M 이하, l x l0^-8 M 이하, l x l0^-9 M 이하, 1 x 10^-10 M 이하, 1 x 10^-11 M 이하, 또는 1 x 10^-12 M 이하의 인간 ActRIIA에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.

친화도는 친화도 ELISA 분석에 의해 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서 친화도는 BIACORE™ 분석에 의해 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 친화도는 동역학 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 친화도는 평형/용액 방법에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은 본 명세서에서 추가로 상세 설명되거나 또는 해당 분야에서 공지된다.

결합제, 가령 항체 또는 결합 파트너의 친화도, 그리고 결합제 (가령 항체)가 결합을 저해하는 정도는 기존의 기술을 이용하여, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR; BIACORE™, Biosensor, Piscataway, N.J.)으로 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 또는 Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51 :660-672 (1949))의해 설명된 방법에 따라서 측정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명을 위하여, 표적 분자는 고형상에 고정화되고 유동 세포를 따라 흐르는 이동상내 리간드에 노출된다. 고정화된 표적으로의 리간드 결합이 일어난다면, SPR 각의 변화를 야기하는 국부적 굴절률(refractive index)이 변화하며, 이는 반사광의 강도에서의 변화를 탐지함으로써 실시간으로 모니터링 될 수 있다. SPR 신호의 변화 속도는 분석되어 결합 반응의 연합(association) 및 분리 (dissociation) 상에 대한 명확한 속도 상수를 산출할 수 있다. 이들 값의 비는 명확한 평형 상수 (친화도)를 제공한다 (가령, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)를 참고).

올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 실시예 (서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9)에서 도시된 CDR 중 적어도 하나; 및/또는 ActRIIA와의 Ab-14E1의 결합을 교차-차단하는 및/또는 Ab-14E1에 의해 ActRIIA와의 결합으로부터 교차-차단되는 ActRIIA 결합제의 CDR; 및/또는 세포-기반 분석 (즉 ActRIIA 중화 결합제)에서 ActRIIA의 효과를 차단할 수 있는 ActRIIA 결합의 CDR과 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다면, 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명의 범위 내에 있는 ActRIIA 결합제 폴리펩티드 및 항체의 실시예는 Ab-14E1의 가변 영역 (서열번호: 12 및 13)과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, 그리고 ActRIIA와의 Ab-14E1의 결합을 교차-차단하고, 및/또는 Ab-14E1에 의해 ActRIIA와 결합하는 것으로부터 교차-차단되는 아미노산 서열을 갖고; 및/또는 세포-기반 분석 (즉 ActRIIA 중화 결합제)에서 ActRIIA의 저해성 효과를 차단할 수 있고; 및/또는 하기 실시예에서 설명된 접촉 잔기 중 하나 이상과 결합하는 것들이다.

본 발명의 범위 내에 있는 ActRIIA 결합제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 실시예는 Ab-14E1의 가변 영역 (서열번호: 15 및 16)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하며, 여기서 인코딩된 ActRIIA 결합제는 ActRIIA와의 Ab-14E1의 결합을 교차-차단하고, 및/또는 Ab-14E1에 의해 ActRIIA에 결합하는 것으로부터 교차-차단되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖고; 및/또는 세포-기반 분석 (즉, ActRIIA 중화 결합제)에서 ActRIIA의 저해성 효과를 차단할 수 있거나; 또는 하기 실시예에서 설명된 접촉 잔기 중 하나 이상과 결합하는 것들이다.

본 발명의 ActRIIA 결합제는 본 명세서에서 설명된 세포-기반 분석에서 및/또는 본 명세서에서 설명된 생체내 분석에서의 ActRIIA 기능을 바람직하게 조정하고 및/또는 하기 실시예에서 설명된 ActRIIA의 접촉 잔기 중 하나 이상과 결합하고 및/또는 본 출원에서 설명된 항체 Ab-14E1의 결합을 교차-차단하고 및/또는 본 출원에서 설명된 항체 Ab-14E1에 의해 ActRIIA에 결합하는 것으로부터 교차-차단된다. 이에 따라, 이러한 결합제는 본 명세서에서 설명된 분석을 이용하여 식별될 수 있다.

특정 구체예에서, 결합제는 실시예에서 설명된 ActRIIA의 접촉 잔기 중 하나 이상과 결합하는 일차 식별 항체에 의해 발생되고 및/또는 본 명세서에서 설명된 세포-기반 및/또는 생체내 분석에서 중화시키고 및/또는 본 출원에서 설명된 항체 Ab-14E1을 교차-차단하고 및/또는 본 출원에서 설명된 항체에 의해 ActRIIA을 결합하는 것으로부터 교차-차단된다. 이후 이들 항체로부터의 CDR 영역은 적절한 생체적합 프레임워크 내로 삽입되는 데에 사용되어 ActRIIA 결합제를 만들어 낸다. 결합제의 비-CDR 부분은 아미노산으로 구성될 수 있거나, 또는 비단백질 분자일 수 있다. 본 명세서에서 설명된 분석은 결합제의 특징을 허용한다. 바람직하게, 본 발명의 결합제는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 항체이다.

본 발명에 따른 항체를 발생시키기 위한 본 명세서에서 설명된 방법에서, 새로운 프레임워크 및/또는 불변 영역 내로 특정 Ab-14E1 CDR의 조작을 포함한, 적절한 분석은 바람직한 항체 또는 결합제를 선택하는 데에 이용가능하다 (즉 ActRIIA와의 결합 친화도를 측정하기 위한 분석; 교차-차단하는 분석, 가령 하기 실시예 4에서 설명된 BIACORE™-기반 인간 ActRIIA 펩티드 에피토프 경쟁 결합 분석; A204 세포-기반 분석; 생체내 분석).

용어 "교차-차단한다", "교차-차단된다" 및 "교차-차단하는"은 ActRIIA와의 기타 항체 또는 결합제의 결합을 방해하는 항체 또는 기타 결합제의 능력을 의미하는 데에 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

항체 또는 기타 결합제가 ActRIIA와의 또 다른 것의 결합을 방해할 수 있는 정도, 및 따라서 본 발명에 따라 교차-차단하는 것으로 말할 수 있는 지 없는 지는 경쟁 결합 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 한 가지 특정하게 적합한 정량 분석은 표면 플라스몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 BIACORE™ 기기를 이용한다. 실시예 4는 BIACORE^TM 기반 교차-차단 분석을 수행하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 적합한 정량적 교차-차단 분석은 ELISA-기반 기법을 이용하여 ActRIIA와의 결합에 대해 항체 또는 기타 결합제 간의 경쟁을 측정한다.

일반적으로, 다음은 항체 또는 기타 결합제가 본 발명에 따라 교차-차단하거나 또는 교차-차단 할 수 있는지 없는지 확인하기 위한 적합한 BIACORE^TM 분석을 설명한다. 편의를 위해, 두 개의 항체에 대해 참고가 만들어졌지만, 하지만 분석은 본 명세서에서 설명된 임의의 ActRIIA 결합제로 이용될 수 있다는 점이 이해될 것이다. BIACORE^TM 기기 (예를 들어 BIACORE^TM 3000)는 제조자의 권장에 따라서 작동된다.

따라서 한 가지 교차-차단 분석에서, ActRIIA-mFc 융합 단백질은 CM5 BIACORE^TM 칩 상에서 이전에 부착된 항-mFc IgG에 의해 포획되어 ActRIIA-피복 표면을 발생시킨다. 전형적으로, ActRIIA-mFc (이합체)의 200-800 공명 유닛은 칩과 커플링될 것이다 (용이하게 측정가능한 수준의 결합을 제공하지만 사용되는 검사 시약의 농도에 의해 쉽게 포화시킬 수 있는 양).

서로 교차-차단하는 이들의 능력에 대해 평가되기 위한 두 개의 항체 (A* 및 B*로 명명됨)는 적합한 완충액내 결합 부위의 1 대 1 몰 비로 혼합되어 검사 혼합물을 만들었다. 결합 부위 기준으로 농도를 계산할 때, 항체의 분자량은 그 항체에서의 ActRIIA 결합 부위 수로 나눈 항체의 총 분자량으로 추정된다.

검사 혼합물내 항체 각각의 농도는 BIACORE™ 칩 상에 포획된 ActRIIA-mFc 분자에서의 그 항체의 결합 부위를 쉽게 포화시키기 위해 충분이 높아야한다. 혼합물내 항체는 동일한 몰 농도 (결합 기준으로)로 있으며 그 농도는 전형적으로 1.00 내지 1.5 마이크로몰 (결합 부위 기준으로)이다.

항체 A* 단독 및 항체 B* 단독을 함유한 개별적 용액이 또한 제조된다. 이들 용액내 항체 A* 및 항체 B*는 동일한 완충액 내에 그리고 검사 혼합물에서와 같이 동일한 농도로 있어야 한다.

검사 혼합물은 ActRIIA-mFc-피복 BIACORE™ 칩 위로 통과되고 결합의 총량이 기록된다. 이후 칩은 칩-결합 ActRIIA-mFc를 손상시키지 않고 결합된 항체를 제거하는 것에 관한 이러한 방식으로 처리된다. 전형적으로, 이것은 60초 동안 30 mM HCl로 칩을 처리하여 이루어진다.

이후 항체 A* 단독의 용액은 ActRIIA-mFc-피복 표면 위로 통과되고 결합량이 기록된다. 칩은 재처리되어 칩-결합 ActRIIA-mFc를 손상시키지 않고 결합된 항체 모두를 제거한다.

이후 항체 B* 단독의 용액은 ActRIIA-mFc-피복 표면 위로 통과되고 결합량이 기록된다.

항체 A* 및 항체 B*의 혼합물의 최대 이론적 결합은 그 다음에 계산되며, 이는 ActRIIA 표면 단독 위로 통과될 때의 항체 각각의 결합 합이다. 정확하게 기록된 혼합물 결합이 이 이론적 최대값보다 더 적다면, 두 개의 항체는 서로를 교차-차단한다.

따라서, 일반적으로, 본 발명에 따른 교차-차단 항체 또는 기타 결합제는 분석 동안에 그리고 본 발명의 이차 항체 또는 기타 결합의 존재에서, 기록된 결합이 조합내 두 개의 항체 또는 결합제의 최대 이론적 결합의 80% 내지 0.1% (가령 80% 내지 4%), 특정하게는 최대 이론적 결합의 75% 및 0.1% (가령 75% 내지 4%), 더욱 특정하게는 최대 이론적 결합의 70% 및 0.1% (가령 70% 내지 4%)이도록 (상기 정의된 바와 같음) 상기 BIACORE™ 교차-차단 분석에서 ActRIIA에 결합하게 될 것 중 하나이다.

상기 설명된 BIACORE™ 분석은 항체 또는 기타 결합제가 본 발명에 따라 서로 교차-결합하는지 확인하는 데에 이용되는 분석이다. 드물게, 특정한 항체 또는 기타 결합제는 항-mFc IgG를 통해 CM5 BIACORE™ 칩과 커플링된 ActRIIA-mFc에 결합할 수 없다 (이는 ActRIIA 상의 관련된 결합 부위가 mFc로의 ActRIIA 연결에 의해 가려지거나 또는 파괴되는 경우 발생할 수 있음). 이러한 경우, 교차-차단은 ActRIIA의 태그된 버전, 예를 들어 C-말단 His-태그된 ActRIIA 를 사용하여 확인될 수 있다. 이 특정한 구성 방식에서, 항-His 항체는 BIACORE™ 칩과 커플링될 것이고 이후 His-태그된 ActRIIA는 칩의 표면 위로 통과되고 항-His 항체에 의해 포획될 것이다. 교차-차단 분석은 각각의 칩 재생 주기 후, 새로운 His-태그된 ActRIIA가 항-His 항체로 피복된 표면 뒤에 로딩될 것을 제외하고는, 상기 설명된 바와 같이 본질적으로 수행될 것이다. 게다가, 해당 분야에서 공지된 다양한 기타 태그 및 태그 결합 단백질 조합은 이러한 교차-차단 분석을 위해 사용될 수 있다 (가령, 항-HA 항체를 이용한 HA 태그; 항-FLAG 항체를 이용한 FLAG 태그; 스트렙타비딘을 이용한 비오틴).

일반적으로, 다음은 항-ActRIIA 항체 또는 기타 ActRIIA 결합제가 본 발명에 따라 교차-차단하거나 또는 교차-차단할 수 있는지 없는지 확인하기 위한 ELISA 분석을 설명한다. 편의를 위해, 두 개의 항체에 대해 참고가 만들어졌지만, 하지만 분석은 본 명세서에서 설명된 임의의 ActRIIA 결합제로 이용될 수 있다는 점이 이해될 것이다.

