MXPA04011613A

MXPA04011613A - Desaturasas de acido graso de hongos.

Info

Publication number: MXPA04011613A
Application number: MXPA04011613A
Authority: MX
Inventors: Byron Froman
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2002-05-22
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2005-03-07
Also published as: BR122014000528B1; WO2003099216A3; US20100212045A1; AU2003245308B2; US7622632B2; CA2486559C; AR039851A1; ES2542420T3; AU2003245308A1; WO2003099216A2; EP1549133B1; AR074003A2; BRPI0311324B1; EP1549133A2; US8362320B2; KR101138631B1; US20060156435A1; EP1549133A4; JP4515904B2; CA2486559A1

Abstract

La invencion se refiere en general a metodos y composiciones relacionados con enzimas desaturasa de hongos, que modulan el numero y la posicion de dobles enlaces en acidos grasos poliinsaturados de cadena larga, LC-PUFAs; en particular, la invencion se refiere a metodos y composiciones para mejorar los perfiles de acidos grasos omega-3 en productos y partes de plantas usando enzimas desaturasa, y acidos nucleicos que codifican para dichas enzimas; en modalidades particulares, las enzimas desaturasa son (15-desaturasas de hongos; se proveen tambien composiciones de aceite de canola mejoradas que tienen SDA y que mantienen un contenido de acido oleico benefico.

Description

DESATURASAS DE ACIDO GRASO DE HONGOS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. número de serie 60/382,391 , presentada en mayo 22 de 2002, y la solicitud de patente provisional de E.U.A. número de serie 60/453,125, presentada en marzo 7 de 2003. La descripción completa de cada una de las solicitudes anteriores, se incorpora específicamente en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere en general a enzimas desaturasa que modulan el número y la ubicación de dobles enlaces en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs), métodos de uso de las mismas, y composiciones derivadas de las mismas. En particular, la invención se refiere a perfiles de ácido graso mejorados usando enzimas desaturasa, y ácidos nucleicos que codifican para dichas enzimas identificadas en hongos.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los productos primarios de la biosíntesis de ácidos grasos en la mayoría de los organismos, son compuestos de 16 y 18 carbonos. La relación relativa de longitudes de cadena y grado de insaturación de estos ácidos grasos, varía ampliamente entre las especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen principalmente ácidos grasos saturados y monosaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con 1 , 2 ó 3 dobles enlaces, los últimos dos comprendiendo ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs). Dos familias importantes de PUFAs son los ácidos grasos omega-3 (representados también como ácidos grasos "n-3"), ejemplificados por ácido eicosapentanoico (EPA, 20:4, n-3), y los ácidos grasos omega-6 (representados también como ácidos grasos "n-6"), ejemplificados por ácido araquidónico (ARA, 20:4, n-6). Los PUFAs son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula y el tejido adiposo, en donde pueden encontrarse en formas tales como fosfolípidos y como triglicéridos, respectivamente. Los PUFAs son necesarios para el desarrollo adecuado en mamíferos, en particular en el cerebro del infante en desarrollo, y para la formación y reparación de tejidos. Varios trastornos responden al tratamiento con ácidos grasos. Se ha mostrado que la complementación con PUFAs reduce la velocidad de restenosis después de angioplastía. Se han documentado también los beneficios a la salud de ciertos ácidos grasos omega-3 dietéticos para enfermedad cardiovascular y artritis reumatoide (Simopoulos, 1997; James et al, 2000). Además, se han sugerido los PUFAs para su uso en tratamientos de asma y psoriasis. La evidencia indica que los PUFAs pueden intervenir en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFAs pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de piedras del riñon o tracto urinario. La mayor parte de la evidencia para beneficios a la salud, se aplica a los ácidos grasos omega-3 de cadena larga, EPA y DHA, que están en el pescado y el aceite de pescado. Con esta base de evidencia, las autoridades en salud y los especialistas en nutrición en Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Canadá, Ottawa), Europa (de Deckerer et al., 1998), el Reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physíological significance: The report of the British Nutrition Foundation's Task Forcé, Chapman and Hall, Londres) y los Estados Unidos (Simopoulos et al., 1999), han recomendado el consumo dietético incrementado de estos PUFAs. Los PUFAs pueden usarse también para tratar diabetes (véase patente de E.U.A. No. 4,826,877; Horrobin et al., 1993). Se ha demostrado alteración en el metabolismo y la composición de ácidos grasos en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones intervienen en algunas de las complicaciones a largo plazo que resultan de diabetes, incluyendo retinopatía, neuropatía, nefropatía y daño del sistema reproductivo. Se ha mostrado que al aceite de prímula, que contiene GLA, previene y revierte el daño nervioso en el diabético. PUFAs tales como ácido linoleico (LA, 18:2, ?9, 12) y ácido a- linolénico (ALA, 18:3, ?9, 12, 15), son considerados como ácidos grasos esenciales en la dieta, debido a que los mamíferos carecen de la capacidad para sintetizar estos ácidos. Sin embargo, cuando son ingeridos, los mamíferos tienen la capacidad de metabolizar LA y ALA para formar las familias n-6 y n-3 de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC- PUFA). Estos LC-PUFAs son componentes celulares importantes que confieren fluidez a las membranas, y funcionan como precursores de eicosanoides biológicamente activos tales como prostaglandinas, prostaciclinas y leucotrienos, que regulan funciones fisiológicas normales. En mamíferos, la formación de LC-PUFA es limitada en velocidad por el paso de desaturación ?6, que convierte LA a ácido ?-linolénico (GLA, 18:3, ?6, 9, 12) y ALA a SDA (18:4, ?6, 9, 12, 15). Se ha mostrado que muchas condiciones fisiológicas y patológicas deprimen este paso metabólico y, en consecuencia, la producción de LC-PUFA. Sin embargo, la derivación de la desaturación ?6 mediante la complementación dietética con EPA o DHA, puede aliviar eficazmente muchas enfermedades patológicas asociadas con bajos niveles de PUFA. Sin embargo, como se describe en más detalle más adelante, las fuentes actualmente disponibles de PUFA no son deseables por una multitud de razones. La necesidad de una fuente confiable y económica de PUFAs, ha estimulado el interés en fuentes alternativas de PUFAs. Los PUFAs de cadena larga principales de importancia, incluyen ácido docosahexanoico (DHA, 22:6, n-3) y EPA, que se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceite de pescado, y ácido araquidónico (ARA 20:4, n-6), presente en hongos filamentosos. Para DHA, existen muchas fuentes para producción comercial que incluyen una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces marinos de agua fría, y fracciones de yema de huevo. Fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros Trichodesma y Echium. Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFAs a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFAs, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceite altamente heterogéneas. Por ejemplo, el aceite de las semillas de Echum, además de SDA, contienen niveles casi equivalentes del ácido graso omega-6 GLA. Los aceites obtenidos de estas fuentes pueden requerir por lo tanto purificación extensiva para separar uno o más PUFAs deseados, o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFAs. Las fuentes naturales de PUFAs están sujetas también a fluctuaciones incontrolables en disponibilidad. Las existencias de pescado pueden sufrir variación natural, o pueden agotarse por la pesca excesiva. Además, aún con una evidencia abrumadora de sus beneficios terapéuticos, no se hace caso a las recomendaciones dietéticas respecto a los ácidos grasos omega-3. Los aceites de pescado tiene sabores y olores desagradables, los cuales pueden ser imposibles de separar económicamente del producto deseado, y pueden hacer que dichos productos sean inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites animales, en particular los aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. Los alimentos pueden ser enriquecidos con aceites de pescado, pero de nuevo, dicho enriquecimiento es problemático debido al costo y la declinación de las existencias de pescado al nivel mundial. Este problema es un impedimento al consumo e ingestión de pescado entero. Sin embargo, si los mensajes sobre la salud para incrementar la ingestión de pescado fueran aprovechados por las comunidades, probablemente habría un problema para satisfacer la demanda de pescado. Además, existen problemas con la sustentación de esta industria, que depende notablemente de las existencias de pescado silvestre como alimento en acuacultura (Naylor et al., 2000). Otras limitaciones naturales favorecen una alternativa novedosa para la producción de ácidos grasos omega-3. El tiempo atmosférico y las enfermedades pueden causar fluctuación en los rendimientos de fuentes de pescado y plantas. La tierra de cultivo disponible para la producción de cultivos alternos productores de aceite, está sujeta a competencia con la expansión estable de poblaciones humanas y la necesidad incrementada asociada para producir alimentos en la tierra cultivable restante. Cultivos que producen PUFAs, tales como la borraja, no han sido adaptados para crecimiento comercial, y pueden no tener un buen rendimiento en monocultivo. El crecimiento de dichos cultivos no es de esta manera económicamente competitivo, en donde pueden desarrollarse cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella, es también costosa. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA, y son difíciles de procesar. Microorganismos tales como Porphyrídium y Mortierella, son difíciles de cultivar a una escala comercial. Muchas enzimas intervienen en la biosíntesis de PUFA. El LA, (18:2, ?9, 12) es producido a partir de ácido oleico (OA, 18:1 , ?9) por una A12-desaturasa, mientras que el ALA (18:3) es producido a partir de LA por una ? d-desaturasa. El SDA (18:4, ?6, 9, 12, 15) y el GLA (18:3, ?6, 9, 12) son producidos a partir de LA y ALA por una A6-desaturasa. Sin embargo, como se indicó anteriormente, los mamíferos no pueden desaturar más allá de la posición ?9, y no pueden convertir por lo tanto el ácido oleico en LA. Asimismo, el ALA no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariontes, incluyendo hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en la posición del carbono 12 y el carbono 15. Los ácidos grasos poliinsaturados principales de los animales se derivan por lo tanto de la dieta mediante la desaturación y elongación subsecuentes de los LA y ALA de la dieta. La patente de E.U.A. No. 5,952,544 describe fragmentos de ácido nucleico aislados y clonados de Brassica napus que codifican para enzimas desaturasa de ácido graso. La expresión de los fragmentos de ácido nucleico de dicha patente se expresa en plantas, y resulta en la acumulación de ALA. Sin embargo, en plantas transgénicas que expresan la ?15- desaturasa de plantas, el LA sustancial continúa siendo no convertido por la desaturasa. Sería ventajosa una enzima más activa que convierta más LA a ALA. La conversión incrementada de LA a ALA crearía mayores cantidades de ALA. Los niveles de ALA incrementados permiten que la ?ß-desaturasa, cuando es coexpresada con un ácido nucleico que codifica para la ?15- desaturasa actúe sobre el ALA, produciendo de esta manera niveles mayores de SDA. Debido a la multitud de usos benéficos del SDA, existe la necesidad de crear un incremento sustancial en el rendimiento de SDA. Se han buscado ácido nucleicos de varias fuentes para incrementar el rendimiento de SDA. Sin embargo, las innovaciones que permitirían la producción comercial mejorada en cultivos terrestres, son aún altamente deseadas (véase, por ejemplo, Reed et al., 2000). Además, el uso de polinucleótidos de desaturasa derivados de Caenorhabditis elegans (Meesapyodsuk et al., 2000), no es ideal para la producción comercial de aceites de semilla enriquecidos de plantas. Se han aislado ácidos nucleicos que codifican para ?15-desaturasas de varias especies de cianobacterias y plantas, incluyendo Arabidopsis, soya y perejil. Las secuencias deducidas de aminoácidos de estas desaturasas demuestran un alto grado de similitud, más notablemente en la región de tres motivos ricos en histidina que, sin ser limitado por teoría alguna, se piensa intervienen en la unión al hierro. Sin embargo, no se ha aislado ?15-desaturasa alguna de alguna especie de hongos. Además, aún cuando se han secuenciado los genomas de varias especies de hongos y se han usado algoritmos sofisticados, las búsquedas que usan secuencias de aminoácidos y de ADNc de ?? d-desaturasa conocidas contra bases de datos de ADN de Aspergillus y Neurospora, no han producido A15-desaturasas. Por lo tanto, sería ventajoso obtener material genético que intervenga en la biosíntesis de PUFA y que exprese el material aislado en un sistema de plantas, en particular, un sistema de plantas de cultivo terrestres, que pueda manipularse para proveer la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFAs. Existe también la necesidad de incrementar la ingestión de ácidos grasos omega-3 en humanos y animales. De esta manera, existe la necesidad de proveer una amplia gama de alimentos y complementos alimenticios enriquecidos con ácidos grasos omega-3, de modo que los sujetos puedan seleccionar forraje, ingredientes de forraje, alimento e ingredientes alimenticios que armonicen con sus hábitos dietéticos usuales. Actualmente, existe sólo un ácido graso omega-3, ALA, disponible en aceites vegetales. Sin embargo, existe conversión deficiente del ALA ingerido a los ácidos grasos omega-3 de cadena más larga, tales como EPA y DHA. Se ha demostrado en la solicitud de E.U.A. copendiente número de serie 10/384,369, titulada "Treatment And Prevention Of Inflammatory Disorders", que el aumento de la ingestión de ALA a partir del promedio de la comunidad de 1 gramo al día a 14 g al día mediante el uso de aceite de linaza, sólo aumentó modestamente los niveles del fosfolípido EPA en plasma. Un incremento 14 veces mayor en la ingestión de ALA, resultó en un incremento dos veces mayor en el fosfolípido EPA en plasma (Manzioris et al., 1994). De esta manera, para ese fin, existe la necesidad de una producción eficiente y comercialmente viable de PUFAs usando desaturasas de ácido graso, genes que los codifiquen, y métodos recombinantes que los produzcan. Existe también la necesidad de aceites que contengan proporciones relativas mayores de PUFAs específicos y/o enriquecidas en los mismos, y composiciones y complementos alimenticios que los contengan. Existe también la necesidad de métodos económicos confiables para producir PUFAs específicos. A pesar de las ineficiencias y los bajos rendimientos como se describió anteriormente, la producción de ácidos grasos omega-3 mediante la cadena alimenticia terrestre, es una empresa benéfica para la salud pública y, en particular, la producción de SDA. El SDA en particular es importante debido a que, como se describió anteriormente, existe una baja conversión de ALA a EPA. Esto es porque en este proceso de tres enzimas (que requieren ?6, ?12 y ?15), la enzima inicial, ??-desaturasa, tiene baja actividad en humanos y es limitativa en velocidad. La evidencia de que la A6-desaturasa es limitativa en velocidad, es provista por estudios que demuestran que la conversión de su substrato, ALA, es menos eficiente que la conversión de su producto, SDA a EPA, en ratones y ratas (Yamazaki er a/., 1992; Huang, 991 ). Con base en dichos estudios, se observa que en cultivos de semillas oleaginosas comerciales, tales como cañóla, soya, maíz, girasol, cártamo o lino, la conversión de cierta fracción de los ácidos grasos monoinsaturados y políinsaturados que tipifica su aceite de semilla a SDA, requiere la expresión específica de la semilla de enzimas desaturasa múltiples, incluyendo ?6 y ?12, y una enzima que tenga actividad de ?15- desaturasa. Los aceites derivados de plantas que expresan niveles elevados de ?6, ?12 y A15-desaturasas, con ricos en SDA y otros ácidos grasos omega-3. Dichos aceites pueden usarse para producir alimentos y complementos alimenticios enriquecidos en ácidos grasos omega-3, y el consumo de dichos alimentos aumenta eficazmente los niveles de EPA y DHA en los tejidos. Alimentos y productos alimenticios tales como leche, margarina y embutidos, todos hechos o preparados con aceites enriquecidos en ácidos grasos omega-3, resultan en beneficios terapéuticos. Se ha mostrado que los sujetos pueden tener una ingestión de ácidos grasos omega-3 comparable a EPA y DHA de por lo menos 1.8 g al día, sin alterar sus hábitos dietéticos, usando alimentos que contengan aceites enriquecidos con ácidos grasos omega-3 (Naylor, citado anteriormente). De esta manera, existe una fuerte necesidad de ácidos nucleicos novedosos de Al5-desatu rasas para su uso en plantas de cultivo transgénicas para producir aceites enriquecidos en PUFAs. Asimismo, se requieren nuevos aceites de semilla de plantas enriquecidos para PUFAs y, en particular, ácidos grasos omega-3, tales como ácido estearidónico.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados que codifican para un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 15 (??d-desaturasa). Estos pueden usarse para transformar células o modificar la composición de ácidos grasos de una planta o el aceite producido por una planta. Una modalidad de la invención es una secuencia de polinucleótidos aislada de una especie de hongo que tiene actividad de desaturasa única. Los polinucleótidos aislados pueden aislarse de especies de hongos que pertenecen de preferencia a fila seleccionados del grupo que consiste de zygomycota (cigomicetos), basidiomycota (basidiomicetos) y ascomycota (ascomicetos). En ciertas modalidades, los polinucleótidos aislados se aislan de una especie de hongos seleccionada del grupo que consiste de Neurospora crassa, Aspergillus nidulans y Botrytis cinérea. En otro aspecto, la invención provee un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 34; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33; (c) un polinucleótido que híbrida con una o más de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33, o un complemento de la misma, bajo condiciones de 5X SSC, formamida a 50% y 42°C; y (d) un polinucleótido de hongos que codifica para un polipéptido que tiene por lo menos uno de los motivos de aminoácido: TrplleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe (WILAHECGHGASF) (SEQ ID NO: 6); LeuAlaHisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO: 7); HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 8); LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 9); His(His/Ala)ArgH¡sHisArg(Phe/Tyr)ThrThr (H(H/A)RHHR(F/Y)TT) (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 ); TrpValHisHisTrpLeuValAlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrH¡s (WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH) (SEQ ID NO: 11 ); AlalleThrTyrLeu(H¡s/Gln)HisThr (AITYL(H/Q)HT) (SEQ ID NO: 12); GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO: 13) o HisValValHisHisLeuPheXaaArgIleProPheTyr (HVVHHLFXRIPFY) (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22). En otro aspecto, la invención provee un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado de conformidad con la invención. El término "vector recombinante", como se usa en la presente, incluye cualquier segmento recombinante de ADN que se desee introducir en una célula, tejido y/u organismo hospedero, e incluye específicamente cassettes de expresión aislados de un polinucleótido de partida. Un vector recombinante puede ser lineal o circular. En varios aspectos, un vector recombinante puede comprender por lo menos una secuencia adicional seleccionada del grupo que consiste de: secuencias reguladoras acopladas operativamente al polinucleótido; marcadores de selección acoplados operativamente al polinucleótido; secuencias de marcación acopladas operativamente al polinucleótido; una porción de purificación acoplada operativamente al polinucleótido; y una secuencia de elección de objetivo acoplada operativamente al polinucleótido.