분석의 일반적인 원리는 ELISA 플레이트의 웰 상에서 피복된 항-ActRIIA 항체를 갖는다는 점이다. 이차, 잠재적 교차-차단, 항-ActRIIA 항체의 초과량이 용액 내에 첨가된다 (즉, ELISA 플레이트에 결합하진 않음). 이후 ActRIIA (또는 대안적으로 ActRIIA-mFc) 의 제한된 양이 웰에 첨가된다. 용액내 피복된 항체 및 항체는 ActRIIA (또는 ActRIIA-mFc) 분자의 제한된 수의 결합을 위해 경쟁한다. 플레이트는 세척되어 피복된 항체에 의해 결합되지 않은 ActRIIA 를 제거하고 이차, 용액-상 항체 그리고 이차, 용액-상 항체와 ActRIIA 간에 형성된 임의의 복합체를 또한 제거한다. 이후 결합된 ActRIIA 양은 적절한 ActRIIA 검출 시약을 사용하여 측정된다. 피복된 항체를 교차-차단할 수 있는 용액내 항체는　ActRIIA　분자의 수에서 감소를 야기할 수 있을 것이며 여기서 피복된 항체는　ActRIIA　분자의 수에 대하여 결합할 수 있고,　이차,　용액-상 항체의 부재에서 결합할 수 있다.

이 분석은 Ab-14E1 및 이론적 항체에 대하여 더 상세하게 본 명세서에서 설명된다. 예를 들면, Ab-14E1이 고정화된 항체인 것으로 선택되는 경우, ELISA 플레이트의 웰 상에 피복되며, 그 후에 플레이트는 적합한 차단 용액으로 차단되어 차후에 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화한다. 이후 Ab-XX의 초과량은 웰 당 Ab-XX ActRIIA 결합 부위 몰이 ELISA 플레이트의 피복 동안에, 웰 당 사용되었던 Ab-14E1 ActRIIA 결합 부위의 몰보다 적어도 10 배 더 높도록 ELISA 플레이트에 첨가된다.

이후 ActRIIA는 웰당 첨가된 ActRIIA의 몰이 각 웰을 피복하기 위해 사용된 Ab-14E1 ActRIIA 결합 부위의 몰보다 적어도 25배 더 낮도록 첨가된다. 적합한 항온처리(incubation) 기간 후에, ELISA 플레이트는 세척되고 ActRIIA 검출 시약이 첨가되어 피복된 항-ActRIIA 항체 (이 경우에는Ab-14E1)에 의해 특이적으로 결합된 ActRIIA 양을 측정한다. 분석을 위한 백그라운드 신호는 피복된 항체 (이 경우에는 Ab-14E1), 용액-상 항체 (이 경우에는 Ab-XX), ActRIIA 완충액 단독(즉 ActRIIA가 없음) 및 ActRIIA 검출 시약을 이용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의된다. 분석을 위한 양성 조절 신호는 피복된 항체 (이 경우에는 Ab-14E1), 용액-상 항체 완충액 단독 (즉 용액-상 항체), ActRIIA 및 ActRIIA 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의된다. ELISA 분석은 백그라운드 신호보다 적어도 3배의 양성 조절 신호를 가지기 위하여 이러한 방식으로 진행될 필요가 있다.

방법론적 인공물에 대한 대조군으로서, 교차-차단 분석은 설명된 구성방식으로 진행될 수 있고 또한, Ab-XX는 피복된 항체로서 그리고 Ab-14E1은 용액-상 항체로서, 역이 될 수 있다.

A204 황문근육종 세포를 이용한 보고-유전자 분석이 주어진 항-ActRIIA 항체가 재조합 ActRIIA 리간드, 가령 액티빈 A 및 액티빈 B에 의해 내생 ActRIIA의 활성화를 중화시킬 수 있는지 없는지 확인하는 데에 이용될 수 있다. 항체의 부재에서, 이들 ActRIIA 리간드는 A204 세포에서 ActRIIA 신호전달을 분량-의족적으로 자극할 수 있다.

상기 분석을 시작하기 위해, A204 세포 (ATCC HTB-82)는 웰당 10⁵ 개 세포로 48-웰 플레이트 내에 분배된다. 그 다음 날, 세포는 일차 보고 플라스미드인, pGL3(CAGA)12 (Dennler et al, 1998, EMBO 17:3091-3100)와 형질감염 효율성을 위해 조절하는 데에 이용되는 레닐라(Renilla) 보고 플라스미드인, pRLCMV로 형질감염된다. CAGA12 모티프는 TGF-베타-반응 유전자 내에 존재하고, 따라서 이 벡터는 Smad2 및 Smad3을 통한 인자 신호전달을 위해 일반적으로 유용하다. 10 μg pGL3(CAGA)12, 1 μg pRLCMV, 30 μl Fugene 6 (Roche Diagnostics), 및 970 μl OptiMEM (Invitrogen)을 함유한 용액은 30분 동안 전항온처리되고(preincubated), 이후 실온에서 하룻밤 동안 항온처리를 위해 도말된 세포 (500 μl/웰) 에 적용된 맥코이(McCoy) 성장 배지에 첨가된다. 3일 째에, 배지는 제거되고 세포는 0.1% BSA를 함유한 인산염-완충 식염수에서 희석된 검사 물질과 함께 37℃에서 6시간 동안 항온처리된다 (250 μl/웰). 헹구고 난 후, 세포는 수동 용해 완충액 (Promega E1941)으로 용해되고 -70℃에서 하룻밤 동안 저장된다. 4일 째에, 플레이트는 부드러운 흔들림과 함께 실온까지 데워진다. 세포 용해물은 이중복으로 화학발광 플레이트 (96-웰)에 이동되고 듀얼-루시퍼라아제 리포터 어세이(Dual-Luciferase Reporter Assay) 시스템 (Promega E1980)으로부터 시약을 이용한 광도계에서 분석되어 정규화된 발광효소 활성도를 측정한다.

본 명세서에 개시된 항체는 단백질의 생체내 활성도에 중요한 인간 ActRIIA의 영역에 결합하고, 그렇게 함으로써 ActRIIA의 활성도를 저해한다. ActRIIA로의 항체의 결합은 ActRIIA-매개 신호전달, 예를 들어 액티빈-의존 종양형성을 가진 동물에서 순환 FSH 농도, 체중 또는 악액질의 마커와 연관된 바이오마커에서의 변화와 관련이 있을 수 있다.

ActRIIA 신호전달에 의존하는 약역학적 파라미터는 ActRIIA를 중화시킬 수 있는 ActRIIA 결합제를 식별하고 치료학적 혜택을 제공하기 위하여 ActRIIA 결합제의 생체내 검사에 대해 종점으로서 측정될 수 있다. 이러한 파라미터는 실시예에서 나타난 바와 같이 난소적출된 (OVX) 암컷내 혈청 FSH 농도, 제지방 체중 및 지방 함량을 포함한다. 이러한 약역학적 파라미터에서, 비히클-처리된 동물과 비교하여, ActRIIA 중화 결합제는 통계상으로 유의적인 변화를 일으킬 수 있는 것으로서 정의된다. 이러한 생체내 검사는 임의의 적합한 포유류 (가령 쥐, 랫트, 원숭이)에서 수행될 수 있다.

3. 선별 분석 및 기타 생물화학적 용도

특정한 측면에서, 본 발명은 ActRIIA의 작동제(agonist) 또는 길항제인 화합물 (약제)을 식별하기 위한 실험대상 ActRIIA 결합제의 용도에 관한 것이다. 이 선별을 통하여 식별된 화합물은 검사되어 생체 내 또는 시험관 내에서 ActRIIA-매개 신호전달을 조정하는 이들의 능력을 평가할 수 있다. 이들 화합물은 예를 들어, 동물 모델에서 검사될 수 있다.

다양한 분석 구성방식은 충분할 것이고 그리고 본 개시에 비추어, 본 명세서에서 명확히 설명되지 않은 상기 분석 구성방식은 그럼에도 불구하고 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 검사 화합물 (약제)은 임의의 조합의 화학적 방법에 의해 만들어질 수 있다. 대안적으로, 실험대상 화합물은 생체 내 또는 시험관 내에서 합성된, 자연 발생 생물분자일 수 있다. 조직 성장의 조절자로서 작용하는 이들의 능력에 대해 검사되어야 할 화합물 (약제)는 예를 들어, 박테리아, 효모, 식물 또는 기타 유기체 (가령, 천연 생성물), 화학적으로 생성된 것 (가령, 펩티드모방체를 포함하여, 소분자), 또는 재조합으로 생성된 것에 의해 생성될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 검사 화합물은 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬, 및 핵산 분자를 포함한다. 특정한 구체예에서 검사제는 약 2,000 달톤보다 작은 분자량을 가진 작은 유기 분자이다.

본 발명의 검사 화합물은 단일, 별개의 독립체(entity)로서 제공되거나, 또는 가령 조합 화합에 의해 만들어진, 더 큰 복합성의 라이브러리에서 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예를 들어, 알코올, 할로젠화 알킬, 아민, 아미드, 에스테르, 알데하이드, 에테르 및 유기 화합물의 기타 종류를 포함할 수 있다. 검사 시스템에 대해 검사 화합물의 제시는 단리된 형태 또는 화합물의 혼합물로서, 특히 초기 선별 단계에서 이루어질 수 있다. 임의로, 화합물은 기타 화합물로 임의로 유도화될 수 있고 그리고 화합물의 단리를 촉진하는 유도기(derivatizing group)를 가질 수 있다. 유도기의 비-제한 예시는 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌(digoxygenin), 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자성 비드(magnetic bead), 글루타티온 S 전이효소 (GST), 광활성가능한 가교제 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.

화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 검사하는 많은 약물 선별 프로그램에서, 고속 처리 분석은 시간의 주어진 기간 내에 조사된 화합물의 수를 최대화하기 위하여 바람직하다. 무세포(cell-free) 시스템에서 수행되는, 가령 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유도될 수 있는 분석은 그들이 발생되어 검사 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서 신속한 발달 및 변형의 상대적으로 쉬운 탐지를 허용할 수 있다는 점에서 종종 "일차" 선별로서 바람직하다. 게다가, 검사 화합물의 세포 독성 또는 생체이용가능성의 효과는 시험관내 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있고, 상기 분석은 그 대신에, ActRIIA　결합제 및　ActRIIA　폴리펩티드 사이의 결합 친화도 변형에서 드러나는 바와 같이 분자 표적에 대한 약물의 효과에 일차적으로 주력한다.

단지 예증하기 위하여, 본 발명의 예시적인 선별 검사에서, 관심 화합물은 분석의 의도를 위해 적절한 바와 같이, ActRIIA 폴리펩티드에 일반적으로 결합할 수 있는, 단리된 그리고 정제된 ActRIIA 결합제와 접촉된다. 이후 화합물과 ActRIIA 결합제의 혼합물에 조성물 함유 ActRIIA 폴리펩티드가 첨가된다. ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA 결합제 사이의 복합체의 탐지 및 정량화는 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA 결합제 사이의 저해 (또는 강화) 복합체 형성에서 화합물의 효능을 확인하기 위한 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 검사 화합물의 다양한 농도를 이용하여 얻은 데이터로부터 분량 반응 곡선을 만듦으로써 평가될 수 있다. 게다가, 대조군 분석이 또한 수행되어 비교를 위한 기저선을 제공할 수 있다. 예를 들어, 대조군 분석에서, 단리된 및 정제된 ActRIIA 결합제는 ActRIIA 폴리펩티드를 함유한 조성물에 첨가되고, 그리고 ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA 결합제 사이의 복합체의 형성은 검사 화합물의 부재에서 정량화된다. 일반적으로, 반응물이 혼합될 수 있는 순서는 다양할 수 있고, 동시에 혼합될 수 있다는 점이 이해될 것이다. 게다가, 정제된 단백질을 대신하여, 세포 추출물 및 용해물이 적합한 무세포 분석 시스템을 시행하는 데에 사용될 수 있다.

ActRIIA 폴리펩티드 및 ActRIIA 결합제 사이의 복합체 형성이 다양한 기술에 의해 탐지될 수 있다. 예를 들어, 복합체 형성의 조절은 예를 들어, 탐지가능하게 표지된 단백질 가령, 방사성 표지된 (가령, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H), 형광으로 표지된 (가령, FITC), 또는 효소로 표지된 ActRIIA 폴리펩티드 또는 ActRIIA 결합제를 사용하여, 면역분석으로, 또는 크로마토그래피식 검출법으로 정량화될 수 있다.

4. 치료제의 조제 및 전달

제약학적 조성물이 제공되며, 이는 제약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제와 함께, 상기-설명된 결합제, 가령 항체 Ab-14E1 또는 이의 인간화된 버전 중 하나를 포함한다.