En otro aspecto, la invención provee células, tales como células de mamífero, planta, insecto, levadura y bacteria, transformadas con los polinucleótidos de la presente invención. En otra modalidad, las células son transformadas con vectores recomblnantes que contienen promotores constitutivos y específicos de tejidos, además de los polinucleótidos de la presente invención. En ciertas modalidades de la invención, dichas células pueden definirse además como transformadas con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6. En otro aspecto, la invención provee un polipéptido, incluyendo fragmentos y proteínas que tienen actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. En una modalidad de la invención, el polipéptido comprende por lo menos uno de los motivos de aminoácido: TrplleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe (WILAHECGHGASF) (SEQ ID NO: 6); LeuAlaHisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO: 7); HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 8); LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 9); Hís(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr (H(H/A)RHHR(F/Y)TT) (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 ); TrpValHisHisTrpLeuValAlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis (WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH) (SEQ ID NO: 1 1 ); AlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr (AITYL(H/Q)HT) (SEQ ID NO: 12); GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO: 13) o HisValValHisHisLeuPheXaaArglleProPheTyr (HVVHHLFXRIPFY) (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22). En otras modalidades, el polipéptido se define además que comprende dichos motivos de aminoácido completos. La invención provee también un polipéptido de hongos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 34; o un fragmento de la misma que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. Otro aspecto de la invención provee un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos omega-3 de semillas de plantas, el cual comprende los pasos de: (a) obtener semillas de una planta de conformidad con la invención; y (b) extraer el aceite de dichas semillas. Ejemplos de dicha semilla de planta incluyen cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa y maíz. Métodos preferidos para transformar dichas células vegetales, incluyen el uso de plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, electroporación y bombardeo balístico de alta velocidad. En otro aspecto, se provee un método para producir una planta que comprende aceite de semilla que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3, el cual comprende introducir un vector recombinante de la invención en una planta que produce aceite. En el método, la introducción del vector recombinante puede comprender fitomejoramiento, y puede comprender los pasos de: (a) transformar una célula vegetal con el vector recombinante; y (b) regenerar dicha planta a partir de la célula vegetal, en donde la planta tiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3. En el método, la planta puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste de Arabidopsis thaíiana, Brassica de semilla oleaginosa, colza, girasol, cártamo, cañóla, maíz, soya, algodón, lino, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, cacao, cacahuate, plantas con fruto, plantas de cítricos, y plantas que producen nueces y bayas. La planta puede definirse además como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, y la planta puede tener SDA incrementado. El método puede comprender además introducir el vector recombinante en una pluralidad de plantas que producen aceite, y seleccionar las plantas o la progenie de las mismas que tengan heredado el vector recombinante para una planta que tenga un perfil deseado de ácidos grasos omega-3. En otro aspecto, la invención provee un aceite de semilla de cañóla endógeno que tiene un contenido de SDA de alrededor de 8% a aproximadamente 27%, y un contenido de ácido oleico de alrededor de 40% a aproximadamente 70%. En ciertas modalidades, el aceite de semilla de cañóla puede definirse además que comprende menos de 10% de ALA, LA y GLA combinados. El aceite puede comprender también un contenido de SDA definido además como de alrededor de 10% a aproximadamente 20%, incluyendo de alrededor de 12% a aproximadamente 20%, de alrededor de 15% a aproximadamente 20%, de alrededor de 10% a aproximadamente 17%, y de alrededor de 12% a aproximadamente 17%. En otras modalidades de la invención, el aceite de semilla de cañóla puede tener un contenido de ácido oleico definido además como de alrededor de 45% a aproximadamente 65%, incluyendo de alrededor de 50% a aproximadamente 65%, de alrededor de 50% a aproximadamente 60%, y de alrededor de 55% a aproximadamente 65%. En otras modalidades de la invención, el contenido de SDA se define además como de alrededor de 12% a aproximadamente 17%, y el contenido de ácido oleico se define además como de alrededor de 55% a aproximadamente 65%. En una modalidad de la invención, un aceite de semilla de cañóla es de semilla de Brassica napus o Brassica rapa. En ciertas modalidades, un aceite provisto tiene una relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3, de alrededor de 1 :1 a aproximadamente 1 :4, incluyendo de alrededor de 1 :2 a aproximadamente 1 :4. En otro aspecto, la invención provee un método para incrementar el valor nutricional de un producto comestible para consumo humano o animal, el cual comprende añadir un aceite de semilla de cañóla provisto por la invención, al producto comestible. En ciertas modalidades, el producto es alimento para consumo humano y/o animal. El producto comestible puede ser también forraje y/o un complemento alimenticio para animales. En el método, el aceite de semilla de cañóla puede incrementar el contenido de SDA del producto comestible, y/o puede disminuir la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 del producto comestible. El producto comestible puede carecer de SDA antes de añadir el aceite de semilla de cañóla. En otro aspecto, la invención provee un método para fabricar alimento o forraje, el cual comprende añadir un aceite de semilla de cañóla provisto por la invención a ingredientes de alimento o forraje de partida para producir el alimento o forraje. En ciertas modalidades, el método se define además como un método para fabricar alimento y/o forraje. La invención provee también alimento o forraje obtenido mediante el método. En otro aspecto, la invención comprende un método para proveer SDA a un humano o animal, el cual comprende administrar el aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 1, a dicho humano o animal. En el método, el aceite de semilla de cañóla puede administrarse en una composición comestible, incluyendo alimento o forraje. Ejemplos de alimento incluyen bebidas, alimentos infundidos, salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de fruta, jarabes, postres, alcorzas y rellenos, productos congelados blandos, confitura o alimento de humedad intermedia. La composición comestible puede ser sustancialmente un líquido o sólido. La composición comestible puede ser también un complemento alimenticio y/o nutracéutico. En el método, el aceite de semilla de cañóla puede administrarse a un humano y/o un animal. Ejemplos de animales a los cuales puede administrarse el aceite, incluyen ganado o aves de corral.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor con relación a uno o más de estos dibujos, en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas en la presente. La invención puede entenderse más claramente a partir de la siguiente descripción de las figuras: La figura 1 muestra la región codificante de NcD15D de ?15-desaturasa de hongos en un cassette pCR2.1 (pMON67004). La figura 2 muestra la región codificante de NcD15D de ? 5-desaturasa de hongos en el vector de expresión en levaduras pYES 2.1 (pMON77208). La figura 3 muestra los niveles de ALA en 200 mitades de semilla (semillas cortadas a la mitad), ordenados de ALA más bajo a más alto. La figura 4 muestra un diagrama de flujo o mapas de plásmidos que resultan en los plásmidos pMON772 y pMON77217. La figura 5 muestra un ejemplo de dendrograma de polipéptidos de desaturasa, incluyendo ?15-desaturasa de N. crassa. La figura 6 muestra una alineación de secuencias de ejemplos de polipéptidos de desaturasa respecto a ?15-desaturasa de N. crassa. La figura 7A-7G muestra mapas de plásmidos de construcciones preparadas.

DESCRIPCION DETALLADA PE LA INVENCION La invención supera las limitaciones de la técnica anterior, proveyendo métodos y composiciones para la creación de plantas con contenido de PUFA mejorado. La modificación del contenido de ácidos grasos de un organismo tal como una planta, presenta muchas ventajas, incluyendo nutrición mejorada y beneficios a la salud. La modificación del contenido de ácidos grasos puede usarse para lograr niveles benéficos o perfiles de PUFAs deseados en plantas, partes de plantas y productos de plantas, incluyendo aceite de las semillas de las plantas. Por ejemplo, cuando se producen los PUFAs deseados en el tejido de la semilla de una planta, el aceite puede aislarse de las semillas, resultando típicamente en un alto contenido de aceite en PUFAs deseados, o un aceite que tenga un contenido o perfil deseado de ácidos grasos, el cual puede usarse a su vez para proveer características benéficas en productos alimenticios y otros productos. La invención provee en particular aceite de cañóla endógeno que tiene SDA, mientras contiene también un contenido benéfico de ácido oleico. Varios aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones para modificación del contenido de PUFA de una célula, por ejemplo, modificación del contenido de PUFA de la célula de una planta. Las composiciones relacionadas con la invención incluyen secuencias de polinucleótidos aisladas novedosas, construcciones de polinucleótidos y plantas y/o partes de plantas transformadas mediante polinucleótidos de la invención. El polinucleótido aislado puede codificar para desaturasas de ácido graso de hongos y, en particular, puede codificar para una A15-desaturasa de hongos. Pueden manipularse células hospederas para que expresen un polinucleótido que codifica para polipéptidos de desaturasa que catalizan la desaturación de ácidos grasos. Algunos aspectos de la invención incluyen varios polipéptidos de desaturasa, y polinucleótidos que codifican para los mismos. Varias modalidades de la invención pueden usar una combinación de polinucleótidos de desaturasa y los polipéptidos codificados que dependen típicamente de la célula hospedera, la disponibilidad de substratos y los productos finales deseados. El término "desaturasa" se refiere a un polipéptido que puede desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos de uno o más ácidos grasos, para producir un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado, o precursor del mismo. De particular interés, son polipéptidos que pueden catalizar la conversión de ácido esteárico a ácido oleico, ácido oleico a LA, LA a ALA o ALA a SDA, incluyendo enzimas que desaturan en las posiciones 12, 15 ó 6. El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, sin importar la longitud o modificación de post-traducción (por ejemplo, glucosilación o fosforilación). Consideraciones para elegir un polipéptido específico que tenga actividad de desaturasa incluyen, pero no están limitadas a, el pH óptimo del polipéptido, sí el polipéptido es una enzima limitativa de velocidad, o un componente de la misma, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un PUFA deseado, y/o si el polipéptido requiere un cofactor. El polipéptido expresado tiene de preferencia características que son compatibles con el ambiente bioquímico de su ubicación en la célula hospedera. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por los substratos. Los análisis de la Km y la actividad específica de un polipéptido en cuestión pueden considerarse al determinar la conveniencia de un polipéptido determinado para modificar la producción, el nivel o el perfil de PUFAs en una célula hospedera determinada. El polipéptido usado en una situación particular, es uno que pueda funcionar típicamente bajo las condiciones presentes en la célula hospedera deseada, pero puede ser de otra manera cualquier polipéptido de desaturasa que tenga una característica deseada o que sea capaz de modificar la producción, el nivel o el perfil relativo de un PUFA deseado, o cualquier otra característica deseada, como se describe en la presente. Los substratos para la enzima expresada pueden ser producidos por la célula hospedera, o pueden proveerse exógenamente. Para lograr la expresión, los polipéptidos de la presente invención son codificados por polinucleótidos como se describe más adelante. Los inventores han aislado y producido enzimas originadas de hongos que exhiben actividad de Al 5-desaturasa. Fuentes de hongos incluyen, pero no están limitadas a, el género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus nidulans; el género Botrytis, por ejemplo, Botrytis cinérea; el género Neurospora, por ejemplo, Neurospora crassa; y otros hongos que exhiben actividad de A15-desaturasa.

De interés particular, son A15-desaturasas de Neurospora crassa y/o Aspergillus nidulans. Se determinó que la secuencia de aminoácidos de la Al 5-desaturasa de N. crassa, descrita en SEQ ID NO: 3 y codificada por la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, tiene un peso molecular de aproximadamente 49,123.37 Daltons. La secuencia consiste de 429 aminoácidos; 32 de los cuales son fuertemente básicos (lisina, arginina); 35 de los cuales son fuertemente ácidos (ácido aspártico, ácido glutámico); 170 aminoácidos hidrofóbicos (alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano, valina); y 100 aminoácidos polares (asparagina, cisteína, glutamina, serina, treonina, tirosina). SEQ ID NO: 3 tiene un punto isoeléctrico de 7.187; una carga de 1.634 a pH 7.0; una temperatura de fusión de Davis, Botsein, Roth de 89.65°C, y una temperatura de Wallace de 5098.00. Se determinó que la secuencia de aminoácidos de la ? 5-desaturasa de A. nidulans, descrita en SEQ ID NO: 5 y codificada por la secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO: 4, tiene un peso molecular de aproximadamente 46,300 Daltons. La secuencia consiste de 401 aminoácidos; de los cuales 31 son fuertemente básicos (lisina, arginina); 34 son fuertemente básicos (ácido aspártico, ácido glutámico); 161 aminoácidos hidrofóbicos (alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano, valina); y 100 aminoácidos polares (asparagina, cisteína, glutamina, serina, treonina, tirosina). SEQ ID NO: 5 tiene un punto isoeléctrico de 6.83. Las secuencias que codifican para la A15-desaturasa de Neurospora crassa y/o Aspergillus nidulans pueden expresarse en plantas, microorganismos o animales transgénicos, para efectuar mayor síntesis de ALA de LA, así como SDA. Pueden usarse también otros polinucleótidos que son sustancialmente idénticos al polinucleótido de Al 5-desaturasa de N. crassa y/o A. nidulans, o que codifican para polipéptidos que son sustancialmente idénticos al polipéptido de A15-desaturasa de N. crassa y/o A. nidulans. El término "sustancialmente idéntica" se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que exhibe, en orden de preferencia creciente, por lo menos 80%, 90% o 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de Al 5-desaturasa de N. crassa y/o A. nidulans. Pueden hacerse comparaciones de polipéptidos o polinucleótidos, usando programas de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas de análisis de secuencias de The GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., adison, Wis. 53715) y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Calif. 95008). Dicho programa compara secuencias similares asignando grados de similitud o identidad. Abarcadas por la presente invención, son desaturasas relacionadas del mismo organismo o de otros organismos relacionados. Dichas desaturasas relacionadas incluyen variantes de las ?15-desaturasas descritas, que ocurren naturalmente dentro de la misma especie o diferentes especies de hongos. Las desaturasas relacionadas pueden identificarse por su capacidad para funcionar sustancialmente gua\ que las desaturasas descritas; es decir, son aún capaces de convertir efectivamente LA a ALA y GLA a SDA. Pueden identificarse también desaturasas relacionadas seleccionando bases de datos de secuencias para homólogos de secuencias con las desaturasas descritas, mediante hibridación de una sonda basada en las desaturasas descritas con una colección construida del organismo de origen, o mediante RT-PCR, usando ARN mensajero del organismo de origen, e iniciadores basados en las desaturasas descritas. Ciertos aspectos de la invención incluyen variantes y fragmentos de un polipéptido de ?15-desaturasa de hongos, y los ácidos nucleicos codificantes, de modo que retienen la actividad de desaturasa. En otro aspecto de la invención, un vector que contiene un ácido nucleico, o fragmento del mismo, que contiene un promotor, una secuencia codificante de ?15-desaturasa y una región de terminación, puede transferirse en un organismo en el cual el promotor y las regiones de terminación sean funcionales. Por consiguiente, esta invención provee organismos que producen ?15-desaturasa recombinante. Otro aspecto de esta invención provee ?15-desaturasa aislada, que puede purificarse a partir de los organismos recombinantes, mediante métodos estándar de purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1987). Varios aspectos de la invención incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican para desaturasas descritas en la presente. Los ácidos nucleicos pueden aislarse de hongos que incluyen, pero no están limitados a, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Botrytis cinérea, y similares. Los genomas de estos hongos han sido secuenciados, y se ha determinado que cada uno es rico en ALA. Una estrategia de clonación basada en oligonucleótidos iniciadores diseñados para amplificar secuencias identificadas como desaturasas de ácido graso potenciales, con base en búsquedas BLAST de la base de datos del ADN genómico de N. crassa, puede usarse para secuenciar clones individuales. Estos clones pueden caracterizarse entonces funcionalmente. Pueden proveerse construcciones de ácido nucleico que se integran en el genoma de una célula hospedera, o que se replican en forma autónoma (por ejemplo, que se replican episómicamente) en la célula hospedera. Para la producción de ALA y/o SDA, los cassettes de expresión (es decir, un polinucleótido que codifica para una proteína que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido nucleico que dirige la expresión del polinucleótido) usados en general, incluyen un cassette de expresión que provee la expresión de un polinucleótido que codifica para una ?15-desaturasa. En ciertas modalidades, una célula hospedera puede tener contenido de ácido oleico de tipo silvestre. Métodos y composiciones para la construcción de vectores de expresión, cuando se consideran a la luz de las enseñanzas provistas en la presente para la expresión de enzimas desaturasa de hongos, serán evidentes para los expertos en la técnica. Los vectores de expresión, como se describe en la presente, son moléculas de ADN o ARN diseñadas para la expresión controlada de un polinucleótido deseado, por ejemplo, el polinucleótido que codifica para A15-desaturasa. Ejemplos de vectores incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus. De conformidad con la presente invención, se contemplan también por ejemplo vectores promiscuos (Wolk et al. 1984; Bustos eí al., 1991 ). Revisiones de vectores, y métodos para prepararlos y usarlos, pueden encontrarse en Sambrook et al. (1989); Goeddel (1990); y Perbal (1988). Elementos de secuencia capaces de efectuar la expresión de un polinucleótido, incluyen promotores, elementos intensifieadores, secuencias de activación hacia el extremo 5', señales de terminación de la transcripción y sitios de poliadenilación. Polinucleótidos que codifican para desaturasas, pueden ponerse bajo el control por transcripción de un promotor fuerte. En algunos casos, esto lleva a un incremento en la cantidad de enzima desaturasa expresada, y concomitantemente un incremento en el ácido graso producido como resultado de la reacción catalizada por la enzima. Existe una amplia variedad de secuencias de promotor en plantas que pueden usarse para dirigir la expresión de polinucleótidos específica de tejidos que codifican para desaturasas en plantas transgénicas. Por ejemplo, el promotor de napina y los promotores de proteína portadora de acilo, se han usado previamente en la modificación de la composición del aceite de semilla mediante expresión de una forma antisentido de una desaturasa (Knutzon et al. 1999). En forma similar, se ha mostrado que el promotor para la subunidad beta de la ß-conglicinina de soya es altamente activo, y resulta en expresión específica de tejidos en plantas de especies transgénicas diferentes a la soya (Bray et al., 1987). Arondel et al. (1992) incrementaron la cantidad de ácido linolénico (18:3) en tejidos de plantas Arabidopsis transgénicas, poniendo el gen fad3 localizado en el retículo endoplásmico, bajo el control por transcripción del promotor constitutivo fuerte 35S del virus del mosaico de la coliflor. El experto en la técnica puede determinar vectores y elementos reguladores (incluyendo regiones codificantes y promotores enlazados operablemente) adecuados para expresión en una célula hospedera particular. El término "enlazado operablemente" significa en este contexto, que el promotor y las secuencias de terminador funcionan efectivamente para regular la transcripción. Como otro ejemplo, un vector adecuado para la expresión de A15-desaturasa en plantas transgénicas, puede comprender una secuencia de promotor específica de la semilla derivada de heliantinina, napina o glicinina enlazada operablemente a la región codificante de ? 5-desaturasa, y además enlazada operablemente a una señal de terminación de proteína de reserva de la semilla o la señal de terminación de nopalina sintasa. Como otro ejemplo, un vector para su uso en la expresión de ?15-desaturasa en plantas, puede comprender un promotor constitutivo o un promotor específico de tejidos enlazado operablemente a la región codificante de Al5-desaturasa, y además enlazado operablemente a un terminador constitutivo o específico de tejidos, o la señal de terminación de nopalina sintasa. Modificaciones de las secuencias de nucleótidos o elementos reguladores descritos en la presente, que mantienen las funciones contempladas en la presente, están dentro del alcance de esta invención. Dichas modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente sustituciones que reflejan la degeneración del código genético. Técnicas estándar para la construcción de dichos vectores recombinantes son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook et al. (1989), o cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que están ampliamente disponibles. Está disponible una variedad de estrategias para ligar fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de ADN. Se contempla además de conformidad con la presente invención, incluir en un vector de ácido nucleico otros elementos de secuencia de nucleótidos que faciliten la clonación, expresión o procesamiento, por ejemplo, secuencias que codifiquen para péptidos de señal, una secuencia que codifique para KDEL que se requiere para la retención de proteínas en el retículo endoplásmico, o secuencias que codifiquen para péptidos de tránsito que dirigen la ?15-desaturasa hacia el cloroplasto. Dichas secuencias son conocidas por los expertos en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, en Van den Broeck et al. (1985). Secuencias de señal procarióticas y eucarióticas se describen, por ejemplo, en Michaelis et al. ( 982). En ciertas modalidades, los cassettes de expresión pueden incluir un cassette que provea para actividad de ?6- y/o ?? d-desaturasa, en particular en una célula hospedera que produzca o pueda captar LA o ALA, respectivamente. La producción de ácidos grasos insaturados tipo omega-6, tales como LA, se ve favorecida en un organismo hospedero que es incapaz de producir ALA. La producción de ALA por el hospedero puede removerse, reducirse y/o inhibirse, inhibiendo la actividad de una ?? d-desaturasa. Esto puede lograrse mediante selección estándar, proveyendo un cassette de expresión para una Al 5-desaturasa antisentido, interrumpiendo un gen de A15-desaturasa objetivo a través de inserción, deleción, sustitución del gen objetivo completo, o parte del mismo, o añadiendo un inhibidor de ?15-desaturasa. En forma similar, la producción de LA o ALA se ve favorecida en un microorganismo o animal que tenga actividad de A6-desaturasa, proveyendo un cassette de expresión para un transcrito de ?? antisentido, interrumpiendo un gen de ?ß-desaturasa, o mediante el uso de un inhibidor de ?d-desaturasa. Los polinucleótidos que codifican para desaturasas deseadas, pueden identificarse en una variedad de formas. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo, colecciones genómicas o de ADNc de Neurospora, se seleccionan con sondas detectables enzimáticamente o sintetizadas químicamente, las cuales pueden obtenerse de ADN, ARN o nucleótidos de ocurrencia no natural, o mezclas de los mismos. Pueden sintetizarse enzimáticamente sondas a partir de polinucleótidos de desaturasas conocidas, mediante métodos de hibridación de severidad normal o reducida. Pueden usarse también sondas de oligonucleótidos para seleccionar fuentes, y pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias peptídicas obtenidas de la proteína purificada deseada. Pueden degenerarse sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos para que abarquen la degeneración del código genético, o pueden inclinarse a favor de los codones preferidos del organismo de origen. Pueden usarse también oligonucleótidos como iniciadores para PCR a partir de ARN mensajero transcrito en forma inversa a partir de una fuente conocida o supuesta; el producto de PCR puede ser ADNc de longitud completa, o puede usarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. En forma alternativa, puede secuenciarse completamente una proteína deseada, y puede realizarse la síntesis total de un ADN que codifique para ese polipéptido. Una vez que el ADNc o el ADN genómico deseado ha sido aislado, puede secuenciarse mediante métodos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos métodos están sujetos a errores, de modo que la secuenciación múltiple de la misma región es de rutina, y se espera aún lleve a índices mensurables de errores en la secuencia deducida resultante, en particular en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensiva, o composiciones de bases no usuales, tales como regiones con alto contenido de bases de GC. Cuando surgen discrepancias, puede repetirse la secuenciación, y pueden usarse métodos especiales. Los métodos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación, usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteren la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo, añadiendo formamida; diferentes iniciadores o iniciadores localizados a diferentes distancias de la región problema; o diferentes moldes tales como molécula de ADN de cadena sencilla. Puede usarse también secuenciación de ARN mensajero. La secuencia codificante completa, o parte de la misma para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, puede ser de una fuente natural. Sin embargo, en algunas situaciones, es deseable modificar los codones completos, o una porción de los mismos, por ejemplo, para intensificar la expresión, usando codones preferidos del hospedero. Codones preferidos del hospedero pueden determinarse a partir de los codones de más alta frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie hospedera particular de interés. De esta manera, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, puede sintetizarse totalmente o en parte. El ADN completo, o porciones del mismo, pueden sintetizarse también para remover cualquier secuencia o región de desestabilización de estructura secundaria que estaría presente en el ARN mensajero transcrito. El ADN completo, o porciones del mismo, pueden sintetizarse también para alterar la composición de bases a una más preferible en la célula hospedera deseada. Métodos para sintetizar secuencias y reunir secuencias, están bien establecidos en la literatura. Puede usarse mutagénesis in vitro y selección, mutagénesis dirigida a sitio u otros medios, para obtener mutaciones de genes de desaturasa de ocurrencia natural para producir un polipéptido que tenga actividad de desaturasa in vivo, con parámetros físicos y cinéticos más deseables para funcionar en la célula hospedera, tal como una vida media más larga o una mayor velocidad de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado. Una vez que se haya obtenido el polinucleótido que codifica para un polipéptido de desaturasa, se pone un vector capaz de repllcación en una célula hospedera, o se propaga in vitro mediante técnicas tales como PCR o PCR larga. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos, y similares. Vectores deseables incluyen aquellos útiles para mutagénesis del gen de Interés, o para la expresión del gen de interés en células hospederas. La técnica de PCR larga ha hecho posible la propagación in vitro de grandes construcciones, de modo que modificaciones al gen de interés, tales como mutagénesis o adición de señales de expresión, y propagación de las construcciones resultantes, pueden ocurrir enteramente in vitro sin el uso de un vector de repllcación o una célula hospedera. Para la expresión de un polipéptido de desaturasa, regiones de terminación e inicio de la transcripción y traducción son enlazadas operablemente al polinucleótido que codifica para el polipéptido de desaturasa. La expresión de la región codificante del polipéptido puede ocurrir in vitro o en una célula hospedera. Regiones de terminación e inicio de la transcripción y traducción, se derivan de una variedad de fuentes no exclusivas que incluyen el polinucleótido que se va a expresar, genes conocidos o que se sospecha son capaces de expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un locus endógeno en una célula hospedera. La expresión en una célula hospedera puede lograrse en una forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula hospedera, pero cuyas construcciones no se replican y rara vez se integran en la célula hospedara, o en donde la célula hospedera no esté proliferando. Puede lograrse también expresión transitoria, induciendo la actividad de un promotor regulable enlazado operablemente al gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles exhiben con frecuencia un nivel de expresión basal reducido. Puede lograrse expresión estable introduciendo una construcción que pueda integrarse en el genoma del hospedero, o que se replique en forma autónoma en la célula hospedera. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse a través del uso de un marcador seleccionable localizado en la construcción de expresión o transfectado con la misma, seguido de selección para células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de integración, la integración de construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma del hospedero, o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma del hospedero suficientes para dirigir la recombinación con el locus del hospedero. En donde las construcciones son dirigidas hacia un locus endógeno, todas las regiones reguladoras de la transcripción y traducción, o algunas de las mismas, pueden ser provistas por el locus endógeno. Cuando se desee expresión incrementada del polipéptido de desaturasa en el organismo de origen, pueden usarse varios métodos. Genes adicionales que codifiquen para el polipéptido de desaturasa pueden introducirse en el organismo hospedero. La expresión del locus de desaturasa nativo puede incrementarse también a través de recombinación homologa, por ejemplo, insertando un promotor más fuerte en el genoma del hospedero para causar expresión incrementada, removiendo secuencias de desestabilización del ARN mensajero o la proteína codificada, eliminando esa información del genoma del hospedero, o añadiendo secuencias de estabilización al ARN mensajero (véase patente de E.U.A. No. 4,910,141 ). Se contempla que más de un polinucleótido que codifica para una desaturasa o un polinucleótido que codifica para más de una desaturasa, puede introducirse y propagarse en una célula hospedera mediante el uso de vectores de expresión episómicos o integrados. En donde dos o más genes se expresan a partir de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un diferente medio de replicación. Cada construcción introducida, ya sea integrada o no, debe tener medios de selección diferentes, y debe carecer de homología con las otras construcciones para mantener una expresión estable y prevenir el reordenamiento de los elementos entre las construcciones. Elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y métodos de propagación de la construcción introducida pueden determinarse experimentalmente, de modo que todos los polinucleótidos introducidos sean expresados a los niveles necesarios para proveer la síntesis de los productos deseados. Cuando sean necesarias para la transformación, las secuencias codificantes de Al5-desaturasa de la presente invención pueden insertarse en un vector de transformación en plantas, por ejemplo, el vector binario descrito por Bevan (1984). Pueden derivarse vectores de transformación en plantas modificando el sistema natural de transferencia de genes de Agrobacteríum tumefaciens. El sistema natural comprende grandes plásmidos Ti (inductores de tumores) que contienen un gran segmento, conocido como ADN T, que es transferido a plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia del ADN T. La región de ADN T es bordeada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, los genes inductores de tumores han sido eliminados, y las funciones de la región vir se usan para transferir ADN introducido bordeado por secuencias de borde de ADN T. La región T contiene también un marcador seleccionable para resistencia a antibióticos, y un sitio de clonación múltiple para inserción de secuencias para transferencia. Dichas cepas diseñadas se conocen como cepas de A. tumefaciens "desarmadas", y permiten la transformación eficiente de secuencias bordeadas por la región T en los genomas nucleares de plantas. La presente invención encuentra muchas aplicaciones. Las sondas basadas en los polinucleótidos de la presente invención pueden encontrar uso en métodos para aislar moléculas relacionadas, o en métodos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los polinucleótidos u oligonucleótidos deben ser detectables. Esto se logra usualmente uniendo una marca en un sitio interno, por ejemplo, mediante incorporación de un residuo modificado, o en el extremo 5' o 3'. Dichas marcas pueden ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que es marcada detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no marcada y una molécula terciara marcada detectablemente; este procedimiento puede extenderse, en tanto sea práctico para lograr una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios o de unión mediante puentes, pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u otros anticuerpos, o pueden incluir cualquier molécula que se una a alguna otra, por ejemplo, un sistema de biotina-estreptavidina/avidina. Marcas detectables incluyen típicamente isótopos radiactivos, moléculas que se producen químicamente o enzimáticamente o alteran la luz, enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes, o moléculas cuya fluorescencia o características de emisión de luz cambian tras la unión. Ejemplos de métodos de marcación pueden encontrarse en la patente de E.U.A. No. 5,011 ,770. En forma alternativa, la unión de moléculas objetivo puede detectarse directamente midiendo el cambio en calor de solución en la unión de la sonda al objetivo, mediante calorimetría de titulación isotérmica, o recubriendo la sonda u objetivo sobre una superficie, y detectando el cambio en dispersión de luz de la superficie producida, por unión del objetivo o sonda, respectivamente, como puede hacerse con el sistema BIAcore. Construcciones que comprendan el gen de interés, pueden introducirse en una célula hospedera mediante técnicas estándar. Por conveniencia, una célula hospedera que ha sido manipulada mediante cualquier método para captar una secuencia o construcción de ADN, será referida en la presente como "transformada" o "recombinante". El presente hospedero tendrá por lo menos una copia de la construcción de expresión, y puede tener dos o más, por ejemplo, dependiendo de si el gen es integrado en el genoma, amplificado, o está presente en un elemento extracromosómico que tiene números de copias múltiples. La célula hospedera transformada puede identificarse mediante selección de un marcador contenido en la construcción introducida. En forma alternativa, una construcción de marcación separada puede introducirse con la construcción deseada, ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en células hospederas. Típicamente, los hospederos transformados se seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico, o pueden carecer de un factor necesario para el crecimiento del hospedero no transformado, tal como un nutriente o factor de crecimiento. Un gen de marcación introducido para el mismo, puede conferir resistencia a antibióticos, o puede codificar para una enzima o factor de crecimiento esencial, y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando se expresa en el hospedero transformado. La selección de un hospedero transformado puede ocurrir también cuando la proteína de marcación expresada puede detectarse, ya sea directamente o indirectamente. La proteína de marcación puede expresarse sola o como una fusión con otra proteína. La proteína de marcación puede detectarse mediante su actividad enzimática, por ejemplo, la beta- galactosidasa puede convertir el substrato X-gal a un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina a un producto emisor de luz. La proteína de marcación puede detectarse por sus características de modificación o producción de luz; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria, fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína de marcación o una marca molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Células que expresan la proteína de marcación o marca pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o mediante técnicas tales como FACS o toma panorámica usando anticuerpos. Deseablemente, la resistencia a kanamicina y el aminoglucósido G418 es de interés, así como la capacidad para crecer en medios que carecen de uracílo, leucina, lisina o triptófano. De particular interés, es la producción de PUFAs mediada por Al 5-desaturasa en células hospederas eucarióticas. Las células eucarióticas incluyen células vegetales, tales como las de plantas de cultivo que producen aceite y otras células sujetas a manipulación genética, incluyendo células de hongos. Las células pueden cultivarse o formarse como un organismo hospedero completo, o parte del mismo, incluyendo una planta. En una modalidad preferida, el hospedero es una célula vegetal que produce y/o puede asimilar substratos suministrados exógenamente para una ?15- desaturasa, y produce de preferencia grandes cantidades de uno o más de los substratos. La célula hospedera transformada se desarrolla bajo condiciones adecuadas adaptadas para un resultado final deseado. Para células hospederas desarrolladas en cultivo, las condiciones se optimizan típicamente para producir el rendimiento más grande o más económico de PUFAs que se relaciona con la actividad de desaturasa seleccionada. Condiciones del medio que pueden optimizarse incluyen: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, adición de substrato, concentración final de substrato añadido, forma de substrato añadido, crecimiento aeróbico o anaerobico, temperatura de crecimiento, agente inductor, temperatura de inducción, fase de crecimiento en la inducción, fase de crecimiento en la cosecha, pH, densidad y mantenimiento de la selección. Otro aspecto de la presente invención provee plantas transgénicas o progenie de plantas que contienen el ADN aislado de la invención. Se contempla plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se transforman células vegetales con un ADN aislado que codifica para A15-desaturasa mediante cualquiera de los métodos de transformación de plantas descritos anteriormente. La célula vegetal transformada, usualmente en un cultivo de callos o disco foliar, se regenera en una planta transgénica completa mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Horsch et al., 1985). En una modalidad, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa, maíz, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, plantas con fruto, plantas de cítricos, o plantas que producen nueces y bayas. Puesto que la progenie de las plantas transformadas hereda el polinucleótido que codifica para ?15-desaturasa, las semillas o estacas de plantas transformadas pueden usarse para mantener la línea de plantas transgénicas. La presente invención provee además un método para proveer plantas transgénicas con un contenido incrementado de ALA y/o SDA. Este método incluye, por ejemplo, introducir ADN que codifica para Al5-desaturasa en células vegetales que carecen o que tienen bajos niveles de ALA o SDA, pero que contienen LA, y regenerar plantas con contenido incrementado de ALA y/o SDA a partir de las células transgénicas. En ciertas modalidades de la invención, puede introducirse también un ADN que codifica para una ?6- y/o Al2-desaturasa en las células vegetales. Dichas plantas pueden o no comprender también actividad de ?6- y/o Al2-desaturasa endógena. En ciertas modalidades, plantas de cultivo modificadas desarrolladas comercialmente se contemplan como el organismo transgénico incluyendo, pero no limitado a, Arabidopsis thaliana, cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa, maíz, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, plantas con fruto, plantas de cítricos, o plantas que producen nueces y bayas. La presente invención provee además un método para proveer plantas transgénicas que pueden contener niveles elevados de ALA y/o SDA, en donde dichos niveles elevados son mayores que los niveles encontrados en plantas no transformadas. Este método puede comprender introducir uno o más polinucleótidos que codifican para A15-desaturasa en una planta que carece o que tiene bajos niveles de ALA, pero que contiene LA. Vectores de expresión que comprenden ADN que codifica para una Al5-desaturasa, o una A15-desaturasa y una A6-desaturasa, pueden construirse mediante métodos de tecnología recombinante conocidos por los expertos en la técnica (Sambrook et al., 1989). En particular, se contemplan plantas de cultivo desarrolladas comercialmente como el organismo transgénico incluyendo, pero no limitado a, Arabidopsis thaliana, cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa y maíz. Para complementación dietética, los PUFAs purificados, plantas transformadas o partes de plantas, o derivados de los mismos, pueden incorporarse en aceites de cocina, grasas o margarinas formulados de modo que en uso normal, el sujeto reciba la cantidad deseada. Los PUFAs pueden incorporarse también en fórmulas infantiles, complementos nutricionales u otros productos alimenticios, y pueden encontrar uso como agentes antiinflamatorios o que disminuyen el colesterol. Como se usa en la presente, "composición comestible" se define como composiciones que pueden ser ingeridas por un mamífero, tales como productos alimenticios, sustancias nutricionales y composiciones farmacéuticas. Como se usa en la presente, "productos alimenticios" se refieren a sustancias que pueden usarse o prepararse para su uso como alimento para un mamífero, e incluyen sustancias que pueden usarse en la preparación de alimento (tales como aceites para freír) o aditivos de alimentos. Por ejemplo, los productos alimenticios incluyen productos usados para consumo humano, o cualquier producto de los mismos tales como, por ejemplo, huevos. Productos alimenticios típicos incluyen, pero no están limitados a, bebidas (por ejemplo, bebidas suaves, bebidas carbonatadas, bebidas listas para mezclar), alimentos infundidos (por ejemplo, frutos y vegetales), salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de fruta, jarabes, postres (por ejemplo, pudines, gelatina, alcorzas y rellenos, conservas horneadas y postres congelados tales como helados y sorbetes), productos congelados blandos (por ejemplo, cremas congeladas blandas, helados congelados blandos y yogurts, remates congelados blandos tales como remates lácteos o remates no lácteos batidos), aceites y productos emulsionados (por ejemplo, manteca, margarina, mayonesa, mantequilla, aceite de cocina y aderezos para ensalada), y alimentos de humedad intermedia (por ejemplo, arroz y alimentos para perro). Además, las composiciones comestibles descritas en la presente pueden ingerirse también como un aditivo o complemento contenido en alimentos y bebidas. Estos pueden formularse junto con una sustancia nutricional tal como varias vitaminas y minerales, e incorporados en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas nutritivas, leches de soya y sopas; composiciones sustancialmente sólidas; y gelatinas, o pueden usarse en forma de un polvo que se incorporará en varios alimentos. El contenido del ingrediente efectivo en dicho alimento funcional o para la salud puede ser similar a la dosis contenida en un agente farmacéutico típico. Los PUFAs purificados y plantas o partes de plantas transformadas, pueden incorporarse también en forraje para animales, en particular para ganado. De esta forma, los animales mismos pueden beneficiarse de una dieta rica en PUFA, mientras que los consumidores humanos de productos alimenticios producidos a partir de dicho ganado pueden beneficiarse también. Se espera que en ciertas modalidades, el SDA sea convertido a EPA en animales, y de esta manera dichos animales pueden beneficiarse de un incremento en EPA por consumo de SDA. Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones pueden administrarse en general oralmente, pero pueden administrarse mediante cualquier vía por la cual puedan ser absorbidas exitosamente, por ejemplo, parenteralmente (es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente), rectalmente, vaginalmente o tópicamente, por ejemplo, como una loción o ungüento para la piel. Los PUFAs de las plantas o partes de plantas transformadas de la presente invención, pueden administrarse solos o en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En donde estén disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida de administración oral. La complementación dietética como se describió anteriormente, puede proveer también una vía de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable es abarcada por la presente invención; especialmente preferidas, son las sales de sodio, potasio o litio. También abarcadas son las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como N-metil glucamina, presente en la publicación del PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres de etilo. Como sales sólidas, los PUFAs pueden administrarse también en forma de tableta. Para administración intravenosa, los PUFAs o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralipid. Si se desea, las regiones de un polipéptido de desaturasa importantes para actividad de desaturasa, pueden determinarse a través de mutagénesis de rutina, seguida de expresión de los polipéptidos mutantes resultantes y determinación de sus actividades. Los mutantes pueden incluir sustituciones, deleciones, inserciones y mutaciones puntuales, o combinaciones de las mismas. Pueden hacerse sustituciones con base en el carácter hidrofílico o hidrofóbico conservado (véase Kyte y Doolittle, 1982), o con base en la capacidad para asumir una estructura secundaria de polipéptido similar (véase Chou y Fasman, 1978). Un análisis funcional típico comienza con mutagénesís por deleción para determinar los límites N- y C- terminales de la proteína necesarios para función, y entonces se hacen mutaciones puntuales, inserciones o deleciones para determinar adicionalmente regiones necesarias para función. Pueden usarse también otras técnicas tales como mutagénesis de cassette o síntesis total. La mutagénesís por deleción se logra, por ejemplo, usando exonucleasas que remuevan secuencialmente las regiones codificantes 5' o 3'. Están disponibles equipos para dichas técnicas. Después de la deleción, la región codificante concluye ligando oligonucleótidos que contengan codones de inicio o detención a la región codificante eliminada después de deleción 5' o 3', respectivamente. En forma alternativa, se insertan oligonucleótidos que codifican para codones de inicio o detención en la región codificante, mediante una variedad de métodos que incluyen mutagénesis dirigida a sitio, PCR mutagénica o mediante ligación en ADN digerido en sitios de restricción existentes. En forma similar, pueden hacerse deleciones internas a través de una variedad de métodos que incluyen el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de iniciadores mutagénicos mediante mutagénesis dirigida a sitio o PCR mutagénica. Las inserciones se hacen a través de métodos tales como mutagénesis por exploración del enlazador, mutagénesis dirigida a sitio o PCR mutagénica. Las mutaciones puntuales se hacen a través de técnicas tales como mutagénesis dirigida a sitio o PCR mutagénica. Las mutagénesis químicas pueden usarse también para identificar regiones de un polipéptido de desaturasa importante para actividad. Dicho análisis de función-estructura puede determinar qué regiones pueden eliminarse, qué regiones toleran inserciones, y qué mutaciones puntuales permiten que la proteina muíante funcione en sustancialmente la misma forma que la desaturasa nativa. Dichas proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que codifican para las mismas, están dentro del alcance de la presente invención. Como se describió anteriormente en la presente, ciertas modalidades de la presente invención se refieren a construcciones de transformación en plantas. Por ejemplo, un aspecto de la presente invención es un vector de transformación en plantas que comprende uno o más genes de desaturasa o moléculas de ADNc. Ejemplos de secuencias codificantes para su uso con la invención, incluyen el gen de ??d-desaturasa de Neurospora crassa NcD15D (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y el gen de ?15-desaturasa de Aspergillus nidulans AnD15D (SEQ ID NO: 4). En ciertas modalidades, pueden usarse también secuencias de desaturasa antisentido con la invención. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican para desaturasa, incluyen por lo menos 20, 40, 80, 120, 300 y hasta la longitud completa de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33. En ciertos aspectos, un ácido nucleico puede codificar para 1 , 2, 3, 4 o más enzimas desaturasa. En modalidades particulares, un ácido nucleico puede codificar para una ?6- y una A15-desaturasa.