가령, 피하, 경구, 비경구, 정맥내, 비강내, 및 근육내 투여 및 제제를 포함하여, 여러 가지 치료 요법에서 본 명세서에서 설명된 특정한 조성물을 이용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 발달이 해당 분야에서 잘 공지되고, 그 중 일부가 예증의 일반적인 목적을 위해 하기에 간략하게 논의된다.

특정한 출원에서, 본 명세서에 개시된 제약학적 조성물은 경구 투여를 통하여 동물에게 전달될 수 있다. 이로써, 이들 조성물은 불활성 희석제로 또는 동화가능한 식용 담체로 조제될 수 있거나, 또는 이들은 딱딱하거나 또는 연한-외피 젤라틴 캡슐내로 밀봉될 수 있거나, 또는 이들은 알약 내로 압축될 수 있거나, 또는 이들은 식이요법의 음식에 직접 편입될 수 있다.

특정한 환경에서, 본 명세서에 개시된 제약학적 조성물을 피하로, 비경구로, 정맥 내로, 근육 내로, 또는 심지어 복강 내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 기법은 통상의 기술자에게 잘 공지되고, 이들 중 일부는 예를 들어, 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5,641,515호 및 미국 특허 제 5,399,363호에서 추가 설명된다. 특정한 구체예에서, 유리 염기로서 활성 화합물 또는 약물학적으로 허용가능한 염의 용액이 계면활성제, 가령 하이드록시프로필셀룰로오스로 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 그리고 오일에서 분산제가 제조된다. 저장 및 용도의 일반적인 조건 하에, 이들 제조물은 일반적으로 방부제를 함유하여 미생물의 성장을 예방할 것이다.

주사가능한 용도를 위해 적합한 예시적인 제약학적 형태는 멸균한 수성 용액 또는 분산제 및 멸균한 주사가능 용액 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균한 분말을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,466,468호). 모든 경우에, 상기 형태는 멸균되어야 하고 용이한 주사 능력이 있는 정도로 유체여야 한다. 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야하고 미생물, 가령 박테리아 및 곰팡이의 오염작용에 대항하여 보존되어야한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유한 용매 또는 분산매일 수 있다. 알맞은 유동성이 예를 들어, 레시틴과 같은 피복 사용에 의해, 분산제의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및/또는 계면활성제 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄, 페놀, 소르빈산, 티메로살(thimerosal) 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우, 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기적인 흡수는 약제의 조성물, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에서의 이용에 의해 흡수를 지연시키는 것을 야기할 수 있다.

한 가지 구체예에서, 수성 용액의 비경구 투여를 위하여, 상기 용액은 필요하다면, 적절하게 완충되어야하고 액상 희석제는 먼저, 충분한 식염수 또는 글루코오스로를 이용하여 등장성으로 만들어 주어야한다. 이들 특정한 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 활용될 수 있는 멸균된 수성 매체는 본 개시에 비추어 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에서 용해되고 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에서 주사될 수 있다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038 및 1570-1580을 참고). 투여량에서의 일부 편차는 처리되는 실험대상의 상태에 따라서 어쩔 수 없이 발생할 것이다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제조물은 FDA Office of Biologies 표준에 의해 요구된 바와 같이 멸균성, 발열성, 및 일반적인 안정성 및 순도 표준을 당연히 바람직하게 충족시킬 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 명세서에서 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 예시적인 제약학적으로-허용되는 염은 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함하며, 이는 무기산 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 가령 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성된다. 또한 유리 카르복실기로 형성된 염은 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모니움, 칼슘, 또는 수산화 제2 철(ferric hydroxide), 그리고 유기 염기, 가령 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다. 조제 시, 용액은 투여 제제와 양립할 수 있는 방식으로, 그리고 치료학적으로 유효한 이러한 양으로 투여될 것이다.

담체는 용매, 분산매, 비히클, 피복제, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등 모두를 추가로 포함할 수 있다. 제약학적 활성 물질을 위한 이러한 매체 및 물질의 용도는 해당 분야에 잘 공지된다. 임의의 기존 매체 또는 물질이 유효 성분(active ingredient)과 양립하지 않는 다는 점을 제외하고, 치료학적 조성물내 이의 용도가 고려된다. 추가의 유효 성분은 또한 조성물 내에 편입될 수 있다. 관용구 "제약학적으로-허용되는"은 인간에게 투여될 때 알레르기성 또는 유사한 부반응(untoward reaction)을 야기하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 나타낸다.합한 숙주 세포/유기체내로 본 발명의 조성물의 도입을 위해 사용된다. 특정하게,

특정 구체예에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 비히클 등은 적 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 비히클, 나노구형, 또는 나노 입자 등 내에 캡슐화되어 전달하기 위해 조제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 이러한 담체 비히클의 표면에 공유 결합으로 또는 비-공유결합으로 결합될 수 있다.

잠재적인 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀 유사 제조물의 형성 및 용도는 해당 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 공지된다 (예를 들어, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995; 미국 특허 제5,567,434호; 미국 특허 제 5,552,157호; 미국 특허 제 5,565,213호; 미국 특허 제 5,738,868호 및 미국 특허 제 5,795,587호를 참고하고, 이들 각각은 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 특이적으로 편입됨). 리포좀의 용도는 전신 전달 후 자가면역 반응 또는 허용되지 않는 독성과 연관되는 것으로 나타나지 않는다. 특정 구체예에서, 리포좀은 수성 매체에서 분산되는 인지질로부터 형성되고 자발적으로 다중라멜라 동심 이중층 소포체 (또한 용어 다중라멜라 소포체 (MLV))를 형성한다.

대안적으로, 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 제약학적으로-허용되는 나노입자 제제를 위해 제공한다. 일반적으로, 나노입자는 안정한 그리고 생산적인 방식으로 화합물을 인트랩(entrap)할 수 있다 (예를 들어, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998을 참고). 세포내 중합의 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자 (약 0.1 um 크기)는 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계될 수 있다. 이러한 입자는 예를 들어, Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(l):l-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2):149-55, 1998; Zambaux et al., J Controlled Release 50(l-3):31-40, 1998; 및 미국 특허 제5,145,684호에 의해 설명된 바와 같이 만들어질 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 제약학적 조성물은 이러한 제약학적 조성물의 용도에 관한 설명을 제공하는 포장재와 함께, 용기 내에 배치될 수 있다. 일반적으로, 이러한 설명은 시약 농도, 그리고 특정한 구체예 내에서, 제약학적 조성물을 재구성하는 데에 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석제 (가령, 물, 식염수 또는 PBS)의 상대량을 설명하는 명백한 표현을 포함할 것이다.

투여되는 분량은 체중의 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg 범위에 있을 수 있다. 하지만, 해당 분야의 통상의 기술자에게 분명해질 것과 같이, 투여의 양과 빈도는 당연히, 치료될 증상의 성질 및 중증도, 바람직한 반응, 환자의 상태 등과 같은 요인에 의존할 것이다.

5. ActRIIA 결합제의 치료학적 용도

특정한 구체예에서, 본 발명의 ActRIIA 결합제는 ActRIIA 및/또는 ActRIIA 리간드 (가령, 액티빈 A, GDF8, 또는 GDF11)의 비정상 활성도와 연관된 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이들 질병, 장애, 또는 질환은 일반적으로, 본 명세서에서 "ActRIIA-연관 질환"으로 언급된다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 개체에게 상기 설명된 바와 같은 ActRIIA 결합제의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 통하여 병든 개체에서 질병, 장애, 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 특정하게, 동물, 및 더욱 특정하게는 인간의 치료적 그리고 예방적 치료를 목표로 한다.

본 개시는 예를 들어, ActRIIA를 표적으로 하는 중화 항체와 같은 ActRIIA 결합제의 치료학적 유효량을 개체에 투여함으로써 병든 개체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 인히빈-알파 서브유닛에서 유전적으로 결핍이 있는 쥐는 인히빈 A 및 인히빈 B에서 결핍이 있으며, 이는 액티빈 A 및 B를 과발현하는 생식선 종양을 야기한다 (Matzuk et al., 1992, Nature 360:313-319; Matzuk et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:8817-8821). 이러한 쥐 모두는 이 종양이 생기고 결국에는 ActRIIA를 통하여 작용하는 고수준의 종양-유도 액티빈에 의해 매개된 암 악액질-유사 증후군으로 죽는다 (Coerver et al., 1996, Mol Endocrinol 10:534-543). 본 발명에 제한됨 없이, ActRIIA를 표적으로 하는 중화 항체는 인히빈-결핍 쥐에 대해 본 명세서에서 나타난 바와 같이, 액티빈-생성 종양의 영향을 치료하고, 액티빈-매개 악액질을 완화시키고, 그리고 환자의 생존을 연장시키는 데에 유용한다 (실시예 참고).

ActRIIA 및 ActRIIA-리간드 복합체는 조직 성장 그리고 다양한 구조의 보정 형성과 같은 초기 발달 과정에서 또는 성적 발달, 뇌하수체 호르몬 생성, 및 뼈와 연골의 형성을 포함한 하나 이상의 발달-후 능력에서 중요한 역할을 한다. 따라서, ActRIIA-연관 질환은 비정상적인 조직 성장 및 발달 결핍을 포함한다. 추가적으로, ActRIIA-연관 질환은 세포 성장 및 분화의 장애, 가령 염증, 알레르기, 자가면역 질환, 감염성 질병, 및 종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

예시적인 ActRIIA-연관 질환은 신경근 장애 (가령, 근이영양증 및 근위축증), 울혈성 폐쇄성 폐질환 또는 폐기종 (및 근육 소모와 연관됨), 근육 소모 증후군, 근육감소증, 악액질, 지방 조직 장애 (가령, 비만), 제 2형 당뇨병, 및 골 퇴행성 질병 (가령, 골다공증)을 포함한다. 다른 예시적인 ActRIIA-연관 질환은 근육퇴행성 및 신경근 장애, 조직 수복 (가령, 상처 치유), 신경변성 질환 (가령, 근위축측삭경화증), 면역학적 질환 (가령, 림프구의 비정상적인 증식 또는 기능과 관련된 질환), 및 비만 또는 지방조직의 비정상적인 증식과 관련된 질환을 포함한다.

특정한 구체예에서, 본 발명의 ActRIIA 결합제는 근이영양증에 대한 치료의 부분으로서 사용될 수 있다. 용어 "근이영양증"은 골격근 그리고 가끔은 심근 및 호흡관 근육의 점진적인 약화 및 저하로 특징되는 퇴행성 근육 질병의 그룹을 나타낸다. 근이영양증은 근육에서 미세한 변화로 시작되는 진행성 근육 소모 및 약화로 특징되는 유전 질환이다. 근육은 시간에 걸쳐 퇴화되기 때문에, 인간의 근육 강도가 줄어든다. 실험대상 ActRIIA 결합제를 포함한 요법으로 치료될 수 있는 예시적인 근이영양증은 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, (DMD)), 베커 근이영양증(Becker muscular dystrophy (BMD)), 에머리-드레이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD)), 사지연결근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy (LGMD)), 안면견갑상완근이영양증(fascioscapulohumeral muscular dystrophy (FSH 또는 FSHD)) (또한 란두우지-디제린(Landouzy-Dejerine)으로도 공지됨), 근긴장성 근이영양증(myotonic muscular dystrophy (MMD)) (또한 슈타이너트 질병(Steinert's Disease)으로도 공지됨), 눈인두근이영양증(myotonic muscular dystrophy (OPMD)), 원위근이영양증(distal muscular dystrophy (DD)), 선청성 근이영양증(congenital muscular dystrophy (CMD)), 및 견갑상완근이영양증(scapulohumeral muscular dystrophy (SMD))를 포함한다.

뒤시엔느 근이영양증 (DMD)은 1860년대에 프랑스 신경학자 기욤 벤자민 하만드 뒤시엔드(Guillaume Benjamin Amand Duchenn)에 의해 처음 설명되었다. 베커 근이영양증 (BMD)은 1950년대에 DMD의 이 변이체를 처음 설명한, 독일 의사 피터 에밀 베커(Peter Emil Becker)의 이름을 따서 명명된다. DMD는 남성에서 가장 빈번하게 유전되는 질병 중 하나이며, 3,500명의 소년 중 한 명이 앓고 있다. X 염색체의 짧은 팔(Short arm of a chromosome)에 위치한 디스트로핀(dystrophin) 유전자가 파괴될 때 DMD가 발생한다. 남성만이 한 쌍의 X 염색체를 가지고 있기 때문에, 그들은 오직 한쌍의 디스트로핀 유전자를 가지고 있다. 디스트로핀 단백질 없이는, 근육이 수축과 이완 주기 동안에 쉽게 손상된다. 근육 질병에서의 초기는 재생으로 보상하는 반면에, 나중에는 근육 전구 세포에서 계속 진행되는 손상을 따라잡을 수 없으며 건강한 근육이 비-기능적 섬유-지방 조직에 의해 대체된다.