En ciertas modalidades de la invención, se proveen secuencias codificantes enlazadas operablemente a un promotor heterólogo, en orientación sentido o antisentido. Se proveen también construcciones de expresión que comprenden estas secuencias, así como plantas y células vegetales transformadas con las secuencias. La producción de construcciones que puede usarse en conjunto con técnicas de transformación en plantas usando éstas y otras secuencias de conformidad con la invención, será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Gelvin et al., 1990). De esta manera, las técnicas de la presente invención no se limitan a alguna secuencia de ácido nucleico en particular. Un uso de las secuencias provistas por la invención, será en la alteración de fenotipos de la planta, por ejemplo, composición de aceite, mediante transformación genética con genes de desaturasa, en particular modalidades de una A15-desaturasa de hongos. El gen de desaturasa puede proveerse con otras secuencias. En donde una región codificante expresable que no sea necesariamente una región codificante de marcación se use en combinación con una región codificante de marcación, pueden usarse las regiones codificantes separadas en los mismos segmentos de ADN o en segmentos de ADN diferentes para transformación. En el último caso, los vectores diferentes se suministran concurrentemente a células receptoras para aumentar al máximo la cotransformación. La elección de algún elemento adicional usado en conjunto con las secuencias codificantes de desaturasa, dependerá con frecuencia del propósito de la transformación. Uno de los propósitos principales de la transformación de plantas de cultivo, es agregar rasgos comercialmente deseables y agronómicamente importantes a la planta. Puesto que los PUFAs son conocidos por conferir muchos efectos benéficos a la salud, los incrementos concomitantes en la producción de SDA pueden ser también benéficos, y podrían lograrse mediante la expresión de A 5-desaturasas de hongos. Dicho incremento de SDA puede comprender, en ciertas modalidades de la invención, la expresión de ?6- y/o Al2-desaturasas, incluyendo ?6- y/o A12-desatu rasas de hongos o plantas. Los vectores usados para la transformación de plantas pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, YACs (cromosomas artificiales de levadura), BACs (cromosomas artificiales de bacterias), o cualquier otro sistema de clonación adecuado, así como fragmentos de ADN de los mismos. De esta manera, cuando se usa el término "vector" o "vector de expresión", se incluyen todos los tipos de vectores anteriores, así como secuencias de ácido nucleico aisladas de los mismos. Se contempla que el uso de sistemas de clonación con grandes capacidades de inserción, permitirá la introducción de grandes secuencias de ADN que comprendan más de un gen seleccionado. De conformidad con la invención, esto podría usarse para introducir varios ácidos nucleicos que codifican para desaturasa. La introducción de dichas secuencias puede facilitarse mediante el uso de cromosomas artificiales de bacterias o levaduras (BACs o YACs, respectivamente), o incluso cromosomas artificiales de plantas. Por ejemplo, el uso de BACs para transformación mediada por Agrobacterium, fue descrito por Hamilton et al. (1996). Particularmente útiles para transformación, son cassettes de expresión que han sido aislados de dichos vectores. Los segmentos de ADN usados para la transformación de células vegetales comprenderán en general, de hecho, el ADNc, el gen o los genes que se desee introducir y se hayan expresado en las células hospederas. Estos segmentos de ADN pueden incluir además estructuras tales como promotores, intensificadores, polienlazadores, o incluso genes reguladores, según se desee. El gen o segmento de ADN elegido para introducción celular, codificará con frecuencia para una proteína que se expresará en las células recombinantes resultantes, resultando en un rasgo seleccionare o tamizable y/o que impartirá un fenotipo mejorado a ia planta transgénica resultante. Sin embargo, este puede no ser siempre el caso, y la presente invención abarca también plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Componentes preferidos que se incluirán probablemente con vectores usados en la presente invención, son los siguientes: En una modalidad, la presente invención usa ciertos promotores. Ejemplos de dichos promotores que pueden usarse con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los promotores 35S del Ca V (virus del mosaico de la coliflor), 34S del FMV (virus del mosaico de la escrofularia) (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,378,619, cuyo contenido se incorpora en su totalidad en la presente como referencia), Napin (de Brassica), 7S (de soya), Glob y Lee (del maíz). El promotor 35S del CaMV, y los promotores que son regulados durante la maduración de las semillas de la planta, son de interés particular para su uso con la presente invención. Dichos promotores y elementos reguladores de la transcripción, individualmente o en combinación, se contemplan para su uso en los presentes vectores de expresión repiicables, y son conocidos por los expertos en la técnica. El promotor 35S del CaMV es descrito, por ejemplo, por Restrepo et al. (1990). Secuencias reguladoras mutadas y genéticamente transformadas que llevan a expresión específica de la semilla, pueden usarse también para la producción de una composición de aceite de semilla modificada. Dichas modificaciones de la invención descritas en la presente, serán obvias para los expertos en la técnica. La secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia guía no traducida, puede influir también sobre la expresión génica. Puede desearse de esta manera usar una secuencia guía particular con una construcción de transformación de la invención. Se contemplan secuencias guía preferidas que incluyen aquellas que comprenden secuencias que se predice dirigen la expresión óptima del gen unido, es decir, que incluyen una secuencia guía consenso preferida que puede incrementar o mantener la estabilidad del ARN mensajero, y prevenir el inicio inadecuado de la traducción. La elección de dichas secuencias será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Se preferirán típicamente secuencias que se deriven de genes que son altamente expresados en plantas. Las construcciones de transformación preparadas de conformidad con la invención, incluirán típicamente una secuencia de ADN del extremo 3' que actúe como una señal para terminar la transcripción, y permita la poliadenilación del ARN mensajero producido por secuencias codificantes enlazadas operablemente a un gen de desaturasa (por ejemplo, ADNc). En una modalidad de la invención, se usa el terminador nativo de un gen de desaturasa. En forma alternativa, un extremo 3' heterólogo puede intensificar la expresión de las regiones codificantes de desaturasa. Ejemplos de terminadores considerados como útiles, incluyen aquellos del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (extremo nos 3') (Bevan et al., 1983), el terminador para el transcrito de T7 del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, el extremo 3' de los genes del inhibidor de proteasa I o II de papa o tomate, y el terminador 35S del CaMV (tml3'). En donde se desee, pueden incluirse además elementos reguladores tales como un intrón Adh (Callis, et al., 1987), intrón de sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989) o elemento omega del TMV (Gallie et al., 1989). Mediante el uso de una proteína de marcación seleccionare o tamizable, es posible proveer o intensificar la capacidad para identificar transformantes. "Genes de marcación", son genes que imparten un fenotipo distinto a células que expresan la proteína de marcación, y permiten de esta manera que dichas células transformadas se diferencien de células que no tienen el marcador. Dichos genes pueden codificar para un marcador seleccionable o tamizable, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que puede "seleccionarse" mediante medios químicos, es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, o similares), o si es simplemente un rasgo que puede identificarse a través de observación o prueba, es decir, mediante "tamizado" (por ejemplo, la proteína fluorescente verde). De hecho, muchos ejemplos de proteínas de marcación adecuadas se conocen en la técnica, y pueden usarse en la práctica de la invención. Se piensa que métodos adecuados para la transformación de células vegetales u otras células para su uso con la presente invención, incluyen virtualmente cualquier método por el cual puede introducirse ADN en una célula, tal como mediante suministro directo de ADN, tal como mediante transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993), mediante captación de ADN mediada por inhibición/desecación (Potrykus et al., 1985), mediante electroporación (patente de E.U.A. No. 5,384,253, que se incorpora específicamente en su totalidad en la presente como referencia), mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; patente de E.U.A. No. 5,302,523, que se incorpora específicamente en su totalidad en la presente como referencia; y patente de E.U.A. No. 5,464,765, incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia), mediante transformación mediada por Agrobacterium (patente de E.U.A. No. 5,591 ,616 y patente de E.U.A. No. 5,563,055; ambas incorporadas específicamente en la presente como referencia), y mediante aceleración de partículas recubiertas de ADN (patente de E.U.A. No. 5,550,318; patente de E.U.A. No. 5,538,877; y patente de E.U.A. No. 5,538,880; cada una incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia), etc. Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, las células de virtualmente cualquier especie vegetal pueden transformarse establemente, y estas células pueden desarrollarse en plantas transgénicas. Después de efectuar el suministro de ADN exógeno a células receptoras, los siguientes pasos se refieren en general a identificar las células transformadas para cultivo y regeneración de la planta adicionales. Para mejorar la capacidad para identificar transformantes, puede desearse usar un gen de marcación seleccionare o tamizable con un vector de transformación preparado de conformidad con la invención. En este caso, en general, se pondría entonces a prueba la población de células potencialmente transformadas exponiendo las células a un agente o agentes selectivos, o se seleccionarían las células para el rasgo deseado del gen de marcación. Las células que sobrevivan a la exposición al agente selectivo, o las células que hayan sido calificadas como positivas en una prueba de selección, pueden cultivarse en medios que sustenten la regeneración de plantas. En un ejemplo de modalidad, pueden modificarse medios MS y N6 incluyendo otras sustancias tales como reguladores del crecimiento. Uno de dichos reguladores del crecimiento es dicamba o 2,4-D. Sin embargo, pueden usarse otros reguladores del crecimiento, incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o picloram. Se ha encontrado que la mejora de los medios facilita el crecimiento de células en etapas de desarrollo específicas. El tejido puede mantenerse en un medio básico con reguladores del crecimiento, hasta que exista tejido suficiente para iniciar los esfuerzos de regeneración de la planta, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para regeneración, típicamente por lo menos dos semanas, y transferido entonces a medios que lleven a la maduración de los embrioides. Los cultivos se transfieren cada dos semanas a este medio. El desarrollo de brotes indicará el tiempo de transferencia al medio que carece de reguladores del crecimiento. Para confirmar la presencia del ADN exógeno o "transgenes" en las plantas en regeneración, puede llevarse a cabo una variedad de pruebas. Dichas pruebas incluyen, por ejemplo, pruebas de "biología molecular" tales como Southern y Northern blotting y PCR™, pruebas "bioquímicas" tales como detectar la presencia de un producto de proteína, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISAs y Western blots), o mediante función enzimática; pruebas de partes de la planta, tales como pruebas de hoja o raíz; y también, analizando el fenotipo de la planta regenerada completa. Además de la transformación directa de un genotipo particular de la planta con una construcción preparada de conformidad con la presente invención, pueden obtenerse plantas transgénicas cruzando una planta que tenga un ADN seleccionado de la invención con una segunda planta que carezca del ADN. Pueden usarse también técnicas de fitomejoramiento para introducir desaturasas múltiples, por ejemplo, ?6, ?12 y/o Al5-desaturasas en una sola planta. De esta manera, la ?? d-desaturasa puede ser efectivamente sobrerregulada. Mediante la creación de plantas homocígóticas para una actividad de A15-desaturasa y/u otra actividad de desaturasa (por ejemplo, actividad de ?6- y/o Al2-desaturasa), pueden incrementarse metabolitos benéficos en la planta. Como se describió anteriormente, puede introducirse un gen de desaturasa seleccionado en una variedad de planta particular mediante cruzamiento, sin la necesidad de transformar directamente una planta de esa variedad determinada. Por lo tanto, la presente invención no sólo abarca una planta transformada o regenerada directamente de células que han sido transformadas de conformidad con la presente invención, sino también la progenie de dichas plantas. Como se usa en la presente, el término "progenie" denota la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de conformidad con la presente invención, en donde la progenie comprende una construcción de ADN seleccionada preparada de conformidad con la invención. El "cruzamiento" de una planta para proveer una línea de plantas que tienen uno o más transgenes o alelos añadidos respecto a una línea de plantas de partida, como se describe en la presente, se define como las técnicas que resultan en una secuencia particular que es introducida en una línea de plantas cruzando una línea de partida con una línea de plantas donadoras que comprenden un transgen o alelo de la invención. Para lograr esto se podrían seguir, por ejemplo, los siguientes pasos: (a) sembrar semillas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de plantas donadoras que comprenden un transgen o alelo deseado) plantas progenitoras; (b) desarrollar las semillas de la primera y segunda plantas progenitoras en plantas que poseen flores; (c) polinizar una flor de la primera planta progenitora con polen de la segunda planta progenitora; y (d) cosechar semillas producidas en la planta progenitora que posee la flor fecundada. La retrocruza se define en la presente, como el procedimiento que incluye los pasos de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene un gen deseado, secuencia de ADN o elemento, con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen deseado, secuencia de ADN o elemento; (b) seleccionar una o más plantas de la progenie que contengan el gen deseado, secuencia de ADN o elemento; (c) cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir los pasos (b) y (c) con el propósito de transferir una secuencia de ADN deseada de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo. La introgresión de un elemento de ADN en el genotipo de una planta, se define como el resultado del proceso de conversión por retrocruza. El genotipo de una planta en el cual una secuencia de ADN ha sido introgresada, puede referirse como un genotipo, línea, endógamo o híbrido convertido por retrocruza. En forma similar, el genotipo de una planta que carezca de la secuencia de ADN deseada, puede referirse como un genotipo, línea, endógamo o híbrido no convertido.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar modalidades de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes, representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y lograr aún un resultado idéntico o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos en la presente, mientras que se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustituyentes y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, como se define mediante las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Cepas y condiciones de crecimiento Se obtuvieron el tipo A de la cruza de Neurospora crassa y el tipo silvestre Glasgow de A$pergillus nidulans, del Fungal Genetics Stock Center. Se desarrollaron cultivos en mecRo de Vogel (N. Cas^'- - f'3É, Neurospora Newsletter, 8: 25-26, 1965). Se inocularon cultivos líquidos con ascosporas, y se desarrollaron durante 3 días a aproximadamente 5°C con agitación a 100 RPM. Se cosechó el micelio mediante filtración en un embudo de Buchner a través de papel Whatman número , y se almacenó a 80°C para aislamiento de ARN, o se liofilizó directamente para determinación de composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases. La cepa de Saccharomyces cerevisiae usada fue INVSd, una cepa diploide que es auxotrófica para histidina, leucina, triptófano y uracilo (Invitrogen). Las células se mantuvieron en medios YPD a 30°C.

EJEMPLO 2 Aislamiento de ARN de hongos Se aisló ARN total del micelio de hongos de las 3 cepas descritas en el ejemplo 1 , usando el método de guanidinio ácido-fenol-cloroformo de Chomczynski y Sacchi (1987, Tri-Reagent, SIGMA). Este método provee 500 mg de micelio que se muele en nitrógeno líquido, y se añade entonces a 7 mi de Tri-Reagent. Se añadió cloroformo para separar la fase acuosa de la fase orgánica. Se precipitó el ARN con isopropanol, y se lavó entonces con etanol a 70% antes de ser resuspendido en agua desionizada.

EJEMPLO 3 Clonación de las secuencias de ?12- y Al5-desaturasa de N. crassa Con base en comparaciones de secuencias con las secuencias genómicas de N. crassa, se diseñaron iniciadores específicos de genes para amplificar las regiones codificantes de longitud completa de la D12-desaturasa putativa (Nc111F2 y Nc111R3) y la ??d-desaturasa putativa (Nc94F6 y Nc94R8). Se diseñaron iniciadores de avance que incluían tres nucleótidos 5' del sitio Met de partida. Nc111 F2: 5 -AAGATGGCGTCCGTCTCCTCTGCCCTTCCC-3' (SEQ ID NO: 15) Nc111 R3: 5'-TTAGTTGGTTTTGGGGAGCTTGGCAGGCTTG-3' (SEQ ID NO: 16) Nc94F6: 5'-GCGGCCGCAACATGACGGTCACCACCCGCAGCCA-3' (SEQ ID NO: 17). El sitio Noñ añadido al extremo 5' del oligonucleótido, está en cursivas. Nc94R8: 5'-CC 7GCAGGTTACTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCG-3' (SEQ ID NO: 18). El sitio Sse83871 añadido al extremo 5' del oligonucleótido, está en cursivas. Se preparó el ADNc para N. crassa, usando el equipo de amplificación de ADNc Marathón (Clontech Laboratories). Estos iniciadores se usaron con ADNc listo para 3 -RACE para amplificar desaturasas putativas usando el sistema de PCR Gene Amp 9700 (PE Applied Biosystems), con las condiciones de iteración recomendadas. El producto de PCR generado con los oligonucleótidos Nc94F6 y Nc94R8, fue ligado en pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y nombrado como pMON67004 (figura 1). El ADN fue secuenciado, y se encontró que tres "cajas His", un rasgo conservado entre desaturasas unidas a membrana, están presentes en las posiciones de aminoácido 124-128, 160-164 y 359-363. Cuando se comparó con las otras ?12- y ?15-desaturasas unidas a membrana, se encontró que el motivo de la caja de istidina "HXXHH" final está también intacto. Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos correspondientes para la Al5-desaturasa (NcD15D), se dan en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y el clon genómico se da en SEQ ID NO: 1. pMON67004 fue digerido con EcoRI y ligado en el sitio EcoRI del vector de expresión en levaduras pYES2/CT para generar p ON77208 (figura 2). Para los vectores de transformación en plantas, pMON67004 fue digerido con EcoRI, seguido de una reacción de reserva, y cortado entonces por Sse8387l. El fragmento del gen fue ligado en el vector binario pMON73270, el cual fue digerido por Notl, seguido de una reacción de reserva, y entonces por Sse8387l. Esto dio lugar al vector pMON77214 (figura 4), en el cual el gen de Al5-desaturasa, NcD15D, estaba bajo regulación del promotor Napin específico de la semilla. El fragmento de ADN digerido con EcoRI/Sse8387l fue ligado también en el vector binario, pMON73273, dando lugar a pMON77217 (figura 4), en el cual NcD15D estaba bajo regulación del promotor 35S constitutivo.

El producto de PCR generado con los oligonucleótidos Nc111F2 y Nc111R3, fue ligado directamente en pYES2. 5-His-TOPO (Invitrogen), para generar pMON67005 (figura 7A). El ADNc fue secuenciado, y se encontró que tres "cajas His" están presentes en las posiciones de aminoácido 158-162, 194-198 y 394-398. Cuando se comparó con otras ?12- y ?15-desaturasas unidas a membrana, se encontró que el motivo de la caja de histidina "HXXHH" final estaba también intacto. Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos correspondientes para la A12-desaturasa putativa (NcD12D), se dan en SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, respectivamente.

EJEMPLO 4 Transformación y expresión en levaduras Se introdujeron las construcciones pMON67005 y pMON77208 en la cepa hospedera INVSd de S. cerevisiae (auxotrófica para uracilo) usando el protocolo PEG/Li Ac descrito en el manual de Invitrogen para pYES2.1/V5-H¡s-TOPO. Se seleccionaron transformantes en placas hechas de medio mínimo SC menos uracilo con glucosa a 2%. Se usaron colonias de transformantes para inocular 5 mi de medio mínimo SC menos uracilo y glucosa a 2%, desarrollado durante la noche a 30°C. Para inducción, células de levadura de fase estacionaria fueron transformadas a pellas y resuspendidas en medio mínimo SC menos uracilo complementado con galactosa a 2%, y desarrollado durante tres días a 15°C. Cuando se proveyeron ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añadió 0.01% de LA (?9, 12-18:2) con el emulsificante Tergitol a 0.1%. Los cultivos se desarrollaron durante 3 días a 15°C, y se cosecharon después mediante centrifugación. Las pellas de células se lavaron una vez con regulador de pH de TE estéril, pH 7.5, para remover los medios, y se liofilizaron durante 24 horas. La cepa hospedera transformada con el vector que contenía al gen de LacZ, se usó como control negativo en todos los experimentos. Para el análisis de ácidos grasos, la extracción de los lípidos de levadura siguió los procedimientos descritos anteriormente. En resumen, pellas de levadura liofitizadas fueron extraídas con 15 mi de metanol y 30 mi de cloroformo conteniendo 100 g de tridecanoína. Después de la extracción, los lípidos de levadura se saponificaron primero, y se metilaron los ácidos grasos liberados. La distribución de ésteres metílicos de ácido graso se analizó entonces mediante cromatografía de gases (GC) usando un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890 II Plus (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipado con un detector de ionización de llama, y una columna capilar de sílice fundida (Supelcomega; 50 m x 0.25 mm, d.i., Supelco, Bellefonte, PA). En levaduras transformadas con el vector de expresión que contenía LacZ como control, no se midió LA ni ALA (18:3) en líneas desarrolladas en ausencia de LA añadido. En levaduras transformadas con un vector de expresión que contenía NcD15D o BnD15D, en ausencia de LA añadido, no se acumuló ALA. En levaduras transformadas con un vector de expresión que contenía NcD12D sin LA añadido, se acumuló LA hasta 22% de los ácidos grasos, indicativo de actividad de D12D. Cuando se añadió LA a la línea de levaduras que expresaba NcD15D, ALA comprendió 1 % de los ácidos grasos. En la línea de levaduras que expresaba la A15-desaturasa de Brassica napus (BnD15D), ALA comprendió 0.2% de los ácidos grasos después de la adición de LA. En el control de LacZ, no se detectó ALA después de la adición de LA.

CUADRO 1 Datos de expresión en levaduras % de ácidos grasos en levaduras 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 Construcción Identidad Substrato % % % % % % de FA añadido PMON77208 NcD15D Ninguno 13.96 48.33 5.06 29.07 0.02 0.02 pMON67003 BnD15D Ninguno 13.22 48.15 5.18 29.82 0.00 0.00 PMON67005 NcD12D Ninguno 15.24 47.95 5.18 10.3 22.3 0 LacZ LacZ Ninguno 14.01 49.61 5.27 27.29 0.02 0.01 ? ??77208 NcD15D 18:2 18.34 25.98 5.94 16.09 30.30 1.04 PMON67003 BnD15D 18:2 18.45 26.19 5.91 16.26 30.61 0.20 LacZ LacZ 18:2 19.26 18.87 6.00 10.82 42.47 0.01 EJEMPLO 5 Transformación de Arabidopsis con NcD15D Este ejemplo describe la transformación y regeneración de plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas que expresan una secuencia codificante de ?15-desaturasa heteróloga. Se desarrollaron plantas de Arabidopsis, sembrando semillas en macetas de 10.16 cm conteniendo agua de osmosis invertida (ROW) y MetroMix 200 saturado (The SCOTTS Co., Columbus, OH). Las plantas fueron vernalizadas colocando las macetas en un semillero de cajón cubierto con un domo de humedad, en una cámara de crecimiento a 4-7°C, 8 horas de luz/día durante 4 a 7 días. Los semilleros de cajón se transfirieron a una cámara de crecimiento a 22°C, 55% de humedad relativa y 16 horas de luz/día, a una intensidad promedio de aproximadamente 160-200 moles/seg*m2. Después de la germinación el domo se levantó, y se deslizó de nuevo 2.54 cm para permitir la circulación de aire suave sin desecación. El domo de humedad se removió cuando las hojas verdaderas se habían formado. Las plantas se llenaron al fondo con agua, según fuese necesario, con ROW hasta 2 a 3 semanas después de la germinación. Las plantas se llenaron entonces al fondo con agua, según fuese necesario, con solución PLANTEX 18-18-15 (Plantex Corporation Ottawa, Canadá) a 50 ppm de N2. Las macetas fueron raleadas, de modo que quedara una planta por maceta 2 a 3 semanas después de la germinación. Una vez que las plantas comenzaron a erguirse, la inflorescencia primaria fue recortada para fomentar el crecimiento de los primordios axilares. Se introdujeron los vectores de transformación pMON77214 y pMON77217 en la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens, usando metodología bien conocida en la técnica. Se obtuvieron plantas de A. thaliana transgénicas como es descrito por Bent et al. (1994) o Bechtold et al. ( 993).