BMD는 디스트로핀 유전자내 상이한 돌연변이에서 기인한다. BMD 환자는 몇몇 디스트로핀을 가지고 있지만, 하지만 양에서 불충분 하거나 질에서도 불량하다. 어느 정도의 디스트로핀을 갖는 것은 DMD를 앓는 사람들만큼 심하게 또는 빠르게 퇴화하는 것으로부터 BMD를 앓는 사람들의 근육을 보호한다.

예를 들어, 연구는 생체 내에서 GDF8 (ActRIIA 리간드)의 차단 또는 제거 기능이 DMD 및 BMD 환자에서의 적어도 특정한 증상을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 실험대상 ActRIIA 결합제는 GDF8 저해제 (길항제)로서 작용할 수 있고, 그리고 DMD 및 BMD 환자의 생체내 GDF8 및/또는 ActRIIA의 기능을 차단하는 대안적인 수단을 구성한다.

다른 구체예에서, ActRIIA 결합제는 예시로 염증성 근질환, 대사성 근질환, 및 근긴장증을 포함하는 근질환에 의한 근위축증을 치료하거나 예방하는 데에 또한 사용될 수 있다. 실험대상 ActRIIA 결합제는 선천적 근질환, 가령 근세관성 근질환, 네말린 근질환, 및 미토콘드리아 근질환을 치료하는 것에서 적용된다. 실험대상 ActRIIA 결합제는 봉입체 근염, 마이오글로빈뇨증, 횡문근변성, 화골성 근염, 다발성 근염, 또는 피부근염을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 추가적으로, ActRIIA 결합제는 글루코코르이코이드 치료, 근육감소증, 장기간 침상 안정, 골격 고정화, 패혈증, 또는 선천적 심부전으로 인한 근이영양증을 치료하거나 예방할 수 있다.

실험대상 ActRIIA 결합제는 근육 성장이 필요한 다른 신경근 질병 또는 질환에서 근육 질량을 증가시키는 데에 효과적인 수단을 제공한다. 예를 들어, 근위축측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis (ALS), 또한 루게릭 병 또는 운동뉴런 질환이라고도 공지됨)은 만성의, 불치의, 그리고 제지할 수 없는 CNS 장애이며, 이는 뇌를 골격근에 연결하는 CNS의 구성요소인, 운동 뉴런을 공격한다. ALS에서, 운동 뉴런이 악화되고, 결국에는 죽게 되며, 그리고 사람의 뇌가 완전하게 기능하고 깨어있는 것으로 정상적으로 남아있음에도 불구하고, 움직이기 위한 명령이 근육에 도달하지 않는다. ALS가 발병한 대부분의 사람은 40 내지 70 세이다. 약화된 일차 운동 뉴런은 팔 또는 다리에 초래한 것들이다. ALS를 앓는 사람들은 걷는 데에 어려움을 가지고 있고, 그들은 물건을 떨어뜨리고, 넘어지고, 그들의 말을 불분명하게 발음하고, 그리고 비통제적으로 웃거나 울 수 있다. 결국에 사지의 근육이 못 쓰게 되는 것에서부터 위축되기 시작한다. 이러한 근육 약화는 쇠약해질 것이고 사람은 휠체어가 필요하게 될 것이고 또는 침대 밖에서 기능할 수 없게 될 것이다. 대부분의 ALS 환자는 발병 3-5 년에, 호흡 부전 또는 폐렴과 같은 산소호흡기 보조의 합병증으로 사망한다. ActRIIA 결합제가 유용할 수 있는 기타 신경근 질병은 척추 부상 또는 뇌졸중으로 인한 마비; 트라우마 또는 퇴행성, 대사성, 또는 염증성 신경병증으로 인한 신경제거; 성인 운동 뉴런 질병; 다초점 전도체 차단을 동반한 자가면역 운동 신경병증; 및 소아 또는 청소년 척수성 근위축을 포함할 수 있다.

ActRIIA 결합제에 의해 유도된 증가된 근육 질량은 근육 소모 질병을 앓는 환자들에게 또한 혜택일 수 있다. Gonzalez-Cadavid et al. (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14938-43)은 인간에서 GDF8 발현이 제-지방 질량과 역으로 상관관계가 있다는 점 및 GDF8 유전자의 증가된 발현이 AIDS 소모 증후군을 앓는 남성에서 무게 감소와 상관관계가 있다는 점이 보고하였다. AIDS 환자에서 GDF8의 기능을 저해함으로써, 만약 완전하게 제거되지 않는다면, AIDS의 적어도 특정한 증상이 개선될 수 있으며, 따라서 AIDS 환자의 삶의 질을 상당히 향상시킬 수 있다.

암 식욕부진-악액질 증후군은 가장 쇠약하게 하고 삶을 위협하는 암의 측면 중 하나이다. 암 식욕부진-악액질 증후군에서 점진적 무게 감소는 암의 많은 유형 중 공통적인 특징이고 그리고 삶의 불량한 질 및 화학요법에 대한 불량한 반응뿐만 아니라, 또한 무게 감소가 없는 비교가능한 종양을 가진 환자에서 찾아볼 수 있는 것보다 더 짧은 생존 시간의 원인이 된다. 식욕부진, 지방 및 근육 조직 소모, 정신적인 고통, 및 삶의 낮은 질과 연관하여, 악액질은 암과 숙주 사이의 복합적 상호작용로부터 발생한다. 이는 암 환자 중에서 가장 일반적인 사망의 원인이며, 80% 사망률로 존재한다. 이는 단백질, 탄수화물, 및 지방 대사에 영향을 주는, 물질대사 혼란의 복합적 예시이다. 종양은 직접적 및 간접적 이상을 둘 다 만들어 내며, 이는 식욕부진 및 무게 감소를 야기한다. 현재, 과정을 조절하거나 역전시키기 위한 치료법이 없다. 암 식욕부진-악액질 증후군은 사이토카인 생성, 지질-가동화 및 단백질분해-유도 인자의 방출, 및 중간 대사에서의 변이에 영향을 준다. 식욕부진이 일반적임에도 불구하고, 감소된 음식 섭취 단독으로는 암 환자에서 나타나는 신체 조성 내의 변화를 설명할 수 없고, 그리고 영양분 섭취를 증가시키는 것은 소모 증후군을 역전시킬 수 없다. 6개월 기간 내에 발병전 무게의 5%보다 큰 비자발적인 무게 감소가 일어난다면, 일반적으로 악액질이 암 환자에서 의심된다.

성체 쥐에서 GDF8의 전신적인 과발현이 인간 악액질 증후군에서 나타나난 것과 유사한 극심한 근육 및 지방 손실을 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에 (Zimmers et al., 2002, Science 296:1486-1488), 제약학적 조성물로서 실험대상 ActRIIA 결합제는 근육 증가가 바람직한 악액질 증후군의 증상을 예방하고, 치료하거나, 또는 완화시키는 데에 유익하게 사용될 수 있다. 이것은 암과 연관된 악액질 그리고 류마티스 관절염과 연관된 악액질을 포함할 것이다.

특정한 구체예에서, 본 발명은 ActRIIA 결합제, 예를 들어 개체에게 ActRIIA를 표적으로 하는 중화 항체의 치료학적 유효량을 투여함으로써 병든 개체내 FSH 분비를 감소시키거나 또는 저해하는 방법을 제공한다. 남성 내 FSH에 대한 표준치는 혈중 2 내지 18 mIU/ml 범위에 있다. 여성에 대한 표준치는 5 내지 25 mIU/mL 범위에 있다. 건강한 여성에서 50 mIU/mL 보다 높은 수준은 폐경기와 연관된다. FSH의 조직 농도는 침을 검사함으로써 측정될 수 있다 (eMHP™).

특정한 구체예에서, 본 발명은 FSH 분비를 감소시키기 위하여, ActRIIA 결합제, 예를 들어 개체에게 ActRIIA에 대항하는 중화 항체의 치료학적 유효량을 투여함으로써 병든 개체의 전립선암을 치료하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 인간, 특히 전립선 암 발병에 대해 높은 위험 인자를 가진 남성의 치료학적 그리고 예방적 치료법을 위해 사용될 수 있다. 모든 남성이 전립선 암을 발병시킬 위험 인자가 있기 때문에, 전립선 암 발병에 대해 높은 위험 인자를 가진 남성은 그의 위험 인자가 일반적인 모집단 또는 특정 연령 그룹 내에 있는 남성의 모집단과 비교하여 질병 발병의 더 큰 가능성을 부여하는 남성이다. 예시적인 위험 인자는 연령, 가족력 또는 유전자 구성, 운동 및 식이요법과 같은 생활습관, 및 방사능 또는 기타 암-유발제에 노출을 포함한다.

용어 "전립선 암을 치료"는 비치료 대조군에 비하여 또는 치료 전 질병의 중증도에 비하여 질병의 하나 이상의 증상 또는 특성의 향상을 나타낸다. 상기 용어는 치료를 받는 환자가 치유된다는 점 또는 질병이 환자로부터 완전하게 제거된다는 점을 필수적으로 요구하지는 않는다. 전립선 암을 치료하는 약제는 상기 질병의 하나 이상의 증상 또는 특성의 중증도를 감소시키는 약제일 수 있다. 종양 성장 및 진행이 세포 주기 진행 및 세포 분열의 매개자 및 세포사멸의 조절자, 또는 아폽토시스를 포함하여 다양한 인자에 의해 영향 받을 수 있다는 점을 주목해야한다. 이에 따라, 전립선 암을 치료하는 것은 암세포 증식의 감소 또는 세포 분열 속도의 감소를 수반할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전립선 암을 치료하는 것은 암 세포 생존의 감소 또는 아폽토시스의 증가를 수반할 수 있다. 이에 따라, 특정한 구체예에서, 전립선 암을 치료하는 것은 세포 분열의 감소 및 세포 사멸의 증가 둘 모두를 수반할 수 있다. 메커니즘에 상관없이, 전립선 암 치료에서의 약제의 유효성은 관찰가능한 미터법, 가령 대조군과 비교하여 (감소된 증식, 증가된 아폽토시스, 또는 둘 모두로 인해) 더 낮은 수의 암세포, 또는 대조군과 비교하여 종양 크기의 감소에 의해 측정될 수 있다. 그러므로 전립선 암을 치료하는 것 또는 종양 또는 암세포 성장을 저해시키는 것은 이러한 변화가 일어나는 메커니즘에 관해 중립적인 것으로 의도된다. 예방 및 치료 둘 모두는 외과의사 또는 기타 의료인에 의해 제공된 진단에서 및 치료제 투여의 의도된 결과 분석에서 구별될 수 있다.

인간에서 전립선 암 진행 상의 실험대상 길항제의 효과를 관찰할 때, 효과는 측정가능한 질병의 감소 또는 소멸, 및/또는 새로운 병변의 부재 또는 전이 예방에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, ActRIIA 결합제는 비침습성 및 침습성 전립선 암 둘 모두를 가진 환자에서 전립선 암 진행을 상당히 감소시키거나 또는 지연시킬 수 있다. 추가적으로, 상기 약제는 전립선 암에 대한 위험 요인을 가진 건강한 남성에서 전립선 암 발병의 위험 요인을 예방하거나 또는 감소시킬 수 있다. 이들 약제는 상기 질병의 병력을 가진 환자에서 전립선 암 재발의 위험을 또한 감소시킬 수 있다.

이에 따라, ActRIIA 결합제는 전립선 암 발병에 대해 위험 요소를 가진 것으로 간주되는 개체에서 전립선 암의 발병을 예방하거나 또는 지연시키는 데에 사용될 수 있고, 그리고 이러한 길항제는 선택된 환자 모집단에서 사용될 수 있다. 적절한 환자 모집단의 실시예는 전립선 암의 가족력을 가진 환자, 가령 아버지 또는 형제가 상기 질병을 진단 받았던 경우의 남성 환자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 전립선 암 발병에 대해 높은 위험 인자를 가진 것으로 간주되지만 하지만 상기 질병을 진단 받지 않은 환자는 ActRIIA 결합제로 치료된다. 이러한 치료는 환자가 30, 40, 50, 60, 또는 70 세에 도달할 때 시작할 수 있다.