En resumen, se desarrollaron cultivos de Agrobacterium que contenían los vectores binarios pMON77214 o pMON77217 durante la noche en LB (bacto-triptona a 10%, extracto de levadura a 5% y NaCI a 10% con kanamicina (75 mg/L), cloramfenicol (25 mg/L) y espectinomicina (100 mg/L)). El cultivo de bacterias se centrifugó y se resuspendió en sacarosa a 5% + Silwet-77 a .05%. La porción aérea de plantas de A. thaliana completas (de aproximadamente 5 a 7 semanas), se sumergió en la solución resultante durante dos a tres segundos. El exceso de solución se removió secando las plantas sobre toallas de papel. Las plantas sumergidas se colocaron sobre su costado en un semillero de cajón cubierto, y se transfirieron a una cámara de crecimiento a 19°C. Después de 16 a 24 horas el domo se removió, y las plantas permanecieron erguidas. Cuando las plantas llegaron a la madurez, el agua se retuvo durante 2 a 7 días antes de cosechar las semillas. La semilla cosechada se hizo pasar a través de un tamiz malla de acero inoxidable. Para seleccionar los transformantes, la semilla se colocó sobre medio de agar que contenía 50 mg/L de glifosato. Las plántulas verdes se rescataron, se transplantaron en macetas de 10.16 cm, y se desarrollaron bajo las condiciones descritas anteriormente. Las hojas se cosecharon para análisis de ácidos grasos cuando la roseta estaba en la etapa de 4 hojas. Después de la liofilización, los ácidos grasos de las hojas se analizaron como se describió anteriormente.

EJEMPLO 6 Expresión funcional de clones de N. crassa Para evaluar el carácter específico funcional del clon D15D de N. crassa, la región codificante de pMON67004 fue clonada en un vector de expresión en plantas en el cual el promotor 35S constitutivo dirige la expresión del transgen. La construcción resultante, p ON77217, fue transformada en A. thaliana, y se analizaron hojas de plantas 12 transformadas para composición de ácidos grasos. En las líneas no transformadas, aproximadamente 20% de los ácidos grasos eran LA, y aproximadamente 48% ALA. En dos eventos de transformación de A. thaliana independientes, los niveles de LA fueron reducidos hasta aproximadamente 3% y 5%, y los niveles de ALA aumentaron hasta 65% y 63%, respectivamente, indicando actividad de Al 5-desaturasa ¡n planta. Estos datos se resumen en el cuadro 2. Los controles se designan como CONT.

CUADRO 2 Contenido de ácidos grasos de hojas de Arabidopsis EVENTO 16:0 16:1 18:0 18. 18:2 (LA) 18:3(ALA) CONT 1 14.9 0.8 1.4 4.8 19.7 48.2 CONT 2 15.3 0.9 1.4 5.1 20.5 49.2 CONT 3 14.5 0.9 1.4 5.1 19.6 49.5 ATG174 15.6 1.0 1.6 4.6 15.4 51 .9 AT G717 15.3 0.7 1.4 4.2 17.9 52.1 AT G716 14.9 0.6 1.6 3.1 15.8 55.1 ATG718 15.3 0.8 1.8 4.0 5.4 63.7 AT G709 17.0 0.9 1.9 4.3 3.5 64.0 Para evaluar el carácter específico funcional del clon D15D de N. crassa que dirige la producción de ALA en semillas, la región codificante de pMON67004 fue clonada en un vector de expresión específico de la semilla en el cual el promotor Napin dirige la expresión del transgen. La construcción resultante, pMON77214, fue transformada en A. thaliana, y se analizaron semillas de plantas T2 transformadas para composición de ácidos grasos. En las líneas no transformadas, aproximadamente 26% de los lípidos de la semilla estaba presente como LA, y aproximadamente 18% como ALA. En dos eventos de transformación de A. thaliana independientes, los niveles de LA fueron reducidos hasta aproximadamente 14% y 13%, y los niveles de ALA fueron incrementados hasta 26% y 30%, respectivamente, indicando actividad de ?? d-desaturasa en las semillas. Estos datos se muestran en el cuadro 3.

CUADRO 3 Contenidos de ácidos grasos de semillas de Arabidopsis EVENTO 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 (LA) 18:3 (ALA) Control 6.86 0.39 2.94 14.7 27.95 17.75 Control 7.11 0.37 3.33 15.22 26.48 18.11 G709 7.1 0.37 3.13 13.16 24.58 20.85 G71 1 7.08 0.37 3.16 13.49 24.24 21.07 G705 7.75 0.38 3.09 12.62 19.26 26.3 G707 8.12 0.36 2.98 14.2 15.71 29.74 Estos resultados indican que la proteína codificada por el ADNc de NcD15D de Neurospora, es una A15-desaturasa funcional en plantas, y que puede dirigir la síntesis de ALA en hojas y en semillas.

EJEMPLO 7 Actividad de la A15-desaturasa de Neurospora crassa en cañóla Se transformaron líneas con la construcción pMON77214, que contiene la A15-desaturasa de Neurospora dirigida por el promotor Napin. Las variedades de cañóla Quantum y Ebony fueron transformadas, y se incluyeron controles para ambas variedades. Los datos mostrados en el cuadro 4, corresponden al por ciento de 18:2 (LA) y 18.3 (ALA) en grupos de 20 semillas de plantas RQ.

CUADRO 4 Por ciento de PUFAs en grupos de 20 semillas de plantas Ro CUADRO 4 (CONTINUACION) La producción de ALA a niveles mayores de aproximadamente 12% de ácidos grasos de las semillas en estas líneas, fue indicativa de la actividad de A15-desaturasa heteróloga. El nivel más alto de ALA observado a partir de esta transformación estuvo en la línea BN_G1395, que contiene 30.17% de ALA. Para varias de las líneas que expresan pMON77214, se determinaron los ácidos grasos en semillas individuales, y se llevaron líneas a la siguiente generación. Como era de esperarse, los niveles de ALA aumentaron hasta casi el doble en semillas individuales respecto a los grupos, indicativo de homocigocidad para los transgenes en segregantes individuales dentro de cada silicua. En la línea BN_1296, la semilla R1 agrupada contenía 25.04% de ALA. En la semilla individual más alta de esta línea (BN_G1296- 1 ), se observó 48.2% de ALA. Los niveles de ALA en 200 mitades de semilla, ordenados de ALA más bajo a más alto, se muestra en la figura 3.

EJEMPLO 8 Clonación de la secuencia de ?15-desaturasa de A. nidulans y las secuencias de ?12- y ?15-desaturasa de B. cinérea Con base en comparaciones de secuencias con la secuencia genómica de A. nidulans, se diseñaron iniciadores específicos de genes para amplificar las regiones codificantes de longitud completa de la ?15-desaturasa putativa (AnD15-F1 y AnD15-R1 ). Se diseñó el iniciador de avance que incluye tres nucleótidos 5' del sitio Met de partida. AnD15-F1 : 5'-AATATGGCTGCAACTGCAACAACCC-3' (SEQ ID NO: 23) AnD15-R1 : 5'-TTCCGCTTTGGCACCCTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 24) Se diseñaron los oligonucleótidos iniciadores BcD12F1 y BcD12R1 a partir de una secuencia genómica parcial (clon de gDNA parcial patentado de Monsanto, encontrado con BLASTALL), para amplificar las regiones codificantes de longitud completa de Al2-desaturasa de B. cinérea. Se diseñó el iniciador degenerado D15D-R9 que amplifica cualquier ?15- desaturasa de B. cinérea putativa en una reacción de 5'-RACE. Se diseñó el oligonucleótido BDC15-F1 para una reacción de 3'RACE del producto de PCR generado a partir del oligonucleótido D15D-R9. Se diseñaron los oligonucleótidos BcD15F3 y BcD15R1 F que amplifican la región codificante de longitud completa de una A15-desaturasa de B. cinérea putativa. BcD12F1 : 5'-GTCGACACCATGGCCTCTACCACTGCTCTC-3', el extremo 5' contiene Salí -3' (SEQ ID NO: 25) BcD12R1 : 5'-CTGCAGTGCCTTGAGCTTCATTGGTGGTGTA-3', el extremo 5' contiene Pstl (SEQ ID NO: 26) D15D-R9: 5'- GCCRTGNCCRCAYTCRTGNGCNAGDAT-3' (SEQ ID NO: 27) BcD15-F1 : 5'-ACGATGACTCTCGATTACACAAGTCACCCG-3' (SEQ ID NO: 28) BcD15F3: 5'-GTCGACACGATGACTCTCGATTACACAAGTCACC-3', el extremo 5' contiene Salí (SEQ ID NO: 29) BcD15R1 : 5'-CTGCAGAATGCTTGAGCTATCAGCAGATCCCAA-3', el extremo 5" contiene Pstl (SEQ ID NO: 30). Se preparó ADNc para A. nidulans y B. usando el equipo GeneRacer (Invitrogen). Estos iniciadores se usaron con ADNc listo para 3'- RACE, para amplificar desaturasas putativas usando un sistema de PCR de Gene Amp 9700 (PE APPLIED BIOSYSTEMS) con las condiciones de iteración recomendadas. El producto de PCR que codifica para ?15- desaturasa de A. nidulans, fue generado con los oligonucleótidos AnD15-F1 y AnD15-R1 , fue ligado en pYES2.1-TOPO (Invitrogen), y nombrado como pMON67010 (figura 7B). El ADNc fue secuenciado, y se encontró que tres "cajas His", un rasgo conservado entre desaturasas unidas a membrana, están presentes en las posiciones de aminoácido 93-97, 129-133 y 327-331. Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos correspondientes para la ?15-desaturasa (AnD15D), se dan en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. Un ADNc que codifica para Al2-desaturasa de B. cinérea, fue amplificado mediante PCR con los oligonucleótidos BcD12F1 y BcD12R1 y ligado después directamente en pYES2.1 V5-His-TOPO (Invitrogen), para generar pMON67022 (figura 7D). El ADNc fue secuenciado, y se encontró que tres "cajas His", un rasgo conservado entre desaturasas unidas a membrana, están presentes en las posiciones de aminoácido 155-159, 191-195 y 390-394. Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos correspondientes para la A12-desaturasa putativa (BcD12D), se dan en SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. Para clonar una ?? d-desaturasa de B. cinérea, se generó un oligonucleótido degenerado basado en la alineación de secuencias de aminoácidos de las ?12 y A 5-desaturasas de N. crassa y Aspergillus sp. Se llevó a cabo una reacción de 5'-RACE usando el equipo GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad CA), siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante. Después de la síntesis de ADNc, el extremo 5' de un ADNc de ?? d-desaturasa putativo, fue amplificado mediante PCR usando el oligonucleótido degenerado D15D-R9, y ligado en pCR2.1-TOPO. El fragmento de 742 pares de bases resultante fue secuenciado, y se determinó mediante alineación deducida de aminoácidos, que es similar a las otras ?15- desaturasas de hongos. Se usó una reacción de 3 -RACE para amplificar 664 pares de bases del extremo 3' de la A15-desaturasa de B. cinérea putativa usando el oligonucleótido BcD15-F1 , y ligado en pCR2.1-TOPO. Se diseñaron los oligonucleótidos BcD15F3 y BcD15R1 a partir de la secuencia mixta de los productos de 5'- y 3'- RACE, y se usaron para amplificar un ADNc de ?15-desaturasa putativa de ß. cinérea de longitud completa mediante reacción de 3'-RACE, y ligado en pYES2.1-TOPO. El plásmido resultante fue nombrado como pMON67021 (figura 7C). Las secuencias de nucleótidos y polipéptidos correspondientes para la Al5-desaturasa putativa (BcD15D), se dan en SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, respectivamente. Para evaluar la actividad de ??d-desaturasa del AnD15D putativo en la prueba de expresión en levaduras, se alimentaron levaduras que expresan la A15-desaturasa putativa al substrato para esta enzima, es decir, LA, y se cuantificó la producción de ALA. Estos datos, en los cuales se comparó la producción de ALA por la Al 5-desaturasa de N. crassa, PMON67023, con la de la ??d-desaturasa de A. nidulans, se muestran en el cuadro 5. Se construyó pMON67023 (figura 7E) de la manera siguiente: Nc94F2: 5'-AACATGACGGTCACCACCCGCAGCCACAAG-3' (SEQ ID NO: 35). Nc94R2: 5'-CTGGGTGCTCTGAACGGTGTGCGCCCAAAT-3* (SEQ ID NO: 36). Se usaron los iniciadores Nc94F2 y Nc94R2 para amplificar la región codificante de NcD15D sin un codón de detención. El fragmento resultante fue ligado en pYES2.1-TOPO para generar una fusión en el marco de lectura entre la región codificante de NcD15D y el epítope V5 y la región 6- His contenida en el vector de expresión pYES2.1.

CUADRO 5 Producción de ALA por la A15-desaturasa de Neurospora crassa y la A15-desaturasa de Aspergillus nidulans Substrato LA (añadido como Construcción Gen ALA añadido substrato) pMON67010 AnD15D LA 28.43 20.32 pMON67010 AnD15D LA 24.66 19.65 pMON67023 NcD15D LA 47.98 10.94 pMON67023 NcD15D LA 47.52 9.24 Estos resultados indican que en este sistema de expresión, la desaturasa de A. nidulans es casi dos veces más activa que NcD15D.

CUADRO 6 Análisis del uso del substrato de AnD15D en levaduras Estos resultados indican que en este sistema de expresión, D15D de A. nidulans es capaz de desaturar LA y GLA.

EJEMPLO 9 Optimización de codones de las ?15-desaturasas de A. nidulans y N. crassa para la soya Se construyó un cuadro de uso de codones a partir de ocho proteínas específicas de la semilla altamente expresadas de soya (conglicinina, glicinina, globulina), y 17 proteínas específicas de la semilla altamente expresadas de cañóla (cuciferina, napina, oleosina). Las secuencias de ácido nucleico de NcD15D y AnD15D, junto con el cuadro de uso de codones descrito anteriormente, fueron enviados a Blue Heron Biotechnology Inc., (Bothell, Wa), quien usó entonces un algoritmo patentado para generar las secuencias de codones finales optimizadas con las estructuras secundarias de ARN de energía de formación libre más baja. La secuencia de codones optimizada de NcD15D fue sintetizada por Blue Heron Biotechnology Inc., y nombrada como NcD15Dnno (SEQ ID NO: 37). La secuencia de codones optimizada de AnD15D fue sintetizada por Midland (Midland, TX), y nombrada como AnD15Dnno (SEQ ID NO: 38).

EJEMPLO 10 Actividad de la ?15-desaturasa de Neurospora en combinación con las ?6- y A12-desaturasas de Mortierella alpina Se evaluó la actividad de la ?15-desaturasa de Neurospora en combinación con las ?6- y A12-desaturasas de Mortierella alpina, transformando cañóla con la construcción pMON77216 (figura 7G), que contiene las tres desaturasas bajo el control del promotor Napin. Sin embargo, en muchas líneas obtenidas, se encontró que la A12-desaturasa había sido parcialmente eliminada. Se determinó el contenido de ácidos grasos de grupos de 10 semillas de plantas RO individuales. Los niveles de ácido esteárico (18:0) (SA), ácido oleico (18:1 ) (OA), LA, ALA, SDA y GLA, se muestran en el cuadro 6 siguiente. La línea control fue Ebony. La semilla agrupada de una mayoría de los eventos transgénicos producidos, contenía SDA mensurable, y en 8 eventos SDA se acumuló hasta más de 10% de los ácidos grasos.

CUADRO 6 Resultados del por ciento de área relativa (casi por ciento en peso) de semillas R1 agrupadas CUADRO 6 (CONTINUACION) BN G1148 1.85 29.28 29.24 12.95 16.18 3.95 BN G1149 1.63 37.03 22.9 9.66 20.16 4.29 BN G1150 2.72 35.99 20.19 10.53 19.67 4.47 BN G1151 1.62 32.92 23.19 9.25 21.68 4.88 BN "G1152 2.4 30.12 25.47 14.34 15.85 4.93 BN G1153 2.45 35.53 22.92 1.87 15.36 4.93 BN G1154 2.31 26.49 19.78 6.29 31.62 5.06 BN G1155 1.84 34.83 21.08 11.55 18.46 5.36 BN G1156 1.73 55.09 8.75 2.81 20.2 5.39 BN G1157 1.87 34.84 21.19 10.88 19.14 5.41 BN G1158 2.98 29.18 22.71 17.48 14.23 5.9 BN G1159 2.17 36.41 18.63 10.27 20.3 5.98 BN G1160 1.85 40.01 17.37 13.86 13.79 6.11 BN G1161 1.94 29.5 25.74 9.15 20.3 6.12 BN G1162 1.74 33.78 20.98 12.79 16.98 6.24 BN G1163 1.84 34.83 21.13 10.28 18.76 6.27 BN G 164 1.96 37.43 17.03 5.79 24.34 6.45 BN G1165 1.86 36.5 18.9 11.28 18.7 6.68 BN G1166 1.95 29.59 24.52 13.72 18.95 6.69 BN G1167 2.62 25.92 22.63 15.39 19.76 6.69 BN G1168 2.78 48.4 12.78 6.28 17.57 6.71 BN G1169 2.92 37.66 17.21 13.51 14.14 7.22 BN G1170 2.57 26.3 22.62 11.07 22.43 7.25 BN G1171 2.24 24.1 20.08 28.31 10.8 7.53 BN G1172 2.79 26.16 20.37 13.4 21.15 7.8 BN G1173 1.88 28.4 20.84 21.11 13.55 7.93 BN G1174 2.36 24.04 17.6 28.46 10.82 8.13 BN G1175 3.43 24.83 20.39 21.68 15.5 8.23 BN G1176 2.06 30.09 18.23 13.06 20.9 8.23 BN G1177 1.74 64.72 7.85 2.46 8.1 8.29 BN G1178 1.62 25.75 19.49 9.12 27.3 8.6 BN G1179 1.72 30.98 19.19 .78 20.65 8.95 BN G1180 2.55 21.39 19.93 26.55 12.19 9.07 BN G1181 2.53 21.81 21.21 15.3 22.58 9.16 BN G1182 1.75 24.68 20 14.66 22.4 9.36 BN G1183 2.42 31.08 16.43 15.08 17.5 9.48 BN G1184 2.2 26.92 17.92 17.43 18.69 10 BN G1185 2.58 63.63 4.49 5.11 6.18 10.29 BN G1186 1.13 55.27 9.21 4.08 12.73 0.29 BN G1187 2.22 37.22 14.97 13.19 16.2 10.46 BN G1188 2.5 26.64 18.05 19.8 14.58 10.83 CUADRO 6 (CONTINUACION) BN G1 189 2.41 26.12 18.44 16.81 19.27 .01 BN G1190 2.29 36.61 12.21 14.29 14.68 13.31 BN G1191 2.31 18.94 12.95 18.1 1 22.1 17.95 Los datos de ácidos grasos de semillas individuales del evento BN_G1824, incluyendo homocigotos y heterocigotos, se muestran a continuación en el cuadro 7. En un caso, se observó 18.6.% de SDA, 17.8% de ALA, 11 .2% de LA, 24% de ácido oleico y 18.8% de GLA. Este evento es referido como un evento de alto SDA/alto GLA. En otra semilla de este evento, se observó 16.8% de SDA, 7% de ALA, 2% de LA, 62.1 % de ácido oleico y 3.1 % de GLA. Este evento es referido como una línea de alto SDA/bajo GLA. Los datos moleculares indicaron que, en las líneas de alto SDA/bajo GLA, la secuencia codificante de ?12 no fue funcional. En particular, se indicó que las líneas de alto SDA/bajo GLA comprendían una sola copia de inserción de ADN T parcial individual que había perdido todo el ADN de la inserción entre el borde izquierdo y los 51 pares de bases terminales de la región codificante de la A12-desaturasa de Mortierella alpina (por ejemplo, los últimos 51 pares de bases de SEQ ID NO: 41). Notable en la línea de alto SDA bajo GLA, es que el ácido oleico está casi a los niveles del tipo silvestre, mientras que en las líneas de alto SDA/alto GLA, el ácido oleico se reduce aproximadamente 2.5 veces con respecto al tipo silvestre. Las líneas que exhiben el fenotipo de alto SDA/alto ácido oleico, están resaltadas en gris.