이에 따라, ActRIIA 결합제는 전립선 암 발병에 대해 위험 요소를 가진 것으로 간주되는 개체에서 전립선 암의 발병을 예방하거나 또는 지연시키는 데에 사용될 수 있고, 그리고 이러한 길항제는 선택된 환자 모집단에서 사용될 수 있다. 적절한 환자 모집단의 실시예는 전립선 암의 가족력을 가진 환자, 가령 아버지 또는 형제가 상기 질병을 진단 받았던 경우의 남성 환자를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 전립선 암 발병에 대해 높은 위험 인자를 가진 것으로 간주되는 하지만 상기 질병을 진단 받지 않은 환자는 ActRIIA 결합제로 치료된다. 이러한 치료는 환자가 30, 40, 50, 60, 또는 70 세에 도달할 때 시작할 수 있다.

본 명세서에서 개시된 ActRIIA 결합제, 특히 항-ActRIIA 항체는 고형 종양을 가진 환자 그리고 전이성 암을 가진 환자를 포함한 환자의 전립선 암을 치료하거나 또는 예방하는 데에 사용될 수 있다. 또한 ActRIIA 결합제는 전립선의 전암성 또는 양성 병변을 가진 또는 전형적인 과형성, 비정형 과형성, 및 비침습성 또는 상피내 암종(in situ carcinoma)을 포함한 임의의 이상 증식 병변을 가진 인간 피험체에 투여될 수 있다. 또한 본 개시의 길항제는 호르몬-의존 또는 호르몬-반응 암 및 호르몬-비의존 암 (가령, 호르몬-내화성 전립선 암) 둘 모두의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. ActRIIA 결합제는 상승된 (정상적인 전립선 조직-유도 세포에 비하여) 수준의 액티빈 (가령, A, AB 또는 B) 또는 상승된 수준의 ActRIIA를 발현하는 종양에서 특히 유용한다는 것을 입증할 수있다.

특정한 구체예에서, 본 발명은 개체에게 ActRIIA 결합제, 가령 항-ActRIIA 항체의 치료학적 유효량을 투여함으로써 FSH-분비 뇌하수체 종양을 앓는 개체에서 FSH 분비를 감소시키거나 저해하는 방법을 제공한다. 이들 뇌하수체 종양에서 FSH-과분비를 저해하는 것은 종양 증상, 가령 증가된 에스트로겐 수준 및 난소 낭종의 발달을 감소시키는 치료로서 유용하다. 본 방법은 기존의 암 요법, 가령 수술과 함께 바람직하게 사용되지만, 하지만 FSH 분비의 저해 단독은 특히 수술 또는 방사선 치료가 사용이 금지되는 경우에, 효과적인 치료가 될 수 있다. 항-ActRIIA 항체는 난소 과자극 증후군을 앓는 환자를 치료하는 데에 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 기존의 암 요법 (가령, 화학요법, 방사능 요법, 광선요법, 면역요법 및 수술, 특히 전립선 절제술)의 유효성이 실험대상 결합제의 용도를 통하여 향상될 수 있다는 점을 인식한다. 이에 따라, ActRIIA 결합제는 전립선 암의 치료, 예방, 또는 관리를 위한 조합 요법으로 사용될 수 있다. 상기 결합제는 방사선 치료 및/또는 수술 치료와 조합하여 그리고 세포독성 화학요법 및/또는 내분비 요법과 조합하여 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 조합 치료는 상승작용으로 기능할 수 있고 각각의 개체 치료의 투여량의 감소를 허용하고, 그렇게 함으로써 더 높은 투여량에서 각 치료에 의해 나타나는 해로운 부작용을 감소시킬 수 있다. 다른 예로, 치료에 대해 내화성인 악성은 두 가지 이상의 상이한 치료의 조합 요법에 대해 반응할 수 있다. 이에 따라, 본 개시는 항-종양 약제의 치료적 효과를 향상시키거나 또는 이러한 항-종양 약제에 대한 세포 저항성을 극복하기 위하여, 수반하여 또는 연속하여 또 다른 기존의 항-종양 약제와 조합한 ActRIIA 결합제의 투여에 관한 것이다. 또한 본 개시는 호르몬 요법과 조합한 ActRIIA 결합제의 투여에 관한 것이다. 또한 ActRIIA 결합제는 FSH 분비 뇌하수체 종양으로 인한 증상을 감소시키기 위한 요법과 병행하여 사용된다. 조합적 항-종양 요법을 위해 사용될 수 있는 제약학적 조성물은 단지 예시하기 위해 다음을 포함한다: 아미노글루테티이미드(aminoglutethimide), 암사크린(amsacrine), 아나스트라졸(anastrozole), 아스파라기나아제(asparaginase), bcg, 비칼루타미드(bicalutamide), 블레오마이신(bleomycin), 부세렐린(buserelin), 부설판(busulfan), 캄포테신(campothecin), 카페시타빈(capecitabine), 카보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 클라드리빈(cladribine), 클로드로네이트(clodronate), 콜히친(colchicine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이프로테론(cyproterone), 사이타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 닥티노마이신(d액티노마이신), 다우노르비신(daunorubicin), 디엔에스트롤(dienestrol), 디에틸스티베스트롤(diethylstilbestrol), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에스트라디올(estradiol), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포사이드(etoposide), 엑스메스탄(exemestane), 필그라스팀(filgrastim), 플루다라빈(fludarabine), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 플루타미드(flutamide), 젬시다빈(gemcitabine), 제니스테인(genistein), 고세렐린(goserelin), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드, 이마티닙(imatinib), 인터페론(interferon), 이리노테칸(irinotecan), 이로노데칸(ironotecan), 레트로졸(letrozole), 류코보린(leucovorin), 레우프롤리드(leuprolide), 레바미솔(levamisole), 로무스틴(lomustine), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 메게스트롤(megestrol), 멜파란(melphalan), 메르캅토푸린(mercaptopurine), 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 닐루타마이드(nilutamide), 노코다졸(nocodazole), 오트레오티드(octreotide), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 파미드로네이트(pamidronate), 펜토스타틴(pentostatin), 플리카마이신(plicamycin), 포르피머(porfimer), 프로카르바진(procarbazine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 리투시맙(rituximab), 스트렙토조신(streptozocin,), 수라민(suramin), 타목시펜(tamoxifen), 테모졸로미드(temozolomide), 테니포시드(teniposide), 테스토스테론(testosterone), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 이염화 티타노센(titanocene dichloride), 토포테칸(topotecan), 트라스주맙(trastuzumab), 트레티노인(tretinoin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 및 비노렐빈(vinorelbine).

이들 화학요법 항-종양 화합물은 예를 들어, 다음 그룹 내로 그들의 작용 매커니즘에 의해 분류될 수 있다: 항-대사물/항-암 약제, 가령 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록슈리딘(floxuridine), 카페시타빈, 젬시다빈 및 사이타라빈) 및 푸린 유사체, 폴레이트(folate) 길항제 및 관련된 저해제 (메르캅토푸린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(chlorodeoxyadenosine) (클라드리빈)); 천연 산물, 가령 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) (빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈)를 포함한 항증식성/ 항유사분열 약제, 미세소관 장애물질, 가령 탁산(taxane) (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론(epothilones) 및 바벨빈(navelbine), 에피디포도필로톡신(epidipodophyllotoxins) (에토포사이드, 테니포시드), DNA 손상제 (액티노마이신(actinomycin), 암사크린 안트라사이클린(anthracycline), 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신(camptothecin), 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산(Cytoxan), 닥티노마이신, 다우노르비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴(hexamethylmelamineoxaliplatin), 이포스파미드(iphosphamide), 멜파란, 머클로르에타민(merchlorehtamine), 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아(nitrosourea), 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔(taxol), 탁소테르(taxotere), 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포라미드(triethylenethiophosphoramide) 및 에토포사이드 (VP16)); 항생제, 가령 닥티노마이신 (액티노마이신 D), 다우노르비신, 독소루비신 (아드리아마이신(adriamycin)), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신(mithramycin)) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신적으로 대사작용하고 그들 고유의 아스파라긴을 합성하는 능력을 가지고 있지 않은 세포를 허용치 않는 L-아스파라기나아제); 항혈소판제; 항증식성/항유사분열 알킬화제, 가령 질소 머스타드(nitrogen mustards) (메클로르에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜파란, 클로람부실), 에틸렌이민(ethylenimine) 및 메틸멜라민(methylmelamine) (헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine) 및 티오테파), 알킬 설포네이트(alkyl sulfonate)-부설판, 니트로소우레아 (카르무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠(trazene) - 다카르바지닌(dacarbazinine) (DTIC); 항증식성/항유사분열 항대사성물질, 가령 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 착화합물 (시스플라틴, 카보플라틴), 프로카르바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide); 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타마이드) 및 아로마타아제(aromatase) 저해제 (레트로졸, 아나스트라졸); 항응고제 (헤파린(heparin), 합성 헤파린염 염 및 트롬빈의 기타 저해제); 섬유소 용해제 (가령 조직 플라스미노겐 활성자, 스트렙토키나아제(streptokinase) 및 우로키나아제(urokinase)), 아스피린(aspirin), 디피리다몰(dipyridamole), 티클로피딘(ticlopidine), 클로피도그렐(clopidogrel), 앱시식맙(abciximab); 항이동제; 항분비제 (브레벨딘(breveldin)); 면역억제제 (사이클로스포린(cyclosporine), 타크로리무스(tacrolimus) (FK-506), 시롤리무스(sirolimus) (라파마이신(rapamycin)), 아자티오프린(azathioprine), 마이코페톨레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)); 항-혈관 신생 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 저해제 (혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 저해제, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 저해제); 안지오텐신(angiotensin) 수용체 차단제; 산화 질소 공여자; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스주맙); 세포 주기 저해제 및 분화 유도물질 (트레티노인); mTOR 저해제, 토포이소머라아제(topoisomerase) 저해제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린 캄프토테신, 다우노르비신, 닥티노마이신, 에니포사이드(eniposide), 에피루비신, 에토포사이드, 이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(corticosteroid) (코르티손(cortisone), 덱사메타손(dexamethasone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 메틸페레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니손(prednisone), 및 프레니솔론(prenisolone)); 성장 인자 신호 전달 키나아제 저해제; 미토콘드리아 기능장애 유도물질 및 카스파제(caspase) 활성제; 및 크로마틴(chromatin) 장애물질.

특정한 구체예에서, 조합 요법을 위해 사용될 수 있는 제약학적 화합물은 항-혈관 신생제, 가령 (1) "혈관신생 분자", 가령 VEGF 또는 bFGF (염기성 섬유모세포 성장인자)의 방출 저해제; (2) 혈관신생 분자의 중화제, 가령 항-βbFGF 항체; 및 (3) 콜라게나아제 저해제, 기저막 턴오버(turnover) 저해제, 혈관억제성(angiostatic) 스테로이드, 균류-유도 혈관신생 저해제, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘, 관절염 약물, 가령 D-페니실라민 및 골드 티오말레이트(gold thiomalate), 비타민 D3 유사체, 알파-인터페론, 등을 포함한, 혈관신생 자극에 대한 내피세포 반응의 저해제를 포함한다. 혈관신생의 추가적인 제안된 저해제에 대하여, Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988), 및 미국 특허 제5,092,885호, 제5,112,946호, 제5,192,744호, 제5,202,352호, 및 제6573256호를 참고한다. 추가적으로, 혈관신생을 저해하는 데에 사용될 수 있는 매우 다양한 화합물, 예를 들어, VEGF-매개 혈관신생 경로를 차단하는 펩티드 또는 약제, 엔도스타틴 단백질 또는 유도체, 앤지오스타틴의 리신 결합 단편, 멜라닌 또는 멜라닌-촉진 화합물, 플라스미노겐 단편 (가령, 플라스미노겐의 크링글(Kringle) 1-3), 트로포인(tropoin) 서브유닛, 빈트로넥틴(vitronectin) αvβ3의 길항제, 사포신(Saposin) B로부터 유도된 펩티드, 항생제 또는 유사체 (가령, 테트라사이클린(tetracycline), 또는 네오마이신(neomycin)), 디에노게스트(dienogest)-함유 조성물, 펩티드와 커플링된 MetAP-2 저해성 중심부를 포함하는 화합물, 화합물 EM-138, 칼콘(chalcone) 및 이의 유사체, 및 NAALADase 저해제가 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,395,718호, 제 6,462,075호, 제6,465,431호, 제6,475,784호, 제6,482,802호, 제6,482,810호, 제6,500,431호, 제6,500,924호, 제6,518,298호, 제6,521,439호, 제6,525,019호, 제6,538,103호, 제6,544,758호, 제6,544,947호, 제6,548,477호, 제6,559,126호 및 제6,569,845호를 참고.