CUADRO 7 Resultados del por ciento de área relativa (casi por ciento en peso) de la semilla individual R1 de BN G1190 Composición de Línea ácidos grasos (por número ciento en peso) SA OA LA GLA ALA SDA 1 1.29 64.94 19.96 0 9.07 0 2 1.53 65.62 16.5 0 10.01 0 3 1.4 61.38 20.02 0 1 1.78 0.02 4 1.78 65.09 17.67 0.02 9.22 0.15 5 1.53 60.94 7.8 3.55 14.13 5.23 6 2.01 61.95 7.1 4.2 12.34 5.79 7 1.8 59.54 5.5 4.47 12.81 9.2 8 2.16 25.6 17.86 19.69 18.91 9.28 9 1.9 61.92 4.71 3.25 12.71 9.34 10 4.79 22.52 14.36 29.86 9.84 10.29 11 2.81 61.55 3.92 2.79 1.89 10.46 12 2.07 61.13 4.36 4.37 10.9 10.47 13 1.57 59.75 4.27 3.3 13.01 11 14 1.89 63.95 3.54 2.88 10.29 11.09 15 1.95 62.9 4 3.53 10.35 11.29 16 2.04 60.91 4.2 3.2 12.16 11.37 17 2.37 49.02 7.68 12.6 9.45 11.48 18 1.88 62.52 3.41 4.25 9.09 11.79 19 2.4 25.65 16.6 17.6 18.36 12.03 20 3.31 25.5 16.45 16.69 18.76 12.12 21 5.64 20.98 12.57 29.74 10.03 12.17 22 2.51 24.55 15.7 17.28 19.83 12.23 23 2.62 25.54 15.55 18.14 18.87 12.45 24 3.35 22.96 14.87 23.38 14.62 12.98 25 2.2 24.61 15.99 17.98 18.5 13.61 26 1.62 58.5 3.48 3.09 12.36 13.66 27 3.77 24.48 14.69 18.4 16.75 13.85 28 2.51 23.72 15.35 16.53 19.8 14.24 29 2.46 24.04 13.81 18.61 19.94 14.31 30 2.44 23.63 14.82 20.44 16.85 14.35 31 1.85 64.75 1.94 2.85 7.01 14.55 32 2.04 19.45 14.32 15.63 25.95 14.73 33 2.24 23.34 14.79 18.9 18.22 14.84 34 3.55 23.16 12.92 21.86 15.59 15.12 CUADRO 7 (CONTINUACION) 35 3.17 24.94 12.74 18.41 16.98 15.26 36 2.36 21.79 14.57 23.35 13.99 15.38 37 2.55 23.14 14.94 19.56 17.3 15.39 38 2.53 23.44 14.99 16.32 19.84 15.46 39 2.09 58.1 2.87 3.21 11.23 15.52 40 2.22 61.6 2.44 3.32 8.34 15.58 41 4.1 23.71 13.78 17.72 18.09 15.63 42 2.34 22.81 13.35 19.72 19.09 15.67 43 3.71 21.49 13.43 22.95 14.94 15.98 44 4.05 23.04 13.77 20.1 15.43 16.18 45 2.57 24.02 12.05 19.87 1 .05 16.46 46 2.09 62.09 1.98 3.08 7.06 16.75 47 3.17 21.82 13.7 16.23 21.06 16.82 48 4.07 22.52 12.25 19.85 16.27 16.86 49 2.46 22.48 12.5 20.28 17.02 17.66 50 2.78 24.1 1 11.17 18.82 17.75 18.59 Para evaluar adicionalmente la actividad de la A15-desaturasa de Neurospora crassa en combinación con las ?6- y Al2-desaturasas de M. alpina, líneas homocigóticas para la construcción pCGN5544 (conteniendo ?6- y ?-12 desaturasas de M. alpina), que contenían hasta 35% de GLA en el aceite de las semillas, fueron retransformadas con la construcción pMON77214 que contenía NcD15D. Se analizaron grupos de 20 semillas de 1 plantas R0. Los LA, ALA, SDA y GLA en estas líneas se muestran en el cuadro 8.

CUADRO 8 Análisis de los resultados del por ciento de área relativa (casi por ciento en peso) de la semilla del grupo R1 Línea LA ALA SDA GLA Ebony control 16.05 8.7 0 0 Ebony control 17.46 9.05 0 0 BN 1569 21.19 11 0.1 1 30.1 BN 1561 25.35 14.7 1.57 6.03 BN 1566 29.26 14.03 1.75 9.04 BN 1564 17.92 26.51 2.33 4.5 BN 1644 24.25 16.1 4.05 16.64 BN 1527 22 15.97 4.17 10.44 BN 1563 20.13 17.26 4.52 12.1 1 BN 1609 22.46 23.76 5.22 11.39 BN 1622 9.1 15.77 6.33 5.23 BN 1680 21.47 19.19 1 1.19 19.07 BN 1624 12.95 22.1 17.95 18.1 1 EJEMPLO 11 Actividad de la A15-desaturasa de Neurospora crassa en combinación con la A6-desaturasa de Mortierella alpina Se evaluó la actividad de la ?? d-desaturasa de Neurospora crassa en combinación con la ?ß-desaturasa de Mortierella alpina, transformando cañóla con la construcción pMON77215 (figura 7F), que contiene las dos desaturasas bajo el control del promotor Napin. Se construyó este vector digiriendo pCGN5536 (patente de E.U.A. No. 6,459,018 B1 ), que contiene al promotor Napin que dirige la expresión de la A6-desaturasa de M. alpina (MaD6D), con Notl, y ligando entonces el fragmento del cassette de expresión en el sitio Not I del vector binario, pMON70660, para formar pMON77212. Se construyó el plásmido pMON77215 digiriendo pMON77214 con Pmel y AscI, y ligando entonces el fragmento del cassette de expresión Napin-NcD15D resultante en los sitios SwaI y AscI de pMON77212, para dar una construcción que contenía MaD6D y NcD15D. Se determinó el contenido de ácidos grasos de grupos de 10 semillas de transformantes de cañóla R0 individuales. Los niveles de SA, OA, LA, ALA, SDA y GLA se muestran en el cuadro 9 siguiente. La línea control fue Ebony (SP30052). La semilla agrupada de una mayoría de los eventos transgénicos producidos, contenía SDA mensurable, y en 25% de los eventos (10 de 40), SDA se acumuló a más de 10% de los ácidos grasos.

CUADRO 9 Resultados del por ciento de área relativa (casi por ciento en peso) para la semilla R1 agrupada de PMON77215 Acido graso (por ciento en peso) ID del evento SA OA LA GLA ALA SDA Ebony 1.43 66.47 16.85 0 8.7 0 Control BN G2463 1.98 63.51 17.96 0.13 9.9 0.1 BN G2444 1.62 60.61 19.58 0.13 1 1.38 0.36 BN G2443 1.47 59.39 17.8 3.42 10.2 1.1 BN G1700 1.69 65.41 11.8 7.79 4.93 1.69 BN G2082 1.84 59.51 16.72 4.45 10.16 1.73 BN G2316 2.19 66.1 11.49 7.17 4.24 2.24 BN G2083 1.89 61.57 12.61 7.29 7.02 2.28 BN G2413 1.97 64.12 9.74 1.58 11.09 4.63 BN G2317 2.74 66.72 6.92 0.44 10.42 5.13 BN G2412 2.31 61.63 8.48 1.66 13.6 5.21 CUADRO 9 (CONTINUACION) Acido graso (por ciento en peso) BN G2315 2.91 64.38 10.22 0.91 6.07 5.28 BN G2028 1.91 61.48 10.25 2.2 11.59 5.59 BN G2357 2.51 64.17 8.28 0.85 10.42 5.62 BN G2027 2.13 53.72 12.39 2.6 15.72 5.78 BN G2360 2.51 62.75 9.47 4.89 7.17 5.84 BN G2390 3.2 63.66 8.44 0.5 10.2 5.88 BN G2029 1.78 61.89 10.41 1.44 11.12 6.35 BN G2414 2.07 57.13 11 2.36 14.07 6.44 BN G2416 2.26 65.01 7.17 0.83 11.86 6.45 BN G2250 2.19 61.99 8.8 1.93 9.72 6.6 BN G1698 1.82 68.26 6.4 3.76 6.55 6.65 BN G2356 2.82 62.46 11.52 1.75 6.99 6.84 BN G1937 2 56.02 10.92 2.24 12.6 7.81 BN G2319 1.99 58.47 9.63 5.86 9.05 7.91 BN G1699 1.74 64.72 7.85 2.46 8.1 8.29 BN G2359 2.96 64. 7 7.09 2.05 7.67 8.88 BN G2460 2.54 62.4 5.33 1.43 1 1.43 9.63 BN G2409 3.27 57.85 9.71 3.97 7.44 9.87 BN G2318 2.54 61.04 7.6 2.37 8.43 9.99 BN G2358 2.76 62.33 5.88 2.06 8.72 10.08 BN G1697 2.58 63.63 4.49 5.11 6.18 10.29 BN G1803 1.13 55.27 9.21 4.08 12.73 10.29 BN G2391 2.83 58.33 1 1.45 2.42 6.6 10.57 BN G1859 2.33 52.66 9.71 2.98 12.19 11.03 BN G2389 2.54 59.21 6.97 3.88 8.07 1 1.84 BN G1860 2.22 51.02 9.49 4.62 10.5 13.44 BN G2410 3.24 55.96 7.03 3.1 8.88 13.82 BN G2445 2.77 57.67 6.21 2.78 9.62 14.14 BN G2361 2.31 56.5 8.86 3.77 6.48 14.78 Los datos de ácidos grasos de semillas individuales del evento BN_G1860, incluyendo homocigotos y heterocigotos, se muestran a continuación en el cuadro 10. En un caso, se observó hasta 19% de SDA, 10% de ALA, 7% de LA, 48% de ácido oleico y 5% de GLA.

CUADRO 10 Resultados del por ciento de área relativa (casi por ciento en peso) para la semilla R1 individual de PMON77215 de BN G1860 Acido graso (por ciento en peso) ID del evento SA OA LA GLA ALA SDA BN G1860-1 1.57 65.11 16.5 0 10.47 0.01 BN G 860-2 1 .4 57.32 19.05 0 15.3 0.02 BN G1860-3 1.74 60.16 19.44 0 11 .95 0.03 BN G 1860-4 1.77 56.85 8.1 1 6.79 9.1 1 9.96 BN G 860-5 2.37 57.88 5.26 2.94 12.72 1 1.48 BN G1860-6 1.72 60.18 5.03 2.87 1 1 .42 11.71 BN G 1860-7 2.53 55.86 9.31 6.08 5.96 12.23 BN G1860-8 2.21 56.83 7.48 5.93 8.52 12.38 BN G1860-9 2.12 60.21 4.83 2.8 10.13 12.43 BN G1860-10 3.12 56.6 10.33 4.54 4.5 12.48 BN G1860-11 2.2 53.64 12.32 5.54 4.73 12.88 BN G1860-12 2.25 55.58 10.53 5.07 5.42 13.53 BN G1860-13 2.03 57.57 7.08 4.19 8.15 13.69 BN G1860-14 1.76 54.42 7.16 6.43 8.99 13.77 BN G1860-15 2.77 57.4 8.5 4.17 5.73 13.78 BN G1860-16 1.43 55.39 9.93 5.62 6.38 13.82 BN G1860-17 2.91 53.02 10.79 4.34 5.89 13.92 BN G1860-18 1.92 60.27 3.72 1.96 10.7 13.92 BN G1860-19 1.85 59.6 4.72 2.56 9.85 14.16 BN G1860-20 2.45 58.84 6.51 3.66 6.88 14.22 BN G1860-21 1.88 57.95 5 2.85 10.56 14.42 BN G 1860-22 1.91 55.15 6.02 5.3 9.2 14.75 BN G 1860-23 3.01 59.08 5.36 2.88 7.33 14.85 BN G 1860-24 2.94 56.48 6.78 3.95 7.83 14.86 BN G 1860-25 2.34 53.88 8.64 4.49 6.42 14.94 BN G 1860-26 2.75 52.92 7.04 4.38 9.4 14.96 BN G 1860-27 1.7 57.28 4.41 2.99 10.74 15.05 BN G 1860-28 2.3 53.15 9.42 5.79 6.53 15.29 BN G 1860-29 2.9 54.49 6.2 3.73 7.92 15.38 BN G 1860-30 1.8 58.02 4 2.41 10.67 15.42 BN G1860-31 2.67 54.97 7.32 4.68 7.92 15.44 BN G 860-32 2.31 56.01 5.09 4.34 9.93 15.47 BN G 1860-33 2.18 55.92 8.83 4.06 5.46 15.54 BN G 1860-34 2.38 54.85 8.52 4.01 5.76 15.56 BN G1860-35 1.99 58.89 4.14 2.09 9.74 15.58 BN G1860-36 2.87 55.91 6.55 2.8 7.37 15.66 BN G1860-37 2.35 53.18 8.89 4.73 6.45 15.71 CUADRO 10 (CONTINUACION) BN G 1860-38 3.15 51.6 10.29 4.85 5.68 15.78 BN G 1860-39 2.31 55.68 6.08 4.52 7.81 15.92 BN G 1860-40 3.26 54.62 6.54 3.55 7.53 16.19 BN G 1860-41 2.09 56.03 6.27 4.04 7.56 16.35 BN G 1860-42 2.33 53.62 6.48 5.35 7.97 16.62 BN G 1860-43 2.37 57.86 5.24 2.81 7.32 16.77 BN G 1860-44 2.04 51.3 1 1.41 5.03 5.09 16.94 BN G 1860-45 2.1 53.32 8.75 4.04 6.44 17.12 BN G 1860-46 2.14 53.01 6.85 4.3 7.82 17.16 BN G 1860-47 2.42 50.96 7.83 4.13 7.91 17.44 BN G 1860-48 1.94 49.97 10.64 4.78 5.74 17.84 BN G 1860-49 1.46 55.32 4.57 2.67 9.98 18 BN G 1860-50 2.41 47.66 6.83 5.46 9.91 19.23 EJEMPLO 12 Optimización de codones de la secuencia de A15-desaturasa de N. crassa para el maíz Se construyó un cuadro de uso de codones a partir de 9 genes específicos de la semilla altamente expresados del maíz (seis zeínas y tres oleosinas). Mediante el uso de este cuadro, dos codones de NcD15D fueron mutados usando el equipo de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA), y la secuencia resultante fue nombrada como NcFAD3m (SEQ ID NO: 42). Los codones mutados fueron los siguientes: 1) para hacer un sitio de inicio de la traducción más preferido, una alanina en SEQ ID NO: 2 es sustituida con una treonina cambiando la primera base del segundo codón (posición 4 en SEQ ID NO: 42) de un ACG a GCG; y 2) para remover un codón raro, un codón de valina fue cambiado de GTA a GTG en la posición 882 (SEO. ID NO: 42).

EJEMPLO 13 Equivalencia de EPA Una medida de la calidad del aceite de la semilla para el valor para la salud, es la equivalencia de EPA. El valor refleja la velocidad de conversión metabólica a EPA. Esta se calcula añadiendo el por ciento de ALA dividido entre 14, y el por ciento de SDA dividido entre 4. Las composiciones de aceite de cañóla obtenidas por los inventores tenían una alta equivalencia de EPA, indicando características excelentes para lograr los beneficios a la salud asociados con los niveles incrementados de EPA en humanos y animales. Un ejemplo del análisis se da a continuación comparando el aceite de cañóla convencional respecto a un ejemplo de una composición de aceite de alto SDA típica de 10% de ALA y 15% de SDA. El aceite de cañóla de las variedades convencionales tiene aproximadamente 12% de ALA y 0% de SDA, y de esta manera tiene una equivalencia de EPA de 12/14 + 0/4 = 0.8. En contraste, el ejemplo de composición de aceite de alto SDA tiene una equivalencia de EPA de 10/14 + 15/4 = 4.4. Los valores relativos se muestran a continuación. Los valores son en por ciento en peso, no sobre una base en porciones. La vasta diferencia muestra la importancia de producir SDA en el aceite de cañóla.

CUADRO 11 Comparación de la equivalencia de EPA REFERENCIAS Las referencias incluidas a continuación se incorporan en la presente como referencia, al grado de que complementan, explican, proveen una base para, o enseñan, metodología, técnicas y/o composiciones usadas en la presente. Patente de E.U.A. 4,535,060 Patente de E.U.A. 4,666,701 Patente de E.U.A. 4,758,592 Patente de E.U.A. 4,826,877 Patente de E.U.A. 4,910,141 Patente de E.U.A. 5,011 ,770 Patente de E.U.A. 5,1 16,871 Patente de E.U.A. 5,302,523 Patente de E.U.A. 5,322,783 Patente de E.U.A. 5,378,619 Patente de E.U.A. 5,384,253 Patente de E.U.A. 5,464,765 Patente de E.U.A. 5,508,184 Patente de E.U.A. 5,508,468 Patente de E.U.A. 5,538,877 Patente de E.U.A. 5,538,880 Patente de E.U.A. 5,545,818 Patente de E.U.A. 5,550,318 Patente de E.U.A. 5,563,055 Patente de E.U.A. 5,591 ,616 Patente de E.U.A. 5,610,042 Patente de E.U.A. 5,952,544 Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087, 1986. Arondel, Science, 258(5086): 1353-1355, 1992. Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc, NY, 1987. Barton et al., Cell, 32: 1033, 1983. Bates, Mol. Biotechnol., 2(2): 135-45, 1994. Battraw y Hall, Theor. App. Genet, 82(2): 161-168, 1991. Bechtold et al., CR. Acad. Sci. Life Sci., 316: 1194-1 199, 1993.

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Leu Leu Phe Asn Val Ser Ala Gly Lys Gly Ser Lys Gln Trp Glu Thr 225 230 235 240 Gly Lys Gly Gly Met Gly Trp Leu Arg Val Ser His Phe Glu Pro Ser 245 250 255 Ser Ala Val Phe Arg Asn Ser Glu Ala lie Tyr lie Ala Leu Ser Asp 260 265 270 Leu Gly Leu Met lie Met Gly Tyr lie Leu Tyr Gln Ala Ala Gln Val 275 280 285 Val Gly Trp Gln Met Val Gly Leu Leu Tyr Phe Gln Gln Tyr Phe Trp 290 295 300 Val His His Trp Leu Val Ala lie Thr Tyr Leu His His Thr His Glu 305 310 315 320 Glu Val His His Phe Asp Ala Asp Ser Trp Thr Phe Val Lys Gly Ala 325 330 335 Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Phe Gly Phe lie Gly Lys His Leu Phe 340 345 350 His Asn lie lie Asp His His Val Val His His Leu Phe Pro Arg lie 355 360 365 Pro Phe Tyr Tyr Ala Glu Glu Ala Thr Asn Ser lie Arg Pro Met Leu 370 375 380 Gly Pro Leu Tyr His Arg Asp Asp Arg Ser Phe Met Gly Gln Leu Trp 385 390 395 400 Tyr Asn Phe Thr His Cys Lys Trp Val Val Pro Asp Pro Gln Val Pro 405 410 415 Gly Ala Leu lie Trp Ala His Thr Val Gln Ser Thr Gln 420 425 <210> 4 <211> 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Phe Asn Arg lie 325 330 335 ccg ttc tac cat gee gag gag gcg act aat gee att att ccc gta ctc 1056 Pro Phe Tyr His Ala Glu Glu Ala Thr Asn Ala lie lie Pro Val Leu 340 345 350 ggg gac atg tat cat cgc gaa gag acc ggc ttc ttg tgg agt tta atg 1104 Gly Asp Met Tyr His Arg Glu Glu Thr Gly Phe Leu Trp Ser Leu Met 355 360 365 gag acg tac aag aac tgt cgg ttt gta ggc gtt gaa aat gat gtt gga 1152 Glu Thr Tyr Lys Asn Cys Arg Phe Val Gly Val Glu Asn Asp Val Gly 370 375 380 aag gag ggc gtt ttg cat tgg gtt ttt gag gag aag aag ggt gee aaa 1200 Lys Glu Gly Val Leu His Trp Val Phe Glu Glu Lys Lys Gly Ala Lys 385 390 395 400 gcg gaa 1206 Ala <210> 5 <211> 401 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 5 Met Ala Ala Thr Ala Thr Thr Leu Ala Glu lie Glu Lys Lys Lys Glu 1 5 10 15 Glu lie Thr Leu Gln Thr lie Lys Asn Ala lie Pro Lys His Cys Phe 20 25 30 Asn Arg Ser Leu Leu lie Ser Ser Ala Tyr Val Val Arg Asp Leu Leu 35 40 45 Tyr Ala Ser Val Leu Phe Tyr Phe Ala Leu His lie Asp Thr Leu Phe 50 55 60 Ser Ser Gln Leu Leu Arg lie Leu Ala Trp Thr Ala Tyr Gly Phe Met 65 70 75 80 Gln Gly Cys Val Gly Thr Gly lie Trp lie Leu Ala His Glu Cys Gly 85 90 95 His Gly Ala Phe Ser Pro Tyr Gln Thr Trp Asn Asp Val Val Gly Trp 100 105 110 Thr Leu His Ser Leu Leu Met Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys lie Thr 115 120 125 His Ala Arg His His Arg Tyr Thr Asn Asn Thr Glu Arg Asp Thr Ala 130 135 140 Phe Val Pro Trp Thr Glu Lys Glu Tyr Asp Thr Arg Pro Arg Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Ala Trp Phe Glu Met Phe Glu Asp Thr Pro Val Tyr Asn Leu lie 165 170 175 Ser Leu Leu Ala His Gln lie Ala Gly Trp Gln Met Tyr Leu Cys Phe 180 185 190 Tyr Val Ser Ala Gly Ala Lys Ser Lys Pro Val Pro Gln Gly Lys Gln 195 200 205 Ser Gly Trp Phe Gly Gly Gln Gln Ser Ala Ser His Phe Asp Pro Gly 210 215 220 Ser Ser Leu Trp Thr Glu Asn Gln Arg His Leu lie Ala lie Ser Asp 225 230 235 240 Leu Gly Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Asn Trp Tyr Leu Ala Gln Gln 245 250 255 Val Gly Val Leu Arg Met Val Leu lie Tyr Val Val Pro Tyr Phe Trp 260 265 270 Val His His Trp Leu Val Ala lie Thr Tyr Leu His His Thr His Pro 275 280 285 Ser lie Pro His Tyr Thr Asp Ser Thr Trp Thr Phe Thr Lys Gly Ala 290 295 300 Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Phe Gly Phe lie Gly Arg His Phe Phe 305 310 315 320 His His lie lie Asp His His Val Val His His Leu Phe Asn Arg lie 325 330 335 Pro Phe Tyr His Ala Glu Glu Ala Thr Asn Ala He lie Pro Val Leu 340 345 350 Gly Asp Met Tyr His Arg Glu Glu Thr Gly Phe Leu Trp Ser Leu Met 355 360 365 Glu Thr Tyr Lys Asn Cys Arg Phe Val Gly Val Glu Asn Asp Val Gly 370 375 380 Lys Glu Gly Val Leu His Trp Val Phe Glu Glu Lys Lys Gly Ala Lys 385 390 395 400 Ala <210> 6 <211> 13 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <220 <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 6 Tr lie Leu Ala His Glu Cys Gly His Gly Ala Ser Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 7 Leu Ala His Glu Cys Gly His 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 8 His Ser Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys 1 5 10 210 9 <211> 9 212> PRT <213> Secuencia artificial <220> 223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 9 Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 10 His His Arg His His Arg Phe Thr Thr 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213J Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 11 Trp Val His His Trp Leu Val Ala lie Thr Tyr Leu His His Thr His 1 5 10 15 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 12 Ala lie Thr Tyr Leu His Gln His Thr 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400 13 Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg 1 5 210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 14 His Val Val His His Leu Phe Xaa Arg lie Pro Phe Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 15 aagatggcgt ccgtctcctc tgcccttccc <210> 16 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 16 ttagttggtt ttggggagct tggcaggctt g <210> 17 <211> 34 <212> ADN 213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 17 gcggccgcaa catgacggtc accacccgca gcca <210> 18 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial 220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 18 cctgcaggtt actgggtgct ctgaacggtg tgcg 210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 19 His His Arg His His Arg Tyr Thr Thr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 20 His Ala Arg His His Arg Phe Thr Thr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial <400> 21 His Ala Arg His His Arg Tyr Thr Thr 1 5 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético <400> 22 Trp Val His His Trp Leu Val Ala lie Thr Tyr Leu Gln His Thr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 23 aatatggctg caactgcaac aaccc 25 <210> 24 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético 400> 24 ttccgctttg gcacccttct 22 <210> 25 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 25 gtcgacacca tggcctctac cactgctctc 30 <210> 26 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 26 ctgcagtgcc ttgagcttca ttggtggtgt a 31 <210> 27 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <220> <221> Base modificada <222> (7) .. (12) <223> N = A, C, G T/U <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 27 gccrtgnccr caytcrtgng cnagdat 27 <210> 28 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 28 acgatgactc tcgattacac aagtcacccg 30 <210> 29 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 29 gtcgacacga tgactctcga ttacacaagt cace 34 <210> 30 <211? 33 <212? ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 30 ctgcagaatg cttgagctat cagcagatcc caá 33 <210> 31 <211> 1428 <212> ADN <213> Botrytis cinérea <400> 31 atggcctcta ccactgctct cccaaagcgc accgccgttc aaagaacggt gacctcctcc 60 actgccgaat cagctccctc gacagctgcc ggttccccca atgatacccc aagacaatec 120 ccctcgtcta cttctctgtc atctatgtca tctctaggcg aagatgttaa gageaccaag 180 ccatatggca aaetcatega tacttacgga aacgaatttg agettecaga ttataccgtc 240 aatgacatcc gtaacgcaat tccaaagcat tgttacgagc gatctggagt aaggggtttg 300 gcttatgttg etegegatat tgecagetta gccaccacat tcttcctctt caacaaatac 360 cttacaccag aaaacgttcc ctcaactyca gcgcgcgctg tgctgtgggc tttatacacc 420 gttgttcagg gtttgtttgg tactggtctc tgggttcttg ctcatgagtg tggccatcaa 480 tetttetega cttcaaaggt cttgaacgat acaactggat ggatctgcca ctctgctctt 540 ctcgtcccat acttttcatg gaagatctct cacggcaagc ateacaaage tactggcaac 600 atggagcgtg atatggtttt cgttccaaag acccgtcaag attatgctac ccgcgtcggc 660 aagttcgttc atgagcttca cgagctcacc gaggagactc caatcgcaac tcttattcac 720 tccatcggac aacaacttgc tggctggcct ttgtacttat tcatgaacgt caccggtcac 780 aacaaccatg agcgtcaaca tgagggtcgt ggaaagggta aggtcaacag tttctggacc 840 gtcagtcact tcaacccagc cagtcctctt tatgaagcta aggatgccaa attgatcttg 900 ttgagtgatc tcggtatcgc catcaccgcc gctgtcctta tcatgcttag caagacatac 960 ggattttaca acatggctat ctggtacttc attccatacc tctgggtaaa ccactggctt 1020 gttgctatca ccttcctcca acacaccgac ccaactcttc ctcactactc tggcgagagc 1080 tggaactatg ttcgtggagc cgcagcaacc atcgatcgtg aattcggatt catcggacgc 1140 actcttcttc acggtatcat cgagacccac gttcttcacc actacgtcag caccattcct 1200 ttctaccacg ccgatgaggc taccgaggcc atcaagccta tcatgggtcg tcactacaga 1260 gccgatgttc gaggcggatc ccttggattt ttgaagagct tgtggtccag cgctcgttgg 1320 tgccagtggg tcgagccatc tgagggtgct gaaggtgagg gcaagaaggt attcttcttc 1380 cgtaaccgca atggactcgg tacaccacca atgaagctca aggcataa 1428 <r210> 32 <211> 475 <212> P T <213> Botrytis cinérea <400> 32 Met Ala Ser Thr Thr Ala Leu Pro Lys Arg Thr Ala Val Gln Arg Thr 1 5 10 15 Val Thr Ser Ser Thr Ala Glu Ser Ala Pro Ser Thr Ala Ala Gly Ser 20 25 30 Pro Asn Asp Thr Pro Arg Gln Ser Pro Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Met Ser Ser Leu Gly Glu Asp Val Lys Ser Thr Lys Pro Tyr Gly Lys 50 55 60 Leu lie Asp Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Glu Leu Pro Asp Tyr Thr Val 65 70 75 80 Asn Asp lie Arg Asn Ala lie Pro Lys His Cys Tyr Glu Arg Ser Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Ala Tyr Val Ala Arg Asp lie Ala Ser Leu Ala Thr 100 105 110 Thr Phe Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Leu Thr Pro Glu Asn Val Pro Ser 115 120 125 Thr Xaa Ala Arg Ala Val Leu Trp Ala Leu Tyr Thr Val Val Gln Gly 130 135 140 Leu Phe Gly Thr Gly Leu Trp Val Leu Ala His Glu Cys Gly His Gln 145 150 155 1S0 Ser Phe Ser Thr Ser Lys Val Leu Asn Asp Thr Thr Gly Trp lie Cys 165 170 175 His Ser Ala Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys lie Ser His Gly 180 185 190 Lys His His Lys Ala Thr Gly Asn Met Glu Arg Asp Met Val Phe Val 195 200 205 Pro Lys Thr Arg Gln Asp Tyr Ala Thr Arg Val Gly Lys Phe Val His 210 215 220 Glu Leu His Glu Leu Thr Glu Glu Thr Pro lie Ala Thr Leu lie His 225 230 235 240 Ser lie Gly Gln Gln Leu Ala Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Phe Met Asn 245 250 255 Val Thr Gly His Asn Asn His Glu Arg Gln His Glu Gly Arg Gly Lys 260 265 270 Gly Lys Val Asn Ser Phe Trp Thr Val Ser His Phe Asn Pro Ala Ser 275 280 285 Pro Leu Tyr Glu Ala Lys Asp Ala Lys Leu lie Leu Leu Ser Asp Leu 290 295 300 Gly lie Ala lie Thr Ala Ala Val Leu lie Met Leu Ser Lys Thr Tyr 305 310 315 320 Gly Phe Tyr Asn Met Ala lie Trp Tyr Phe lie Pro Tyr Leu Trp Val 325 330 335 Asn His Trp Leu Val Ala lie Thr Phe Leu Gln His Thr Asp Pro Thr 340 345 350 Leu Pro His Tyr Ser Gly Glu Ser Trp Asn Tyr Val Arg Gly Ala Ala 355 360 365 Ala Thr lie Asp Arg Glu Phe Gly Phe lie Gly Arg Thr Leu Leu His 370 375 380 Gly lie lie Glu Thr His Val Leu His His Tyr Val Ser Thr lie Pro 385 390 395 400 Phe Tyr His Ala Asp Glu Ala Thr Glu Ala lie Lys Pro lie Met Gly 405 410 415 Arg His Tyr Arg Ala Asp Val Arg Gly Gly Ser Leu Gly Phe Leu Lys 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ctcaaggttc actgaatcag gctcaatcca aaaatattct aggcaacagt 650 cacttctcac cagcaagcac actatttcgt cccgaggaat cacatctcat tattctttcg 720 gatattggca ttggccttgt cgtgtttgga ctttggtacg ctagccaaat atttggtgga 780 tccatgattg cattgttgta tcttcaacct tatctctggg tcaaccactg gattgtcgct 840 atcacctatc tgcatcatac acaccctgat gtacccaaat acgaaccgga agcatggaca 900 tttcttaaag gtgcacttgc aacagttgat cgggagctgg ggtgggtggg aaagcacatg 960 ctacacaaca ttgccgagtt ccatgttatt caccacctat tttcacgtat ccctcaatat 1020 cacgctgagg aagcgaccaa ggctattatg ccattgctga aaagctctta ccgtagtgat 1080 aagaagcgaa acttttggat gtgtatgtgg gagtctttta ctaagtgcca gtacgttgtt 1140 ccatatgacg ttaaggctaa gctagaagat cgtacaatgg tctacaaggg tggtccaacg 1200 ccaacctcag agatctttat gaggaagaaa ggatgggtca aggaggtgaa tcagagtaaa 1260 cag tgggat ctgctgatag ctcaagcatt tga 1293 <210> 34 <211> 430 <212> PRT <213> Botrytis cinérea <400> 34 Met Thr Leu Asp Tyr Thr Ser His Pro Ala Glu Leu Val Lys Gly Gly 1 5 10 15 Glu Val Pro Thr Asn Pro Lys Val Thr Val Lys Asp Leu Arg Asn 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Asp lie Gly lie Gly Leu Val Val Phe Gly Leu Trp Tyr Ala Ser Gln 245 250 255 lie Phe Gly Gly Ser Met lie Ala Leu Leu Tyr Leu Gln Pro Tyr Leu 260 265 270 Trp Val Asn His Trp lie Val Ala lie Thr Tyr Leu His His Thr His 275 280 285 Pro Asp Val Pro Lys Tyr Glu Pro Glu Ala Trp Thr Phe Leu Lys Gly 290 295 300 Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Glu Leu Gly Trp Val Gly Lys His Met 305 310 315 320 Leu His Asn lie Ala Glu Phe His Val lie His His Leu Phe Ser Arg 325 330 335 lie Pro Gln Tyr His Ala Glu Glu Ala Thr Lys Ala lie Met Pro Leu 340 345 350 Leu Lys Ser Ser Tyr Arg Ser Asp Lys Lys Arg Asn Phe Trp Met Cys 355 360 365 Met Trp Glu Ser Phe Thr Lys Cys Gln Tyr Val Val Pro Tyr Asp Val 370 375 380 Lys Ala Lys Leu Glu Asp Arg Thr Met Val Tyr Lys Gly Gly Pro Thr 385 390 395 400 Pro Thr Ser Glu lie Phe Met Arg Lys Lys Gly Trp Val Lys Glu Val 405 410 415 Asn Gln Ser Lys Gln Leu Gly Ser Ala Asp Ser Ser Ser lie 420 425 430 <210> 35 <211> 30 <212 ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 35 aacatgacgg tcaccacccg cagccacaag 30 <210> 36 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Iniciador sintético <400> 36 ctgggtgctc tgaacggtgt gcgcccaaat 30 <210> 37 <211> 1290 <212> ADN <213> Neurospora crassa <400> 37 atggctgtca ctactaggtc acacaaagcc gccgctgcca ccgaacctga agttgtgtct 60 acaggagtgg atgcagtcag cgctgccgca ccaagcagta gtagctcctc atcctcccaa 120 aagtcagctg agcctatcga atatccagac atcaagacaa ttcgtgacgc tataccagac 180 cactgcttta gacctcgcgt ttggatatcc atggcgtact ttattcgcga ttttgcaatg 240 gctttcggcc tcggatactt ggcatggcaa tacatccctt tgattgcaag taccccattg 300 agatacggag cttgggcttt gtacggttac ctccagggac tcgtctgtac tggaatttgg 360 atcttggctc acgaatgcgg tcacggagcc ttttctagac acacctggtt caacaacgtt 420 atgggttgga ttggtcactc tttcctacta gtcccatatt ttagctggaa attttcccat 480 caccgtcatc ataggttcac cggacatatg gaaaaagata tggcgttcgt tccagccacg 540 gaggcggaca gaaatcagag aaaactagct aatctctata tggacaaaga gactgcggag 600 atgttcgagg atgttcctat tgtgcagttg gttaaactaa ttgctcacca actcgccggt 660 tggcagatgt atctcttgtt caacgttagt gccggaaaag gctccaaaca gtgggaaacc 720 ggcaaaggtg gaatgggatg gctccgcgtg agccatttcg aaccaagttc agccgttttc 780 agaaacagcg aagcaattta catagctcta agcgatctcg gacttatgat tatgggatac 840 attctctacc aggcagccca agttgttgga tggcaaatgg ttggtctctt gtattttcaa 900 cagtacttct gggttcacca ttggctcgtt gccatcactt accttcatca cacacacgaa 960 gaagttcacc actttgatgc agattcttgg acatttgtta agggtgccct cgctaccgtg 1020 gacagagact tcggtttcat cggcaagcac ctcttccata acatcattga ccatcatgtt 1080 gttcatcacc tcttcccaag aatccctttc tactacgctg aagaagctac caattcaata 1140 agacctatgc tcggacctct ttaccacaga gatgaccgtt ctttcatggg gcaactctgg 1200 tacaacttca cacactgcaa atgggttgtc cctgatcctc aagtgccagg tgctctaatc 1260 tgggctcaca ccgttcagag tactcagtaa 1290 <210> 38 <211=. 1209 <212> ADN <213 Asperrillus nidulans <400> 38 atggccgcaa ccgcgaccac tctcgctgaa atagaaaaga agaaggaaga gattacacta 60 cagacaatca agaatgccat accaaagcac tgttttaacc gtagtttgct tatttcaagt 120 gcctacgtcg tcagagacct cctctacgca tcagttttgt tctattttgc acttcatatt 180 gatacgctct tctcatccca gctccttagg atcttggcat ggacagctta cggtttcatg 240 caaggctgcg tgggaacggg tatatggata ttggcacatg aatgcggaca cggagctttt 300 agcccttacc aaacctggaa cgacgttgtt gggtggaccc ttcattctct tctcatggtc 360 ccttacttct cttggaaaat aacccacgca aggcaccaca gatatacgaa caataccgag 420 agggacacag ccttcgttcc ctggaccgag aaggaatacg acaccagacc tcgttacttc 480 cctgcatggt tcgagatgtt tgaagacaca ccagtgtata acttgatttc attgctcgcc 540 catcagatcg ccggctggca aatgtacctc tgcttctacg tctcagccgg agccaaaagt 600 aagcctgttc cacaaggcaa gcagtccgga tggtttggag gtcaacaatc tgcatcacac 660 tttgacccag gaagctctct atggaccgaa aaccagcgcc atctaatcgc aatctccgac 720 cttggactcc ttctcgtggc cgccgcgaat tggtacttgg ctcaacaagt tggtgttcta 780 agaatggtgc tcatttacgt cgtcccctac ttttgggtcc accactggct agtcgccatc 840 acgtacctcc accacactca cccatccata ccacactaca ccgactctac ctggacattc 900 actaaaggag cactctcaac agtggatcgt gacttcggat ttataggaag gcacttcttt 960 caccacatca ttgatcacca cgtcgttcat cacttgttca ataggatacc attctatcac 1020 gcagaggaag ctactaacgc aataatacca gttctcggtg atatgtacca tagagaagaa 1080 accggattcc tctggagtct tatggaaact tataaaaact gtcgctttgt tggcgtggag 1140 aacgatgtgg gtaaggaggg agttctccat tgggttttcg aagaaaagaa aggcgctaaa 1200 gctgaatag 1209 <210 39 <211> 1446 <212> ADN <213> Neurospora crassa <400> 39 atggcgtccg tctcctctgc ccttcccgag ggcaacaagc ctgccctgcg caggacccaa 60 accgaggcca cctccgactc ataccctggt accgctgatg cctctccctt cgactctccc 120 cttgagcgct cggcctccaa cacctcgctt tcttcccagg cctctgacaa cgtcaagacc 180 gacaaggccg agttcggcaa gctgctcgac acgtatggca acgagttcga ggtccccgac 240 ttcaccatca aggacatccg cgatgccatc cccgcccact gctttgagcg ttcggctctt 300 cacagcttgg cgcacgtcgt ccgcgacatc atttacctca ccgtcacttt ttacgtctgg 360 aacaagtatg tcactcccga gtacatcccc atgaaggctg cccgtgtcgt cctctggggt 420 ctgtacacct tcatgcaggg ccttttcggc accggtctct gggttcttgc ccatgagtgc 480 ggtcaccagg ctttctcccc gtccaggttg atcaacgaca ccgtcggctg ggtcctccac 540 tctgcccttc tcgtccccta cttctcgtgg aagttctccc acagcaagca ccacaaggcc 600 accggcaaca tcgagcgtga catggtcttc gttcctcgga cccgcgagca gtttgcgtct 660 cgcatcggcc gtttcgtcca tgagatttcc gagttgaccg aggagacccc catctacacc 720 ttgatccacc ttatcggtca gcagctcatc ggctggccca actacctcat gaccaacgtc 780 accggccaca acttccacga gaggcagcgc gagggtcgtg gcaagggcaa gaagaacggc 840 tggttcactg gtgtcaacca cttcaacccc agctctcccc tctatgagga gcgtgaggcc 900 ccctggatca tcgtctccga catcggtatc gctatcgccg ccaccgccct catctacctc 960 ggcaacacct tcggctggtc caacatgttc gtctggtact tccttcccta cctctgggtc 1020 aaccactggc ttgttgccat cacctacctc cagcacaccg acccctcgct cccccactac 1080 acccctgatc agtggaactt tgtccgtggt gccgccgcga ctattgaccg cgagttcggc 1140 ttcatcggcc gtcacctcct ccacggcatt atcgagaccc acgttctcca ccactacgtc 1200 agcaccattc ccttttacca cgccgacgag gcctccgagg ccatcaagaa ggtcatgggc 1260 cgtcactacc gcgctgacgt ccaagatggc cccatcggtt tcatcaaggc catgtggaag 1320 gctgctcgtt ggtgccagtg ggttgagcct accgagggcg ctgagggtaa gggcaagggc 1380 gtcttgttct accgcaacca gaacggtctc ggtgtcaagc ctgccaagct ccccaaaacc 1440 aactaa 1446 <210> 40 <211> 481 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400 40 Met Ala Ser Val Ser Ser Ala Leu Pro Glu Gly Asn Lys Pro Ala Leu 1 5 10 15 Arg Arg Thr Gln Thr Glu Ala Thr Ser Asp Ser Tyr Pro Gly Thr Ala 20 25 30 Asp Ala Ser Pro Phe Asp Ser Pro Leu Glu Arg Ser Ala Ser Asn Thr 35 40 45 Ser Leu Ser Ser Gln Ala Ser Asp Asn Val Lys Thr Asp Lys Ala Glu 50 55 60 Phe Gly Lys Leu Leu Asp Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Glu Val Pro Asp 65 70 75 80 Phe Thr lie Lys Asp lie Arg Asp Ala lie Pro Ala His Cys Phe Glu 85 90 95 Arg Ser Ala Leu His Ser Leu Ala His Val Val Arg Asp lie lie Tyr 100 105 110 Leu Thr Val Thr Phe Tyr Val Trp Asn Lys Tyr Val Thr Pro Glu Tyr 115 120 125 lie Pro Met Lys Ala Ala Arg Val Val Leu Trp Gly Leu Tyr Thr Phe 130 135 140 Met Gln Gly Leu Phe Gly Thr Gly Leu Trp Val Leu Ala His Glu Cys 145 150 155 160 Gly His Gln Ala Phe Ser Pro Ser Arg Leu lie Asn Asp Thr Val Gly 165 170 175 Trp Val Leu His Ser Ala Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Phe 180 185 190 Ser His Ser Lys His His Lys Ala Thr Gly Asn lie Glu Arg Asp Met 195 200 205 Val Phe Val Pro Arg Thr Arg Glu Gln Phe Ala Ser Arg lie Gly Arg 210 215 220 Phe Val His Glu lie Ser Glu Leu Thr Glu Glu Thr Pro lie Tyr Thr 225 230 235 240 Leu lie His Leu lie Gly Gln Gln Leu lie Gly Trp Pro Asn Tyr Leu 245 250 255 Met Thr Asn Val Thr Gly His Asn Phe His Glu Arg Gln Arg Glu Gly 260 265 270 Arg Gly Lys Gly Lys Lys Asn Gly Trp Phe Thr Gly Val Asn His Phe 275 280 285 Asn Pro Ser Ser Pro Leu Tyr Glu Glu Arg Glu Ala Pro Trp lie lie 290 295 300 Val Ser Asp lie Gly lie Ala lie Ala Ala Thr Ala Leu lie Tyr Leu 305 310 315 320 Gly Asn Thr Phe Gly Trp Ser Asn Met Phe Val Trp Tyr Phe Leu Pro 325 330 335 Tyr Leu Trp Val Asn His Trp Leu Val Ala lie Thr Tyr Leu Gln His 340 345 350 Thr Asp Pro Ser Leu Pro His Tyr Thr Pro Asp Gln Trp Asn Phe Val 355 360 365 Arg Gly Ala Ala Ala Thr lie Asp Arg Glu Phe Gly Phe lie Gly Arg 370 375 380 His Leu Leu His Gly lie lie Glu Thr His Val Leu His His Tyr Val 385 390 395 400 Ser Thr lie Pro Phe Tyr His Ala Asp Glu Ala Ser Glu Ala lie Lys 405 410 415 Lys Val Met Gly Arg His Tyr Arg Ala Asp Val Gln Asp Gly Pro lie 420 425 430 Gly Phe lie Lys Ala Met Trp Lys Ala Ala Arg Trp Cys Gln Trp Val 435 440 445 Glu Pro Thr Glu Gly Ala Glu Gly Lys Gly Lys Gly Val Leu Phe Tyr 450 455 460 Arg Asn Gln Asn Gly Leu Gly Val Lys Pro Ala Lys Leu Pro Lys Thr 465 470 475 480 Asn <210> 41 <211> 1200 <212> ADN <213> Afortierella alpina <400> 41 atggcacctc ccaacactat cgatgccggt ttgacccagc gtcatatcag cacctcggcc 60 ccaaactcgg ccaagcctgc cttcgagcgc aactaccagc tccccgagtt caccatcaag 120 gagatccgag agtgcatccc tgcccactgc tttgagcgct ccggtctccg tggtctctgc 180 cacgttgcca tcgatctgac ttgggcgtcg ctcttgttcc tggctgcgac ccagatcgac 240 aagtttgaga atcccttgat ccgctatttg gcctggcctg tttactggat catgcagggt 300 attgtctgca ccggtgtctg ggtgctggct cacgagtgtg gtcatcagtc cttctcgacc 360 tccaagaccc tcaacaacac agttggttgg atcttgcact cgatgctctt ggtcccctac 420 cactcctgga gaatctcgca ctcgaagcac cacaaggcca ctggccatat gaccaaggac 480 caggtctttg tgcccaagac ccgctcccag gttggcttgc ctcccaagga gaacgctgct 540 gctgccgttc aggaggagga catgtccgtg cacctggatg aggaggctcc cattgtgact 600 ttgttctgga tggtgatcca gttcttgttc ggatggcccg cgtacctgat tatgaacgcc 660 tctggccaag actacggccg ctggacctcg cacttccaca cgtactcgcc catctttgag 720 ccccgcaact ttttcgacat tattatctcg gacctcggtg tgttggctgc cctcggtgcc 780 ctgatctatg cctccatgca gttgtcgctc ttgaccgtca ccaagtacta tattgtcccc 840 tacctctttg tcaacttttg gttggtcctg atcaccttct tgcagcacac cgatcccaag 900 ctgccccatt accgcgaggg tgcctggaat ttccagcgtg gagctctttg caccgttgac 960 cgctcgtttg gcaagttctt ggaccatatg ttccacggca ttgtccacac ccatgtggcc 1020 catcacttgt tctcgcaaat gccgttctac catgctgagg aagctaccta tcatctcaag 1080 aaactgctgg gagagtacta tgtgtacgac ccatccccga tcgtcgttgc ggtctggagg 1140 tcgttccgtg agtgccgatt cgtggaggat cagggagacg tggtcttttt caagaagtaa 1200 <210> 42 <211> 1290 <212> ADN <213> Neurospora crassa <400> 42 atggcggtca ccacccgcag ccacaaggcc gcggccgcca ccgagcccga ggttgtcagc 60 accggcgttg acgccgtctc tgctgctgct ccctcctcct cctcctcctc ttccagccaa 120 aagtcggccg agcccatcga ataccccgac atcaagacca tccgcgacgc catccccgac 180 cactgcttcc gcccgcgcgt ctggatctcc atggcctact tcatccgcga cttcgccatg 240 gcctttggcc tcggctacct cgcctggcag tacatccccc tgatcgcctc caccccgctc 300 cgctacggcg cctgggctct gtacggctac ctccagggtc tcgtctgcac gggcatctgg 360 attctggcgc acgagtgcgg ccacggcgcc ttctcgaggc acacgtggtt caacaacgtc 420 atggggtgga ttggccactc cttcctcttg gtcccttact tcagctggaa gttcagccac 480 catcgccacc atcgcttcac cggccacatg gagaaggaca tggcgtttgt gcctgccacc 540 gaggctgatc gcaaccagag gaagctggcc aacttgtaca tggacaagga gacggccgag 600 atgtttgagg atgtgcccat tgtccagctc gtcaagctca tcgcccacca gctggccggc 660 tggcagatgt accccctctt caacgtctcc gccggtaagg gcagcaagca gtgggagact 720 ggcaagggcg gcatgggctg gttgagggtt agccactttg agccttcctc tgctgtgttc 780 cgcaactccg aggccatcta cattgccctg tccgatcttg gtctcatgat catgggctac 840 atcctctacc aggccgcgca ggttgttggc tggcagatgg tgggtctgct gtacttccag 900 cagtacttct gggttcacca ttggttggtc gccatcactt acctccacca cacccacgag 960 gaagtccacc actttgacgc cgactcgtgg accttcgtca agggcgctct cgccaccgtc 1020 gaccgcgatt ttggcttcat tggcaagcac ctcttccaca acattatcga ccaccacgtc 1080 gtccaccact tgttccctcg catccccttc tactacgccg aagaagccac caactcgatc 1140 cgccccatgc tcggccccct ctaccaccgc gacgaccgct ccttcatggg ccagctgtgg 1200 tacaacttca cccactgcaa gtgggtcgtt ccggaccccc aggtccccgg cgcgcttatt 1260 tgggcgcaca ccgttcagag cacccagtaa 1290 <210 43 <211> 1617 <212> ADN <213> Mortierella alpina <400> 43 cgacactcct tccttcttct cacccgtcct agtccccttc aacccccctc tttgacaaag 60 acaacaaacc atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg aggttttgaa 120 tgccgaggct ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca cccttcttga tgatcatcga 180 caacaaggtg tacgatgtcc gcgagttcgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct 240 cacgcacgtt ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact tttcaccccg aggctgcttg 300 ggagactctt gccaactttt acgttggtga tattgacgag agcgaccgcg atatcaagaa 360 tgatgacttt gcggccgagg tccgcaagct gcgtaccttg ttccagtctc ttggttacta 420 cgattcttcc aaggcatact acgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggttt 480 gtcgacggtc attgtggcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc 540 tgcgcttttg ggtctgttct ggcagcagtg cggatggttg gctcacgact ttttgcatca 600 ccaggtcttc caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg 660 ccagggcttc tcgtcctcgt ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ccgcccccaa 720 cgtccacggc gaggatcccg acattgacac ccaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc 780 gttggagatg ttctcggatg tcccagatga ggagctgacc cgcatgtggt cgcgtttcat 840 ggtcctgaac cagacctggt tttacttccc cattctctcg tttgcccgtc tctcctggtg 900 cctccagtcc attctctttg tgctgcctaa cggtcaggcc cacaagccct cgggcgcgcg 960 tgtgcccatc tcgttggtcg agcagctgtc gcttgcgatg cactggacct ggtacctcgc 1020 caccatgttc ctgttcatca aggatcccgt caacatgctg gtgtactttt tggtgtcgca 1080 ggcggtgtgc ggaaacttgt tggcgatcgt gttctcgctc aaccacaacg gtatgcctgt 1140 gatctcgaag gaggaggcgg tcgatatgga tttcttcacg aagcagatca tcacgggtcg 1200 tgatgtccac ccgggtctat ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact atcagatcga 1260 gcaccacttg ttcccttcga tgcctcgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga 1320 gaccctgtgc aaaaagtaca atgtccgata ccacaccacc ggtatgatcg agggaactgc 1380 agaggtcttt agccgtctga acgaggtctc caaggctgcc tccaagatgg gtaaggcgca 1440 gtaaaaaaaa aaacaaggac gttttttttc gccagtgcct gtgcctgtgc ctgcttccct 1500 tgtcaagtcg agcgtttctg gaaaggatcg ttcagtgcag tatcatcatt ctccttttac 1560 cccccgctca tatctcattc atttctctta ttaaacaact tgttcccccc ttcaccg 1617