조합 요법의 성질에 기반하여, 본 발명의 치료학적 ActRIIA 결합제의 투여는 기타 요법이 투여되면서 및/또는 투여 후에 지속될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 결합제의 투여는 단일 분량으로 또는 복수 분량으로 만들어질 수 있다. 몇 가지 예에서, 결합제의 투여는 기존 요법에 적어도 몇 일 앞서 시작되는 반면에, 또 다른 예에서, 투여는 기존 요법의 투여 직전 또는 투여시 시작된다.

본 출원의 한 가지 측면은 생식력에서 유용한 방법 및 조성물에 대해 제공한다. ActRIIA 결합제의 투여를 통하여 FSH 분비를 감소시키거나 또는 저해하는 것은 정자 성숙을 저해하는 데에 유용한 방법이다. 여성에서, FSH의 감소는 난소내 여포 과립막 세포의 증식을 제한시키는 것으로 작용한다. ActRIIA 결합제의 투여를 통하여 FSH 분비를 감소시키거나 또는 저해하는 것은 피임의 유용한 방법이다. 또한 감소된 FSH는 난소 내에서 여포의 성숙을 지연시킬 수 있고, 그렇게 함으로써 여성에서 제한된 수의 여포의 성숙을 연기한다. 이러한 치료는 나중에 자연 수정 및 임신의 가능성을 증가시키기 위한 잠재성을 갖는다. FSH 분비를 감소시킴으로써 난소 내에서 여포의 성숙을 지연시키는 것은 난모세포의 소모, 화학요법의 일반적인 부작용 또는 빠르게 분열하는 세포를 치료하는 것으로 설계된 유사 치료를 예방하는 것에서 또한 유용하다.

또한 본 출원은 하나 이상의 피임제와 조합하여 하나 이상의 ActRIIA 결합제를 포함한 신규 조성물에 대해 제공한다. 예시적인 피임제는 에스트로겐, 프로게스토겐(progestogen), 프로게스틴(progestin) (가령, 노르에티노드렐(norethynodrel), 노르에틴드론(norethindrone), 노르게스티메이트(norgestimate), 노르게스트렐(norgestrel), 레보노르게스트렐(levonorgestrel), 메드록시프로게스테론 및 데속게스트렐(desogestrel)), 오르멜록시펜(Ormeloxifene) (센트크로만(Centchroman))를 포함한다.

특정한 구체예에서, 본 발명은 FSH 분비를 감소시키거나 또는 저해하기 위하여, ActRIIA 결합제, 가령 ActRIIA를 표적으로 하는 중화 항체의 치료학적 유효량을 병든 개체에게 투여함으로써 상기 개체에서 에스트로겐 관련 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 에스트로겐 합성에서 FSH의 기능을 조절하는 것 때문에, FSH 분비의 감소는 또한 에스트로겐 관련 장애, 가령 자궁섬유종, 자궁내막증, 다낭성 난소 질병, 기능장애 자궁 출혈, 및 난소암의 치료에서 효과적일 수 있다.

실시예

본 발명은 이제 일반적으로 설명되며, 다음 실시예에 대해 참고함으로써 더욱 쉽게 이해될 것이며, 상기 실시예는 단지 본 발명의 특정한 구체예의 예증의 목적을 위해 포함되고, 본 발명에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1. 단일클론 항체의 발생

종(species) 사이 이 수용체의 높은 서열 보존 때문에 ActRIIA (ACVR2A)에 대항하는 항체를 발생시키는 것이 어려웠다. 출원인은 쥐의 A/J, BALB/c, 및 Swiss Webster 스트레인에게 상이한 ActRIIA-기반 면역원을 이용한 집중적인 면역화 프로토콜을 실시했지만, 하지만 이들 시도는 모두 항체를 발생시키는 데에 실패하였다.

이러한 어려움을 극복하기 위해, 출원인은 ActRIIA 유전자내 삭제 돌연변이(null mutation) 보유한 쥐를 면역화하는 데에 인간 ActRIIA 항원 구조체를 사용하였다. Acvr2a^-/- 쥐 (C57BL/6Acvr2a ^tm1Zuk )는 생존력이 감소되었고, 여기서 20-30% 의 쥐가 두개안면 이상 (craniofacial abnormality)으로 인해 출산 전후에 죽었다 (Matzuk et al., 1995, Nature 374:356-360). 동형 수컷은 생식력이 있는 반면에, 동형 암컷은 생식력이 없다. 중요하게는, Acvr2a^-/- 쥐가 성체 때까지 충분히 생존하여 인간 ActRIIA 수용체에 대항하는 단일클론 항체의 생성을 위해 사용되도록 그것들을 허용한다. 따라서, 여덟 마리의 수컷 및 여덟 마리의 암컷 Acvr2a^-/- 쥐를 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH) 또는 오브알부민(ovalbumin, OVA) 중 하나와 접합된 다음 인간 ActRIIA-His 서열로 그리고 완전한 프로인트 어쥬반트(Freund's adjuvant), 불완전한 프로인트 어쥬반트, 또는 인산-완충 식염수의 존재에서 피하로 면역화하였다 (25 μg/쥐).

SGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPHHHHHH* (서열번호: 3)

면역화 후 대략 10일에 혈액을 수집하여 항원으로서 ActRIIA-Fc를 사용하여 간접 ELISA로 항-ActRIIA 항체의 역가를 측정하였다. 선별에 기반하여, 면역화된 Acvr2a^-/- 쥐 한마리에게 항-CD40 단일클론 항체 (10 μg/쥐), CD40 작용물질과 함께 ActRIIA-His-KLH (50 μg/쥐) 의 이차 투여 (i.p.)를 제공하여 B-세포 활성화를 촉진하였다. 3일 후, 비장을 제거하였고, 그리고 표준 방법으로 B 세포를 SP2/0 쥐 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻었다. 전반적인 결합 특성(ELISA), 오프-율(off-rate) (BIACORE™ 분석), 및 중화 잠재성 (세포-기반 보고-유전자 분석)에 대한 선별에 기반하여 유망 하이브리도마 클론을 식별하였다. 2회의 하이브리도마 서브클로닝(subcloning) 후, 서열화, 정제, 및 추가 특징화를 위해 항체 후보 14E1.H8.H1 (Ab-14E1)를 선택하였다.

실시예 2. Ab-14E1 서열

본 발명에 따라서 생성되는 항체의 구조를 분석하기 위하여, 항-ActRIIA 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 클로닝하였다. QIAshredder (Qiagen) 균질화 시스템 및 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 하이브리도마 당 대략적으로 4 x 10⁶개 세포로부터 전령 RNA를 제조하였다. 일차-가닥 cDNA를 합성하는 데에 Advantage RT PCR Kit (Clontech)를 사용하였고, 이는 이후 Advantage-HF 2 PCR Kit (Clontech) 및 축퇴 프라이머 세트(degenerate primer set) (Zhou et al., 1994, Nucl Acids Res 22:888을 참고)와 조합하여 사용되어 PCR 증폭을 수행하였다.

PCR 반응 산물을 아가로오스 겔 및 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)로 정제하였다. 이후 불변 영역에 대해 상보적인 3' PCR 프라이머를 사용하여 표준 방법으로 서열을 결정하였다. Ab-14E1에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열은 도 1 및 2에 각각 나타나고, 그리고 상응하는 뉴클레오티드 서열은 도 3 및 4에 나타난다. 네 개의 뉴클레오티드 치환이 축퇴 PCR 프라이머에 의해 클로닝되는 동안 VH의 N-말단 근처에 도입되었으며, 이는 그럼에도 불구하고 활성 항체를 야기하였다는 점에 주목한다. 이들 뉴클레오티드를 최종 서열 (서열번호. 14, 위치 3, 6, 7, 및 12; 도 3)에서 조정하여 하이브리도마로부터 정제된 단백질의 N-말단 서열에 의해 확인된 바와 같이, 공지된 면역글로불린 프레임워크 서열에 맞추었다. 침묵(silent) 뉴클레오티드 치환은 VH (서열번호: 14, 위치 351 및 357; 도 3) 및 VL (서열번호: 15; 위치 312 및 315; 도 4)의 C-말단 근처에 도입되어 클로닝을 위한 제한 부위를 형성하였다는 점에 또한 주목한다.

하기 나열된 것은 Kabat et al. (1987, Sequences of proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA) 및 Chothia 및 협력자 (Al-Lazikani et al., 1997, J Mol Biol 273:927-948)에 따라 정의된, Ab-14E1에 대한 CDR 서열이다.

CDR-H1 YSITSGYYWN (서열번호: 4)

CDR-H2 YISYDGSNNYNPSLIN (서열번호: 5)

CDR-H3 YAYRNDVRFAY (서열번호: 6)

CDR-L1 RASQDISNFLN (서열번호: 7)

CDR-L2 FTSRLHS (서열번호: 8)

CDR-L3 QQGNTLPWT (서열번호: 9)

단백질 A 크로마토그래피, 투석, 바이러스 여과, 및 완충액 교환으로 하이브리도마 조건 배지로부터의 항체 단백질 정제를 수행하였다.

정제된 VH 및 VL 단백질의 N-말단을 N-말단 서열화로 확인하여 각각DVQLQESSGPG (서열번호: 10) 및 DIQMTQTTS (서열번호: 11)되도록 하였다.

실시예 3. Ab-14E1 및 ActRIIA 사이의 접촉 부위

Ab-14E1내 특이성-결정 잔기 (SDR)를 식별하기 위하여, a) 14E1 Fab 단독 및 b) ActRIIA 세포외 도메인(ECD)과 복합된 14E1 Fab의 x-선 결정학 분석으로 Ab-14E1 및 인간 ActRIIA 사이의 접촉 부위를 위치시켰다.

단백질 발생. 37℃에서 4시간 동안 4 mM EDTA 및 10 mM 시스테인을 함유한 인산-완충 식염수내 100:1 (w/w) Ab-14E1:파파인의 비에서 활성화된 파파인을 사용하여 Ab-14E1을 분해시킴으로써 결정화를 위해 14E1 Fab를 제조하였다. 분해된 샘플을 2배 희석하였고, pH 9.5까지 조정하였고, 그리고 HiTrap Q 세파로오스(Sepharose)™ (GE Healthcare)로 크로마토그래피를 시행하여 Fab 구성요소 (플로우-스로우(flow-through))를 분리하였고, 이후에 이를 크기-배제 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 정제된 14E1 Fab를 5 mM 트리스(Tris) (pH 8.0), 25 mM NaCl, 및 2 mM EDTA를 함유한 용액에서 12 mg/ml로 저장하였다.

엔테로키나아제(enterokinase) 절단 부위를 함유한 연결자에 의해 Fc 도메인에 부착되는 인간 ActRIIA ECD로 구성된 융합 단백질로부터 결정화를 위해 ActRIIA ECD를 제조하였다. 37℃에서 하룻밤 동안 엔테로키나아제를 이용한 이 융합 단백질의 분해 그리고 MABSELECT™ (GE Healthcare) 크로마토그래피를 이용한 Fc 구성요소의 제거로 ActRIIA ECD를 얻었다. 이후 ActRIIA ECD를 엔도글리코시다아제(Endoglycosidase) H_f (New England Biolabs)로 탈글리코실화하였고, 크기-배제 크로마토그래피로 정제하였고, 카르복시펩티다아제 B 및 Y로 분해하였고 (인산-완충 식염수 내 20:1 ActRIIA ECD:CPB/CPY의 비, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리 됨), 그리고 크기-배제 크로마토그래피로 다시 정제하였다. 단백질 복합체를 발생시키기 위하여, 정제된 14E1 Fab을 정제된 ActRIIA ECD와 1:1.2의 비로 혼합하였고 그리고 크기-배제 크로마토그래피로 최종 시간에 정제하였다. 14E1 Fab 및 ActRIIA ECD의 정제된 복합체를 10 mM 트리스 (pH 8.0) 및 25 mM 염화나트륨을 함유한 용액에서 20.5 mg/ml로 저장하였다.

결정화 방법. 폴리에틸렌 글리콜을 15-25%로, 염, 가령 티오시안산 칼륨, 황산 나트륨, 말로네이트, 또는 타르타르산 나트륨 칼륨을 함유하는, 및 5.5 내지 8.5 범위의 pH값의 조건에서 14E1 Fab를 결정화하였다. 20% 폴리에틸렌 글리콜 3350, 200 mM 황산 나트륨 및 100 mM 비스-트리스 프로판에서 커진, pH 7.75의 결정체로부터 데이터를 수집하였다. 3:1 (v/v) 비의 결정화 완충액 및 글리세롤로 구성된 완충액 내로 이들 결정체를 이동시켰고 그리고 x-선 시스템 상으로 이동시키기 전에 액상 질소에서 급냉동시켰다.

폴리에틸렌 글리콜을 7-15%로, 염화 아연을1-15 mM으로 함유하는, 및 5.5 내지 7.5의 pH 값의 조건에서 14E1 Fab 및 ActRIIA ECD의 복합체를 결정화하였다.pH 7.00에서의 8% 폴리에틸렌 글리콜 8000, 8 mM 염화 아연, 및 100 mM HEPES에서 커진, pH 7.00의 결정체로부터 데이터를 수집하였다. 25% 에틸렌 글리콜을 함유한 결정화 완충액 내로 이들 결정체를 이동시켰고 그리고 x-선 시스템 상으로 이동시키기 전에 액상 질소에서 급냉동시켰다.

결정학적 데이터

다음 결정학적 데이터는 14E1 Fab 및 ActRIIA ECD와의 14E1 Fab 복합체에 대해 얻어졌다.

구조적 정제 공정. 14E1 Fab의 결정체 구조를 결정하기 위하여, 출원인은 분자 대체 모델링을 위한 모델로서 PDB 구조 1FIG를 사용하였고 그리고 예상한 바와 같이, 하나의 Fab 분자로 구성된 단일 용액을 얻었다. PDB 구조 2A6D 및 1KEN, 각각으로부터의 상동 VL 및 VH 도메인을 상응하는 1FIG 도메인 상에 겹쳐놓았다. 배치된 VL 및 VH 도메인을 대체하여 새로운 14E1 Fab 모델을 만들었으며, 이를 상충하는 서열 면적의 조정을 통하여 정제하였다. 14E1 Fab 모델을 재구성하였고 그리고 이들 조정된 서열로 추가 정제하여 최종 통계자료로 평가된 바와 같은 뛰어난 모델을 산출하였다 (상기 표 참고).

14E1 Fab 및 ActRIIA ECD 간의 복합체의 결정 구조를 결정하기 위하여, 출원인은 분자 대체를 위한 모델로서 ActRIIA의 14E1 구조 및 PDG 2GOO 구조를 사용하였다. 예상한 바와 같이, 하나의 ActRIIA 분자 및 하나의 14E1 Fab 분자로 구성된 단일 용액을 얻었다. 이후 14E1 Fab 및 ActRIIA ECD 모델을 재구성하였고 그리고 정제하여 최종 통계자료로 평가된 바와 같은 좋은 질의 모델을 산출하였다 (상기 표 참고).

구조 결과. 결정학 분석은 ActRIIA 상에서 이전에 측정된 리간드 결합 부위로 광범위하게 포개진 14E1 Fab 및 ActRIIA ECD 사이의 대형 접촉 표면 (대략적으로 2650 Ų인 총 매립 표면 면적(buried surface area))을 나타내었다 (Greenwald et al., 1999, Nat Struct Biol 6:18-22; Gray et al., 2000, J Biol Chem 275:3206-3212; Allendorph et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:7643-7648). 소프트웨어 분석 (Acta Cryst D50:760-763, 1994)에 의해 결정된 바와 같이, ActRIIA를 접촉시키는 14E1 Fab VH 내 특이적 아미노산 잔기는 도 5에서 나타나고 또한 VH 잔기 각각이 개별적인 ActRIIA 잔기를 만들어 내는 원자 접촉수와 함께 하기 표에 나열된다. 하기 표에서, VH내 아미노산 위치는 세 가지 대안적인 기준점에 대하여 정의된다: a) N-말단 아스파르테이트 잔기; b) 위치 0으로서 재정립된 일차 시스테인 잔기 (C1, 위치 22); 또는 c) 위치 0으로서 재정립된 이차 시스테인 잔기 (C2, 위치 96). 하기 표의 ActRIIA ECD 잔기의 넘버링(numbering)은 도 6에서와 같이 동일하며, 이는 ActRIIA ECD 서열 (서열번호: 16) 내에 VH-접촉 ActRIIA 잔기의 분포를 나타낸다.

ActRIIA를 접촉시키는 14E1 Fab VL내 특이적 아미노산 잔기는 도 7에서 나타나고 또한 VL 잔기 각각이 개별적인 ActRIIA 잔기를 만들어내는 원자 접촉수와 함께 하기 표에 나열된다. 하기 표에서, VL내 아미노산 위치는 세 가지 대안적인 기준점에 대하여 정의된다: a) N-말단 아스파르테이트 잔기; b) 위치 0으로서 재정립된 일차 시스테인 잔기 (C1, 위치 23); 또는 c) 위치 0으로서 재정립된 이차 시스테인 잔기 (C2, 위치88). 하기 표의 ActRIIA ECD 잔기의 넘버링(numbering)은 도 8에서와 같이 동일하며, 이는 ActRIIA ECD 서열 (서열번호: 16) 내에 VL-접촉 ActRIIA 잔기의 분포를 나타낸다.

실시예 4. Ab-14E1에 의한 ActRIIA 결합 및 중화

출원인은 플라스몬 표면 공명 (BIACORE™-기반 분석)을 사용하여 정제된 Ab-14E1에 의해 결합하는 인간 ActRIIA의 동역학 및 친화도를 측정하였다. 이 항체는 대략적으로 12 pM의 K_D (도 9)를 가진 ActRIIA-mFc (이합체 단백질)에 결합시키는 것으로 그리고 10배 낮은 친화도에서 히스티딘으로 태그된 단합체 ActRIIA (ActRIIA-His)를 결합시키는 것으로 밝혀졌다.

추가적으로, Ab-14E1이 이의 동족 리간드와의 ActRIIA의 결합을 차단할 수 있는 지 없는지 확인하는 데에 BIACORE™-기반 분석을 이용하였다. 상당하게도, 두 가지 상이한 검사 입체형태 (도 10-11)내 Ab-14E1와의 ActRIIA-Fc의 전항온처리로 ActRIIA-Fc와의 다수 리간드의 결합을 방지하였으며, 따라서 이는 Ab-14E1의 중화 능력을 명시한다. 이합체 ActRIIA-Fc가 히스티딘으로 태그된 ActRIIA의 단합체 세포외 도메인으로 대체될 때 유사한 결과를 얻었다. 게다가, ActRIIA 리간드, 가장 특히 액티빈 A는 농도-의존 방식 (도 12)으로 ActRIIA-Fc와의 Ab-14E1의 결합을 경쟁적으로 억제하였으며, 따라서 이는 공유된 에피토프로 인한 ActRIIA 중화의 추가적인 증거를 제공하였다.

실시예 5. 세포-기반 분석에서 Ab-14E1에 의한 ActRIIA 신호전달의 중화

ActRIIA 리간드 액티빈 A 및 액티빈 B에 의한 신호전달에서 정제된 항-ActRIIA 항체의 효과를 평가하는 데에 A204 세포에서의 보고 유전자 분석을 이용하였다. 이 분석은 형질감염 효능에 대해 조절하기 위해 pGL3(CAGA)12 보고 플라스미드 (Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100) 그리고 레닐라 보고 플라스미드 (pRLCMV)로 형질감염된 인간 횡문근육종 세포주에 기반한다. CAGA12 모티프는 TGF-베타 반응 유전자 (PAI-1 유전자)에서 존재하며, 그래서 이 벡터는 Smad2 및 Smad3을 통한 인자 신호전달을 위해 일반적으로 유용하다. A204 세포주가 우선적으로 ActRIIA를 발현하기 때문에, 잠재적인 ActRIIA 중화 능력에 대해 항체를 검사하는 것이 적합하다. 이러한 저해제의 부재에서, ActRIIA 리간드는 A204 세포내 ActRIIA 신호전달을 분량-의존적으로 자극할 수 있다.

분석 첫날에, A204 세포 (ATCC HTB-82)를 48-웰 플레이트에 웰 당 10⁵개 세포로 분배하였다. 그 다음날에, 10 μg pGL3(CAGA)12, 1 μg pRLCMV, 30 μl Fugene 6 (Roche Diagnostics), 및 970 μl OptiMEM (Invitrogen)을 함유한 용액을 30분 동안 전항온처리하였고, 이후 맥코이 성장 배지에 첨가하였으며, 이를 실온에서 하룻밤 동안 항온처리를 위해 도말된 세포 (500 μl/웰) 에 적용하였다. 3일 째에, 배지를 제거하였고 세포를 0.1% BSA를 함유한 인산염-완충 식염수에서 희석된 검사 물질 (250 μl/웰)과 함께 37℃에서 6시간 동안 항온처리하였다. 헹구고 난 후, 수동 용해 완충액 (Promega E1941)으로 세포를 용해시켰고 -70℃에서 하룻밤 동안 저장하였다. 4일 째 및 마지막 날에, 부드러운 흔들림과 함께 플레이트를 실온까지 데웠다. 세포 용해물을 이중복으로 화학발광 플레이트 (96-웰)에 이동시켰고 듀얼-루시퍼라아제 리포터 어세이 시스템 (Promega E1980)으로부터 시약을 이용한 광도계에서 분석하여 정규화된 발광효소 활성도를 측정하였다.

Ab-14E1은 이 분석에서 액티빈 A 신호전달의 강력한 저해제이다 (도 13). 액티빈 B를 가진 Ab-14E1에 대해서도 유사한 결과를 얻었으며, 따라서 이는 Ab-14E1이 세포-기반 시스템에서 ActRIIA-매개 신호전달을 중화시킬 수 있다는 점을 명시한다.

실시예 6. 쥐의 FSH 수준에서 Ab-14E1의 저해성 효과

액티빈을 뇌하수체 생식선자극으로부터의 FSH 분비를 증가시키는 이의 능력으로 독창적으로 식별하였다. ActRIIA를 통하여 부분적으로, 액티빈-매개 신호전달은 다수의 조절 수준에서의 작용을 통하여 FSH 분비를 촉진하는 것으로 현재 간주된다 (Gregory et al., 2004, Semin Reprod Med 22:253-267). 따라서, 출원자는 항체의 중화 능력의 생체내 검사로서 쥐에서의 FSH 농도 순환을 저해하는 Ab-14E1의 능력을 연구하였다. FSH 분비를 저해하지 않기 위해 암컷 C57BL/6 쥐 (6 주령)에게 모의 수술(n = 16) 또는 양측 난소절제술 (OVX; n = 18) 중 한 가지를 시행하였고 그렇게 함으로써 외생 저해성 인자에 대한 민감도를 증가시켰다. 쥐에게 6주의 회복 기간을 허용하였고 이후 매주 두 번 Ab-14E1 (50 mg/kg, s.c.) 또는 비히클 (트리스-완충 식염수)로 처리하였다. OVX 쥐에서 처리 4주 후에 그리고 생식선-완전 (모의) 쥐에서는 처리 8주 후에 혈액 샘플을 수집하였고, 그리고 쥐 FSH의 혈청 수준을 방사면역분석으로 측정하였다. 도 14에서 나타난 바와 같이, Ab-14E1로의 처리는 OVX 쥐 (p < 0.01)에서 50%보다 크게 그리고 모의 쥐에서는 30%보다 크게 혈청 FSH 농도를 감소시켰지만, 그럼에도 불구하고 후자의 차이는 통계학적인 유의성에 도달하지 않았다 이 연구의 결과는 생체내 ActRIIA 신호전달을 중화시키는 Ab-14E1의 능력과 일치한다.

실시예 7. 인히빈-결핍 쥐에서 암 악액질 상에서 Ab-14E1의 효과

인히빈-알파 서브유닛에서 유전적으로 결핍이 있는 쥐는 액티빈 A 및 B를 과발현하는 생식선 종양을 발달시킨다 (Matzuk et al., 1992, Nature 360:313-319; Matzuk et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:8817-8821). 이러한 쥐 모두는 이 종양이 생기고 결국에는 ActRIIA를 통하여 작용하는 고수준의 종양-유도 액티빈에 의해 매개된 암 악액질-유사 증후군으로 죽는다 (Coerver et al., 1996, Mol Endocrinol 10:534-543). 그러므로, 출원인은 이들 쥐에서 악액질을 저해하는 Ab-14E1의 능력을 연구하였다. 6주령을 시작으로 하여, 인히빈-알파 무반응 대립유전자(null allele)에 대해 동형인 수컷 및 암컷 쥐를 Ab-14E1 (10 mg/kg) 또는 비히클 (인산-완충 식염수) 중 하나로, 피하로, 주 당 2회 처리하였다. 쥐를 매일 모니터링하였고 심각한 병적상태 (탈수, 무기력, 웅크린 자세, 단정치 않은 모습, 호흡곤란, 또는 본래 체중의 20% 보다 크게 감소)에 있을 경우 안락사시켰고, 그리고 처리 유효성의 지수로서 주 당 2회 체중을 측정하였다. 도 15에서 나타난 바와 같이, Ab-14E1로 처리된 수컷 쥐 (n = 9)는 비히클-처리된 수컷 (n = 11)보다 연구 과정에 걸쳐 더 나은 무게 증가를 나타내었고, 그리고 수컷에서 Ab-14E1 처리로 향상된 생존에 대한 경향이 있었다 (데이터는 나타나지 않음). 비히클-처리된 암컷 쥐는 그들의 수컷 상대 쥐와는 다르게, 상당한 악액질을 발달시키는 데에 예상치 못하게 실패하였고, 그리고 Ab-14E1로의 암컷 처리는 비히클과 비교하여 체중 증가로의 유의하지 않은 경향만을 야기하였다. 이 연구의 결과는 Ab-14E1이 초과 액티빈-ActRIIA 신호전달에 의해 야기된 생체내 종양-의존 악액질을 완화시킨다는 것을 명시한다.