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 34; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33; (c) un polinucleótido que híbrida con una o más de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33, o un complemento de la misma, bajo condiciones de 5X SSC, formamida a 50% y 42°C; y (d) un polinucleótido de hongos que codifica para un polipéptido que tiene por lo menos uno de los motivos de aminoácido: TrplleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe (WILAHECGHGASF) (SEQ ID NO: 6); LeuAlaHisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO: 7); HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 8); LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 9); His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr (H(H/A)RHHR(F/Y)TT) (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 ); TrpValHisHisTrpLeuValAlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis (WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH) (SEQ ID NO: 1 1 ); AlalleThrTyrLeu(H¡s/Gln)HisThr (AITYL(H/Q)HT) (SEQ ID NO: 12); GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO: 13) o HisValValHisHisLeuPheXaaArglleProPheTyr (HVVHHLFXRIPFY) (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22). 2 - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho polinucleótido es de un filum seleccionado del grupo que consiste de zygomycota (cigomicetos), basidiomycota (basidiomicetos) y ascomycota (ascomicetos). 3. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido es de una especie seleccionada del grupo que consiste de Neurospora crassa, Aspergillus nidulans y Botrytis cinérea. 4. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene por lo menos uno de los motivos de aminoácido: TrplleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe (WILAHECGHGASF) (SEQ ID NO: 6); LeuAlaHisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO: 7); HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 8); LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 9); His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr (H(H/A)RHHR(F/Y)TT) (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 ); TrpValHisHisTrpLeuValAlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis (WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH) (SEQ ID NO: 1 1 ); AlalleThrTyrLeu(His/Gln)H¡sThr (AITYL(H/Q)HT) (SEQ ID NO: 12); GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO: 13) o HisValValHisHisLeuPheXaaArglleProPheTyr (HVVHHLFXRIPFY) (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22). 5. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 34. 6. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33. 7. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido híbrida con una o más de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 33 bajo condiciones de 5X SSC, formamida a 50% y 42°C. 8. - Un vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 1. 9. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende por lo menos una secuencia adicional seleccionada del grupo que consiste de: (a) secuencias reguladoras enlazadas operativamente al polinucleótido; (b) marcadores de selección enlazados operativamente al polinucleótido; (c) secuencias de marcación enlazadas operativamente al polinucleótido; (d) una porción de purificación enlazada operativamente al polinucleótido; y (e) una secuencia de elección de objetivos enlazada operativamente al polinucleótido. 10. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque se define que comprende un promotor enlazado operablemente a dicho polinucleótido aislado. 1. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, específico de organelos, específico de tejidos, constitutivo o específico de células. 12. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de 35S del CaMV, 34S del FMV, Napin, 7S, Glob y Lee. 13. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque se define como un cassette de expresión aislado. 14. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque se define que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12. 15. - Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 40; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 39; y (c) un polinucleótido que híbrida con una o ambas de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 39, o un complemento de la misma, bajo condiciones de 5X SSC, formamida a 50% y 42°C. 16. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho polinucleótido es de un filum seleccionado del grupo que consiste de zygomycota (cigomicetos), basidiomycota (basidiomicetos) y ascomycota (ascomicetos). 17. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el polinucleótido es de una especie seleccionada del grupo que consiste de Neurospora crassa, Aspergillus nidulans y Botrytis cinérea. 18. - Un vector recombinante que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 15. 19. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque se define que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. 20. - Un polipéptido de hongos, o fragmento del mismo, que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido nucleico en el carbono 15, y comprende por lo menos uno de los motivos de aminoácido: TrplleLeuAlaHisGluCysGlyHisGlyAlaSerPhe (WILAHECGHGASF) (SEQ ID NO: 6); LeuAlaHisGluCysGlyHis (LAHECGH) (SEQ ID NO: 7); HisSerPheLeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (HSFLLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 8); LeuLeuValProTyrPheSerTrpLys (LLVPYFSWK) (SEQ ID NO: 9); His(His/Ala)ArgHisHisArg(Phe/Tyr)ThrThr (H(H/A)RHHR(F Y)TT) (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21 ); TrpValHisHisTrpLeuValAlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThrHis (WVHHWLVAITYL(H/Q)HTH) (SEQ ID NO: 1 1 ); AlalleThrTyrLeu(His/Gln)HisThr (AITYL(H/Q)HT) (SEQ ID NO: 12); GlyAlaLeuAlaThrValAspArg (GALATVDR) (SEQ ID NO: 13) o HisValValHisHisLeuPheXaaArglleProPheTyr (HVVHHLFXRIPFY) (SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 22). 21. - El polipéptido de hongos de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque se define adicionalmente como un polipéptido que comprende todos los motivos de dichos aminoácidos. 22. - Un polipéptido de hongos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 34; o un fragmento de la misma que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. 23. - Un polipéptido de hongos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 40; o un fragmento de la misma que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12. 24. - Una planta transgénica transformada con el vector recombinante de la reivindicación 8. 25. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque se define adicionalmente como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6. 26. - Una célula hospedera transformada con el vector recombinante de la reivindicación 8. 27. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha célula hospedera expresa una proteína codificada por dicho vector. 28. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la célula ha heredado dicho vector recombinante de un progenitor de la célula. 29. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque la célula ha sido transformada con dicho vector recombinante. 30. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque dicha célula hospedera es una célula vegetal. 31. - Una planta transgénica transformada con el vector recombinante de la reivindicación 15. 32. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque se define como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. 33. - Una célula hospedera transformada con el vector recombinante de la reivindicación 15. 34. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque dicha célula hospedera expresa una proteína codificada por dicho vector. 35. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la célula ha heredado dicho vector recombinante de un progenitor de la célula. 36. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la célula ha sido transformada con dicho vector recombinante. 37. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque dicha célula hospedera es una célula vegetal. 38. - Un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos omega-3 de semillas de plantas, que comprende los pasos de: (a) obtener semillas de una planta de la reivindicación 24; y (b) extraer el aceite de dichas semillas. 39. - Un método para producir una planta que comprende aceite de semilla que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3, que comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 8 en una planta que produce aceite. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la introducción del vector recombinante comprende fitomejoramiento. 41. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la introducción del vector recombinante comprende los pasos de: (a) transformar una célula vegetal con el vector recombinante de la reivindicación 8; y (b) regenerar dicha planta a partir de la célula vegetal, en donde la planta tiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3. 42. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la planta es una planta seleccionada del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, Brassica de semilla oleaginosa, colza, girasol, cártamo, cañóla, maíz, soya, algodón, lino, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, cacao, cacahuate, plantas con fruto, plantas de cítricos, y plantas que producen nueces y bayas. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la planta se define además como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6. 44. - El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque se incrementa el nivel de ácido estearidónico. 45. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque se define que comprende introducir el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8 en una pluralidad de plantas que producen aceite, y seleccionar dichas plantas o progenie de las mismas que tienen heredado el vector recombinante para una planta que tiene un perfil deseado de ácidos grasos omega-3. 46. - Un método para producir una planta que comprende aceite de semilla que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3, que comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 15 en una planta que produce aceite. 47. - El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la introducción del vector recombinante comprende fitomejoramiento. 48. - El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la introducción del vector recombinante comprende los pasos de: (a) transformar una célula vegetal con el vector recombinante de la reivindicación 15; y (b) regenerar dicha planta a partir de la célula vegetal, en donde la planta tiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3. 49. - El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la planta es una planta seleccionada del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, Brassica de semilla oleaginosa, colza, girasol, cártamo, cañóla, maíz, soya, algodón, lino, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, cacao, cacahuate, plantas con fruto, plantas de cítricos, y plantas que producen nueces y bayas. 50. - Un aceite de semilla de cañóla endógeno que tiene un contenido de ácido estearidónico de alrededor de 8% a aproximadamente 27%, y un contenido de ácido oleico de alrededor de 40% a aproximadamente 70%. 51. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque se define que comprende menos de 10% de ácido alfa-linoleico, ácido linoleico y ácido gama-linoleico combinados. 52. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de alrededor de 10% a aproximadamente 20%. 53. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de alrededor de 12% a aproximadamente 17%. 54. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de alrededor de 45% a aproximadamente 65%. 55. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de alrededor de 55% a aproximadamente 65%. 56. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de alrededor de 12% a aproximadamente 17%, y el contenido de ácido oleico se define además como de alrededor de 55% a aproximadamente 65%. 57. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque se define como de semilla de Brassica napus. 58. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque se define como de semilla de Brassica rapa. 59. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 en el aceite, es de alrededor de 1 :1 a aproximadamente 1 :4. 60. - El aceite de semilla de cañóla de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 en la semilla, se define además como de alrededor de 1 :2 a aproximadamente 1 :4. 61. - Un método para incrementar el valor nutricional de un producto comestible para consumo humano o animal, que comprende añadir el aceite de semilla de cañóla de la reivindicación 50, al producto comestible. 62. - El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el producto comestible es alimento humano. 63. - El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el producto comestible es forraje para animales. 64. - El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el producto comestible es un complemento alimenticio. 65. - El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el aceite de semilla de cañóla incrementa el contenido de ácido estearidónico del producto comestible. 66. - El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el aceite de semilla de cañóla disminuye la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 del producto comestible. 67. - El método de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque el producto comestible carece de ácido estearidónico antes de la adición del aceite de semilla de cañóla. 68. - Un método para fabricar alimento o forraje, que comprende añadir el aceite de semilla de cañóla de la reivindicación 50, a ingredientes de alimento o forraje de partida para producir el alimento o forraje. 69. - El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque se define como un método para fabricar alimento. 70. - El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque se define como un método para fabricar forraje. 71. - Alimento o forraje producido mediante el método de conformidad con la reivindicación 68. 72. - Un método para proveer ácido estearidónico a un humano o animal, que comprende administrar el aceite de semilla de cañóla de la reivindicación 50, a dicho humano o animal. 73. - El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque el aceite de semilla de cañóla se administra en una composición comestible. 74. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque la composición comestible es alimento o forraje. 75. - El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado además porque el alimento comprende bebidas, alimentos infundidos, salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de fruta, jarabes, postres, alcorzas y rellenos, productos congelados blandos, confitura o alimento de humedad intermedia. 76. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque la composición comestible es sustancialmente un líquido. 77. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque la composición comestible es sustancialmente un sólido. 78. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque la composición comestible es un complemento alimenticio. 79. - El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado además porque la composición comestible es un nutracéutico. 80. - El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque el aceite de semilla de cañóla se administra a un humano. 81. - El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque el aceite de semilla de cañóla se administra a un animal. 82.- El método de conformidad con la reivindicación 81 , caracterizado además porque el aceite de semilla de cañóla se administra a ganado o aves de corral.