종합하면, 전술한 결과는 ActRIIA 항원을 이용한 ActRIIA-결핍 쥐의 면역화가 높은 친화도로 ActRIIA에 결합 할 수 있는, 다양한 복합성의 다수 분석 시스템에서 ActRIIA-매개 신호전달을 중화시킬 수 있는, 그리고 생체내 액티빈-의존 암 악액질을 완화시킬 수 있는 단일클론 항체 (Ab-14E1)을 만들어낸다는 점을 증명한다.

실시예 8. 정상 쥐의 근육에서 Ab-14E1의 자극성 효과

출원인은 정상 쥐의 체중 및 제지방 질량에서 Ab-14E1의 효과를 연구하였다. 6주령을 시작으로 하여, 수컷 C57BL/6 쥐를 Ab-14E1 (10 mg/kg, i.p., n = 10) 또는 비히클 (인상-완충 식염수, n=5)로 4 주 동안 매주 2회 처리하였다. 체중은 매주 2회 측정하였고, 제지방 질량은 처리 시작 시점에 그리고 처리 4 주 후 전신 핵 자기 공명 (NMR)으로 측정하였다. 도 16에서 나타난 바와 같이, Ab-14E1로 처리한 쥐는 연구 과정 내내 대조군 보다 상당히 더 큰 무게 증가를 보였다. 연구가 끝날 무렵, Ab-14E1로 처리한 쥐는 대조군에 비해 전신 제지방 질량을 두 배보다 더 많이 늘렸다 (도 17). 연구 종료시, Ab-14E1로 처리한 쥐에서의 흉근 무게 (양측)는 유의성 (p = 0.137)을 나타내는 차이로, 비히클-처리 쥐의 흉근 무게보다 15% 더 무거웠다. 추가적으로, 비히클 (p = 0.058)과 비교하여 Ab-14E1 처리에서는 전신 지방 질량의 상당히 더 낮은 축적이 있었으며, 이는 ActRIIA를 지향하는 항체가 지방 축적을 감소시키는 데에 사용될 수 있다는 점을 명시한다. 전술한 결과는 항-ActRIIA 항체로의 치료가 정상 쥐에서의 무게 증가, 특히 제지방 질량 (근육 질량의 지표)에서의 증가를 증가시킬 수 있다는 점을 증명한다.

참조에 의한 편입

본 명세서에서 언급된 모든 공개공보 및 특허는 각 개별적인 공개공보 또는 특허가 참조로서 편입되는 것으로 특정하게 및 개별적으로 명시되는 것처럼 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.

주제의 특정 구체예가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이고 그리고 제한적이지는 않다. 본 명세서 및 하기 청구항의 검토에 따라 해당 분야의 통상의 기술자에게 많은 변형이 명확해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 이러한 변형과 함께, 등가물, 및 명세서의 이들 전체 범위와 함께, 청구항에 대한 참조로서 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> SEEHRA, JASBIR MARTINEZ-HACKERT, ERIK <120> ACTRIIA BINDING AGENTS AND USES THEREOF <130> PHPH-061-101 <140> 13/291,958 <141> 2011-11-08 <150> 61/411,396 <151> 2010-11-08 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110 Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ala Phe Trp Val 145 150 155 160 Tyr Arg His His Lys Met Ala Tyr Pro Pro Val Leu Val Pro Thr Gln 165 170 175 Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu 180 185 190 Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys 195 200 205 Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln 210 215 220 Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly 245 250 255 Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His 290 295 300 Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His 305 310 315 320 Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala 325 330 335 Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser 340 345 350 Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro 355 360 365 Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val 420 425 430 Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His 435 440 445 Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His 450 455 460 Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr 465 470 475 480 Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr 485 490 495 Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser 500 505 510 Leu <210> 2 <211> 1542 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccagagatg 360 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420 ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480 tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540 cccccacctt ctccattact agggttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660 tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720 atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780 gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840 gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960 agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020 tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080 ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140 gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260 cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320 ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380 tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440 cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtctat ga 1542 <210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe 1 5 10 15 Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro 20 25 30 Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys 35 40 45 Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser 65 70 75 80 Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys 85 90 95 Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro 100 105 110 Val Thr Pro Lys Pro Pro His His His His His His 115 120 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Ile Asn 1 5 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Tyr Ala Tyr Arg Asn Asp Val Arg Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Phe Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Ser Gly Pro Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser 1 5 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Ile Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Tyr Ala Tyr Arg Asn Asp Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 gatgtacagc ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataagct acgacggcag caataactac 180 aacccatctc tcataaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga attctgtgac tactgaagac acagctacat atttctgtgc aagttatgcc 300 tataggaacg acgtgaggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac cgtctccgca 360 <210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctacttc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattaccaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tcgagatcaa a 321 <210> 16 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr 20 25 30 Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile 35 40 45 Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser 85 90 95 Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr 100 105 110 Pro Lys Pro Pro 115 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Glu Val Lys Leu 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Asp Val Gln Leu 1

Claims (18)

1. 인간 ActRIIA와의 액티빈 A의 결합을 저해하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
2. 제 1항에 있어서, 인간 ActRIIa에 결합하고 인간 ActRIIA와의 Ab-14E1의 결합을 교차-차단하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
3. 인간 ActRIIA와의 액티빈 A 및 액티빈 B의 결합을 저해하는 단리된 항체 또는 이의 단편.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-ActRIIA 항체 또는 단편은 (a) 생체내 여포-자극 호르몬 수준을 감소시키는 것, 및 (b) 시험관내 세포주에서 액티빈 A 신호전달을 저해하는 것으로 구성된 그룹에서 선택된 활성도를 갖는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-ActRIIA 항체 또는 단편은 (a) 난소적출된, 암컷 C57BL/6 쥐에서 여포-자극 호르몬 수준을 감소시키는 것 및 (b) 액티빈 A에 노출된 A204 세포주내 CAGA12-조절 보고 유전자(reporter gene)의 발현을 저해하는 것으로 구성된 그룹에서 선택된 활성도를 갖는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 그룹에서 선택된, 인간 ActRIIA의 세포외 도메인내 하나 이상의 아미노산을 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편:
   a. 서열번호: 16의 위치 13에 있는 페닐알라닌,
   b. 서열번호: 16의 위치 14에 있는 페닐알라닌,
   c. 서열번호: 16의 위치 15에 있는 아스파라긴,
   d. 서열번호: 16의 위치 17에 있는 아스파라긴,
   e. 서열번호: 16의 위치 21에 있는 아스파르테이트,
   f. 서열번호: 16의 위치 22에 있는 아르기닌,
   g. 서열번호: 16의 위치 23에 있는 트레오닌,
   h. 서열번호: 16의 위치 29에 있는 글루타메이트,
   i. 서열번호: 16의 위치 30에 있는 프롤린,
   j. 서열번호: 16의 위치 31에 있는 시스테인,
   k. 서열번호: 16의 위치 32에 있는 타이로신,
   l. 서열번호: 16의 위치 33에 있는 글리신,
   m. 서열번호: 16의 위치 34에 있는 아스파르테이트,
   n. 서열번호: 16의 위치 36에 있는 아스파르테이트,
   o. 서열번호: 16의 위치 37에 있는 리신,
   p. 서열번호: 16의 위치 39에 있는 아르기닌,
   q. 서열번호: 16의 위치 40에 있는 히스티딘,
   r. 서열번호: 16의 위치 42에 있는 페닐알라닌,
   s. 서열번호: 16의 위치 44에 있는 트레오닌,
   t. 서열번호: 16의 위치 46에 있는 리신,
   u. 서열번호: 16의 위치 55에 있는 발린,
   v. 서열번호: 16의 위치 56에 있는 리신,
   w. 서열번호: 16의 위치 57에 있는 글루타민,
   x. 서열번호: 16의 위치 58에 있는 글리신,
   y. 서열번호: 16의 위치 59에 있는 시스테인,
   z. 서열번호: 16의 위치 60에 있는 트립토판,
   aa. 서열번호: 16의 위치 61에 있는 류신,
   bb. 서열번호: 16의 위치 62에 있는 아스파르테이트,
   cc. 서열번호: 16의 위치 63에 있는 아스파르테이트,
   dd. 서열번호: 16의 위치 64에 있는 이소류신,
   ee. 서열번호: 16의 위치 65에 있는 아스파라긴,
   ff. 서열번호: 16의 위치 66에 있는 시스테인,
   gg. 서열번호: 16의 위치 76에 있는 리신,
   hh. 서열번호: 16의 위치 80에 있는 글루타메이트,
   ii.서열번호: 16의 위치 81에 있는 발린,
   jj. 서열번호: 16의 위치 83에 있는 페닐알라닌, 및
   kk. 서열번호: 16의 위치 85에 있는 시스테인.
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 VH 잔기의 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편:
   a. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 -20에 있는 발린,
   b. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +4에 있는 글리신,
   c. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +5에 있는 타이로신,
   d. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +9에 있는 세린,
   e. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +10에 있는 글리신,
   f. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +11에 있는 타이로신,
   g. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +12에 있는 타이로신,
   h. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +32에 있는 타이로신,
   i. 서열번호: 12의 시스테인₁로부터 위치 +37에 있는 아스파라긴,
   j. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +4에 있는 알라닌,
   k. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +5에 있는 타이로신,
   l. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +6에 있는 아르기닌,
   m. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +7에 있는 아스파라긴,
   n. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +8에 있는 아스파르테이트,
   o. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +10에 있는 아르기닌,
   p. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +12에 있는 알라닌,
   q. 서열번호: 12의 시스테인₂로부터 위치 +13에 있는 타이로신; 및
   r. 전술한 것 중 어느 하나의 보존적 치환.
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 VL 잔기의 그룹에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편:
   a. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +5에 있는 아스파르테이트,
   b. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +7에 있는 세린,
   c. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +9에 있는 아스파라긴,
   d. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +10에 있는 페닐알라닌,
   e. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +27에 있는 타이로신,
   f. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +28에 있는 페닐알라닌,
   g. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +30에 있는 세린,
   h. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +31에 있는 아르기닌,
   i. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +32에 있는 류신,
   j. 서열번호: 13의 시스테인₁로부터 위치 +34에 있는 세린,
   k. 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 -21에 있는 세린,
   l. 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +3에 있는 글리신,
   m. 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +4에 있는 아스파라긴,
   n. 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +5에 있는 트레오닌,
   o. 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +6에 있는 류신
   p. 서열번호: 13의 시스테인₂로부터 위치 +8에 있는 트립토판, 및
   q. 전술한 것 중 어느 하나의 보존적 치환.
9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로 구성된 그룹에서 선택된 CDR과 적어도 80% 동일성을 지닌 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로 구성된 그룹에서 선택된 CDR과 적어도 80% 동일성을 지닌 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 적어도 다섯 개 또는 적어도 여섯 개 CDR 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
11. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 세 개, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하며, 여기서 CDR-H1은 서열번호: 4와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호: 5와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고, 그리고 CDR-H3은 서열번호: 6과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
12. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄를 포함하며, 여기서 상기 중쇄는 서열번호: 12에서 주어진 서열과 적어도 80% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
13. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호: 13에서 주어진 서열과 적어도 80% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
14. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하며, 여기서 중쇄는 서열번호: 12에서 주어진 서열과 적어도 80% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함하고 경쇄는 서열번호: 13에서 주어진 서열과 적어도 80% 동일성을 지닌 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
15. ActRIIA 결합제를 만들어 내는 방법에 있어서, 상기 방법은 생존가능한, 동형의 ActRIIA-결핍 쥐를 ActRIIA로부터 유래된 항원 폴리펩티드로 면역화하는 단계를 포함하는, ActRIIA 결합제를 만들어 내는 방법.
16. 제약학적 조성물에 있어서, 악액질 증후군의 증상을 예방하고, 치료하거나, 또는 완화시키기 위한, 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 항체 또는 단편을 포함하는 제약학적 조성물.
17. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체 중 하나 이상과 조합하는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.
18. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, Fc, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 및 트랜스페린 중 적어도 하나와 접합되는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 단편.

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